JP2018524146A - クロマトグラフィーカラムからプロダクトを連続的に溶出する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、複数のクロマトグラフィーカラムからバイオ医薬プロダクト、生物学的プロダクト、高分子プロダクトを連続的に溶出する方法を提供し、この方法は、（ａ）インレットを通してプロダクトストリームを供給する工程と、（ｂ）ローディングゾーンにおいてプロダクトストリームによりｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムをローディング時間ｔＢで同時にロードし、ｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムのアウトレットストリームは、回収ゾーンにある少なくともｎ−１本の回収クロマトグラフィーカラムに同時に分配され、ｎは１〜５であり、所与の時点における前記ｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムは、０〜Ｌ１の間、Ｌ１〜Ｌ２の間、および最大でＬｎ−１〜Ｌｎの間で変動するローディング時間ｔＢを有し、各フロントクロマトグラフィーカラムは、Ｌｎの総ローディング時間を有し、Ｌｎ〜Ｌｎ−１の一定の切換時間ｔＳ後に周期的に、フロントクロマトグラフィーカラムｎはローディングゾーンから出て、回収ゾーンからの回収クロマトグラフィーカラムはローディングゾーンに入ることを特徴とする工程と、（ｃ）工程（ｂ）からのプロダクトをロードしたカラムを少なくとも１つの洗浄バッファーで洗う工程と、（ｄ）切換時間ｔＳの８０％以上である溶出時間ｔＥで、工程（ｃ）からの洗浄済みカラムからプロダクトを溶出する工程とを含み、総実行時間ｔＧの８０％超にわたって、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムが連続的に溶出工程（ｄ）にある。
Description
本発明は、クロマトグラフィーカラムからプロダクトを連続的に溶出する方法に関する。
生物工学的な製造においてタンパク質は通常、バッチで精製される。これは、プロダクト全部が製造サイクルの完了後に取り除かれて、個々の製造サイクルがバッチ方式で不連続的に処理されることを意味する。製造を再び実行するには、次に新しい別のプロダクトサイクルまたはバッチを開始する必要がある。
近年、バッチプロセスとは対照的にプロセスが中断なく進む連続的な方法も生物工学的な製造において実行可能であることが実証されてきている。
厳しく規制されている医薬品製造では、清潔で且つ滅菌されたバイオリアクターを用意して無菌プロダクトを確保するために、時間、技術、および人材の点で大変な努力を要する。多目的系または２つのプロダクトバッチ間のプロダクト切り替えの場合に交差汚染を確実に回避するには、非常に複雑な洗浄の検証が洗浄の他に必要であり、適用となる場合、その検証は繰り返し行われなければならない。
これは、ダウンストリームプロセシング（ＵＳＰ）、すなわち、発酵槽での生物学的プロダクトの製造にも、ダウンストリームプロセシング（ＤＳＰ）、すなわち、醗酵物の生成にもあてはまる。
特に醗酵の場合、培養の成功に無菌環境が必須である。バッチ発酵槽または流加回分発酵槽を滅菌するためにＳＩＰ技術（ＳＩＰ＝定置滅菌）が一般に使用される。
必須の洗浄および滅菌手順から生じる反応装置の休止時間は、特に使用期間が短く、プロダクト変更の頻度が高い場合に、反応装置の使用できる状態のかなりの部分をとる。これは、例えば、生物工学的な製造のＵＳＰにおける培地調製および醗酵の方法工程、並びにＤＳＰにおける可溶化、凍結、解凍、ｐＨ調整、例えば、クロマトグラフィーを介した生産分離、沈殿、または結晶化、バッファー調整、およびウイルス不活性化に影響を及ぼす。
ダウンストリームの方法では、規制上の要件は微生物低減方法の管理である。したがってバッチ操作の場合、滅菌方法は必要ない。しかし連続的な方法では、タンパク質の精製は、可能であれば洗浄工程なしに比較的長い期間にわたって行われる。これは好ましくは精製の間に滅菌工程なしに起こる。微生物によるコンタミネーションのリスクが単純なバッチ操作の場合に比べて何倍も高いが、これは本当である。
国際公開第２０１２／０７８６７７号は、製造システム、より具体的には、使い捨てシステムにおけるクロマトグラフィーおよびその組み合わせによるバイオ医薬プロダクトの連続加工のための方法およびシステムを記載する。国際公開第２０１２／０７８６７７号は、バイオ医薬プロダクトおよび生物学的プロダクトの連続製造のためのアプローチを提供するが、開示された解決方法は実行に適していない。また、国際公開第２０１２／０７８６７７号は製品の連続的な溶出を開示していない。
