CN117980740A - 用于在连续色谱操作过程中监测色谱树脂的方法 - Google Patents

用于在连续色谱操作过程中监测色谱树脂的方法 Download PDF

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Abstract

用于通过监测缓冲液变化，然后对记录值进行平滑和求导，在不中断柱操作的情况下监测以连续模式操作的色谱柱的质量和效率的方法。

Description

用于在连续色谱操作过程中监测色谱树脂的方法
发明背景
柱色谱法广泛用于生物技术行业来纯化产品。通常，靶治疗蛋白如胰岛素或单克隆抗体是在原核或真核细胞中产生的。然后需要从培养基、细胞、细胞碎片和培养过程中产生的任何其他杂质中纯化靶蛋白。柱色谱用于通过例如靶蛋白和杂质之间的电荷差异、靶蛋白或杂质对配体的亲和力以及尺寸排阻来分离靶蛋白。大多数纯化方案需要依次进行几个不同的色谱步骤来纯化靶蛋白。
色谱操作需要通过HETP(等效理论板高度)测试来测试填充床的质量以对柱效率进行定期检查。该测试通常是通过将柱从生产中取出并使用脉冲分析来完成的。
传统上，生物制造以批量模式进行，每个阶段都需要储存罐或等效物以在连续步骤之间保存产品。这需要停止和启动该过程，耗费时间，并且需要使用储存容器，耗费宝贵的空间。连续加工是这样的概念，即让原材料(即培养的工程化细胞和培养基)进入制造过程的一端，并让产品从另一端出来，不需要储存罐或停止和启动过程。然而，连续过程使得几乎不可能有效且一致地监测色谱柱的质量和效率。本领域需要的是在不必停止或延迟用于测试的过程条件的情况下监测色谱质量的方法。
发明概述
本发明提供了不必停止生产过程即可监测柱色谱的方法。换言之，本发明解决了现有技术中难以监测柱质量和效率(即柱性能)的问题。本发明涉及在连续过程生产场景中监测柱性能，而不需要停止过程、不需要向过程流程添加额外的测试特定步骤或添加特定于柱测试目的的试剂(例如脉冲化学品或试剂)。换言之，无需中断过程即可监测柱性能。
本发明通过监测过程参数的相变来解决该问题。可以通过本发明来监测以监测柱性能的过程参数包括，例如但不限于a)电导率；b)pH；c)盐浓度；d)光吸收；e)用合适波长的光激发后的荧光；f)折射率；g)电化学响应；和h)质谱数据。可以在任何生产过程中以及对于生产过程中的任何柱来监测一个或多个过程参数。
在本发明的一方面，通过测量可测量参数例如电导率、光吸收或pH的变化来确定填充床的质量。因此，当前的HETP正面分析(HETP frontal analysis)方法包括突然改变柱中流动的溶液以产生测量值的阶跃(step)。通过对产生这些阶跃的现有色谱操作进行正面分析，并在一个又一个的循环中重复该分析，可以在不中断过程的情况下监测色谱柱的填充质量。此外，这种一个又一个分析循环的重复允许人们判断连续过程中柱质量的变化。
可以通过使用特定于被监测的过程参数的探针来监测过程参数。本领域的技术人员或普通技术人员将能够选择适当的探针来监测特定的过程参数。
过程参数可以手动监测，即由人观察并注意读取探针或记录系统。然而，优选地，过程参数由被设计、编程或适合于监测所述过程参数并记录来自探针的值的计算机或计算机系统自动监测。以这种方式，观察和记录的值可以输入到程序中，用于分析以确定柱质量是否足以用于另一次运行或者柱是否需要清洁或重新填充。
本发明考虑了监测以连续过程模式操作的一个或多个色谱柱的效率和质量的方法，该方法包括：提供以连续模式使用的一个或多个色谱柱；紧接在将一种过程流体换成在一个或多个过程参数上不同的另一种过程流体之前、期间和直接之后检测一个或多个过程参数的变化以生成过程数据，所述过程参数选自由pH、电导率、盐浓度、光吸收、用适当波长的光激发后的荧光、折射率、电化学响应和质谱组成的组；对所述过程数据应用曲线平滑滤波器以生成校正的过程数据；计算所述校正过程数据的一阶导数(first derivative)以产生所述校正过程数据的求导(derivatized)过程数据；确定所述求导数据的HETP值和不对称性；将HETP值和不对称性与标准化值进行比较；其中，如果HETP值和不对称性落在所述标准化值内，则将该柱用于另一过程运行。
该方法还考虑曲线平滑计算是Savitzky-Golay平滑滤波器。
该方法还进一步考虑一个或多个柱(column or columns)已连续用于2至100次运行。
权利要求1的方法，其中所述一个或多个柱已连续用于5至50次运行。
该方法还进一步考虑连续过程模式依次包括至少两个但不超过五个不同的柱。
该方法还进一步考虑柱选自由亲和柱、离子交换柱、尺寸排阻柱、反相柱、手性柱、正面柱和疏水柱组成的组。
该方法还进一步考虑监测每个柱的效率和质量。
该方法还进一步考虑连续过程模式包括多个过程步骤，依次包括至少两个但不超过十个过程步骤，并且至少一个过程步骤包括色谱柱。
该方法还进一步考虑标准化值基于使用相同或基本上相同的柱和过程参数的历史数据。
该方法还进一步考虑HETP值和不对称性不落入所述标准化值内，则再生柱。
该方法还进一步考虑HETP值和不对称性不落入所述标准化值内，则由自动系统通知操作员。在一些实施方案中，自动系统是警报系统或其他通知系统。可以考虑这些警报的几个参数。例如，1)启用/禁用；2)非关键级别-高/低，其可能会触发蜂鸣器并显示非关键警报；3)关键警报-高/低，其停止过程，但操作员必须确认并可以重新启动过程，例如用来完成过程运行。
附图说明
