KR20240046607A

KR20240046607A - 연속 크로마토그래피 작업 동안의 크로마토그래피 수지의 모니터링 방법

Info

Publication number: KR20240046607A
Application number: KR1020247009879A
Authority: KR
Inventors: 다미엥 케르베닉; 필립 므와쏘니에
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2022-09-27
Publication date: 2024-04-09
Also published as: TW202326112A; CA3232551A1; CN117980740A; WO2023052358A1

Abstract

완충제 변화의 모니터링 후 기록된 값의 평활화 및 미분에 의해 컬럼 작동의 중단 없이 연속 모드로 작동되는 크로마토그래피 컬럼의 품질 및 효율의 모니터링 방법.

Description

연속 크로마토그래피 작업 동안의 크로마토그래피 수지의 모니터링 방법

컬럼 크로마토그래피는 생성물을 정제하기 위해 생명공학 산업에서 광범위하게 사용된다. 전형적으로, 인슐린 또는 모노클로날 항체 등의 표적 치료 단백질은 원핵 또는 진핵 세포에서 생산된다. 이어서 표적 단백질은 배양 배지, 세포, 세포 잔해 및 배양 과정에서 발생하는 임의의 다른 불순물로부터 정제되어야 한다. 컬럼 크로마토그래피는, 예를 들어, 표적 단백질과 불순물 사이의 전하 차이, 리간드에 대한 표적 단백질 또는 불순물의 친화성 및 크기 배제에 의해 표적 단백질을 분리하는 데 사용된다. 대부분의 정제 프로토콜은 표적 단백질을 정제하기 위해 순차적으로 여러 상이한 크로마토그래피 단계를 필요로 한다.

크로마토그래피 작업은 HETP (이론단 등가 높이) 시험을 통해 패킹 층의 품질을 시험함으로써 컬럼 효율의 정기적 체크를 필요로 한다. 이 시험은 일반적으로 컬럼을 생산으로부터 제거하고 펄스 분석을 사용함으로써 수행된다.

전통적으로, 바이오제조는 배치 모드로 수행되었으며, 각 스테이지는 순차적 단계 사이에서 생성물을 보유하기 위한 보유 탱크 또는 등가물을 필요로 하였다. 이는 공정의 중지 및 시작, 시간 소비, 및 저장 용기의 사용, 귀중한 공간의 소비를 필요로 한다. 연속 가공처리는 원료 (즉, 배양된 조작 세포 및 배지)가 제조 공정의 한쪽 단부로 진입하고 보유 탱크 또는 공정의 중지 및 시작의 필요 없이 생성물이 다른 단부에서 나오는 개념이다. 그러나, 연속 공정은 크로마토그래피 컬럼의 품질 및 효율을 효과적이고 일관되게 모니터링하는 것을 거의 불가능하게 만든다. 관련 기술분야에서 필요한 것은 시험을 위해 공정 조건을 중지하거나 지연시킬 필요 없이 크로마토그래피 품질을 모니터링하는 방법이다.

발명의 요약

본 발명은 생성 공정을 중지할 필요 없이 컬럼 크로마토그래피를 모니터링하는 방법을 제공한다. 다시 말해서, 본 발명은 컬럼 품질 및 효율 (즉, 컬럼 성능)을 모니터링하는 것이 어렵다는 선행 기술 문제를 해결한다. 본 발명은, 공정을 중지할 필요, 공정 유동에 추가의 시험 특이적 단계를 추가할 또는 컬럼 시험 목적상 특이적인 시약 (예컨대 펄스 화학물질 또는 시약)을 추가할 필요 없이, 연속 공정 생성 시나리오에서 컬럼 성능을 모니터링하는 것에 관한 것이다. 다시 말해서, 공정의 중단 없이 컬럼 성능을 모니터링한다.

본 발명은 공정 파라미터의 위상 변화를 모니터링함으로써 이 문제를 해결한다. 본 발명에 의해 컬럼 성능을 모니터링하기 위해 모니터링될 수 있는 공정 파라미터는, 예를 들어, a) 전도도; b) pH; c) 염 농도; d) 광 흡수; e) 적합한 파장의 빛으로의 여기 후 형광; f) 굴절률; g) 전기화학 반응; 및 h) 질량 분광측정 데이터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의의 생성 공정에서, 또한 생성 공정에서의 임의의 컬럼에 대하여 하나 이상의 공정 파라미터가 모니터링될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에서, 패킹 층의 품질은 전도도, 흡광도 또는 pH 등의 측정가능한 파라미터의 변화를 측정함으로써 이루어진다. 따라서, HETP 정면(frontal) 분석의 본 발명의 방법은 측정 값의 하나의 단계를 생성하기 위해 컬럼 내에서 유동하는 용액을 갑자기 변화시키는 것으로 이루어진다. 이들 단계를 생성하는 기존의 크로마토그래피 작업에 대한 정면 분석을 사용하고 이 분석을 사이클마다 반복함으로써, 공정의 중단 없이 크로마토그래피 컬럼의 패킹 품질을 모니터링할 수 있다. 또한, 이 분석을 사이클마다 반복함으로써 연속 공정 동안 컬럼 품질 변화를 확인할 수 있다.

공정 파라미터는 모니터링되는 공정 파라미터(들)에 대해 특이적인 프로브의 사용에 의해 모니터링될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 공정 파라미터를 모니터링하기 위한 적절한 프로브를 선택할 수 있을 것이다.

공정 파라미터는 수동으로, 즉 사람이 프로브 또는 기록 시스템의 판독값을 관찰하고 기재함으로써 모니터링될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 공정 파라미터는 상기 공정 파라미터를 모니터링하고 프로브로부터의 값을 기록하도록 디자인, 프로그래밍 또는 개조된 컴퓨터 또는 컴퓨터 시스템에 의해 자동으로 모니터링된다. 이러한 방식으로, 관찰 및 기록된 값은 컬럼 품질이 또 다른 실행에 충분한지 또는 컬럼을 세정하거나 재패킹해야 하는지에 대한 결정을 위한 분석용 프로그램에 입력될 수 있다.

본 발명은 효율 및 품질에 대해 연속 공정 모드로 작동되는 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 모니터링하는 방법을 고려하며, 방법은 연속 모드로 사용되는 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 제공하는 단계; 하나의 공정 유체를 하나 이상의 공정 파라미터가 상이한 또 다른 공정 유체로 교환하기 직전에, 그 동안, 또한 그 직후에, pH, 전도도, 염 농도, 광 흡수, 적합한 파장의 빛으로의 여기 후 형광, 굴절률, 전기화학 반응 및 질량 분광측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정 파라미터의 변화를 검출하여 공정 데이터를 생성하는 단계; 상기 공정 데이터에 곡선 평활화 필터를 적용하여 보정된 공정 데이터를 생성하는 단계; 상기 보정된 공정 데이터의 1차 도함수를 계산하여 상기 보정된 공정 데이터의 유도된(derivatized) 공정 데이터를 생성하는 단계; 상기 유도된 데이터의 HETP 값 및 비대칭성을 결정하는 단계; HETP 값 및 비대칭성을 표준화된 값과 비교하는 단계를 포함하고; 여기서, HETP 값 및 비대칭성이 상기 표준화된 값 내에 속하면, 컬럼이 또 다른 공정 실행에 사용된다.

방법은 곡선 평활화 계산이 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 평활화 필터임을 추가로 고려한다.

방법은 컬럼 또는 컬럼들이 2 내지 100회 실행 동안 연속적으로 사용되었음을 또한 추가로 고려할 수 있다.

상기 컬럼 또는 컬럼들이 5 내지 50회 실행 동안 연속적으로 사용된, 제1항의 방법.

방법은 연속 공정 모드가 적어도 2개 내지 최대 5개의 상이한 컬럼을 순차적으로 포함함을 또한 추가로 고려할 수 있다.

방법은 컬럼이 친화성, 이온 교환, 크기 배제, 역상, 키랄, 정면 및 소수성으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 또한 추가로 고려할 수 있다.

방법은 각각의 컬럼이 효율 및 품질에 대해 모니터링됨을 또한 추가로 고려할 수 있다.

방법은, 연속 공정 모드가 다수의 공정 단계를 포함하고, 적어도 2개 내지 최대 10개의 공정 단계를 순차적으로 포함하고, 적어도 하나의 공정 단계가 크로마토그래피 컬럼을 포함함을 또한 추가로 고려할 수 있다.

