TW202326112A - 在連續層析操作中監測層析樹脂之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於藉由監測緩衝液變化且接著平滑並推導所記錄之值來監測以連續模式操作之層析管柱之品質及效率而不中斷管柱操作之方法。

Description

在連續層析操作中監測層析樹脂之方法
管柱層析廣泛用於生物技術工業中來純化產品。通常，靶向治療蛋白(諸如胰島素或單株抗體)係於原核或真核細胞中產生。然後靶蛋白需自培養基、細胞、細胞碎片及培養過程中產生之任何其他雜質純化。管柱層析係用以藉由(例如)靶蛋白與雜質之間的電荷差、靶蛋白或雜質對配體之親和力及粒徑排阻分離靶蛋白。大多數純化方案需依次進行數個不同之層析步驟來純化靶蛋白。
層析操作要求藉由透過HETP (理論板相當高度)測試來測試填充床之品質定期檢查管柱效率。此測試係一般藉由將該管柱自生產中取出並使用脈衝分析進行。
傳統上，生物製造已以分批模式進行，其中各階段均需要儲存槽或等同物以在連續步驟之間儲存產品。此需要停止及開始過程、耗費時間及使用儲存容器、佔用寶貴空間。連續處理係使原材料(即，經培養之基因改造細胞及培養基)進入製造過程之一端並使產品自另一端流出且無需儲存槽或停止及開始該過程之概念。然而，連續過程使得幾乎不可能有效且一致地監測層析管柱之品質及效率。此項技術中需要監測層析品質而無需停止或延遲用於測試之處理條件之方法。
本發明提供監測管柱層析而無需停止生產過程之方法。換而言之，本發明解決現有技術中難以監測管柱品質及效率(即，管柱性能)之問題。本發明係針對監測連續過程生產場景中之管柱性能而無需停止該過程、無需向方法流程添加另外測試特定步驟或出於管柱測試目的添加特定試劑(諸如脈衝化學品或試劑)。換而言之，監測管柱性能而不中斷該過程。
本發明藉由監測過程參數之相變解決此問題。可經監測以藉由本發明監測管柱性能之過程參數包括，例如(但不限於) a)電導率；b) pH；c)鹽濃度；d)光吸收；e)用合適波長之光激發後之螢光；f)折射率；g)電化學反應；及h)質譜分析資料。一或多個過程參數可於任何生產過程中及針對該生產過程中之任何管柱監測。
在本發明之一項態樣中，藉由量測諸如電導率、吸光度或pH之可量測參數之變化確定填充床之品質。因此，HETP前沿分析之本發明方法由突然改變管柱中流動之溶液以產生量測值之階躍構成。藉由使用對產生彼等步驟之現存層析操作之前沿分析並一個接一個循環重複此分析，可監測層析管柱之填充之品質而不中斷過程。此外，一個接一個循環重複此分析容許吾人在連續過程期間確定管柱品質之變化。
過程參數可藉由使用對正監測之過程參數具有特異性之探針監測。熟習此項技術者或一般技術者將可選擇適用於監測特定過程參數之探針。
過程參數可手動監測，即，由一個人觀察並記錄探針或記錄系統之讀數。然而，較佳地，該等過程參數係由經設計、程式化或調適以監測該等過程參數並記錄來自該等探針之值之電腦或電腦系統自動監測。以此方法可將經觀察並記錄之值輸入程式內用於分析以確定管柱品質是否足以再次運行或該管柱是否需清潔或重新填充。
本發明審慎考慮一種監測以連續過程模式操作之一或多個層析管柱的效率及品質之方法，該方法包括：提供一或多個以連續模式使用之層析管柱；偵測一或多個選自由以下組成之群之過程參數之變化：在緊接將一或多個過程參數不同之一種過程流體交換成另一過程流體之前、期間及之後不久之pH、電導率、鹽濃度、光吸收、用合適波長之光激發後之螢光、折射率、電化學反應及質譜分析，以產生過程資料；將曲線平滑濾波器應用至該過程資料以產生經校正之過程資料；計算該經校正之過程資料之一階導數以產生該經校正之過程資料之經推導之過程資料；確定該經推導之資料之HETP值及不對稱性；將該HETP值及不對稱性與標準化值做比較；其中，若該等HETP值及不對稱性落於該等標準化值內，則該管柱係用於另一過程運行。
本方法進一步審慎考慮曲線平滑計算係薩維茨基-戈萊(Savitzky-Golay)平滑濾波器。
本方法可仍進一步審慎考慮該或該等管柱已連續使用介於2至100次運行之間。
如技術方案項1之方法，其中該或該等管柱已連續使用介於5至50次運行之間。
本方法可仍進一步審慎考慮連續過程模式依次包含至少兩個但不多於五個不同之管柱。
本方法可仍進一步審慎考慮管柱係選自由以下組成之群：親和力、離子交換、粒徑排阻、反相、對掌性、正面及疏水性。
本方法可仍進一步審慎考慮監測各管柱之效率及品質。
本方法可仍進一步審慎考慮連續過程模式包含多個過程步驟，依次包含至少兩個但不多於十個過程步驟及至少一個過程步驟包含層析管柱。
本方法可仍進一步審慎考慮標準化值係基於使用相同或大體上相同之管柱及過程參數之歷史資料。
本方法可仍進一步審慎考慮若HETP值及不對稱性確實不落於該等標準化值內，則管柱係經再生。
本方法可仍進一步審慎考慮HETP值及不對稱性確實不落於該等標準化值內，由自動系統通知操作員。在一些實施例中，該自動系統係警報系統或其他通知系統。經審慎考慮此等警報可存在數個參數。例如，1)啟用/禁用；2)非臨界水準-高/低，其可觸發蜂鳴器並顯示非臨界警報；3)臨界警報-高/低，其停止過程，但操作員必須確認並可重新開始該過程，例如，來完成過程運行。
定義
如本文使用之術語「層析」係指自混合物中存在之其他分子分離受關注之分析物(例如，靶分子)之任何類型之技術。通常，由於混合物之個別分子在移動相之影響下遷移通過平穩介質，或於結合及溶析過程中之速率之差異，受關注之分析物係與其他分子分離。