图1显示了色谱柱脉冲分析后生成的代表性曲线。
图2A和B.图2A显示了由色谱柱中的缓冲液变化产生的测量值的步骤的图形展示。图2B显示了对柱后电导率点进行平滑和求导后得到的曲线。
图3显示了柱运行的多个阶段生成的电导率的代表性图。表示了其中进行HETP正面分析的区域。
图4显示了三个柱在多个循环内生成的HETP值。水平实线举例说明了为这些运行推荐的HETP可接受范围。第4个循环的峰是出于展示目的而中断连续色谱过程的地方。
图5显示了由三个柱生成的不对称数据的实例，其中所述柱明显超出了推荐值。水平实线举例说明了为这些运行推荐的不对称性的可接受范围。第4个循环的峰是出于展示目的而中断连续色谱过程的地方。
图6显示了不同时间点的柱后电导率。
图7显示了使用平滑因子(sf)2、3、6和9进行平滑后与图6相同的数据。
图8显示了求导后与图6和7相同的数据。
图9显示了HETP(Y1轴)和第1个柱在12个循环(X轴)中收集的洗脱液的量(Y2轴)的图。
图10显示了第1个柱在12个循环(X轴)中的不对称性图(Y轴)。
图11显示了HETP(Y1轴)和第2个柱在12个循环(X轴)中收集的洗脱液的量(Y2轴)的图。
图12显示了第2个柱在12个循环(X轴)中的不对称性(Y轴)图。
图13显示了HETP(Y1轴)和第3个柱在12个循环(X轴)中收集的洗脱液的量(Y2轴)的图。
图14显示了第3个柱在12个循环(X轴)的不对称性(Y轴)图。
发明详述
定义
如本文所用，术语“色谱法”是指将目标分析物(例如，靶分子)与混合物中存在的其他分子分开的任何类型的技术。通常，由于混合物中的各个分子在移动相的影响下或在结合和洗脱过程中通过固定介质迁移的速率不同，因此目标分析物与其他分子分开。
术语“色谱树脂”或“色谱介质”在本文中可互换使用，并且指将目标分析物(例如，靶分子)与混合物中存在的其他分子分开的任何类型的相(例如，固相)。通常，由于混合物中的各个分子在移动相的影响下或在结合和洗脱过程中通过固定固相迁移的速率不同，因此目标分析物与其他分子分开。多种类型的色谱介质的实例包括例如阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换膜、疏水相互作用树脂和离子交换整料(monoliths)。其他色谱介质对于本领域技术人员或普通技术人员来说在提交本申请时可能是已知的并且被包括在本文中。
如本文所用，术语“捕获步骤”通常是指用于将靶分子与刺激响应性聚合物或色谱树脂结合的方法，其产生含有靶分子和聚合物或树脂的沉淀物的固相。通常，随后使用洗脱步骤回收靶分子，该洗脱步骤从固相去除靶分子，从而导致靶分子与一种或多种杂质分开。在多种实施方案中，可以使用色谱介质，例如树脂、膜或整料，或聚合物，例如刺激响应性聚合物、聚电解质或结合靶分子的聚合物进行捕获步骤。
如本文所用，术语“结合”描述靶分子(例如，含有Fc区的蛋白质)和附着于基质的配体(例如，结合于固相基质或树脂的蛋白质A)之间的相互作用，一般指靶分子通过例如结合位点处的蛋白质和配体结构的空间互补性与结合位点处的静电力、氢键、疏水力和/或范德华力偶合的组合效应与配体的可逆结合。一般来说，结合位点的空间互补性越大并且其他力越强，那么蛋白质对其各自配体的结合特异性就越大。特异性结合的非限制性实例包括抗体-抗原结合、酶-底物结合、酶-辅因子结合、金属离子螯合、DNA结合蛋白-DNA结合、调节蛋白-蛋白相互作用等。理想地，在亲和色谱中，在游离溶液中以约10-4至10-8M的亲和力发生特异性结合。
术语“洗涤剂”是指离子型和非离子型表面活性剂，例如聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQU ATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)，有用的去污剂是聚山梨酯，例如聚山梨酯20(TWEEN)或聚山梨酯80(TWEEN/>)或多种酸，例如辛酸。
“缓冲液”是通过其酸碱结合物组分的作用抵抗pH变化的溶液。可以根据例如缓冲液的期望pH而采用的多种缓冲液描述于：Buffers.A Guide for the Preparation andUse of Buffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,编辑Calbiochem Corporation(1975)。缓冲剂的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵缓冲剂，以及这些的组合。
根据本发明，术语“缓冲液”或“溶剂”用于表示用于装载、洗涤、洗脱和重新平衡分隔单元的任何液体组合物。
当“装载”分离柱时，缓冲液用于将包含靶分子(例如，含有Fc区的靶蛋白)和一种或多种杂质的样品或组合物装载到色谱柱(例如，亲和柱或离子交换柱)上。缓冲液具有这样的电导率和/或pH，使得靶分子与色谱基质结合，同时理想情况下所有杂质均不结合并流穿柱。
当“装载”分离柱以“流穿”靶分子时，使用缓冲液将包含靶分子(例如，含有Fc区的靶蛋白)和一种或多种杂质的样品或组合物装载到色谱柱(例如，亲和柱或离子交换柱)上。缓冲液具有这样的电导率和/或pH，使得靶分子不与色谱基质结合并流穿柱，同时理想情况下所有杂质都与柱结合。
术语“重新平衡”是指在装载靶分子之前使用缓冲液来重新平衡色谱基质。通常，装载缓冲液用于重新平衡。
