MX2012013682A - Metodo para producir una preparacion de inmunoglobulina con un rendimiento mejorado. - Google Patents

Metodo para producir una preparacion de inmunoglobulina con un rendimiento mejorado.

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Abstract

Métodos mejorados para manufacturar productos de IVIG. Estos métodos presentan diversas ventajas, tales como la pérdida reducida de IgG durante la purificación y la mejora de la calidad de los productos finales. Composiciones acuosas y farmacéuticas apropiadas para una administración intravenosa, subcutánea y/o intramuscular. Métodos para tratar una enfermedad o una afección, que comprenden administrar una composición de IgG como las que se proveen en la presente.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR UNA PREPARACIÓN DE INMUNOGLOBULINA CON UN RENDIMIENTO MEJORADO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los productos de globulinas inmunes derivados de plasma humano fueron usados por primera vez en 1952 para tratar deficiencias inmunes. Inicialmente, la administración intramuscular o subcutánea de inmunoglobulina del isotipo G (IgG) era el método preferido. Sin embargo, para inyectar mayores cantidades de IgG, necesarias para un tratamiento efectivo de diversas enfermedades, se desarrollaron productos de administración intravenosa con IgG en menores concentraciones (50 mg/ml) . Usualmente, la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) contiene inmunoglobulinas G (IgG) combinadas del plasma de más de mil donantes de sangre. Típicamente contienen más de 95% de IgG no modificada, que tiene funciones efectoras dependientes de Fe intactas, y solamente cantidades traza de inmunoglobulina A (IgA) o de inmunoglobulina M (IgM) . Las IVIG son productos de IgG purificados y estériles que se usan primariamente para tratar tres categorías principales de afecciones médicas: (1) las deficiencias inmunes, tales como la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, la hipogammaglobulinemia (deficiencias inmunes primarias), y las afecciones caracterizadas por una inmunidad comprometida adquirida (deficiencias inmunes secundarias), donde se observan niveles bajos de anticuerpos; (2) las enfermedades inflamatorias y autoinmunes; y (3) las infecciones agudas.
Específicamente, muchas personas con trastornos de inmunodeficiencia primaria carecen de los anticuerpos necesarios para resistir la infección. En determinados casos, estas deficiencias pueden complementarse mediante la infusión de IgG purificada, comúnmente a través de una administración intravenosa (es decir, una terapia con IVIG) . Varios trastornos de inmunodeficiencia primaria se tratan comúnmente de esta manea, incluyendo la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA) , la inmunodeficiencia variable común (CVID) , el síndrome de híper-IgM (HIM) , la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) y algunas deficiencias de la subclase de la IgG (Blaese y Winkelstein, J. Patient & Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson, MD: Inmune Deficiency Foundation; 2007).
Si bien el tratamiento con IVIG puede ser muy efectivo para gestionar los trastornos de inmunodeficiencia primaria, esta terapia solamente es un reemplazo temporal para los anticuerpos que no se producen en el cuerpo, en vez de una cura para la enfermedad. Por consiguiente, para los pacientes que dependen de la terapia con IVIG se necesitan dosis repetidas, típicamente de aproximadamente una vez por mes de vida. Esta necesidad se refleja en una gran demanda de una producción continua de composiciones de IVIG. Sin embargo, a diferencia de otros productos biológicos que se producen mediante la expresión in vitro de vectores de ADN recombinante, la IVIG se fracciona a partir de donaciones de sangre y plasma humanos. Por lo tanto, no es posible incrementar la cantidad de productos IVIG mediante el incremento simple del volumen de producción. Por el contrario, el nivel de IVIG disponible comercialmente se ve limitado por el suministro disponible de donaciones de sangre y plasma.
Diversos factores rigen la demanda de IVIG, incluyendo la aceptación de los tratamientos con IVIG, la identificación -de indicaciones adicionales para las cuales sea efectiva la terapia con IVIG y el diagnóstico y la prescripción creciente de IVIG para los pacientes. Notablemente, la demanda global de IVIG ha aumentado hasta más del cuádruple desde 1990, y continúa aumentando en la actualidad a una velocidad anual de aproximadamente entre 7% y 10% (Robert P., Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2009) 359-367). Por ejemplo, la Autoridad Nacional de la Sangre de Australia informó que la demanda de IVIG en Australia había aumentado 10,6% durante el año fiscal 2008-2009 (National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009) .
Debido en parte a la demanda global creciente y a las fluctuaciones en el suministro disponible de productos de inmunoglobulina, en varios países, incluyendo Australia e Inglaterra, se han implementado programas de gestión de la demanda para proteger los suministros de estos productos para los pacientes con mayor demanda durante los períodos de escasez de los productos.
Se ha informado que en 2007 se fraccionaron 26,5 millones de litros de plasma, para generar 75,2 toneladas métricas de IVIG, con un rendimiento de producción promedio de 2,8 gramos por litro (Robert P., supra) . En este mismo informe se estimó que se espera que los rendimientos globales de IVIG aumenten hasta aproximadamente 3,43 gramos por litro hacia 2012. Sin embargo, debido al crecimiento continuo de la demanda global de IVIG, proyectado entre aproximadamente 7% y 13% por año hasta 2015, será necesaria una mejora adicional del rendimiento general de IVIG para satisfacer la demanda global .
Los proveedores comerciales de productos de IVIG usan varios métodos para preparar la IVIG. Un problema común con los métodos para producir IVIG usados actualmente es la pérdida sustancial de IgG durante el proceso de purificación, estimada en más de 35% del contenido total de IgG del material de partida. Un desafio consiste en mantener la cualidad de la inactivación viral y la falta de impurezas que pudieran provocar reacciones adversas, y simultáneamente incrementar el rendimiento de IgG. Si se tienen en cuenta los niveles de producción actuales de IVIG, lo que podría considerarse un incremento pequeño en el rendimiento sería de hecho altamente significativo. Por ejemplo, de acuerdo con los niveles de producción de 2007, un incremento en la eficiencia de 2%, igual a 56 miligramos adicionales por litro, daría como resultado 1,5 toneladas métricas adicionales de IVIG.
En la cuarta parte de una serie de trabajos seminales publicados sobre la preparación y las propiedades de las proteínas del suero y el plasma, Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc, 1946, 68(3): 459-475) describieron primero métodos para realizar el fraccionamiento con alcohol de las proteínas del plasma (método 6) , que permiten aislar una fracción enriquecida en IgG a partir de plasma humano. Varios años después, Oncley et al. (J. Am. Chem. Soc, 1949, 71(2) : 541-550) expandieron los métodos de Cohn al publicar un método (método 9) que resultaba en el aislamiento de una preparación de IgG más pura.
[0001] Estos métodos, que constituyen la base de toda la industria de los factores sanguíneos derivados del plasma, no permiten proveer preparaciones de IgG que tengan concentraciones suficientemente elevadas para el tratamiento de diversas enfermedades relacionadas con el sistema inmune, incluyendo el síndrome de Kawasaki, la púrpura trombocitopénica idiopática y las deficiencias inmunes primarias. Por lo tanto, se desarrollaron metodologías adicionales donde se emplean diversas técnicas, tales como la cromatografía de intercambio iónico, para proveer formulaciones de IgG de mayor pureza y con concentraciones más elevadas. Hoppe et al. {Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752), Falksveden (Patente Sueca N° 348942) y Falksveden y Lundblad {Methods of Plasma Protein Fractionation 1980) estuvieron entre los primeros que emplearon la cromatografía de intercambio iónico para este propósito.
En diversos métodos modernos se emplea un paso de precipitación, tal como la precipitación con caprilato (Lebing et al., Vox Sang 2003 ( 84 ): 193-201 ) y la precipitación de las fracciones de Cohn (I+)II+III con etanol (Tanaka et al., Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30), en combinación con una cromatografía en columna. Más recientemente, Teschner et al. {Vox Sang, 2007 (92):42-55) describieron un método para preparar un producto con 10% de IVIG donde primero se eliminan los crioprecipitados del plasma combinado y luego se lleva a cabo un fraccionamiento de Cohn-Oncley modificado con etanol en frió, seguido por el tratamiento del intermediario con S/D, una cromatografía de intercambio iónico, una nanofiltración, y opcionalmente una ultrafiltración/diafiltración .
Sin embargo, a pesar de la pureza, la seguridad y el rendimiento mejorados que proveen estos métodos para manufacturar IgG, aún se pierde una cantidad significativa de IgG durante el proceso de purificación. Por ejemplo, Teschner et al. informaron que su método resulta en un rendimiento incrementado de IgG, de 65% (Teschner et al., supra) . Esto representa una pérdida de aproximadamente un tercio de la IgG presente en la fracción del plasma combinado durante el proceso de manufactura. Dado el rendimiento global promedio de IVIG por litro de plasma procesado, es probable que los procesos de manufactura usados por otros proveedores comerciales de IVIG den como resultado pérdidas de IgG significativamente mayores.
Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados y más eficientes para manufacturar productos de IVIG. La presente invención satisface estas y otras necesidades al proveer métodos para manufacturar IVIG que producen rendimientos que son al menos entre 6 y 10% mayores que los que pueden obtenerse en la actualidad, así como composiciones de IVIG obtenidas con ellos.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0002] En un aspecto, en la presente invención se proveen métodos para preparar composiciones enriquecidas en IgG (por ejemplo, composiciones de IVIG) a partir de plasma. Ventajosamente, los métodos que se proveen en la presente proveen mejoras significativas con relación a los métodos actuales conocidos en la técnica para manufacturar composiciones de IVIG. Por ejemplo, los métodos que se proveen en la presente permiten obtener rendimientos incrementados de IgG en una composición final en bruto, sin que se pierda la pureza necesaria para la administración intravenosa .
En un aspecto, se provee un método para preparar una composición enriquecida en IgG a partir de plasma, que comprende los siguientes pasos: (a) precipitar una fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados en un primer paso de precipitación, con entre aproximadamente 6% y aproximadamente 10% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5, para obtener un primer precipitado y un primer sobrenadante; (b) precipitar la IgG del primer sobrenadante en un segundo paso de precipitación, con entre aproximadamente 20% y aproximadamente 25% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un segundo precipitado; (c) suspender nuevamente el segundo precipitado para formar una suspensión; (d) precipitar la IgG de la suspensión formada en el paso (c) en un tercer paso de precipitación, con entre aproximadamente 22% y aproximadamente 28% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un tercer precipitado; (e) suspender nuevamente el tercer precipitado para formar una suspensión; y (f) separar . la fracción soluble de la suspensión formada en el paso (e) , con lo que se forma una composición enriquecida en IgG, donde al menos uno de los pasos de precipitación, el primero, el segundo o el tercero, comprende la adición del alcohol por atomización. En una forma de realización, el alcohol se agrega en el primer paso de precipitación por atomización. En otra forma de realización, el alcohol se agrega en el segundo paso de precipitación por atomización. En aun otra forma de realización, el alcohol se agrega en el tercer paso de precipitación por atomización.
En determinadas formas de realización, el pH de una o más de las soluciones puede ajustarse agregando un agente modificador del pH por atomización. En formas de realización relacionadas, el pH de al menos uno de los pasos de precipitación, el primero, el segundo o el tercero, se alcanza agregando una solución modificadora del pH después de la adición del alcohol, antes y después de la adición del alcohol, durante la adición del alcohol y después de ella, o antes de la adición del alcohol, durante dicha adición y después de ella. En aun otra forma de realización relacionada, el pH de un paso de precipitación puede mantenerse durante la reacción de precipitación completa, mediante el ajuste continuo del pH.
En una forma de realización especifica, el pH del primer paso de precipitación se ajusta después de la adición del alcohol, mediante la adición de un agente modificador del pH por atomización. En otra forma de realización, el pH del segundo paso de precipitación se ajusta después de la adición del alcohol, mediante la adición de un agente modificador del pH por atomización. En aun otra forma de realización, el pH del tercer paso de precipitación se ajusta después de la adición del alcohol, mediante la adición de un agente modificador del pH por atomización.
Adicionalmente, los métodos de preparación que se proveen en la presente también pueden comprender un paso de cromatografía de intercambio iónico (es decir, una cromatografía de intercambio aniónico y/o de intercambio catiónico) , un paso de nanofiltración, un paso de ultrafiltrac ón/diafiltración o cualquier otra técnica de purificación apropiada, con el fin de mejorar en mayor medida la pureza o la calidad de las preparaciones de IVIG.
En otro aspecto, se provee un método para preparar una composición enriquecida en IgG a partir de plasma, que comprende- los siguientes pasos: ajustar el pH de una fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados en exactamente o aproximadamente 7,0; (b) ajustar la concentración de etanol de la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados del paso (a) en exactamente o aproximadamente 25% (v/v) , a una temperatura de exactamente o aproximadamente entre -7°C y -9°C, con lo que se forma una mezcla; (c) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (b) ; (d) suspender nuevamente el precipitado del paso (c) con un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con exactamente o aproximadamente 600 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo que se forma una suspensión; (e) mezclar dióxido de silicio (Si02) finamente dividido con la suspensión del paso (d) durante al menos aproximadamente 30 minutos; (f) filtrar la suspensión con un filtro prensa, con lo que se forma un filtrado; (g) lavar el filtro prensa con al menos 3 volúmenes muertos del filtro prensa de un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con exactamente o aproximadamente 150 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo que se forma una solución de lavado; (h) combinar el filtrado del paso (f ) con la solución de lavado del paso (g) , con lo que se forma una solución, y tratar la solución con un detergente; (i) ajustar el pH de la solución del paso (h) en exactamente o aproximadamente 7,0 y agregar etanol hasta una concentración final de exactamente o aproximadamente 25%, con lo que se forma un precipitado; (j) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (i) ; (k) disolver el precipitado en una solución acuosa que comprende un solvente o un detergente y mantener la solución durante al menos 60 minutos; (1) después del paso (k) , hacer pasar la solución a través de una columna de cromatografía de intercambio catiónico y eluir las proteínas absorbidas en la columna para obtener una fracción eluida; (m) hacer pasar la fracción eluida del paso (1) a través de una columna de cromatografía de intercambio aniónico para generar un efluente; (n) hacer pasar el efluente del paso (m) a través de un nanofiltro para generar un nanofiltrado ; (o) hacer pasar el nanofiltrado del paso (n) a través de una membrana de ultrafiltración para generar un ultrafiltrado; y (p) diafiltrar el ultrafiltrado del paso (o) contra un amortiguador de diafiltración para generar un diafiltrado con una concentración de proteínas de entre aproximadamente 8% (p/v) y aproximadamente 12% (p/v) , de manera de obtener una composición de IgG concentrada.
En otro aspecto, en la presente invención se proveen composiciones acuosas de IgG preparadas con los métodos que se describen en la presente. En general, las composiciones de IgG tienen una pureza elevada (por ejemplo, tienen contenidos de IgG de al menos 95%, 98%, 99% o más), contienen concentraciones de proteínas de entre aproximadamente 20 g/1 y aproximadamente 200 g/1 y contienen niveles extremadamente bajos de los contaminantes comunes de la IVIG, tales como la IgA, la igM, el fibrinógeno, la transíerrina, el ACA, la actividad amidolítica, la actividad del PKA, y semejantes.
En aun otro aspecto, se proveen composiciones y formulaciones farmacéuticas de IgG apropiadas para usarlas en terapias con IVIG. Las formulaciones farmacéuticas tienen una pureza elevada (por ejemplo, tienen contenidos de IgG de al menos 95%, 98%, 99% o más), contienen concentraciones de proteínas de entre aproximadamente 20 g/1 y aproximadamente 200 g/1 y contienen niveles extremadamente bajos de los contaminantes comunes de la IVIG, tales como la IgA, la IgM, el fibrinógeno, la transíerrina, el ACA, la actividad amidolítica, la actividad del PKA, y semejantes. En general, las composiciones farmacéuticas se formulan apropiadamente para una administración intravenosa (es decir, para una terapia con IVIG) , para una administración subcutánea o para una administración intramuscular.
En otro aspecto, en la presente invención se proveen métodos para tratar una inmunodeficiencia, una enfermedad autoinmune o una infección aguda en un ser humano que lo necesita, donde los métodos comprenden administrar una composición farmacéutica como las que se describen en la presente. Los ejemplos no limitativos de enfermedades y afecciones que pueden tratarse o gestionarse con los métodos que se proveen en la presente incluyen el transplante alogénico de médula ósea, la leucemia linfocitica crónica, la púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), el VIH pediátrico, las inmunodeficiencias primarias, la enfermedad de Kawasaki, la polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) , el transplante de riñon a un receptor con un contenido elevado de anticuerpos o desde un donante con una incompatibilidad ABO, el síndrome de fatiga crónica, la colitis provocada por Clostridium difficile, la dermatomiositis y la polimiositis, la oftalmopatía de Graves, el síndrome de Guillain-Barré, la distrofia muscular, la miositis con cuerpos de inclusión, el síndrome de Lambert-Eaton, el lupus eritematoso, la neuropatía motora multifocal, la esclerosis múltiple ( S) , la miastenia grave, la trombocitopenia aloinmune neonatal, las infecciones de parvovirus B19, el pénfigo, la púrpura post-transfusión, el rechazo de transplantes renales, el aborto espontáneo, el síndrome de la persona rígida, el síndrome de opsoclonus-mioclonus, la sepsis severa y el shock séptico en adultos críticamente enfermos, la necrólisis epidérmica tóxica, la leucemia linfocítica crónica, el mieloma múltiple, la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, la hipogammaglobulinemia, la deficiencia inmune primaria, la RRMS, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Concentración de IgG determinada por EL'ISA (A) y por métodos nefelométricos (·) , y concentración total de las proteínas (¦) presentes en el lavado del filtrado de las fracciones II+III, en función de la cantidad de volúmenes muertos de amortiguador usados para lavar el dispositivo de filtración después de la filtración.
Figura 2: Actividad del PKA promedio en las fracciones disueltas del precipitado G después de la extracción y la clarificación a un pH de entre 3,8 y 5,0, mediante la adición de ácido acético en presencia y ausencia de un tratamiento con Aerosil (dióxido de silicio) .
Figura 3: Contenido promedio de fibrinógeno en las fracciones disueltas del precipitado G después de la extracción y la clarificación a un pH de entre 3,8 y 5,0, mediante la adición de ácido acético en presencia y ausencia de un tratamiento con Aerosil (dióxido de silicio) .
Figura 4: Actividad amidolitica promedio en las fracciones disueltas del precipitado G después de la extracción y la clarificación a un pH de entre 3,8 y 5,0, mediante la adición de ácido acético en presencia y ausencia de un tratamiento con Aerosil (dióxido de silicio) .
Figura 5: Actividad amidolitica en fracciones disueltas del precipitado G, extraídas y clarificadas a un pH de entre 3,8 y 7,8, después de incubarlas durante dos semanas a 4°C (?) o durante una semana adicional a temperatura ambiente (¦) .
Figura 6: Actividad del PKA en fracciones disueltas del precipitado G extraídas y clarificadas a un pH de entre 3,8 y 7,8.