術語「層析樹脂」或「層析介質」在本文中可互換使用及係指自混合物中存在之其他分子分離受關注之分析物(例如，靶分子)的任何類型之相(例如，固相)。通常，由於混合物之個別分子在移動相之影響下遷移通過平穩固相，或於結合及溶析過程中之速率之差異，受關注之分析物係與其他分子分離。各種類型之層析介質之實例包括(例如)陽離子交換樹脂、親和力樹脂、陰離子交換樹脂、陰離子交換膜、疏水性相互作用樹脂及離子交換單塊。在提交本申請案的同時，其他層析介質可為熟習此項技術者或一般技術者已知且包括於本文中。
如本文使用之術語「捕獲步驟」一般係指一種用於使靶分子與刺激反應性聚合物或層析樹脂結合之方法，其導致含有該靶分子及該聚合物或樹脂之沈澱之固相。通常，隨後使用溶析步驟回收該靶分子，該溶析步驟自該固相去除該靶分子，藉此導致該靶分子與一或多種雜質分離。在各種實施例中，該捕獲步驟可使用層析介質，諸如樹脂、膜或單塊，或聚合物，諸如刺激反應性聚合物、聚電解質或結合該靶分子之聚合物進行。
如本文使用術語「結合」來描述靶分子(例如，含有Fc區之蛋白質)與附接至基質之配體(例如，與固相基質或樹脂結合之蛋白質A)之間的相互作用，係指該靶分子透過於結合位點處以靜電力、氫鍵鍵合、疏水性作用力及/或凡得瓦力偶合之例如蛋白質及配體結構於結合位點處之空間互補性之組合效應之一般可逆結合至配體。一般而言，於該結合位點處之空間互補性越大及其他力越強，蛋白質對其各別配體之結合特異性將越大。特異性結合之非限制性實例包括抗體-抗原結合、酵素-受質結合、酵素-輔因子結合、金屬離子螯合、DNA結合蛋白-DNA結合、調節蛋白-蛋白質相互作用，及類似物。理想地，在親和力層析中，於游離溶液中以約10 -4至10 -8M之親和力發生特異性結合。
術語「清潔劑」係指離子型及非離子型表面活性劑，諸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；曲拉通(Triton)；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油烯基-或硬脂基-硫代甜菜鹼；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油烯基-或硬脂基-肌胺酸；亞油烯基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯胺丙基-、椰油醯胺丙基-、亞油醯胺丙基-、肉豆蔻醯胺丙基-、棕櫚醯胺丙基-或異硬脂醯胺丙基-甜菜鹼(例如月桂醯胺丙基)；肉豆蔻醯胺丙基-、棕櫚醯胺丙基-或異硬脂醯胺丙基-二甲胺；椰油醯基甲基牛磺酸鈉或油醯基甲基牛磺酸鈉；及MONAQU AT TM系列(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)。有用之清潔劑係聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20 (TWEEN 20 ®)或聚山梨醇酯80 (TWEEN 80 ®)或各種酸，諸如辛酸。
「緩衝液」係一種藉由其酸鹼共軛組分之作用抵抗pH變化之溶液。可採用各種緩衝液(例如，取決於該緩衝液之所需pH)係描述於以下中：Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D.編，Calbiochem Corporation (1975)。緩衝液之非限制性實例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽及銨緩衝液，及此等之組合。
根據本發明，術語「緩衝液」或「溶劑」係用於用以裝載、清洗、溶析及重新平衡分離單元之任何液體組合物。
當「裝載」分離管柱時，緩衝液係用以將包含靶分子(例如，含有Fc區之靶蛋白)及一或多種雜質之樣品或組合物裝載至層析管柱(例如，親和力管柱或離子交換管柱)上。該緩衝液具有傳導性及/或pH使得該靶分子結合至層析基質，而理想地所有雜質均未結合並流動通過該管柱。
當「裝載」分離管柱以「流動通過」靶分子時，緩衝液係用以將包含靶分子(例如，含有Fc區之靶蛋白)及一或多種雜質之樣品或組合物裝載至層析管柱(例如，親和力管柱或離子交換管柱)上。該緩衝液具有傳導性及/或pH使得該靶分子未結合至層析基質並流向管柱，而理想地所有雜質均結合該管柱。
術語「重新平衡」係指使用緩衝液以在裝載靶分子之前重新平衡層析基質。通常，裝載緩衝液係用於重新平衡。
「清洗」層析基質意謂使適當之液體(例如，緩衝液)通過或經過基質。通常，清洗係用以在溶析靶分子之前自該基質去除弱結合之污染物及/或在裝載之後去除未結合或弱結合之靶分子。
如本文使用之術語「親和力層析基質」係指攜載適用於親和力層析之配體之層析基質。通常，該配體(例如，蛋白質A或其功能變體或片段)係共價附接至層析基質材料且當溶液與該層析基質接觸時，可接近溶液中之靶分子。親和力層析基質之一項實例係蛋白質A基質。親和力層析基質通常基於鎖/鑰機制(諸如抗原/抗體或酵素/受體結合)以高特異性結合該等靶分子。親和力基質之實例係攜載蛋白質A配體，諸如蛋白質A SEPHAROSE™、PROSEP ®-A、ESHMUN ®A及ESHMUNO ®P (均購自MilliporeSigma, St. Louis, MO)之基質。在本文描述之方法及系統中，親和力層析步驟可用作整個純化過程中之結合及溶析層析步驟。
如本文使用之術語「離子交換」及「離子交換層析」係指混合物中受關注之溶質或分析物(例如，純化中之靶分子)與連接(諸如藉由共價附接)至固相離子交換材料之帶電化合物相互作用，使得該受關注之溶質或分析物與該帶電化合物之非特異性相互作用大於或小於該混合物中之溶質雜質或污染物之層析方法。該混合物中之污染溶質比該受關注之溶質更快或更慢自該離子交換材料之管柱溶析或相對於該受關注之溶質自該樹脂排除。
