KR20140058601A

KR20140058601A - 백시니아 바이러스의 생산을 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20140058601A
Application number: KR1020147005901A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 컨; 존 벨
Original assignee: 제네렉스, 인코포레이티드
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2014-05-14
Also published as: ES2813413T3; JP6243333B2; CN103732236B; US10767166B2; US9719105B2; US20190169578A1; EP2739293A1; US20140162342A1; CN103732236A; EP2739293B1; AU2012294606A1; JP2014521353A; DK2739293T3; BR112014000787B1; CA2841831C; AU2012294606B2; WO2013022764A1; KR102022952B1; US10202581B2; CA2841831A1

Abstract

본 발명의 소정 실시형태는 백시니아 바이러스의 대규모 생산을 위한 바이러스 생산 공정들에 관한 것이다.

Description

백시니아 바이러스의 생산을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR PRODUCTION OF VACCINA VIRUS}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2011년 8월 5일자로 출원된, 미국 가특허 출원 제61/515,724호의 이익을 주장하며, 이의 전문은 인용에 의해 본원에 포함된다.

발명의 배경

I. 발명의 분야

본 발명의 실시형태들은 일반적으로 바이러스학, 의학, 및 바이러스 치료학에 관한 것이다. 소정 실시형태들은 바이러스 생산 방법에 관한 것이다.

II. 배경

종양 분해성 바이러스(oncolytic virus: OV)는 종양 세포에서 특이적으로 성장하여 이들을 사멸시키도록 설계되거나 선택된, 복제성 치료제이다. 몇몇의 그룹은 전-임상 동물 모델, 및 사람에서의 조기 임상 데이터를 기준으로 한 상업화의 초기 단계에 있다. 그러나, 당해 분야에서 여전히 직면하고 있는 과제는 환자들에게 전달하기 위한 대규모 약제학적 등급의 바이러스를 제조하는 것이다. 바이러스들은 합성된 약물이라기보다는 오히려 생물학적 실체이므로, 제조 공정은 세포 내에서 바이러스의 생산 및 감염 효력을 유지하면서 오염성 세포 잔해의 후속적인 제거를 포함한다. 지금까지, 전부는 아니지만 사람 용도를 위한 백시니아 바이러스 생성물의 상업적인 제조 대부분이 비-사람 세포 배양물에서 백신으로 존재하여 왔다. 일반적으로, 백신 적용을 위해, 환자들은, 오염성 세포 단백질이 실제로 항원보강제(adjuvant)로 작용하여 제제의 면역원성을 증가시킬 수 있는 국소 부위(흔히 근육내)내에 저 용량의 바이러스들을 제공받는다. 대조적으로, 종양 분해성 바이러스 치료제의 경우, 필요한 바이러스의 용량은 백신 적용을 위한 용량보다 백만배까지 더 크고, 정맥내, 두개내, 복강내 또는 직접 종양 주사에 의해 투여될 수 있다. OV의 경우, 오염성 비-사람 세포 잔해가 제거된 다량의 바이러스를 제조할 수 있는 것이 중요하다. 또한, 백시니아 바이러스는 바이러스 막 내에 숙주 세포 단백질을 포함시키는 외피 바이러스(envelope virus)이다. 바이러스 외피에의 사람 단백질의 포함은 사람 숙주 면역계에 의해 검출되지 않고 이동하는 능력을 증가시킬 것이다.

대규모의 종양 분해성 바이러스 생산을 위한 추가의 방법 및 조성물에 대한 요구가 남아 있다.

본 발명의 요약

백시니아 바이러스는 현탁액 배양물에서 성장된 HeLa 세포에서 생산되어 왔다. 그러나, 현탁액 배양 조건들은 현재 바이러스의 대규모 생산에 적합하지 않다. 따라서, 백시니아 바이러스의 대규모 또는 시판 규모의 생산이 HeLa 세포를 사용하여 성공적으로 시도되지 않았다. 더욱이, 부착성 HeLa 세포주들은, 충분한 수의 세포를 생산하여, 부착성 HeLa 세포를 사용하여 대규모 생산에 필요한 양으로 백시니아 바이러스를 생산하는 것이 보장될 것으로 기대되지 않았다. 본 출원은 부착성 HeLa 세포를 사용하여 백시니아 바이러스를 생산하기 위한 대규모 공정을 기술한다.

소정 실시형태들은, 다음 단계들 중 하나 이상을 포함하는 백시니아 바이러스의 생산 방법에 관한 것이다.

소정 양상에서, 당해 방법은 부착성 HeLa 세포를 백시니아 바이러스와 접촉시킴으로써 표면에 부착된 HeLa 세포를 백시니아 바이러스로 감염시키는 것을 포함한다. 바람직하게, 백시니아 바이러스는, 이의 전문이 인용에 의해 본원에 포함된, 미국 특허 출원 공보 제2009/0004723호의 단락 [0028] 내지 [0052]에 기술된 것과 같은 재조합체 백시니아 바이러스이다. 소정 실시형태에서, 페트리 디쉬(petri dish)에 부착된 HeLa 세포는 특허청구범위의 범위로부터 특이적으로 배제된다. 몇몇의 실시형태들에서, 본 발명은, (a) 표면에 부착된 HeLa 세포를 백시니아 바이러스로 감염시키는 단계, (b) 감염된 세포를 후손 바이러스(progeny virus)의 생산이 허용되는 조건 하에서 배양시키는 단계, 및 (c) 배양물로부터 백시니아 바이러스를 수거하는 단계를 포함하는, 백시니아 바이러스의 생산 방법을 제공한다.

몇몇의 실시형태에서, 백시니아 바이러스의 생산 방법으로서, (a) 적어도 1x1O⁷, 1x1O⁸, 5x10⁸, 1x1O⁹, 5x10⁹, 1x1O¹⁰, 5x10¹⁰, 1x1O¹¹, 5x10¹¹, 1x1O¹², 5x10¹², 1x1O¹³, 5x10¹³ 이상의 부착성 HeLa 세포(이들 사이의 모든 값 및 범위를 포함한다)를 백시니아 바이러스 조성물과 접촉시킴으로써, 표면에 부착된 HeLa 세포를 재조합체 백시니아 바이러스로 감염시키는 단계; 및 (b) 감염된 세포를, 세포당 50, 60, 70, 80, 90, 100 이상의 재조합체 백시니아 바이러스(이들 사이의 모든 값 및 범위를 포함한다)의 생산이 허용되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 백시니아 바이러스의 생산 방법이 제공된다. 바람직하게, HeLa 세포당 적어도 50 플라크 형성 단위(plaque forming unit: pfu)의 백시니아 바이러스가 당해 방법들에 따라 생산되고, 보다 바람직하게는 HeLa 세포당 적어도 75pfu의 백시니아 바이러스가 생산된다.

다른 실시형태에서, 표면에 부착된 HeLa 세포는 백시니아 바이러스로 0.001 내지 1.0, 바람직하게는 0.005 내지 0.5, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.1의 감염 다중도(multiplicity of infection: m.o.i.)로 감염된다. 특히 바람직한 실시형태에서, m.o.i.는 0.01 내지 0.05이며, 이들 사이의 모든 값 및 범위도 포함된다. 다른 바람직한 실시형태에서, m.o.i.는 0.015 내지 0.03이다. 용어 "감염 다중도" 또는 "m.o.i."는 감염 동안 HeLa 세포당 첨가된 바이러스의 플라크 형성 단위(pfu)의 비를 말한다.

관련 실시형태에서, 약 10⁴ 내지 약 10⁶개의 HeLa 세포/㎠, 바람직하게는 약 10⁵개의 HeLa 세포/㎠의 밀도로 부착된 HeLa 세포는, 당해 방법에 따른 백시니아 바이러스로 감염되고, 여기서, 백시니아 바이러스의 농도는 10³ 내지 10⁵ pfu/ml, 바람직하게는 약 10⁴ pfu/ml이다.