방법은 표준화된 값이 동일한 또는 실질적으로 동일한 컬럼 및 공정 파라미터를 사용한 이력 데이터에 기초함을 또한 추가로 고려할 수 있다.

방법은 HETP 값 및 비대칭성이 상기 표준화된 값 내에 속하지 않으면 컬럼이 재생됨을 또한 추가로 고려할 수 있다.

방법은 HETP 값 및 비대칭성이 상기 표준화된 값 내에 속하지 않으면 자동 시스템에 의해 작업자에게 통지됨을 또한 추가로 고려할 수 있다. 일부 실시양태에서 자동 시스템은 경보 시스템 또는 다른 통지 시스템이다. 이들 경보에 대한 여러 파라미터가 존재할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 1) 가능/불능(Enabled/Disabled); 2) 심각하지 않은 수준 - 고/저, 이는 버저를 울리고 심각하지 않은 경보를 표시할 수 있음; 3) 심각한 경보 - 고/저, 이는 공정을 중지시키지만, 작업자는 공정을 확인해야 하고, 예를 들어, 공정 실행을 완료하기 위해, 이를 재시작할 수 있음.

도 1은 크로마토그래피 컬럼의 펄스 분석 후 생성된 대표적 곡선을 나타낸다.
도 2a & b. 도 2a는 크로마토그래피 컬럼에서의 완충제 변화에 의해 생성된 측정 값의 하나의 단계의 그래프 표시를 나타낸다. 도 2b는 컬럼-후(post-column) 전도도 포인트가 평활화되고 미분된 후의 생성 곡선을 나타낸다.
도 3은 컬럼 실행의 다양한 스테이지 동안 생성된 전도도의 대표적 그래프를 나타낸다. HETP 정면 분석이 수행되는 영역이 표시되어 있다.
도 4는 다수의 사이클에 걸쳐 3개 컬럼에 대해 생성된 HETP 값을 나타낸다. 실선 수평선은 이들 실행에 대한 HETP의 권고 허용가능 범위를 예시한다. 사이클 4에서의 피크는 연속 크로마토그래피의 공정이 입증 목적으로 중단된 곳이다.
도 5는 컬럼이 권고 값을 명백히 벗어나는 3개의 컬럼에 의해 생성된 비대칭성 데이터의 일례를 나타낸다. 실선 수평선은 이들 실행에 대한 비대칭성의 권고 허용가능 범위를 예시한다. 사이클 4에서의 피크는 연속 크로마토그래피의 공정이 입증 목적으로 중단된 곳이다.
도 6은 다양한 시점에서의 컬럼-후 전도도를 나타낸다.
도 7은 2, 3, 6 및 9의 평활화 인자 (sf)로 평활화 후 도 6과 동일한 데이터를 나타낸다.
도 8은 미분 후 도 6 & 7과 동일한 데이터를 나타낸다.
도 9는 12 사이클 (X-축)에 걸친 컬럼 1에 대한 HETP (Y1-축) 및 수집된 용출액의 양 (Y2-축)의 플롯을 나타낸다.
도 10은 12 사이클 (X-축) 동안 컬럼 1에 대한 비대칭성 (Y-축)의 플롯을 나타낸다.
도 11은 12 사이클 (X-축)에 걸친 컬럼 2에 대한 HETP (Y1-축) 및 수집된 용출액의 양 (Y2-축)의 플롯을 나타낸다.
도 12는 12 사이클 (X-축) 동안 컬럼 2에 대한 비대칭성 (Y-축)의 플롯을 나타낸다.
도 13은 12 사이클 (X-축)에 걸친 컬럼 3에 대한 HETP (Y1-축) 및 수집된 용출액의 양 (Y2-축)의 플롯을 나타낸다.
도 14는 12 사이클 (X-축) 동안 컬럼 3에 대한 비대칭성 (Y-축)의 플롯을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

정의

용어 "크로마토그래피"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 관심 분석물 (예를 들어, 표적 분자)을 분리하는 임의의 종류의 기술을 지칭한다. 통상적으로, 관심 분석물은, 결합 및 용출 공정에서, 또는 이동 상의 영향 하에 고정 매질을 통해 혼합물의 개개의 분자가 이동하는 속도차의 결과로 다른 분자로부터 분리된다.

용어 "크로마토그래피 수지" 또는 "크로마토그래피 매질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 관심 분석물 (예를 들어, 표적 분자)을 분리하는 임의의 종류의 상 (예를 들어, 고체 상)을 지칭한다. 통상적으로, 관심 분석물은, 결합 및 용출 공정에서, 또는 이동 상의 영향 하에 고정 고체 상을 통해 혼합물의 개개의 분자가 이동하는 속도차의 결과로 다른 분자로부터 분리된다. 다양한 유형의 크로마토그래피 매질의 예는, 예를 들어, 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환 수지, 음이온 교환 막, 소수성 상호작용 수지 및 이온 교환 모노리스를 포함한다. 다른 크로마토그래피 매질은 본 출원의 출원 시점에 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 수 있고 본원에 포함된다.

용어 "포획 단계"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 일반적으로 표적 분자를 자극 반응성 중합체 또는 크로마토그래피 수지와 결합시키는 데 사용되는 방법을 지칭하며, 이는 표적 분자 및 중합체 또는 수지의 침전물을 함유하는 고체 상을 생성한다. 전형적으로, 표적 분자는 후속적으로 고체 상으로부터 표적 분자를 제거하는 용출 단계를 사용하여 회수되고, 이로써 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자가 분리된다. 다양한 실시양태에서, 포획 단계는 크로마토그래피 매질, 예컨대 수지, 막 또는 모노리스, 또는 중합체, 예컨대 자극 반응성 중합체, 다가전해질 또는 표적 분자에 결합하는 중합체를 사용하여 수행될 수 있다.

표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질)와 매트릭스에 부착된 리간드 (예를 들어, 고체 상 매트릭스 또는 수지에 결합된 단백질 A) 사이의 상호작용을 설명하기 위해 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "결합"은, 일반적으로, 예를 들어 결합 부위에서 정전기력, 수소 결합, 소수성 힘, 및/또는 반 데르 발스 힘으로 커플링된 결합 부위에서의 단백질 및 리간드 구조의 공간적 상보성의 조합 효과를 통한 리간드에 대한 표적 분자의 가역적 결합을 지칭한다. 일반적으로, 공간적 상보성이 크고 결합 부위에서 다른 힘이 강할수록, 그의 각 리간드에 대한 단백질의 결합 특이성이 커진다. 특이적 결합의 비-제한적인 예는 항체-항원 결합, 효소-기질 결합, 효소-보조인자 결합, 금속 이온 킬레이트화, DNA 결합 단백질-DNA 결합, 조절 단백질-단백질 상호작용 등을 포함한다. 이상적으로, 친화성 크로마토그래피에서 특이적 결합은 유리(free) 용액 중에서 약 10^-4 내지 10^-8 M의 친화도로 나타난다.

용어 "세제"는 이온성 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤(Triton); 나트륨 도데실 술페이트 (SDS); 나트륨 라우렐 술페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQU AT^TM 시리즈 (Mona Industries, Inc., 미국 뉴저지주 패터슨)를 지칭한다. 유용한 세제는 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 (TWEEN 20®) 또는 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80®) 또는 다양한 산, 예컨대 옥탄산이다.

"완충제"는 그의 산-염기 컨쥬게이트 화합물의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충제의 요망되는 pH에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충제가 하기 문헌에 기재되어 있다: Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). 완충제의 비-제한적 예는 MES, MOPS, MOPSO, 트리스(Tris), HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 완충제, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.

본 발명에 따라 용어 "완충제" 또는 "용매"는 분리 유닛을 로딩하고, 세척하고, 용출하고, 재평형화하는 데 사용되는 임의의 액체 조성물에 대하여 사용된다.

분리 컬럼의 "로딩"시, 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 친화성 컬럼 또는 이온 교환 컬럼) 상에 로딩하기 위해 완충제가 사용된다. 완충제는 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되면서 이상적으로는 모든 불순물이 컬럼에 결합되지 않고 컬럼을 통해 유동하도록 하는 전도도 및/또는 pH를 갖는다.

표적 분자의 "관통 유동"을 위한 분리 컬럼의 "로딩"시, 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 친화성 컬럼 또는 이온 교환 컬럼) 상에 로딩하기 위해 완충제가 사용된다. 완충제는 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지 않고 컬럼을 통해 유동하면서 이상적으로는 모든 불순물이 컬럼에 결합되도록 하는 전도도 및/또는 pH를 갖는다.