Figura 7: Diferencia en la pureza del filtrado de las fracciones modificadas II+III con un tratamiento con sílice esfumado o sin él. Cromatografía de electroforesis en acetato de celulosa de un filtrado de las fracciones modificadas II+iii (A) clarificado solamente con el coadyuvante de filtrado y (B) clarificado después de un tratamiento con sílice esfumado.
DefiniCIONEs Como se lo usa en la presente, un "anticuerpo" hace referencia a un polipéptido que sustancialmente está codificado por un gen de inmunoglobulina o por varios genes de inmunoglobulina, o por fragmentos de éstos, que reconoce específicamente un analito (antígeno) y se une a él. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como los diversos genes de las regiones variables de las inmunoglobulinas . Las cadenas livianas se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de las inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Un ejemplo de una unidad estructural de inmunoglobulina (un anticuerpo) está compuesto por dos pares de cadenas de polipéptidos, donde cada par tiene una cadena "liviana" (de aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kD) . El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente entre 100 y 110 aminoácidos o más, que es la responsable primaria del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena liviana variable (VL) y cadena pesada variable (VH) hacen referencia a estas cadenas liviana y pesada, respectivamente.
Como se lo usa en la presente, el término "ultrafiltración (UF) " abarca una variedad de métodos de filtración por membrana donde se fuerza un líquido a través de una membrana semipermeable con presión hidrostática . Se retienen los sólidos suspendidos y los solutos de mayor peso molecular, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular pasan a través de la membrana. Este proceso de separación frecuentemente se usa para purificar y concentrar soluciones macromoleculares (de 103-106 Da) , especialmente soluciones de proteínas. Hay diversos tipos de membranas de ultrafiltración disponibles, dependiendo del tamaño de las moléculas que retienen. La ultrafiltración típicamente se caracteriza por membranas con poros con tamaños de entre 1 y 1000 kDa y por presiones de operación de entre 0,01 y 10 bares, y es particularmente útil para separar coloides, por ejemplo, proteínas, de moléculas pequeñas, tales como azúcares y sales.
Como se la usa en la presente, la "diafiltración" se lleva a cabo con las mismas membranas que la ultrafiltración, y se trata de una filtración con flujo tangencial. Durante la diafiltración, el amortiguador se introduce en el tanque de reciclado mientras el filtrado se retira de la unidad de operación. En los procesos donde el producto está en la fracción retenida (por ejemplo, la IgG) , la diafiltración permite separar los componentes del producto combinado por lavado, para llevarlos al filtrado, con lo que se intercambian los amortiguadores y se reduce la concentración de especies indeseables.
Como se lo usa en la presente, el término "aproximadamente" denota un rango aproximado de más o menos 10% respecto de un valor especificado. Por ejemplo, el término "aproximadamente 20%" abarca un rango de 18-22%.
[0003] Como se lo usa en la presente, el término "mezcla" describe la acción de provocar una distribución pareja de dos o más compuestos o sustancias diferentes en una solución o en una suspensión, por medio de cualquier forma de agitación. De la manera que se interpreta el término en esta solicitud, no es necesario que tenga lugar una distribución completamente pareja de todos los ingredientes en una solución o en una suspensión.
Como se lo usa en la presente, el término "solvente" abarca cualquier sustancia liquida capaz de disolver o dispersar una o más sustancias adicionales. Un solvente puede ser de naturaleza inorgánica, tal como el agua, o puede ser un liquido orgánico, tal como el etanol, la acetona, el acetato de metilo, el acetato de etilo, el hexano, el é'ter de petróleo, etcétera.. Como se lo usa en la presente, el término "tratamiento con solvente detergente" hace referencia a un solvente orgánico (por ejemplo, fosfato de tri-N-butilo ) que es parte de la mezcla solvente detergente usada para inactivar los virus recubiertos con lipidos en la solución.
Como se lo usa en la presente, el término "detergente" es sinónimo de los términos "agente tensioactivo" y "agente con actividad en superficie". Los agentes tensioactivos típicamente son compuestos orgánicos anfifílicos, es decir, contienen grupos hidrofóbicos ("colas") y grupos hidrofílicos ("cabezas"), que tornan los agentes tensioactivos solubles en solventes orgánicos y en agua. Un agente tensioactivo puede clasificarse en función de la presencia de grupos formalmente cargados en su cabeza. Un agente tensioactivo no iónico no tiene grupos cargados en su cabeza, mientras que un agente tensioactivo iónico tiene una carga neta en su cabeza. Un agente tensioactivo zwitteriónico contiene una cabeza con grupos con cargas opuestas. Algunos ejemplos de agentes tensioactivos comunes incluyen los agentes tensioactivos aniónicos (basados en aniones sulfato, sulfonato o carboxilato) , por ejemplo, perfluorooctanoato (PFOA o PFO) , perfluorooctanosulfonato (PFOS) , dodecil sulfato de sodio (SDS), lauril sulfato de sodio y otras sales de alquil sulfatos, lauret sulfato de sodio (también conocido como lauril éter sulfato de sodio o SLES) , alquil bencenosulfonato; agentes tensioactivos catiónicos (basados en cationes de amonio cuaternario), por ejemplo, bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB) , también conocido como bromuro de hexadecil trimetil amonio, y otras sales de alquiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio (CPC) , seboamina polietoxilada (POEA), cloruro de benzalconio (BAC) , cloruro de benzetonio (BZT) ; ácidos grasos de cadena larga y sus sales, incluyendo caprilato, ácido caprilico, heptanoato, ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido nonanoico, ácido decanoico y semejantes; agentes tensioactivos zwitteriónicos (anfotéricos) , por ejemplo, dodecil betaina; cocamidopropil betaina; coco anfo glicinato; agentes tensioactivos no iónicos, por ejemplo, alquil poli (óxido de etileno) , alquilfenol poli (óxido de etileno), copolimeros de poli (óxido de etileno) y poli (óxido de polipropileno) (conocidos comercialmente como poloxámeros o poloxaminas ) , alquil poliglucósidos, incluyendo octil glucósido, decil maltósido, alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetilico y alcohol oleilico) , cocoamida MEA, cocoamida DEA, polisorbatos (Tween 20, Tween 80, etcétera) , detergentes Tritón y óxido de dodecil dimetilamina .
Como se lo usa en la presente, el término tratamiento con "IgG intravenosa" o "IVIG" generalmente hace referencia a un método terapéutico que comprende la administración intravenosa, subcutánea o intramuscular de una composición de inmunoglobulinas IgG a un paciente, con el objeto de tratar diversas afecciones, tales como las deficiencias inmunes, las enfermedades inflamatorias y las enfermedades autoinmunes. Las inmunoglobulinas IgG típicamente se combinan y se preparan a partir del plasma. Pueden usarse anticuerpos completos o fragmentos de éstos. Las inmunoglobulinas IgG pueden formularse en mayores concentraciones (por ejemplo, mayores que 10%) para la administración subcutánea, o pueden formularse para la administración intramuscular. Esto es particularmente común para las preparaciones de IgG especializadas, que se preparan con titulaciones mayores que el promedio para antígenos específicos (por ejemplo, el factor Rho D, la toxina de Pertussis, la toxina del tétanos, la toxina del botulismo, la rabia, etcétera) . Para simplificar la descripción, estas composiciones de IgG formuladas para una administración subcutánea o intramuscular también se incluyen en el término "IVIG" en esta solicitud.
Una "cantidad o dosis eficaz para el uso terapéutico" o una "cantidad o dosis suficiente/eficaz" hacen referencia a una dosis que produce los efectos que se buscan con la administración. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento y podrá ser determinada por aquellos versados en la técnica, usando procedimientos conocidos (véanse, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (volúmenes 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Comppunding (1999); Pickar, Dosage Calculatíons (1999) ; y Remington ; The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, 2003, Gennaro, editor, Lippincott, Williams & Wilkins) .
Como se lo usa en esta solicitud, el término "atomización" hace referencia a un medio para administrar una sustancia liquida en un sistema, por ejemplo, durante un paso de precipitación con alcohol, tal como el paso de precipitación de las fracciones de Cohn modificadas I o II+III, en forma de pequeñas gotas o una neblina de dicha sustancia liquida. La atomización puede llevarse a cabo usando cualquier dispositivo presurizado, tal como un recipiente (por ejemplo, una botella atomizadora) que tiene una cabeza o una tobera atomizadora y que se opera manual o automáticamente, para generar una neblina fina a partir de un liquido. Típicamente, la atomización se lleva a cabo mientras se agita o se mezcla continuamente el sistema que recibe la sustancia líquida, con el fin de asegurar una distribución rápida y pareja del líquido en el sistema.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Consideraciones generales Una práctica usual en la medicina moderna comprende usar preparaciones esterilizadas de inmunoglobulinas concentradas (especialmente IgG) para tratar afecciones médicas que se clasifican dentro de tres categorías principales: las deficiencias inmunes, las enfermedades inflamatorias y autoinmunes y las infecciones agudas. Un producto basado en IgG de uso frecuente, la inmunoglobulina intravenosa o IVIG, se formula para la administración intravenosa, por ejemplo, en una concentración de exactamente o aproximadamente 10% de IgG. Las inmunoglobulinas concentradas también pueden formularse para una administración subcutánea o intramuscular, por ejemplo, en una concentración de exactamente o aproximadamente 20% de IgG. Para facilitar la descripción, estas composiciones de IgG formuladas para administraciones subcutáneas o intramusculares también quedarán incluidas dentro del término "IVIG", como se lo usa en la presente.
En determinados aspectos, en la presente invención se proveen métodos para manufacturar IVIG que permiten incrementar el rendimiento final del producto y que aún dan como resultado composiciones de IVIG con calidades iguales o superiores, y en algunos casos, con mayores concentraciones. En una forma de realización,' en la presente invención se proveen métodos de fraccionamiento de Cohn modificados que permiten reducir las pérdidas de IgG en uno o más pasos de precipitación .
En otro aspecto, en la presente invención se proveen composiciones de IgG preparadas de acuerdo con los métodos de manufactura mejorados que se proveen en la presente. Ventajosamente, la preparación de estas composiciones es mucho menos costosa que la de los productos comerciales disponibles en la actualidad, debido al rendimiento mejorado que puede alcanzarse con los métodos que se proveen en la presente. Además, estas composiciones son tanto o más puras que las composiciones manufacturadas usando métodos comerciales. Vale destacar que estas composiciones son apropiadas para usarlas en terapias con IVIG para deficiencias inmunes, para enfermedades inflamatorias y autoinmunes y para infecciones agudas. En una forma de realización, la composición de IgG comprende exactamente o aproximadamente 10% de IgG para una administración intravenosa. En otra forma de realización, la composición de IgG comprende exactamente o aproximadamente 20% de IgG para una administración subcutánea o intramuscular.
En otro aspecto, en la presente invención se proveen composiciones y formulaciones farmacéuticas de composiciones de IgG preparadas de acuerdo con las metodologías de manufactura mejoradas que se proveen en la presente. En determinadas formas de realización, estas composiciones y formulaciones proveen propiedades mejoradas en comparación con las de las otras composiciones de IVIG disponibles en el mercado. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, las composiciones y las formulaciones que se proveen en la presente son estables durante un periodo de tiempo extendido.
En aun otro aspecto, en la presente invención se provee un método para tratar deficiencias inmunes, enfermedades inflamatorias y autoinmunes e infecciones agudas que comprende la administración de una composición de IgG preparada usando los métodos mejorados que se proveen en la presente .
II . Métodos para manufacturar la IVIG En general, las preparaciones de inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención pueden prepararse a partir de cualquier material de partida apropiado, por ejemplo, plasma recuperado o plasma en la fuente. En un ejemplo típico, se recolecta sangre o plasma de donantes saludables. Usualmente, la sangre se recolecta de una especie animal que es igual a la del sujeto al que se le administrará la preparación de inmunoglobulina (lo que típicamente se conoce como inmunoglobulinas "homologas") . Las inmunoglobulinas se aislan de la sangre con procedimientos apropiados, tales como, por ejemplo, la precipitación (el fraccionamiento con alcohol o el fraccionamiento con polietilenglicol) , los métodos de cromatografía (la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de inmunoafinidad, etcétera) , la ultracentrifugación y la preparación por electroforesis, y semejantes (véanse, por ejemplo, Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); las Patentes de los EEUU N° 5122373 y 5177194; cuyas descripciones se incorporan en la presente a modo de referencia, en su totalidad y para todo propósito) .
En muchos casos, las inmunoglobulinas se preparan a partir de productos que contienen gammaglobulina producidos con métodos de fraccionamiento con alcohol y/o de cromatografía de intercambio iónico y de afinidad bien conocidos por aquellos versados en la técnica. Por ejemplo, como punto de partida para el aislamiento de las inmunoglobulinas frecuentemente se usa la fracción purificada II de Cohn. La pasta de la fracción inicial de Cohn II típicamente comprende aproximadamente 95 por ciento de IgG y está compuesta por cuatro subtipos de IgG. Los distintos subtipos están presentes en la fracción II aproximadamente en la misma proporción que en el plasma humano combinado del que se obtiene dicha fracción. La fracción II se somete a una purificación adicional antes de formular un producto para la administración. Por ejemplo, la pasta de la fracción II puede disolverse en una solución alcohólica acuosa purificada y fría, para luego eliminar las impurezas por precipitación y filtración. Después de la filtración final, la suspensión de inmunoglobulina puede someterse a una diálisis o a una diafiltración (por ejemplo, usando membranas de ultrafiltración con un límite de peso molecular nominal menor o igual que 100000 daltons) para eliminar el alcohol. La solución puede concentrarse o diluirse para obtener la concentración deseada de proteínas, y luego puede purificarse una vez más de acuerdo con procedimientos conocidos por aquellos versados en la técnica.
Además, pueden usarse pasos de preparación adicionales para enriquecer la mezcla en un isotipo o un subtipo de inmunoglobulina particular. Por ejemplo, puede usarse una cromatografía en sefarosa con la proteína A, con la proteína G o con la proteína H para enriquecer una mezcla de inmunoglobulinas en IgG o en subtipos específicos de IgG. Véanse en general Harlo y Lañe, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999) ; Harlow y Lañe, Antibodies , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); y la Patente de los EEUU N° 5180810, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia, en su totalidad y para todo propósito.
[0004] A diferencia de los métodos que se describieron con anterioridad, en un aspecto de la presente invención, se proveen métodos para preparar composiciones de IgG concentradas donde se emplea un material de partida con bajo contenido de crioprecipitados . En general, en los métodos que se proveen en la presente se usan pasos de fraccionamiento con alcohol de Cohn-Oncley. modificados y cromatografías de intercambio iónico para proveer rendimientos de IgG superiores, al tiempo que se mantiene una calidad igual o mayor que la de las preparaciones de IVIG comerciales. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, se proveen métodos que resultan en una composición final de IgG en bruto que contiene aproximadamente 751 del contenido de IgG hallado en el material de partida de plasma en bruto. Estos métodos representan un incremento de al menos 10-12% en el rendimiento general de IgG, en comparación con los métodos de purificación conocidos actualmente en la técnica. Por ejemplo, se estima que el proceso de manufactura GAMMAGARD® LIQUID resulta en un rendimiento final de entre aproximadamente 60% y 65% del contenido de IgG hallado en el material de partida. Por lo tanto, los métodos que se proveen en la presente dan como resultado una mejora significativa en comparación con las tecnologías de purificación de IgG existentes .
En una forma de realización, en la presente invención se provee una composición purificada de IgG que contiene al menos 70% del contenido de IgG hallado en el material de partida de plasma en bruto. En otra forma de realización, se provee una composición purificada de IgG que contiene al menos 75% del contenido de IgG hallado en el material de partida de plasma en bruto. En otras formas de realización, la composición purificada de IgG que se provee en la presente contendrá al menos aproximadamente 65% del contenido de IgG hallado en el material de partida de plasma en bruto, o al menos 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%73%, 74%, 75% del contenido de IgG hallado en el material de partida de plasma en bruto, o más.
A. Métodos modificados de fraccionamiento por precipitación con alcohol/cromatografia de intercambio iónico En un aspecto, en la presente invención se proveen métodos mejorados para manufacturar composiciones de IgG apropiadas para usar en una terapia con IVIG. En general," con estos métodos se proveen preparaciones de IgG que tienen mayores rendimientos y purezas comparables o incluso superiores a las que pueden alcanzarse con los métodos que se emplean actualmente para la producción de productos de IVIG comerciales.
En un aspecto especifico, en la presente invención se provee un método para preparar una composición de IgG concentrada a partir de plasma, por ejemplo, con 10% de IVIG, donde el método comprende llevar a cabo al menos un paso de precipitación con alcohol y al menos un paso de cromatografía de intercambio iónico. En particular, varios pasos en el proceso mejorado ulterior son diferentes de los procesos anteriores, por ejemplo, el uso de etanol al 25% a menores temperaturas, la adición de etanol por atomización, el ajuste del pH por atomización y el uso de partículas de sílice finamente dividido.
En una forma de realización determinada, el método comprende los siguientes pasos: (a) precipitar una fracción con bajo contenido de crioprecipitados en un primer paso de precipitación, con entre aproximadamente 6% y aproximadamente 10% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para obtener un sobrenadante enriquecido en IgG; (b) precipitar la IgG del sobrenadante con entre aproximadamente 20% y aproximadamente 30% de alcohol, a una temperatura menor y a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un primer precipitado; (c) suspender nuevamente el primer precipitado formado en el paso (b) para formar una suspensión; (d) tratar la suspensión formada en el paso (c) con un detergente; (e) precipitar la IgG de la suspensión con entre aproximadamente 20% y aproximadamente 30% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un segundo precipitado; (f) suspender nuevamente el segundo precipitado formado en el paso (e) para formar una suspensión; (g) tratar la suspensión formada en el paso (f) con un solvente y/o un detergente; y (h) realizar al menos un fraccionamiento por cromatografía de intercambio iónico, de modo de preparar una composición de IgG concentrada. En una forma de realización, el método también comprende tratar la suspensión formada en el paso (c) con dióxido de silicio (Si02) finamente dividido y filtrar la solución antes del paso (d) .