「離子交換層析」具體包括陽離子交換、陰離子交換及混合模式離子交換層析。例如，陽離子交換層析可結合靶分子(例如，含有Fc區之靶蛋白)，接著溶析(例如，使用陽離子交換結合及溶析層析或「CIEX」或「CEX」)或可主要結合雜質而該靶分子「流動通過」管柱(陽離子交換流通過層析FT-CEX)。陰離子交換層析可結合該靶分子(例如，含有Fc區之靶蛋白)，接著溶析或可主要結合該等雜質而該靶分子「流動通過」該管柱，亦稱為陰性層析。在一些實施例中及如本文闡述之實例中證實，陰離子交換層析步驟係以流通模式進行。
術語「離子交換基質」係指帶負電之基質(即，陽離子交換介質)或帶正電之基質(即，陰離子交換介質)。電荷可藉由使一或多個帶電配體附接至該基質提供，例如，藉由共價鍵聯。或者或另外，該電荷可為該基質之固有性質(例如，與二氧化矽之情況一樣，其具有總體負電荷)。
混合模式陰離子交換材料通常具有陰離子交換基團及疏水性部分。合適之混合模式陰離子交換材料係CAPTO ®Adhere (GE Healthcare, Woburn, MA)。
本文使用術語「陰離子交換基質」以係指帶正電之基質，例如，具有一或多個附接至其之帶正電配體，諸如四級胺基。市售陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素、QAE SEPHADEX™及FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare)。本文描述之方法及系統中可使用之其他例示性材料係FRACTOGEL ®EMD TMAE、FRACTOGEL ®EMD TMAE HIGHCAP、ESHMUNO ®Q及FRACTOGEL ®EMD DEAE (MilliporeSigma, Burlington, MA)。
術語「陽離子交換基質」係指帶負電且具有與該基質之固相接觸之水溶液中之陽離子交換之游離陽離子之基質。附接至該固相以形成該陽離子交換基質或樹脂之帶負電配體可(例如)為羧酸鹽或磺酸鹽。市售陽離子交換基質包括羧甲基纖維素、固定於瓊脂糖上之磺丙基(SP) (例如，SP-SEPHAROSE FAST FLOW™或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™，來自GE Healthcare)及固定於瓊脂糖上之磺醯基(例如，來自GE Healthcare之S-SEPHAROSE FAST FLOW™)。較佳係FRACTOGEL ®EMD SO3、FRACTOGEL ®EMD SE HIGHCAP、ESHMUNO ®S、ESHMUNO ®CP-FT、ESHMUNO ®CPX及FRACTOGEL ®EMD COO (MilliporeSigma)。
本文中用於管柱再生之術語「再生」應意謂處理管柱以去除與層析樹脂緊密結合之污染物。熟習此項技術者已知使層析管柱再生之方法。多種方法均適用於清潔層析介質。應考慮材料之化學穩定性及污染之類型。通常使用有機溶劑、鹼及酸。聚合物基質之特徵在於比基於在NaOH或其他鹼之存在下可不穩定之矽膠之無機吸附劑更高之化學穩定性。與基於碳水化合物之介質相比，聚合物基質亦可經受使用酸之處理。
脂質或類似物質(例如，脂蛋白)可用有機溶劑(諸如乙醇、異丙醇或乙二醇)去除。變性蛋白質可用氫氧化鈉(0.1 N高達至1.0 N NaOH)有效去除。
若污染物緊密結合，則可有必要用酸性胃蛋白酶溶液(例如，於0.01 N HCL中之0.1%胃蛋白酶)、6 M鹽酸胍或稀釋之月桂醯肌胺酸鈉(SLS)溶液(於0.25 M NaCl中之2% SLS)再生管柱材料。然後SLS可用於0.01 N HCL中之20% 2-丙醇去除。
術語「平衡緩衝液」係指用以中和條件或以其他方式使靶分子與層析管柱或生物反應器內之配體有效相互作用之溶液或試劑。例如，本文描述之緩衝液溶液可在正發生化學變化時保持生物系統之pH幾乎恆定。在根據本發明之實施例之一些實例中，儘管該生物系統具有介於(例如) 7.0至10.0之pH，但由該平衡緩衝液維持該pH幾乎恆定。
術語「溶析緩衝液」係指用以取出或溶析結合至層析介質之產品之緩衝液或試劑。例如，溶析緩衝液可在第一溶析期間可溶析空AAV (腺相關病毒)及在第二溶析期間可溶析全AAV顆粒，藉此容許濃縮全AAV顆粒。
術語「流出物」係指可移動，即，在層析過程中留下之組分，亦稱為溶析液，例如，使用溶析緩衝液之恆定組成而不增加或減少緩衝液組分。
術語「等度溶析條件」係指在層析過程中溶析緩衝液之恆定組成之條件。
術語「梯度溶析條件」係指在層析過程中改變溶析緩衝液之組成之條件，例如，於特定時間內及/或在複數個管柱體積期間形成0至100%緩衝液之溶析緩衝液之梯度。
層析可以三種模式中之任一者操作：(1)分批模式，其中用靶蛋白裝載介質，停止裝載，清洗並溶析介質，及收集池；(2)半連續模式，其中連續進行裝載，而溶析係間歇性的(例如，在連續多管柱層析之情況下)；及(3)全「連續模式」，其中連續進行裝載及溶析兩者。美國專利申請案US 2013/0280788 (以全文引用之方式併入本文中)描述依次及循序採用數個層析管柱，稱為連續層析方法及裝置之實施例。連續層析可為「連續過程」純化程序或操作之部分。
如本文中可互換使用之術語「連續(continuous或contiguous)過程」係指用於純化靶分子之過程，其包括兩個或更多個過程步驟(或單元操作)，使得來自一個過程步驟之輸出物直接流入該過程之下一過程步驟中，而不中斷，且其中兩個或更多個過程步驟可同時進行其等持續時間之至少一部分。換而言之，在連續過程之情況下，如本文描述，未必在下一過程步驟開始之前完成過程步驟，但樣品之一部分始終移動通過該等過程步驟。術語「連續過程」亦適用於過程步驟內之步驟，在該情況下，在進行包括多個步驟之過程步驟期間，該樣品連續流動通過進行該過程步驟必需之多個步驟。本文描述之此過程步驟之一項實例係流動通過包括以連續方式進行之多個步驟之純化步驟，例如，流通活性炭，接著流通AEX介質，接著流通CEX介質，接著流通病毒過濾。