용어 "재평형화"는 표적 분자를 로딩하기 전에 크로마토그래피 매트릭스를 재평형화하기 위해 완충제를 사용하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 로딩 완충제가 재평형화에 사용된다.

크로마토그래피 매트릭스를 "세척하다" 또는 그의 "세척"이란, 적절한 액체, 예를 들어 완충제를 매트릭스를 통해 또는 매트릭스 상에서 통과시키는 것을 의미한다. 전형적으로, 세척은 표적 분자를 용출하기 전에 매트릭스로부터 약하게 결합된 오염물을 제거하기 위해 및/또는 로딩 후에 결합되지 않은 또는 약하게 결합된 표적 분자를 제거하기 위해 사용된다.

용어 "친화성 크로마토그래피 매트릭스", 본원에서 사용되는 바와 같이, 친화성 크로마토그래피에 적합한 리간드를 운반하는 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 전형적으로, 리간드 (예를 들어, 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편)는 크로마토그래피 매트릭스 물질에 공유적으로 부착되고 용액이 크로마토그래피 매트릭스와 접촉할 때 용액 중의 표적 분자에 접근가능하다. 친화성 크로마토그래피 매트릭스의 일례는 단백질 A 매트릭스이다. 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 전형적으로 항원/항체 또는 효소/수용체 결합과 같은 잠금/키 메커니즘에 기초하여 높은 특이성으로 표적 분자에 결합한다. 친화성 매트릭스의 예는 단백질 A SEPHAROSE™, PROSEP®-A, ESHMUNO® A 및 ESHMUNO® P (모두 미국 미주리주 세인트루이스의 MilliporeSigma로부터 입수가능함)와 같은 단백질 A 리간드를 운반하는 매트릭스이다. 본원에 기재된 공정 및 시스템에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 전체 정제 공정에서 결합 및 용출 크로마토그래피 단계로서 사용될 수 있다.

용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 혼합물 중 관심 용질 또는 분석물 (예를 들어, 정제되는 표적 분자)이 고체 상 이온 교환 물질에 연결된 (예컨대 공유 부착에 의해) 대전된 화합물과 상호작용하고, 그에 따라 관심 용질 또는 분석물이 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물보다 더 많게 또는 적게 대전된 화합물과 비-특이적으로 상호작용하는 크로마토그래피 공정을 지칭한다. 혼합물 중의 오염 용질은 관심 용질보다 더 빠르게 또는 느리게 이온 교환 물질의 컬럼으로부터 용출되거나, 관심 용질에 비해 수지에 결합되거나 수지로부터 배제된다.

"이온-교환 크로마토그래피"는 구체적으로 양이온 교환, 음이온 교환, 및 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질)에 결합한 후 용출될 수 있거나 (예를 들어, 양이온 교환 결합 및 용출 크로마토그래피 또는 "CIEX" 또는 "CEX" 사용) 표적 분자가 컬럼을 "관통 유동"하는 동안 주로 불순물에 결합할 수 있다 (양이온 교환 관통 유동 크로마토그래피 FT-CEX). 음이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질)에 결합한 후 용출될 수 있거나 표적 분자가 컬럼을 "관통 유동"하는 동안 주로 불순물에 결합할 수 있고, 이는 또한 음성 크로마토그래피로서 언급된다. 일부 실시양태에서, 또한 본원에 기재된 실시예에서 나타나는 바와 같이, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 관통 유동 모드로 수행된다.

용어 "이온 교환 매트릭스"는 음으로 대전된 (즉, 양이온 교환 매질) 또는 양으로 대전된 (즉, 음이온 교환 매질) 매트릭스를 지칭한다. 전하는 하나 이상의 대전된 리간드를 예를 들어 공유 연결에 의해 매트릭스에 부착시킴으로써 제공될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 전하는 매트릭스의 고유 특성일 수 있다 (예를 들어, 전체적 음전하를 갖는 실리카의 경우와 같이).

혼합 모드 음이온 교환 물질은 전형적으로 음이온 교환 기 및 소수성 모이어티를 갖는다. 적합한 혼합 모드 음이온 교환 물질은 CAPTO® Adhere (GE Healthcare, 미국 매사추세츠주 워번)이다.

용어 "음이온 교환 매트릭스"는, 양으로 대전된, 예를 들어, 하나 이상의 양으로 대전된 리간드, 예컨대 4급 아미노 기가 부착된 매트릭스를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 상업적으로 입수가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로스, QAE SEPHADEX™ 및 FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare)을 포함한다. 본원에 기재된 공정 및 시스템에서 사용될 수 있는 다른 예시적 물질은 FRACTOGEL® EMD TMAE, FRACTOGEL® EMD TMAE HIGHCAP, ESHMUNO® Q 및 FRACTOGEL® EMD DEAE (MilliporeSigma, 미국 매사추세츠주 벌링턴)이다.

용어 "양이온 교환 매트릭스"는 음으로 대전된, 또한 매트릭스의 고체 상과 접촉된 수용액 중의 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 매트릭스를 지칭한다. 양이온 교환 매트릭스 또는 수지를 형성하기 위해 고체 상에 부착된 음으로 대전된 리간드는, 예를 들어, 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 상업적으로 입수가능한 양이온 교환 매트릭스는 카르복시-메틸-셀룰로스, 아가로스 상에 고정화된 술포프로필 (SP) (예를 들어, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, GE Healthcare) 및 아가로스 상에 고정화된 술포닐 (예를 들어, S-SEPHAROSE FAST FLOW™, GE Healthcare)을 포함한다. FRACTOGEL® EMD SO3, FRACTOGEL® EMD SE HIGHCAP, ESHMUNO® S, ESHMUNO® CP-FT, ESHMUNO® CPX 및 FRACTOGEL® EMD COO (MilliporeSigma)가 바람직하다.

본원에서 컬럼 재생에 적용시 용어 "재생"은 크로마토그래피 수지에 단단히 결합된 오염물을 제거하기 위한 컬럼 처리를 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 크로마토그래피 컬럼의 재생 방법을 알고 있다. 크로마토그래피 매질의 세정을 위해 다양한 방법이 실행가능하다. 물질의 화학적 안정성 및 오염의 유형이 고려된다. 유기 용매, 염기 및 산이 종종 사용된다. 중합체 매트릭스는 NaOH 또는 다른 알칼리의 존재 하에 불안정적일 수 있는 실리카 겔을 기재로 하는 무기 흡착제보다 더 높은 화학적 안정성을 특징으로 한다. 이들은 또한 탄수화물을 기재로 하는 매질과 대조적으로 산으로의 처리도 견딜 수 있다.

지질 또는 유사 물질 (예를 들어, 지질단백질)은 에탄올, 이소프로판올 또는 에틸렌 글리콜 등의 유기 용매를 사용하여 제거할 수 있다. 변성된 단백질은 수산화나트륨 (0.1N 내지 1.0N NaOH)을 사용하여 효과적으로 제거할 수 있다.

오염물이 단단히 결합되어 있는 경우, 산성 펩신 용액 (예를 들어, 0.01 N HCL 중 0.1% 펩신), 6 M 구아니딘 히드로클로라이드 또는 희석된 나트륨 라우로일 사르코신세이트 (SLS) 용액 (0.25 M NaCl 중 2% SLS)을 사용하여 컬럼 물질을 재생하는 것이 필수적일 수 있다. 이어서 0.01N HCL 중의 20% 2-프로판올을 사용하여 SLS를 제거할 수 있다.

용어 "평형 완충제"는 크로마토그래피 컬럼 또는 생물반응기 내의 리간드와 효과적으로 상호작용하도록 조건을 중화하거나 표적 분자를 달리 편향시키는 데 사용되는 용액 또는 시약을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 완충제 용액은 화학 변화가 발생하고 있는 동안 생물학적 시스템의 pH를 거의 일정하게 유지할 수 있다. 개시내용의 실시양태에 따른 일부 예에서, pH는, 예를 들어, 7.0 내지 10.0 사이의 pH를 갖는 생물학적 시스템에도 불구하고 평형 완충제에 의해 거의 일정하게 유지된다.

