BR112014000787B1

BR112014000787B1 - Método para produzir vírus vaccinia

Info

Publication number: BR112014000787B1
Application number: BR112014000787-0A
Authority: BR
Inventors: David Kirn; John Bell
Original assignee: Sillajen Biotherapeutics, Inc
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2021-04-13
Also published as: JP2014521353A; US10202581B2; CA2841831A1; CA2841831C; US20170298324A1; AU2012294606A1; CN103732236B; BR112014000787A2; AU2012294606B2; DK2739293T3; WO2013022764A1; EP2739293A1; KR102022952B1; ES2813413T3; PL2739293T3; CN103732236A; US20140162342A1; US9719105B2; JP6243333B2; KR20140058601A

Abstract

método para produzir vírus vaccinia certas concretizações referem-se a processos de produção viral para a produção em larga escalada do vírus vaccinia.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos no 61/515.724, depositado no dia 5 de agosto de 2011, cujo conteúdo incorpora-se ao presente documento por referência na íntegra.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO I. CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] Em termos gerais, as concretizações da presente invenção referem-se à virologia, à medicina e à terapêutica viral. Certas concretizações referem-se a processos de produção viral.

II. ANTECEDENTES

[0003] Os vírus oncolíticos (VOs) são vírus terapêuticos replicantes projetados ou selecionados especificamente para se desenvolver dentro de células tumorais e exterminá-las. Vários grupos estão nos estágios iniciais de comercialização com base em modelos animais pré-clínicos e dados clínicos iniciais em humanos. No entanto, um desafio que o campo ainda enfrenta consiste em produzir vírus de grau farmacêutico em larga escala para administração a pacientes. Os vírus são uma entidade biológica em vez de um fármaco sintetizado, portanto o processo de fabricação envolve a produção do vírus dentro de células e a remoção subsequente de resíduos celulares contaminantes sem que se perca o potencial infectante. Até hoje, a maior parte da fabricação comercial de produtos do vírus vaccinia para uso humano, se não ela toda, se deu na forma de vacinas em culturas celulares não humanas. Em geral, para a aplicação de uma vacina, os pacientes recebem pequenas doses do vírus em um sítio local (geralmente intramuscular) onde proteínas celulares contaminantes possam, na verdade, servir como coadjuvantes para aumentar a imunogenicidade ao preparado. Em contrapartida, com os vírus terapêuticos oncolíticos, as doses de vírus necessárias são até um milhão de vezes maiores para a aplicação da vacina e podem ser administradas por via intravenosa, intracranial, intraperitoneal ou por injeções diretas no tumor. No caso dos vírus oncolíticos, é fundamental poder fabricar grandes quantidades de vírus isentas de resíduos celulares contaminantes não humanos. Ademais, os vírus vaccinia são vírus envelopados que incorporam proteínas da célula hospedeira na membrana viral. A incorporação de proteínas humanas no envelope do vírus aumenta sua capacidade de se deslocar sem ser detectado pelo sistema imunológico humano hospedeiro.

[0004] Portanto, persiste a necessidade de novos métodos e composições para a produção de vírus oncolíticos em larga escala.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] O vírus vaccinia é produzido em células HeLa cultivadas em uma cultura de suspensão. No entanto, as condições das culturas de suspensão atualmente não são adequadas para a produção de vírus em larga escala. Sendo assim, a produção do vírus vaccinia em larga escala ou em escala comercial ainda não foi obtida com êxito usando células HeLa. Além do mais, não se esperava que linhas celulares HeLa aderentes produzissem um número de células suficiente para garantir o uso de células HeLa aderentes na produção do vírus vaccinia em quantidades necessárias à produção em larga escala. O presente pedido descreve um processo em larga escala para a produção do vírus vaccinia usando células HeLa aderentes.

[0006] Certas concretizações referem-se a métodos para produzir um vírus vaccinia que incluem uma ou mais das etapas a seguir.

[0007] Em certos aspectos, os métodos incluem infectar células HeLa aderidas a uma superfície com um vírus vaccinia colocando as referidas células HeLa aderentes em contato com o referido vírus vaccinia. De preferência, o vírus vaccinia é um vírus vaccinia recombinante, como os descritos nos parágrafos de 28 a 52 na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos no 2009/0004723, incorporada ao presente documento por referência na íntegra. Em certas concretizações, células HeLa aderidas a uma placa de Petri são especificamente excluídas do âmbito da Reivindicação. Em várias concretizações, a presente invenção propõe um método para produzir um vírus vaccinia que compreende (a) infectar células HeLa aderidas a uma superfície com o vírus vaccinia, (b) cultivar as células infectadas em condições favoráveis à produção de vírus progenitos, e (c) coletar o vírus vaccinia da cultura.

[0008] Em algumas concretizações, propõem-se métodos para produzir um vírus vaccinia que compreendem (a) infectar células HeLa aderidas a uma superfície com um vírus vaccinia recombinante colocando ao menos 1 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011, 1 x 1012, 5 x 1012, 1 x 1013, 5 x 1013 ou mais células HeLa aderentes, incluindo todos os valores e faixas entre esses, em contato com uma composição do vírus vaccinia; e (b) cultivar as células infectadas em condições favoráveis à produção de 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vírus vaccinia recombinantes por célula, incluindo todos os valores e faixas entre esses. De preferência, de acordo com os métodos, são produzidas ao menos 50 unidades formadoras de placa 50 (pfu) de vírus vaccinia por célula HeLa; com maior preferência, ao menos 75 pfu de vírus vaccinia por célula HeLa.

[0009] Em outras concretizações, as células HeLa aderidas a uma superfície são infectadas com o vírus vaccinia a uma multiplicidade de infecção (m.o.i.) entre 0,001 e 1,0, de preferência, entre 0,005 e 0,5 e, com maior preferência, entre 0,01 e 0,1. Em uma concretização particularmente preferida, a m.o.i. é entre 0,01 e 0,05, incluindo todos os valores e faixas entre esses. Em outras concretizações preferidas, a m.o.i. é entre 0,015 e 0,03. O termo “multiplicidade de infecção”, ou “m.o.i.”, refere-se à razão de unidades formadoras de placa (pfu) do vírus adicionadas por célula HeLa durante a infecção.

[0010] Em concretizações relacionadas, células HeLa aderidas a uma densidade de cerca de 104 a cerca de 106 células HeLa/cm2, de preferência, de cerca de 105 células HeLa/cm2, são infectadas com o vírus vaccinia de acordo com os métodos, sendo a concentração do vírus vaccinia entre 103 e 105 pfu/ml, de preferência de 104 pfu/ml.