En una forma de realización, se provee un método para preparar una composición de IgG concentrada a partir de plasma, donde el método comprende los siguientes pasos: (a) ajustar el pH de una fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados en aproximadamente 7,0; (b) ajustar la concentración de etanol de la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados del paso (a) en exactamente o aproximadamente 25% (v/v) a una temperatura de entre aproximadamente -5°C y aproximadamente -9°C, con lo que se forma una mezcla, donde la concentración de etanol puede ajustarse por atomización; (c) separar el líquido y el precipitado de la mezcla del paso (b) ; (d) suspender nuevamente el precipitado del paso (c) con un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con exactamente o aproximadamente 600 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo que se forma una suspensión; (e) mezclar dióxido de silicio (Si02) finamente dividido con la suspensión del paso (d) durante al menos aproximadamente 30 minutos; (f) filtrar la suspensión con un filtro prensa, con lo que se forma un filtrado; (g) lavar el filtro prensa con al menos 3 volúmenes muertos del filtro prensa de un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con aproximadamente 150 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo que se forma una solución de lavado; (h) combinar el filtrado del paso (f) con la solución de lavado del paso (g) , con lo que se forma una solución, y tratar la solución con un detergente; (i) ajustar el pH de la solución del paso (h) en aproximadamente 7,0 y agregar etanol en una concentración final de exactamente o aproximadamente 25%, con lo que se forma un precipitado, donde la concentración de etanol y/o el pH pueden ajustarse por atomización; (j) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (i); (k) disolver el precipitado en una solución acuosa que comprende un solvente o un detergente y mantener la solución durante al menos 60 minutos; (1) después del paso (k), hacer pasar la solución a través de una columna de cromatografía de intercambio catiónico y eluir las proteínas absorbidas en la columna' para obtener una fracción eluida; (m) hacer pasar la fracción eluida del paso (1) a través de una columna de cromatografía de intercambio aniónico para generar un efluente (es decir, un flujo libre) ; (n) hacer pasar el efluente del paso (m) a través de un nanofiltro para generar un nanofiltrado ; (o) hacer pasar el nanofiltrado del paso (n) a través de una membrana de ultrafiltración para generar un ultrafiltrado; y (p) diafiltrar el ultrafiltrado del paso (o) contra un amortiguador de diafiltración para generar un diafiltrado con una concentración de proteínas de entre aproximadamente 8% (p/v) y aproximadamente 22% (p/v) , de manera de obtener una composición de IgG concentrada. En una forma de realización, la temperatura del paso (b) es exactamente o aproximadamente -7°c .
[0005] En determinadas formas de realización, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas de entre aproximadamente 8% y aproximadamente 12%, por ejemplo, de aproximadamente 8%, o de aproximadamente 9%, 10%, 11% o 12%. En una forma de realización preferida, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas de exactamente o aproximadamente 10%. En otra forma de realización preferida, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas de exactamente o aproximadamente 11%. En aun- otra forma de realización preferida, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas de exactamente o aproximadamente 12%. En otras formas de realización, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas de entre aproximadamente 13% y aproximadamente 17%, por ejemplo, de aproximadamente 13%, o de aproximadamente 14%, 15%, 16% o 17%. En aun otras formas de realización, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas de entre aproximadamente 18% y aproximadamente 22%, por ejemplo, de aproximadamente 18%, o de aproximadamente 19%, 20%, 21% o 22%. En una forma de realización preferida, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas de exactamente o aproximadamente 20%. En otra forma de realización preferida, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas de exactamente o aproximadamente 21%. En aun otra forma de realización preferida, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas .de exactamente o aproximadamente 22%.
En determinadas formas de realización de la presente invención, los métodos que se proveen en la presente pueden comprender mejoras en dos o más de los pasos de fraccionamiento del proceso descripto con anterioridad. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, las mejoras pueden hallarse en el primer paso de precipitación, en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III, en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III y/o en el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III.
En una forma de realización, la mejora realizada en el primer paso de precipitación es la adición del alcohol por atomización. En otra forma de realización, la mejora realizada en el primer paso de precipitación es la adición de un agente modificador del pH por atomización. En aun otra forma de realización, la mejora realizada en el primer paso de precipitación es el ajuste del pH de la solución después de la adición del alcohol. En una forma de realización relacionada, la mejora realizada en el primer paso de precipitación es el mantenimiento del pH durante la adición del alcohol. En otra forma de realización relacionada, la mejora realizada en el primer paso de precipitación es el mantenimiento del pH durante el periodo de incubación de la precipitación, mediante el ajuste continuo del pH de la solución. En determinadas formas de realización, el primer paso de precipitación puede mejorarse implementando más de una de estas mejoras. Otras mejoras que puedan realizarse en este paso serán evidentes a partir de la sección que se proveerá más adelante, donde se describe el primer paso de precipitación, el fraccionamiento modificado I. Cuando se implementa una o más de las mejoras descriptas con anterioridad, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción precipitada del primer paso de precipitación y/o se desnaturaliza irreversiblemente una fracción reducida de IgG durante el paso de precipitación.
En una forma de realización, la mejora realizada en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III es la adición del alcohol por atomización. En otra forma de realización, la mejora realizada en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III es la adición de un agente modificador del pH por atomización. En aun otra forma de realización, la mejora realizada en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III es el ajuste del pH de la solución después de la adición del alcohol. En una forma de realización relacionada, la mejora realizada en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III es el mantenimiento del pH durante la adición del alcohol. En otra forma de realización relacionada, la mejora realizada en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III es el mantenimiento del pH durante el periodo de incubación de la precipitación, mediante el ajuste continuo del pH de la solución. En otro aspecto, el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III se mejora incrementando la concentración de alcohol en exactamente o aproximadamente 25%. En aun otra forma de realización, el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III se mejora disminuyendo la temperatura de incubación hasta aproximadamente entre -7°C y -9°C. En determinadas formas de realización, el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III puede mejorarse implementando más de una de estas mejoras. Otras mejoras que puedan realizarse en este paso serán evidentes a partir de la sección que se proveerá más adelante, donde se describe el segundo paso de precipitación, el fraccionamiento modificado II+III. Cuando se implementa una o más de las mejoras cescriptas con anterioridad, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción del sobrenadante del paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III y/o se desnaturaliza irreversiblemente . una fracción reducida de IgG durante el paso de precipitación.
En una forma de realización, la mejora realizada en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III se efectúa incrementando el contenido de ácido acético glacial del amortiguador de disolución en aproximadamente 0,06%. En otra forma de realización, la mejora realizada en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III se efectúa manteniendo el pH de la solución durante el periodo de la incubación de disolución, mediante el ajuste continuo del pH de la solución. En otra forma de realización, la mejora realizada en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III se efectúa mezclando dióxido de silicio (Si02) finamente dividido con la suspensión de las fracciones II+III antes de la filtración. En determinadas formas de realización, el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III puede mejorarse implementando más de una de estas mejoras. Otras mejoras que puedan realizarse en este paso serán evidentes a partir de la sección que se proveerá más adelante, donde se describe el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III, la extracción del precipitado de las fracciones modificadas II+III. Cuando se implementa una o más de las mejoras descriptas con anterioridad, se recupera una cantidad incrementada de IgG en la suspensión de las fracciones II+III y/o se reduce la cantidad de impurezas en la suspensión de las fracciones II+III.
[0006] Un ejemplo de una mejora realizada en el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III se efectúa lavando posteriormente el filtro con al menos aproximadamente 3, 6 volúmenes muertos de un amortiguador de disolución que contiene exactamente o aproximadamente 150 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1. Otras mejoras que puedan realizarse en este paso serán evidentes a partir de la sección que se proveerá más adelante, donde se describe el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III, el tratamiento preliminar y la filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III. Cuando se implementa una o más de las mejoras descriptas con anterioridad, se pierde una cantidad reducida de IgG durante el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III.
En una forma de realización, el método puede comprender una mejora en el primer paso de precipitación y en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III.
En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el primer paso de precipitación y en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III.
En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el primer paso de precipitación y en el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III .
En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III y en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III.
En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+ III y en el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III.
[0007] En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III y en el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III.
En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el primer paso de precipitación, en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III y en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III.
[0008] En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el primer paso de precipitación, en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III y en el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III.
En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el primer paso de precipitación, en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III y en el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III .
[0009] En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III, en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III y en el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III.
En otra forma de realización, el método puede comprender una mejora en todos los pasos, el primer paso de precipitación, el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III, el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III y el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III.
En determinadas formas de realización, una mejora en el proceso que constituye el método para purificar IgG que. se provee en la presente comprende la adición por atomización de una o más soluciones que de otro modo se introducirían en la fracción del plasma en forma fluida. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, la mejora del proceso comprende agregar el alcohol (por ejemplo, etanol) en la fracción del plasma por atomización, con el objeto de precipitar una o más especies proteicas. En otras formas de realización, las soluciones que pueden agregarse a la fracción del plasma por atomización incluyen sin limitaciones, una solución modificadora del pH, una solución solvente, una solución detergente, un amortiguador de dilución, una solución modificadora de la conductividad, y semejantes. En una forma de realización preferida, se llevan a cabo uno o más pasos de precipitación con alcohol, que comprenden agregar el alcohol a la fracción del plasma por atomización. En una segunda forma de realización preferida, se llevan a cabo uno o más pasos de ajuste del pH mediante la adición de una solución modificadora del pH a la fracción del plasma por atomización.
En determinadas formas de realización, otra mejora del proceso, que puede combinarse con cualquier otra mejora del proceso, comprende el ajuste del pH de la fracción del plasma que se precipita, posteriormente o simultáneamente con la adición de un agente precipitante (por ejemplo, alcohol o polietilenglicol ) . En algunas formas de realización, se provee una mejora en el proceso donde el pH de la fracción del plasma que está siendo sometida a la precipitación activa se mantiene durante la incubación de la precipitación completa o durante el paso de retención, por medio del monitoreo y el ajuste continuo del pH. En formas de realización preferidas, el ajuste del pH se realiza agregando una solución modificadora del pH por atomización.
En otras formas de realización, otra mejora del proceso, que puede combinarse con cualquier otra mejora del proceso, comprende el uso de un paso de tratamiento con sílice finamente dividido para eliminar las impurezas. 1. Preparación del plasma con bajo contenido de crioprecipitados El material de partida usado para preparar las composiciones de IgG concentradas generalmente consiste en plasma recuperado (es decir, plasma que ha sido separado de sangre completa ex vivo) o plasma en la fuente (es decir, plasma recolectado por plasmaferesis ) . El proceso de purificación típicamente comienza con el descongelamiento del plasma combinado congelado, en el cual ya se ha evaluado la seguridad y los parámetros de calidad. El descongelamiento típicamente se efectúa a una temperatura no mayor que 6°C. Una vez que se ha descongelado el plasma congelado a baja temperatura, se realiza una centrifugación en frío (por ejemplo, = 6°C) para separar los crioprecipitados sólidos del líquido sobrenadante. Como alternativa, el paso de separación puede realizarse por filtración en lugar de centrifugación. Después, el líquido sobrenadante (que también conoce como el "plasma con bajo contenido de crioprecipitados" después de que se eliminan las proteínas insolubles en frío, por medio de una centrifugación a partir de plasma descongelado fresco) se procesa en el siguiente paso. En este momento, pueden llevarse a cabo diversos pasos adicionales para aislar la actividad de pasaje del inhibidor del factor ocho ( FEIBA) , el complejo del factor IX, el concentrado del factor VII o el complejo de la antitrombina III. 2. Primer paso de precipitación, el fraccionamiento modificado I En este paso, típicamente se enfría el plasma con bajo contenido de crioprecipitados a aproximadamente 0 ± 1°C y se ajusta el pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5, preferiblemente entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,3, más preferiblemente en aproximadamente 7,2. En una forma de realización, el pH del plasma con bajo contenido de crioprecipitados se ajusta en exactamente o aproximadamente 7,2. Luego se agrega etanol enfriado con antelación mientras se agita el plasma, con una concentración deseada de etanol de exactamente o aproximadamente 8% v/v. Al mismo tiempo, la temperatura se reduce aún más, hasta entre aproximadamente -4 y aproximadamente 0°C. En una forma de realización preferida, la temperatura se reduce hasta exactamente o aproximadamente -2°C, para precipitar contaminantes como la a2-macroglobulina, las globulinas ß?? y ß??, el fibrinógeno y el factor VIII. Típicamente, el paso de precipitación incluirá un tiempo de retención de al menos aproximadamente 1 hora, aunque también podrán emplearse tiempos de retención más prolongados o más breves. Después, el sobrenadante (el sobrenadante I), que idealmente contiene la totalidad del contenido de IgG presente en el plasma con bajo contenido de crioprecipitados, se recolecta por centrifugación, por filtración o con otro método apropiado.
En comparación con los métodos convencionales empleados como el primer paso de fraccionamiento para el plasma con bajo contenido de crioprecipitados (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), en diversas formas de realización de la presente invención se proveen métodos que resultan en rendimientos de IgG mejorados en la fracción del sobrenadante I. En una forma de realización, el rendimiento de IgG mejorado se alcanza agregando el alcohol por atomización. En otra forma de realización, el rendimiento de IgG mejorado se alcanza agregando un agente modificador del pH por atomización. En aun otra forma de realización, el rendimiento de IgG mejorado se alcanza ajustando el pH de la solución después de la adición del alcohol. En una forma de realización relacionada, el rendimiento de IgG mejorado se alcanza ajustando el pH de la solución durante la adición del alcohol .
En un aspecto especifico, la mejora se relaciona con un método donde se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción precipitada del primer paso de precipitación. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción precipitada del primer paso de precipitación, en comparación con la cantidad de IgG que se pierde en el primer paso de precipitación del protocolo del método 6 de Cohn.
[0010] En determinadas formas de realización, la mejora en el proceso se efectúa ajustando el pH de la solución entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5 después de la adición del alcohol para la precipitación. En otras formas de realización, el pH de la solución se ajusta entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,3 después de la adición del alcohol para la precipitación. En aun otras formas de realización, el pH de la solución se ajusta en aproximadamente 7,0, o en aproximadamente 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ó 7,5, después de la adición del alcohol para la precipitación. En una forma de realización particular, el pH de la solución se ajusta en aproximadamente 7,2 después de la adición del alcohol para la precipitación. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción precipitada del primer paso de precipitación, en comparación con un paso de precipitación análogo donde el pH de la solución se ajusta antes de la adición del alcohol para la precipitación, pero no después de ella. En una forma de realización, el pH se mantiene en el valor deseado durante el periodo de retención o incubación de la precipitación, mediante el ajuste continuo del pH de la solución. En una forma de realización, el alcohol es etanol.
En otras formas de realización determinadas, la mejora en el proceso se efectúa agregando el alcohol para la precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por atomización, en vez de en forma fluida. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción precipitada del primer paso de precipitación, en comparación con un paso de precipitación análogo donde el alcohol y/o la solución usada para ajustar el pH se introducen en forma fluida. En una forma de realización, el alcohol es etanol.
En aun otras formas de realización determinadas, la mejora se efectúa ajustando el pH de la solución entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5. En una forma de realización preferida, el pH de la solución se ajusta entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,3. En otras formas de realización, el pH de la solución se ajusta en exactamente o aproximadamente 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ó 7,5 después de la adición del alcohol para la precipitación, mediante la adición del alcohol para la precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por atomización, en vez de en forma fluida. En una forma de realización particular, el pH de la solución se ajusta en exactamente o aproximadamente 7,2 después de la adición del alcohol para la precipitación, mediante la adición del alcohol para la precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por atomización, en vez de en forma fluida. En una forma de realización, el alcohol es etanol . 3. Segundo paso de precipitación, el fraccionamiento modificado II+III Para incrementar aun más el contenido de IgG y la pureza del fraccionamiento, el sobrenadante I se somete a un segundo paso de precipitación, que es un paso de fraccionamiento de las fracciones II+III de Cohn-Oncley. En general, el pH de la solución se ajusta entre aproximadamente 6,6 y aproximadamente 6,8. En una forma de realización preferida, el pH de la solución se ajusta en exactamente o aproximadamente 6,7. Luego se agrega alcohol a la solución, preferiblemente etanol, mientras se agita, en una concentración final de entre aproximadamente 20% y aproximadamente 25% (v/v) , para precipitar la IgG en la fracción. En una forma de realización preferida, el alcohol se agrega en una concentración final de exactamente o aproximadamente 25% (v/v) para precipitar la IgG en la fracción. En general, bajo estas condiciones no precipitarán contaminantes como la a?-lipoproteina, la l-antitripsina, las Gc-globulinas, la a??-glicoproteina, la haptoglobulina, la ceruloplasmina, la transíerrina, la hemopexina, una fracción del factor Christmas, la globulina que se una a la tiroxina, la colinesterasa, el hipertensinógeno y la albúmina .
Antes de la adición del alcohol o simultáneamente con dicha adición, la solución se enfría adicionalmente a una temperatura de entre aproximadamente -7°C y aproximadamente -9°C. En una forma de realización preferida, la solución se enfría a una temperatura exactamente o aproximadamente -7°C. Una vez completa la adición del alcohol, el pH de la solución se ajusta inmediatamente entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,0. En una forma de realización preferida, el pH de la solución se ajusta en exactamente o aproximadamente 6,9. Típicamente, el paso de precipitación incluirá un tiempo de retención de al menos aproximadamente 10 horas, aunque también podrán emplearse tiempos de retención más prolongados o más breves. Después, el precipitado (las fracciones modificadas II+III) , que idealmente contiene al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% del contenido de IgG presente en el plasma con bajo contenido de crioprecipitados , se separa del sobrenadante por centrifugación, por filtración o con otro método apropiado, y se recolecta. En comparación con los métodos convencionales empleados como segundos pasos de fraccionamiento para el plasma con bajo contenido de crioprecipitados (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra) , en diversas formas de realización de la presente invención se proveen métodos que resultan en rendimientos de IgG mejorados en el precipitado de las fracciones modificadas II+III. En una forma de realización relacionada, en la presente invención se proveen métodos que resultan en una pérdida reducida de IgG en el sobrenadante de las fracciones modificadas II+III.
En comparación con los métodos convencionales empleados como segundos pasos de fraccionamiento para el plasma con bajo contenido de crioprecipitados (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), en diversas formas de realización de la presente invención se proveen métodos que resultan en rendimientos de IgG mejorados en el precipitado de las fracciones modificadas II+III. En una forma de realización, la mejora se efectúa agregando el alcohol por atomización. En otra forma de realización, la mejora se efectúa agregando un agente modificador del pH por atomización. En otra forma de realización, la mejora se efectúa ajustando el pH de la solución después de la adición del alcohol. En una forma de realización relacionada, la mejora se efectúa ajustando el pH de la solución durante la adición del alcohol. En otra forma de realización, la mejora se efectúa incrementando la concentración de alcohol (por ejemplo, etanol) en aproximadamente 25% (v/v) . En otra forma de realización, la mejora se efectúa disminuyendo la temperatura del paso de precipitación hasta entre aproximadamente -7°C y -9°C. En una forma de realización preferida, la mejora se efectúa incrementando la concentración de alcohol (por ejemplo, etanol) en aproximadamente 25% (v/v) y disminuyendo la temperatura hasta entre aproximadamente -7°C y -9°C. En comparación, tanto Cohn et al. como Oncley et al. llevan a cabo la precipitación a -5°C, y Oncley et al. usan 20% de alcohol para reducir el nivel de contaminantes en el precipitado. Ventajosamente, los métodos que se proveen en la presente permiten obtener un rendimiento máximo de IgG, sin niveles de contaminación elevados en el producto final.