용어 "용출 완충제"는 크로마토그래피 매질에 결합된 생성물을 제거하거나 용출하는 데 사용되는 완충제 또는 시약을 지칭한다. 예를 들어, 용출 완충제는 제1 용출 동안 비어 있는 AAV (아데노-관련 바이러스) 입자를, 또한 제2 용출 동안 채워진 AAV 입자를 용출할 수 있고, 이로써 채워진 AAV 입자의 농축이 가능해진다.

용어 "유출물"은, 예를 들어, 완충제 농도를 증가 또는 감소시키지 않으면서 용출 완충제의 일정한 조성을 사용하여, 용출액으로서 공지된 크로마토그래피 공정 동안 나오는, 즉 이동성인 성분을 지칭한다.

용어 "등용매 용출 조건"은 크로마토그래피 공정 동안 용출 완충제의 일정한 조성의 조건을 지칭한다.

용어 "구배 용출 조건"은, 크로마토그래피 공정 동안 용출 완충제의 조성을 변화시키는, 예를 들어, 특정 시간에 및/또는 복수의 컬럼 부피 동안 0-100% 완충제로부터 용출 완충제의 구배를 형성하는 조건을 지칭한다.

크로마토그래피는 세 가지 모드 중 임의의 것으로 작동될 수 있다: (1) 배치 모드, 여기서는 매질을 표적 단백질로 로딩하고, 로딩을 중지하고, 매질을 세척 및 용출하고, 풀(pool)을 수집함; (2) 반-연속 모드, 여기서는 로딩이 연속적으로 수행되면서 용출은 간헐적임 (예를 들어, 연속 다중컬럼 크로마토그래피의 경우); 및 (3) 완전 "연속 모드", 여기서는 로딩 및 용출 둘 다 연속적으로 수행됨. 미국 특허 출원 US 2013/0280788 (그 전체가 본원에 포함됨)은, 차례로, 또한 순차적으로 여러 크로마토그래피 컬럼을 사용하는, 연속 크로마토그래피 방법 및 장치로서 언급되는 것의 실시양태를 기재한다. 연속 크로마토그래피는 "연속 공정" 정제 절차 또는 작업의 부분일 수 있다.

용어 "연속 공정" 또는 "인접 공정"은, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같이, 하나의 공정 단계로부터의 출력이 중단 없이 공정에서 다음 공정 단계로 직접 유동하도록 하는, 2개 이상의 공정 단계 (또는 단위 작업)를 포함하며, 여기서 2개 이상의 공정 단계는 그의 지속기간의 적어도 일부 동안 동시에 수행될 수 있는 것인, 표적 분자의 정제 공정을 지칭한다. 다시 말해서, 본원에 기재된 바와 같은 연속 공정의 경우, 다음 공정 단계가 시작되기 전에 공정 단계를 완료할 필요가 없으며, 샘플의 적어도 일부가 항상 공정 단계를 통해 이동하고 있다. 용어 "연속 공정"은 또한 공정 단계 내의 단계에도 적용되며, 이 경우, 다수의 단계를 포함하는 공정 단계의 수행 동안, 샘플이 공정 단계 수행을 위해 필수적인 다수의 단계를 통해 연속적으로 유동한다. 본원에 기재된 이러한 공정 단계의 일례는 연속 방식으로 수행되는 다수의 단계, 예를 들어 관통-유동 활성탄, 그 후 관통-유동 AEX 매질, 그 후 관통-유동 CEX 매질, 그 후 관통-유동 바이러스 여과를 포함하는 관통 유동 정제 단계이다.

용어 "반-연속 공정"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 단일 공정 단계에서의 유체 물질의 입력 또는 출력이 불연속적이거나 간헐적인, 표적 분자의 일반적으로 연속적인 정제 공정을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 공정 단계 (예를 들어, 결합 및 용출 크로마토그래피 단계)에서의 입력물은 연속적으로 로딩될 수 있지만; 출력물은 간헐적으로 수집될 수 있으며 (예를 들어, 서지 탱크 또는 풀 탱크에서), 여기서 정제 공정에서의 다른 공정 단계는 연속적이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공정 및 시스템은, 이들이 간헐적 방식으로 작동되는 적어도 하나의 단위 작업을 포함하는 반면 공정 또는 시스템에서의 다른 단위 작업은 연속적 방식으로 작동될 수 있다는 점에서 성질상 "반-연속"적이다.

용어 "연결된 공정"은, 공정의 정상 작동 동안 유체 물질이 공정에서 공정 단계를 연속적으로 관통 유동하고 2개 이상의 공정 단계와 동시에 접촉하도록, 공정이 서로 직접적으로 유체 소통되는 2개 이상의 공정 단계 (또는 단위 작업)를 포함하는, 표적 분자의 정제 공정을 지칭한다. 때때로, 공정에서의 적어도 하나의 공정 단계는 폐쇄 위치에서 밸브 등의 배리어에 의해 다른 공정 단계로부터 일시적으로 격리될 수 있음이 이해된다. 개개의 공정 단계의 이러한 일시적 격리는, 예를 들어, 공정의 시동 또는 셧다운 동안 또는 개개의 단위 작업의 제거/교체 동안 필수적일 수 있다. 용어 "연결된 공정"은 또한, 예를 들어, 공정 단계의 의도된 결과를 달성하기 위해 공정 단계가 여러 단계의 수행을 필요로 하는 경우, 공정 단계 내의 단계에도 적용된다. 이러한 일례는, 관통-유동 모드로 수행되는 여러 단계, 예를 들어, 활성탄, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 바이러스 여과를 포함할 수 있는, 본원에 기재된 바와 같은 관통-유동 정제 공정 단계이다.

용어 "유체 소통"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 공정 단계가 임의의 적합한 수단 (예를 들어, 연결 라인 또는 서지 탱크)에 의해 연결되어 있고, 이로써 하나의 공정 단계로부터 또 다른 공정 단계로의 유체의 유동이 가능하게 되는, 두 공정 단계 사이의 유체 물질의 유동 또는 공정 단계의 단계들 사이의 유체 물질의 유동을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2-단위 작업 사이의 연결 라인에는 연결 라인을 통한 유체의 유동을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브가 개입될 수 있다.

용어 "정제하는", "정제", "분리하다", "분리하는", "분리", "단리하다", "단리하는" 또는 "단리"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플로부터 표적 분자의 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 분자의 순도는 샘플로부터 적어도 하나의 불순물을 제거 (완전히 또는 부분적으로)함으로써 증가된다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 표적 분자의 순도는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 크로마토그래피 공정을 사용함으로써 샘플로부터 하나 이상의 불순물을 제거 (완전히 또는 부분적으로)함으로써 증가된다. 또 다른 실시양태에서, 샘플 중의 표적 분자의 순도는 샘플 중의 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자를 침전시킴으로써 증가된다. 폴리펩티드의 용어 "pI" 또는 "등전점"은, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 양전하가 그의 음전하와 균형을 이루는 pH를 지칭한다. pI는 폴리펩티드의 부착된 탄수화물의 아미노산 잔기 또는 시알산 잔기의 순전하로부터 계산될 수 있거나 등전점 집중에 의해 결정될 수 있다.

용어 "pH"는 액체 중의 수소 이온 농도의 척도를 지칭하는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이는 용액의 산도 또는 알칼리도의 척도이다. pH의 계산을 위한 방정식은 1909년 덴마크 생화학자 Søren Peter Lauritz Sørensen에 의해 제안되었다:

pH = -log[H+]

여기서 log는 밑이 10인 로그이고, [H+]는 용액 리터당 몰 단위의 수소 이온 농도를 나타낸다. 용어 "pH"는 "힘"을 의미하는 독일어 단어 "potenz"에 수소의 원소 기호인 H가 조합된 것에서 유래되고, 따라서 pH는 "수소의 힘"에 대한 약어이다.

용어 "공정 파라미터"는, 정제 공정에서 사용되는 조건으로서 본원에서 사용되는 바와 같다. 이들 공정 파라미터는, 예를 들어, 하나 이상의 센서 및/또는 프로브로 모니터링될 수 있다. 공정 파라미터의 예는 온도, 압력, pH, 전도도, 용존 산소 (DO), 용존 이산화탄소 (DCO₂), 혼합 속도 및 유량이다. 센서는 또한 일부 경우에는 광학 센서일 수 있다. 센서는 공정 파라미터의 조정을 위해 자동 제어 시스템에 연결될 수 있다.