如本文使用之術語「半連續過程」係指用於純化靶分子之一般連續過程，其中任何單個過程步驟中流體材料之輸入或輸出係不連續或間歇性的。例如，在根據本發明之一些實施例中，過程步驟(例如，結合及溶析層析步驟)中之輸入物可連續裝載；然而，可間歇性收集輸出物(例如，於緩衝槽或集儲槽中)，其中純化過程中之其他過程步驟係連續的。因此，在一些實施例中，本文描述之方法及系統本質上係「半連續」的，因為其等包括以間歇性方式操作之至少一個單元操作，而該方法或系統中之其他單元操作可以連續方式操作。
術語「連接過程」係指用於純化靶分子之過程，其中該過程包含兩個或更多個彼此直接流體連通之過程步驟(或單元操作)，使得流體材料連續流動通過該過程中之過程步驟且在正常操作該過程期間與兩個或更多個過程步驟同時接觸。應瞭解有時，該過程中之至少一個過程步驟可由屏障(諸如處於關閉位置之閥)與其他過程步驟臨時隔離。個別過程步驟之此臨時隔離可係必要的，例如，在該過程之啟動或關閉期間或在個別單元操作之去除/更換期間。術語「連接過程」亦適用於過程步驟內之步驟，例如，當過程步驟需進行數個步驟以達成該過程步驟之預期結果時。一項此實例係流通純化過程步驟，如本文描述，其可包括以流通模式進行之數個步驟，例如，活性炭、陰離子交換層析、陽離子交換層析及病毒過濾。
如本文使用之術語「流體連通」係指流體材料在兩個過程步驟之間之流動或流體材料在過程步驟之步驟之間之流動，其中該等過程步驟係藉由任何合適之方式(例如，連接管線或緩衝槽)連接，藉此可使流體自一個過程步驟流動至另一過程步驟。在一些實施例中，兩個單元操作之間的連接管線可由一或多個閥中斷以控制流體通過該連接管線之流動。
如本文使用之術語「純化(purifying、purification)」、「分離(separate、separating、separation)」、「隔離(isolate、isolating或isolation)」係指自包含靶分子及一或多種雜質之樣品增加靶分子之純度。通常，該靶分子之純度係藉由自該樣品去除(完全或部分)至少一種雜質增加。在一些實施例中，如本文描述，樣品中該靶分子之純度係藉由使用(例如)層析過程自該樣品去除(完全或部分)一或多種雜質增加。在另一實施例中，樣品中該靶分子之純度係藉由將靶分子從該樣品之一或多種雜質中沈澱增加。如本文中可互換使用，多肽之術語「pI」或「等電點」係指該多肽之正電荷平衡其負電荷時之pH。pI可自該多肽附接之碳水化合物之胺基酸殘基或唾液酸殘基之淨電荷計算或可藉由等電聚焦確定。
此項技術中已知術語「pH」係指液體中氫離子濃度之量度。其係溶液之酸度或鹼度之量度。用於計算pH之方程式係於1909年由丹麥生物化學家索倫彼得勞裡茨索倫森(Søren Peter Lauritz Sørensen)提出： pH = -log[H+] 其中log係以10為底之對數及[H+]代表以莫耳每公升溶液為單位之氫離子濃度。術語「pH」來自德語單詞「濃度(potenz)」，其意謂「力量」，與氫之元素符號H組合，因此pH係「氫能」之縮寫。
如本文使用之術語「過程參數」作為純化過程中使用之條件。此等過程參數可用(例如)一或多個感測器及/或探針監測。過程參數之實例係溫度、壓力、pH、電導率、溶解氧(DO)、溶解二氧化碳(DCO 2)、混合速率及流動速率。在一些情況下，該感測器亦可為光學感測器。該感測器可連接至自動控制系統用於調整過程參數。
如本文使用之術語「電導率」係指水溶液在兩個電極之間傳導電流之能力。在溶液中，該等電流藉由離子傳輸流動。因此，隨著水溶液中存在之離子量增加，該溶液將具有更高之電導率。用於電導率之量測單位係毫西門子每厘米(mS/cm或mS)，且可使用市售電導率儀(例如，由Orion、OPTEX及KNAUER銷售)量測。溶液之電導率可藉由改變其中之離子濃度改變。例如，可改變該溶液中緩衝劑之濃度及/或鹽(例如，NaCl或KCl)之濃度以達成所需電導率。在一些實施例中，各種緩衝液之鹽濃度係經修飾以達成所需電導率。在一些實施例中，在將一或多種添加劑添加至樣品裝載之過程中，若循序使用一或多個清洗步驟，則此等清洗步驟採用電導率約20 mS/cm或更小之緩衝液。
如本文使用之術語「鹽」係指藉由酸及鹼之相互作用形成之化合物。本文描述之方法中採用之各種緩衝液中可使用之各種鹽包括(但不限於)乙酸鹽(例如，乙酸鈉)、檸檬酸鹽(例如，檸檬酸鈉)、氯化物(例如，氯化鈉)、硫酸鹽(例如，硫酸鈉)或鉀鹽。
如本文使用之術語「結合及溶析模式」及「結合及溶析過程」係指樣品中含有之至少一個靶分子(例如，含有Fc區之蛋白質)結合至合適之樹脂或介質(例如，親和力層析介質或陽離子交換層析介質)及後續溶析之分離技術。
如本文中可互換使用之術語「流通過程」、「流通模式」及「流通操作」係指生物醫藥製劑中含有之至少一個靶分子(例如，含有Fc區之蛋白質或抗體)連同一或多種雜質一起預期流動通過材料，該材料通常結合該一或多種雜質，其中該靶分子通常不結合(即，流動通過)之分離技術。
術語「穿透」係指特定溶質連續泵送通過管柱開始溶析時之體積。穿透體積適用於確定用於特定溶質之管柱之總樣品容量。
術語「有效穿透」係用管柱出口處流動之溶液於280 nm之吸光度量測，方式為藉由將其從在靶蛋白(例如，免疫球蛋白G)之任何穿透之前量測之雜質之平臺期間量測之吸光度中減去並將其除以於進料之280 nm之吸光度與於雜質之平臺之280 nm之吸光度之離線量測之間的差值。