En un aspecto, la mejora se relaciona con un método donde se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción del sobrenadante del paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III. En determinadas formas de realización, la mejora en el proceso se efectúa ajusfando el pH de la solución entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,1, inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición. En otra forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa manteniendo el pH de la solución entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,1, de manera continua durante el periodo de incubación de la precipitación. En otras formas de realización, el pH de la solución se ajusta entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,0 inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición, o se ajusta en aproximadamente 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 ó 7,1 inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición. En una forma de realización particular, el pH de la solución se ajusta en aproximadamente 6,9 inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición. En determinadas formas de realización, el pH de la solución se mantiene entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,0, de manera continua durante el periodo de incubación de la precipitación, o en aproximadamente 6,9, de manera continua durante el periodo de incubación de la precipitación. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción del sobrenadante del segundo paso de precipitación, en comparación con un paso de precipitación análogo donde el pH de la solución se ajusta antes de la adición del alcohol para la precipitación, pero no después de dicha adición, o en comparación con un paso de precipitación análogo donde el pH de la solución no se mantiene durante el periodo de incubación de la precipitación completo. En una forma de realización, el pH se mantiene en el valor deseado durante el periodo de retención o incubación de la precipitación, mediante el ajuste continuo del pH de la solución. En una forma de realización, el alcohol es etanol.
En otra forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa agregando el alcohol para la precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por atomización, en vez de en forma fluida. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción del sobrenadante del segundo paso de precipitación, en comparación con un paso de precipitación análogo donde el alcohol y/o la solución usada para ajustar el pH se introducen en forma fluida. En una forma de realización, el alcohol es etanol.
[0012] En otra forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa llevando a cabo el paso de precipitación a una temperatura de entre aproximadamente -7°C y aproximadamente -9°C. En una forma de realización, el paso de precipitación se lleva a cabo a una temperatura de exactamente o aproximadamente -7°C. En otra forma de realización, el paso de precipitación se lleva a cabo a una temperatura de exactamente o aproximadamente -8°C. En otra forma de realización, el paso de precipitación se lleva a cabo a una temperatura de exactamente o aproximadamente -9°C. En determinadas formas de realización, la concentración de alcohol en el paso de precipitación es de entre aproximadamente 23% y aproximadamente 27%. En una forma de realización preferida, la concentración de alcohol es de entre aproximadamente 24% y aproximadamente 26%. En otra forma de realización preferida, la concentración de alcohol es de exactamente o aproximadamente 25%. En otras formas de realización, la concentración de alcohol puede ser de exactamente o aproximadamente 23%, 24%, 25%, 26% o 27%. En una forma de realización particular, el segundo paso de precipitación se lleva a cabo a una temperatura de exactamente o aproximadamente -7°C, con una concentración de alcohol de exactamente o aproximadamente 25%. En una forma de realización, el alcohol es etanol.
[0013] El efecto del incremento de la concentración de alcohol en la segunda precipitación, desde 20%, valor que usan Oncley et al., supra, hasta 25%, en combinación con la disminución de la temperatura de la incubación, desde -5°C, valor que se usa en los métodos Cohn y Oncley, es un incremento de entre 5% y 6% n el contenido de IgG del precipitado de las fracciones modificadas II+III.
En otra forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa ajusfando el pH de la solución entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,1, preferiblemente en exactamente o aproximadamente 6,9, inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición, manteniendo el pH de la solución entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,1, preferiblemente en exactamente o aproximadamente 6, 9, mediante el ajuste continuo del pH durante el periodo de incubación de la precipitación, y agregando el alcohol para la precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por atomización, en vez de en forma fluida. En otra forma de realización particular, la mejora en el proceso se efectúa llevando a cabo el paso de precipitación a una temperatura de entre aproximadamente -7°C y aproximadamente -9°C, preferiblemente en exactamente o aproximadamente -7°C, y precipitando la IgG con una concentración de alcohol de entre aproximadamente 23% y aproximadamente 27%, preferiblemente de exactamente o aproximadamente 25%. En aun otra forma de realización particular, la mejora en el proceso se efectúa incorporando todas las mejoras para las fracciones modificadas II+III mencionadas con anterioridad.
. Extracción del precipitado de las fracciones modificadas II+III Con el fin de solubilizar el contenido de IgG del precipitado de las fracciones modificadas II+III, se usa un amortiguador de extracción en frío para suspender nuevamente el precipitado del fraccionamiento II+III, con una proporción típica de 1 parte del precipitado por cada 15 partes del amortiguador de extracción. Pueden usarse otras proporciones apropiadas para la resuspensión, por ejemplo, entre aproximadamente 1:8 y aproximadamente 1:30, o entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:20, o entre aproximadamente 1:12 y aproximadamente 1:18, o entre aproximadamente 1:13 y aproximadamente 1:17, o entre aproximadamente 1:14 y aproximadamente 1:16. En determinadas formas de realización, la proporción de resuspensión puede ser de aproximadamente 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, o más.
Las soluciones apropiadas para la extracción del precipitado modificado II+III generalmente tendrán un pH de entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,5. En determinadas formas de realización, la solución tendrá un pH de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,0, en otras formas de realización, la solución de extracción tendrá un pH de aproximadamente 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 ó 5,5. En una forma de realización preferida, el pH del amortiguador de extracción será de exactamente o aproximadamente 4,5. En otra forma de realización preferida, el pH del amortiguador de extracción será de exactamente o aproximadamente 4,7. En otra forma de realización preferida, el pH del amortiguador de extracción será de exactamente o aproximadamente 4,9. En general, estos requerimientos de pH pueden cumplirse usando un agente amortiguador seleccionado, por ejemplo, entre acetato, citrato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, mezclas de éstos, y semejantes. Las concentraciones apropiadas del amortiguador típicamente varían entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 mM, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 mM, o son de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mM del agente amortiguador.
El amortiguador de extracción preferiblemente tendrá una conductividad de entre aproximadamente 0,5 mS/cm y aproximadamente 2,0 mS/cm. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, la conductividad del amortiguador de extracción será de aproximadamente 0, 5 mS/cm, o de aproximadamente 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, o de aproximadamente 2,0 mS/cm. Aquellos versados en la técnica han de saber cómo generar amortiguadores de extracción con conductividades apropiadas.
En una forma de realización particular, un ejemplo de un amortiguador de extracción puede contener fosfato de sodio monobásico exactamente o aproximadamente 5 mM y acetato exactamente o aproximadamente 5 mM, a un pH de exactamente o aproximadamente 4,5 ± 0,2 y con una conductividad de exactamente o aproximadamente 0,7-0,9 mS/cm.
En general, la extracción se lleva -a cabo a entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 10°C, o a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. En determinadas formas de realización, la extracción puede llevarse a cabo a aproximadamente 0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C o 10°C. En una forma de realización particular, la extracción se lleva a cabo a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 10°C. Típicamente, el proceso de extracción se prolongará entre aproximadamente 60 y aproximadamente 300 minutos, o entre aproximadamente 120 y 240 minutos, o entre aproximadamente 150 y 210 minutos, mientras se agita continuamente la suspensión. En determinadas formas de realización, el proceso de extracción se prolongará aproximadamente 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o aproximadamente 300 minutos.
Ventajosamente, se descubrió que, en comparación con el proceso de manufactura actual, GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare), donde se emplea un amortiguador de extracción que contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM y 0,051% de ácido acético glacial (v/v) , al incrementarse el contenido de ácido acético glacial en exactamente o aproximadamente 0,06% (v/v), puede obtenerse un incremento sustancial en el rendimiento en la composición final de IgG. En comparación con los métodos empleados con anterioridad para la extracción del precipitado formado en el segundo paso de precipitación ( GAMMAGARD® LIQUID) , en diversas formas de realización de la presente invención se proveen métodos que resultan en rendimientos de IgG mejorados en la suspensión de las fracciones modificadas II+III.
[0014] En un aspecto, la mejora se relaciona con un método donde se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción no solubilizada del precipitado de las fracciones modificadas II+III. En una forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa extrayendo el precipitado de las fracciones modificadas II+III con una proporción de 1:15 (entre el precipitado y el amortiguador) de una solución que contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM y 0,06% de ácido acético glacial (v/v) . En otra forma de realización, la mejora se efectúa manteniendo, el pH de la solución durante el proceso de extracción.
En otro aspecto, la mejora se relaciona con un método donde se solubiliza una cantidad incrementada de IgG a partir del precipitado de las fracciones II+III en el paso de disolución de las fracciones II+III. En una forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa solubilizando el precipitado de las fracciones II+III en un amortiguador de disolución que contiene 600 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1. En otra forma de realización, la mejora se relaciona con un método donde se reducen las impurezas después de solubilizar ^ la IgG en el precipitado de las fracciones II+III. En una forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa mezclando dióxido de silicio (Si02) finamente dividido con la suspensión de las fracciones II+III durante al menos aproximadamente 30 minutos. 5. Tratamiento preliminar y filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III Con el fin de eliminar la fracción no solubilizada del precipitado de las fracciones modificadas II+III (es decir, la torta de filtrado de las fracciones modificadas II+III) , se filtra la suspensión, típicamente usando una filtración en profundidad. Los filtros de profundidad que pueden emplearse en los métodos que se proveen en la presente incluyen filtros de profundidad de metal, de vidrio, de cerámica, orgánicos (tales como la tierra de diatomeas) , y semejantes. Los ejemplos de filtros apropiados incluyen, sin limitaciones, los filtros Cuno 50SA, Cuno 90SA, y Cuno VR06 (Cuno) . Como alternativa, el paso de separación puede realizarse por centrifugación en lugar de filtración.
Aunque las mejoras del proceso de manufactura que se describieron con anterioridad permiten minimizar las pérdidas de IgG en los pasos iniciales del proceso de purificación, las impurezas criticas, incluyendo la actividad del PKA, la actividad amidolitica y el contenido de fibrinógeno, son mucho mayores, por ejemplo, cuando la pasta II+III se extrae a un pH de 4,5 ó 4,6, en comparación con una extracción un pH de aproximadamente entre 4,9 y 5,0 (véanse los ejemplos 2 a 5) .
Con el fin de contrarrestar las impurezas extraídas en los métodos que se proveen en la presente, se descubrió recientemente que es posible mejorar notablemente la pureza de la composición de IgG agregando un paso de tratamiento preliminar antes de la filtración/centrifugación. En una forma de realización, el paso de tratamiento preliminar comprende la adición de partículas de dióxido de silicio finamente dividido (por ejemplo, sílice esfumado, Aerosil®) , a lo que sigue un período de incubación de entre 40 y 80 minutos, durante el cual se mezcla constantemente la suspensión. En determinadas formas de realización, el período de incubación será de entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o de aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 minutos, o más. En general, el tratamiento se llevará a cabo a entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 10°C, o a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. En determinadas formas de realización, el tratamiento puede llevarse a cabo a aproximadamente 0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C o 10°C. En una forma de realización particular, el tratamiento se lleva a cabo a entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 10°C.
El efecto del tratamiento con sílice esfumado se refleja, por ejemplo, en los resultados obtenidos en el ejemplo 17. En este ejemplo, se suspende un precipitado de las fracciones II+ III y se lo divide en dos muestras, una de las cuales se clarifica solamente con un coadyuvante de filtrado antes de la filtración (figura 7A) , y la otra se trata con sílice esfumado antes de agregar el coadyuvante de filtrado y realizar la filtración (figura 7B) . Como puede observarse en las cromatografías y en los datos cuantificados, la muestra del filtrado tratada con antelación con sílice esfumado presentó una IgG con una pureza mucho mayor que la muestra que solamente fue tratada con el coadyuvante de filtrado (68,8% en comparación con 55,7%; compárense las tablas 17 y 18, respectivamente) .
En determinadas formas de realización, el sílice esfumado se agrega en una concentración de entre aproximadamente 20 g/kg de pasta II+III y aproximadamente 100 g/kg de pasta II+ III (es decir, para un precipitado de las fracciones modificadas II+III que se extrajera con una proporción de 1:15, el sílice esfumado debería agregarse en una concentración de entre aproximadamente 20 g/16 kg de la suspensión II+III y aproximadamente 100 g/16 kg de la suspensión II+III, o en una concentración final de aproximadamente 0,125% (p/p) y aproximadamente 0,625% (p/p) ) . En determinadas formas de realización, el sílice esfumado puede agregarse en una concentración de aproximadamente 20 g/kg de pasta II+ III, o de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 g/kg de pasta II+III. En una forma de realización específica, el sílice esfumado (por ejemplo, Aerosil 380 o un equivalente) se agrega a la suspensión de las fracciones modificadas II+III en una concentración final de aproximadamente 40 g/16 kg de II+ III. La mezcla se efectúa a aproximadamente 2-8°C durante al menos 50-70 minutos.
En determinadas formas de realización, el coadyuvante de filtrado, por ejemplo, Celpure C300 (Celpure) o Hyflo-Supper-Cel (World Minerals) , se agregará después del tratamiento con dióxido de silicio, con el fin de facilitar la filtración en profundidad. El coadyuvante de filtrado puede agregarse en una concentración final de entre aproximadamente 0,1 kg/kg de pasta II+III y aproximadamente 0,07 kg/kg de pasta II+III, o de entre aproximadamente 0,2 kg/kg de pasta II+III y aproximadamente 0,06 kg/kg de pasta II+III, o de entre aproximadamente 0,3 kg/kg de pasta II+III y aproximadamente 0,05 kg/kg de pasta II+III. En determinadas formas de realización, el coadyuvante de filtrado se agregará en una concentración final de aproximadamente 0,1 kg/kg de pasta II+ III, o de aproximadamente 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 ó 0,7 kg/kg de pasta II+III.
Con el proceso de manufactura GAMMAGARD® LIQUID se perdía una fracción significativa de la IgG durante el paso de filtración. Se descubrió que los métodos actuales de lavado posterior a la filtración, que comprenden el uso de 1,8 volúmenes muertos de amortiguador de suspensión para purgar los marcos y las líneas del filtro prensa, eran insuficientes para obtener una recuperación máxima de la IgG en este paso. Sorprendentemente, se descubrió que se necesitaban al menos 3,0 volúmenes muertos, preferiblemente 3, 6 volúmenes muertos de amortiguador de suspensión para obtener una recuperación eficiente de la IgG total en la suspensión clarificada de las fracciones modificadas II+III (véase el ejemplo 12 y la figura 1) . En determinadas formas de realización, el filtro prensa puede lavarse con cualquier amortiguador de suspensión apropiado. En una forma de realización particular, el amortiguador de lavado comprenderá, por ejemplo, fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM y 0,015% de ácido acético glacial (v/v) .
En un aspecto, la mejora se relaciona con un método donde se pierde una cantidad reducida de IgG durante el paso de filtración de la suspensión de las fracciones II+III. En una forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa realizando un lavado posterior del filtro con al menos aproximadamente 3,6 volúmenes muertos de un amortiguador de disolución que contiene 150 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1.
En comparación con los métodos empleados con anterioridad para clarificar la suspensión formada en el segundo paso de precipitación (GAMAGARD® LIQUID) , en diversas formas de realización de la presente invención se proveen métodos que resultan en rendimientos mejorados de IgG y en purezas superiores en la suspensión clarificada de las fracciones II+III. En un aspecto, la mejora se relaciona con un método donde se pierde una cantidad reducida de IgG en la torta de filtrado de las fracciones modificadas II+III. En otro aspecto, la mejora se relaciona con un método donde hay una cantidad reducida de impurezas en la suspensión clarificada de las fracciones II+III.
En una forma de realización, las mejoras del proceso se efectúan incluyendo un tratamiento con sílice esfumado antes de la clarificación por filtración o centrifugación de la suspensión de las fracciones modificadas II+III. En determinadas formas de realización, el tratamiento con sílice esfumado incluirá la adición de entre aproximadamente 0, 1 kg/kg de pasta II+III y aproximadamente 0,07 kg/kg de pasta II+III, o de entre aproximadamente 0,2 kg/kg de pasta II+III y aproximadamente 0,06 kg/kg de pasta II+III, o de entre aproximadamente 0,3 kg/kg de pasta II+III y aproximadamente 0,05 kg/kg de pasta II+III, o de aproximadamente 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 ó 0,7 kg/kg de pasta II + III, y la mezcla se incubará durante entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 minutos, o más, a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. En otra forma de realización, las mejoras del proceso se efectúan incluyendo un tratamiento con sílice esfumado, con el cual se reducen los niveles residuales de fibrinógeno, de actividad amidolítica y/o de actividad del activador de la prekalikreína .
En otra forma de realización, las mejoras del proceso se efectúan lavando el filtro de profundidad con entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5 volúmenes del volumen muerto del filtro después de completar el paso de filtración de la suspensión de las fracciones modificadas II+III. En determinadas formas de realización, el filtro se lavará con entre aproximadamente 3,5 volúmenes y aproximadamente 4,5 volúmenes, o con al menos aproximadamente 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0 volúmenes del volumen muerto del filtro. En una forma de realización particular, el filtro prensa se lavará con al menos aproximadamente 3, 6 volúmenes muertos de amortiguador de suspensión . 6. Tratamiento con detergente Con el fin de eliminar más contaminantes del filtrado de las fracciones modificadas II+III, la muestra se somete posteriormente a un tratamiento con detergente. Los métodos para el tratamiento de fracciones derivadas del plasma con detergente son bien conocidos en la técnica. En general, podrá usarse cualquier tratamiento con un detergente no iónico convencional en combinación con los métodos que se proveen en la presente. Por ejemplo, a continuación se provee un ejemplo de un protocolo para un tratamiento con detergente .
En resumen, se agrega polisorbato-80 al filtrado de las fracciones modificadas II+III, en una concentración final de aproximadamente 0,2% (p/v) y con agitación, y la muestra se incuba durante al menos 30 minutos a una temperatura de aproximadamente entre 2 y 8°C. Luego se mezcla citrato de sodio deshidratado con la solución, en una concentración final de aproximadamente 8 g/1, y la muestra se incuba durante 30 minutos adicionales, con agitación continua a una temperatura de aproximadamente entre 2 y 8°C.
En determinadas formas de realización, podrá usarse cualquier detergente no iónico apropiado. Los ejemplos de detergentes no iónicos apropiados incluyen sin limitaciones, octilglucósido, digitonina, C12E8, Lubrol, Tritón X-100, Nonidet P-40, Tween-20 (es decir, polisorbato-20 ) , Tween-80 (es decir, polisorbato-80 ) , un alquil poli (óxido de etileno) , un detergente Brij, un alquilfenol poli (óxido de etileno), un poloxámero, octil glucósido, decil maltósido, y semejantes.