용어 "전도도"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 수용액이 두 전극 사이에 전류를 전도하는 능력을 지칭한다. 용액 중에서, 전류는 이온 수송에 의해 유동한다. 따라서, 수용액 중에 존재하는 이온의 양이 증가함에 따라, 용액은 보다 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도에 대한 측정 단위는 센티미터당 밀리지멘스 (mS/cm 또는 mS)이며, 상업적으로 입수가능한 전도도 측정기 (예를 들어, Orion, OPTEX AND KNAUER에 의해 판매됨)를 사용하여 측정될 수 있다. 용액의 전도도는 그 안의 이온의 농도를 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 요망되는 전도도를 달성하기 위해 용액 중의 완충 작용제의 농도 및/또는 염 (예를 들어, NaCl 또는 KCl)의 농도가 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요망되는 전도도를 달성하기 위해 다양한 완충제의 염 농도가 변형된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 첨가제가 샘플 로드에 첨가되는 공정에서, 하나 이상의 세척 단계가 후속적으로 사용되는 경우, 이러한 세척 단계는 약 20 mS/cm 이하의 전도도를 갖는 완충제를 사용한다.

용어 "염"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 산 및 염기의 상호작용에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 본원에 기재된 방법에서 사용되는 다양한 완충제에 사용될 수 있는 다양한 염은 아세테이트 (예를 들어, 아세트산나트륨), 시트레이트 (예를 들어, 시트르산나트륨), 클로라이드 (예를 들어, 염화나트륨), 술페이트 (예를 들어, 황산나트륨), 또는 칼륨 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

용어 "결합 및 용출 모드" 및 "결합 및 용출 공정"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 샘플 중에 함유된 적어도 하나의 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질)가 적합한 수지 또는 매질 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 매질 또는 양이온 교환 크로마토그래피 매질)에 결합하고 후속적으로 용출되는 분리 기술을 지칭한다.

용어 "관통-유동 공정", "관통-유동 모드" 및 "관통-유동 작업"은, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 불순물과 함께 바이오의약품 제제 중에 함유된 적어도 하나의 표적 분자 (예를 들어, Fc-영역 함유 단백질 또는 항체)가, 통상적으로 하나 이상의 불순물에 결합하는 물질을 통해 유동하도록 의도되고, 여기서 표적 분자는 통상적으로 결합하지 않는 것인 (즉, 관통 유동하는 것인) 분리 기술을 지칭한다.

용어 '돌파(breakthrough)"는 컬럼을 통해 연속적으로 펌핑된 특정 용질이 용출되기 시작하는 부피를 지칭한다. 돌파 부피는 특정 용질에 대한 컬럼의 총 샘플 용량을 결정하는 데 유용하다.

용어 "유효 돌파"는, 표적 단백질 (예를 들어, 면역글로불린 G)의 임의의 돌파 전에 측정된 불순물의 정체기 동안 측정된 흡광도로부터 컬럼의 출구에서 유동하는 용액의 280 nm에서의 흡광도를 빼고, 이를 공급물의 280 nm에서의 흡광도의 오프라인 측정값과 불순물의 정체기의 280 nm에서의 흡광도 사이의 차이로 나누는 것으로 측정된다.

용어 "공정 단계" 또는 "단위 작업"은, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같이, 정제 공정에서 특정 결과를 달성하기 위한 하나 이상의 방법 또는 장치의 사용을 지칭한다. 본원에 기재된 공정 및 시스템에 사용될 수 있는 공정 단계 또는 단위 작업의 예는 정화, 결합 및 용출 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 관통-유동 정제 및 제형화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 공정 단계 또는 단위 작업 각각은 그 공정 단계 또는 단위 작업의 의도된 결과를 달성하기 위해 하나 초과의 단계 또는 방법 또는 장치를 사용할 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 정화 단계 및/또는 관통-유동 정제 단계는, 그 공정 단계 또는 단위 작업을 달성하기 위해 하나 초과의 단계 또는 방법 또는 장치를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공정 단계 또는 단위 작업을 수행하기 위해 사용되는 하나 이상의 장치는 단일-사용 장치이고, 공정에서 임의의 다른 장치를 교체할 필요 없이 또는 심지어 공정 실행을 중지할 필요 없이 제거되고/거나 교체될 수 있다.

용어 "서지 탱크"는 본원에서 사용되는 바와 같이 (예를 들어, 단일 공정 단계가 하나 초과의 단계를 포함하는 경우) 공정 단계 사이에서 또는 공정 단계 내에서 사용되는 임의의 컨테이너 또는 용기 또는 백을 지칭하며; 여기서 하나의 단계로부터의 출력물은 서지 탱크를 통해 다음 단계로 유동한다. 따라서, 서지 탱크는, 단계로부터의 출력물의 전체 부피를 보유하거나 수집하도록 의도되지 않는다는 점에서 "풀 탱크"와 상이하지만; 대신에 하나의 단계로부터 다음 단계로의 출력물의 연속 유동을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공정 또는 시스템에서의 두 공정 단계 사이에서 또는 공정 단계 내에서 사용되는 서지 탱크의 부피는, 공정 단계로부터의 출력물의 전체 부피의 25% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 서지 탱크의 부피는 공정 단계로부터의 출력물의 전체 부피의 10% 이하이다. 일부 다른 실시양태에서, 서지 탱크의 부피는, 표적 분자가 정제되어야 하는 출발 물질을 구성하는 생물반응기 내의 세포 배양물의 전체 부피의 35% 미만, 또는 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만이다.

용어 "정적 혼합기"는 두 가지 유체 물질, 전형적으로는 액체를 혼합하기 위한 장치를 지칭한다. 장치는 일반적으로 원통형 (튜브) 하우징에 함유된 혼합기 요소로 이루어진다. 전반적 시스템 디자인은 유체의 두 스트림을 정적 혼합기 내로 전달하는 방법을 포함한다. 스트림이 혼합기를 통해 이동함에 따라, 비-이동 요소는 물질을 연속적으로 블렌딩한다. 완전한 혼합은 유체의 특성, 튜브의 내경, 혼합기 요소의 수 및 그의 디자인 등을 포함한 많은 변수에 따라 달라진다.

용어 "표준화된 값(들)" 또는 "허용된 값(들)"은 특정 공정 또는 절차 파라미터에 대해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 허용되는 값 또는 값의 범위를 지칭한다. 표준화된 값(들)을 벗어나는 값은 공정 또는 절차가 효율적으로 작동하지 않고 있으며 공정 파라미터 또는 공정 구성요소가 조정, 세정 또는 교체되어야 할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명과 관련하여, 공정 파라미터가 효율적인 크로마토그래피 컬럼 실행에 대한 표준 또는 허용된 값을 벗어나면, 크로마토그래피 컬럼이 재생되거나, 세정되거나 교체된다. 표준화된 값은, 예를 들어, pH, 온도, 전도도, 염 농도, 광 흡수, 적합한 파장의 빛으로의 여기 후 형광, 굴절률, 전기화학 반응 및 질량 분광측정 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 값은 공정 데이터 (즉, 공정 값(들)) 생성을 위해 하나의 공정 유체를 하나 이상의 공정 파라미터가 상이한 또 다른 공정 유체로 교환하기 직전, 그 동안, 또한 그 직후를 포함하나 이에 제한되지는 않는 크로마토그래피 실행 동안 임의의 시간에 측정될 수 있으며, 상기 공정 데이터는 가공처리되는 크로마토그래피 실행에 대한 해당 파라미터에 대한 표준으로 간주되는 값 (표준 값)과 비교된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 특정 크로마토그래피 컬럼 및 공정 파라미터에 대한 표준화된 값(들)을 결정할 수 있을 것이다.

이론단 등가 높이

이론단 등가 높이 (HETP)는 컬럼 유효성 및 효율을 평가하기 위해 사용되는 모델링 시스템이다. HETP 모델은 컬럼을 최적화하기 위해 크로마토그래피 컬럼을 디자인하고 평가하는 데 도움이 된다. 목표는 컬럼 유출물 피크의 최소 또는 제한된 확장을 얻는 것이다. HETP 모델은 크로마토그래피 컬럼을 플레이트라고 불리는 이론적인 층으로 나눈다. 고정 상과 이동 상 사이의 별도의 샘플 평형화가 "플레이트"에서 발생한다. 플레이트 수 (N)가 높을수록, 분리가 우수할 것이다. 컬럼이 적당히 패킹되면, 이는 "좋은" 수의 플레이트, 또한 그에 따라 작은 HETP를 가질 것이다. 비교적 높은 수의 플레이트를 갖는 컬럼은 보다 낮은 수의 피크를 갖는 유사한 컬럼보다 더 예리한 컬럼 피크를 가질 것이다.