如本文中可互換使用之術語「過程步驟」或「單元操作」係指使用一或多種方法或裝置以於純化過程中達成某一結果。本文描述之方法及系統中可採用之過程步驟或單元操作之實例包括(但不限於)澄清、結合及溶析層析、病毒滅活、流通純化及調配。應瞭解該等過程步驟或單元操作中之各者可採用多於一個步驟或方法或裝置以達成該過程步驟或單元操作之預期結果。例如，在一些實施例中，如本文描述，澄清步驟及/或流通純化步驟可採用多於一個步驟或方法或裝置以達成該過程步驟或單元操作。在一些實施例中，用以進行過程步驟或單元操作之一或多種裝置係單一用途裝置且可去除及/或更換而無需更換該過程中之任何其他裝置或甚至不得不停止過程運行。
如本文使用之術語「緩衝槽」係指在過程步驟之間或過程步驟內(例如，當單個過程步驟包含多於一個步驟時)使用之任何容器或器皿或袋；其中來自一個步驟之輸出物流動通過該緩衝槽流至下一步驟。因此，緩衝槽不同於集儲槽，因為其非意欲容納或收集來自步驟之全部體積之輸出物；相反可使來自一個步驟之輸出物連續流動至下一步驟。在一些實施例中，在本文描述之方法或系統之兩個過程步驟之間或過程步驟內使用之緩衝槽之體積係不大於來自該過程步驟之輸出物之全部體積之25%。在另一實施例中，緩衝槽之體積係不大於來自過程步驟之輸出物之全部體積之10%。在一些其他實施例中，緩衝槽之體積係小於生物反應器中細胞培養物之全部體積之35%、或小於30%、或小於25%、或小於20%、或小於15%、或小於10%，其構成來自待純化之靶分子之起始材料。
術語「靜態混合器」係指一種用於混合兩種流體材料(通常，液體)之裝置。該裝置一般由圓柱形(管)外殼中含有之混合器元件構成。整個系統設計併入一種用於將兩個流體流遞送至該靜態混合器內之方法。當該等流移動通過該混合器時，非移動元件連續摻混該等材料。完全混合取決於許多變量，包括流體之性質、該管之內徑、混合器元件之數量及其等設計等。
術語「標準化值」或「可接受值」係指由一般技術者在特定過程或程序參數之領域中可接受之值或值之範圍。超出該(等)標準化值之值指示該過程或程序未高效操作且過程參數或過程組件可需調整、清潔或更換。例如，如與本發明相關，若過程參數超出用於高效層析管柱運行之標準值或可接受值，則該層析管柱係經再生、清潔或更換。標準化值可選自(例如) pH、溫度、電導率、鹽濃度、光吸收、用合適波長之光激發後之螢光、折射率、電化學反應及質譜分析中之一或多者。可於層析運行期間之任何時間下量測值，包括(但不限於)在緊接將一或多個過程參數不同之一種過程流體交換成另一過程流體之前、期間及之後不久，以產生過程資料(即，過程值)，將該過程資料與視為處理中之層析運行之該參數之標準(標準值)之值進行比較。一般技術者將可確定任何特定層析管柱及過程參數之標準化值。
理論板 相當 高度
理論板相當高度(HETP)係用以評估管柱有效性及效率之建模系統。HETP模型幫助用戶設計並評估層析管柱以將該管柱最佳化。目的係獲得管柱流出物峰之最小或有限加寬。該HETP模型將層析管柱分成稱為板之理論層。樣品於固定相與流動相之間的單獨平衡發生於該等「板」中。板數(N)越高，分離將更佳。若管柱係經正確填充，則其將具有「較佳」之板數，且因此，小HETP。具有相對高板數之管柱將具有比具有較低數量峰之類似管柱更尖銳之管柱峰。 HETP  =  L/N
因此，HETP描述高斯(Gaussian)曲線之寬度。針對填充良好之管柱，該等HETP將在平均粒徑3至6倍之範圍內。例如，針對75 μm珠，HETP標靶係0.0225至0.045 cm。
不對稱性係可影響管柱有效性及效率之另一因素。在理想之管柱運行中，管柱峰之前半部分應為該管柱峰之後半部分之鏡像。換而言之，一半不應比另一半更「落後」。不對稱性係如下計算： A S= b / a
圖1顯示具有一定程度之不對稱性之代表性管柱峰。
因此，不對稱性描述峰形狀與理想之高斯曲線之偏差。良好之工作範圍係0.8至1.8，但此範圍可基於管柱長度進一步細化。針對長床，良好之工作範圍係0.8至1.5，及針對短床，良好之工作範圍係0.7至1.8。
脈衝分析
HETP脈衝分析係一般藉由注射少量惰性示蹤劑達成，該示蹤劑將藉由吸光度或電導率量測監測且在理論上將顯示為無限短持續時間(dt)及無限高值(y max= 1/dt)之脈衝。示蹤劑之此脈衝流動通過填充床而除流動通過多孔介質外無任何其他相互作用，導致在該管柱後顯示具有高斯形狀之峰。此高斯曲線之分析以下式給定HETP之值及不對稱性： 其中BH係床高度，t R係可用注射該示蹤劑之時間與最大峰高顯示之時間之間的持續時間確定之滯留時間。W 1/2係於該峰之最大高度之一半處之峰的寬度。參見圖1。A10及B10係介於達成最大值之10%之時間與達成峰高之最大值之時間之間的持續時間。較小之HETP值及接近1之不對稱性表明層析介質於該管柱中之填充品質良好。
前沿分析
另一方法，HETP前沿分析由突然改變流入管柱中之緩衝液以產生量測值之階躍構成。此階躍理論上係先前描述之脈衝以下式之積分：當t＜t 0時，則y=y 1及當t≥t 0時，則y=y 2，及(y 2- y 1)係該階躍之高度。此階躍流動通過該管柱理論上導致曲線為高斯曲線之積分。藉由此曲線之推導，吾人可獲得具有高斯形狀之類似峰以獲得HETP及不對稱性值。參見圖2A及B。圖3顯示在管柱運行之各種階段期間產生之電導率之代表圖。表示可進行HETP前沿分析之區域。
此方法給定在連續層析操作之每個循環結束時層析樹脂之填充品質而不停止該連續層析操作。吾人於圖4中顯示於範圍內之每個管柱及一個接一個循環之HETP值。吾人於圖5中顯示與圖4之HEPT值相比，超出範圍之每個管柱及一個接一個循環之不對稱性值。水平實線指示推薦之HETP及不對稱性(可接受值)之例示性範圍。可接受值可基於特定管柱參數而不同。一般技術者將可根據由本說明書提供之教示確定特定管柱運行之可接受HETP及不對稱性參數。通常，針對填充良好之管柱，該等HETP將在平均粒徑3至6倍之範圍內。例如，針對75 μm珠，HETP標靶係0.0225至0.045 cm。