En una forma de realización, una mejora del proceso se efectúa agregando los reactivos detergentes (por ejemplo, polisorbato-80 'y citrato de sodio deshidratado) por atomización en vez de en forma fluida. En otras formas de realización, los reactivos detergentes pueden agregarse como sólidos al filtrado de las fracciones modificadas II+III, al tiempo que se agita la mezcla para asegurar la distribución rápida de los aditivos. En determinadas formas de realización, es preferible agregar los reactivos sólidos esparciéndolos sobre un área superficial deslocalizada del filtrado, de modo que no haya una concentración local excesiva, como la que ocurre en la adición en forma fluida. 7. Tercer paso de la precipitación, la precipitación G Con el fin de eliminar varias proteínas residuales pequeñas, tales como la albúmina y la transíerrina, se lleva a cabo una tercera precipitación con una concentración de alcohol de 25%. En resumen, el pH del filtrado II+III tratado con detergente se ajusta entre aproximadamente 6,8 y 7,2, preferiblemente entre aproximadamente 6,9 y aproximadamente 7,1, más preferiblemente en aproximadamente 7,0, con una solución modificadora del pH apropiada (por ejemplo, hidróxido de sodio 1 M o ácido acético 1 M) . Luego se agrega alcohol frió a la solución, en una concentración final de aproximadamente 25% (v/v) , y se incuba la mezcla con agitación para formar un tercer precipitado (es decir, el precipitado G) .
En un aspecto, una mejora del proceso se relaciona con un método donde se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción del sobrenadante del tercer paso de precipitación. En determinadas formas de realización, la mejora en el proceso se efectúa ajusfando el pH de la solución entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,2 inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición. En otra forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa manteniendo el pH de la solución entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,2, de manera continua durante el periodo de incubación de la precipitación. En otras formas de realización, el pH de la solución se ajusta entre aproximadamente 6,9 y aproximadamente 7,1 inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición, o en aproximadamente 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 ó 7,2 inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición. En una forma de realización particular, el pH de la solución se ajusta en aproximadamente 7,0 inmediatamente después de la adición del alcohol para la precipitación o durante dicha adición. En determinadas formas de realización, el pH de la solución se mantiene entre aproximadamente 6, 9 y aproximadamente 7,1, de manera continua durante el periodo de incubación de la precipitación, o en aproximadamente 7,0, de manera continua durante el periodo de incubación de la precipitación. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción del sobrenadante del tercer paso de precipitación, en comparación con un paso de precipitación análogo donde el pH de la solución se ajusta antes de la adición del alcohol para la precipitación, pero no después de ella, o en comparación con un paso de precipitación análogo donde el pH de la solución no se mantiene durante el periodo completo de incubación del precipitado. En una forma de realización, el pH se mantiene en el valor deseado durante el periodo de precipitación o de incubación, mediante el ajuste continuo del pH de la solución. En una forma de realización, el alcohol es etanol.
En otra forma de realización, la mejora en el proceso se efectúa agregando el alcohol para la · precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por atomización, en vez de en forma fluida. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción del sobrenadante del tercer paso de precipitación, en comparación con un paso de precipitación análogo donde el alcohol y/o la solución usada para ajustar el pH se introducen en forma fluida. En una forma de realización, el alcohol es etanol. 8. Suspensión y filtración del precipitado G (PptG) Con el fin de solubilizar el contenido de IgG del precipitado G, se usa un amortiguador de extracción frío para suspender nuevamente el PptG. Posteriormente, la solución PptG suspendida se filtra con un filtro de profundidad apropiado, con poros con un tamaño nominal de entre aproximadamente 0,1 pm y aproximadamente 0,4 um. En una forma de realización, el tamaño nominal de los poros del filtro de profundidad es de aproximadamente 0,2 pm (por ejemplo, un filtro Cuno VR06 o un equivalente) , con lo cual puede obtenerse un filtrado clarificado. En otra forma de realización, la solución PptG suspendida se centrifuga para recuperar un sobrenadante clarificado. 9. Tratamiento con solvente detergente Con el fin de inactivar los diversos contaminantes virales que pudieran estar presentes en los productos derivados del plasma, el filtrado del PptG clarificado se somete posteriormente a un tratamiento con un solvente detergente (S/D) . Los métodos para tratar fracciones derivadas del plasma con detergentes son conocidos en la técnica (puede hallarse una revisión en Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Hae atol . 2006; 19 ( 1 ) : 205-42 ) . En general, podrá usarse cualquier tratamiento con S/D convencional en combinación con los métodos que se proveen en la presente. Por ejemplo, a continuación se provee un ejemplo de un protocolo para un tratamiento con S/D.
En resumen, se agrega Tritón X-100, Tween-20 y tri (n-butil) fosfato (TNBP) al filtrado del PptG clarificado, en concentraciones finales de aproximadamente 1,0%, 0,3% y 0,3%, respectivamente. Luego se agita la mezcla a una temperatura de entre aproximadamente 18°C y aproximadamente 25°C durante al menos aproximadamente una hora.
En una forma de realización, una mejora del proceso se efectúa agregando los reactivos del S/D (por ejemplo, Tritón X-100, Tween-20 y TNBP) por atomización, en vez de en forma fluida. En otras formas de realización, los reactivos detergentes pueden agregarse como sólidos al filtrado del PptG clarificado, que se mezcla para asegurar una distribución rápida de los componentes del S/D. En determinadas formas de realización, es preferible agregar los reactivos sólidos esparciéndolos sobre un área superficial deslocalizada del filtrado, de modo que no haya una concentración local excesiva, como la que ocurre en la adición en forma fluida. 10. Cromatografía de intercambio iónico Con el fin de purificar y concentrar aun más la IgG del filtrado del PptG tratado con el S/D, puede emplearse una cromatografía de intercambio catiónico y/o de intercambio aniónico. Los métodos para purificar y concentrar la IgG usando una cromatografía de intercambio iónico son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en la Patente de los EEUU N° 5886154 se describe un método donde se extrae el precipitado de las fracciones II+ III a un pH bajo (de entre aproximadamente 3,8 y 4,5), a lo que sigue la precipitación de la IgG usando ácido caprílico, y finalmente la implementación de dos pasos de cromatografía de intercambio aniónico. En la. Patente de los EEUU N° 6069236 se describe un esquema de purificación de la IgG por cromatografía que no se basa en lo absoluto en la precipitación con alcohol. En la Publicación PCT N° WO 2005/073252 se describe un método para purificar IgG, que comprende la extracción del precipitado de las fracciones II+III, un tratamiento con ácido caprílico, un tratamiento con PEG y un solo paso de cromatografía de intercambio aniónico. En la Patente de los EEUU N° 7186410 se describe un método para purificar IgG, que comprende la extracción de un precipitado de las fracciones I+II+III o de la fracción II, a lo que sigue un solo paso de intercambio aniónico, que se lleva a cabo a pH alcalino. En la Patente de los EEUU N° 7553938 se describe un método que comprende la extracción de un precipitado de las fracciones I+II+III o de las fracciones II+III, un tratamiento con caprilato y uno o dos pasos de cromatografía de intercambio aniónico. En la Patente de los EEUU N° 6093324 se describe un método de purificación que comprende el uso de una resina macroporosa de intercambio aniónico operada a un pH de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 6,6. En la Patente de los EEUU N° 6835379 se describe un método de purificación que se basa en la cromatografía de intercambio catiónico, en ausencia de un fraccionamiento con alcohol. Las descripciones de las publicaciones anteriores se incorporan en la presente a modo de referencia, en su totalidad y para todo propósito¦ En una forma de realización de los métodos de la presente invención, el filtrado del PptG tratado con el S/D puede someterse a una cromatografía de intercambio catiónico y una cromatografía de intercambio aniónico. Por ejemplo, en una forma de realización, el filtrado del PptG tratado con el S/D se hace pasar a través de una columna intercambio catiónico, a la que se une la IgG en la solución. Luego pueden separarse los reactivos del S/D de la IgG absorbida por lavado, después de lo cual la IgG se separa de la columna por medio de una elución con un amortiguador de elución a un pH elevado, de aproximadamente entre 8,0 y 9,0. De esta manera, el paso de cromatografía de intercambio catiónico puede usarse para eliminar los reactivos del S/D de la preparación, para concentrar la solución que contiene la IgG, o para ambos fines. En determinadas formas de realización, el pH del amortiguador de elución puede ser de entre aproximadamente 8,2 y aproximadamente 8,8, o de entre aproximadamente 8,4 y aproximadamente 8,6, o de aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ó 9,0. En una forma de realización preferida, el pH del amortiguador de elución es de aproximadamente 8,5 ± 0,1.
En determinadas formas de realización, el pH la fracción eluida de la columna de intercambio catiónico puede ajustarse en un valor menor, por ejemplo, de entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 6,5, y dicha fracción puede diluirse con un amortiguador apropiado, de modo de reducir la conductividad de la solución. En determinadas formas de realización, el pH de la fracción eluida por intercambio catiónico puede ajustarse entre aproximadamente 5,7 y aproximadamente 6,3, o entre aproximadamente 5,9 y aproximadamente 6,1, o en aproximadamente 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 ó 6,5. En una forma de realización preferida, el pH de la fracción eluida se ajusta en aproximadamente 6,0 ± 0,1. Luego se carga la fracción eluida en una columna de intercambio aniónico, a la que se unen varios de los contaminantes hallados en la preparación. La fracción que fluye a través de la columna, que contiene la fracción de IgG, se recolecta durante la carga y el lavado de la columna. En determinadas formas de realización, los pasos de cromatografía de intercambio iónico de la presente invención pueden llevarse a cabo en un modo en columna, en un modo en lotes o en una combinación de ambos modos.
En determinadas formas de realización, una mejora del proceso se efectúa agregando la solución usada para ajustar el pH por atomización, en vez de en forma fluida. 11. Nanofiltración y ultra/diafiltración Con el fin de reducir aun más la carga viral de la composición de IgG que se provee en la presente, el efluente de la columna de intercambio aniónico puede someterse a una nanofiltración usando un dispositivo de nanofiltración apropiado. En determinadas formas de realización, el dispositivo de nanofiltración tendrá poros con un tamaño promedio de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 200 nm. Los ejemplos de nanofiltros apropiados para este uso incluyen, sin limitaciones, DVD, DV 50, DV 20 (Pall) , Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore) , Planova 15N, 20N, 35N y 75N (Planova) . En una forma de realización especifica, el nanofiltro puede tener poros con un tamaño promedio de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 72 nm, o de entre aproximadamente 19 nm y aproximadamente 35 nm, o de aproximadamente 15 nm, 19 nm, 35 nm o 72 nm. En una forma de realización preferida, el nanofiltro tendrá poros con un tamaño promedio de aproximadamente 35 nm, por ejemplo, es un filtro Asahi PLANOVA 35N o un equivalente de éste.
Opcionalmente, la ultrafiltración/diafiltración puede realizarse para concentrar aun más el nanofiltrado . En una forma de realización, se usa una membrana con canales abiertos, con un lavado posterior y una formulación diseñados específicamente cerca del final del proceso de producción, con el fin de duplicar aproximadamente la concentración de proteínas de las composiciones de IgG (200 mg/ml), en comparación con las IVIG de uso actual (por ejemplo, GAMMAGARD® LIQUID) , sin afectar el rendimiento y la estabilidad durante el almacenamiento. Con la mayoría de las membranas de ultrafiltración disponibles comercialmente, no es posible alcanzar una concentración de 200 mg/ml de IgG sin que haya pérdidas importantes de proteínas. Estas membranas serán bloqueadas rápidamente, por lo .que será difícil realizar un lavado posterior apropiado. Entonces, es necesario usar configuraciones de membranas con canales abiertos. Incluso con las membranas con canales abiertos, es necesario usar un procedimiento de lavado posterior diseñado específicamente para obtener la concentración necesaria, sin una pérdida significativa de proteínas (una pérdida menor que 2%) . Resulta aun más sorprendente que la mayor concentración de proteínas, 200 mg/ml, no afecte la capacidad de inactivación de virus del paso de almacenamiento a bajo pH.
Después de la nanofiltración, el filtrado puede concentrarse aun más por ultrafiltración/diafiltración. En una forma de realización, el nanofiltrado puede concentrarse por ultrafiltración hasta alcanzar una concentración de proteínas de entre aproximadamente 2% y aproximadamente 10% (p/v) . En determinadas formas de realización, la ultrafiltración se lleva a cabo en un cásete con una pantalla con canales abiertos y la membrana de ultrafiltración tiene un límite nominal de peso molecular (NMWCO) menor que aproximadamente 100 kDa o menor que aproximadamente 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 kDa, o menor. En una forma de realización preferida, la membrana de ultrafiltración tiene un NMWCO no mayor que 50 kDa .
Una vez completo el paso de ultrafiltración, el concentrado puede concentrarse aun más por diafiltración contra una solución apropiada para una administración intravenosa o intramuscular. En determinadas formas de realización, la solución de diafiltración puede comprender un estabilizador y/o . un agente amortiguador. En una forma de realización preferida, el estabilizador y el agente amortiguador son glicina en una concentración apropiada, por ejemplo, de entre aproximadamente 0,20 M y aproximadamente 0,30 M, o de entre aproximadamente 0,22 M y aproximadamente 0,28 M, o de entre aproximadamente 0,24 M y aproximadamente 0,26 mM, o en una concentración de aproximadamente 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 ó 3,0. En una forma de realización preferida, el amortiguador de diafiltración contiene glicina exactamente o aproximadamente 0,25 M.
Típicamente, el volumen de intercambio mínimo es al menos aproximadamente 3 veces el volumen del concentrado original, o al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más veces el volumen del concentrado original. La solución de IgG puede concentrarse hasta una concentración final de proteínas de entre aproximadamente 5% y aproximadamente 22% (p/v) , o de entre aproximadamente 6% y aproximadamente 18% (p/v), o de entre aproximadamente 7% y aproximadamente 16% (p/v), o de entre aproximadamente 8% y aproximadamente 14% (p/v) , o de entre aproximadamente 9% y aproximadamente 12%, o en una concentración final de aproximadamente 5%, o de 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, o más. Típicamente, al final del proceso de concentración, el pH de la solución será de aproximadamente entre 4,6 y 5,1.
En un ejemplo de una forma de realización, el pH de la composición de IgG se ajusta en aproximadamente 4,5 antes de la ultrafiltración. La solución se concentra hasta una concentración de proteínas de 5 ± 2% p/v por ultrafiltración . La membrana de UF tiene un límite nominal de peso molecular (NMWCO) de 50000 Daltons o menos (membrana de poliéter de sulfona Millipore Pellicon) . El concentrado se somete a una diafiltración contra diez volúmenes de una solución de glicina 0,25 M, a un pH de 4,5 ± 0,2. Durante la operación de ultra/diafiltración, la solución se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. Después de la diafiltración, la solución se concentra hasta alcanzar una concentración de proteínas de al menos 11% (p/v) . 12. Formulación Una vez completo el paso de diafiltración, la concentración de proteínas de la solución se ajusta con el amortiguador de diafiltración en una concentración final entre aproximadamente 5% y aproximadamente 20% (p/v) , o de entre aproximadamente 6% y aproximadamente 18% (p/v), o de entre aproximadamente 7% y aproximadamente 16% (p/v), o de entre aproximadamente 8% y aproximadamente 14% (p/v), o de entre aproximadamente 9% y aproximadamente 12%, o en una concentración final de aproximadamente 5%, o de 6%, 7% , 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13% , 14% , 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%.
En una forma de realización preferida, la concentración final de proteínas de la solución es de entre aproximadamente 9% y aproximadamente 11%, más preferiblemente de aproximadamente 10%.
La solución formulada en bruto también se esteriliza filtrándola a través de una membrana de filtro con poros con un tamaño absoluto no mayor que aproximadamente 0,22 micrones, por ejemplo, de aproximadamente 0,2 micrones . Después, la solución se coloca de manera aséptica en los recipientes finales para sellarla de manera apropiada, y se toman muestras para evaluarlas.
En una forma de realización, la concentración de la composición de IgG también se ajusta en aproximadamente 10,2 ± 0,2% (p/v) con el amortiguador de diafiltración . De ser necesario, el pH se ajusta entre aproximadamente 4,4 y aproximadamente 4,9. Finalmente, la solución se filtra de manera estéril y se incuba durante tres semanas a exactamente o aproximadamente 30°C. 13. Adición del alcohol Ventajosamente, se descubrió que, con el fin de fraccionar la IgG a partir del plasma, la adición del alcohol por atomización en vez de en forma fluida da como resultado pérdidas reducidas en el rendimiento de IgG. Sin limitar la invención a una teoría, durante la adición en forma fluida a la fracción del plasma, la concentración local transitoriamente excesiva de alcohol en el ingreso del fluido puede resultar en la desnaturalización de las proteínas y en pérdidas irreversibles y/o en la precipitación de IgG durante los pasos en los que la IgG debería permanecer en el sobrenadante. Además, estos efectos pueden amplificarse cuando es necesario agregar grandes volúmenes de alcohol, tal como en las purificaciones a escala industrial que comprenden el fraccionamiento de al menos 100 1 de plasma combinado.
El efecto de la adición de alcohol por atomización se refleja en el ejemplo 14, donde se precipitaron muestras de plasma con bajo contenido de crioprecipitados con etanol al 8%, el cual se introdujo en forma fluida (1 y 2) o por atomización (3 y 4) . Como puede observarse en la tabla 14, prácticamente 100% de la IgG presente en el plasma con bajo contenido de crioprecipitados se recupera en el sobrenadante cuando el etanol se agrega a la muestra por atomización, mientras que se pierde entre 4 y 5% de la IgG al agregar el alcohol en forma fluida. Esto da como resultado una pérdida de IgG de entre aproximadamente 0,20 y 0,25 g/1 tan solo en este paso. En términos de los niveles de producción de 2007, esto se traduce en una pérdida de aproximadamente 5, 3 millones de gramos (5300 kilogramos) de IgG. Si se tiene en cuenta el precio comercial actual de la IVIG, que varia entre $50 y $100 por gramo, una pérdida de entre 4 y 5% en este paso representa una pérdida económica global de hasta quinientos millones de dólares por año.
Por lo tanto, en un aspecto de los métodos que se proveen en la presente, los uno o más pasos de precipitación se llevan a cabo mediante la adición del alcohol por atomización. En determinadas formas de realización, la adición por atomización puede llevarse a cabo usando cualquier dispositivo presurizado, tal como -un recipiente (por ejemplo, una botella atomizadora) que tiene una cabeza o una tobera atomizadora y que se opera manual o automáticamente, para generar una neblina fina a partir de un liquido. En determinadas formas de realización, la adición por atomización se lleva a cabo mientras se agita o se mezcla continuamente el sistema, con el fin de asegurar una distribución rápida y pareja del liquido en el sistema. 14. Ajuste del pH Los perfiles de precipitación de las proteínas de las fracciones de plasma dependen en gran medida del pH de la solución a partir de la cual se precipitan las proteínas del plasma. Este hecho ha sido explotado por los científicos en el fraccionamiento de las proteínas del plasma desde la introducción de los métodos de Cohn y Oncley en 1946 y 1949, respectivamente. Tradicionalmente, el pH de la fracción del plasma se ajusta antes de agregar el alcohol para poder obtener los rendimientos de recuperación más altos para el componente de interés. Ventajosamente, recientemente se descubrió que, si se ajusta el pH de la solución directamente después de agregar el alcohol o simultáneamente con la adición del alcohol, se obtiene una precipitación más definida y reproducible . Se descubrió que la adición de etanol a las fracciones de plasma resulta en fluctuaciones en el pH de la solución, generalmente debido al incremento del pH de la solución. Por lo tanto, si se ajusta el pH de la fracción del plasma en un valor predeterminado antes de la adición del alcohol, pero no después de ella, la reacción de precipitación ocurriré a un pH no óptimo.