HETP = L/N

따라서, HETP는 가우스 곡선의 폭을 설명한다. 잘 패킹된 컬럼의 경우, HETP는 평균 입자 직경의 3 - 6배 범위에 있을 것이다. 예를 들어, 75 μm 비드의 경우, HETP 표적은 0.0225 내지 0.045 cm이다.

비대칭성은 컬럼 유효성 및 효율에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 인자이다. 이상적인 컬럼 실행에서는, 컬럼 피크의 앞쪽 절반이 컬럼 피크의 뒤쪽 절반에 대한 거울 상이어야 한다. 다시 말해서, 절반이 나머지 절반보다 더 "트레일 오프(trail off)"되어서는 안 된다. 비대칭성은 다음과 같이 계산된다:

A_S = b / a

도 1은 어느 정도의 비대칭성을 갖는 대표적 컬럼 피크를 나타낸다.

따라서, 비대칭성은 이상적인 가우스 곡선으로부터의 피크 형상의 편차를 나타낸다. 좋은 작업 범위는 0.8 - 1.8이지만 이 범위는 컬럼 길이에 기초하여 추가로 세분화될 수 있다. 긴 층의 경우, 좋은 작업 범위는 0.8 - 1.5이고, 짧은 층의 경우 좋은 작업 범위는 0.7 - 1.8이다.

펄스 분석

HETP 펄스 분석은 일반적으로 흡광도 또는 전도도 측정에 의해 모니터링되고 무한히 짧은 지속기간 (dt) 및 무한히 높은 값 (y_max = 1/dt)의 펄스로서 이론적으로 표시되는 소량의 불활성 추적자를 주입함으로써 달성된다. 다공성 매질을 통해 유동하는 것 외에 임의의 다른 상호작용 없이 패킹 층을 통해 이 추적자 펄스가 유동하면 가우스 형상을 갖는 피크의 컬럼 뒤 표시를 제공한다. 이 가우스 곡선을 분석하면 하기 공식을 사용하여 HETP 및 비대칭성의 값이 제공된다:

여기서 BH는 층 높이이고, t_R은 추적자의 주입 시간과 최대 피크 높이의 표시 시간 사이의 지속기간으로 결정될 수 있는 체류 시간이다. W_1/2은 피크의 최대 높이의 절반에서의 피크 폭이다. 도 1 참조. A10 및 B10은 최대값의 10% 및 피크 높이의 최대값에 도달하는 시간 사이의 지속기간이다. HETP 값이 더 작고 비대칭성이 1에 더 가까운 것은 컬럼 내의 크로마토그래피 매질의 우수한 패킹 품질의 표시이다.

정면 분석

또 다른 방법인 HETP 정면 분석은 측정 값의 하나의 단계를 생성하기 위해 컬럼 내에서 유동하는 완충제를 갑자기 변화시키는 것으로 이루어진다. 이 단계는 이론적으로 이전에 기재된 펄스를 하기 공식으로 통합하는 것이다: t<t₀이면 y=y₁이고, t≥t₀이면 y=y₂이고, (y₂ - y₁)은 단계의 높이임. 컬럼을 통한 이 단계의 유동은 이론적으로 가우스 곡선의 적분인 곡선을 생성한다. 이 곡선의 미분에 의해, 우리는 가우스 형상을 갖는 유사한 피크를 얻어 HETP 및 비대칭성 값을 얻을 수 있다. 도 2a & b 참조. 도 3은 컬럼 실행의 다양한 스테이지 동안 생성된 전도도의 대표적 그래프를 나타낸다. HETP 정면 분석이 수행될 수 있는 영역이 표시되어 있다.

이 방법은 연속 크로마토그래피 작업의 중지 없이 연속 크로마토그래피 작업의 모든 사이클의 종료시 크로마토그래피 수지의 패킹 품질을 제공한다. 우리는 도 4에 범위 내에 있는 컬럼별 및 사이클별 HETP의 값을 표시하였다. 우리는 도 5에, 도 4의 HEPT 값과 대조적으로 범위에서 벗어난 컬럼별 및 사이클별 비대칭성의 값을 표시하였다. 실선 수평선은 권고 HETP 및 비대칭성 (허용가능 값)의 예시적 범위를 나타낸다. 허용가능 값은 특정 컬럼 파라미터에 기초하여 상이할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 의해 제공된 교시내용에 따라 실행되는 특정 컬럼에 대한 허용가능 HETP 및 비대칭성 파라미터를 결정할 수 있을 것이다. 전형적으로, 잘 패킹된 컬럼의 경우, HETP는 평균 입자 직경의 3 - 6배 범위에 있을 것이다. 예를 들어, 75 μm 비드의 경우, HETP 표적은 0.0225 내지 0.045 cm이다.

비대칭성의 좋은 작업 범위는 0.8 - 1.8이지만 이 범위는 컬럼 길이에 기초하여 추가로 세분화될 수 있다. 긴 층의 경우, 좋은 작업 범위는 0.8 - 1.5이고, 짧은 층의 경우 좋은 작업 범위는 0.7 - 1.8이다.

평활화 필터

평활화 필터는, 통계, 이미지 처리 및 데이터 처리에 사용되는 수학 공식 또는 알고리즘으로, 데이터 세트를 평활화하는 것은 노이즈 또는 다른 미세-규모 구조/빠른 현상을 배제하면서 데이터에서의 중요한 패턴을 포착하려고 시도하는 근사 함수의 생성이다. 평활화에서는, 신호의 데이터 포인트가 수정되어 인접한 포인트보다 더 높은 개개의 포인트 (아마도 노이즈로 인해)가 감소되고 인접한 포인트보다 더 낮은 포인트가 증가되어 보다 평활한 신호를 생성한다. 다시 말해서, 이들 필터의 목적은 신호 강도를 감소시키지 않으면서 노이즈 데이터를 평활화하는 것이다.

각각 다양한 상이한 용도에 대한 그의 장점 및 단점을 갖는 많은 특정 평활화 필터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대부분은 "이동 평균" 분석을 사용한다. 이동 평균 분석을 사용하면, 각 데이터 포인트가 주변 데이터 포인트의 로컬 평균으로 대체된다. 알고리즘은 가중 또는 비가중 평활화 기능을 구현할 수 있다. 가중 평균은 분석되는 중앙 값에 더 큰 가중치를 부여하는 반면, 이름에서 알 수 있듯이, 비가중 평균은 분석되는 모든 값에 동일한 가중치를 부여한다.

특정 용도에 대해 또 다른 알고리즘 대신 하나의 알고리즘을 사용하기로 결정하는 선택은, 특히 용도가 새롭거나 통상적이지 않거나 시험되지 않은 경우, 경험적 수단에 의해 결정되어야 할 수 있다. 또한 추가로, 예를 들어, Weiner 필터링 (en.wikipedia.org/wiki/Wiener_filter) 또는 평활화되지 않은 원시 데이터의 사용을 포함한, 평활화 필터에 대한 대안이 관련 기술분야에 존재한다.

구체적으로 제한되지는 않지만, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 사비츠키-골레이 필터를 사용한다. Savitzky A., and Golay, M.J.E. 1964, Analytical Chemistry, vol. 36, pp. 1627-1639. 사비츠키-골레이 필터는 저역 통과 필터이다. 저역 통과 필터는 본질적으로 저주파 신호를 제외한 모든 신호를 필터링함으로써 작동한다. 효과적으로, 이는 "지터리(jittery)" 고주파 노이즈를 제거함으로써 데이터를 "평활화"한다.

연속 크로마토그래피

연속 크로마토그래피에서는, 전형적으로 여러 동일한 컬럼이 방법 요건에 따라 컬럼이 직렬 및/또는 병렬로 작동될 수 있게 하는 배열로 연결된다. 따라서, 모든 컬럼은 동시에 실행될 수 있거나 그의 작동이 간헐적으로 겹칠 수 있다. 각 컬럼은 전형적으로 공정 실행 동안 여러 번 로딩, 용출, 및 재생된다. 단일 크로마토그래피 사이클이 로딩, 세척, 용출 및 재생 등의 여러 연속 단계에 기초하는 종래의 크로마토그래피와 비교하여, 다수의 동일한 컬럼에 기초한 연속 크로마토그래피의 경우, 모든 이들 단계가 상이한 컬럼 상에서 일어날 수 있다. 따라서, 연속 크로마토그래피 작업은 크로마토그래피 수지의 보다 우수한 활용 및 감소된 완충제 요구를 제공할 수 있으며, 이는 공정 경제성에 유익하다.