“洗涤(wash)”或“洗涤(washing)”色谱基质是指使适当的液体，例如缓冲液穿过基质或在基质上通过。通常，洗涤用于在洗脱靶分子之前从基质中去除弱结合的污染物和/或在装载之后去除未结合或弱结合的靶分子。
如本文所用，术语“亲和色谱基质”是指携带适合于亲和色谱的配体的色谱基质。通常，配体(例如，蛋白A或其功能变体或片段)共价连接至色谱基质材料，并且当溶液接触色谱基质时可接近溶液中的靶分子。亲和色谱基质的一个实例是蛋白A基质。亲和色谱基质通常基于锁/钥机制(例如抗原/抗体或酶/受体结合)以高特异性结合靶分子。亲和基质的实例是携带蛋白A配体的基质，例如蛋白A SEPHAROSETM、-A、/>A和P(均可从MilliporeSigma,St.Louis,MO获得)。在本文描述的方法和系统中，亲和色谱步骤可以用作整个纯化过程中的结合和洗脱色谱步骤。
如本文所用，术语“离子交换”和“离子交换色谱”是指这样的色谱过程，其中混合物中的目标溶质或分析物(例如，正在纯化的靶分子)与连接(例如通过共价连接)至固相离子交换材料的带电化合物相互作用，使得目标溶质或分析物与带电化合物的非特异性相互作用多于或少于混合物中的溶质杂质或污染物。混合物中的污染溶质比目标溶质更快或更慢地从离子交换材料柱洗脱，或者相对于目标溶质结合到树脂或从树脂排除。
“离子交换色谱”具体包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式离子交换色谱。例如，阳离子交换色谱可以结合靶分子(例如，含有Fc区的靶蛋白)，然后洗脱(例如，使用阳离子交换结合和洗脱色谱或“CIEX”或“CEX”)或者可以主要结合杂质，同时靶分子“流穿”柱(阳离子交换流穿色谱FT-CEX)。阴离子交换色谱可以结合靶分子(例如，含有Fc区的靶蛋白)，然后洗脱，或者可以主要结合杂质，同时靶分子“流穿”柱，也称为负色谱。在一些实施方案中并且如本文中阐述的实施例中所展示的，阴离子交换色谱步骤以流穿模式进行。
术语“离子交换基质”是指带负电(即，阳离子交换介质)或带正电(即，阴离子交换介质)的基质。电荷可以通过将一种或多种带电配体连接至基质来提供，例如通过共价连接。备选地或额外地，电荷可以是基质的固有特性(例如，如二氧化硅的情况，其具有总负电荷)。
混合模式阴离子交换材料通常具有阴离子交换基团和疏水部分。合适的混合模式阴离子交换材料是Adhere(GE Healthcare，Woburn，MA)。
本文使用的术语“阴离子交换基质”是指带正电荷的基质，例如具有与其连接的一个或多个带正电荷的配体，例如季氨基。市售阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAESEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM(GE Healthcare)。可用于本文所述的过程和系统中的其他示例性材料是EMD TMAE、/>EMD TMAE HIGHCAP、Q和/>EMD DEAE(MilliporeSigma,Burlington,MA)。
术语“阳离子交换基质”是指带负电荷的基质，并且其具有游离阳离子以与水溶液中与基质固相接触的阳离子进行交换。连接至固相以形成阳离子交换基质或树脂的带负电荷的配体可以是例如羧酸盐或磺酸盐。市售阳离子交换基质包括羧甲基纤维素、固定在琼脂糖上的磺丙基(SP)(例如，来自GE Healthcare的SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCETM)和固定在琼脂糖上的磺酰基(例如，来自GE Healthcare的S-SEPHAROSE FAST FLOWTM)。优选EMD SO3、/>EMD SEHIGHCAP、/>S、/>CP-FT、/>CPX和EMD COO(MilliporeSigma)。
当本文应用于柱再生时，术语“再生”应指对柱进行处理以去除与色谱树脂紧密结合的污染物。本领域技术人员知道如何再生色谱柱。有多种方法可用于清洁色谱介质。考虑了材料的化学稳定性和污染类型。经常使用有机溶剂、碱和酸。聚合物基质的特征在于比基于硅胶的无机吸附剂具有更高的化学稳定性，所述硅胶在存在NaOH或其他碱的情况下可能不稳定。与基于碳水化合物的介质相比，它们还可以承受酸处理。
可以用有机溶剂如乙醇、异丙醇或乙二醇去除脂质或类似物质(例如，脂蛋白)。可以用氢氧化钠(0.1N最高至1.0N NaOH)有效去除变性蛋白质。
如果污染物结合紧密，则可能需要用酸性胃蛋白酶溶液(例如，0.1％胃蛋白酶溶于0.01N HCL)、6M盐酸胍或稀释的月桂酰肌氨酸钠(sodium lauroyl sarcosinsate)(SLS)溶液(2％ SLS溶于0.25M NaCl)来再生柱材料。然后可以用溶于0.01N HCL的20％2-丙醇去除SLS。
术语“平衡缓冲液”是指用于中和条件或以其他方式偏置靶分子以与色谱柱或生物反应器内的配体有效相互作用的溶液或试剂。例如，本文描述的缓冲溶液能够在化学变化发生时保持生物系统的pH几乎恒定。在根据本公开的实施方案的一些实例中，尽管生物系统具有例如7.0至10.0之间的pH，但通过平衡缓冲液将pH维持为几乎恒定。
术语“洗脱缓冲液”是指用于除去或洗脱与色谱介质结合的产物的缓冲液或试剂。例如，洗脱缓冲液可能能够在第一次洗脱期间洗脱空的AAV(腺相关病毒)颗粒并在第二次洗脱期间洗脱完整的AAV颗粒，从而允许浓缩完整的AAV颗粒。