Del mismo modo, la precipitación de las proteínas de la fracción del plasma afectará el ambiente electrostático, por lo que alterará el pH de la solución. Por consiguiente, a medida que progrese el paso de precipitación, el pH de la solución comenzará a apartarse del valor de pH predeterminado que permite obtener una recuperación máxima de las especies proteicas de interés. Esto es especialmente válido para los pasos de precipitación donde se precipita una gran fracción de las proteínas, para los pasos de precipitación donde se usa un alto contenido de alcohol y para los pasos de precipitación donde se necesita un período de incubación prolongado .
El efecto del ajuste del pH de la fracción del plasma se refleja en los resultados determinados en el ejemplo 16. En este ejemplo, se precipitó la IgG a partir de dos muestras de sobrenadantes de la fracción I después de agregar el alcohol por atomización. El pH de ambas muestras se ajustó en 6,7 antes de agregar el alcohol y se reajustó en 6,9 después de agregar el alcohol, pero antes del paso de incubación de 10 horas. En la primera muestra (la referencia), el pH no se ajustó durante la incubación de 10 horas, mientras que en la muestra dos (con un ajuste continuo) , el pH se ajustó constantemente en 6,9 durante la incubación de 10 horas. Como puede observarse en la tabla 16, una vez retirado el precipitado de las muestras de las fracciones modificadas II+III, el primer sobrenadante contenía 0,2 g de IgG/1 de plasma, mientras que la segunda muestra,' donde el pH había sido mantenido constante durante la incubación del precipitado, solamente contenia 0,13 g de IgG/1 de plasma. La pérdida reducida de 0,07 g de IgG/1 de plasma en la segunda muestra representa, en términos de los niveles de producción de 2007, una pérdida de aproximadamente 1,9 millones de gramos (1900 kilogramos) de IgG. Si se tiene en cuenta el precio comercial actual de la IVIG, que varia entre $50 y $100 por gramo, una pérdida de 1,5% en este paso representa una pérdida económica global de hasta 200 millones de dólares por año.
Por ende, en un aspecto de los métodos que se proveen en la presente, el pH de a fracción del plasma se ajusta directamente después de la adición del alcohol. En formas de realización relacionadas, el pH puede ajustarse antes y después de la adición del alcohol, o durante de la adición del alcohol y después de ella, o antes de la adición del alcohol, durante dicha adición y después de ella. En una forma de realización relacionada, el pH de una solución se ajusta continuamente "durante uno o más pasos de precipitación con alcohol o durante una o más incubaciones. En determinadas formas de realización, el pH de una solución se ajusta o se mantiene continuamente mientras se agita o se mezcla continuamente el sistema, con el fin de asegurar una distribución rápida y pareja del agente modificador del pH en el sistema.
De manera similar al caso de la adición del alcohol en forma fluida, recientemente se descubrió que la adición de grandes volúmenes de un agente modificador del pH en forma fluida puede provocar variaciones locales transitorias del pH, lo que puede resultar en una desnaturalización o una precipitación indeseable. Por consiguiente, en una forma de realización de los métodos que se proveen en la presente, los agentes modificadores del pH pueden introducirse en uno o más pasos de fraccionamiento del plasma por atomización. En otra forma de realización de los métodos que se proveen en la presente, el pH de la fracción del plasma o durante el paso de precipitación puede ajustarse mediante la adición por atomización de un agente modificador del pH. En determinadas formas de realización, la adición por atomización puede llevarse a cabo usando cualquier dispositivo presurizado, tal como un recipiente (por ejemplo, una botella atomizadora) que tiene una cabeza o una tobera atomizadora y que se opera manual o automáticamente, para generar una neblina fina a partir de un liquido. En determinadas formas de realización, la adición por atomización se lleva a cabo mientras se agita o se mezcla continuamente el sistema, con el fin de asegurar una distribución rápida y pareja del liquido en el sistema.
III . Composiciones de IgG concentradas Se han descripto composiciones de IVIG que comprenden anticuerpos completos para el tratamiento de determinadas afecciones autoinmunes (véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patentes de los EEUU N° US 2002/0114802, US 2003/0099635 y US 2002/0098182) . Las composiciones de IVIG que se describen en estas referencias incluyen anticuerpos policlonales . 1. Composiciones acuosas de IgG En un aspecto, la presente invención se relaciona con composiciones acuosas de IgG preparadas con los métodos que se proveen en la presente. En general, las composiciones de IgG preparadas con los métodos novedosos que se describen en la presente tendrán un alto contenido de IgG y una gran pureza. Por ejemplo, las composiciones de IgG que se .proveen en la presente pueden tener una concentración de proteínas de al menos aproximadamente 3% (p/v) y un contenido de IgG mayor que aproximadamente 90%, en términos de pureza. Estas composiciones de IgG de gran pureza son apropiadas para administraciones terapéuticas, por ejemplo, para una terapia con IVIG. En una forma de realización, la concentración de IgG es de aproximadamente 10% y se la usa para una administración intravenosa. En otra forma de realización, la concentración es de. aproximadamente 20% y se la usa para una administración subcutánea o intramuscular.
En una forma de realización, en la presente invención se provee una composición acuosa de IgG preparada con un método que comprende los siguientes pasos: (a) precipitar una fracción con bajo contenido de crioprecipitados en un primer paso de precipitación, con entre aproximadamente 6% y aproximadamente 10% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para obtener un sobrenadante enriquecido en IgG; (b) precipitar la IgG del sobrenadante con entre aproximadamente 20% y aproximadamente 30% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un primer precipitado; (c) suspender nuevamente el primer precipitado formado en el paso (b) para formar una suspensión; (d) tratar la suspensión formada en el paso (c) con un detergente; (e) precipitar la IgG de la suspensión con entre aproximadamente 20% y aproximadamente 30% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un segundo precipitado; (f) suspender nuevamente el segundo precipitado formado en . el paso (e) para formar una suspensión; (g) tratar la suspensión formada en el paso (f) con un solvente y/o un detergente, y (h) realizar al menos un fraccionamiento por cromatografía de intercambio iónico, de modo de preparar una composición de IgG concentrada.
En una forma de realización específica, se provee una composición de IgG que se prepara con un método que comprende los siguientes pasos: (a) ajustar el pH de una fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados en aproximadamente 7,0; (b) ajustar la concentración de etanol de la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados del paso (a) en aproximadamente 25% (v/v) , a una temperatura de entre aproximadamente -5°C y aproximadamente -9°C, con lo que se forma una mezcla; (c) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (b) ; (d) suspender nuevamente el precipitado del paso (c) con un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con 600 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo . que se forma una suspensión; (e) mezclar dióxido de silicio (Si02) finamente dividido con la suspensión del paso (d) durante al menos aproximadamente 30 minutos; (f) filtrar la suspensión con un filtro prensa, con lo que se forma un filtrado; (g) lavar el filtro prensa con al menos 3 volúmenes muertos del filtro prensa de un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con 150 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo que se forma una solución de lavado; (h) combinar el filtrado del paso (f) con la solución de lavado del paso (g) , con lo que se forma una solución, y tratar la solución con un detergente; (i) ajustar el pH de la solución del paso (h) en aproximadamente 7,0 y agregar etanol en una concentración final de aproximadamente 25%, con lo que se forma un precipitado; (j) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (i); (k) disolver el precipitado en una solución acuosa que comprende un solvente o un detergente y mantener la solución durante al menos 60 minutos; (1) después del paso (k) , hacer pasar la solución a través de una columna de cromatografía de intercambio catiónico y eluir las proteínas absorbidas en la columna para obtener una fracción eluida; (m) hacer pasar la fracción eluida del paso (1) a través de una columna de cromatografía de intercambio aniónico para generar un efluente; (n) hacer pasar el efluente del paso (m) a través de un nanofiltro para generar un nanofiltrado; (o) hacer pasar el nanofiltrado del paso (n) a través de una membrana de ultrafiltración para generar un ultrafiltrado; y (p) diafiltrar el ultrafiltrado del paso (o) contra un amortiguador de diafiltración para generar un diafiltrado con una concentración de proteínas de entre aproximadamente 8% (p/v) y aproximadamente 12% (p/v) , de manera de obtener una composición de IgG concentrada.
En determinadas formas de realización, las composiciones acuosas de IgG se preparan usando un método que se provee en la presente, que comprende mejoras en dos o más de los pasos de fraccionamiento del proceso descripto con anterioridad. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, las mejoras pueden hallarse en el primer paso de precipitación, en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+ III, en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III y/o en el paso de suspensión de la filtración de las fracciones modificadas II+III.
En una forma de realización, se provee una composición acuosa de IgG que se prepara con un método de purificación que se describe en la presente, donde el método comprende la adición por atomización de una o más soluciones que de otro modo se introducirían en la fracción del plasma en forma fluida. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el método comprenderá introducir un alcohol (por ejemplo, etanol) en la fracción del plasma por atomización. En otras formas de realización, las soluciones que pueden agregarse a la fracción del plasma por atomización incluyen, sin limitaciones, una solución modificadora del pH, una solución solvente, una solución detergente, un amortiguador de dilución, una solución modificadora de la conductividad, y semejantes. En una forma de realización preferida, se llevan a cabo uno o más pasos de precipitación con alcohol, que comprenden agregar el alcohol a la fracción del plasma por atomización. En una segunda forma de realización preferida, se llevan a cabo uno o más pasos de ajuste del pH mediante la adición de una solución modificadora del pH a la fracción del plasma por atomización.
En determinadas formas de realización, se provee una composición acuosa de IgG que se prepara con un método de purificación que se describe en la presente, donde el método comprende ajustar el pH de la fracción del plasma que se precipita, posteriormente o simultáneamente con la adición de un agente precipitante (por ejemplo, alcohol o polietilenglicol) . En algunas formas de realización, se provee una mejora en el proceso donde el pH de la fracción del plasma que está siendo sometida a la precipitación activa se mantiene durante la incubación de la precipitación completa o durante el paso de retención, por medio del monitoreo y el ajuste continuo del pH. En formas de realización preferidas, el ajuste del pH se realiza agregando una solución modificadora del pH por atomización.
En una forma de realización, en la presente invención se proveen composiciones acuosas de IgG que comprenden una concentración de proteínas de entre aproximadamente 30 g/1 y aproximadamente 250 g/1. En determinadas formas de realización, la concentración de proteínas de la composición de IgG es de entre aproximadamente' 50 g/1 y aproximadamente 200 g/1, o de entre aproximadamente 70 g/1 y aproximadamente 150 g/1, o de entre aproximadamente 90 g/1 y aproximadamente 120 g/1, o cualquier concentración apropiada dentro de estos rangos, por ejemplo, aproximadamente 30 g/1, o aproximadamente 35 g/1, 40 g/1, 45 g/1, 50 g/1, 55 g/1, 60 g/1, 65 'g/1, 70 g/1, 75 g/1, 80 g/1, 85 g/1, 90 g/1, 95 g/1, 100 g/1, 105 g/1, 110 g/1, 115 g/1, 120 g/1, 125 g/1, 130 g/1, 135 g/1, 140 g/1, 145 g/1, 150 g/1, 155 g/1, 160 g/1, 165 g/1, 170 g/1, 175 g/1, 180 g/1, 185 g/1, 190 g/1, 195 g/1, 200 g/1, 205 g/1, 210 g/1, 215 g/1, 220 g/1, 225 g/1, 230 g/1, 235 g/1, 240 g/1, 245 g/1, 250 g/1, o más. En una forma de realización preferida, la composición acuosa de IgG tendrá una concentración de exactamente o aproximadamente 10%. En una forma de realización particularmente preferida, la composición tendrá una concentración de 10,2 ± 0,2% (p/v) . En otra forma de realización preferida, la composición acuosa de IgG tendrá una concentración de exactamente o aproximadamente 20%.
Los métodos que se proveen en la presente permiten preparar composiciones de IgG que tienen niveles de pureza muy altos. Por ejemplo, en una forma de realización, al menos aproximadamente 95% de las proteínas totales en una composición que se provee en la presente serán IgG. En otras formas de realización, al menos aproximadamente 96% de las proteínas serán IgG, o al menos aproximadamente 97%, 98%, 99%, 99,5% de las proteínas totales de la composición, o más, serán IgG. En una forma de realización preferida, al menos 97% de las proteínas totales de la composición serán IgG. En otra forma de realización preferida, al menos 98% de las proteínas totales de la composición serán IgG. En otra forma de realización preferida, al menos 99% de las proteínas totales de la composición serán IgG.
De manera similar, los métodos que se proveen en la presente permiten preparar composiciones de IgG que contienen niveles extremadamente bajos de agentes contaminantes. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, se proveen composiciones de IgG que contienen' menos de aproximadamente 100 mg/1 de IgA. En otras formas de realización, la composición de IgG contendrá menos de aproximadamente 50 mg/1 de IgA, preferiblemente menos de aproximadamente 35 mg/1 de IgA, más preferiblemente menos de aproximadamente 20 mg/1 de IgA. 2. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, en la presente invención se proveen composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden IgG purificada preparadas con los métodos que se proveen en la presente. En general, las composiciones y las formulaciones farmacéuticas de IgG preparadas con los métodos novedosos que se describen en la presente tendrán un contenido elevado de IgG y una gran pureza. Por ejemplo, las composiciones y las formulaciones farmacéuticas de IgG que se proveen en la presente pueden tener una concentración de proteínas de al menos aproximadamente 71 (p/v) y un contenido de IgG mayor que aproximadamente 95%, en términos de pureza. Estas composiciones y formulaciones farmacéuticas de IgG de gran pureza son apropiadas para administraciones terapéuticas, por ejemplo, para una terapia con IVIG. En una forma de realización preferida, una composición farmacéutica de IgG preferida se formula para una administración intravenosa (por ejemplo, una terapia con IVIG).
En una forma de realización, las composiciones farmacéuticas que se proveen en la presente se preparan formulando una composición acuosa de IgG que ha sido aislada usando un método provisto en la presente. En general, la composición formulada habría sido sometida a al menos uno, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres pasos para inactivar o eliminar los virus. Los ejemplos no limitativos de pasos para inactivar o eliminar los virus que pueden emplearse con los métodos que se proveen en la presente incluyen el tratamiento con solventes detergentes (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrínolysis 1994 (5, Supl . 3):S21-S28 y Kreil et al., Transfusión 2003 (43) : 1023-1028, ambos incorporados expresamente en la presente a modo de referencia, en su totalidad y para todo propósito) , la nanofiltración (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 y Yuasa et al., J Gen Virol . 1991 (72 (parte 8) ): 2021-2024, ambos incorporados expresamente en la presente a modo de referencia, en su totalidad y para todo propósito) y la incubación a bajo pH y alta temperatura (Kempf et al., Transfusión 1991 (31)423-427 y Louie et al., Biologicals 1994 (22) : 13-19) .
En determinadas formas de realización, se proveen formulaciones farmacéuticas que tiene un contenido de IgG de entre aproximadamente 80 g/l de IgG y aproximadamente 120 g/l de IgG. En general, estas formulaciones de IVIG se preparan aislando una composición de IgG a partir de plasma usando un método como los que se describen en la presente, concentrando la composición y formulando la composición concentrada en una solución apropiada para la administración intravenosa. Las composiciones de IgG pueden concentrarse usando cualquier método apropiado, conocido por aquellos versados en la técnica. En una forma de realización, la composición se concentra por ultrafiltración/diafiltración . En algunas formas de realización, en el dispositivo de ultrafiltración usado para concentrar la composición se empleará una membrana de ultrafiltración con un límite nominal de peso molecular (NM CO) menor que aproximadamente 100 kDa o menor que aproximadamente 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 kDa, o incluso menor. En una forma de realización preferida, la membrana de ultrafiltración tiene un NMWCO no mayor que 50 kDa. El intercambio de los amortiguadores puede efectuarse usando cualquier procedimiento apropiado conocido por aquellos versados en la técnica. En una forma de realización especifica, el intercambio de los amortiguadores se efectúa por diafiltración.
En una forma de realización especifica, se provee una composición farmacéutica de IgG, donde la composición de IgG ha sido purificada a partir de plasma usando un método que comprende los siguientes pasos: (a) precipitar una fracción con bajo contenido de crioprecipitados en un primer paso de precipitación, con entre aproximadamente 6% y aproximadamente 10% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para obtener un sobrenadante enriquecido en IgG; (b) precipitar la IgG del sobrenadante con entre aproximadamente 20% y aproximadamente 30% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un primer precipitado; (c) suspender nuevamente el primer precipitado formado en el paso (b) para formar una suspensión; (d) tratar la suspensión formada en el paso (c) con un detergente; (e) precipitar la IgG de la suspensión con entre aproximadamente 20% y aproximadamente 30% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un segundo precipitado; (f) suspender nuevamente el segundo precipitado formado en el paso (e) para formar una suspensión; (g) tratar la suspensión formada en el paso (f) con un solvente y/o un detergente; (h) realizar al menos un fraccionamiento por cromatografía de intercambio iónico; (i) realizar un tratamiento con un solvente detergente; y (j) someter la composición a una nanofiltración, de modo de preparar una composición de IgG.
[0015] En una forma de realización específica, se provee una composición farmacéutica de IgG, donde la composición de IgG ha sido purificada a partir de plasma usando un método que comprende los siguientes pasos: (a) ajusfar el pH de una fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados en aproximadamente 7,0; (b) ajusfar la concentración de etanol de la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados del paso (a) en aproximadamente 25% (v/v) , a una temperatura de entre aproximadamente -5°C y aproximadamente -9°C, con lo que se forma una mezcla; (c) separar el líquido y el precipitado de la mezcla del paso (b) ; (d) suspender nuevamente el precipitado del paso (c) con un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con 600 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo que se forma una suspensión; (e) mezclar dióxido de silicio (Si02) finamente dividido con la suspensión del paso (d) durante al menos aproximadamente 30 minutos; (f) filtrar la suspensión con un filtro prensa, con lo que se forma un filtrado; (g) lavar el filtro prensa con al menos 3 volúmenes muertos del filtro prensa de un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con 150 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo que se forma una solución de lavado; (h) combinar el filtrado del paso (f) con la solución de lavado del paso (g) , con lo que se forma una solución, y tratar la solución con un detergente; (i) ajusfar el pH de la solución del paso (h) en aproximadamente 7,0 y agregar etanol en una concentración final de aproximadamente 25%, con lo que se forma un precipitado; . (j) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (i); (k) disolver el precipitado en una solución acuosa que comprende un solvente o un detergente y mantener la solución durante al menos 60 minutos; (1) después del paso (k), hacer pasar la solución a través de una columna de cromatografía de intercambio catiónico y eluir las proteínas absorbidas en la columna para obtener una fracción eluida; (m) hacer pasar la fracción eluida del paso (1) a través de una columna de cromatografía de intercambio aniónico para generar un efluente; (n) hacer pasar el efluente del paso (m) a través de un nanofiltro para generar un nanofiltrado; (o) hacer pasar el nanofiltrado del paso (n) a través de una membrana de ultrafiltración para generar un ultrafiltrado; y (p) diafiltrar el ultrafiltrado del paso (o) contra un amortiguador de diafiltración para generar un diafiltrado con una concentración de proteínas de entre aproximadamente 8% (p/v) y aproximadamente 12% (p/v) , de manera de obtener una composición de IgG concentrada.
