CN101687119B - 色谱方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种模拟的移动床方法，其中在至少一个吸附剂与目标化合物结合之后，清洗所述至少一个吸附剂，并且在其中将来自所述吸附剂的出口的清洗液体随后通到另外一个吸附剂上，来结合通过所述的清洗所除去的目标化合物。在一种实施方案中，该方法包含使用三个或多个串联连接的吸附剂来结合至少一种目标化合物，和从所述的三个吸附剂中来洗提目标化合物。在结合到吸附剂之后，将清洗液体通过所述的吸附剂，来回收解吸的和/或未结合的目标化合物，和将出口的这样的清洗液体导入到在所述串联中的下一个吸附剂，还没有供料加入到该下一个吸附剂中。目标化合物通过从清洗过的吸附剂中洗提目标化合物来进行回收。

Description

色谱方法
技术领域
本发明涉及色谱法，并且更具体的，涉及在连续色谱法中经济性的加工和生产量的提高。本发明包含一种使用半连续色谱法分离目标化合物的方法，以及用于进行这样的方法的系统。 
发明背景 
在生物制药领域中，在遗传工程和细胞培养工艺中新近的进步已经驱动了比以往更高的表达度(expression levels)，这给下游的净化，特别是俘获步骤带来了相当大的负担。虽然引入新的色谱树脂明显的提高了基于常规的固定床色谱法的加工效率，但是通过连续方式的运行能够获得另外的益处。当使用连续的生物反应器例如这些以灌注方式运行的反应器时，后者是特别吸引人的。 
在连续色谱法中，根据所述方法的需要，将几个同样的色谱柱以这样的排列连接在一起，该排列允许色谱柱串联的和/或平行的运行。因此，全部的色谱柱可以大体上同时运行，但是方法步骤稍有变化。该程序可以重复，以使得每个色谱柱在该加工中填加、洗提和再生几次。与“常规的”色谱法相比(在该常规色谱法中，在基于多个同样的色谱柱的连续色谱法中，单个色谱循环是基于几个连续步骤的，例如填加、清洗、洗提和再生的)，全部的这些步骤是同时的、但是每个步骤是在不同的色谱柱上发生的。连续色谱法运行产生了更佳的色谱树脂利用率，降低了加工时间和减少了缓冲液的需要，全部这些都有利于经济性的进行加工。连续色谱法有时候表示模拟的移动床(SMB)色谱法。 
Bishop等人(“Simulated Moving Bed technology inBiopharmaceutical Processing”，Bischops，M.和Pennings，M.，RecoveryBiological Products XI，(2003)Banff，Alberta，加拿大)公开了一种基于模拟的移动床(SMB)技术的连续色谱法，其已经成功的用于实验室规模的使用蛋白质A亲合性树脂的I gG的净化。虽然存在着这样的事实，即，SMB所提供的多色谱柱和多区域连续方案明显的提高了加工效率，但是SMB系统到目前为止还没有用于cGMP生物制药生产中，这主要是因为 来自硬件和操作观点二者的系统的复杂性。 
Heeter等人(Heeter，G.A.和Liapis，A.I.，J.Chrom A，711(1995))已经提出了一种基于三柱周期性逆流色谱法(3C-PCC)原理的方法，来作为典型的四区域SMB系统的替代。更新的，Lacki等人(“Protein ACounter-Current Chromatography for Continuous AntibodyPurification”，Lacki，K.M.和Bryntesson，L.M.，ACS(2004)Anaheim，CA USA)描述了将这样的3C-PCC系统用于IgG在MabSelectTM亲合性树脂上的吸收。这种3C-PCC方法比典型的四区域SMB系统需要更简单的硬件，并且更容易操作，直接降低了与固定设备和系统维护相关的成本。 
实际上，模拟的移动床技术已经在不同的其他领域中应用了几十年。例如，US 3291726(Universal Oil Products)在1966年就描述了一种连续的模拟的逆流吸附方法，用于石化工业。 
US6325940(Daicel)涉及一种模拟的移动床色谱法系统，其包含用分离性填料填充的床，通过该方法能够评价填充床的分离性能，而不需将该填充床从循环的流体通过中除去。由于该填充床能够不需除去其而评价，因此能够检查所述系统的系统劣化是否是由于色谱柱引起的，并且如果是，则该色谱柱导致了劣化。该系统包含至少四个串联连接的并且彼此循环的填充床和用于加入和取出流体的端口。 