不對稱性之良好之工作範圍係0.8至1.8，但此範圍可基於管柱長度進一步細分。針對長床，良好之工作範圍係0.8至1.5，及針對短床，良好之工作範圍係0.7至1.8。
平滑濾波器
平滑濾波器係統計學、影像處理及資料處理中用以平滑資料集之數學公式或演算法，其用以建立嘗試捕獲該資料中之重要模式，同時排除雜訊或其他精細結構/快速現象之近似函數。在平滑處理中，信號之資料點係經修飾，因此高於相鄰點(可能因為雜訊)之個別點係經減少，及低於該等相鄰點之點係經增加，產生更平滑之信號。換而言之，此等濾波器之目的係在不降低信號強度之情況下平滑雜訊資料。
存在此項技術中已知的許多特定平滑濾波器，針對各種不同之用途各具有其優點及缺點。大多數使用「移動平均」分析。憑藉移動平均分析，各資料點係由周圍資料點之局部平均值替換。該演算法可執行加權或未加權平滑函數。加權平均值對分析中之中值賦予更大之權重，而未加權平均值顧名思義對分析中之所有值賦予同等之權重。
決定針對特定用途使用一種演算法而非另一種演算法之選擇可需藉由經驗方式確定，尤其若用途係新穎的、非習知或未經測試的。此外，此項技術中現存之平滑濾波器之替代方案包括例如維納(Weiner)濾波(en.wikipedia.org/wiki/Wiener_filter)或使用未平滑之原始資料。
儘管未明確限制，於一較佳實施例中，本發明利用薩維茨基-戈萊濾波器。Savitzky A.及Golay, M.J.E. 1964, Analytical Chemistry，第36卷，第1627至1639頁。該薩維茨基-戈萊濾波器係低通濾波器。低通濾波器基本上藉由濾除除低頻信號外之所有信號工作。有效地，此藉由去除「抖動」之高頻雜訊「平滑」出資料。
連續層析
在連續層析中，取決於方法要求，數個相同之管柱通常係以容許管柱串聯及/或並聯操作之配置連接。因此，所有管柱均可同時運行或可於其等操作中間歇性重疊。各管柱係通常在過程運行期間裝載、溶析及再生數次。相較於習知層析，其單個層析循環係基於數個連續步驟，諸如裝載、清洗、溶析及再生，在基於多個相同管柱之連續層析之情況下，所有此等步驟均可發生於不同之管柱上。因此，連續層析操作可導致更好地利用層析樹脂並減少緩衝液需求，其有利於過程經濟。
結合及溶析層析或尺寸層析過程步驟中可使用之例示性連續層析過程可(例如)於歐洲專利申請案第EP11008021.5 (US 2014/0251911)及EP12002828.7 (US 2020/0101399)號中找到，其等兩者係以引用之方式併入本文中。此外，美國專利第9,149,738號(以全文引用之方式併入本文中)描述一種依次及循序採用數個層析管柱之連續層析方法及裝置。連續層析可適用於此項技術中已知的任何一或多種類型之層析。 範例
連續層析程序中證實之 HETP
為證實此分析方法之益處，吾人進行以4 g/L捕獲免疫球蛋白G，藉由於TRIS緩衝液中以0.05 mol/L製備其並在pH = 6.5下調節。吾人使用3個內徑200 mm之QuikScale (Milliporeigma, Bedfor, MA)層析管柱，該等管柱係用稱為來自Merck KGaA之Eshmuno ®A之蛋白質A親和力層析樹脂填充，及針對3.079 L之總管柱體積，床高度為9.8 mm。各管柱已用HETP脈衝分析方法使用丙酮2% w/w之脈衝，於NaCl 0.3 M之緩衝液中，及150 cm/h之線速度測試。丙酮脈衝體積係管柱體積之2%。該測試已用CoPrime ®生物層析(MilliporeSigma)系統進行及該HETP脈衝分析係使用由Merck KGgA研發之其軟體Common Control Platform ®之報告生成器計算。管柱1之結果係HETP = 0.0183 cm及不對稱性= 1.692，管柱2之結果係HETP = 0.0145 cm及不對稱性= 1.783，管柱3之結果係HETP = 0.0337 cm及不對稱性= 1.333。
用於此示範之多管柱捕獲系統容許以294 cm/h於2兩個串聯管柱上裝載，而第三管柱進行非裝載步驟。第一管柱係由第一泵直接向其入口供應免疫球蛋白G之裝載管柱。在裝載該第一管柱時，該免疫球蛋白G之一部分結合至蛋白質A樹脂Eshumno ®A。該第一管柱之出口直接連接至作為預裝載管柱之第二管柱。該第二管柱接受未與該第一管柱結合之材料，該材料為雜質，但亦接受未與該第一管柱之蛋白質A樹脂結合之免疫球蛋白G。將該第二管柱之出口廢棄。當該裝載發生時，該樹脂之蛋白質A位點將結合至經捕獲之免疫球蛋白G。該等結合位點之飽和將遵循該第一管柱之入口至出口之梯度，該入口首先由經結合之免疫球蛋白G飽和，而該出口附近之結合位點可不飽和。然而，隨著該管柱末端附近之結合位點變得越來越飽和，該等結合位點變得經裝載且過量之免疫球蛋白G穿透該管柱。
在涉及僅一個管柱之傳統分批方法中，藉由在產品穿透之前停止過程避免產品之損失。此係藉由於估計獲得10%穿透之體積之90%時停止管柱裝載進行，10%穿透意謂產品於該管柱之出口處之濃度係入口處濃度之10%。因此，在傳統方法中，經結合之蛋白質A位點自入口至出口之梯度導致使用之結合位點越少，越靠近該出口。連續層析之目的係第一管柱過飽和至60%或70%並將管柱順流進料至第二管柱以捕獲穿透該第一管柱之免疫球蛋白G。此導致更高效使用該第一管柱之蛋白質A樹脂。