부착성 HeLa 세포의 배양. 당해 방법들에 따른 백시니아 바이러스로 감염시키기 위한 부착성 HeLa 세포는, 유리 및 플라스틱 용기, 예를 들면, Nunclon^® Cell Factories™와 같은 세포 팩토리(cell factory), 코닝 라이프 사이언시즈(Corning Life Sciences)로부터의 CELLCUBE^® 시스템과 같은 세포 큐브(cell cube), Gibco^® 또는 Lampire^® 세포 배양 백(bag)과 같은 세포-지지 매트릭스로 충전된 연질 플라스틱 백(예: 주입 백); 롤러 병(roller bottle); Magna-Flex^® 스피너 플라스크(Spinner Flask)와 같은 스피너 병(spinner bottle); 발효기; 또는 셀렉스 바이오사이언시스(Cellex Biosciences)로부터의 세포 배양 시스템(AcuSyst^® 중공 섬유 반응기), BioVest(Cell-Pharm^® 시스템 100 또는 시스템 2500) 또는 Fibercell™을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 생물반응기에서의 성장을 포함하는(그러나, 이들에 한정되지 않음) 임의의 적합한 방법에 의해서 배양될 수 있다. 생물반응기는 온도 및 pH와 같은 변수들을 정밀하게 모니터링하고 제어하는 것이 가능하기 때문에 생물반응기에서의 배양이 바람직하다. 소정 양상에서, CellBind™ 플라스틱웨어(www.sigmaaldrich.com)를 사용할 수 있다. 세포 배양물은, 세포 클러스터, 예를 들면, 미세 담체 비드 상의 회전타원체 또는 스캐폴드(scaffold) 상의 세포(예를 들면, 생분해성 스캐폴드), 조직, 또는 조직 오르가노이드(tissue organoid)의 형태로 존재할 수 있다. 소정 양상에서, 부착성 HeLa 세포는 미세 담체, 세포 큐브, 세포 팩토리, T-플라스크, 또는 롤러 병 용기에서 배양된다. 바람직한 실시형태에서, 부착성 HeLa 세포는 하나 이상의 롤러 병들에서, 예를 들면, 롤러셀(RollerCell) 40 장치[제조원: 룩셈부르크 소재의 셀론 에스.에이.(Cellon S.A.)]를 사용하여 배양된다. 사용된 용기는 약, 적어도, 또는 최대 1,700; 5,000; 10,000; 25,000; 50,000; 100,000; 150,000; 200,000; 500,000㎠(이들 사이의 모든 범위 및 값이 포함된다)의 누적된 배양 면적을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 소정 양상에서, 용기는, 168,000㎠ 이상의 누적 배양 면적을 갖는다.

백시니아 바이러스로 감염되는 부착성 HeLa 세포는, BME[기초 이글 배지(basal Eagle Medium)], MEM(최소 이글 배지), 배지 199, DMEM[둘베코 변형 이글 배지(Dulbccco's modified Eagle Medium)], GMEM[글라스고우 변형 이글 배지(Glasgow modified Eagle medium)], DMEM-HamF12 및 Ham-F1O, 이스코브 변형 둘베코 배지(Isocove's Modified Dulbecco's medium), 맥코이 5A 배지(MacCoy's 5 A medium), 또는 RPMI 1640를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 성장, 유지 및 세포 지지체 표면에 대한 부착을 지지하는 임의의 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 바람직하게, 배양 배지는 정의된 배양 배지이다. 한 양상에서, 배양 배지는 실질적으로 혈청을 포함하지 않는다. HeLa 세포들과 함께 사용하기에 최적화된 혈청 불포함 배지의 예로는 VP-SFM[기브코 비알엘(Gibco BRL)/라이프 테크놀로지스(Life Technologies)], Ex-Cell^® HeLa 혈청 불포함 배지(SFM)[제조원: 시그마 알드리히(Sigma Aldrich)], 및 퀀텀(Quantum) 101[제조원: 지이 헬스케어(GE Healthcare)]이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시형태에서, 배양 배지는 태아 소 혈청(FBS)과 같은 동물 혈청도 포함할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 5% 내지 10%의 혈청(예를 들면, FBS)를 포함할 수 있거나 5% 미만의 혈청(예를 들면, FBS)를 함유할 수 있거나, 또는 이들 사이의 임의의 범위 또는 값을 함유할 수 있다. 한 실시형태에서, 배양 배지는 10% FBS와 같이, 5% 내지 10%의 FBS가 보충된 DMEM이다.

용어 "미세 담체"는, 세포를 배양하는데 사용하기 위한, 그리고, 세포가 부착될 수 있는, 작은 별개의 입자를 의미한다. 미세 담체는 막대, 구(sphere) 등과 같은 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다. 많은 실시형태에서, 미세 담체는, 피복되어 세포 배양에 적합한 표면을 제공하는 미세 담체 기재를 포함한다. 폴리펩타이드는 표면 피복에 결합되거나, 절편이식되거나, 또는 그렇지 않으면 부착될 수 있다. 미세 담체는 고수율의 부착-의존성 세포를 제공할 목적으로 세포 배양물에 사용되어 왔다. 미세 담체는 전형적으로 세포 배양 배지에서 스터링되거나(stirred) 교반되고, 보다 전통적인 배양 장비에 비하여, 매우 큰 부착 및 성장 표면적 대 체적 비를 제공한다. 미세 담체의 상세한 예에 관해서는 미국 특허 공보 제2011/0027889호를 참조하고, 이 문헌의 전문은 인용에 의해 본원에 포함된다.

소정 실시형태에서, 백시니아 바이러스는, IHD-J, 와이어스(Wyeth), 웨스턴 리저브(Western Reserve), 또는 코펜하겐(Copenhagen) 스트레인(strain)의 백시니아 바이러스이다. 소정 양상에서, 백시니아 바이러스는 재조합체 백시니아 바이러스이다. 재조합체 백시니아 바이러스는 이종 암호화 영역을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이종 암호화 영역은, 백시니아 바이러스 게놈에서 천연적으로 발견되지 않는 암호화 영역이다. 소정 양상에서, 이종 암호화 영역은 면역자극성 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 면역자극성 폴리펩타이드는 사이토카인, 예를 들면, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

소정 양상에서, 재조합체 백시니아 바이러스는 종양 세포에서 선택적으로 복제한다. 재조합체 백시니아 바이러스는 내인성 유전자 내에 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 핵산 서열의 결실, 핵산 잔기의 치환, 또는 백시니아 바이러스의 기능 또는 발현에 영향을 미치는 하나 이상의 핵산 잔기의 삽입일 수 있다. 당해 돌연변이는 종양 세포에서의 선택적 성장 또는 비-종양 세포에서의 약화된 성장 또는 종양 세포에서의 향상된 성장 또는 이들의 조합을 초래할 수 있다. 내인성 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 재조합체 백시니아 바이러스는 티미딘 키나제 결핍성(TK^-) 백시니아 바이러스(즉, 암호화된 폴리펩타이드가 비기능성이 되도록 하는 티미딘 키나제를 암호화하는 유전자 내에 돌연변이를 갖는 백시니아 바이러스)일 수 있다. 소정 양상에서, 내인성 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 재조합체 백시니아 바이러스는, IHD-J, 와이어스, 웨스턴 리저브, 또는 코펜하겐 스트레인의 백시니아 바이러스이고/이거나 이종 암호화 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 내인성 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 백시니아 바이러스는 이종 암호화 영역, 예를 들면, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 폴리펩타이드 암호화 영역도 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

감염된 HeLa 세포의 배양. 백시니아 바이러스와 접촉되었던, 부착된 HeLa 세포는 후손 백시니아 바이러스의 생산이 허용되는 조건 하에서 배양된다. 배양 조건으로는, 정의된 감염 배지, 정의된 pH, 정의된 배양 용기, 정의된 온도 또는 온도 범위, 정의된 세포수, 정의된 세포 컨플루언시(cell confluency), 정의된 물리적 조작(예를 들면, 효소 또는 화학적 처리, 회전 빈도, 진탕 속도 등), 정의된 기체 상의 상태, 정의된 배양 시간, 정의된 세포 식종 밀도, 및 정의된 수의 세포 계대를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한 양상에서, 바이러스는, 부착성 HeLa 세포를 제조하는데 사용되는 HeLa 세포 배양 배지에 단순히 첨가될 수 있고, 이 경우에 배양 배지 및 감염 배지는 동일하다. 다른 양상에서, 부착성 HeLa 세포를 제조하는데 사용되는 배양 배지는 감염 단계에서 제거되고, 백시니아 바이러스와 접촉된 HeLa 세포는, 혈청을 포함할 수 있거나 혈청을 실질적으로 포함하지 않을 수 있는, 감염 배지를 이용하여, 후손 바이러스가 생산될 때까지 배양된다. 적합한 감염 배지로는 BME, MEM, 배지 199, DMEM, GMEM, DMEM-HamF12 및 Ham-F1O, 이스코브 변형된 둘베코 배지(Isocove's Modified Dulbecco's medium), 맥코이 5A 배지, 또는 RPMI 1640가 포함되지만, 이들에 한정되지 않으며, 이들 중 어느 것이라도 임의로 혈청 보충될 수 있다. 또한, 혈청 불포함 배지, 예를 들면, VP-SFM, Ex-Cell^® HeLa 혈청 불포함 배지(SFM), 및 퀀텀 101도 감염 배지로서 사용하기에 적합하다.