[0011] Cultivo de Células HeLa Aderentes. Células HeLa aderentes para infecção com o vírus vaccinia de acordo com os métodos podem ser cultivadas por qualquer método adequado, incluindo (entre outros) cultivo em recipientes de vidro e plástico, por exemplo, frascos de cultura, biorreatores, incluindo, entre outros, fábricas celulares, como as Nunclon® Cell Factories™, cubos celulares, como o sistema CELLCUBE® da Corning Life Sciences, sacolas plásticas maleáveis (como sacolas de infusão) preenchidas com uma matriz de suporte celular, como sacolas de cultura celular Gibco® ou Lampire®; garrafas rotatórias; garrafas tipo spinner, como Frascos Tipo Spinner Magna- Flex®; fermentadoras; ou fibras ocas de vários materiais, como os sistemas de cultura celular da Cellex Biosciences (reator de fibras ocas AcuSyst®), BioYest (sistema Cell-Pharm® 100 ou 2500) ou Fibercell™. O cultivo em biorreatores é preferencial porque eles permitem o monitoramento e o controle preciso de variáveis como temperatura e pH. Em certos aspectos, é possível usar artigos de plástico CellBind™ (www.sigmaaldrich.com). As culturas celulares podem ser na forma de aglomerados celulares, como esferoides sobre uma conta microcarregadora, ou células em uma estrutura (isto é, estruturas biodegradáveis), tecido ou organoides de tecido. Em certos aspectos, as células HeLa aderentes são cultivadas em um microcarregador, cubo celular, fábrica celular, frasco T ou garrafa rotatória. Em uma concretização preferida, as células HeLa aderentes são cultivadas em uma ou mais garrafas rotatórias, por exemplo, usando um aparelho RollerCell 40 (Cellon S.A., Luxembourg). O recipiente usado pode compreender, entre outras, uma área de cultura cumulativa de cerca de ao menos, ou no máximo, 1.700, 5.000, 10.000, 25.000, 50.000, 100.000, 150.000, 200.000 ou 500.000 cm2, incluindo todas as faixas e valores entre esses. Em certos aspectos, o recipiente tem uma área de cultura cumulativa de ao menos 168.000 cm2.

[0012] As células HeLa aderentes que serão infectadas com o vírus vaccinia podem ser cultivadas em qualquer meio de cultura adequado que estimule o crescimento, o manutenção e a ligação à superfície de suporte celular, incluindo, entre outros, BME (meio basal de Eagle), MEM (meio mínimo de Eagle), meio 199, DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbocco), GMEM (meio de Eagle modificado por Glasgow), DMEM-HamF12 e Ham-F10, meio de Dulbecco modificado por Isocove, meio 5A de MacCoy ou RPMI 1640. De preferência, o meio de cultura é um meio de cultura definido. Em um aspecto, o meio de cultura é substancialmente isento de soro. Exemplos de meios isentos de soro otimizados para uso com células HeLa incluem, entre outros, VP-SFM (Gibco BRL/Life Technologies), meio isento de soro (SFM) HeLa Ex-Cell® (Sigma Aldrich) e Quantum 101 (GE Healthcare). Em outras concretizações, o meio de cultura pode compreender também soro animal, como soro bovino fetal (FBS). Por exemplo, o meio de cultura pode compreender de 5% a 10% de soro (por exemplo, FBS) ou pode conter menos que 5% de soro (por exemplo, FBS), ou qualquer faixa ou valor entre esses. Em uma concretização, o meio de cultura é DMEM suplementado com 5% a 10% de FBS, como 10% de FBS.

[0013] O termo “microcarregador” significa uma pequena partícula distinta para uso nas células em cultivo e à qual as células se ligam. Os microcarregadores podem ser em qualquer formato adequado, como bastões, esferas e seus semelhantes. Em muitas concretizações, um microcarregador inclui uma base microcarregadora, a qual é revestida para proporcionar uma superfície adequada à cultura celular. Um polipeptídeo pode ser ligado, enxertado ou conectado de alguma outra forma ao revestimento de superfície. Os microcarregadores são usados em culturas celulares a fim de proporcionar grandes produções de células dependentes de ligação. Os microcarregadores normalmente são agitados ou mexidos em meios de cultura celular e proporcionam uma razão da área da superfície de ligação e crescimento para o volume bem grande em relação a equipamentos de cultura mais tradicionais. Consulte a publicação de patente dos Estados Unidos 2011/0027889, a qual se incorpora ao presente documento por referência na íntegra, para um exemplo detalhado de um microcarregador.

[0014] Em certas concretizações, o vírus vaccinia é uma linhagem do vírus vaccinia do IHD-J, da Wyeth, da Western Reserve ou de Copenhagen. Em certos aspectos, o vírus vaccinia é um vírus vaccinia recombinante. O vírus vaccinia recombinante pode compreender uma região de codificação heteróloga. Conforme usado neste documento, uma região de codificação heteróloga é uma região de codificação que não é encontrada naturalmente no genoma do vírus vaccinia. Em certos aspectos, a região de codificação heteróloga codifica um polipeptídeo imunoestimulatório. O polipeptídeo imunoestimulatório pode ser uma citocina, tal como, entre outros, o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF).

[0015] Em certos aspectos, o vírus vaccinia recombinante replica-se seletivamente em uma célula tumoral. O vírus vaccinia recombinante pode compreender uma mutação em um gene endógeno. A mutação pode ser a deleção de uma sequência de ácidos nucleicos, a substituição de resíduos de ácidos nucleicos ou a introdução de um ou mais resíduos de ácidos nucleicos que afetem a função ou expressão do vírus vaccinia. A mutação pode resultar no crescimento seletivo em uma célula tumoral, no crescimento atenuado em uma célula não tumoral, no crescimento intensificado em uma célula tumoral ou em uma combinação desses. Um vírus vaccinia recombinante com mutação em um gene endógeno pode ser um vírus vaccinia com deficiência de timidina quinase (TK) (isto é, um vírus vaccinia com mutação em um gene que codifica a timidina quinase tornando o polipeptídeo codificado não funcional). Em certos aspectos, o vírus vaccinia recombinante com mutação em um gene endógeno é uma linhagem do vírus vaccinia do IHD-J, da Wyeth, da Western Reserve ou de Copenhagen e/ou compreende uma região de codificação heteróloga. Em outra concretização, um vírus vaccinia com mutação em um gene endógeno também compreende uma região de codificação heteróloga, tal como, entre outras, uma região de codificação do polipeptídeo fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos.

[0016] Cultivo das células HeLa infectadas. As células HeLa aderidas submetidas ao contato com o vírus vaccinia são cultivadas em condições favoráveis à produção de vírus vaccinia progênios. As condições de cultura podem compreender mas não se limitam a um meio de infecção definido, pH definido, recipiente de cultura definido, temperatura ou faixa de temperatura definida, número celular definido, confluência celular definida, manipulação física definida (por exemplo, tratamento enzimático ou químico, frequência de rotação, velocidade de agitação etc.), condições de fase gasosa definidas, tempo de cultura definido, densidade de semeadura celular definida e número de passagens celulares definido. Em um aspecto, o vírus pode ser simplesmente adicionado ao meio de cultura celular HeLa usado para preparar as células HeLa aderentes, caso este em que o meio de cultura e o meio de infecção são os mesmos. Em outros aspectos, o meio de cultura usado para preparar as células HeLa aderentes é removido na etapa de infecção e as células HeLa submetidas ao contato com o vírus vaccinia são cultivadas em um meio de infecção que pode compreender ou ser substancialmente isento de soro até produzir o vírus progênio. Meios de infecção adequados incluem, entre outros, BME, MEM, meio 199, DMEM, GMEM, DMEM-HamF12 e Ham-F10, meio de Dulbecco modificado por Isocove, meio 5A de MacCoy ou RPMI 1640, qualquer um dos quais pode ser opcionalmente suplementado com soro. Meios isentos de soro, como VP-SFM, meio isento de soro (SFM) HeLa Ex-Cell® e Quantum 101 também são adequados para uso como meio de infecção.