認為第二管柱係預裝載的，因為其在進料濃度之0%與60至70%之間的較低入口濃度處捕獲免疫球蛋白G。產品及雜質濃度係使用於280 nm量測之吸光度估計。在裝載開始期間，在未結合之產品任何穿透之前，可結合至蛋白質A之無Fc位點之雜質首先流動通過並離開該管柱。此等雜質於280 nm之吸光度稱為雜質平臺且對應於0%穿透。相反，在裝載第一管柱之前，免疫球蛋白G之進料於280 nm量測之離線吸光度給定100%穿透之值。有效穿透係用該管柱之出口處流動之溶液於280 nm之吸光度量測，方式為藉由將其從在免疫球蛋白G之任何穿透之前量測之雜質之平臺期間量測之吸光度中減去並將其除以該進料於280 nm之吸光度與雜質之平臺於280 nm之吸光度之離線量測之間的差值。
當達成穿透水平(諸如60%或70%)時，使用一組三通閥將第一管柱與進料泵斷開並將其連接至緩衝液泵用於非裝載步驟。該第一管柱之出口係與第二管柱斷開並連接至一組出口，諸如廢物或溶離份收集。該第二管柱之入口係連接至該進料泵。該第二管柱變為裝載管柱。該第二管柱之出口係連接至第三管柱之入口，該第三管柱變為連接至廢物之預裝載管柱。管柱1之非裝載步驟將將必須比管柱2之穿透更快。在於管柱2上穿透之後，將其連接至緩衝液泵用於非裝載步驟。管柱3變為裝載管柱及其入口連接至該進料泵及管柱3之出口係連接至變為預裝載管柱之管柱1之入口。在於管柱3上穿透之後，完成完整之循環及系統藉由將管柱1之入口連接至該進料泵並在新循環中變為裝載管柱而開始新循環，將管柱1之出口連接至再次變為預裝載管柱之管柱2之入口及將管柱3連接至該緩衝液泵用於非裝載步驟。本發明之另外優點係從不停止該進料泵且使所有非裝載階段均比裝載階段更快。
針對吾人之示範，非裝載階段係以430 cm/h執行。其首先由用TRIS 0.05 mol/L在pH = 6.5下將該管柱清洗8個管柱體積構成。然後在pH = 3下使用乙酸0.1 mol/L溶析並用0.05 AU (吸光度單位。參見，en.wikipedia.org/wiki/Absorbance#Absorbance_of_a_material)作為收集之峰開始及結束進行峰收集，接著針對3個管柱體積用NaOH 0.1 mol/L進行滅菌步驟及針對5個管柱體積用TRIS 0.05 mol/L在pH = 6.5下進行平衡。
由於在每個管柱之非裝載階段之每個循環中均運行此步驟序列，因此可能一個接一個循環監測該等管柱之狀態。於吾人之示範中，吾人分析平衡期間電導率之曲線，當其在pH = 6.5下自20mS/cm NaCl 0.1 mol/L降至9 mS/Cm TRIS緩衝液0.05 mol/L時。吾人與測定該管柱之停留時間分佈進行比較(參見，例如，en.wikipedia.org/wiki/Residence_time#Pulse_experiments及en.wikipedia.org/wiki/Residence_time#Biochemical)。將由於自NaCl 0.1 mol/L切換至TRIS緩衝液0.05 mol/L導致之電導率下降視為電導率階躍實驗，其係脈衝函數之積分函數(參見，例如en.wikipedia.org/wiki/Laplace_transform#Table_of_selected_Laplace_transforms)，因此在HETP脈衝分析與HETP前沿分析之間進行類比。藉由推導電導率於管柱出口處之曲線，吾人可獲得與脈衝分析中可獲得之曲線相似之曲線。參見，圖6。由於最小雜訊正干擾電導率曲線之推導，因此有必要將此曲線平滑並推導。
為平滑電導率曲線，吾人使用薩維茨基-戈萊平滑濾波器及下式： 。在此式中，sf係介於2至12之間的平滑因子；在圖bb中，吾人顯示sf 2、3、6及9。c t係時間t之電導率，c t+i係時間t之電導率加介於2個點之間的時間間隔數i，於吾人之示範中其係2秒及y t係於時間t之平滑電導率。a i係平滑係數，其中a i= a -i及下表中描述之根據平滑因子之值。吾人觀察到該平滑電導率之各點均為移動平均值之結果及每個點之權重不等。用於此移動平均值之點數係等於2sf+1，因為其在計算時使用點c t、此點之前的sf點及此點之後的sf點。 表 1
平滑因子 點數 a0 a1 a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8 a9 a10 a11 a12 h
2 5 17 12 -3                     35
3 7 7 6 3 -2                   21
4 9 59 54 39 14 -21                 231
5 11 89 84 69 44 9 -36               429
6 13 25 24 21 16 9 0 -11             143
7 15 167 162 147 122 87 42 -13 -78           1105
8 17 43 42 39 34 27 18 7 -6 -21         323
9 19 269 264 249 224 189 144 89 24 -51 -136       2261
10 21 329 324 309 284 249 204 149 84 9 -76 -171     3059
11 23 79 78 75 70 63 54 43 30 15 -2 -21 -42   805
12 25 467 462 447 422 387 343 287 222 147 62 -33 -138 -253 5175
圖7顯示在第10個循環之非裝載階段之平衡期間之管柱3上之結果。吾人觀察到於112 s之輕微電導率下降已經平滑。