米国特許第２０１４／０２５５９９４Ａ１号は、治療用タンパク質を製造する、統合された連続的な方法を開示する。しかし米国特許第２０１４／０２５５９９４Ａ１号は、そのような方法で連続的に溶出を実施することができる特徴を開示していない。
欧州特許第２１８２９９０Ａ１号は、高温水蒸気を用いることによってクロマトグラフィーカラムを滅菌する方法を開示する。
まずはじめに、幾つかの用語を詳細に定義する。
本発明の文脈において、連続的な方法または連続的な溶出とは、少なくとも２つの方法工程が連続して実施されるいずれの方法も意味し、該方法においてアップストリームの工程のアウトレットストリームはダウンストリームの工程に運ばれる。ダウンストリームの工程は、アップストリームの工程が完了する前にプロダクトストリームの処理を開始する。典型的には、連続的な方法においてプロダクトストリームの一部は常に製造システムに運ばれ、「連続的プロダクトストリーム」と呼ばれる。したがって、プロダクトストリームのアップストリームユニットからダウンストリームユニットへの連続的な輸送または転送とは、アップストリームユニットの操作が終わる前に、ダウンストリームユニットが既に動いている、すなわち、２つの連続してつながったユニットはそれらを流れるプロダクトストリームに同時に方法を適用する。
本発明の文脈において、「フロントクロマトグラフィーカラム」という用語は、ローディングの間に直列接続において最初の位置にあり、プロダクトストリームで直接ロードされるクロマトグラフィーカラムを意味する。
本発明の文脈において、「回収クロマトグラフィーカラム」という用語は、ローディングの間に直列接続においてフロントクロマトグラフィーカラムの後ろの２番目の位置にあり、フロントクロマトグラフィーカラムからのプロダクトストリームでロードされるクロマトグラフィーカラムを意味する。
本発明の文脈において、「ローディング時間ｔＢ」とは、フロントクロマトグラフィーカラムとしてのクロマトグラフィーカラムがローディングゾーンに位置する時間を意味する。
本発明の文脈において、「切換時間ｔＳ」とは、一定の切換時間ｔＳの後に、周期的にフロントクロマトグラフィーカラムｎがローディングゾーンから出て、回収ゾーンからの回収クロマトグラフィーカラムがローディングゾーンに入ることを意味する。
本発明の文脈において、「溶出時間ｔＥ」とは、プロダクトが溶出バッファーによってクロマトグラフィーカラムからプロダクトアウトレットに溶出される時間を意味する。
本発明の文脈において、「総実行時間ｔＧ」とは、本発明による方法が中断なく完全に実行される時間を意味する。
本発明の文脈において、「微生物低減」という用語は、微生物数が減じられた状態、すなわち、ユニット面積またはユニット体積当たりの微生物数が事実上ゼロである状態を意味し、ガンマ線照射、ベータ線照射、オートクレーブ、酸化エチレン（ＥＴＯ）処理、および「定置蒸気滅菌」（ＳＩＰ）処理などの好適な微生物低減方法によって達成可能である。
本発明の文脈において、「使い捨て可能な物品」という用語は、プロダクトと接触する当該の部品、より具体的には、装置、タンク、フィルター、および接続要素が、１回使用した後に廃棄するのに適することを意味し、該タンクはプラスチックからでも金属からでも作られることができる。本発明の文脈において、その用語はまた、本発明による方法において一回だけ使用され、該方法ではその後もう使用されない、例えば、鋼鉄で作られた再使用可能な物品も包含する。本発明の文脈において、前記の、例えば、鋼鉄で作られた再使用可能物品は以降「使い捨て可能な物品として使用される」対象物とも呼ばれる。使用されるそのような使い捨て可能な物品は、以降本発明による方法において、「単回使用」物品（「ＳＵ技術」）とも呼ぶことができる。これらは、本発明による方法およびモジュラーシステムの微生物低減状態をさらに一層向上させる。
本発明の文脈において、「プロダクトストリーム」という用語は、プロダクトおよび本発明による方法の他の方法工程各々の結果を含有する異成分から成る細胞培養物−流体混合物の細胞を含まない流体、すなわち、濾過後、クロマトグラフィー後、ウイルス枯渇後、限外濾過後、透析濾過後、または本発明による方法のさらなる工程後のプロダクトストリームを意味する。前記プロダクトストリームはさまざまな濃度およびさまざまな純度を有しうる。
本発明の文脈において、「ウイルス枯渇」という用語は、処理される流体に存在するウイルスの完全な不活性化および／または除去に至るまでの、処理される流体のユニット体積当たりの活性があるウイルスの濃度の低下を意味する。
本発明の文脈において、「バブルトラップ」という用語は、気泡を集める装置を意味し、これが起っているとき、当該流体は脱気される。
本発明の文脈において、「モジュラー」という用語は、本発明による方法の個々の工程が、相互につながっている別個のモジュールで実施でき、そのモジュールは予め構成され、且つ微生物が低減され、閉鎖された方法およびさまざまな組合せで互いにつなげることができることを意味する。