术语“流出物”是指可移动的组分，即在色谱过程期间留下的组分，又名洗脱液，例如使用恒定成分的洗脱缓冲液而不增加或减少缓冲液成分。
术语“等温洗脱条件”是指色谱过程中洗脱缓冲液的恒定成分的条件。
术语“梯度洗脱条件”是指色谱过程中洗脱缓冲液的变化成分的条件，例如，在特定时间和/或在多个柱体积期间形成从0-100％缓冲液的洗脱缓冲液梯度。
色谱可以以三种模式中的任何一种进行操作：(1)分批模式，其中用靶蛋白装载介质，停止装载，洗涤并洗脱介质，并收集池；(2)半连续模式，其中连续进行装载，而洗脱是间歇的(例如，在连续多柱色谱的情况下)；(3)完整的“连续模式”，其中装载和洗脱都是连续进行的。美国专利申请US 2013/0280788(以其整体并入本文)描述了称为连续色谱方法和设备的实施方案，其依次且顺序地采用若干色谱柱。连续色谱可以是“连续过程”纯化程序或操作的一部分。
本文中可互换使用的术语“连续过程”或“邻接过程”是指用于纯化靶分子的过程，其包括两个或更多个过程步骤(或单元操作)，使得来自一个过程步骤的输出直接流动进入过程中的下一个过程步骤，而不会中断，并且其中两个或更多个过程步骤可以在其持续时间的至少一部分内同时执行。换言之，在连续过程的情况下，如本文所述，不必在下一个过程步骤开始之前完成过程步骤，但样品的一部分总是移动通过过程步骤。术语“连续过程”也适用于过程步骤内的步骤，在这种情况下，在执行包括多个步骤的过程步骤期间，样品连续流过执行该过程步骤所必需的多个步骤。本文所述的此类过程步骤的一个实例是流穿纯化步骤，其包括以连续方式进行的多个步骤，例如流穿活性炭，随后流穿AEX介质，随后流穿CEX介质，随后流穿病毒过滤。
如本文所用，术语“半连续过程”是指用于纯化靶分子的大体连续过程，其中在任何单个过程步骤中流体材料的输入或输出是不连续或间歇的。例如，在根据本发明的一些实施方案中，可以连续装载过程步骤(例如，结合和洗脱色谱步骤)中的输入；然而，可以间歇地收集(例如，在缓冲罐或池罐中)输出，其中纯化过程中的其他过程步骤是连续的。因此，在一些实施方案中，本文描述的方法和系统本质上是“半连续的”，因为它们包括以间歇方式操作的至少一个单元操作，而该方法或系统中的其他单元操作可以以连续方式运行。
术语“连接的过程”是指用于纯化靶分子的过程，其中该过程包括彼此直接流体连通的两个或更多个过程步骤(或单元操作)，使得流体材料连续流穿该过程中的过程步骤并且在过程的正常操作期间同时接触两个或更多个过程步骤。应当理解，有时，过程中的至少一个过程步骤可以通过屏障例如处于关闭位置的阀与其他过程步骤临时隔离。各个过程步骤的这种临时隔离可能是必要的，例如，在过程的启动或关闭期间或者在各个单元操作的移除/更换期间。术语“连接的过程”也适用于过程步骤内的步骤，例如，当过程步骤需要执行若干步骤以便实现过程步骤的预期结果时。一个这样的实例是如本文所述的流穿纯化过程步骤，其可以包括以流穿模式进行的若干步骤，例如活性炭、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和病毒过滤。
如本文所用，术语“流体连通”是指流体材料在两个过程步骤之间的流动或流体材料在过程步骤的步骤之间的流动，其中过程步骤通过任何合适的设备(例如，连接管线或缓冲罐)连接，从而使流体能够从一个过程步骤流动到另一过程步骤。在一些实施方案中，两个单元操作之间的连接管线可被一个或多个阀中断以控制流体通过连接管线的流动。
如本文所用，术语“纯化(purifying)”、“纯化(purification)”、“分开(separate)”、“分开(separating)”、“分离(isolate)”、“分离(isolating)”或“分离(isolation)”是指增加来自包含靶分子和一种或多种杂质的样品的靶分子的纯度程度。通常，通过从样品中去除(完全或部分)至少一种杂质来增加靶分子的纯度。在一些实施方案中，通过使用例如本文所述的色谱过程从样品中去除(完全或部分)一种或多种杂质来增加样品中靶分子的纯度。在另一个实施方案中，通过将靶分子从样品中的一种或多种杂质中沉淀出来来增加样品中靶分子的纯度程度。如本文中可互换使用的，术语多肽的“pI”或“等电点”是指多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pI可以根据多肽所连接的碳水化合物的氨基酸残基或唾液酸残基的净电荷来计算，或者可以通过等电聚焦来确定。
本领域已知术语“pH”是指液体中氢离子浓度的量度。它是溶液酸度或碱度的量度。用于计算pH的公式由丹麦生物化学家Peter Lauritz />于1909年提出：
pH＝-log[H+]
其中log是以10为底的对数，[H+]代表氢离子浓度，单位为摩尔/升溶液。术语“pH”来自德语单词“potenz”，意思是“力量”，与氢的元素符号H结合，因此pH是“氢的力量”的缩写。
如本文所用，术语“过程参数”用作纯化过程中使用的条件。这些过程参数可以用例如一个或多个传感器和/或探针来监测。过程参数的实例包括温度、压力、pH、电导率、溶解氧(DO)、溶解二氧化碳(DCO2)、混合速率和流速。在一些情况下，传感器还可以是光学传感器。传感器可以连接至自动控制系统以调整过程参数。