[0017] Em certos aspectos, as células infectadas são cultivadas em um meio de infecção com 5% a 10% de soro (por exemplo, soro bovino fetal (FBS)) a um pH de cerca de 7, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 ou 8, de preferência, a um pH superior a 7,1, com maior preferência, a um pH superior a 7,2 e, com maior preferência ainda, a um pH de cerca de 7,3. Em outros aspectos, as células são cultivadas em um meio de infecção com menos que 5% de soro (por exemplo, FBS), tal como 0% de soro (por exemplo, FBS) a um pH de cerca de 7, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 ou 8, de preferência, a um pH superior a 7,1, com maior preferência, a um pH superior a 7,2 e, com maior preferência ainda, a um pH de cerca de 7,3. Em aspectos relacionados, as células são cultivadas a um pH de cerca de 7,3 em um meio de infecção que compreende entre 0% e 10% de soro (por exemplo, FBS). Em outras concretizações, as células são cultivadas a um pH superior a 7,2 e inferior a 7,6 em um meio de infecção que compreende entre 0% e 10% de soro (por exemplo, FBS). Em uma concretização preferida, o meio de infecção compreende DMEM e, como opção, de 100 a 300 mM de glutamina. As células podem ser cultivadas a uma temperatura de cerca de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40° C. Em uma concretização preferida, as células são cultivadas a uma temperatura entre 36° C e 37,5° C, de preferência a 37° C. Em certos aspectos, o meio de infecção excluirá especificamente um ou mais dentre sulfato de dextrano, Pluronic F-68, Tween-80 e/ou hidrolisado de proteína de soja. Em concretizações preferidas, o meio de infecção exclui especificamente sulfato de dextrado e ao menos um dos componentes a seguir: Pluronic F-68, Tween-80 e hidrolisado de proteína de soja. Em outras concretizações preferidas, o meio de infecção é substancialmente isento de todos esses componentes.

[0018] Os métodos podem incluir ainda expandir a cultura de células HeLa antes, durante ou depois da infecção. As células HeLa podem passar por ao menos 1, 2, 3, 4, 5 ou mais recipientes de cultura, por exemplos, garrafas rotatórias. Em certos aspectos, as células são destacadas de uma superfície tratando-as com uma solução de destaque que compreende proteases e/ou enzimas colagenolíticas, por exemplo, HyQtase®. Cada recipiente pode ter uma área de cultura maior em comparação ao anterior. Em certos aspectos, um recipiente de cultura tem uma área de cultura total de ao menos 84.000 a 1.000.000 cm2. Em certos aspectos, a passagem final é a um recipiente de cultura com área de cultura de ao menos 168.000 cm2.

[0019] Em certas concretizações, o intervalo de tempo entre a semeadura de um recipiente de cultura e a infecção é de 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 ou mais horas, incluindo todos os valores e faixas entre esses. Em certos aspectos, as células HeLa aderentes são submetidas ao contato com 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 ou 1 x 109 pfu/ml do vírus vaccinia, incluindo todos os valores e faixas entre esses. Em uma concretização preferida, células HeLa aderentes a uma densidade de cerca de 104 a cerca de 106 células HeLa/cm2, de preferência, de cerca de 105 células HeLa/cm2, são submetidas ao contato com entre 103 e 105 pfu/ml do vírus vaccinia, com maior preferência, cerca de 104 pfu/ml do vírus vaccinia.

[0020] Em certos aspectos, os métodos incluem isolar o vírus vaccinia produzido pelas células HeLa aderentes. O vírus vaccinia colhido pode ser concentrado e purificado de acordo com métodos conhecidos pelos versados na técnica. Outras concretizações da invenção referem-se a uma composição do vírus vaccinia produzida pelos métodos descritos neste documento, tal como os descritos nos parágrafos de 295 a 303 da Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos no 2009/0004723, incorporada ao presente documento por referência na íntegra.

[0021] Outras concretizações da invenção são discutidas ao longo deste pedido. Toda concretização descrita com referência a um aspecto da invenção aplica-se a outros aspectos da invenção e vice- versa. As concretizações na seção Exemplos são vistas como concretizações da invenção aplicáveis a todos os aspectos da invenção.

[0022] O uso do artigo indefinido “um” junto com o termo “compreender” nas Reivindicações e/ou no Relatório específico pode significar o numeral “um”, mas também é consistente com o significado de “um ou mais”, “ao menos um” e “um ou mais de um”.

[0023] Contempla-se que qualquer concretização discutida neste documento seja implementada com relação a qualquer método ou composição da invenção e vice-versa. Além disso, as composições e kits da invenção podem ser usados para realizar métodos da invenção.

[0024] Ao longo do presente relatório descritivo, o termo “cerca de” é usado para indicar que um valor inclui a margem de erro padrão do dispositivo ou método empregado para determinar o valor.

[0025] O uso do termo “ou” nas Reivindicações é tal que significa “e/ou”, salvo indicação explicitamente em contrário para fazer referência a alternativas ou se as alternativas se excluírem umas às outras, embora a revelação possibilite uma definição que se refira tanto a alternativas exclusivas quanto a “e/ou”. Também se contempla que qualquer item listado usando o termo “ou” também seja especificamente excluído.

[0026] Conforme usadas neste relatório descritivo e nas Reivindicações, as palavras “compreender” (e qualquer derivação de compreender, como “compreendendo” “compreende” e “compreendem”) “possuir” (e qualquer derivação de possuir, como “possuindo”, “possui” e “possuem”), “incluir” (e qualquer derivação de incluir, como “incluindo”, “inclui” e “incluem”) ou “conter” (e qualquer derivação de conter, como “contendo”, “contém” e “contêm”) são inclusivas ou abertas e não excluem elementos ou etapas de método adicionais ou não citados.

[0027] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção transparecerão pela leitura da descrição detalhada a seguir. No entanto, deve-se ter em mente que, embora indiquem concretizações específicas da invenção, a descrição detalhada e os exemplos específicos são dados a título meramente ilustrativo, uma vez que várias alterações e modificações dentro do âmbito e da essência da invenção transparecerão aos versados na técnica pela leitura da presente descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] Os desenhos a seguir constituem parte do presente relatório descritivo e destinam-se a demonstrar melhor certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida com referência a um ou mais desses desenhos junto com a descrição detalhada das concretizações específicas apresentadas neste documento.

[0029] A FIG. 1 ilustra a produção da linhagem JX-594 do vírus vaccinia recombinante (pfu/célula) em várias linhas celulares humanas. As células foram infectadas a uma multiplicidade de infecção de 0,1 e, 72 horas após a infecção, coletaram-se os lisados e determinou-se o título nas células U-2 OS.

[0030] A FIG. 2 ilustra o efeito do pH do meio de infecção na produtividade da linhagem JX-594 do vírus vaccinia recombinante em células HeLa aderentes. As células foram infectadas a uma multiplicidade de infecção de 0,1 em meios com o pH indicado e, 72 horas após a infecção, coletaram-se os lisados e determinou-se o título nas células U-2 OS.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031] Os vírus vaccinia são vírus envelopados que produzem quatro formas infecciosas que diferem quanto à membrana externa: vírion maduro intracelular (IMV), vírion envelopado intracelular (IEV), vírion envelopado associado a célula (CEV) e vírion envelopado extracelular (EEV). A forma EEV é resistente ao complemento devido à incorporação na célula hospedeira de reguladores de ativação do complemento hospedeiros à membrana EEV externa (Vanderplasschen et al, (1997) PNAS 95:7.544 a 7.549). A capacidade de esquivar da inativação do complemento e a capacidade geral de esquivar do reconhecimento por parte do sistema imunológico hospedeiro são características importantes para a eficácia na administração sistêmica aos pacientes.