소정 양상에서, 감염된 세포는, 5 내지 10%의 혈청[예를 들면, 태아 소 혈청(FBS)]을 포함하는 감염 배지에서, 약 7, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5. 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8의 pH, 바람직하게는 7.1 초과의 pH, 보다 바람직하게는 7.2 초과의 pH, 가장 바람직하게는 약 7.3의 pH에서 배양된다. 다른 양상에서, 세포는, 5% 미만의 혈청(예를 들면, FBS), 예를 들면, 0%의 혈청(예를 들면, FBS)을 포함하는 감염 배지에서, 약 7, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5. 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8의 pH, 바람직하게는 약 7.1 초과의 pH, 보다 바람직하게는 약 7.2 초과의 pH, 가장 바람직하게는 약 7.3의 pH에서 배양된다. 관련 양상에서, 세포는, 약 7.3의 pH에서 0% 내지 10%의 혈청(예를 들면, FBS)을 포함하는 감염 배지에서 배양된다. 다른 실시형태에서, 세포는, 7.2 초과 및 7.6 미만의 pH에서, 0% 내지 10%의 혈청(예를 들면, FBS)을 포함하는 감염 배지에서 배양된다. 바람직한 실시형태에서, 감염 배지는 DMEM 및 임의로 100 내지 300mM의 글루타민을 포함한다. 세포는 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40℃의 온도에서 배양될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 36 ℃ 내지 37.5℃, 바람직하게는 37℃의 온도에서 배양된다. 소정 양상에서, 감염 배지는 덱스트란 설페이트, 플루로닉(Pluronic) F-68, 트윈(Tween)-80 및/또는 대두 단백질 가수분해물 중 하나 이상을 특이적으로 배제할 것이다. 바람직한 실시형태에서, 감염 배지는 덱스트란 설페이트 및 다음 성분들 중 하나 이상을 특이적으로 배제한다: 플루로닉 F-68, 트윈-80 및 대두 단백질 가수분해물. 다른 바람직한 실시형태에서, 감염 배지는 실질적으로 이들 성분을 전부 포함하지 않는다.

당해 방법은 감염 전 내지 감염 동안, 또는 감염 후에 HeLa 세포 배양물을 확장시킴을 추가로 포함할 수 있다. HeLa 세포는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 배양 용기들, 예를 들면, 롤러 병 배양 용기들을 통해 계대배양할 수 있다. 소정 양상에서, 세포는, 프로테아제 및/또는 콜라겐분해 효소, 예를 들면, HyQtase^®를 포함하는 탈착 용액으로 처리함으로써 표면으로부터 탈착된다. 각각의 용기는 이전의 배양 용기와 비교하여 증가된 배양 면적을 가질 수 있다. 소정 양상에서, 배양 용기는 적어도 84,000㎠ 내지 1,000,000㎠의 총 배양 면적을 가진다. 소정 양상에서, 최종 계대배양은 적어도 168,000㎠의 배양 면적을 갖는 배양 용기에 대한 것이다.

소정 실시형태에서, 배양 용기의 식종(seeding)과 감염 사이의 시간 간격은 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144시간 또는 그 이상이고, 이들 사이의 모든 값 및 범위도 포함된다. 소정 양상에서, 부착성 HeLa 세포는, 1x10¹, 1x10², 1x10³, 1x10⁴, 1x1O⁵, 1x1O⁶, 1x1O⁷, 1x10⁸, 1x10⁹pfu/mL(이들 사이의 모든 값 및 범위를 포함한다)의 백시니아 바이러스와 접촉된다. 바람직한 실시형태에서, 부착성 HeLa 세포는 약 10⁴ 내지 약 10⁶개의 HeLa 세포/㎠, 바람직하게는 약 10⁵개의 HeLa 세포/㎠의 밀도로 10³ 내지 10⁵pfu/ml의 백시니아 바이러스, 보다 바람직하게는 약 10⁴pfu/ml의 백시니아 바이러스와 접촉된다.

소정 양상에서, 당해 방법은, 부착성 HeLa 세포들에 의해 생산된 백시니아 바이러스를 단리함을 포함한다. 수거된 백시니아 바이러스는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 농축되고 정제될 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태는, 미국 특허 출원 공보 제2009/0004723호의 단락 [0295] 내지 [0303]에 기술된 바와 같은, 본원에 기술된 방법들에 의해 생산된 백시니아 바이러스 조성물에 관한 것이고, 상기 문헌의 전문은 인용에 의해 본원에 포함된다.

본 발명의 다른 실시형태는 본 출원에 걸쳐 논의된다. 본 발명의 한 양상에 관해 논의된 임의의 실시형태는 본 발명의 다른 양상에도 적용되고, 이의 역으로도 적용된다. 실시예 단락에서의 실시형태는 본 발명의 모든 양상에 적용가능한 본 발명의 실시형태인 것으로 이해된다.

특허청구범위 및/또는 명세서에서의 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우에 단어 "하나"("a" 또는 "an")의 사용은 "하나"("one")를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.

본원에 논의된 임의의 실시형태는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 시행될 수 있으며, 이의 역으로도 시행될 수 있음이 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물 및 키트(kit)를 사용하여 본 발명의 방법을 달성할 수 있다.

본 출원에 걸쳐, 용어 "약"은, 하나의 값이 당해 값을 측정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.

특허청구범위에서의 용어 "또는"의 사용은,

당해 기재내용이 단지 대안만을 나타내는 정의 및 "및/또는"을 지지하더라도, 단지 대안만을 나타내거나, 대안이 상호 배타적임을 명쾌하게 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 또한, 용어 "또는"을 사용하여 열거되는 모든 것은 특이적으로 배제될 수 있음이 고려된다.

본 명세서 및 특허청구범위(들)에 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)"(및 임의의 형태의 포함하는, 예를 들면, "포함하다" 및 "포함한다" 등), "갖는"(및 임의의 형태의 갖는, 예를 들면, "갖다" 및 "가지다"), "포함하는(including)"(및 임의의 형태의 포함하는, 예를 들면, "포함하다" 및 "포함한다") 또는 "함유하는(containing)"(및 임의의 형태의 함유하는, 예를 들면, "함유하다" 및 "함유한다")은 포괄적이거나 오픈 엔드이고, 추가의 열거되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제시키지 않는다.

본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형이 당해 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이므로, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는, 본 발명의 구체적인 실시형태를 나타내는 한편, 단지 설명의 방법으로서 제공된다.

다음 도면은 본 명세서의 부분을 구성하고, 본 발명의 소정 양상을 추가로 입증하는 것으로 의도된다. 본 발명은 본원에 나타낸 특정 실시형태의 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중 하나 이상을 참조하여 보다 더 이해될 수 있다.
도 1은 다양한 사람 세포주에서의 재조합체 백시니아 바이러스 스트레인 JX-594(pfu/세포)의 생산을 도해한다. 세포는 0.1의 감염 다중도로 감염되었고, 감염 후 72시간째에 분해물을 수집하여 U-2 OS 세포에 대해 역가를 측정하였다.
도 2는 부착성 HeLa 세포에서의 재조합체 백시니아 바이러스 스트레인 JX-594의 생산시 감염 배지의 pH의 효과를 도해한다. 세포는 표시된 pH의 배지에서 0.1의 감염 다중도로 감염되었고, 감염 후 72시간째에 분해물을 수집하여 U-2 OS 세포에 대해 바이러스 역가를 측정하였다.