如本文所用，术语“电导率”是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传输流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液将具有更高的电导率。电导率的测量单位是milliSeimens每厘米(mS/cm或mS)，并且可以使用市售的电导率计(例如，由Orion、OPTEX AND KNAUER出售)来测量。溶液的电导率可以通过改变其中离子的浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如，NaCl或KCl)的浓度，以实现期望的电导率。在一些实施方案中，修改多种缓冲液的盐浓度以实现期望的电导率。在一些实施方案中，在将一种或多种添加剂添加至样品负载的过程中，如果随后使用一个或多个洗涤步骤，则此类洗涤步骤采用电导率为约20mS/cm或更小的缓冲液。
如本文所用，术语“盐”是指通过酸和碱相互作用形成的化合物。可用于本文所述方法中采用的多种缓冲液中的多种盐包括但不限于乙酸盐(例如，乙酸钠)、柠檬酸盐(例如，柠檬酸钠)、氯化物(例如，氯化钠)、硫酸盐(例如，硫酸钠)或钾盐。
如本文所用，术语“结合和洗脱模式”和“结合和洗脱过程”是指这样的分离技术，其中样品中含有的至少一种靶分子(例如，包含Fc区的蛋白质)与合适的树脂或介质(例如，亲和色谱介质或阳离子交换色谱介质)结合并且随后被洗脱。
术语“流穿过程”、“流穿模式”和“流穿操作”在本文中可互换使用，是指这样的分离技术，其中期望生物药物制剂中含有的至少一种靶分子(例如，含有Fc区的蛋白质或抗体)与一种或多种杂质一起流穿材料，所述材料通常结合所述一种或多种杂质，其中所述靶分子一般不结合(即，流穿)。
术语“突破(breakthrough)”是指连续泵送通过柱的特定溶质开始洗脱的体积。突破体积可用于确定用于特定溶质的柱的总样品容量。
术语“有效突破”是这样测量的，即用在柱出口处流动的溶液在280nm处的吸光度，通过将其从靶蛋白(例如免疫球蛋白G)的任何突破之前测量的杂质平台期间测量的吸光度中扣减，并将其除以进料在280nm处的吸光度的离线测量值与杂质平台在280nm处的吸光度之间的差值。
本文可互换使用的术语“过程步骤”或“单元操作”是指使用一种或多种方法或设备以在纯化过程中实现某个结果。可用于本文所述的方法和系统中的方法步骤或单元操作的实例包括但不限于澄清、结合和洗脱色谱、病毒灭活、流穿纯化和配制。应当理解，每个过程步骤或单元操作可以采用多于一个的步骤或方法或设备来实现该过程步骤或单元操作的预期结果。例如，在一些实施方案中，如本文所述的澄清步骤和/或流穿纯化步骤可以采用多于一个的步骤或方法或设备来实现该过程步骤或单元操作。在一些实施方案中，用于执行过程步骤或单元操作的一个或多个设备是一次性设备并且可以被移除和/或更换，而无需更换过程中的任何其他设备或者甚至不必停止过程运行。
如本文所用，术语“缓冲罐”是指在过程步骤之间或过程步骤内使用的任何容器或器皿或袋子(例如，当单个过程步骤包括多于一个步骤时)；其中一个步骤的输出流经缓冲罐进入下一步。因此，缓冲罐与池罐不同，因为它不旨在保存或收集步骤的全部输出量；而是实现从一个步骤到下一步的连续输出流。在一些实施方案中，在本文所述的过程或系统中的两个过程步骤之间或一个过程步骤内使用的缓冲罐的体积不超过该过程步骤的输出的总体积的25％。在另一个实施方案中，缓冲罐的体积不超过过程步骤的输出的总体积的10％。在一些其他实施方案中，缓冲罐的体积小于生物反应器中细胞培养物总体积的35％，或小于30％，或小于25％，或小于20％，或小于15％，或小于10％，其构成待从其中纯化靶分子的起始材料。
术语“静态混合器”是指用于混合两种流体材料(通常是液体)的设备。该设备通常由包含在圆柱形(管)外壳中的混合器元件组成。整个系统设计整合了将两股流体输送到静态混合器中的方法。当流体移动穿过混合器时，不动的元件不断地混合材料。完全混合取决于许多变量，包括流体的特性、管的内径、混合器元件的数量及其设计等。
术语“标准化值”或“接受值”是指本领域普通技术人员对于特定过程或程序参数所接受的值或值范围。超出标准值的值表明过程或程序未有效运行，并且可能需要调整、清洁或更换过程参数或过程组件。例如，与本发明相关，如果过程参数超出有效色谱柱运行的标准化的或可接受的值，则对色谱柱进行再生、清洁或更换。标准化值可以选自例如pH、温度、电导率、盐浓度、光吸收、用合适波长的光激发后的荧光、折射率、电化学响应和质谱中的一种或多种。可以在色谱运行期间的任何时间测量值，包括但不限于紧接在将一种过程流体交换成在一个或多个过程参数上不同的另一种过程流体之前、期间和之后测量以生成过程数据(即，过程值)，所述过程数据与认为对用于所处理的色谱运行的参数标准的值(标准值)进行比较。本领域普通技术人员将能够确定任何特定色谱柱和过程参数的标准化值。
理论板的高度当量
理论板高度当量(HETP)是用于评估柱有效性和效率的建模系统。HETP模型帮助用户设计和评估色谱柱以优化所述柱。目标是获得柱流出物峰的最小或有限展宽。HETP模型将色谱柱划分为称为塔板的理论层。样品在固定相和流动相之间的单独平衡发生在“塔板”中。塔板数(N)越高，分离得越好。如果柱填充正确，它将具有“良好”数量的塔板，因此HETP较小。具有相对较多塔板数的柱将比具有较少峰数的类似柱具有更尖锐的柱峰。
HETP＝L/N
因此，HETP描述了Gaussian曲线的宽度。对于填充良好的柱，HETP将在平均粒径的3-6倍范围内。例如，对于75μm珠子，HETP目标为0.0225至0.045cm。
不对称性是影响柱有效性和效率的另一个因素。在理想的柱运行中，柱峰的前半部分应该是柱峰后半部分的镜像。换言之，一半不应比另一半“落后”更多。如下计算不对称性：