[0032] A membrana plasmática do IMV incorpora várias proteínas da célula hospedeira durante sua formação. Visto que o IMV representa a maior parte da progênie infecciosa, células produtoras da mesma espécie que os pacientes almejados da viroterapia oncolítica podem ser vantajosas para a difusão sistêmica dentro do paciente já que os vírus serão menos imunogênicos. Essas proteínas da célula hospedeira nas membranas plasmáticas do IMV também podem proporcionar certas vantagens no processo de infecção.

[0033] Embora o IMV represente a maior parte da progênie infecciosa, não se estabeleceu em definitivo que a forma EEV do vírus não está contida nos preparados da cultura celular. As proteínas reguladoras de ativação do complemento da mesma espécie que os pacientes almejados podem desempenhar papel fundamental na inibição da ativação do complemento e, portanto, esquivar da depuração imunológica por parte do sistema imunológico hospedeiro. Sendo assim, os inventores desenvolveram um sistema para produzir grandes quantidades do vírus vaccinia com um componente celular humano.

[0034] Antigamente, o vírus vaccinia para uso como vacina era produzido a partir de cascas de ferida humanas, contudo, mais tarde, passou a ser cultivado na pele de bezerros, ovelhas e búfalos da Índia, na membrana corialantoica de embriões de pintos ou em fibroblastos embrionários de bovinos primitivos (Ellner, 1998). Para as iniciativas mundiais de erradicação da varíola, produziram-se estoques por infecção através da escarificação da pele de bezerros (Fenner, 1977). Os estoques de vírus foram preparados a partir de linfa bovina, sendo essa fórmula a única vacina licenciada e disponível, conhecida como DRYVAX® (Wyeth). O preparado de vírus foi concentrado e liofilizado, o que responde por sua estabilidade (Fenner, 1977). Ele foi produzido a uma concentração de ao menos 108 pfu/ml de material liofilizado. Foi reconstituído em 50% de glicerina e 0,25% de fenol em água estéril para injeção e administrado a até 400 vacinas por via intradérmica pelo uso de agulha bifurcada (Fenner 1977) com uma dose a cerca de 2,5 x 105 pfu; isto é, ao menos 104 vezes menos que a dose padrão de 109 pfu (ou mais) do vírus vaccinia como vírus oncolítico.

[0035] Um candidato clínico proeminente para o vírus vaccinia oncolítico é o vírus vaccinia com a timidina quinase desativada, o qual expressa o GM-CSF (Jennerex, JX-594). No entanto, outras variantes e linhagens do vírus vaccinia também podem ser produzidas pelos métodos descritos neste documento. Por exemplo, o JX-963 é um vírus vaccinia recombinante que, junto com a remoção do gene TK, executa a deleção adicional do gene do fator de crescimento do vaccinia (VGF) construído em uma estrutura do vaccinia da Western Reserve. Esse vírus vaccinia duplamente delido (vvDD) provou-se um vírus específico de tumor com atividade antitumoral em modelos animais (McCart et al., 2001; Thorne et al., 2007; Naik et al., 2006). Uma segunda variante do vvDD é o JX-929, que expressa o receptor humano da somatostaina (SSTR2) em células infectadas, facilitando a geração de imagens moleculares depois da administração sistêmica usando 111In- pentatreótido (McCart et al. 2004).

I. Cultura Celular

[0036] A produção viral em base celular foi examinada em busca de alternativas para a vacinação com DRYVAX® e para a produção do vírus vaccinia usado no campo da imunoterapia viral e terapia gênica. Uma linhagem do vírus vaccinia de segunda geração cultivada na linha celular renal símia Vero chamada de ACAM200 foi desenvolvida. Nesses estudos, o vírus foi purificado efetivamente a partir de culturas celulares. Além disso, vacinas contra o câncer que usam o vírus vaccinia junto com antígenos específicos de tumor (isto é, PSA, CEA) e moléculas imunoestimulatórias (isto é, B7.1, ICAM-1 e LFA-1) foram produzidas em células e administradas a pacientes em ensaios clínicos de Fase I e II (Li, et al., 2005; Guo e Bartlett, 2004). No entanto, em ambos os casos acima, os pacientes receberam a administração local em vez da administração sistêmica dos preparados virais e, geralmente, receberam uma fração da dose total do vírus necessária para a eficiência oncolítica in vivo.

[0037] Em comparação a outros vírus divulgados como candidatos a vírus oncolíticos, os poxvírus, como o vaccinia, trazem alguns desafios específicos à fabricação e purificação em larga escala. Por ser um dos maiores vírus da natureza, os poxvírus são visíveis por microscopia óptica e medem de 200 a 400 nm de comprimento (Moss, in Fields' virology B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, Eds. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001) pp. 2.849 a 2.883). Devido à sua grande dimensão, o vírus vaccinia não pode ser esterilizado por filtração e, portanto, qualquer processo de fabricação é tipicamente fechado.

[0038] Como todo o seu ciclo de vida ocorre dentro do citoplasma da célula hospedeira, a maior parte das partículas infeccionas não é liberada no meio celular, mas se mantém dentro da célula infectada, portanto, a purificação requer a lise da célula infectada e a purificação das partículas virais para eliminar o resíduo celular.

[0039] Na morfogênese dos poxvírus, eles adquirem membranas pela síntese de novo da membrana no início da morfogênese e, mais tarde, adquirem novas membranas a partir da golgi hospedeira (Moss, in Fields' virology B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, Eds. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001) pp. 2.849 a 2.883).

[0040] Os métodos atuais destinam-se a um processo celular aderente desenvolvido para produzir vírus com grau GMP para ensaios contra o câncer. O processo celular aderente pode ser realizado em condições isentas de soro ou na presença de soro. As metas de produtividade para a plataforma de fabricação descrita neste documento são de ao menos 30, 100, 125, 150, 200 ou mais pfu/célula - a concentração de vírus estimada por dose é de cerca de 109 pfu/ml.

[0041] Uma concretização da invenção destina-se a procedimentos para a produção de JX-594 com título elevado na cultura celular. Várias linhas celulares humanas foram testadas e a HeLa, uma linha celular humana do câncer cervical, provou suportar a replicação robusta do vírus em culturas aderentes. Os presentes métodos não se limitam a células HeLa, sendo possível usar outras células aderentes no processo de produção, mas, atualmente, as células HeLa são consideradas a melhor linha celular para a produção do vírus vaccinia.

[0042] A abordagem típica para avaliar a produtividade do vírus consiste em realizar um ensaio de placa padrão, que envolve uma série de diluição, seguida por um período de 2 a 3 dias esperando que se formem placas, e, então, o cálculo do título. Como alternativa, uma abordagem PCR quantitativa (Q-PR) foi padronizada, a qual permite determinar o número de genomas virais produzidos durante a infecção. Oligonucleotídeos iniciadores de amplificação foram otimizados, os quais permitem quantificar o número de cópias do gene viral E9L em células infectadas e correlacionar esses resultados com os dados do ensaio de placa padrão. A vantagem dessa abordagem é que ela pode ser adaptada para um formato com 96 cavidades e os dados são obteníveis em horas em vez de dias. Assim, a triagem inicial padrão dos meios e suplementos, o tempo para colheita e as influências da concentração do vírus de entrada podem ser rapidamente realizadas e analisadas em placas com 96 cavidades. Após essa triagem inicial, todos os resultados positivos foram confirmados com o ensaio de placa clássico.