本発明の文脈において、「モジュラーシステム」という用語は、流体（「プロダクトストリーム」）を運ぶことができる、少なくとも２つのダウンストリーム工程および／またはアップストリーム工程を実施するために相互につながった一連のモジュール（「ユニット」）を意味する。本発明によれば、そのユニットは工程を連続的に実施するのに適し、連続的な流体ストリーム（「プロダクトストリーム」）で操作することができる。「モジュラーシステム」の個々のモジュールはいずれの組み合わせでも互いにつなげることができる。
本発明の文脈において、「閉鎖された」という用語は、本発明による方法および本発明によるモジュラーシステムによって製造および／または加工されたプロダクトが室内環境に曝露されないように操作される該方法および該モジュラーシステムの操作モードを意味する。材料、対象物体、およびバッファーなどを、本発明による閉鎖された方法および対応する本発明による閉鎖されたモジュラーシステムに外から加えることができ、その添加は製造および／または加工されたプロダクトの室内環境への曝露が回避されるような方法で行われる。
先行技術で既知の慣習的な方法には、さまざまなデメリットがあり、それらを下記で扱う。
バイオ医薬プロダクトおよび生物学的プロダクトを製造するための既知の方法は典型的に、互いにつながっている以下の製造工程を含む。
１ 灌流培養
２ 細胞保持システム、
工程１および２の代わりとして、流加培養も想定することができる。
３ 細胞除去
４ バッファーまたは培地交換、好ましくは、濃縮とともに交換
５ バイオバーデンを減らすこと、好ましくは、滅菌濾過による
６ キャプチャークロマトグラフィー
１ 灌流培養
２ 細胞保持システム、
工程１および２の代わりとして、流加培養も想定することができる。
３ 細胞除去
４ バッファーまたは培地交換、好ましくは、濃縮とともに交換
５ バイオバーデンを減らすこと、好ましくは、滅菌濾過による
６ キャプチャークロマトグラフィー
典型的には、プロダクトストリームのさらなる精製のためにさらなる工程が実施される。より具体的には、
７ ウイルス不活性化
８ 中和、および
９ 随意にさらなる深層濾過、バイオバーデンを減らすこと（滅菌濾過）
７ ウイルス不活性化
８ 中和、および
９ 随意にさらなる深層濾過、バイオバーデンを減らすこと（滅菌濾過）
バイオ医薬プロダクト製造における高品質標準の観点から、典型的には以下の工程がさらに実施される。
１０ クロマトグラフィー中間物および高品質精製
１１ バイオバーデンを減らすこと、例えば、滅菌濾過
１２ ウイルス濾過
１３ バッファー交換および好ましくは、濃縮、ならびに
１４ 滅菌濾過
１０ クロマトグラフィー中間物および高品質精製
１１ バイオバーデンを減らすこと、例えば、滅菌濾過
１２ ウイルス濾過
１３ バッファー交換および好ましくは、濃縮、ならびに
１４ 滅菌濾過
上記製造では、栄養素溶液を含有する発酵槽中の細胞が生物学的プロダクト、例えば、タンパク質、例えば、治療用タンパク質を産生する。使用される栄養素溶液は細菌および胞子などの微生物にとっても理想的な増殖培地である。そのような微生物の増殖は望ましくないので、その状況から問題が生じる。栄養素溶液は、プロセスの実行時間が増えるにつれて、微生物の対数増殖に至って、生産された生物学的プロダクトのバッチすべてが失われるまでさらにコンタミネーションされるようになるので、そのような微生物の望ましくない増殖は、特に実行時間が比較的長い場合に問題となる。
清潔な状態および無菌性を最大限維持する一方で、迅速且つ柔軟に製造システムを再ローディングすることに対する必要性応えるために、連続的な製造、好ましくは、使い捨て技術を用いる連続的な製造の概念は市場において常に大きな関心をひいている。
しかし、そのようなプロセスの、２時間またはそれ以上から数日または数週間にわたる範囲の比較的長い実行時間に対して、慣習的な衛生化対策、例えば、１Ｍ ＮａＯＨによる消毒などの、例えば、慣習的な「定置洗浄」（ＣＩＰ）対策は不十分である。したがって、２時間またはそれを超える実行時間の場合、そのような慣習的なプロセスおよびシステムには、コンタミネーションの可能性および／または微生物増殖の可能性の影響を非常に受けやすいというデメリットがある。
一般に、例えば、モノクローナル抗体を作製するとき、プロテインＡカラムを用いる最初のクロマトグラフィー工程の後に、酸性のｐＨ＜４またはアルカリ性のｐＨ＞９によるウイルス不活性化が続く。この工程は時間が非常に重要であり、ある一定の時間、一般的には＜２時間を下回らないことはできない。しかし、過剰長い滞留時間、例えば、４時間の場合、抗体が壊れることになる。
したがって、その微生物低減状態により、数週間の連続モードの操作が可能になる、異成分から成る細胞培養物−流体混合物からプロダクトを連続的に精製する方法が必要である。