US5457260(UOP Inc.)涉及一种用于模拟的移动吸收床分离的控制方法。更具体的，公开了一种方法，其连续的控制模拟移动吸收床分离方法的至少一种特征。所控制的特征可以是感兴趣成分的净化或者回收。该方法包括测量泵周围或者驱动周围流体中的成分的浓度，计算所述的特征值，和根据运算法则进行所需的操作变量的调节，该运算法则在特征值的变化与由于操作变量的变化导致的成分浓度变化之间建立了联系。因此，快速的产生了控制分离所必需的数据量，由此提供效率、精度和准确度。 
用于可靠的连续加工的一个基本的因素是所用的色谱柱的质量，并且更具体的，是色谱柱之间的类似性乃至同一性。如果色谱柱不同，则理论计算将是不正确的，并且设计一个有效和有力的连续色谱加工将变得很困难。同样，出于按比例增大的考虑，系统中具有同样的色谱柱是基本的。但是，为了获得可重复的结果，用色谱介质填充色谱柱是非常复杂的。甚至板数或者其他填充性能小的差异都会对最终的结果产生巨 大的影响。 
用于大规模色谱法的预填充色谱柱是市售的。预填充色谱柱的优点在于供应商将已经用树脂填充的色谱柱提供给终端用户，由此所述的用户可以将该色谱柱包括到加工中，而不必经历相当复杂的色谱柱填充程序。但是，对于这样的在连续色谱法中有用的色谱柱而言；它们需要以非常苛刻的规格进行填充。这样类似的色谱柱被用于分析等级色谱法，和用于小规模制备色谱法。但是，对于大规模运行来说，这里仍然需要预填充色谱柱，其具有合适的装置来连接到这样的系统，该色谱柱是用苛刻规格进行填充的。 
在制药工业中，生物分子例如蛋白质、核酸等通常是通过使用单个色谱柱的常规色谱法进行分离的。但是，即使在单个色谱柱中的安全性和质量问题比多个复杂的构造更容易控制，但是人们通常关注的是使用这样的常规色谱法所获得的生产能力。因此，这里在该领域中需要改进的色谱法，其提高了目前用单个柱色谱法所获得的整个的效率和经济性。 
发明内容
在一方面，本发明提供了一种用于半连续液体色谱法系统的新颖的运行原理。更具的，本发明提供了一种来自流体混合物例如发酵液的成分中所期望成分的提高的产量。这可以如附加的权利要求所述来实现。 
在具体的一方面，本发明在液体色谱法中提供了改进的色谱性能，该方法包含在洗提(elution)步骤之前，清洗(wash)至少一种目标物已经结合到其上的树脂。 
在另一方面，本发明提供了在本发明的半连续色谱法中使用一组至少三个基本相同填充的色谱柱。 
本发明另外的方面和优点将从下面的详细说明和实施例中变得显而易见。 
附图说明
图1表示了根据本发明的三个色谱柱周期性逆流(3C-PCC)系统的图示。 
图2表示了在本发明的3C-PCC系统中，在填加色谱柱1和2的过程中供料溶液的流程。 
图3表示了在本发明的3C-PCC系统运行过程中，供料和缓冲液清洗的流程。 
图4表示了在本发明的3C-PCC运行过程中，在一个阶段中供料和再生流的流程。 
图5表示了根据本发明，基于 
Figure G200880020436XD00041
探测器平台(GE HealthcareBio-Sciences，瑞典乌普萨拉)的本发明目前的3C-PCC图。 
图6表示了在本发明的3C-PCC系统的启动循环过程中，来自全部三个色谱柱的流出物流中的记录信号。 
图7表示了在本发明的3C-PCC系统的4.66个完全循环过程中，来自全部三个色谱柱的流出物流中的记录信号。 
图8表示了如实施例2所述获得的色谱图中的记录信号。 
定义
术语“供料”指的是一种液体，其包含两种或者多种待分离的化合物。在本文的上下文中，术语“化合物”以广泛的含义用于任何的实体例如分子，化学化合物，细胞等等。 
术语“目标化合物”在此表示任何的化合物，其被期望从包含一种或多种另外的化合物的液体中进行分离。因此，“目标化合物”可以是所期望的化合物例如药物、诊断剂或者疫苗；或者，可选择的，污染性或者不期望的化合物，该化合物应当从一种或多种期望的化合物中除去。 
术语“突破点”(break-through)表示在供料加入到吸附剂例如填充的色谱柱过程中，流出物中首先出现吸收的化合物的时间点。换句话说，“突破点”是当目标化合物开始损失时的时间点。 