발명의 상세한 설명

백시니아 바이러스는, 이들의 외부 막이 상이한 4개의 감염 형태들: 세포내 성숙한 비리온(IMV), 세포내 외피 비리온(IEV), 세포-관련 외피 비리온(CEV) 및 세포외 외피 비리온(EEV)을 생산하는 외피 바이러스이다. EEV 형태는 상보성 활성화의 숙주 조절인자들의 외부 EEV 막 내로의 숙주 세포 포함으로 인하여 상보체에 대해 내성이다[참조: Vanderplasschen et al, (1997) PNAS 95:7544-7549]. 숙주 면역계에 의한 인식을 피하는 일반적인 능력 및 상보체 불활성화를 피하는 능력은 환자들에서 전신계 전달시 효능을 위한 중요한 특성이다.

IMV의 혈장 막은 이의 조립 동안 다수의 숙주 세포 단백질을 혼입시킨다. IMV는 대다수의 감염성 후손을 나타내므로, 종양 분해성 바이로테라피(oncolytic virotherapy)를 위한 표적 환자와 동일한 종 유래의 생산자 세포가, 바이러스가 덜 면역원성이 될 것이므로 환자 내에서 전신 확산에 유리할 수 있다. 또한, IMV 혈장 막 상의 이들 숙주 세포 단백질도 감염 공정에서 소정의 장점을 제공할 수 있다.

비록 IMV가 대다수의 감염성 후손이지만, 바이러스의 EEV 형태가 세포 배양 제제에 함유되지 않는다는 사실은 명확하게 확립되어 있지 않다. 표적 환자와 동일한 종 유래의 상보체 활성화 조절 단백질은 상보체 활성화 억제에 있어 중요한 역할을 할 수 있으므로, 숙주 면역계에 의한 면역 정화를 피할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 사람 세포 구성성분을 이용하여 다량의 백시니아 바이러스를 생산하기 위한 시스템을 개발하였다.

역사적으로, 백신으로서 사용하기 위한 백시니아 바이러스를 사람 딱지(scab)로부터 생산하였으나, 후속적으로 이는 송아지, 양 및 물소의 피부 상에서, 닭 배아의 융모요막 내에서 또는 원시 소 배아 섬유아세포 상에서 성장되었다(참조: Ellner, 1998). 천연두 근절에 있어서 지구 전체의 집중된 노력을 위해, 송아지의 피부의 난절법(scarification)을 통한 감염에 의해 스톡을 생산하였다(참조: Fenner, 1977). 바이러스 스톡을 송아지 림프로부터 제조하였고, 이 제형은 DRYVAX®[제조원: 와이어스(Wyeth)]로 공지되어 있는 허가되어 구입가능한 유일한 백신이다. 바이러스 제제를 농축시키고 동결건조시켰으며, 이는 바이러스 제제의 안정성의 이유가 된다(참조: Fenner, 1977). 이는 적어도 10⁸pfu/ml의 농도의 동결건조된 재료로 생산되었다. 이는 주사용 멸균수 중에 50%의 글리세린 및 0.25%의 페놀에서 재구성되었고, 이분 침(bifurcated needle)의 사용을 통해(참조: Fenner, 1977), 대략 2.5x10⁵pfu(이는 종양 분해성 바이러스로서 백시니아 바이러스의 표준 10⁹pfu(또는 그 이상)의 용량보다 적어도 10⁴-배 더 낮다)로의 용량으로 400개 정도로 많은 백신에 피내 전달된다.

종양 분해성 백시니아 바이러스에 대한 선도 임상 후보물(lead clinical candidate)은 GM-CSF를 발현하는 티미딘 키나제 불활성화된 백시니아 바이러스이다(참조: Jennerex, JX-594). 그러나, 다른 백시니아 바이러스 변이체 및 스트레인도 본원에 기술된 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, JX-963은 TK 유전자의 제거와 함께 웨스턴 리저브 백시니아 골격(Western Reserve vaccinia backbone) 상에 작제된 백시니아 성장 인자(VGF) 유전자의 추가의 결실을 갖는 백시니아 바이러스 재조합체이다. 당해 이중 결실된 백시니아 바이러스(vvDD)는, 종양 특이적이고 동물 모델들에서 항종양 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(참조: McCart et al., 2001; Thorne et al., 2007; Naik et al, 2006). 제2 vvDD 변이체는 JX-929 잠복처(harbor)이고 ¹¹¹In-펜테트레오타이드를 사용한 전신 전달 후 분자 영상화(molecular imaging)를 촉진하는 감염된 세포 내에서 사람 소마토스타틴 수용체(SSTR2)를 발현한다(참조: McCart et al., 2004).

I. 세포 배양

세포계 바이러스 생산을 DRYVAX® 백신화에 대한 대안에 대해 및 바이러스 면역치료요법 및 유전자 치료요법의 분야에서 백시니아 바이러스 용도의 생산에 대해 시험하여 왔다. ACAM2000이라고 칭하는 원숭이 신장 세포주 베로(Vero)에서 성장된 제2 세대 백시니아 바이러스 백신 스트레인을 개발하여 왔다. 이들 연구들에서, 바이러스는 세포 배양물로부터 효과적으로 정제되었다. 또한, 백시니아 바이러스를 종양 특이적 항원들(즉, PSA, CEA) 및 면역자극성 분자들(즉, B7.1, ICAM-1 및 LFA-1)과 함께 사용하는 암 백신도 세포에서 생산하여 페이즈 I 및 II 임상 시험에서 환자들에게 투여하였다(참조: Li, et al., 2005; Guo and Bartlett, 2004). 그러나, 이들 상기 경우 둘 다에서, 환자들은 바이러스 제제의 전신계 투여보다는 오히려 국소 투여를 받았고, 생체내에서 종양 분해성 효능에 요구되는 총 바이러스 용량의 분획을 투여받았다.

종양 분해성 바이러스 후보물로서 제안된 다른 바이러스들과 비교하여, 백시니아와 같은 폭스바이러스(poxvirus)는 대규모 제조 및 정제시 일부 고유한 과제들(challenges)을 나타낸다. 천연에서 가장 큰 바이러스들 중 일부로서, 폭스바이러스는 광학현미경에 의해 가시화할 수 있으며, 길이가 200 내지 400nm로 측정된다[참조: Moss, in Fields' virology B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, Eds. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001) pp. 2849-2883]. 이의 큰 크기로 인하여, 백시니아 바이러스는 여과에 의해 멸균될 수 없으므로 모든 제조 공정은 전형적으로 밀폐되어 있다.

숙주 세포 세포질 내에서 일어나는 이의 전체 라이프 사이클을 사용하여, 대부분의 감염성 입자들은 세포 배지 내로 방출되지 않지만, 감염된 세포 내에서 보유됨으로써 정제는 감염된 세포의 분해 및 세포 잔해로부터의 바이러스 입자의 정제를 필요로 한다.

폭스바이러스의 형태발생에서, 이들은 형태발생의 초기에 새로운(de novo) 막 합성, 및 숙주 골지(host golgi)로부터의 후에 획득된 추가의 막 둘 다로부터 막을 획득한다[참조: Moss, in Fields' virology B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, Eds. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001) pp. 2849-2883].

현재의 방법은 암 시험들을 위해 GMP 등급의 바이러스를 생산하도록 개발된 부착성 세포 공정에 관한 것이다. 부착성 세포 공정은, 혈청 불포함 조건 하에 또는 혈청의 존재 하에 수행될 수 있다. 본원에 기술된 플랫폼(platform)을 제조하기 위한 생산성 목표들은 적어도 30, 100, 125, 150, 200 또는 그 이상의 pfu/세포이며 - 용량당 추정된 바이러스 농도는 약 10⁹pfu/ml이다.

본 발명의 한 실시형태는 세포 배양물에서 고역가 JX-594 생산을 위한 과정들에 관한 것이다. 다양한 사람 세포주들을 시험하였고, 사람 자궁경부암 세포주인 HeLa가 부착성 배양물에서 풍부한 바이러스 복제를 지지하는 것으로 밝혀졌다. 본 방법은 HeLa 세포에 한정되지 않으며, 다른 부착성 세포가 생산 과정에서 사용될 수 있지만, 현재 HeLa 세포는 백시니아 바이러스의 생산을 위한 최상 방식의 세포주를 제공한다.