[0043] Componentes encontrados em meios comerciais isentos de soro foram testados quanto ao seu efeito na produtividade do vírus. A linha celular HeLa S3 foi adaptada para o crescimento em suspensão e, nas nossas mãos, essas células se desenvolveram em um meio de suspensão isento de soro HeLa EX-CELL™ (SAFC Biosciences) tão bem quanto as células aderentes se desenvolvem em meios com soro. No entanto, como mencionado acima, apesar das excelentes características de crescimento celular, os inventores observaram um crescimento viral bastante insatisfatório nesse meio (menos de uma partícula de vírus por célula infectada). Embora a fórmula exata do meio isento de soro HeLa EX-CELL™ seja protegida por direitos autorias, um componente conhecido desses meios isentos de soro é um polissacarídeo sulfatado, o sulfato de dextrado, aparentemente adicionado para evitar a aglomeração celular. No entanto, o sulfato de dextrano também é conhecido por inibir a replicação de uma ampla variedade de vírus envelopados, incluindo retrovírus, herpesvírus, rhabdovírus e aerenavírus (De Clercq, 1993). Há cerca de 20 mg/l de sulfato de dextrano no meio EX-CELL. Várias concentrações de sulfato de dextrano foram usadas e avaliadas no rápido ensaio descrito acima. Descobriu-se que o sulfato de dextrano de fato exerce um impacto negativo dependente da dose na produtividade do vírus, uma descoberta confirmada posteriormente usando ensaios de título clássicos. Embora a remoção do sulfato de dextrano de fato melhore a produtividade do vírus, ela continua abaixo da produtividade usualmente obtida com células HeLa aderentes em meios contendo soro. Outros componentes dos meios que afetam a produtividade viral incluem o Pluronic F-68, um surfactante em bloco bifuncional copolimérico geralmente atóxico a células, Tween-80, um detergente comumente usado, e hidrolisado de soja. Em certos aspectos da invenção, o meio carecerá de um ou mais dentre sulfato de dextrano, Pluronic F-68, Tween-80 e/ou hidrolisado de proteína de soja. Exemplos de algumas dessas fórmulas do meio e de suplementos de soro são delineados na Tabela 1. Tabela 1. Fórmulas de meios de cultura e suplementos

[0044] Visto que o vírus vaccinia prefere o contato de célula com célula para sua difusão eficiente, é possível que as culturas celulares de suspensão sejam limitadas pela transmissão de célula a célula insatisfatória do vírus. Em certos aspectos, a aglomeração das células é promovida, as células são cultivadas em microcarregadores ou a cultura aderente é suficiente para a produção viral.

[0045] Em um exemplo não limitante, as condições a seguir foram usadas para o cultivo de JX-594, as quais resultaram consistentemente em títulos de mais de 100 pfu/célula. As células são dispostas em garrafas rotatórias a 4 x 104 células/cm2 e cultivadas por 2 dias em cultura. Depois disso, remove-se o meio de crescimento adiciona-se um meio fresco contendo 104 pfu/ml de JX-594. As células são mantidas por mais 60 a 70 horas, após o quê coletam-se as células e colhem-se os vírus. Essa configuração pode produzir cerca de 170 doses (109 pfu/dose) de JX-594. Durante esse processo, os inventores descobriram que, inesperadamente, certos fatores exerceram efeito significativo na produção do vírus. Por exemplo, o pH do meio exerceu influência na replicação do JX-594. A produção viral foi otimizada em um meio bem tamponado a um pH de 7,3. A produtividade a partir de culturas aderentes foi significativamente melhor do que todas as experiências em culturas de suspensão.

[0046] Para garantir a produção de preparados virais de alta qualidade suficientemente isentos de produtos contaminantes, vários ensaios podem ser usados para a análise da pureza e/ou qualidade do vírus. Esses ensaios garantirão que os preparados virais equiparam-se a outros lotes verificados do preparado de vírus e garantirão o êxito do processo.

[0047] Em certas concretizações, o vírus vaccinia pode ser isolado e purificado. O método para purificação do vírus vaccinia pode incluir: a. carregar uma matriz em fase sólida com um vírus vaccinia contido em fase líquida; b. lavar a matriz, e c. eluir o vírus vaccinia.

[0048] Em certos aspectos, a matriz pode compreender um ligante que se conecte ao vaccinia. O ligante pode se conectar à matriz em fase sólida ligando-se ou acoplando-se a esta. A interação entre o ligante e o vírus forma um complexo reversível, sendo assim o vírus é retido reversivelmente na matriz. Em certos aspectos, utiliza-se como ligante o glicosaminoglicano (GAG), em especial o sulfato de heparano ou a heparina, ou uma substância semelhante ao GAG. Conforme usado no presente documento, “glicosaminoglicanos” (QAGs) são polissacarídeos não ramificados longos compostos por uma unidade dissacarídica repetida.

[0049] O ligante pode ser uma molécula biológica como, por exemplo, um peptídeo e/ou uma lectina e/ou um anticorpo e/ou, de preferência, um carboidrato. O ligante também pode compreender ou ser composto por sulfato. Em outra concretização, o ligante compreende um ou mais grupos de sulfato carregados negativamente.

[0050] Em certos aspectos, o ligante é uma molécula hidrófoba como, por exemplo, um grupo fenila aromático, um grupo PPG, um grupo butila ou um grupo hexila.

[0051] Em um aspecto, o método compreende a purificação do vírus vaccinia por cromatografia por interação hidrofóbica (HIC). Em outra concretização, o método compreende a purificação do vírus vaccinia por HIC junto com cromatografia por afinidade. O uso da HIC pode proporcionar grandes produções de vírus com grandes reduções de DNA e proteínas contaminantes. O nível de contaminação por DNA pode cair para 0,01% do material inicial e o nível de contaminação por proteínas pode cair para menos de 0,1%.

[0052] Em certos aspectos, a celulose sulfatada pode ser usada com a cromatografia HIC em coluna de fenil para produzir partículas de vírus com rendimentos e níveis de pureza elevados.

[0053] Em certos aspectos, o DNA é degradado ou removido antes ou depois da purificação do vírus vaccinia. O DNA pode ser removido por tratamento com nuclease, tal como tratamento com Benzonase®. O tratamento com nuclease diminui o risco de as vacinas ou vetores virais conterem oncógenos intactos ou outras sequências de DNA funcionais.

[0054] Em aspectos relacionados, as proteínas são degradadas ou removidas antes ou depois da purificação do vírus vaccinia. As proteínas podem ser removidas por tratamento com protease, tal como tratamento com TrypLE® Select. De preferência, utiliza-se uma combinação do tratamento com nuclease e do tratamento com protease a fim de diminuir ou eliminar o DNA e as proteínas HeLa contaminantes.