為獲得電導率之導數，吾人再次使用薩維茨基-戈萊平滑濾波器，但針對一階導數使用下式： 。於此式中，sf係介於2至12之間的平滑因子，及於吾人之示範中，吾人保持相同之sf數：2、3、6及9。c t係於時間t之電導率，c t+i係於時間t之電導率加介於2個點之間的時間間隔數i，其於吾人之示範中係2秒及y t係於時間t之平滑電導率。此次之平滑係數係a i= i及因此a i= - a -i及a 0= 0。下表中描述根據平滑因子之h’ sf之值。吾人觀察到該平滑電導率導數曲線之各點均再次為每點權重不等之移動平均值之結果。用於此移動平均值之點數係再次等於2sf+1，因為其在計算時使用點c t、此點之前的sf點及此點之後的sf點。 表 2
平滑因子 點數 h
2 5 10
3 7 28
4 9 60
5 11 110
6 13 182
7 15 280
8 17 408
9 19 570
10 21 770
11 23 1012
12 25 1300
圖8中顯示在第10個循環之非裝載階段之平衡期間之管柱3之結果。吾人觀察到吾人獲得具有少量不對稱性之類高斯曲線，非常類似於HETP脈衝結果函數。然而，吾人觀察到吾人越平滑該曲線，則其變得越寬及HETP變得越高。由於平滑因子2正給定無雜訊之曲線，因此吾人使用電導率曲線之此輕微平滑。
在連續運行期間，吾人收集溶析峰並藉由於280 nm用NANODROP™系統(Thermofisher, Waltham, MA)之量測評估免疫球蛋白G之其體積及數量。若吾人繪製HETP之結果及收集之溶析液之量(參見，圖9、11及12)，吾人觀察到量測之HETP越低，則收集之免疫球蛋白G越多。此顯示連續監測該管柱之捕獲品質之真正益處。不對稱性圖(參見，圖10、12及14)及溶析液體積給定之資訊較少但兩個值亦趨於隨該HETP增加而增加及溶析液量減少意味性能之損失。
圖1顯示在層析管柱之脈衝分析後產生之代表性曲線。
圖2A及B：圖2A顯示由層析管柱中之緩衝液變化產生之量測值之步驟之圖示。圖2B顯示平滑並推導管柱後電導率點後之合成曲線。
圖3顯示在管柱運行之多種階段期間產生之電導率之代表圖。表示進行HETP前沿分析之區域。
圖4顯示多個循環內三個管柱產生之HETP值。水平實線例示針對此等運行推薦之HETP之可接受範圍。第4個循環之峰值係出於示範目的中斷之連續層析過程處。
圖5顯示由三個管柱產生之不對稱性資料之實例，其中該等管柱係明顯超出推薦值。水平實線例示針對此等運行推薦之不對稱性之可接受範圍。第4個循環之峰值係出於示範目的中斷之連續層析過程處。
圖6顯示多個時間點之管柱後電導率。
圖7顯示在用2、3、6及9之平滑因子平滑後與圖6相同之資料。
圖8顯示推導後與圖6及7相同之資料。
圖9顯示12個循環內第1個管柱(X軸)之HETP (Y1軸)及收集之溶析液之量(Y2軸)之圖。
圖10顯示12個循環之第1個管柱(X軸)之不對稱性(Y軸)之圖。
圖11顯示12個循環內第2個管柱(X軸)之HETP (Y1軸)及收集之溶析液之量(Y2軸)之圖。
圖12顯示12個循環之第2個管柱(X軸)之不對稱性(Y軸)之圖。
圖13顯示12個循環內之第3個管柱(X軸)之HETP (Y1軸)及收集之溶析液之量(Y2軸)之圖。
圖14顯示12個循環之第3個管柱(X軸)之不對稱性(Y軸)之圖。

Claims (11)

  1. 一種監測以連續過程模式操作之一或多個層析管柱之效率及品質之方法，該方法包括： a) 提供一或多個以連續模式使用之層析管柱； b) 偵測選自由以下組成之群之一或多個過程參數之變化：緊接在將一或多個過程參數不同之一種過程流體交換成另一過程流體之前、期間及之後不久之pH、電導率、鹽濃度、光吸收、用合適波長之光激發後之螢光、折射率、電化學反應及質譜分析，以產生過程資料； c) 將曲線平滑濾波器應用於該過程資料以產生經校正之過程資料； d) 計算該經校正之過程資料之一階導數以產生該經校正之過程資料之經推導之過程資料； e) 確定HETP值及該經推導之資料之不對稱性； f) 將該HETP值及不對稱性與標準化值做比較； g) 其中，若該等HETP值及不對稱性落於該等標準化值內，則該管柱係用於另一過程運行。
  2. 如請求項1之方法，其中該曲線平滑計算係薩維茨基-戈萊(Savitzky-Golay)平滑濾波器。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該或該等管柱已連續使用介於2至200次運行之間。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該或該等管柱已連續使用介於5至50次運行之間。
  5. 如請求項1或2之方法，其中該連續過程模式依次包含至少兩個但不多於五個不同之管柱。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該等管柱係選自由以下組成之群：親和力、離子交換、粒徑排阻、反相、對掌性、正面及疏水性。
  7. 如請求項1或2之方法，其中監測各管柱之效率及品質。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該連續過程模式包含多個過程步驟，依次包含至少兩個但不多於十個過程步驟及至少一個過程步驟包含層析管柱。
  9. 如請求項1或2之方法，其中該等標準化值係基於使用相同或大體上相同之管柱及過程參數之歷史資料。
  10. 如請求項1或2之方法，其中若該等HETP值及不對稱性確實不落於該等標準化值內，則該管柱係經再生。
  11. 如請求項1或2之方法，其中若該等HETP值及不對稱性確實不落於該等標準化值內，則由自動系統通知操作員。
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