바이러스 생산성을 평가하기 위한 대표적인 접근법은 희석 연속물들에 이어서 플라크(plaque)가 형성되기를 기다리는 2 내지 3일의 기간 및 이후 역가의 계산을 포함하는, 표준 플라크 검정을 수행하는 것이다. 대안으로서, 감염 후 생산된 다수의 바이러스 게놈의 측정을 허용하는 정량적 PCR 접근법(Q-PCR)이 표준화되어 왔다.

증폭 프라이머를 최적화하여 본 발명자들이 감염된 세포에서 바이러스 E9L 유전자의 카피의 수를 정량화하는 것을 가능하게 하였고, 증폭 프라이머는 이들 결과를 본 발명자들의 표준 플라크 검정 데이터와 상호관련성을 보여주었다. 이러한 접근법의 장점은, 이것이 96 웰 양식(well format)에 적응될 수 있으며 당해 데이터는 일 대신 시간 내에 이용가능하다는 점이다. 따라서, 배지 및 보충물, 수거에 이르는 시간 및 도입 바이러스의 농도의 영향들의 표준 초기 스크린(screen)을 신속하게 수행하여 96웰 플레이트에서 분석할 수 있다. 이러한 초기 스크린 후, 모든 양성 "히트(hit)"를 전통적인 플라크 검정으로 확인하였다.

시판되는 혈청 불포함 배지에서 발견된 구성성분을 바이러스 생산성에 대한 이들의 영향에 대해 시험하였다. HeLa S3 세포주를 현탁액에서의 성장을 위해 적응시키고 본 발명자들의 상황에서 이들 세포들도, 부착성 세포들이 혈청 함유 배지에서 성장시키는 것과 같이 EX-CELL™ HeLa 혈청 불포함 현탁액 배지[제조원: 에스에이에프씨 바이오사이언시스(SAFC Biosciences)]에서 성장시킨다. 그러나, 상기 언급한 바와 같이, 우수한 세포 성장 특성에도 불구하고, 본 발명자들은 이들 배지에서 매우 불량한 바이러스 성장을 관찰하였다(감염된 세포당 1개 미만의 바이러스 입자). 비록 EX-CELL™ HeLa 혈청 불포함 배지의 정확한 제형이 독점적이라고 해도, 이러한 혈청 불포함 배지의 공지되어 있는 구성성분은 세포 클럼핑(clumping)을 방지하는 것을 돕기 위해 명백하게 첨가된, 황화된 다당류, 덱스트란 설페이트이다. 그러나, 덱스트란 설페이트도, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 라브도바이러스 및 아에레나바이러스를 포함하는, 광범위한 외피 바이러스들의 복제를 억제하는 것으로 알려져 있다(참조: De Clercq, 1993). EX-CELL 배지에는 대략 20mg/L의 덱스트란 설페이트가 존재한다. 덱스트란 설페이트의 다양한 농도들을 사용하여 상기에 기술한 신속한 검정에서 평가하였다. 덱스트란 설페이트는 전통적인 역가 검정을 사용하여 후속적으로 확인된 발견인, 바이러스 생산성에 대한 용량 의존적인 부정적 영향을 가진 것으로 발견되었다. 덱스트란 설페이트의 제거가 바이러스 생산성을 향상시키지만, 이는 여전히 혈청 함유 배지에서 부착성 HeLa 세포를 사용하여 통상적으로 달성된 생산성 이하이다. 바이러스 생산성에 영향을 미치는 다른 배지 구성성분으로는, 세포에 대해 일반적으로 비-독성인 이-기능성의, 블록, 공중합체 계면활성제인 플루로닉 F-68; 일반적으로 사용되는 세제인 트윈(Tween)-80; 및 대두 가수분해물이 포함된다. 본 발명의 소정 양상에서, 배지에는 덱스트란 설페이트, 플루로닉 F-68, 트윈-80 및 대두 단백질 가수분해물 중 하나 이상이 결여되어 있을 것이다. 이들 배지 제형 및 혈청 보충물 중 일부의 예는 표 1에 요약되어 있다.

백시니아 바이러스는 효율적인 확산을 위해 세포 대 세포 접촉을 선호하므로, 현탁액 세포 배양물이 바이러스의 불량한 세포 대 세포 전달에 의해 제한될 수 있음이 가능하다. 소정 양상에서, 세포의 클럼핑은 촉진될 수 있거나, 세포는 미세 담체 상에서 성장될 수 있거나, 부착성 배양물이 바이러스 생산에 충분할 수 있다.

비-제한적 예에서, 다음의 조건들을 JX-594의 성장에 사용하였으며, 이는 100pfu/세포를 초과하는 역가를 지속적으로 초래한다. 세포를 롤러 병에서 4x10⁴세포/㎠로 설정(set-up)하고 배양물에서 2일 동안 성장시킨다. 이때, 성장 배지를 제거하고 10⁴pfu/ml의 JX-594를 함유하는 신선한 배지를 첨가한다. 세포를 추가로 60 내지 70시간 동안 유지시키고, 이때 세포를 수집하고 바이러스를 수거한다. 이러한 설정은 대략 170 용량(10⁹pfu/용량)의 JX-594를 생산할 수 있다. 당해 공정 동안, 본 발명자들은 바이러스 배출에 현저한 효과를 갖는 것으로 예상되지 않는 인자들을 발견하였다. 예를 들면, 배지의 pH는 JX-594 복제에 대한 효과를 가진다. 바이러스 생산은 잘 완충된 배지에서 7.3의 pH에서 최적화되었다. 부착성 배양물로부터의 생산성은 현탁액 배양물에서 모든 시도보다 유의적으로 더 우수하다.

오염성 생성물이 충분히 불포함된 고품질 바이러스 제제의 생산을 보증하기 위하여, 바이러스 순도 및/또는 품질의 분석에 다수의 검정을 사용할 수 있다. 당해 검정은, 바이러스 제제들이, 바이러스 제제의 다른 확인된 로트(lot)와 비교할만하고 당해 공정이 성공적임을 보증할 것이다.

소정 실시형태에서, 백시니아 바이러스를 분리하여 정제할 수 있다. 백시니아 바이러스의 정제 방법은: a. 고체-상 매트릭스의 액체-상에 함유된 백시니아 바이러스를 이용한 부하(loading); b. 매트릭스의 세척, 및 c. 백시니아 바이러스의 용출을 포함할 수 있다.

소정 양상에서, 매트릭스는 백시니아에 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 당해 리간드는 매트릭스에 대한 결합 또는 커플링에 의해 고체-상 매트릭스에 부착될 수 있다. 리간드와 바이러스 사이의 상호작용은 가역성 복합체를 형성하고, 따라서, 바이러스는 매트릭스에 의해 가역적으로 보유된다. 소정 양상에서, 글루코사민 글리칸(GAG), 특히, 헤파란 설페이트 또는 헤파린, 또는 GAG-유사 물질이 리간드로서 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "글리코사미노글리칸"(GAG)은 반복된 이당류 단위로 이루어진 비분지형(un-branched) 다당류이다.

리간드는 예를 들면, 펩타이드 및/또는 렉틴 및/또는 항체 및/또는 바람직하게는 탄수화물과 같은 생물학적 분자일 수 있다. 또한, 당해 리간드는 설페이트를 포함하거나 설페이트로 이루어질 수 있다. 추가의 실시형태에서, 리간드는 하나 이상의 음으로 하전된 설페이트 그룹을 포함한다.

소정 양상에서, 리간드는 예를 들면, 방향족 페닐 그룹, PPG 그룹, 부틸 그룹, 또는 헥실 그룹과 같은 소수성 분자이다.

한 양상에서, 당해 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용한 백시니아 바이러스의 정제를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 당해 방법은 친화성 크로마토그래피와 함께 HIC를 사용한 백시니아 바이러스의 정제를 포함한다. HIC의 사용은 DNA 및 단백질 오염물질들이 크게 감소된 고 바이러스 수율들을 제공할 수 있다. DNA 오염 수준은 초기 출발 물질의 0.01%로 감소될 수 있으며, 단백질 오염 수준은 0.1% 미만으로 감소될 수 있다.