AS＝b/a
图1显示了具有一定程度不对称性的代表性柱峰。
因此，不对称性描述了峰形与理想高斯(Gaussian)曲线的偏差。良好的工作范围是0.8-1.8，但该范围可以根据色谱柱长度进一步细化。对于长床，良好的工作范围是0.8-1.5，对于短床，良好的工作范围是0.7-1.8。
脉冲分析
HETP脉冲分析通常通过注入少量惰性示踪剂来实现，该示踪剂将通过吸光度或电导率测量进行监测，并且理论上将展示为无限短持续时间(dt)和无限高值ymax＝1/dt)的脉冲。示踪剂的这种脉冲流穿填充床，除了流穿多孔介质外没有任何其他相互作用，导致在柱后展示具有高斯(Gaussian)形状的峰。对该高斯曲线的分析给出了HETP和不对称性的值，公式如下：
其中BH是床高，tR是保留时间，其可以通过注射示踪剂的时间和展示最大峰高的时间之间的持续时间来确定。W1/2是峰最大高度一半处的峰宽度。参见图1。A10和B10是达到最大值的10％的时间与峰高最大值之间的持续时间。较小的HETP值和接近1的不对称性是柱中色谱介质填充质量良好的标志。
正面分析
另一种方法，HETP正面分析包括突然改变柱中流动的缓冲液，以生成测量值的阶跃。这一阶跃理论上是前面描述的脉冲的积分，使用公式：当t<t0，那么y＝y1并且当t≥t0，那么y＝y2，其中(y2-y1)是阶跃的高度。该阶跃流经柱理论上会产生Gaussian曲线积分的曲线。通过对该曲线的推导，我们可以获得具有Gaussian形状的相似峰值，从而获得HETP和不对称性值。参见图2A和B。图3显示了柱运行的多个阶段生成的电导率的代表性图表。标出了可以进行HETP正面分析的区域。
该方法给出了在连续色谱操作的每个循环结束时色谱树脂的填充质量，而无需停止连续色谱操作。我们在图4中展示了每个柱和一个又一个循环的HETP值，其均在范围内。我们在图5中展示了每个柱和一个又一个循环的不对称值，与图4的HEPT值相反，这些值超出了范围。水平实线表示推荐的HETP和不对称性(可接受值)的示例性范围。可接受的值可能因特定的柱参数而异。本领域普通技术人员将能够利用本说明书提供的教导来确定特定柱运行的可接受的HETP和不对称性参数。通常，对于填充良好的柱，HETP的范围为平均粒径的3-6倍。例如，对于75μm珠子，HETP目标为0.0225至0.045cm。
不对称性的良好工作范围是0.8-1.8，但该范围可以根据柱长度进一步细化。对于长床，良好的工作范围是0.8-1.5，对于短床，良好的工作范围是0.7-1.8。
平滑滤波器
平滑滤波器是统计学、图像处理和数据处理中使用的数学公式或算法，用于平滑数据集，创建近似函数，其尝试捕获数据中的重要模式，同时忽略噪声或其他精细结构/快速现象。在平滑过程中，信号的数据点被修改，因此比相邻点高的各个点(可能是由于噪声)被减少，并且比相邻点低的点被增加，产生更平滑的信号。换言之，这些滤波器的目的是平滑噪声数据而不降低信号强度。
本领域已知有许多特定的平滑滤波器，每种对于多种不同的用途都有其优点和缺点。大多数使用“移动平均”分析。通过移动平均分析，每个数据点都被周围数据点的局部平均值替换。该算法可以实现加权或未加权的平滑函数。加权平均值对所分析的中值给予更大的权重，而未加权平均值，顾名思义，对所有被分析的值给予相同的权重。
对于特定用途，决定使用一种算法而不是另一种算法的选择可能需要通过经验手段来确定，特别是如果用途是新的、非常规的或未经测试的。此外，本领域中存在平滑滤波器的替代方案，包括例如Weiner滤波(en.wikipedia.org/wiki/Wiener_filter)或使用原始未平滑数据。
虽然没有具体限制，但在优选实施方案中，本发明利用Savitzky-Golay滤波器。Savitzky A.,and Golay,M.J.E.1964,Analytical Chemistry,卷36,页1627–1639。Savitzky-Golay滤波器是低通滤波器。低通滤波器本质上通过滤除低频信号以外的所有信号来工作。实际上，这通过消除“抖动”的高频噪声来“平滑”数据。
连续色谱法
在连续色谱法中，几个相同的柱通常以允许柱串联和/或并联操作的排列方式连接，这取决于方法要求。因此，所有柱可以同时运行，或可以在其运行中间歇性重叠。每个柱在过程运行期间通常会被装载、洗脱和再生若干次。与常规色谱法相比，其中单个色谱循环基于若干连续步骤，例如装载、洗涤、洗脱和再生时，在基于多个相同柱的连续色谱法的情况下，所有这些步骤都可以发生在不同的柱上。因此，连续色谱操作可导致色谱树脂的更好利用并减少缓冲液需求，这有利于过程的经济性。
可以在结合和洗脱色谱或分级色谱(sizing chromatography)过程步骤中使用的示例性连续色谱过程可以见于例如欧洲专利申请号EP11008021.5(US 2014/0251911)和EP12002828.7(US2020/0101399)中，两者均通过引用并入。此外，美国专利No.9,149,738(以其整体并入本文)描述了连续色谱方法和装置，其依次且顺序地采用若干色谱柱。连续色谱法可应用于本领域已知的任何类型的色谱法。
实施例
在连续色谱程序中展示的HETP