术语“饱和程度”表示当吸附剂例如填充的色谱柱仅仅保持了一部分它的初始吸收具体目标化合物的能力的时间点。 
术语“完全饱和”表示当吸附剂例如填充的色谱柱不再吸收任何的具体目标化合物时的时间点。 
术语“再生”在此表示一种处理吸附剂来使它重新用于色谱法中的方法。因此，“再生”将包括结合的化合物的释放(也称作化合物的洗提)，以及用适当的吸收缓冲液的再平衡。如下面所讨论的，“再生”还可以包括在适当位置的清洗(CIP)。 
术语“清洗”在此表示这样一种方法，其用合适的液体处理吸附剂例如色谱柱，来洗出例如一种或多种未结合的目标化合物，或者洗出在它饱和到期望的饱和度之后，弱到足以从吸附剂上释放的目标化合物。 
术语“亲合性树脂”在此表示一种树脂，其中配位体的官能团能够 通过“锁/钥匙”机理来结合目标化合物，例如已知的是抗体/抗原；酶/受体；生物素/抗生物素蛋白；蛋白质A/抗体等等亲合性树脂以高特异性来结合目标化合物，并且所述的结合通常基于大于一种的相互作用。公知的亲合性树脂是例如偶合到粒子的蛋白质A，例如蛋白质A Sepharose TM或者Prosep ATM。 
术语“半连续”色谱法系统在此表示一种用于连续吸收但是不连续洗提的系统。 
术语“流动程序化”表示在将供料施用到色谱柱的过程中，供料流速有意的变化。 
术语“俘获”在上下文中表示第一色谱步骤的色谱方法，其中俘获了大量的目标化合物。 
具体实施方式
因此，在第一方面，本发明涉及一种从供料中分离至少一种目标化合物的方法，该方法是一种模拟的移动床方法，其中在至少一个吸附剂与目标化合物结合之后，清洗所述至少一个吸附剂，并且在其中将来自所述吸附剂的出口的清洗液体随后通到另外一个吸附剂上，来结合通过所述的清洗所除去的目标化合物。清洗液体导入其中的吸附剂有利的是新鲜的吸附剂，目标化合物还没有结合到其上。因此，每次将供料重新导入系统中的另外一个吸附剂中时，所述的吸附剂将具有少量的已经结合的目标化合物。因此，本发明能够有效的回收目标化合物。 
本发明的一个实施方案是一种从供料中分离至少一种目标化合物的方法，该方法包含将至少一种目标化合物连续的结合到三个或多个串联连接的吸附剂中的一个或多个上，和从所述的三个吸附剂中不连续的洗提目标化合物；其中在结合之后，将清洗液体通过每个吸附剂，来回收解吸的和/或未结合的目标化合物，和将出口的这样的清洗液体导入到在所述串联中的下一个吸附剂，其中所述的目标化合物是通过从清洗过的吸附剂中洗提目标化合物来进行回收。如同本领域技术人员将理解的那样，串联中最后的吸附剂被连接到第一个吸附剂上，目的是产生一种循环的加工。从上可见，本发明的系统将是串联运行的，由于吸附剂彼此连接来串联连通，因此虽然色谱柱的再生最有利的是与供料填加基本上同时进行，但是在一个吸附剂中，其已经临时的与所述串联相分离了。 
本发明方法所用的吸附剂可以是填充的床，例如填充在色谱柱中的 色谱树脂，隔膜，整料，中空纤维或者任何其他合适的形式。在本文上下文中，应当理解本发明的方法对于任何这样的吸附剂是有用的，在其中突破点曲线出现在施用供料的过程中。如同本领域技术人员将要理解的那样，为了充分的利用本发明的优点，吸附剂应当是相同种类的，例如包含相同种类填充材料的色谱柱。色谱树脂可以例如是亲合性树脂，例如蛋白质A-基树脂；称作IMAC树脂的螯合树脂；疏水相互作用色谱(HIC)树脂；嗜硫树脂；离子交换树脂，和多形态树脂，在其中配位体包含了两个或者多个官能度，例如多形态离子交换剂。色谱树脂的配位体例如在包含非常小的基本球形粒子的树脂中，可以偶合到粒子上。隔膜可以是任何的厚度，并且包括结合基团已经偶合到其上的过滤器，过滤器堆栈体，和其他变体。整料是色谱领域中公知的，并且通常是合成聚合物塞，其可以如隔膜一样薄，或者厚到填充了部分或者全部的色谱柱。 
更具体的，在一种实施方案中，本发明的方法包含： 
(a)将包含至少一种目标化合物的供料通过第1吸附剂，并且将来自该第1吸附剂的流出物导入到第2吸附剂中； 
(b)将所述供料重新导入到第2吸附剂，并将清洗液体通过目标化合物已经结合到其上的第1吸附剂； 
(c)将该清洗液体流出物导入到第3吸附剂，并随后将来自第2吸附剂的流出物导入到第3吸附剂； 
(d)再生该第1吸附剂； 
(e)将所述的供料重新导入所述的第3吸附剂，并将清洗液体通过目标化合物已经结合到其上的第2吸附剂； 