[0055] A matriz pode ser um gel, conta, cavidade, membrana, coluna etc. Em uma concretização preferida da invenção, a fase sólida é uma membrana, em especial uma membrana de celulose. Uma ampla gama de polímeros modificados capazes de se ligar ao vírus pode ser usada. Exemplos desses polímeros incluem derivados da celulose (ésteres de celulose, hidrato de celulose, acetato de celulose, nitrato de celulose); agarose e seus derivados; polissacerídeos, como chitina ou chitosano; poliolefinas (polipropileno); polissulfona; polietersulfona; poliestireno; poliamidas aromáticas e alifáticas; polissulfonamidas; polímeros halogenados (cloreto de polivinila, fluoreto de polivinila, fluoreto de polivinilideno); poliésteres; homopolímeros e copolímeros de acrilonitrila.

[0056] O vírus vaccinia pode ser purificado em condições assépticas a fim de obter um preparado de vírus ativo, estável e altamente puro. Os vírus vaccinia podem ser nativos ou recombinantes.

[0057] Conforme usado no presente documento, “contaminantes” abrange quaisquer substâncias indesejadas que possam derivar das células hospedeira usadas para o crescimento do vírus (por exemplo, DNA ou proteínas da célula hospedeira) ou de quaisquer aditivos usados durante o processo de fabricação, incluindo a montante (por exemplo, gentamicina) e a jusante (por exemplo, Benzonase).

[0058] Conforme usado no presente documento, a fabricação em “escala industrial” ou em “larga escala” do vírus vaccinia ou do vírus vaccinia recombinante compreende métodos capazes de proporcionar um mínimo de 50.000 doses de 1,0 x 108 partículas do vírus (mínimo total de 5,0 x 1012 partículas de vírus) por batelada (ciclo de produção).

[0059] Conforme usado no presente documento, a “Pureza” do preparado ou vacina do vírus vaccinia é investigada quanto ao teor das impurezas de DNA, proteínas, Benzonase e gentamicina. A pureza é expressa por impureza específica, que é a quantidade de cada impureza por dose (por exemplo, ng de DNA/dose).

[0060] Conforme usado no presente documento, “Estabilidade” significa uma medida de como a qualidade do preparado de vírus (substância de fármaco a granel (BDS) ou produto de fármaco final (FDP)) varia com o tempo sob a influência de uma série de fatores ambientais, como temperatura, umidade e iluminação, e a qual estabelece um intervalo de tempo para a realização de novos testes, no caso de uma BDS, ou do tempo de vida, no caso de um FDP, garantidas as condições de armazenamento recomendadas.

[0061] O ligante possibilita a eluição do vírus vaccinia ligado em tais condições brandas em que o vírus vaccinia retenha totalmente sua atividade biológica. Isso significa que o vírus é infeccioso. A infectividade do vírus vaccinia pode ser preservada durante a purificação de tal modo que ao menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da TCID50 (dose infectante em cultura de tecido mediana) seja mantida durante a purificação. De preferência, ao menos 30% da TCID50 inicial é mantida durante a purificação.

[0062] Em uma concretização, a matriz em fase sólida é um gel ou membrana com um tamanho dos poros de 0,25 μm, de preferência, superior a 0,25 μm, com maior preferência, de 1,0 a 3,0 μm, com uma taxa de fluxo linear em condições de purificação reais de 10 cm/min a 20 cm. O tamanho dos poros da matriz pode ser de 0,25 a 0,5 μm, de 0,5 a 0,75 μm, de 0,75 a 1,0 μm, de 1,0 a 2,0 μm, de 2,0 a 3,0 μm ou superior a 3,0 μm.

[0063] O carregamento da fase sólida com um ligante pode ser realizado por uma abordagem de batelada, coluna ou membrana.

[0064] A abordagem de membrana pode trazer alguns benefícios para a purificação de vírus grandes como os vírus vaccinia. Os tamanhos de poro grandes e a disponibilidade do ligante na superfície da membrana permitem altas capacidades de ligação até mesmo de partículas virais grandes.

[0065] Em uma concretização, o vírus liga-se ao ligante em sulfato de amônio, por exemplo, a 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1,0 M, 1,2 M, 1,4 M, 1,6 M, 1,8 M ou 2,0 M.

[0066] Quando a ligação dos vírus vaccinia ou vírus recombinantes com o ligante ou matriz progride o suficiente, os contaminantes da célula hospedeira (em especial o DNA e as proteínas da célula hospedeira) que permanecem na fase líquida podem ser removidos lavando-se a matriz à qual o vírus vaccinia se ligou com um meio de lavagem adequado. Em um aspecto, lava-se a matriz com sulfato de amônio a 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1,0 M, 1,2 M, 1,4 M, 1,6 M, 1,8 M ou 2,0 M.

[0067] Os vírus vaccinia ou vírus recombinantes ligados podem ser eluídos a partir da matriz. A eluição dos vírus vaccinia capturados pode ser realizada por agentes rompendo de maneira específica a interação específica entre o ligante ou matriz e o vírus vaccinia ou por agentes rompendo de maneira não específica a interação eletrostática entre o ligante ou matriz e as proteínas na superfície. Em um aspecto, o agente é o sulfato de amônio. Em outro aspecto, o vírus vaccinia pode ser eluído com GAG ou um ligante semelhante ao GAG. Em outro aspecto, o agente é cloreto de sódio, com maior preferência, com um gradiente de concentração de NaCl crescente que varia de 0,15 M a 2,0 M.

[0068] Antes do carregamento na matriz, pode-se realizar um pré-tratamento da suspensão de vírus, especificamente para remover contaminantes do vírus vaccinia na cultura de fase líquida. O pré- tratamento pode ser uma ou mais das etapas a seguir à parte ou em conjunto: homogeneização das células hospedeiras, tratamento com ultrassom, ciclos de congelamento-descongelamento, lise hipo-osmótica, tratamento à alta pressão, centrifugação, filtração, tratamento com nuclease, tratamento com protease, troca catiônica, precipitação seletiva.

[0069] Dependendo do agente usado para a eluição do vírus vaccinia ou vírus recombinante, pode-se realizar um pós-tratamento a fim de intensificar a pureza do preparado de vírus. O pós-tratamento pode incluir ultrafiltração ou diafiltração para a remoção adicional de impurezas e/ou agentes específicos ou não específicos usados para a eluição.

[0070] Normalmente, o valor do pH aumenta depois da eluição do vírus, em especial para um valor de pH de até 9 ou mais, em especial para pH 7,5, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,5, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,5, 9,6, 9,8, 10,0, 10,2, 10,4 ou 10,5.

[0071] A prática da invenção emprega técnicas da biologia molecular, análise proteica e microbiologia, que são de conhecimento dos versados na técnica. Essas técnicas são explicadas na íntegra, por exemplo, em Ausubel et al. 1995, eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York.

II. EXEMPLOS

[0072] Os exemplos a seguir são dados com o fim de ilustrar várias concretizações da invenção e não se destinam a limitar a presente invenção de qualquer maneira que seja. Os versados na técnica reconhecerão prontamente que a presente invenção é bastante adequada para se cumprir os objetivos e se chegar às finalidades e vantagens mencionadas, bem como aos objetivos, finalidades e vantagens implícitos no presente documento. Os presentes exemplos, junto com os métodos descritos neste documento, são atualmente representativos das concretizações preferidas, são exemplificativos e não são concebidos como limitações ao âmbito da invenção. Mudanças e outros usos dentro da essência da invenção, conforme definida pelo âmbito das Reivindicações, ocorrerão aos versados na técnica.