为了展示这种分析方法的优点，我们通过在0.05mol/L的TRIS缓冲液中制备并调节pH＝6.5，以4g/L的浓度捕获免疫球蛋白G。我们使用内径为200mm的3个QuikScale(Milliporeigma，Bedfor，MA)色谱柱，其填充有来自Merck KGaA的称为A的Protein A亲和色谱树脂，床高为9.8mm，总柱体积为3.079L。已使用NaCl 0.3M缓冲液中的丙酮2％w/w，以150cm/h的线速度的脉冲，利用HETP脉冲分析方法测试了每个柱。丙酮脉冲体积为柱体积的2％。该测试是使用/>Biochromatography(MilliporeSigma)系统进行的，HETP脉冲分析是使用Merck KGgA开发的Common Control/>软件的报告生成器计算的。第1个柱的结果为HETP＝0.0183cm且不对称性＝1.692，第2个柱的结果为HETP＝0.0145cm且不对称性＝1.783，第3个柱的结果为HETP＝0.0337cm且不对称性＝1.333。
用于本次展示的多柱捕获系统允许以294cm/h的速度在串联的2个柱上装载，而第三个柱执行非装载步骤。第一个柱是通过第一个泵直接向其入口供应免疫球蛋白G的装载柱。当装载第一个柱时，一部分免疫球蛋白G与蛋白A树脂A结合。第一个柱的出口直接连接到第二个柱(即预装载柱)。第二个柱接收未与第一个柱结合的材料，该材料是杂质，但也是未与第一个柱的蛋白A树脂结合的免疫球蛋白G。第二个色谱柱的出口被浪费。随着装载的发生，树脂的蛋白A位点将与捕获的免疫球蛋白G结合。结合位点的饱和度将遵循从第一个柱的入口到出口的梯度，入口首先被结合的免疫球蛋白G饱和，同时出口附近的结合位点可能未饱和。然而，随着靠近柱末端的结合位点变得越来越饱和，结合位点变成被装载的并且过量的免疫球蛋白G突破柱。
在仅涉及一个色谱柱的传统批量方法中，通过在产品突破之前停止过程来避免产品损失。这是通过在估计体积的90％处停止柱装载来实现的，以获得10％的突破，这意味着柱出口处的产物浓度是入口处浓度的10％。因此，在传统方法中，从入口到出口的结合蛋白A位点的梯度导致越靠近出口，使用的结合位点越少。连续色谱的目标是使第一个柱过饱和高达60％或70％，并将柱流穿液供给第二个柱以捕获突破第一个柱的免疫球蛋白G。这样可以导致更有效地利用第一个柱的Protein A树脂。
第二个柱被认为处于预装载状态，因为它在进料浓度的0％和60-70％之间的较低入口浓度下捕获免疫球蛋白G。使用280nm处测量的吸光度估计产物和杂质浓度。在装载开始期间，在未结合产物突破之前，不具有能够与Protein A结合的Fc位点的杂质首先流穿并退出柱。这些杂质在280nm处的吸光度称为杂质平台，对应于0％突破。相比之下，在装载第一个柱之前，在280nm处测量免疫球蛋白G进料的离线吸光度可给出100％突破的值。可以利用柱出口处流动的溶液在280nm处的吸光度，通过将其从免疫球蛋白G任何突破之前测量的杂质平台期间测得的吸光度中扣减，并将其除以进料在280nm处的吸光度的离线测量值和杂质平台在280nm处的吸光度之间的差值来测量有效突破。
当达到突破水平(例如60％或70％)时，使用一组三通阀将第一个色谱柱与进料泵断开，并将其连接到缓冲泵以进行非装载步骤。第一个柱的出口与第二个柱断开并连接到一组出口，例如废物或馏分收集器。第二个柱的入口连接至进料泵。第二个柱成为装载柱。第二个柱的出口连接到第三个柱的入口，第三个柱成为连接废物的预装载柱。第1个柱的非装载步骤必须比第2个柱的突破更快。在第2个柱上突破后，将其连接到缓冲泵以进行非装载步骤。第3个柱成为装载柱，其入口连接到进料泵，第3个柱的出口连接到成为预装载柱的第1个柱的入口。第3个柱突破后，一个完整的循环完成，系统通过将第1个柱的入口连接到进料泵来开始新的循环，并成为新的循环装载柱，第1个柱的出口连接到第2个柱的入口，第2个柱再次成为预装载柱，第3个柱连接到缓冲泵以进行非装载步骤。本发明的额外优点是永远不会停止进料泵并且使所有非装载阶段比装载阶段更快。
对于我们的展示，非装载阶段以430cm/h执行。其首先由8个柱体积的TRIS0.05mol/L在pH＝6.5下洗涤柱组成。然后使用乙酸0.1mol/L在pH＝3下进行洗脱，并使用0.05AU(吸光度单位。参见en.wikipedia.org/wiki/Absorbance#Absorbance_of_a_material)作为收集的峰开始和结束进行峰收集，然后使用3个柱体积的NaOH 0.1mol/L进行消毒步骤，并使用5个柱体积的TRIS 0.05mol/L在pH＝6.5下进行平衡。
由于在每个柱的非装载阶段的每个循环中都运行该步骤顺序，因此可以在一个又一个循环后监测柱的状况。在我们的展示中，我们分析了平衡期间中电导率的曲线，因为它在pH＝6.5下从NaCl 0.1mol/L的20mS/cm下降到TRIS缓冲液0.05mol/L的9mS/Cm。我们进行了与柱的停留时间分布的测定的比较(例如，参见en.wikipedia.org/wiki/Residence_time#Pulse_experiments和en.wikipedia.org/wiki/Residence_time#Biochemical)。考虑从NaCl 0.1mol/L切换到TRIS缓冲液0.05mol/L导致的电导率下降作为电导率阶跃实验，这是脉冲函数的积分函数(例如，参见en.wikipedia.org/wiki/Laplace_transform#Table_of_selected_Laplace_transforms)，因此HETP脉冲分析和HETP正面分析之间存在类比。通过对柱出口处电导率曲线的求导，我们可以获得与脉冲分析中获得的曲线相似的曲线。参见图6。由于至少噪声干扰电导率曲线推导，因此有必要对该曲线和求导进行平滑处理。