(f)将该清洗液体流出物导入到第1吸附剂，并随后将来自第3吸附剂的流出物导入到第1吸附剂； 
(g)再生第2吸附剂； 
(h)将所述的供料重新导入所述的第1吸附剂，并将清洗液体通过目标化合物已经结合到其上的第3吸附剂； 
(i)将该清洗液体流出物导入到第2吸附剂，并随后将来自第1吸附剂的流出物导入到第2吸附剂； 
(j)再生第3吸附剂；和 
(k)重复步骤(b)-(j)； 
其中至少一种目标化合物是在步骤(d)、(g)和/或(j)中进行收集的。 
施用到本发明方法所用的吸附剂上的供料可以是任何的液体混合物，有利的是包含通过细胞表达的生物分子的发酵液。在一种可选择的实施方案中，该供料包含血液或者血浆，或者一些其他的生物流体。该供料有利的是与合适的缓冲液相结合。这样的缓冲液将根据目标化合物的性质、色谱树脂和其他参数进行选择，并且将其调整到适于结合(即，目标化合物的吸收)的条件。 
在本发明方法的一种实施方案中，供料是上述的发酵液或者生物流体，其已经进行了一个或多个步骤或者预处理例如过滤(例如用来除去细胞片段)，絮凝，沉积或者色谱法。在本发明一种有利的实施方案中，本发明方法被用于处理大体积液体的加工中，例如用于如下所述的用于净化生物分子的大规模生物制药方法的第一步中。即使本发明可以同等的用于小规模或者分析规模，但是在加工生产量方面来说，体积越大，它的优点越显著。在一种实施方案中，本发明方法所用的每个吸附剂的体积至少是1升，例如1-100升的范围。在另外一种实施方案中，每个吸附剂的范围是1-60升，例如大约56升，在另外一种实施方案中是1-40升，并且在进一步的实施方案中是1-30升。在一种具体的实施方案中，每个吸附剂的体积范围是10-20升。 
目标化合物可以例如选自蛋白质，例如隔膜蛋白质或者抗体，例如单克隆抗体，包含抗体或者抗体片段的融合蛋白质，例如Fab片段，和重组细胞蛋白质；肽；核酸，例如DNA或者RNA，例如低聚核苷酸，质粒，或者染色体组的DNA；细胞，例如原核或者真核细胞或者细胞片段；病毒；朊蛋白(prions)；糖类；脂质等等。在一种实施方案中，至少一种目标化合物是期望的实体，例如生物制药的或者药物的候选物(candidate)，诊断分子或者疫苗。在这种实施方案中，污染物将通过本发明系统的吸附剂；或者在不同于目标化合物的这些条件的条件下结合而非洗提。 
在一种可选择的实施方案中，至少一种目标化合物是残留在流过吸附剂的液体中的污染物，和期望的生物制药或者药物的候选物(candidate)，诊断分子或者疫苗。这种最后提到的实施方案被称作“流过”模式的色谱法。在一种具体的流过模式的实施方案中，在将本发明的方法重复某些次数之后，将污染物已经结合到其上的吸附剂丢弃掉。这种吸附剂被称为一次性的，或者单次使用的产品，并且特别有利的是在高纯度要求的方法中用于高风险污染物例如朊蛋白或者病毒，例如在 医学领域中。 
在一种有利的本发明方法的实施方案中，一旦供料已经供给到具体的吸附剂，则有利的是将来自所述的吸附剂的流出物丢弃，直到大约目标化合物开始从吸附剂中出来的时间(也称作目标的突破点)为止，在合适的时间期间之后，将该流出物导入所述串联中的下下一个吸附剂，由于目标化合物被俘获在该下一个吸附剂上，由此避免了该化合物的实质性损失。但是，如同本领域技术人员将要理解的那样，丢弃任何的流出物并非本发明的本质所需。如果期望的，例如由于可利用的装置的限制，本发明方法可以包括从开始时就将流出物导入到所述的色谱柱中，即，不丢弃任何的流出物。本领域技术人员能够容易的判定突破点出现的时间，以及决定在该突破点之前、之中或者之后，是否将将流体导入到下一个吸附剂中。由于流出物的这种重新导入将在接近于突破点时进行，因此我们有时候在此将它称作“突破重新导入点”。目标化合物的检测可以通过任何通常使用的检测方法例如UV来获得。检测器将在下面更详细的讨论。容易理解，突破点的检测不需要在每个色谱法循环中进行。更合适的，一旦过程已经被优化，则通过流出物的体积；或者通过简单的测量从所述供料供给开始后过去的时间，就很容易确定该时间点。 