결합 및 용출 크로마토그래피 또는 사이징 크로마토그래피 공정 단계에서 사용될 수 있는 예시적 연속 크로마토그래피 공정은, 예를 들어, 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다: 유럽 특허 출원 번호 EP11008021.5 (US 2014/0251911) 및 EP12002828.7 (US 2020/0101399) (둘 다 참조로 포함됨). 또한, 미국 특허 번호 9,149,738 (그 전문이 본원에 포함됨)은 차례로, 또한 순차적으로 여러 크로마토그래피 컬럼을 사용하는, 연속 크로마토그래피 방법 및 장치를 기재한다. 연속 크로마토그래피는 관련 기술분야에 공지된 크로마토그래피의 임의의 유형 또는 유형들에 적용될 수 있다.

예시

연속 크로마토그래피 절차에서 입증된 HETP

이러한 분석 방법의 이점을 입증하기 위해, 우리는 면역글로빈 G를 pH = 6.5로 조정된 0.05 mol/L의 트리스 완충제 중에서 제조함으로써 4 g/L의 면역글로빈 G의 포획을 수행하였다. 우리는 3.079 L의 총 컬럼 부피에 대해 9.8 mm의 층 높이를 갖는 Merck KGaA로부터의 Eshmuno® A라 불리는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로 패킹된 내경 200 mm의 3개의 QuikScale (Milliporeigma, 미국 매사추세츠주 베드포르) 크로마토그래피 컬럼을 사용하였다. 각 컬럼은 150 cm/h의 선형 속도로 NaCl 0.3M의 완충제 중에서 아세톤 2% w/w의 펄스를 사용하는 HETP 펄스 분석 방법으로 시험되었다. 아세톤 펄스 부피는 컬럼 부피의 2%였다. 시험은 CoPrime® Biochromatography (MilliporeSigma) 시스템으로 수행되었고, HETP 펄스 분석은 Merck KGgA에 의해 개발된 그의 소프트웨어 Common Control Platform®의 보고서 생성기로 계산되었다. 컬럼 1에 대한 결과는 HETP = 0.0183 cm 및 비대칭성 = 1.692였고, 컬럼 2에 대해서는 HETP = 0.0145 cm 및 비대칭성 = 1.783이었으며, 컬럼 3에 대해서는 HETP = 0.0337 cm 및 비대칭성 = 1.333이었다.

이 입증에 사용된 멀티-컬럼-캡처 시스템은 제3 컬럼이 비-로딩 단계를 수행하는 동안 직렬의 2개 컬럼 상에 294 cm/h로 로딩할 수 있게 한다. 제1 컬럼은 제1 펌프에 의해 면역글로불린 G가 그의 입구에 직접 공급되는 로딩 컬럼이다. 제1 컬럼이 로딩되는 동안, 면역글로불린 G의 일부가 단백질 A 수지 Eshumno® A에 결합한다. 제1 컬럼의 출구는 로딩-전(pre-loading) 컬럼인 제2 컬럼에 직접 연결된다. 제2 컬럼은 제1 컬럼에 결합되지 않은 물질 (불순물이지만 제1 컬럼의 단백질 A 수지에 결합되지 않은 면역글로불린 G)을 수용한다. 제2 컬럼의 출구는 폐기물로 진행된다. 로딩이 일어남에 따라, 수지의 단백질 A 부위는 포획된 면역글로불린 G에 결합될 것이다. 결합 부위의 포화는 제1 컬럼의 입구에서 출구까지의 구배를 따를 것이며, 입구는 결합된 면역글로불린 G로 먼저 포화되지만, 출구 근처의 결합 부위는 포화되지 않을 수 있다. 그러나, 컬럼의 단부 근처의 결합 부위가 점점 더 포화됨에 따라, 결합 부위가 로딩되고 과잉 면역글로불린 G가 컬럼을 돌파하였다.

단지 하나의 컬럼을 포함하는 전통적인 배치 접근에서는, 생성물의 돌파 전에 공정을 중지시킴으로써 생성물의 손실을 방지한다. 이는 10% 돌파를 얻기 위해 추정되는 부피의 90%에서 컬럼 로딩을 중지함으로써 수행되며, 이는 컬럼의 출구에서의 생성물 중에서의 농도가 입구에서의 농도의 10%임을 의미한다. 따라서, 전통적인 접근에서는, 입구에서 출구까지 결합된 단백질 A 부위의 구배로 인해 출구에 가까울수록 사용되는 결합 부위가 적어진다. 연속 크로마토그래피의 목표는 제1 컬럼을 60% 또는 70%까지 과포화시키고 컬럼 관통유동을 제2 컬럼에 공급하여 제1 컬럼을 돌파하는 면역글로불린 G를 포획하는 것이다. 이는 제1 컬럼의 단백질 A 수지의 보다 효율적인 사용을 제공한다.

제2 컬럼은 공급 농도의 0% 내지 60-70%의 보다 낮은 입구 농도로 면역글로불린 G를 포획하기 때문에 로딩-전으로 간주된다. 생성물 및 불순물 농도는 280 nm에서 측정된 흡광도를 사용하여 추정된다. 로딩 시작 동안, 결합되지 않은 생성물의 임의의 돌파 전에, 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 부위가 없는 불순물이 먼저 컬럼을 관통 유동하여 이를 빠져나간다. 이들 불순물의 280 nm에서의 흡광도는 불순물 정체기라 불리며 0% 돌파에 상응한다. 대조적으로, 제1 컬럼 로딩 전에 면역글로불린 G의 공급물의 280 nm 측정에서의 오프라인 흡광도는 100% 돌파에 대한 값을 제공한다. 유효 돌파는, 면역글로불린 G의 임의의 돌파 전에 측정된 불순물의 정체기 동안 측정된 흡광도로부터 컬럼의 출구에서 유동하는 용액의 280 nm에서의 흡광도를 빼고, 이를 공급물의 280 nm에서의 흡광도의 오프라인 측정값과 불순물의 정체기의 280 nm에서의 흡광도 사이의 차이로 나누는 것으로 측정된다.

60% 또는 70%와 같은 돌파 수준에 도달하면, 3-방향 밸브의 세트를 사용하여 공급 펌프로부터 제1 컬럼을 분리하고 이를 비-로딩 단계를 위해 완충제 펌프에 연결하였다. 제1 컬럼의 출구는 제2 컬럼과 분리되어 폐기물 또는 분획 수집과 같은 출구의 세트에 연결된다. 제2 컬럼의 입구는 공급 펌프에 연결된다. 제2 컬럼은 로딩 컬럼이 된다. 제2 컬럼의 출구는 폐기물에 연결된 로딩-전 컬럼이 되는 제3 컬럼의 입구에 연결된다. 컬럼 1의 비-로딩 단계는 컬럼 2의 돌파보다 더 빨라야 할 것이다. 컬럼 2에서의 돌파 후, 이는 비-로딩 단계를 위한 완충 펌프에 연결된다. 컬럼 3은 로딩 컬럼이 되고, 공급 펌프에 연결된 그의 입구 및 컬럼 3의 출구는 컬럼 1의 입구에 연결되고, 이는 로딩-전 컬럼이 된다. 컬럼 3에서의 돌파 후, 완전한 사이클이 완료되고, 컬럼 1의 입구를 공급 펌프에 연결하고 새로운 사이클을 위한 로딩 컬럼이 되게 함으로써 시스템이 새로운 사이클을 시작하고, 컬럼 1의 출구는 컬럼 2의 입구에 연결되어 다시 로딩-전 컬럼이 되고, 컬럼 3은 비-로딩 단계를 위해 완충 펌프에 연결된다. 본 발명의 추가의 이점은 공급 펌프를 결코 중지시키지 않고 모든 비-로딩 단계를 로딩 단계보다 더 빠르게 갖는다는 점이다.

우리의 입증을 위해, 비-로딩 단계는 430 cm/h에서 실행되었다. 이는 먼저 8개 컬럼 부피에 대해 pH = 6.5의 트리스 0.05 mol/L로의 컬럼 세척으로 구성되었다. 이어서 pH = 3의 아세트산 0.1 mol/L을 사용한 용출 및 피크 시작시 0.05 AU (Absorbance Unit. 하기 참조: en.wikipedia.org/wiki/Absorbance#Absorbance_of_a_material)로의 피크 수집 및 수집 종료 후 3개 컬럼 부피에 대한 NaOH 0.1 mol/L로의 소독 단계 및 5개 컬럼 부피에 대한 pH = 6.5의 트리스 0.05 mol/L로의 평형화를 수행하였다.