これに関連して、常に抗体の溶出は濃度およびｐＨが変動する不連続の時間工程を用いてバッチ式になされるので、アップストリームクロマトグラフィー工程と連動した連続的なウイルス不活性化は特別に重要な課題である。
したがって、本発明の目的は、プロダクト、例えば、タンパク質、を数時間から数週間に至る期間にわたってプロダクトストリームから連続的に溶出することができる方法および対応するシステムを開発することである。連続溶出ストリームではウイルスが絶え間なく枯渇される。
本発明は、複数のクロマトグラフィーカラムからバイオ医薬プロダクト、生物学的プロダクト、高分子プロダクトを連続的に溶出する方法を提供することによってこの目的を達成し、この方法は、
（ａ） インレットを通してプロダクトストリームを供給する工程と、
（ｂ） ローディングゾーンにおいてプロダクトストリームによりｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムをローディング時間ｔＢで同時にロードし、ｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムのアウトレットストリームは、回収ゾーンにある少なくともｎ−１本の回収クロマトグラフィーカラムに同時に分配され、
ｎは１〜５であり、
所与の時点におけるｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムは、０〜Ｌ１の間、Ｌ１〜Ｌ２の間、および最大でＬｎ−１〜Ｌｎの間で変動するローディング時間ｔＢを有し、
各フロントクロマトグラフィーカラムは、Ｌｎの総ローディング時間を有し、
Ｌｎ〜Ｌｎ−１の一定の切換時間ｔＳ後に周期的に、フロントクロマトグラフィーカラムｎはローディングゾーンから出て、回収ゾーンからの回収クロマトグラフィーカラムはローディングゾーンに入ることを特徴とする工程と、
（ｃ） 工程（ｂ）からのプロダクトをロードしたカラムを少なくとも１つの洗浄バッファーで洗う工程と、
（ｄ） 切換時間ｔＳの８０％以上である溶出時間ｔＥで、工程（ｃ）からの洗浄済みカラムからプロダクトを溶出する工程とを含み、
総実行時間ｔＧの８０％超にわたって、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムが連続的に溶出工程（ｄ）にある。
（ａ） インレットを通してプロダクトストリームを供給する工程と、
（ｂ） ローディングゾーンにおいてプロダクトストリームによりｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムをローディング時間ｔＢで同時にロードし、ｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムのアウトレットストリームは、回収ゾーンにある少なくともｎ−１本の回収クロマトグラフィーカラムに同時に分配され、
ｎは１〜５であり、
所与の時点におけるｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムは、０〜Ｌ１の間、Ｌ１〜Ｌ２の間、および最大でＬｎ−１〜Ｌｎの間で変動するローディング時間ｔＢを有し、
各フロントクロマトグラフィーカラムは、Ｌｎの総ローディング時間を有し、
Ｌｎ〜Ｌｎ−１の一定の切換時間ｔＳ後に周期的に、フロントクロマトグラフィーカラムｎはローディングゾーンから出て、回収ゾーンからの回収クロマトグラフィーカラムはローディングゾーンに入ることを特徴とする工程と、
（ｃ） 工程（ｂ）からのプロダクトをロードしたカラムを少なくとも１つの洗浄バッファーで洗う工程と、
（ｄ） 切換時間ｔＳの８０％以上である溶出時間ｔＥで、工程（ｃ）からの洗浄済みカラムからプロダクトを溶出する工程とを含み、
総実行時間ｔＧの８０％超にわたって、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムが連続的に溶出工程（ｄ）にある。
連続的な溶出の技術的な利点は、感度の高いバイオ医薬プロダクト、生物学的プロダクト、高分子プロダクト、例えばモノクローナル抗体を製造する際に、特定の方法工程におけるプロダクト滞留時間が最小化されることである。典型的には、例えば、プロテインＡカラムを用いる第１のクロマトグラフィー工程には、酸性ｐＨ＜４またはアルカリ性ｐＨ＞９によるウイルス不活性化が続くのでこれは本当である。すなわち、ウイルス不活性化の目的のためこの工程は時間が非常に重要であり、ある一定の時間、一般的には＜２時間を下回らないことはできない。しかし、過度に長い滞留時間、例えば、４時間の場合、抗体が壊れることになる。
好ましくは、本発明による方法では、溶出されたプロダクトは溶出工程（ｄ）後に、ホモジナイゼーション工程（ｅ）によって、好ましくは、リサイクリングタンクをもつリサイクリングループによって、またはリサイクリングタンクがないリサイクリングループによって、または使い捨てスタティックミキサーによって混ぜられる。