但是，作为公知的，在突破点之后，在吸附剂完全被目标化合物饱和之前通常需要经过更多的时间。出于加工经济性的原因，最普遍期望的是将每个吸附剂用到它饱和为止。因此，上述的突破重新导入点与供料实际上重新导入串联中下一个吸附剂的时间之间有利的是经过一定的时间期间。本领域技术人员基于目标化合物的突破点曲线，能够容易的决定何时将供料重新导入下一个色谱柱，和决定在完全饱和之前、之中或之后，这个预定的时间点(其有时候在此称作“包含重新导入点”)是否会发生。 
因此，提到本发明方法具体实施方案的重复循环时，突破重新导入点将出现在步骤(b)，(e)和(h)中，而饱和重新导入点将出现在步骤(c)，(f)和(i)中。 
作为本领域公知的，通常是这样的情况，即，并且全部的目标化合物实际上都结合到所述的树脂上，相反，一些目标化合物通常从该树脂上解吸。在色谱法中最普遍的是简单的冲洗目标化合物已经结合到其上的树脂，然后将该冲洗液体丢弃。因此，通过这样的常规操作，一定量 的目标化合物将会损失，并且没有回收。但是，在本发明的方法中，一旦供料被转移到串联中的下一个吸附剂，则前面的吸附剂将可用于清洗和再生。当清洗该吸附剂时，将使用这样的条件，该条件使得大部分目标化合物得以保持结合，而解吸的和/或未结合的目标化合物将出现在清洗液体流出物中。根据本发明，将该清洗液体流出物导入到串联中的下下一个吸附剂，来俘获目标化合物。本领域技术人员很容易选择合适的清洗液体例如缓冲液。在一种实施方案中，在给定的时刻，清洗液体流出物和来自接收供料的吸附剂的流出物在该时刻可以先后施用，或者或多或少的同时施用。这很容易通过调节各个流速的流速和通过使用适当的阀来选择。流速的调节将在下面更详细的讨论。 
从上可见，一旦具体的吸附剂已经与该连续的加工循环相脱离，则可以方便的进行再生。清洗过的吸附剂的再生可以通过公知的方法来完成，并且可以包括通常使用的程序，例如洗提；再平衡和在该洗提和再平衡之间任选的更有力的(aggressive)的清洗。因此，为了洗提所结合的目标化合物，将一种能够释放所述目标化合物的液体(称作洗提液)加入到吸附剂中。这可以通过泵驱动该洗提液通过吸附剂来完成，或者，可选择的，作为一个程序来完成，在这里首先加入洗提液，然后使其起作用，并且最终除去。在一种有利的实施方案中，使用入口和出口端口来将洗提液通过吸附剂，所述端口用于加入和取出供料和清洗液体，并且安装有适当的阀门。结合的目标化合物从吸附剂上的洗提可以是逐步的或者使用称作梯度的变化的条件，例如导电率和/或pH梯度。合适的洗提缓冲液和混合梯度的方式是本领域技术人员公知的。 
在目标化合物洗提之后，吸附剂通常需要再平衡，这恢复了施用供料时所用的初始条件，即，这样的条件，在其中一种或多种目标化合物可以结合。再平衡是通过使合适的缓冲液通过该色谱柱来有利的获得的。 
如上所述，吸附剂可以在洗提和再平衡之间进行清洗，该方法通常称作在适当位置的清洗(CIP)。这样的CIP将使用一种比上述的清洗液体更有力的液体，并且可以是例如碱溶液例如氢氧化钠。CIP可以在一定次数的吸收-洗提循环之后进行，或者，可选择的，如果这里有理由这样去作，则它可以作为每个再生的一个要素来进行。吸附剂需要CIP的频率是多少可以由本领域技术人员容易的确定。 
因此，再生应当包含洗提和随后的再平衡。在一种实施方案中，在 每个第二、第三、第五、第十或者第二十个循环中，再生还包含在洗提之后，在适当位置的清洗。在一种具体的实施方案中，每个色谱循环包含再生，该再生除了洗提和再平衡之外，还包括适当位置的清洗。 
本发明方法的步骤(b)-(j)的循环可以重复任意的次数，例如两次、五次、十次或者二十次，全部取决于具体加工的参数。本领域技术人员能够容易的建立起合适的重复循环的方案，包括合适数目的CIP步骤，来分离给定的目标化合物。 
在第二方面，本发明涉及一种液体色谱法系统，用于从供料中分离至少一种成分，该系统包含至少三个串联连接的吸附剂，其中向每个吸附剂提供这样的装置，该装置用于液体的入口和出口。在一种有利的实施方案中，所述的分别用于入口和出口的装置具有阀装置来允许加入两个、三个或多个入口流以及两个、三个或多个出口流。吸附剂可以通过常规的管线或者管道相连接。 
因此，在本发明系统的一种实施方案中，每个吸附剂在入口和/或出口处具有多端口装置。这样的阀装置可以是例如回转阀、开关阀、隔膜阀例如隔膜隔断阀、AKTATM Pilot阀(GE Healthcare，瑞典乌普萨拉)。适用于模拟的移动床色谱法和连续色谱法的阀门是本领域公知的，对其的广泛讨论参见例如US7141172。 