소정 양상에서, 설페이트화된 셀룰로즈는 HIC 페닐 컬럼 크로마토그래피와 함께 사용되어 고 수율 및 순도 수준에서 바이러스 입자들을 수득할 수 있다.

소정 양상에서, DNA는 백시니아 바이러스의 정제 전에 또는 후에 분해되거나 제거된다. DNA는 Benzonase® 처리와 같은 뉴클레아제 처리에 의해 제거될 수 있다. 뉴클레아제 처리는 온전한 종양유전자(oncogene) 또는 추가의 기능성 DNA 서열을 함유하는 바이러스 벡터 또는 백신의 개연성을 감소시킨다.

관련된 양상에서, 단백질은 백시니아 바이러스의 정제 전에 또는 후에 분해되거나 제거된다. 단백질은 프로테아제 처리, 예를 들면, TrypLE™ 셀렉트 처리(Select treatment)에 의해 제거될 수 있다. 바람직하게, 뉴클레아제 처리와 프로테아제 처리의 조합을 사용하여 오염성 HeLa DNA 및 단백질을 감소시키거나 제거한다.

매트릭스는 겔, 비드, 웰(well), 막, 컬럼 등일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 고체-상은 막, 특히, 셀룰로즈 막이다. 바이러스를 결합시킬 수 있는 광범위한 개질된 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 중합체의 예로는 셀룰로즈 유도체(셀룰로즈 에스테르, 셀룰로즈 수화물, 셀룰로즈 아세테이트, 셀룰로즈 니트레이트); 아가로즈 및 이의 유도체; 키틴 또는 키토산과 같은 다당류; 폴리올레핀(폴리프로필렌); 폴리설폰; 폴리에테르설폰; 폴리스티렌; 방향족 및 지방족 폴리아미드; 폴리설폰아미드; 할로겐화된 중합체(폴리비닐클로라이드, 폴리비닐플루오라이드, 폴리비닐리덴플루오라이드); 폴리에스테르; 아크릴니트릴의 동종- 및 공중합체가 있다.

백시니아 바이러스는 무균성 조건 하에서 정제되어 활성의 안정하고 고도로 순수한 바이러스 제제를 수득할 수 있다. 백시니아 바이러스는 천연이거나 재조합체일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "오염물질"은 바이러스 성장에 사용된 숙주 세포로부터 기원할 수 있거나, 상류(예를 들면, 겐타마이신) 및 하류(예를 들면, 벤조나제)를 포함하는 제조 공정 동안 사용된 임의의 첨가제로부터 기원할 수 있는, 임의의 불필요한 물질들(예를 들면, 숙주 세포 DNA 또는 단백질)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 백시니아 바이러스 또는 재조합체 백시니아 바이러스의 "산업적 규모" 또는 "대규모" 제조는, 배취(batch)(생산 수행)당 1.Ox1O⁸개 바이러스 입자(총 최소 5.0 x 10¹²개 바이러스 입자)의 최소 50,000 용량을 제공할 수 있는 방법을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 백시니아 바이러스 제제 또는 백신의 "순도"는 불순물 DNA, 단백질, 벤조나제, 및 겐타마이신의 함량과 관련하여 조사된다. 순도는 구체적인 불순물로 표시되며, 이는 용량당 각각의 불순물의 양(예를 들면, ng DNA/용량)이다.

본원에 사용된 바와 같이, "안정성"은 바이러스 제제[다량의 약물 물질(Bulk Drug Substance; BDS) 또는 최종 약물 제품(Final Drug Product: FDP)]의 품질이 온도, 습도 및 빛과 같은 각종의 환경적 요인의 영향 하에 시간에 따라 변하는 방법의 척도를 의미하며, 추천된 저장 조건에서 BDS의 경우 재시험 기간 또는 FDP의 경우 저장-수명을 확립한다.

리간드는, 백시니아 바이러스가 완전히 이들의 생물학적 활성을 보유하는 이러한 온화한 조건 하에서 결합된 백시니아 바이러스의 용출을 가능하게 한다. 이는, 바이러스가 감염성임을 의미한다. 백시니아 바이러스의 감염성은 정제 동안 보존됨으로써 초기 TCID₅₀(중간 조직 배양 감염성 투여량)의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 정제 동안 보유될 수 있다. 바람직하게는, 초기 TCID₅₀의 적어도 30%가 정제 동안 보유된다.

한 실시형태에서, 고체 상 매트릭스는, 공극 크기가 0.25μm, 바람직하게는 0.25μm 이상, 보다 바람직하게는 1.0 내지 3.0μm인 겔 또는 막이며, 이는 10cm/분 내지 20cm/분의 실제 정제 조건 하에서의 선형 유속(linear flow rate)을 입증한다. 매트릭스의 공극 크기는 0.25 내지 0.5μm, 0.5 내지 0.75μm, 0.75 내지 1.0μm, 1.0 내지 2.0μm, 2.0 내지 3.0μm, 또는 3.0μm 초과일 수 있다.

리간드를 이용한 고체 상의 부하는 배취식-, 컬럼식- 또는 막 접근법에 의해 수행될 수 있다.

막 접근법은 백시니아 바이러스들과 같은 거대 바이러스들의 정제를 위한 일부 이점을 가질 수 있다. 큰 공극 크기, 및 막의 표면 상의 리간드의 이용가능성은 심지어 큰 바이러스 입자들의 높은 결합능을 허용한다.

한 실시형태에서, 바이러스는 황산암모늄, 예를 들면, 0.2M, 0.4M, 0.6M, 0.8M, 1.0M, 1.2M, 1.4M, 1.6M, 1.8M, 또는 2.0M에서 리간드에 결합한다.

리간드 또는 매트릭스에 대한 백시니아 바이러스 또는 재조합체 바이러스의 결합이 충분히 진행된 경우, 액체 상에 남아있는 숙주 세포 오염물질(특히, 숙주 세포 DNA 및 단백질)은, 백시니아 바이러스가 결합된 매트릭스를 적절한 세척 매질로 세척함으로써 제거할 수 있다. 한 양상에서, 매트릭스는 0.2M, 0.4M, 0.6M, 0.8M, 1.0M, 1.2M, 1.4M, 1.6M, 1.8M, 또는 2.0M에서 황산암모늄으로 세척한다.

결합된 백시니아 바이러스 또는 재조합체 바이러스는 매트릭스로부터 용출시킬 수 있다. 포획된 백시니아 바이러스의 용출은, 리간드 또는 매트릭스와 백시니아 바이러스 사이의 특이적인 상호작용을 특이적으로 파괴시키는 제제에 의해, 또는 리간드 또는 매트릭스와 표면 단백질 사이의 정전기적 상호작용을 비-특이적으로 파괴시키는 제제에 의해 수행될 수 있다. 한 양상에서, 제제는 황산암모늄이다. 추가의 양상에서, 백시니아 바이러스는 GAG 또는 GAG 유사 리간드로 용출시킬 수 있다. 다른 양상에서, 제제는 염화나트륨, 보다 바람직하게는 0.15M 내지 2.0M 범위의 증가하는 NaCl 농도 구배이다.

매트릭스에 부하하기 전에, 구체적으로 액체 상 배양물에서 백시니아 바이러스로부터 오염물질을 제거하기 위해서 바이러스 현탁액의 사전-처리를 수행할 수 있다. 사전-처리는 다음 단계들 중 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 수행할 수 있다: 숙주 세포의 균질화, 초음파 처리, 동결/해동, 저-삼투성 분해, 고압 처리, 원심분리, 여과, 뉴클레아제 처리, 프로테아제 처리, 양이온성 교환, 선택적 침전.

백시니아 바이러스 또는 재조합체 바이러스의 용출에 사용된 제제에 따라서, 후-처리를 수행하여 바이러스 제제의 순도를 향상시킬 수 있다. 후-처리는 용출에 사용된 불순물 및/또는 특이적이거나 비-특이적인 제제의 추가의 제거를 위한 한외여과/투석여과(diafiltration)일 수 있다.