[0073] Testaram-se várias linhas celulares humanas para a produção de JX-594. Em suma, células HeLa, células A549, células MCF-7, células M14, células OS U-2 e células HeLa S3 suspensas e aderentes foram infectadas com JX-594 a uma multiplicidade de infecção de 0,1 e coletaram-se lisados 72 horas depois da infecção e determinou-se o título do vírus em células OS U-2. A figura 1 traz os resultados. Para a surpresa de todos, obtiveram-se bons resultados em células HeLa aderentes.

[0074] Examinaram-se vários parâmetros na tentativa de otimizar a produção do vírus em células HeLa aderentes. Descobriu-se que o pH do meio de infecção exerceu influência inesperadamente significativa na produção viral (vide a Fig. 2). A produção de JX-594 aumentou de cerca de 12 pfu/célula, em um meio de infecção com pH de 7,1, para cerca de 60 pfu/célula, em um meio de infecção com pH de 7,3 em condições, fora isso, idênticas. Quando o pH do meio de infecção foi abaixo de 7,1, a produção viral praticamente inexistiu. Observaram- se outras melhorias na produção viral quando a multiplicidade de infecção foi dentro da faixa de 0,005 e 0,05, em especial entre 0,01 e 0,03, e quando a temperatura foi mantida entre 36° C e 37,5° C durante e após a infecção. O uso de garrafas rotatórias plásticas como superfície aderente também contribuiu para a alta produção do vírus.

[0075] Também foi determinado que a presença e a quantidade de soro no meio usado para cultivar as células HeLa aderentes influenciaram na produção do vírus. A produção ideal foi obtida quando o meio conteve 10% de FBS - a redução na quantidade de soro no meio resultou em queda correspondente na produção do vírus. Não obstante, a otimização de outros parâmetros (por exemplo, pH, multiplicidade de infecção, superfície aderente) neutraliza a queda na produção atribuível a concentrações menores de soro até certo nível.

[0076] A presença e a quantidade de soro no meio de infecção, contudo, não influenciaram significativamente na produção do vírus. Sendo assim, para obter uma produção do vírus vaccinia surpreendentemente boa em células HeLa aderentes de acordo com a presente invenção, o meio de infecção pode compreender ou ser substancialmente isento de soro.

[0077] Segue um fluxograma delineando um exemplo não limitante do processo a montante otimizado:

[0078] Descongelamento das Ampolas e Expansão do Inóculo. O processo a montante é iniciado descongelando um número suficiente de ampolas de um banco celular. A suspensão celular resultante é incubada em um recipiente para cultura celular de poliestireno (636 cm) (Nunc Nalgene). As células são cultivadas usando um protocolo de cultura celular substancialmente aplicado a certa confluência (cerca de 80% a 95%) determinada por avaliação visual.

[0079] Na Passagem 1, o meio é removido e as células são enxaguadas com PBS e destacadas do recipiente de cultura. As células viáveis são contadas usando um Vi-CELL XR (Beckman Coulter) ou um hemocitômetro e, então, semeadas a uma densidade de 1 x 104 a 6 x 104 células/cm2 em quatro recipientes de cultura de poliestireno (área total de 2.544 cm2), cada um contendo 200 ml de Meio 100. A cultura é incubada a 37° C.

[0080] Se a cultura for semeada a 2 x 104, a data prevista para a próxima passagem é de 4 dias após a semeadura. Se a cultura for semeada a 4 x 104, a data prevista para a próxima passagem é de 3 dias após a semeadura. O processo é definido para proporcionar cerca de 1 x 105 células/cm2 em cada passagem.

[0081] Expansão da Cultura Celular em Garrafas Rotatórias. Na data prevista para a Passagem 2, o meio é removido e as células são enxaguadas com PBS e destacadas dos recipientes de cultura de poliestireno.

[0082] As células são semeadas a uma densidade de 1 x 104 a 6 x 104 células/cm2 em duas garrafas rotatórias (GRs, Cellon) de poliestireno com Superfície Estendida (SE) em um aparelho de garrafas rotatórias RC-40 (Synthecon, área de superfície total de 8.400 cm2). Cada garrafa é cultivada contendo 900 ml de Meio 100 e a cultura celular é incubada a 37° C em uma Incubadora RC-40 (Sanyo).

[0083] Na data prevista para a Passagem 3, o meio de cultura celular é removido e as células são enxaguadas com PBS e destacadas. A suspensão celular é coletada das garrafas com superfície estendida, misturada com Meio 100 a 1:1 e as células viáveis são contadas. A quantidade aproximada da suspensão celular é, então, semeada em 4 GRs SE (área de superfície total de 16.800 cm2) de 1 x 104 a 6 x 104 células/cm2. A cultura celular é incubada a 37° C com 900 ml de meio em cada garrafa.

[0084] Durante a Passagem 4, a cultura celular é transferida a 10 GRs (área de superfície total de 42.000 cm2) e, durante a Passagem 5, a cultura celular é expandida para 20 GRs (área de superfície total de 84.000 cm2). A Passagem 6 é a primeira etapa crítica no processo de produção de JX-594, visto que a cultura celular é expandida para 40 GRs (área de superfície total de 168.000 cm2). A densidade de semeadura das 40 GRs é fundamental para a produção de JX-594 e tem um alvo definido de 4 x 104 células/cm2. Amostras da suspensão celular e do meio condicionado são coletadas durante a Passagem 6 para o teste de DNA e o teste de agentes acidentais. A temperatura da cultura celular durante o período de semeadura na produção é mantida em 37° C.

[0085] Infecção e Produção de JX-594. O intervalo de tempo desde a semeadura das 40 GRs até a infecção com ampolas de JX-594 do Banco de Vírus Mestre ou do Banco de Vírus de Trabalho é previsto para durar 72 horas. No dia da infecção, o meio é removido da cultura celular e substituído por Meio 100 fresco contendo 1 x 104 pfu/ml do vírus JX-594. O título do meio de infecção é um parâmetro processual importantíssimo e tem um alvo definido de 1 x 104 pfu/ml. A densidade celular não é contabilizada no momento da infecção, mas espera-se que seja de 1 x 105 células/cm2 com base no histórico de passagem. A duração da infecção é controlada dentro da faixa de 40 a 80 horas e é, de preferência, de cerca de 44 horas. A temperatura da cultura celular durante a infecção é um parâmetro processual importantíssimo e é controlado para permanecer em 37° C.

[0086] Títulos do vírus de até ou mesmo mais que 100 pfu/célula costumam ser obtidos de acordo com o processo.