在一种具体的实施方案中，在它的出口，每个吸附剂具有用于检测目标化合物的装置。适于这个目的检测器和传感器是本领域公知的，例如诸如UV吸收度、光散射、折射率等的检测器。本发明的系统还可以具有吸附剂性能评价装置。 
从本发明的第一方面可见，根据本发明，许多的液体流可以加入到每个色谱柱中；即，供料和来自加入到吸附剂的供料的出口料、清洗液体、用于再生和洗提的液体等。本发明的系统可以具有任何用于处理液体流的常规装置。 
在一种有利的实施方案中，本发明利用液体流速程序化以期望的方式来调整液体流彼此的流速。在一种实施方案中，对液体流例如供料或者清洗液体的流速进行调整，来使得能够在供料重新导入到所述的给定吸附剂之前，完成清洗液体出口到该给定吸附剂的加入。因此，在第一实施方案中，提高清洗液体出口到吸附剂的流速。在该实施方案中，供料的流速可以保持不变。在第二实施方案中，供料的流速降低。在该实 施方案，清洗液体出口的流速可以保持不变。流动程序化的一个优点是每个色谱柱的生产率可以显著的提高。 
在第三方面，本发明涉及一种计算机程序，其提供了对本发明的半连续色谱法的流速控制。该程序将提供相互调整的液体流，产生提高的加工生产率。这样的程序可以例如用于抗体或者Fab片段的净化方法中，其中吸附剂包含蛋白质A或者其他亲合性配体。该程序可以提供到合适的载体上，例如CD或者DVD盘，内存条或者任何其他常规使用的形式格式化磁盘。 
本发明一个具体的方面是一种上述的系统，其具有本发明的计算机程序，来提供用于具有流速程序化的半连续运行的自动系统。 
在第四方面，本发明涉及色谱柱在半连续色谱法例如流速程序化的半连续色谱法中的用途，该色谱柱是由供应商用色谱树脂填充来提供的。在一种有利的实施方案中，用于本方面的色谱柱具有基本上相同的填无性能。在一种具体的实施方案中，该预填充的色谱柱是消过毒的，这允许将其用于医药和诊断产品的制备中。在另外一种实施方案中，该预填充的色谱柱已经根据预定的标准进行了规格化。 
用于这个方面的色谱柱可以用任何的色谱树脂，合成基树脂例如苯乙烯-DVB，有机聚合物基树脂例如琼脂糖或者葡聚糖，或者无机树脂例如二氧化硅来填充。有利的是将下面的常规配位体偶合到所述的树脂上：例如亲合性配位体，离子交换配位体，疏水相互作用色谱法(HIC)配位体，螯合配位体，嗜硫配位体或者多形态配位体。该配位体可以根据它们与期望的目标相结合的能力来进行选择，例如蛋白质A配位体，其结合抗体，抗体片段等等；或者根据它们与一种或多种污染物相结合的能力来进行选择，例如DNA结合性配位体例如离子交换配位体。色谱柱可以是玻璃或者塑料的，并且优选采取路厄(luers)和/或接管来连接到本发明的系统上。 
本发明还涉及一组的至少三个色谱柱，其是用上述的色谱树脂填充的，并且其已经根据本发明方法所用的标准进行了规格化。 
附图详细说明 
图1表示了本发明的一种使用三个色谱柱周期性逆流(3C-PCC)系统的实施方案的图示。 
图2表示了在图1的系统中，在用供料填加色谱柱1和2的过程中 供料溶液的流程。 
图3表示了在图1的系统中，在3C-PCC系统运行过程中，在一个阶段中的供料和缓冲液清洗的流程。 
图4表示了在图1的系统中，在3C-PCC运行过程中，在一个阶段中的供料和再生流的流程。 
图5表示了在图1的系统中，基于 
Figure G200880020436XD00121
探测器平台(GE HealthcareBio-Sciences，瑞典)的本发明目前的3C-PCC图。 
图6表示了在图1的系统中，在本发明的3C-PCC系统的启动循环过程中，来自全部三个色谱柱的流出物流中的记录信号。 
图7表示了在图1的系统中，在本发明的3C-PCC系统的4.66个完全循环过程中，来自全部三个色谱柱的流出物流中的记录信号。 
图8表示了如实施例2所述获得的色谱图中的记录信号。更具体的，这个图表示了使用本发明的3C-PCC系统净化来自哺乳动物细胞培养上清液的单克隆抗体的结果。出现在该色谱图中的第一曲线(最初的蓝色曲线)-色谱柱1，出现的第三曲线(红色曲线)-色谱柱2，和出现的第二曲线(绿色曲线)-色谱柱3。 
试验部分
提供了本发明的实施例仅仅用于示例性目的，并且不应当被解释为对附加的权利要求所定义的本发明的限制。 
实施例1