本発明による方法のさらなる実施形態では、本方法は、工程（ｄ）からの溶出済みカラムを再生する工程（ｆ）をさらに含む。
本発明による方法で使用されるフロントクロマトグラフィーカラムおよび回収クロマトグラフィーカラムは、いずれの好適な結合原理、例えば、リガンドに対するプロダクトの親和性、イオン性相互作用、金属キレート結合、疎水的相互作用、または純粋なファンデルワールス力を呈することができる。
好ましくは、フロントクロマトグラフィーカラムおよび回収クロマトグラフィーカラムは、親和性の原理にしたがって、イオン性相互作用によって、金属キレート結合によって、疎水的相互作用によって、またはファンデルワールス力によってプロダクトに結合する。親和性の原理にしたがって結合する場合、その場合におけるフロントクロマトグラフィーカラムおよび回収クロマトグラフィーカラムは、好ましくは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ならびにプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ＩｇＭ、およびＩｇＧと異なり、プロダクトに対する親和性を有する組換えタンパク質からなる群より選択されるリガンドを含む。
好ましくは、バイオ医薬プロダクト、生物学的プロダクト、高分子プロダクトは、タンパク質、ペプチド、またはＤＮＡもしくはＲＮＡを含み、タンパク質またはペプチドは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換えタンパク質、およびタンパク質ワクチンからなる群より選択され、ＤＮＡまたはＲＮＡはＤＮＡおよび／またはＲＮＡ活性成分またはワクチンの一部である。
本発明による方法のさらなる実施形態では、工程（ｄ）からの溶出されたプロダクトのｐＨは、好ましくはホモジナイゼーション工程（ｅ）の前またはホモジナイゼーション工程（ｅ）に間に、ｐＨ調整剤によってさらに調整される。
好ましくは、工程（ｅ）からのホモジナイゼーションされたプロダクトは規定の滞留時間通路、好ましくはコイルフローインバーター（ＣＦＩ）を通る。
好ましくは、本方法の総実行時間ｔＧは、少なくとも４時間、好ましくは少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも７日、より好ましくは少なくとも４週、および特に好ましくは少なくとも８週である。好ましくは連続モードの操作でのそのような数週間の長い実行時間は、閉鎖されモジュラー式で且つ特に好ましい微生物低減モードでの本方法の操作によって可能になる。
工程（ａ）〜（ｄ）、好ましくは工程（ａ）〜（ｆ）は、微生物を低減させて実施することが好ましい。好ましくは、プロダクトと接触するすべての使用要素、より具体的には、フロントクロマトグラフィーカラムおよび回収クロマトグラフィーカラムは、好適な微生物低減方法による微生物低減に供される。
そのような好適な微生物低減方法は、ガンマ線照射、ベータ線照射、オートクレーブ、酸化エチレン（ＥＴＯ）処理、オゾン処理（Ｏ３）、過酸化水素処理（Ｈ２Ｏ２）、および定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）処理からなる群より選択することができる。
好ましくは、本方法で使用される液体、気体、および固体はすべて、微生物低減に供され、その微生物の低減は、好ましくは孔径が好ましく≦０．４５μｍ以下のフィルターを通した濾過によって達成される。好ましくは、インプロセス滅菌は本方法の間に実施されない。
本発明のさらなる実施形態では、クロマトグラフィーカラムに入るすべての流体の脱気は工程（ｂ）の前に実施され、その脱気は好ましくは、少なくとも１つのバブルトラップによって、および／または少なくとも１つの真空での疎水性精密濾過膜によって、および／または超音波を用いた処理によって、および／またはヘリウムでのスパージングによって達成される。
好ましい実施形態を含む本発明を、以下の図面および例と併せて説明する。本発明はそれらの図面および例に限定されない。文脈から矛盾が明らかでない場合、実施形態は所望の通りに互いに組み合わせることができる。
以下を示す。
以下を示す。
実施例１
実施例１ではＩｇＧ１モノクローナル抗体を使用した。発酵槽培養液を流加回分法によって調製した。供給濃度は０．８〜１．５ｇ／ｌ相当であった。使用したクロマトグラフィーシステムはＴａｒｐｏｎシステムであった。該システムでは内径が１６ｍｍのカラムが１２本使用された。カラムをＧＥ社のプロテインＡ樹脂、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅで充填した。製造業者の仕様書に従ってカラムは体積１６．１ｍｌで高さ８ｃｍに充填した。