전형적으로, pH 값은, 바이러스의 용출 후, 특히, 9 이상의 pH 값, 특히, pH 7.5, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.5, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.5, 9.6, 9.8, 10.0, 10.2, 10.4, 또는 10.5까지 증가한다.

본 발명의 실시는 당해 분야의 숙련가의 능력 내인 분자생물학, 단백질 분석, 및 미생물학에서의 기술들을 사용한다. 이러한 기술들은, 예를 들면, 문헌(참조: Ausubel et al. 1995, eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)에 완벽하게 설명되어 있다.

II . 실시예

다음 실시예들은 본 발명의 각종 실시형태를 설명할 목적으로 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것을 의미하지는 않는다. 당해 분야의 숙련가는, 본 발명이 목적들을 수행하고 언급된 목표 및 장점, 및 본원의 고유한 이들 목적, 목표 및 장점을 수득하기 위해 잘 조정됨을 인식할 것이다. 본 실시예는, 본원에 기술된 방법들과 함께 현재 바람직한 실시형태를 대표하며, 예시이고, 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 의도되지 않는다. 특허청구범위의 범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 내에 포함되는 이들 내의 변화 및 다른 용도는 당해 분야의 숙련가들에게 일어날 것이다.

다양한 사람 세포주들을 JX-594의 생산을 위해 시험하였다. 요약하면, 고유의 HeLa 세포, A549 세포, MCF-7 세포, M14 세포, U-2 OS 세포, 현탁된 HeLa S3 세포 및 고유의 HeLa S3 세포를 JX-594로 0.1의 다중 감염도로 감염시키고, 분해물을 감염 후 72시간째에 수집하고, U-2 OS 세포에 대해 바이러스의 역가를 측정하였다. 결과는 도 1에 도해한다. 놀랍게도, 부착성 HeLa 세포에서 우수한 결과가 수득되었다.

각종 매개변수들을 접착성 HeLa 세포들에서 바이러스의 생산을 최적화하기 위한 시도로 실험하였다. 감염 배지의 pH는 바이러스 생산에 대해 예상치못한 현저한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(참조: 도 2). JX-594의 생산은, 기타의 동일한 조건 하에 pH 7.1의 감염 배지에서의 약 12pfu/세포 내지 pH 7.3의 감염 배지에서의 약 60pfu/세포로 증가하였다. 감염 배지의 pH가 7.1 미만인 경우, 바이러스 생산은 거의 존재하지 않았다. 바이러스 생산에 있어서의 추가의 개선들은, 감염 다중도가 0.005 내지 0.05의 범위, 특히, 0.01 내지 0.03의 범위 내이고, 감염 동안 및 감염 후 온도가 36℃ 내지 37.5℃로 유지되는 경우에 관찰되었다. 부착성 표면으로서의 플라스틱 롤러 병의 사용도 또한 고 바이러스 수율에 기여하였다.

또한, 감염 전 부착성 HeLa 세포를 배양하는데 사용된 배지 중 혈청의 존재 및 양도 바이러스 수율에 영향을 미치는 것으로 측정되었다. 최적 수율은, 배지가 10% FBS를 함유한 경우에 수득되었으며 - 배지 중의 혈청의 양을 감소시키는 것은 바이러스 수율의 상응하는 손실을 초래하였다. 그럼에도 불구하고, 다른 매개변수들의 최적화(예를 들면, pH, 감염 다중도, 부착성 표면)는 감소된 혈청 농도에 대해 어느 정도 기여할 수 있는 수율의 손실에 대응한다.

그러나, 감염 배지 중의 혈청의 존재 및 양은 바이러스 수율에 실질적으로 영향을 미치지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 부착성 HeLa 세포에서 백시니아 바이러스의 놀라운 우수한 수율을 수득하기 위하여, 감염 배지는 혈청을 포함할 수 있거나 실질적으로 혈청을 포함하지 않을 수 있다.

최적화된 상류 공정의 비-제한적인 예를 요약하는 흐름도는 다음과 같다:

바이알 해동 및 접종물 확장. 세포 은행으로부터의 충분한 수의 바이알(vial)을 해동시킴으로써 상류 공정을 개시한다. 수득되는 세포 현탁액을 폴리스티렌 세포 배양 용기(636㎠)[제조원: 누크 날젠(Nunc Nalgene)]에서 항온배양한다. 세포를, 일반적으로 적용되는 세포 배양 프로토콜들을 사용하여, 육안 평가에 의해 측정된 소정 컨플루언시(약 80 내지 95%)까지 성장시킨다.

계대배양 1에서, 배지를 제거하고, 세포들을 PBS로 세정하고 배양 용기로부터 탈착시킨다. 살아있는 세포를 Vi-Cell XR[제조원: 벡만 코울터(Beckman Coulter)] 또는 혈구계산기를 사용하여 계수하고, 이어서, 1x10⁴ 내지 6x10⁴ 세포/㎠의 밀도로, 각각 200mL 배지-100을 함유하는 4개의 폴리스티렌 배양 용기(총 면적 2544 ㎠) 내로 식종(seeding)한다. 배양물을 37℃에서 항온배양한다.

배양물을 2x10⁴으로 식종하는 경우, 다음 계대배양을 위한 표적일은 식종 후 4일째이다. 배양물을 4x10⁴으로 식종하는 경우, 다음 계대배양을 위한 표적일은 식종 후 3일째이다. 당해 공정은 각각의 계대배양시에 대략 1x10⁵개 세포/㎠를 제공하도록 규정된다.

롤러 병 세포 배양물 확장. 계대배양 2를 위한 표적일에, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하여 폴리스티렌 배양 용기들로부터 탈착시킨다.

세포를 1x10⁴ 내지 6x10⁴개 세포/㎠의 밀도로 2개의 확장된 표면(ES) 폴리스티렌 롤러 병(RB, 제조원: Cellon) 내로 RC-40 롤러 병 장치[제조원: 신테콘(Synthecon), 총 표면적 8400㎠)에 식종한다. 900mL의 배지 100을 함유하는 각각의 병을 배양하고 세포 배양물을 37℃에서 RC-40 항온배양기[제조원: 산요(Sanyo)]에서 항온배양한다.

계대배양 3을 위한 표적일에, 세포 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세정하고 탈착시킨다. 세포 현탁액을 ES 병으로부터 수집하여 배지 100과 1:1로 혼합하고 살아있는 세포들을 계수한다. 이어서, 적절한 양의 세포 현탁액을 4개의 ES RB(총 표면적 16800㎠) 내에 1x1O⁴ 내지 6x10⁴ 세포/㎠로 식종한다. 세포 배양물을 37℃에서 각각의 병 내의 900mL의 배지와 함께 항온배양한다.

계대배양 4 동안, 세포 배양물을 10 RB(총 표면적 42000㎠)으로 이동시키고, 계대배양 5 동안에 세포 배양물을 20 RB(총 표면적 84000㎠)으로 확장시킨다. 계대배양 6은, 세포 배양물이 40 RB(총 표면적 168000㎠)으로 확장되므로 JX-594 생산 공정의 제1의 중요한 단계이다. 40 RB의 식종 밀도는 JX-594 생산에 중요하며 4x10⁴ 세포/㎠의 정의된 표적을 갖는다. 세포 현탁액의 샘플 및 조건화된 배지를 계대배양 6 동안에 DNA 핑거프린팅(fingerprinting) 및 부정성 제제 시험(adventitious agent testing)을 위해 수집한다. 생산 식종 기간 동안 세포 배양물의 온도는 37℃로 제어된다.

감염 및 JX -594 생산. 40 RB의 식종으로부터 마스터 바이러스 은행(Master Virus Bank) 또는 워킹 바이러스 은행(Working Virus Bank)으로부터의 JX-594의 바이알을 사용한 감염까지의 간격은 72시간의 표적이다. 감염일에, 배지를 세포 배양물로부터 제거하고, 1x1O⁴pfu/mL의 JX-594 바이러스를 함유한 신선한 배지-100으로 대체한다. 감염 배지의 역가는 중요한 공정 매개변수이며 1x10⁴pfu/mL의 정의된 표적을 갖는다. 세포 밀도는 감염시에 계수되지 않지만, 계대배양 이력(passage history)을 기준으로 하여 1x10⁵개 세포/㎠인 것으로 예측된다. 감염 지속기간은 40 내지 80시간의 범위 내에서 제어되고, 바람직하게는 약 44시간이다. 감염 동안 세포 배양물의 온도는 중요한 공정 매개변수이고, 37℃로 제어된다.