该实施例说明了一种使用本发明的三个色谱柱周期性逆流(3C-PCC)系统的连续的初级俘获步骤，其用于净化在蛋白质A色谱树脂上的人类多克隆IgG。更具体的，三个1毫升色谱柱(HiTrapTM)是用蛋白质A色谱树脂MabSelectTM(GE Healthcare Bio-Sciences，瑞典乌普萨拉)填充的。将该色谱柱连接到一个定制改进的 
Figure G200880020436XD00122
探测器TM(GE HealthcareBio-Sciences，瑞典乌普萨拉)色谱法系统(图5)上，该系统被配置到三个色谱柱周期性逆流系统3C-PCC中。该系统包含两个独立的泵，3个UV检测器，pH和导电率计，几个回转阀和分流机。对UV检测器这样布置，以使得来自每个色谱柱的流出物通过UV检测器。使用UNICORNTM软件(GEHealthcare Bio-Sciences，瑞典乌普萨拉)记录在废弃物管线上所测量的每个UV检测器的吸光率以及pH和导电率水平。将从蛋白质A色谱柱 上洗提的hIgG收集在单个池中。 
下面的单柱色谱法循环被用作以连续的方式运行3C-PCC系统的基础：1)用3色谱柱体积(CV)的缓冲液对色谱柱进行平衡；2)用在缓冲液A中的hIgG填加色谱柱；3)用4CV的缓冲液A清洗色谱柱；4)用4CV的缓冲液B清洗色谱柱；5)用4CV的缓冲液C的CIP色谱柱；和6)3CV的缓冲液A用再生色谱柱。全部的步骤是在0.5mL/min的给定流速进行的。 
所用的溶液的组成在下面给出： 
缓冲液A：50mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7 
缓冲液B：0.1M柠檬酸钠，pH＝3.5 
缓冲液C：50mM NaOH 
供料：1.65g/L的溶解在缓冲液A中的Polynorm hIgG(Octopharm) 
将含有1.6g/L的Polynorm hIgG的400毫升溶液连续的供给到上述的试验3C-PCC装置中。通过将缓冲液B施用到该饱和的色谱柱来将净化的hI gG从该系统中以不连续的方式进行洗提。在图6中表示了在第一的、启动的3C-PCC循环过程中，来自每个色谱柱的流出物中所记录的信号，所述的循环的组成为：1)将供料填加到第一色谱柱中；2)将第1和第2色谱柱串联连接；3)将供料导入第2色谱柱，同时将第1色谱柱清洗到第3色谱柱中；4)将第2和第3色谱柱串联连接，同时施加供料；5)再生第1色谱柱；6)将供料导入到第3色谱柱，并将第2色谱柱清洗到第1色谱柱中；7)将第3和第1色谱柱串联连接，同时连续的施加供料；8)洗提第2色谱柱；9)再生该第2色谱柱；10)将供料导入到第1色谱柱，同时将第3色谱柱清洗到第2色谱柱。图6所示的图案的再现性表示在图7中，这里表示了在14个单个的填加过程中，具有4.7个3C-PCC循环所记录的UV信号。该色谱图表示了如图6和图7所示的来自每个色谱柱的流出物中的IgG浓度，其不是直接的与使用不同的UV检测器所记录的它们相比的。 
在该试验中所获得的结果汇总在下表1中。将这些数据与在单个色谱柱上进行运行的参考物所获的结果进行比较，该单个色谱柱的体积等价于3C-PCC系统中所用树脂总体积。 
表1
3C-PCC和参考的单色谱柱运行的汇总 
Figure G200880020436XD00141
a每单个色谱柱 
b14个单色谱柱填加 
实施例2
该实施例说明了一种使用本发明的三个色谱柱周期性逆流(3C-PCC)系统的连续的初级俘获步骤，其用于净化来自哺乳动物细胞培养上清液的单克隆抗体(MAb)。更具体的，三个1毫升色谱柱(HiTrapTM)是用MabSelectTMSuRe(GE Healthcare Bio-Sciences，瑞典乌普萨拉)填充的，并且将该色谱柱连接到一个基本上如上面的实施例1所述的定制改进的 
Figure G200880020436XD00142
探测器TM(GE Healthcare Bio-Sciences，瑞典乌普萨拉)色谱法系统上。 
简单来说，该单柱色谱法循环用作以连续的方式运行3C-PCC系统的基础，其由下面的步骤组成：1)色谱柱平衡；2)用包含mAb的细胞培养上清液填加色谱柱；3)色谱柱清洗；4)色谱柱洗提；5)色谱柱CIP；和6)色谱柱的再生。图8表示了来自该3C-PCC运行的色谱图。测量洗提部分中的MAb的浓度，并且用于评估产率和生产率，见下表2。 