Ｔａｒｐｏｎシステムには８本のインレットがあった。インレットの構成は次の通りであった。
インレット１：フロントカラムのアウトレットとの接続
インレット２：発酵槽培養液供給
インレット３：洗浄１バッファー
インレット４：洗浄２バッファー
インレット５：溶出バッファー
インレット６：再生バッファー
インレット７：定置洗浄（ＣＩＰ）
インレット８：平衡化バッファーまたは洗浄３バッファー
実施例１ではＩｇＧ１モノクローナル抗体を使用した。発酵槽培養液を流加回分法によって調製した。供給濃度は０．８〜１．５ｇ／ｌ相当であった。使用したクロマトグラフィーシステムはＴａｒｐｏｎシステムであった。該システムでは内径が１６ｍｍのカラムが１２本使用された。カラムをＧＥ社のプロテインＡ樹脂、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅで充填した。製造業者の仕様書に従ってカラムは体積１６．１ｍｌで高さ８ｃｍに充填した。
Ｔａｒｐｏｎシステムには８本のインレットがあった。インレットの構成は次の通りであった。
インレット１：フロントカラムのアウトレットとの接続
インレット２：発酵槽培養液供給
インレット３：洗浄１バッファー
インレット４：洗浄２バッファー
インレット５：溶出バッファー
インレット６：再生バッファー
インレット７：定置洗浄（ＣＩＰ）
インレット８：平衡化バッファーまたは洗浄３バッファー
クロマトグラフィー系のアウトレットは次の通りであった。
アウトレット１：洗浄ストリーム
アウトレット２：閉鎖
アウトレット３：溶出
アウトレット４：洗浄廃液
アウトレット５：回収ゾーンからの通過画分廃液
アウトレット６：インレット１につなげられたフロントカラムのアウトレット
アウトレット１：洗浄ストリーム
アウトレット２：閉鎖
アウトレット３：溶出
アウトレット４：洗浄廃液
アウトレット５：回収ゾーンからの通過画分廃液
アウトレット６：インレット１につなげられたフロントカラムのアウトレット
インレット２〜６には各々、別々のピストンポンプを通してそれぞれの溶液／バッファーを供給した。
バッファー系は次のように構成した。
洗浄１：５０ｍＭ トリス、２．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７
洗浄２：５０ｍＭ ＮａＡｃ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５
溶出バッファー：１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５
再生バッファー：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．７
洗浄３／平衡化バッファー：５０ｍＭ トリス／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７
ＣＩＰ：０．５Ｍ ＮａＯＨ
バッファー系は次のように構成した。
洗浄１：５０ｍＭ トリス、２．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７
洗浄２：５０ｍＭ ＮａＡｃ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５
溶出バッファー：１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５
再生バッファー：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．７
洗浄３／平衡化バッファー：５０ｍＭ トリス／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７
ＣＩＰ：０．５Ｍ ＮａＯＨ
ローディングゾーンにおいて、各フロントカラムに３２．２５カラムボリュームを３０ｍｌ／分の供給速度でローディングした。このローディングの間、３本のカラム常に同時にローディングゾーンにあり、４本の回収カラムは同時に回収ゾーンに位置した。これらの回収カラムはローディングゾーンから未結合のＩｇＧを集めることができた。切換時間は１７．２９分であった。
フロントカラムに切換時間の３倍の時間でロードした後、洗浄１を１０ＣＶ用いてそのカラムを切換時間と同じ時間で洗った。その後、カラムを同様にして洗浄２を１０ＣＶ用いて切換時間と同じ時間洗った。その後、洗浄３は５ＣＶで切換時間の半分の時間で洗浄済みカラム上の塩負荷を減らした。
次に、洗浄済みカラムを４．５ＣＶでちょうど切換時間と同じ時間で溶出した。それによって、￣４．２ｍｌ／分での連続溶出ストリームがプロセス全体で実現した。次いで、カラムの再生、ＣＩＰ、および平衡化をそれぞれ５、３、および５ＣＶのボリュームを用いて切換時間の半分の時間で行った。