[0087] Processo a Jusante de JX-594. Métodos clássicos para o preparo em pequena escala do poxvírus a partir de células incluem a lise hipotônica, seguida por ciclos de congelamento- descongelamento e sonicação. A presente invenção descobriu que tanto o congelamento/descongelamento quanto a sonicação são etapas largamente desnecessárias, que, geralmente, resultam em menores títulos do vírus. Logo, o processamento a jusante de JX-594 faz uso do tratamento com nuclease (Benzonase), para digerir o DNA HeLa, e do tratamento com protease (TrypLE™ Select), para digerir proteínas HeLa, seguidos por filtração por fluxo tangencial (TFF). O tratamento da cultura bruta (contendo vírus e resíduo celular em tampão de lise hipotônica) com benzonase resultou em significativamente menos DNA hospedeiro (HeLa) contaminante no preparado (vide a Fig. 3). Sendo assim, o tratamento com nuclease combinado com TFF proporciona um preparado de vírus significativamente mais puro com significativamente menos proteínas e DNA do hospedeiro contaminantes no preparado ao mesmo tempo em que se mantém o título infeccioso do vírus. Em particular, a redução na contaminação por DNA de 40 μg de DNA/dose para 4 μg de DNA/dose e a redução da contaminação por proteínas de 12 mg de proteínas/dose para 4 mg de proteínas/dose (dose = 1 x 109 pfu de JX-594) foram obtidas usando uma combinação do tratamento com nuclease/protease e TFF. Outras reduções podem ser obtidas empregando uma ou mais etapas cromatográficas. Em um aspecto, as uma ou mais etapas cromatográficas compreendem cromatografia por troca iônica. Em outro aspecto, as uma ou mais etapas cromatográficas compreendem cromatografia por pseudo-afinidade, de preferência, com base na heparina (ou moléculas semelhantes à heparina) ou celulose sulfatada, tirando proveito da capacidade de ligação da heparina da proteína A47L do vírus vaccinia. Em ainda outro aspecto, as uma ou mais etapas cromatográficas compreendem cromatografia por absorção da membrana, por exemplo, cromatografia por afinidade da membrana. As membranas preferidas terão uma estrutura microporosa com tamanho dos poros de ao menos 3 μM.

REFERÊNCIAS

[0088] As referências a seguir, na medida em que indicam procedimentos exemplificativos e outros detalhes complementares aos definidos neste documento, incorporam-se especificamente ao presente documento por referência. 1. B. Moss, in Fields' virology B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, Eds. (Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, 2001) pp. 2.849 a 2.883. 2. J. B. Johnston, G. McFadden, Cell Microbiol 6, 695 (agosto de 2004). 3. C. J. Breitbach et al., Mol Ther 15, 1686 (setembro de 2007). 4. J. H. Kim et al., Mol Ther 14, 361 (setembro de 2006). 5. R. M. Buller, G. L. Smith, K. Cremer, A. L. Notkins, B. Moss, Nature 317, 813 (31 de outubro 31 a 6 de novembro de 1985). 6. R. M. Buller, G. J. Palumbo, Microbiol Rev 55, 80 (março de 1991). 7. M. Hengstschlager et al., J Biol Chem 269, 13836 (13 de maio de 1994). 8. T. C. Liu, E. Galanis, D. Kirn, Nat Clin Pract Oncol 4, 101 (fevereiro de 2007). 9. C. Y. Li, Q. Huang, H. F. Kung, Cell Mol Immunol 2, 81 (abril de 2005). 10. J. W. Hodge et al., Front Biosci 11, 788 (2006). 11. P. D. Ellner, Infection 26, 263 (setembro a outubro de 1998). 12. F. Fenner, Prog Med Virol 23, 1 (1977). 13. A. W. Artenstein et al., Vaccine 23, 3301 (9 de maio de 2005). 14. T. P. Monath et al., Int J Infect Dis 8 Suppl 2, S31 (outubro de 2004). 15. Z. S. Guo, D. L. Bartlett, Expert Opin Biol Ther 4, 901 (junho de 2004). 16. E. De Clercq, Adv Virus Res 42, 1 (1993). 17. L. A. Palomares, M. Gonzalez, O. T. Ramirez, Enzyme Microb Technol 26, 324 (1 de março de 2000). 18. B. Horowitz, M. E. Wiebe, A. Lippin, M. H. Stryker, Transfusion 25, 516 (novembro a dezembro de 1985). 19. M. P. Piet et al., Transfusion 30, 591 (setembro de 1990). 20. B.Chun, Y. Kwon Lee, W. G. Bang, N. Chung, Biotechnol Lett 27, 243 (fevereiro de 2005). 21. B. H. Chun, Y. K. Lee, B. C. Lee, N. Chung, Biotechnol Lett 26, 807 (maio de 2004). 22. J. A. McCart et al., Cancer Res 61, 8751 (15 de dezembro de 2001). 23. S. H. Thorne et al., J Clin Invest 117, 3350 (novembro de 2007). 24. A. M. Naik et al., Hum Gene Ther 17, 31 (janeiro de 2006). 25. J. A. McCart et al., Mol Ther 10, 553 (setembro de 2004). 26. A. Piccini, E. Paoletti, Adv Virus Res 34, 43 (1988). 27. C. S. Chung, J. C. Hsiao, Y. S. Chang, W. Chang, J Virol 72, 1577 (fevereiro de 1998). 28. A. Karger, B. Bettin, H. Granzow, T. C. Mettenleiter, J Virol Methods 70, 219 (fevereiro de 1998).

Claims

1. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, caracterizado por compreender: (a) infectar células HeLa aderidas a uma superfície de biorreator de cultura celular com um vírus vaccinia da cepa Western Reserve colocando as células HeLa em contato com o vírus vaccinia a uma multiplicidade de infecção (m.o.i) entre 0,005 e 1,0 unidades formadoras de placa (pfu)/célula; (b) cultivar as células infectadas num meio de infecção tendo um pH de 7,2 a 7,6 a uma temperatura de 30 °C a 40 °C; e (c) colher o vírus vaccinia da cultura, através do qual é produzido pelo menos 50 pfu de vírus vaccinia por célula de HeLa, calculado como

2. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície do biorreator de cultura celular compreende uma área de cultura cumulativa de pelo menos 168.000 cm2.

3. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH do meio de infecção é de 7,2 a 7,4.

4. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o pH do meio de infecção é de 7,3.

5. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a m.o.i. da etapa (a) é de 0,01 pfu/célula a 0,05 pfu/célula.

6. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a m.o.i. da etapa (a) é de 0,02 pfu/célula a 0,03 pfu/célula.

7. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são realizadas a uma temperatura de 32 °C a 37,5 °C.

8. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são realizadas a uma temperatura de 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C ou 37 °C.

9. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada por um período de 40-80 horas.

10. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada por um período de 44 horas.

11. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 75 pfu de vírus vaccinia por célula de HeLa é produzido calculado como o rendimento total de vírus (pfu)/número total de células HeLa viáveis na etapa (a).

12. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio compreende soro bovino fetal numa quantidade igual ou inferior a 10% em volume do meio.

13. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio deixa de compreender soro.

14. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o vírus colhido é submetido a uma ou mais etapas de purificação, em que referidas uma ou mais etapas de purificação compreendem tratamento do vírus colhido com uma nuclease para remover os ácidos nucleicos das células HeLa e/ou uma protease para remover as proteínas das células HeLa e/ou uma etapa de filtração de fluxo tangencial e/ou uma etapa de cromatografia de afinidade de heparina e/ou uma etapa de cromatografia de absorção de membrana.

15. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus vaccinia é um vírus vaccinia recombinante, que carece de um gene de timidina quinase funcional e/ou que carece de um gene de fator de crescimento de vaccinia funcional e/ou que codifica um polipeptídeo de fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos.

16. Método Para Produzir Vírus Vaccinia, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o vírus vaccinia carece de um gene de timidina quinase funcional e carece de um gene de fator de crescimento de vaccinia funcional.