表2：3C-PCC和单色谱柱运行的比较。 
Figure G200880020436XD00143
*基于1mL色谱柱的数据重新计算的结果 

Claims (22)

1.一种从供料中分离至少一种目标化合物的方法，该方法是模拟的移动床方法，其中在至少一个吸附剂与目标化合物结合之后，清洗所述至少一个吸附剂，并且在其中将来自所述吸附剂的出口的清洗液体随后通到另外的吸附剂上，来结合通过所述的清洗所除去的目标化合物。
2.根据权利要求1的方法，该方法包含将至少一种目标化合物连续地结合到三个或多个串联连接的吸附剂中的一个或多个上，和从所述的三个吸附剂中不连续地洗提目标化合物；其中在结合之后，将清洗液体通过每个吸附剂，来回收解吸的和/或未结合的目标化合物，和将这样的清洗液体的出口导入到在所述串联中的下下一个吸附剂，其中所述的目标化合物是通过从清洗过的吸附剂中洗提目标化合物来进行回收的。
3.根据权利要求1的方法，该方法包含：
(a)将包含至少一种目标化合物的供料通过第1吸附剂，并且将来自该第1吸附剂的流出物导入到第2吸附剂中；
(b)将所述供料重新导入到第2吸附剂，并将清洗液体通过目标化合物已经结合到其上的第1吸附剂；
(c)将该清洗液体流出物导入到第3吸附剂，并随后将来自第2吸附剂的流出物导入到第3吸附剂；
(d)再生该第1吸附剂；
(e)将所述的供料重新导入所述的第3吸附剂，并将清洗液体通过目标化合物已经结合到其上的第2吸附剂；
(f)将该清洗液体流出物导入到第1吸附剂，并随后将来自第3吸附剂的流出物导入到第1吸附剂；
(g)再生第2吸附剂；
(h)将所述的供料重新导入所述的第1吸附剂，并将清洗液体通过目标化合物已经结合到其上的第3吸附剂；
(i)将该清洗液体流出物导入到第2吸附剂，并随后将来自第1吸附剂的流出物导入到第2吸附剂；
(j)再生第3吸附剂；和
(k)重复步骤(b)-(j)；
其中至少一种目标化合物是在步骤(d)、(g)和/或(j)中进行收集的。
4.根据任何一个前述权利要求1-3的方法，其中供料的重新导入是通过阀装置来提供的。
5.根据任何一个前述权利要求1-3的方法，其中至少一个吸附剂是用色谱树脂填充的柱，并且该柱在入口和/或出口处具有多端口装置。
6.根据任何一个前述权利要求1-3的方法，其中控制供料的流速，来提高每个柱的生产率。
7.根据权利要求6的方法，其中对一个或多个另外的液体流的流速进行控制。
8.根据任何一个前述权利要求1-3的方法，其中清洗步骤是用不同的缓冲液来进行的。
9.根据任何一个前述权利要求1-3的方法，其中将每个吸附剂通过多个清洗步骤进行清洗。
10.一种用于实施权利要求1-9之一的方法的液体色谱法系统，其中从供料中分离至少一种成分，该系统包含至少三个串联连接的吸附剂，每个吸附剂是填充在柱中的色谱树脂，其中向每个吸附剂上提供了用于液体入口和出口的装置，并且其中所述的入口和出口装置具有阀装置来允许加入至少三个入口流以及至少三个出口流。
11.根据权利要求10的系统，其中每个吸附剂具有用于检测目标化合物的装置。
12.根据权利要求10的系统，该系统包含3个吸附剂。
13.根据权利要求10的系统，该系统包含三个色谱柱。
14.根据权利要求10-13中任何一个的系统，其中该吸附剂是相同种类的。
15.根据权利要求10-13中任何一个的系统，其中该吸附剂是相同种类的填充有相同种类的色谱树脂的色谱柱。
16.根据权利要求10-13中任何一个的系统，其中每个吸附剂的体积＞1升。
17.一种具有程序的计算机，所述程序用于控制权利要求1-6中任何一个所述的方法，该程序控制每个吸附剂的入口流之间的阀的切换、在每个吸附剂的出口流之间的阀的切换、和/或用于调节至少一个液体流的流速的泵。
18.至少三个预填充的色谱柱的用途，该色谱柱是用权利要求5所述的方法中的色谱树脂填充的。
19.根据权利要求18的用途，其中该色谱柱是用免疫球蛋白结合性树脂填充的。
20.根据权利要求18的用途，其中该色谱柱是用蛋白质A树脂填充的。
21.根据权利要求18的用途，其中该色谱柱是用污染物结合性树脂填充的。
22.根据权利要求18-21中任何一个的用途，其中该预填充的色谱柱是消过毒的。
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