連続溶出ストリームを４．２ｍｌ／分の流量でホモジナイゼーションループに供給した。この供給では、図４に概略的に示されるように溶出液のｐＨは３．１〜６．６を変動した。ウイルス不活性化に関して、効果的なウイルス不活性化を達成するためにｐＨ＜４が必要であった。図４に示されるように、ホモジナイゼーションの結果として大きなｐＨ変動は３．９の最大ｐＨにまで減った。ホモジナイゼーションループは内径が６．４ｍｍで容量が３０ｍｌの配管からなる。そのループでは蠕動ポンプが内容物を３８０ｍｌ／分の流量で送る。インレットからアウトレットへの方向に対して流れる流れの方向によって短絡流のリスクを最小限にした。ホモジナイゼーションしたプロダクトはホモジナイゼーションループからの溶出液と同じ流量で流れた。そのプロダクトを次に滞留時間ループに導いた。滞留時間ループは、理想的なプラグフローの分布に匹敵する狭い滞留時間分布を有するコイルフローインバーター（ＣＦＩ）であった。ＣＦＩの最小滞留時間は６０分であった。ＣＦＩの設定は、Ｋｌｕｔｚら（Klutz, S., Kurt, S.K., Lobedann, M., Kockmann, N., 2015）および「Narrow residence time distribution in tubular reactor concept for Reynolds number range of 10-100, Chem. Eng. Res. Des. 95, 22-33」に記載されている。技術データを表１に載せる。
表１：連続的に操作されたウイルス不活性化のＣＦＩ反応装置の設定パラメーター
本出願につながった研究は、欧州地域開発基金（ＥＲＤＦ）の一部として、「Bio.NRW: MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich」[Bio.NRW: MoBiDiK - modular bioproduction - disposable and continuous]助成契約に基づいて資金を受けた。
Claims (12)
- 複数のクロマトグラフィーカラムからバイオ医薬プロダクト、生物学的プロダクト、高分子プロダクトを連続的に溶出する方法であって、
（ａ） インレットを通してプロダクトストリームを供給する工程と、
（ｂ） ローディングゾーンにおいて前記プロダクトストリームによりｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムをローディング時間ｔＢで同時にロードし、前記ｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムのアウトレットストリームは、回収ゾーンにある少なくともｎ−１本の回収クロマトグラフィーカラムに同時に分配され、
ｎは１〜５であり、
所与の時点における前記ｎ本のフロントクロマトグラフィーカラムは、０〜Ｌ１の間、Ｌ１〜Ｌ２の間、および最大でＬｎ−１〜Ｌｎの間で変動するローディング時間ｔＢを有し、
各フロントクロマトグラフィーカラムは、Ｌｎの総ローディング時間を有し、
Ｌｎ〜Ｌｎ−１の一定の切換時間ｔＳ後に周期的に、前記フロントクロマトグラフィーカラムｎは前記ローディングゾーンから出て、前記回収ゾーンからの回収クロマトグラフィーカラムは前記ローディングゾーンに入ることを特徴とする工程と、
（ｃ） 工程（ｂ）からのプロダクトをロードしたカラムを少なくとも１つの洗浄バッファーで洗う工程と、
（ｄ） 前記切換時間ｔＳの８０％以上である溶出時間ｔＥで、工程（ｃ）からの洗浄済みカラムから前記プロダクトを溶出する工程とを含み、
総実行時間ｔＧの８０％超にわたって、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムが連続的に溶出工程（ｄ）にある、方法。 - 溶出工程（ｄ）後において、溶出されたプロダクトは、ホモジナイゼーション工程（ｅ）によって、好ましくは、リサイクリングタンクを備えるリサイクリングループによって、またはリサイクリングタンクのないリサイクリングループによって、または使い捨てスタティックミキサーによって混合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- （ｆ） 工程（ｄ）からの溶出済みカラムを再生する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 前記フロントクロマトグラフィーカラムおよび前記回収クロマトグラフィーカラムは、親和性の原理にしたがって、イオン性相互作用を介して、金属キレート結合を介して、疎水的相互作用を介して、またはファンデルワールス力を介してプロダクトに結合することを特徴とし、親和性の原理にしたがって結合する場合の前記フロントクロマトグラフィーカラムおよび前記回収クロマトグラフィーカラムが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ならびにプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ＩｇＭ、およびＩｇＧと異なり、プロダクトに対する親和性を有する組換えタンパク質からなる群より好ましくは選択されるリガンドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオ医薬プロダクト、生物学的プロダクト、高分子プロダクトは、タンパク質であり、ペプチドであり、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含み、