이 일련의 단계를 모든 컬럼의 비-로딩 단계에 대해 사이클마다 실행하였기 때문에, 사이클별로 컬럼의 조건을 모니터링할 수 있었따. 우리의 입증에서, 우리는 NaCl 0.1 mol/L의 20 mS/cm으로부터 pH = 6.5의 트리스 완충제 0.05 mol/L의 9 mS/Cm으로 전도도가 강하함에 따라 평형화 동안 전도도의 곡선을 분석한다. 우리는 컬럼의 체류 시간 분포의 결정 (예를 들어, 하기 참조: en.wikipedia.org/wiki/Residence_time#Pulse_experiments 및en.wikipedia.org/wiki/Residence_time#Biochemical)과 비교하였다. NaCl 0.1 mol/L에서 트리스 완충제 0.05 mol/L로의 전환으로 인한 전도도 강하를 전도도 단계 실험으로 간주하며, 이는 펄스 함수의 적분 함수이고 (예를 들어, 하기 참조: en.wikipedia.org/wiki/Laplace_transform#Table_of_selected_Laplace_transforms), 따라서 HETP 펄스 분석과 HETP 정면 분석 사이의 유사성이다. 컬럼 출구에서의 전도도 곡선의 미분에 의해, 우리는 펄스 분석에서 얻을 수 있는 것과 유사한 곡선을 얻을 수 있다. 도 6 참조. 최소한의 노이즈가 전도도 곡선의 미분을 방해함에 따라, 이 곡선의 평활화 및 미분이 필수적이다.

전도도 곡선의 평활화를 위해, 우리는 공식: 으로 사비츠키-골레이 평활화 필터를 사용하였다. 이 공식에서, sf는 2 내지 12의 평활화 인자이고; 도 bb에서 우리는 sf 2, 3, 6 및 9를 보여준다. c_t는 시간 t에서의 전도도이고, c_t+i은 시간 t 플러스 우리의 입증에서는 2초인 두 포인트 사이의 시간 간격의 수 i에서의 전도도이고, y_t는 시간 t에서의 평활화된 전도도이다. a_i는 평활화 계수이며 여기서 a_i = a_-i이고, 평활화 인자에 따른 값은 하기 표에 기재된다. 우리는 평활화된 전도도의 각 포인트가 포인트당 가중치가 동등하지 않은 이동 평균의 결과임을 관찰하였다. 이 이동 평균에 사용된 포인트의 수는 이것이 계산 당시 포인트 c_t, 이 포인트 전의 sf 포인트 및 이 포인트 후의 sf 포인트를 사용하였기 때문에 2sf+1과 같다.

표 1

도 7은 제10 사이클의 비-로딩 단계의 평형화 동안 컬럼 3에 대한 결과를 나타낸다. 우리는 112 s에서의 약간의 전도도 강하가 평활화되었음을 관찰한다.

전도도의 미분을 얻기 위해, 우리는 다시 한번 사비츠키-골레이 평활화 필터를 사용하였지만, 공식: 으로 1차 미분을 수행하였다. 이 공식에서, sf는 2 내지 12의 평활화 인자이고, 우리의 입증에서, 우리는 동일한 sf 수: 2, 3, 6 및 9를 유지한다. c_t는 시간 t에서의 전도도이고, c_t+i은 시간 t 플러스 우리의 입증에서는 2초인 두 포인트 사이의 시간 간격의 수 i에서의 전도도이고, y_t는 시간 t에서의 평활화된 전도도이다. 이번 평활화 계수는 a_i = i이고, 따라서 a_i = - a_-i 및 a₀ = 0이다. 평활화 인자에 따른 h'_sf의 값은 하기 표에 기재된다. 우리는 평활화된 전도도 미분 곡선의 각 포인트가 다시 포인트당 가중치가 동등하지 않은 이동 평균의 결과임을 관찰하였다. 이 이동 평균에 사용된 포인트의 수는 이것이 계산 당시 포인트 c_t, 이 포인트 전의 sf 포인트 및 이 포인트 후의 sf 포인트를 사용하였기 때문에 다시 2sf+1과 같았다.

표 2

제10 사이클의 비-로딩 단계의 평형화 동안 컬럼 3에 대한 결과가 도 8에 나타나 있다. 우리는, 우리가 HETP 펄스 결과 함수와 매우 유사한 약간의 비대칭성을 갖는 가우스형 곡선을 얻었음을 관찰하였다. 그럼에도 불구하고, 우리는 우리가 곡선을 더 평활화할수록 이것이 더 넓어지고 HETP가 더 높아짐을 관찰한다. 평활화 인자 2는 노이즈가 없는 곡선을 제공함에 따라, 우리는 전도도 곡선의 이러한 가벼운 평활화를 사용하였다.

연속 실행 동안 우리는 용출 피크를 수집하였고, NANODROP™ 시스템 (Thermofisher, 미국 매사추세츠주 월섬)으로의 280 nm에서의 측정에 의해 그의 부피 및 면역글로빈 G의 양을 평가하였다. 우리가 HETP 및 수집된 용출액의 양의 결과를 플롯팅한 경우 (도 9, 11 및 12 참조), 우리는 측정된 HETP가 낮을수록 면역글로빈 G가 더 많이 수집됨을 관찰하였다. 이는 컬럼의 포획 품질을 연속적으로 모니터링하는 데 있어 실제 이점을 보여준다. 비대칭성 (도 10, 12 및 14 참조) 및 용출액 부피의 플롯은 보다 적은 정보를 제공하지만, 두 값 모두 HETP 증가에 따라 또한 증가하는 경향이 있으며 용출액 양 감소는 성능 손실을 의미한다.

Claims

효율 및 품질에 대해 연속 공정 모드로 작동되는 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 모니터링하는 방법이며, 상기 방법은
a) 연속 모드로 사용되는 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 제공하는 단계;
b) 하나의 공정 유체를 하나 이상의 공정 파라미터가 상이한 또 다른 공정 유체로 교환하기 직전에, 그 동안, 또한 그 직후에, pH, 전도도, 염 농도, 광 흡수, 적합한 파장의 빛으로의 여기 후 형광, 굴절률, 전기화학 반응 및 질량 분광측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정 파라미터의 변화를 검출하여 공정 데이터를 생성하는 단계;
c) 상기 공정 데이터에 곡선 평활화 필터를 적용하여 보정된 공정 데이터를 생성하는 단계;
d) 상기 보정된 공정 데이터의 1차 도함수를 계산하여 상기 보정된 공정 데이터의 유도된 공정 데이터를 생성하는 단계;
e) 상기 유도된 데이터의 HETP 값 및 비대칭성을 결정하는 단계;
f) HETP 값 및 비대칭성을 표준화된 값과 비교하는 단계
를 포함하고,
g) 여기서, HETP 값 및 비대칭성이 상기 표준화된 값 내에 속하면, 컬럼이 또 다른 공정 실행에 사용되는 것인,
방법.
제1항에 있어서, 상기 곡선 평활화 계산이 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 평활화 필터인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 컬럼 또는 컬럼들이 2 내지 200회 실행 동안 연속적으로 사용된 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼 또는 컬럼들이 5 내지 50회 실행 동안 연속적으로 사용된 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속 공정 모드가 적어도 2개 내지 최대 5개의 상이한 컬럼을 순차적으로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼이 친화성, 이온 교환, 크기 배제, 역상, 키랄, 정면 및 소수성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 컬럼이 효율 및 품질에 대해 모니터링되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속 공정 모드가 다수의 공정 단계를 포함하고, 적어도 2개 내지 최대 10개의 공정 단계를 순차적으로 포함하고, 적어도 하나의 공정 단계가 크로마토그래피 컬럼을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표준화된 값이 동일한 또는 실질적으로 동일한 컬럼 및 공정 파라미터를 사용한 이력 데이터에 기초하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, HETP 값 및 비대칭성이 상기 표준화된 값 내에 속하지 않으면 컬럼이 재생되는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, HETP 값 및 비대칭성이 상기 표준화된 값 내에 속하지 않으면 자동 시스템에 의해 작업자에게 통지되는 것인 방법.