En determinadas formas de realización, se provee una composición farmacéutica de IgG, donde la composición de IgG se prepara usando un método que se provee en la presente, que comprende mejoras en dos o más de los pasos de fraccionamiento del proceso descripto con anterioridad. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, las mejoras pueden hallarse en el primer paso de precipitación, en el paso de precipitación de las fracciones modificadas II+III, en el paso de disolución de las fracciones modificadas II+III y/o en el paso de suspensión de la filtración de las fracciones modificadas II+III.
En determinadas formas de realización, se provee una composición farmacéutica de IgG, donde la composición de IgG se prepara usando un método de purificación que se- describe en la presente, donde el método comprende la adición por atomización de una o más soluciones que de otro modo se introducirían en la fracción del plasma en forma fluida. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el método comprenderá introducir un alcohol (por ejemplo, etanol) en la fracción del plasma por atomización. En otras formas de realización, las soluciones que pueden agregarse a la fracción del plasma por atomización incluyen, sin limitaciones, una solución modificadora del pH, una solución solvente, una solución detergente, un amortiguador de dilución, una solución modificadora de la conductividad, y semejantes. En una forma de realización preferida, se llevan a cabo uno o más pasos de precipitación con alcohol, que comprenden agregar el alcohol a la fracción del plasma por atomización. En una segunda forma de realización preferida, se llevan a cabo uno o más pasos de ajuste del pH mediante la adición de una solución modificadora del pH a la fracción del plasma por atomización.
En determinadas formas de realización, se provee una composición farmacéutica de IgG, donde la composición de IgG se prepara con un método de purificación que se describe en la presente, donde el método comprende ajustar el pH de la fracción del plasma que se precipita, posteriormente o simultáneamente con la adición de un agente precipitante (por ejemplo, alcohol o polietilenglicol ) . En algunas formas de realización, se provee una mejora en el proceso donde el pH de la fracción del plasma que está siendo sometida a la precipitación activa se mantiene durante la incubación de la precipitación completa o durante el paso de retención, por medio del monitoreo y el ajuste continuo del pH. En formas de realización preferidas, el ajuste del pH se realiza agregando una solución modificadora del pH por atomización.
En una forma de realización, en la presente invención se provee una composición farmacéutica de IgG que comprende una concentración de proteínas de entre aproximadamente 70 g/1 y aproximadamente 130 g/1. En determinadas formas de realización, la concentración de proteínas de la composición de IgG es de entre aproximadamente 80 g/1 y aproximadamente 120 g/1, preferiblemente de entre aproximadamente 90 g/1 y aproximadamente 110 g/1, más preferiblemente de aproximadamente 100 g/1, o cualquier concentración apropiada dentro de estos rangos, por ejemplo, aproximadamente 70 g/1, 75 g/1, 80 g/1, 85 g/1, 90 g/1, 95 g/1, 100 g/1, 105 g/1, 110 g/1, 115 g/1, 120 g/1, 125 g/1 o 130 g/1. En una forma de realización preferida, se provee una composición farmacéutica que tiene una concentración de proteínas de exactamente o aproximadamente 100 g/1. En una forma de realización particularmente preferida, la composición farmacéutica tendrá una concentración de proteínas de exactamente o aproximadamente 102 g/1.
En otra forma de realización, en la presente invención se provee una composición farmacéutica de IgG que comprende una concentración de proteínas de entre aproximadamente 170 g/l y aproximadamente 230 g/l. En determinadas formas de realización, la concentración de proteínas de la composición de IgG es de entre aproximadamente 180 g/l y aproximadamente 220 g/l, preferiblemente de entre aproximadamente 190 g/l y aproximadamente 210 g/l, más preferiblemente de aproximadamente 200 g/l, o cualquier concentración apropiada dentro de estos rangos, por ejemplo, aproximadamente 170 g/l, 175 g/l, 180 g/l, 185 g/l, 190 g/l, 195 g/l, 200 g/l, 205 g/l, 210 g/l, 215 g/l, 220 g/l, 225 g/l o 230 g/l. En una forma de realización preferida, se provee una composición farmacéutica que tiene una concentración de proteínas de exactamente o aproximadamente 200 g/l.
Los métodos que se proveen en la presente permiten preparar composiciones farmacéuticas de IgG que tienen niveles de pureza muy altos. Por ejemplo, en una forma de realización, al menos aproximadamente 95% de las proteínas totales en una composición que se provee en la presente serán IgG. En otras formas de realización, al menos aproximadamente 96% de las proteínas serán IgG, o al menos aproximadamente 97%, 98%, 99%, 99,5% de -las proteínas totales de la composición, o más, serán IgG. En una forma de realización preferida, al menos 97% de las proteínas totales de la composición serán IgG. En otra forma de realización preferida, al menos 98% de las proteínas totales de la composición serán IgG. En otra forma de realización preferida, al menos 99% de las proteínas totales de la composición serán IgG.
De manera similar, los métodos que se proveen en la presente permiten preparar composiciones farmacéuticas de IgG que contienen niveles extremadamente bajos de agentes contaminantes. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, se proveen composiciones de IgG que contienen menos de aproximadamente 100 mg/1 de IgA. En otras formas de realización, la composición de IgG contendrá menos de aproximadamente 50 mg/1 de IgA, preferiblemente menos de aproximadamente 35 mg/1 de IgA, más preferiblemente menos de aproximadamente 20 mg/1 de IgA.
Las composiciones farmacéuticas que se proveen en la presente típicamente comprenderán uno o más agentes amortiguadores o agentes estabilizadores del pH apropiados para una administración intravenosa, subcutánea y/o intramuscular. Los ejemplos no limitativos de agentes amortiguadores apropiados para formular una composición de IgG como las que se proveen en la presente incluyen glicina, citrato, fosfato, acetato, glutamato, tartrato, benzoato, lactato, histidina u otros aminoácidos, gluconato, malato, succinato, formato, propionato, carbonato, o cualquier combinación de éstos, con el ajuste del pH en un valor apropiado. En general, el agente amortiguador será suficiente para mantener un pH apropiado en la formulación durante un período de tiempo extendido. En una forma de realización preferida, el agente amortiguador es glicina.
En algunas formas de realización, la concentración del agente amortiguador en la formulación será de entre aproximadamente 100 M y aproximadamente 400 mM, preferiblemente de entre aproximadamente 150 mM y aproximadamente 350 mM, más preferiblemente de entre aproximadamente 200 mM y aproximadamente 300 mM, más preferiblemente de aproximadamente 250 mM. En una forma de realización particularmente preferida, 'la composición de IVIG comprenderá glicina entre aproximadamente 200 mM y aproximadamente 300 mM, más preferiblemente glicina aproximadamente 250 mM.
En determinadas formas de realización, el pH de la formulación será de entre aproximadamente 4,1 y aproximadamente 5, 6, preferiblemente de entre aproximadamente 4,4 y aproximadamente 5,3, más preferiblemente de entre aproximadamente 4,6 y aproximadamente 5,1. En formas de realización particulares, el pH de la formulación puede ser de aproximadamente 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5 ó 5,6. En una forma de realización preferida, el pH de la formulación será de entre aproximadamente 4,6 y aproximadamente 5,1.
En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas que se proveen en la presente opcionalmente pueden comprender también un agente para ajusfar la osmolaridad de la composición. Los ejemplos no limitativos de agentes para ajusfar la osmolaridad incluyen manitol, sorbitol, glicerol, sacarosa, glucosa, dextrosa, levulosa, fructosa, lactosa, polietilenglicoles , fosfatos, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, gluconoglucoheptonato de calcio, dimetil sulfona, y semej antes .
Típicamente, las formulaciones que se proveen en la presente tendrán osmolaridades comparables a la osmolaridad fisiológica, de aproximadamente entre 285 y 295 mOsmol/kg (Lacy et al., Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999:1254) . En determinadas formas de realización, la osmolaridad de la formulación será de entre aproximadamente 200 mOsmol/kg y aproximadamente 350 mOsmol/kg, preferiblemente de entre aproximadamente 240 y aproximadamente 300 mOsmol/kg. En formas de realización particulares, la osmolaridad de la formulación será de aproximadamente 200 mOsmol/kg, o de 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg o 350 mOsmol/kg.
Las formulaciones de IgG que se proveen en la presente generalmente son estables en forma líquida durante un período de tiempo extendido. En determinadas formas de realización, las formulaciones son estables durante al menos aproximadamente 3 meses a temperatura ambiente, o durante al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 meses a temperatura ambiente. La formulación también generalmente será estable durante 6 o al menos aproximadamente 18 meses bajo condiciones refrigeradas (típicamente a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C) , o durante al menos aproximadamente 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 ó 45 meses bajo condiciones refrigeradas.
IV. Métodos de tratamiento De acuerdo con la práctica usual en la medicina moderna, las preparaciones esterilizadas de inmunoglobulinas concentradas (especialmente IgG) se usan para tratar tres categorías principales de afecciones médicas: las deficiencias inmunes, las enfermedades inflamatorias y autoinmunes y las infecciones agudas. Estas preparaciones de IgG también pueden ser útiles para tratar la esclerosis múltiple (especialmente la esclerosis múltiple recurrente-remitente o RRMS) , la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. La preparación de IgG purificada de esta invención es apropiada para estos propósitos, así como para otros usos clínicamente aceptados para las preparaciones de IgG.
La FDA ha aprobado el uso de IVIG para tratar diversas indicaciones, incluyendo el transplante alogénico de médula ósea, la leucemia linfocítica crónica, la púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), el VIH pediátrico, las inmunodeficiencias primarias, la enfermedad de Kawasaki, la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) , el transplante de riñon a un receptor con un contenido elevado de anticuerpos o desde un donante con una incompatibilidad ABO. En determinadas formas de realización, las composiciones de IVIG que se proveen en la presente son útiles para el tratamiento o la gestión de estas enfermedades y afecciones.
Además, a los pacientes usualmente se les proveen usos no convencionales de las IVIG, por ejemplo, para el tratamiento o la gestión de las siguientes indicaciones: el síndrome de fatiga crónica, la colitis provocada por Clostridium difficile, la dermatomiositis y la polimiositis , la oftalmopatía de Graves, el síndrome de Guillain-Barré, la distrofia muscular, la miositis con cuerpos de inclusión, el síndrome de Lambert-Eaton, el lupus eritematoso, la neuropatía motora multifocal, la esclerosis múltiple (MS), la miastenia grave, la trombocitopenia aloinmune neonatal, las infecciones de parvovirus B19, el pénfigo, la púrpura posttransfusión, el rechazo de transplantes renales, el aborto espontáneo, el síndrome de la persona rígida, el síndrome de opsoclonus-mioclonus, la sepsis severa y el shock séptico en adultos críticamente enfermos, la necrólisis epidérmica tóxica, la leucemia linfocítica crónica, el mieloma múltiple, la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X y la hipogammaglobulinemia . En determinadas formas de realización, las composiciones de IVIG que se proveen en la presente son útiles para el tratamiento o la gestión de estas enfermedades y afecciones.
Finalmente, se ha propuesto el uso experimental de las IVIG para el tratamiento o la gestión de enfermedades que incluyen la deficiencia inmune primaria, la RRMS, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson (Publicación de Solicitud de Patente de los EEUU N° U.S. 2009/0148463, que se incorpora en la presente a modo de referencia, en su totalidad y para todo propósito) . En determinadas formas de realización, las composiciones de IVIG que se proveen en la presente son útiles para el tratamiento o la gestión de la deficiencia inmune primaria, la RRMS, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. En determinadas formas de realización que comprenden la administración diaria, la cantidad eficaz que ha de administrársele al sujeto puede ser determinada por el médico, teniendo en cuenta las diferencias individuales en la edad, en el peso, en la severidad de la enfermedad, en la ruta de administración (por ejemplo, intravenosa o subcutánea) y en la respuesta a la terapia. En determinadas formas de realización, una preparación de inmunoglobulina de esta invención puede administrársele a un sujeto a razón de entre aproximadamente 5 mg/kilogramo y aproximadamente 2000 mg/kilogramo, por día. En otras formas de realización, la preparación de inmunoglobulina puede administrarse en cantidades de al menos aproximadamente 10 mg/kilogramo, de al menos 15 mg/kilogramo, de al menos 20 mg/kilogramo, de al menos 25 mg/kilogramo, de al menos 30 mg/kilogramo o de al menos 50 mg/kilogramo. En otras formas de realización, la preparación de inmunoglobulina puede administrársele a un sujeto en dosis de hasta aproximadamente 100 mg/kilogramo, de hasta aproximadamente 150 mg/kilogramo, de hasta aproximadamente 200 mg/kilogramo, de hasta aproximadamente 250 mg/kilogramo, de hasta aproximadamente 300 mg/kilogramo, de hasta aproximadamente 400 mg/kilogramo, por día. En otras formas de realización, las dosis de la preparación de inmunoglobulina pueden ser mayores o menores. Adicionalmente, las preparaciones de inmunoglobulina pueden administrarse en una o más dosis por día. Los médicos familiarizados con las enfermedades que pueden ser tratadas con las preparaciones de IgG pueden determinar la dosis apropiada para un paciente de acuerdo con criterios conocidos en la técnica.
De acuerdo con la presente invención, el tiempo necesario para completar un curso de tratamiento puede ser determinado por el médico y puede variar entre un mínimo de un día y más de un mes. En determinadas formas de realización, un curso de tratamiento puede ser de entre 1 y 6 meses .
Al sujeto se le administra una cantidad eficaz de una preparación de IVIG por vía intravenosa. El término "cantidad eficaz" hace referencia a una cantidad de una preparación de IVIG que da como resultado la mejora o el remedio de una enfermedad o una afección en el sujeto. La cantidad eficaz que ha de administrársele al sujeto puede ser determinada por el médico, teniendo en cuenta las diferencias individuales en la edad, en el peso, en la severidad de la enfermedad o en la afección que se desean tratar y en la respuesta a la terapia. En determinadas formas de realización, una preparación de IVIG puede administrársele a un sujeto en una dosis de entre aproximadamente 5 mg/kilogramo y aproximadamente 2000 'mg/kilogramo por administración. En determinadas formas de realización, la dosis puede ser de al menos aproximadamente 5 mg/kg, o de al menos aproximadamente 10 mg/kg, o de al menos aproximadamente 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, o de al menos aproximadamente 2000 mg/kg.
La dosis y la frecuencia del tratamiento con IVIG dependerán, entre otros factores, de la enfermedad o la afección que se deseen tratar y de la severidad la enfermedad o la afección en el paciente. En general, para una disfunción inmune primaria, se administrará una dosis de entre aproximadamente 100 mg/kg y aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, con una frecuencia aproximada de entre 3 y 4 semanas. Para las enfermedades neurológicas y autoinmunes, se implementarán hasta 2 g/kg de peso corporal, con una frecuencia de entre tres y seis meses, en un periodo de cinco días una vez al mes. Esto generalmente se complementa con una terapia de mantenimiento que comprende la administración de entre aproximadamente 100 mg/kg y aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, aproximadamente una vez cada 3-4 meses. En general, un paciente recibirá una dosis o un tratamiento aproximadamente una vez cada 14-35 días, o aproximadamente cada 21-28 días. La frecuencia del tratamiento dependerá, entre otros factores, de la enfermedad o la afección que se deseen tratar y de la severidad de la enfermedad o la afección en el paciente.
En una forma de realización preferida, se provee un método para tratar una inmunodeficiencia, una enfermedad autoinmune o una infección aguda en un ser humano que lo necesita, donde el método comprende administrar una composición farmacéutica de IVIG de la presente invención. En una forma de realización relacionada, en la presente invención se proveen composiciones de IVIG manufacturadas de acuerdo con un método provisto en la presente, para el tratamiento de una inmunodeficiencia, de una enfermedad autoinmune o de una infección aguda en un ser humano que lo necesita .
En determinadas formas de realización, la inmunodeficiencia, la enfermedad autoinmune o la infección aguda se seleccionan entre el transplante alogénico de médula ósea, la leucemia linfocítica crónica, la púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), el VIH pediátrico, las inmunodeficiencias primarias, la enfermedad de Kawasaki, la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) , el transplante de riñon a un receptor con un contenido elevado de anticuerpos o desde un donante con una incompatibilidad ABO, el síndrome de fatiga crónica, la colitis provocada por Clostridium difficile, la dermatomiositis y la polimiositis, la oftalmopatía de Graves, el síndrome de Guillain-Barré, la distrofia muscular, la miositis con cuerpos de inclusión, el síndrome de Lambert-Eaton, el lupus eritematoso, la neuropatía motora multifocal, la esclerosis múltiple (MS) , la miastenia grave, la trombocitopenia aloinmune neonatal, las infecciones de parvovirus B19, el pénfigo, la púrpura post-transfusión, el rechazo de transplantes renales, el aborto espontáneo, el síndrome de la persona rígida, el síndrome de opsoclonus-mioclonus, la sepsis severa y el shock séptico en adultos críticamente enfermos, la necrólisis epidérmica tóxica, la leucemia linfocítica crónica, el mieloma múltiple, la agammaglobulinemia ligada al cromosoma . X, la hipogammaglobulinemia, la deficiencia inmune primaria, la RRMS, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
Ejemplos Los siguientes ejemplos se proveen solamente con fines ilustrativos, y no para limitar la invención. Aquellos versados en la técnica han de poder reconocer fácilmente la posibilidad de cambiar o modificar una variedad de parámetros no críticos para obtener resultados esencialmente iguales o similares .
Ejemplo 1 En este ejemplo se demuestra que es posible recuperar cantidades significativas de fibrinógeno, actividad amidolítica, actividad de prekalikreína y lipoproteínas de una suspensión extraída de pasta de las fracciones modificadas II+III, por medio de un tratamiento con Aerosil antes de la filtración.