前記タンパク質またはペプチドは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換えタンパク質、およびタンパク質ワクチンからなる群より選択され、
前記ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ活性成分またはワクチンの一部であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 工程（ｄ）からの前記溶出されたプロダクトのｐＨは、好ましくはホモジナイゼーション工程（ｅ）の前またはホモジナイゼーション工程（ｅ）に間に、ｐＨ調整剤によってさらに調整されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｅ）からのホモジナイゼーションされたプロダクトは、規定の滞留時間通路を通して、好ましくはコイルフローインバーター（ＣＦＩ）を通して導かれることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 前記方法の総実行時間ｔＧが、少なくとも４時間、好ましくは少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも７日、より好ましくは少なくとも４週、および特に好ましくは少なくとも８週であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ａ）〜（ｄ）、好ましくは工程（ａ）〜（ｆ）が、微生物を減じて実施され、好ましくは前記プロダクトと接触するすべての使用要素、より具体的には前記フロントクロマトグラフィーカラムおよび前記回収クロマトグラフィーカラムは、好適な微生物低減方法による微生物低減に供されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記好適な微生物低減方法は、ガンマ線照射、ベータ線照射、オートクレーブ、酸化エチレン（ＥＴＯ）処理、オゾン処理（Ｏ３）、過酸化水素処理（Ｈ２Ｏ２）、および定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）処理からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
- 前記方法で使用される液体、気体、および固体はすべて、微生物低減に供され、前記微生物低減は好ましくは、孔径が好ましくは０．４５μｍ以下のフィルターを通した濾過によって達成され、インプロセス滅菌は好ましくは、前記方法の間に実施されないことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーカラムに入るすべての流体の脱気は、工程（ｂ）の前に実施され、前記脱気は好ましくは、少なくとも１つのバブルトラップによって、および／または少なくとも１つの真空での疎水性精密濾過膜によって、および／または超音波を用いた処理によって、および／またはヘリウムでのスパージングによって達成されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15167518.8A EP3037513A1 (de) | 2015-05-13 | 2015-05-13 | Verfahren zur kontinuierlichen elution eines produktes von chromatographiesäulen |
| EP15167518.8 | 2015-05-13 | ||
| PCT/EP2016/060368 WO2016180797A1 (de) | 2015-05-13 | 2016-05-10 | Verfahren zur kontinuierlichen elution eines produktes von chromatographiesäulen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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