100pfu/세포 이하 및 심지어 100pfu/세포 이상의 바이러스 역가가 당해 공정에 따라서 정규적으로 수득된다.

JX -594 하류 공정. 세포로부터의 폭스바이러스의 소규모 제조를 위한 전통적인 방법은, 저 등장성 분해(hypotonic lysis)에 이어서 다수 라운드(round)의 동결 해동 및 초음파를 포함하였다. 본 발명자들은, 동결/해동 및 초음파 둘 다가, 감소된 바이러스 역가를 종종 초래하는 매우 불필요한 단계임을 발견하였다. 따라서, JX-594의 하류 공정은 뉴클레아제(벤조나제) 처리를 사용하여 HeLa DNA를 분해하고 프로테아제(TrypLE™ Select) 처리하여 HeLa 단백질을 분해한 후, 접선 유동 여과(TFF)를 사용한다. 벤조나제를 사용한 조 배양물(저 등장성 분해 완충액에 바이러스 및 세포 잔해 함유)의 처리는 제제에서 유의적으로 거의 오염되지 않은 숙주(HeLa) DNA를 생성하였다(참조: 도 3). 따라서, TFF와 조합된 뉴클레아제 처리는 제조시 숙주 DNA 및 단백질을 유의하게 거의 오염시키지 않지만 바이러스의 감염성 역가는 보유하는, 유의하게 더 순수한 바이러스 제제를 제공한다. 특히, 40μg의 DNA/용량으로부터 3μg의 DNA/용량으로의 DNA 오염의 감소 및 12mg의 단백질/용량으로부터 4mg의 단백질/용량(용량 = 1 x 10⁹pfu의 JX-594)으로의 단백질 오염의 감소는, 뉴클레아제/프로테아제 처리 및 TFF의 조합으로 달성될 수 있다. 추가의 감소는 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 이용하여 달성할 수 있다. 한 양상에서, 하나 이상의 크로마토그래피 단계는 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 다른 양상에서, 하나 이상의 크로마토그래피 단계는 헤파린(또는 헤파린-유사 분자) 또는 설페이트화된 셀룰로즈에 근거한 의사-친화성 크로마토그래피(pseudo-affinity chromatography)를 포함하여, 백시니아 바이러스 A27L 단백질의 헤파린-결합 효능의 이점을 이용한다. 또 다른 양상에서, 하나 이상의 크로마토그래피 단계는 막 흡착 크로마토그래피, 예를 들면, 막 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 바람직한 막은, 공극 크기가 적어도 3μΜ인 미세다공성 구조를 가질 것이다.

참조문헌

다음 참조문헌들은, 본원에 제시된 바를 보충하는 예시적 과정 또는 다른 세부사항들을 제공하는 정도로, 인용에 의해 본원에 구체적으로 포함된다.

Claims

(a) HeLa 세포를 0.005 내지 1.0 플라크 형성 단위(pfu: plaque forming unit)/세포의 감염 다중도(m.o.i.: multiplicity of infection)로 백시니아 바이러스와 접촉시킴으로써, 표면에 부착된 HeLa 세포를 백시니아 바이러스로 감염시키는 단계;
(b) 상기 감염된 세포를 7.1 초과의 pH를 갖는 감염 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양물로부터 백시니아 바이러스를 수거하는 단계를 포함하는, 백시니아 바이러스의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 부착된 HeLa 세포의 밀도가 단계 (a) 동안에 10⁴ 내지 10⁶개의 HeLa 세포/㎠인, 방법.
제2항에 있어서, 상기 부착된 HeLa 세포들의 밀도가 단계 (a) 동안에 약 10⁵개 HeLa 세포/㎠인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HeLa 세포가 세포 큐브(cell cube), 세포 팩토리(cell factory), T-플라스크, 롤러 병 또는 미세 담체에 부착되는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 HeLa 세포가 하나 이상의 플라스틱 롤러 병 용기들에 부착되는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 롤러 병들이 168,000㎠ 이상의 배양 면적을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a) 동안의 백시니아 바이러스의 농도가 10³ 내지 10⁵pfu/ml인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 (a) 동안의 백시니아 바이러스의 농도가 약 10⁴pfu/ml인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염 배지의 pH가 7.2 초과이고, 바람직하게는 약 7.3인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)가 36℃ 내지 37.5℃의 온도에서, 바람직하게는 37℃에서 수행되는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)가 40 내지 80시간, 바람직하게는 약 44시간의 기간 동안 수행되는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HeLa 세포당 50pfu 이상의 백시니아 바이러스가 생산되고, 바람직하게는 HeLa 세포당 75pfu 이상의 백시니아 바이러스가 생산되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 덱스트란 설페이트, Pluronic® F-68, 폴리소르베이트 80, 및 대두 가수분해물 중 하나 이상을 포함하지 않는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 배지가 덱스트란 설페이트를 포함하지 않는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 배지에 덱스트란 설페이트, Pluronic® F-68, 폴리소르베이트 80, 및 대두 가수분해물이 결여되어 있는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 소 태아 혈청을 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 배지가 10% 미만의 소 태아 혈청을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 혈청을 포함하지 않는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 m.o.i.가 약 0.01 내지 0.5pfu/세포이고, 바람직하게는 약 0.02pfu/세포인, 방법.
[청구항 19]
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수거된 바이러스가 하나 이상의 정제 단계들에 적용되는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 정제가, 수거된 바이러스를 뉴클레아제로 처리하여 HeLa 세포 핵산 및/또는 프로테아제를 제거함으로써 HeLa 세포 단백질을 제거함을 포함하는, 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 정제가 접선 유동 여과 단계(tangential flow filtration step)를 포함하는, 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제가 헤파린 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는, 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제가 막 흡착 크로마토그래피 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스가 IHD-J, 와이어스(Wyeth), 웨스턴 리저브(Western Reserve), 또는 코펜하겐(Copenhagen) 스트레인의 백시니아 바이러스인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스가 재조합체 백시니아 바이러스인, 방법.
제25항에 있어서, 상기 재조합체 백시니아 바이러스가, 면역자극성 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 암호화 영역을 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 면역자극성 폴리펩타이드가 사이토카인인, 방법.
제27항에 있어서, 상기 사이토카인이 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor)인, 방법.
제28항에 있어서, 상기 재조합체 백시니아 바이러스가 종양 세포에서 선택적으로 복제하는, 방법.
제29항에 있어서, 상기 재조합체 백시니아 바이러스가 내인성 유전자 내에 돌연변이를 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, 상기 재조합체 백시니아 바이러스에는 기능성 티미딘 키나제 유전자가 결여되어 있는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 재조합체 백시니아 바이러스가 IHD-J, 와이어스, 웨스턴 리저브, 또는 코펜하겐 스트레인의 백시니아 바이러스인, 방법.
제32항에 있어서, 상기 재조합체 백시니아 바이러스가 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 폴리펩타이드를 암호화하는, 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 감염 전에 HeLa 배양물의 확장을 추가로 포함하는, 방법.
제34항에 있어서, 상기 HeLa 세포들이, 이전의 배양 용기와 비교하여 증가된 배양 면적을 갖는 하나 이상의 롤러 병 배양 용기를 통해 계대 배양되는, 방법.
제35항에 있어서, 상기 롤러 병 배양 용기가, 850㎠ 이상의 배양 면적을 갖는, 방법.
제35항에 있어서, 최종 계대 배양이, 168,000㎠ 이상의 배양 면적을 갖는 롤러 병 배양 용기에 대한 것인, 방법.
제37항에 있어서, 상기 롤러 병 배양 용기의 식종(seeding)과 감염 사이의 간격이 48 내지 96시간인, 방법.
제38항에 있어서, 상기 부착성 HeLa 세포들이 2x10³ 내지 1x10⁵개의 재조합체 복제 가능 백시니아 바이러스(recombinant replication competent vaccinia virus)/ml와 접촉되는, 방법.