为了平滑电导率曲线，我们使用Savitzky-Golay平滑滤波器，其公式为：在该公式中，sf为2和12之间的平滑因子；在图bb中，我们显示了sf为2、3、6和9。ct是时间t时的电导率，ct+i是时间t时的电导率加上2点之间的时间间隔数i，其在我们的展示中是2秒并且yt是时间t时的平滑电导率。ai是平滑系数，其中ai＝a-i以及下表中描述的与平滑因子一致的值。我们观察到，平滑电导率的每个点都是每个点权重不相等的移动平均值的结果。该移动平均值使用的点数等于2sf+1，因为它使用了计算时的点ct、该点之前的sf点和该点之后的sf点。
表1.
图7显示了第10个循环的非装载阶段平衡期间第3个柱的结果。我们观察到112秒时轻微的电导率下降已被平滑。
为了获得电导率的导数，我们再次使用Savitzky-Golay平滑滤波器，但对于一阶导数，公式如下：在该公式中，sf是2到12之间的平滑因子，在我们的展示中，我们保留相同的sf数字：2、3、6和9。ct是时间t时的电导率，ct+i是时间t时加上2点之间的时间间隔数i的电导率，i在我们的展示中是2秒并且yt是时间t时的平滑电导率。这次的平滑系数为ai＝i，因此ai＝-a-i并且a0＝0。下表描述了与平滑因子一致的h’sf值。我们观察到，平滑的电导率导数曲线的每个点又是每个点权重不相等的移动平均值的结果。用于该移动平均值的点数再次等于2sf+1，因为它在计算时使用点ct、该点之前的sf点和该点之后的sf点。
表2.
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图8所示为第10个循环的非装载阶段平衡期间第3个柱的结果。我们观察到，我们获得了有点不对称的类Gaussian曲线，与HETP脉冲结果函数非常相似。然而，我们观察到，曲线越平滑，它就变得越宽，HETP也变得越高。由于平滑因子2给出的曲线没有噪声，因此我们使用了对电导率曲线的这种轻微平滑处理。
在连续运行期间，我们收集了洗脱峰，并通过NANODROPTM系统(Thermofisher，Waltham，MA)在280nm处测量来评估免疫球蛋白G其体积和数量。如果我们绘制HETP的结果和收集的洗脱液的数量(参见图9、11和12)，我们观察到测量的HETP越低，收集到的免疫球蛋白G就越多。这显示了连续监测柱捕获质量的真正好处。不对称性(参见图10、12和14)和洗脱液体积的图给出的信息较少，但两个值也往往会随着HETP的增加而增加，而洗脱液量减少意味着性能损失。

Claims (11)

1.监测以连续过程模式操作的一个或多个色谱柱的效率和质量的方法，所述方法包括：
a)提供连续模式中使用的一个或多个色谱柱；
b)紧接在将一种过程流体交换成在一个或多个过程参数上不同的另一种过程流体以生成过程数据之前、期间和直接在之后检测一个或多个过程参数的变化，所述过程参数选自由pH、电导率、盐浓度、光吸收、用适当波长的光激发后的荧光、折射率、电化学响应和质谱组成的组；
c)对所述过程数据应用曲线平滑滤波器以生成校正的过程数据；
d)计算所述校正的过程数据的一阶导数以产生所述校正的过程数据的求导的过程数据；
e)确定所述求导的数据的HETP值和不对称性；
f)将HETP值和不对称性与标准化值进行比较；
g)其中，如果HETP值和不对称性落在所述标准化值内，则将该柱用于另一过程运行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述曲线平滑计算是Savitzky-Golay平滑滤波器。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一个或多个柱已连续用于2至200次运行。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述一个或多个柱已连续用于5至50次运行。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述连续过程模式依次包括至少两个但不超过五个不同的柱。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述柱选自由亲和柱、离子交换柱、尺寸排阻柱、反相柱、手性柱、正面柱和疏水柱组成的组。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中监测每个柱的效率和质量。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述连续过程模式包括多个过程步骤，依次包括至少两个但不超过十个过程步骤，并且至少一个过程步骤包括色谱柱。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述标准化值基于使用相同或基本相同的柱和过程参数的历史数据。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中如果所述HETP值和不对称性不落入所述标准化值内，则再生所述柱。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中如果所述HETP值和不对称性不落入所述标准化值内，则由自动系统通知操作员。
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