En la actualidad, se usa sílice esfumado (Aerosil 380) para adsorber el fibrinógeno, la actividad amidolítica, la actividad de prekalikreína y las lipoproteínas. Para investigar el efecto del Aerosil con mayor detalle, se trataron seis suspensiones de las fracciones modificadas II+III con diversas cantidades de Aerosil antes de la filtración. En resumen, se usó un amortiguador de disolución que contenía un amortiguador de acetato de sodio 5 mM/dihidrógeno fosfato de sodio 5 mM, a pH 4,5, para resuspender la pasta modificada II+III, preparada como se describe en la presente, en una proporción de 15 gramos de amortiguador de disolución por gramo de pasta II+III. Después de la adición de la pasta, la suspensión se agitó, durante una hora a entre 2°C y 8°C en un ambiente con un pH controlado (limites IPC del pH: 4,9 y 5,3) . Se descubrió que el pH de esta suspensión normalmente se desvia hasta aproximadamente 5,1, por lo que no es necesario realizar un ajuste adicional del pH. Después de realizar una extracción adicional durante al menos 120 minutos, se agregó Aerosil 380 a los recipientes, a razón de entre 0 y 100 mg por gramo de pasta II+III, y se incubaron las suspensiones durante una hora. Se agregó tierra de diatomeas antes de realizar una filtración en profundidad con un filtro Cuno 50SA. Después de la filtración, los filtros se lavaron con un amortiguador de extracción que contenia 8 g/1 de citrato y 0,2% de polisorbato 80 (pH 5,0), y se agregó el lavado al filtrado. Luego se trató la solución combinada de filtrado y lavado con polisorbato 80 para solubilizar también las impurezas hidrofóbicas, por ejemplo, las lipoproteinas, y se precipitó la IgG con etanol al 25% (pH 7) a entre -8°C y -10°C. El precipitado PptG era prácticamente blanco y presentaba una mayor pureza de IgG. Luego se disolvió el en agua purificada, en una proporción de 7 gramos de agua por cada 2 gramos del precipitado PptG.
Se analizó la recuperación de IgG y las impurezas en las soluciones de IgG después del paso de filtración con el filtro Cuno. Específicamente, se midieron los niveles de actividad amidolítica (PL-1), de actividad, del PKA y de fibrinógeno (tabla 3) . Notablemente, como puede observarse en la tabla 3, los protocolos de extracción donde se usaron entre 40 y 60 mg de Aerosil 380 por g de pasta II+ III resultaron en niveles aceptables de recuperación de IgG, con disminuciones significativas en las actividades amidolíticas y del PKA, y también con una disminución significativa en el nivel de fibrinógeno en el filtrado. En comparación con las extracciones realizadas sin el tratamiento con Aerosil, la adición de 40 mg de Aerosil 380 por gramo de pasta II+III resultó en una reducción de casi 90% en la actividad del PKA y en el contenido de fibrinógeno, y en una reducción de 60% de la actividad amidolítica, al tiempo que se mantuvo una recuperación similar de IgG (73%).
Tabla 1. Efecto de la cantidad de Aerosil 380 en el paso de filtración de las fracciones II+III con un filtro Cuno (extracción bajo las condiciones de GLAMMAGARD® LIQUID) Ejemplo 2 En este ejemplo se demuestra que es posible recuperar cantidades significativas de fibrinógeno de una suspensión extraída de pasta de las fracciones modificadas II+III, por medio de un tratamiento con Aerosil antes de la filtración.
Un propósito de este experimento fue hallar condiciones apropiadas para obtener una remoción eficiente. del fibrinógeno, sin incurrir en pérdidas significativas de IgG.
La pasta modificada II+III, preparada de acuerdo con el método que se provee en la presente, se disolvió en un amortiguador de acetato de sodio 5 mM/fosfato de sodio monobásico 5 mM a pH 4,5. La proporción de disolución fue de 15 kg de amortiguador por kg de pasta II+III. La cantidad de ácido acético agregado al amortiguador se seleccionó de manera que el pH después de sesenta minutos de agitación fuera de 4,9. Con el fin de homogenizar completamente la suspensión, se la agitó durante a lo sumo veinte horas, a entre 2 y 8°C, antes de separarla en 6 porciones de 50 mi cada una, en recipientes de 100 mi donde ya había presentes cantidades variables de Aerosil 380, como se indica en la tabla 2. Luego se agitaron las soluciones de la suspensión II+III durante 80 minutos, en presencia de Aerosil, antes de procesarlas y analizarlas. Después de la agitación, todas las muestras se centrifugaron con una criocentrí fuga Heraeus 8500i a 4600 rpm, durante 30 minutos a 4°C, en tubos Falcon de 50 mi.
En este experimento, las mediciones de IgG se realizaron usando una prueba nefelométrica, que se seleccionó en virtud de que provee valores más precisos, en comparación con una prueba de ELISA, con las concentraciones elevadas halladas en las soluciones de la suspensión II+III. Para minimizar el inconveniente de la turbidez no especifica, las muestras se filtraron a través de tamices de 0,45 m antes de evaluarlas. Para las evaluaciones de la IgM, de la IgA y del fibrinogeno, se llevaron a cabo pruebas de ELISA, debido a las menores concentraciones de estas impurezas en la suspensión. Los resultados del experimento se detallan en la tabla 2 más adelante .
Para realizar una caracterización adicional del efecto del tratamiento con Aerosil sobre la remoción del fibrinogeno y sobre la pérdida de IgG, como se describe en el ejemplo 1, se aplicaron concentraciones adicionales de Aerosil, de entre 0 mg y 40 mg por gramo de pasta modificada II+III. Los resultados que se detallan en la tabla 2 permiten confirmar la capacidad elevada del Aerosil de reducir el fibrinogeno en esta fracción. Notablemente, el uso de 40 mg por gramo de pasta II+III da como resultado una reducción de casi 90% del fibrinogeno, al tiempo que la recuperación de IgG en la torta de filtrado se reduce solamente 10%.
Tabla 2. Resultados de la modificación de las condiciones de la disolución después d la extracción de las fracciones II+III con NaAc 5 mM/NaH2P04 5 mM a pH 4,5, con un proporción de disolución de 1 kg de II+III más 15 kg de amortiguador después de l centrifugación Ejemplo 3 En este ejemplo se demuestran condiciones apropiadas que permiten realizar una extracción altamente eficiente de IgG a partir de pasta de las fracciones modificadas II+III, con la limitación simultánea de los niveles de impurezas perjudiciales. Específicamente, se examinaron parámetros que incluyeron la concentración de ácido acético usada en el amortiguador de disolución para las fracciones II+III y el tratamiento con Aerosil de la solución extraída antes de la filtración.
La pasta II+III se extrajo en acetato de sodio 5 mM, en dihidrógeno fosfato de sodio 5 mM y en cantidades variables de ácido acético concentrado, como se detalla en la tabla 1, durante 180 minutos a entre 2°C y 8°C, a lo que siguió la adición de Aerosil 380, como se detalla en la tabla 1. Después de agitar durante una hora, la suspensión se clarificó por medio de una filtración en un tamiz Cuno 50SA, en presencia de tierra de diatomeas. El lavado posterior del filtrado se llevó a cabo con un amortiguador igual al usado para la extracción, excepto porque se empleó una cantidad diferente de ácido acético, como se detalla en la tabla 1, mediante el uso de 40% del volumen de la suspensión antes de la filtración. La precipitación del precipitado G se realizó en presencia de 25% de alcohol etílico, 8 g/1 de citrato de sodio y 0,2% de Tween 80 (pH 7) a -8°C, y después de un tiempo de retención de 8 horas, se efectuó la separación por centrifugación, con una criocentrífuga Heraeus 8500i en recipientes de acero inoxidable, a 4600 rpm durante 30 minutos a -10°C. El precipitado se disolvió en agua purificada en una proporción de 1:2.
Tabla 3. Influencia de la cantidad de ácido acético usado para ajustar el pH de amortiguador de extracción y de la cantidad de Aerosil usada para la clarificación sobr el rendimiento y la pureza de la IgG en el PptG, y sobre las pérdidas de IgG en la tort de filtrado Como puede observarse en la tabla 1, la adición de Aerosil a la suspensión de la pasta II+III tiene una influencia marcada sobre la pureza de la ?-globulina en la fracción del PptG. Sin Aerosil, la pureza de la ?-globulina es de tan solo 83,5%, pero al agregar 40 mg de Aerosil por gramo de pasta II+III a la suspensión de la pasta II+III, se incrementa la pureza de la ?-globulina hasta 87,2%. Como resulta evidente, el tratamiento con Aerosil da como resultado una reducción significativa del fibrinógeno, de la actividad del PKA y de la actividad amidolitica. Una desventaja de la adsorción de las impurezas sobre el Aerosil es que se incrementa la pérdida de IgG en la torta de filtrado al incrementarse las cantidades de Aerosil. Sin embargo, como se detalla en la tabla 1, las mayores concentraciones de ácido acético en el amortiguador de extracción contrarrestaron parcialmente el efecto del Aerosil sobre la pérdida de IgG en la torta de filtrado, y también redujeron la pérdida de IgG en la fracción del sobrenadante del PptG. Como puede observarse en la tabla 1, al incrementarse la cantidad de ácido acético en el amortiguador de disolución desde 400 µ? por 1 hasta pasta 510 µ? por 1 de pasta, fue posible reducir la cantidad de IgG perdida en la torta prácticamente en 50%. Ventajosamente, la mayor concentración de ácido acético no afecta la pureza de la ?-globulina en la fracción del PptG (87,2% de pureza con 400 µ? por 1 de pasta en comparación con 86,7% de pureza con 510 µ? por 1 de pasta) . Además, con los resultados se comprueba que la diferencia en el valor del pH provocada por las distintas cantidades de ácido acético es insignificante, debido a la capacidad de amortiguación elevada del ácido acético cerca de su valor de pKa, de 4,75 (Merck) . A partir de esto, puede concluirse que, para obtener una mayor precisión en la manufactura a gran escala, el ácido acético debería agregarse en peso. Por lo tanto, la influencia del Aerosil sobre la pureza es mucho mayor que la influencia del ácido acético sobre la pureza, en el rango investigado, como puede observarse a partir de la medición del contenido de ?-globulina por CAE.
Ejemplo 4 Los resultados hallados en el ejemplo 3 serían indicativos de que la cantidad de IgG perdida en la torta de filtrado depende marcadamente de la cantidad de ácido acético usado para ajustar el pH del amortiguador de extracción con una concentración dada de Aerosil. Con el fin de caracterizar adicionalmente este efecto, se extrajo una pasta modificada II+III en agua purificada durante aproximadamente 120 minutos para obtener una suspensión homogénea, la cual se dividió en 4 partes. El pH de estas partes se ajustó en 3,8, 4,2, 4,6 y 5,0, respectivamente, con ácido acético 1 M, a lo que siguió un segundo período de extracción durante otros 120 minutos. Posteriormente, se realizó un tratamiento con 40 mg de Aerosil 380 por gramo de pasta II+III. Después de agitar durante una hora, la suspensión se clarificó por medio de una filtración con un tamiz Cuno 50SA, en presencia de tierra de diatomeas. El lavado posterior del filtro se llevó a cabo con 100 por ciento del volumen de la suspensión previo a la filtración con el amortiguador de extracción, con un pH ajustado como se indicó con anterioridad. El filtrado se trató con 8 g/1 de citrato de sodio y 0,2% de Tween 80, se ajustó su pH en 7,0 y se precipitó la IgG con 25% de alcohol a -8°C. El precipitado PptG se recuperó por centrifugación a 4600 rpm durante 30 minutos a -10°C, en una criocentrí fuga Heraeus 8500i, usando recipientes de acero inoxidable. A continuación, el precipitado se disolvió en agua purificada, en una proporción de 7 gramos de agua por cada 2 gramos del precipitado PptG. Después, en las fracciones relevantes se evaluó la recuperación de IgG, la. actividad del PKA, el contenido de fibrinógeno y la actividad amidolítica para determinar la dependencia de la recuperación del pH (tabla 4) .
Tabla 4. Remoción dependiente del pH del fibrinogeno, de la actividad del PKA y de l actividad amidolitica al realizar una extracción y una clarificación, con un tratamient con Aerosil 10 15 En la tabla 4 se observa que la remoción de la actividad del PKA, de la actividad amidolitica (PL-1) y del fibrinógeno con Aerosil es menos efectiva a un pH menor durante la clarificación. A partir de los resultados obtenidos, puede concluirse que el pH más efectivo para eliminar la actividad del PKA, la actividad amidolitica (PL-1) y el fibrinógeno, y para mantener simultáneamente una recuperación eficiente de IgG en la fracción del PptG, es de aproximadamente 5. Las mayores concentraciones de ácido acético dan como resultado una pérdida significativa de IgG en el sobrenadante del PptG (0,85 g/1 en presencia de ácido acético 75 mM) , al tiempo que se minimiza la pérdida de IgG en la torta de filtrado.
Ejemplo 5 Para determinar la dependencia de los resultados hallados en el ejemplo 4 del tratamiento con Aerosil, se repitió el experimento omitiendo el paso de tratamiento con Aerosil. En resumen, se extrajo una pasta II+III en agua purificada durante aproximadamente 120 minutos para obtener una suspensión homogénea, la cual se dividió en 4 partes. El pH de estas partes se ajustó en 3,8, 4,2, 4,6 y 5,0, respectivamente, con ácido acético 1 M, a lo que siguió un segundo periodo de extracción durante otros 120 minutos. Posteriormente, la suspensión se clarificó por medio de una filtración con un tamiz Cuno 50SA, en presencia de tierra de diatomeas. El lavado posterior del filtro se llevó a cabo con 100 por ciento del volumen de la suspensión previo a la filtración con el amortiguador de extracción, con un pH ajustado como se indicó con anterioridad. El filtrado se trató con 8 g/1 de citrato de sodio y 0,2% de Tween 80, se ajustó su pH en 7,0 y se precipitó la IgG con 25% de alcohol a -8°C. El precipitado PptG se recuperó por centrifugación a 4600 rpm durante 30 minutos a -10°C, en una criocentrifuga Heraeus 8500i, usando recipientes de acero inoxidable. A continuación, el precipitado se disolvió en agua purificada, en una proporción de 7 gramos de agua por cada 2 gramos del precipitado PptG. Después, en las fracciones relevantes se evaluó la recuperación de IgG, la actividad del PKA, el contenido de fibrinógeno y la actividad amidolitica para determinar la dependencia de la recuperación del pH (tabla 5) .
Tabla 5. Remoción dependiente del pH del fibrinógeno, de la actividad del PKA. y de l actividad amidolitica al realizar una extracción y una clarificación, sin un tratamient con Aerosil De manera consistente con los resultados hallados en el ejemplo 4, al incrementarse el pH del amortiguador de extracción/disolución hasta 5, 0, se obtuvo un pequeño incremento en la IgG perdida en la torta de filtrado. Sin embargo, esta pérdida fue más que compensada por una disminución marcada en la pérdida de IgG en el sobrenadante del PptG.
Cuando se comparan los resultados del ejemplo 4 y del ejemplo 5, puede observarse que el tratamiento con Aerosil reduce la cantidad de actividad del PKA residual hallada en la fracción disuelta del PptG cuando la pasta II+III se extrae a pH menores (3,8, 4,2 y 4,6), pero no a pH 5,0 (figura 2) . Por otro lado, el tratamiento con Aerosil reduce significativamente el contenido de fibrinógeno de la fracción disuelta del PptG cuando la pasta II+III se extrae a pH mayores (figura 3; compárense los pH 4,6 y 5,0 con los pH 3,8 y 4,2) . El tratamiento con Aerosil no parece afectar el nivel de actividad amidolitica residual hallado en la fracción disuelta del PptG (figura 4). Notablemente, el nivel de los tres contaminantes en la fracción disuelta del PptG se reduce considerablemente cuando la pasta II+III se extrae a pH 5,0, en comparación con los pH 3,8, 4,2 y 4,6.
Ejemplo 6
[0016] Como puede observarse en los ejemplos anteriores, las pérdidas de IgG en la torta de filtrado y en los sobrenadantes del PptG se minimizan cuando la pasta II+III se extrae a un pH de aproximadamente entre 4,5 y 4,6. Sin embargo, a partir de los ejemplos precedentes también es evidente que las impurezas criticas, incluyendo la actividad del PKA, la actividad amidolitica y el contenido de fibrinógeno, son mucho mayores cuando la pasta II+III se extrae a un pH de 4,5 ó 4,6, en 'comparación con una extracción efectuada a un pH de aproximadamente entre 4,9 y 5,0. Por consiguiente, este ejemplo se llevó a cabo para determinar si los niveles mayores de impurezas observados al extraer la pasta II+III a pH 4,5 podían compensarse incrementando la cantidad de Aerosil usado para adsorber los contaminantes, y si simultáneamente se mantenían niveles bajos de pérdida de IgG en la torta de filtrado y en el sobrenadante del PptG.
En este contexto, la extracción de la pasta modificada II+III se realizó como se describió con anterioridad, con un amortiguador con un pH de 4,5. Luego se agregaron cantidades crecientes de · Aerosil 380, de hasta 200 mg por g de pasta II+III, y se agitó la suspensión durante una hora. El procesamiento ulterior de la muestra se llevó a cabo como se describió con anterioridad.
Como puede observarse en la tabla 6, la remoción del fibrinógeno y de la actividad del PKA mejora significativamente al realizar la clarificación con mayores cantidades de Aerosil. Las pérdidas de IgG en la torta de filtrado debidas a la unión al Aerosil aumentan al incrementarse la cantidad de Aerosil, aunque este efecto fue compensado en una cierta medida por una disminución en la pérdida de IgG en el sobrenadante del PptG. Significativamente, sin embargo, no fue posible reducir la actividad amidolitica al incrementar las cantidades de Aerosil cuando se extrajo la pasta II+III a pH 4,5. Además, aunque la pureza de la ?-globulina mejora con las mayores cantidades de Aerosil, en todos los casos se halla debajo del limite especificado >86% para el PptG, probablemente debido al pH reducido en la extracción y en la clarificación.
Tabla 6. Resultados de la modificación de la concentración de Aerosil con extracción y la clarificación a pH 4,5 5 15 Ejemplo 7 En este ejemplo se demuestra el efecto del pH del amortiguador de extracción sobre la remoción de las impurezas después de la resuspensión y la clarificación de la pasta II+ III .
La extracción a bajo pH de la pasta modificada II+III se efectuó a un pH de 4,2, usando una proporción de 15 gramos de amortiguador por gramo de pasta II+III. Luego se dividió la suspensión en 3 partes y se ajustó el pH en 4,5, 4,7 ó 5,0, respectivamente, con Tris 3 M. Posteriormente, cada solución se dividió adicionalmente en dos partes, cada una de las cuales se incubó durante una hora a 4°C o a 25°C. La filtración con Cuno 50(90)SA se llevó a cabo usando un amortiguador post-lavado de acetato 10 mM que tenia el mismo pH que el amortiguador de clarificación respectivo. Los filtrados se trataron con 8 g/1 de citrato y 0,2% de Tween 80, y luego se precipitó la IgG mediante la adición de 25% de alcohol etílico a -10°C durante al menos 8 horas. El precipitado se recuperó por centrifugación, como se describió con anterioridad, y se lo disolvió en el doble del volumen de agua purificada. La suspensión resultante se filtró usando un dispositivo de filtración Cuno VR06, en una solución final con una conductividad de aproximadamente 1,3 mS/cm.
Para evaluar las diversas condiciones, se determinó el nivel de IgG, IgA, IgM, transferrina, fibrinógeno y otras impurezas. Los resultados de este análisis se proveen en la tabla 7, donde se ilustra la dependencia del pH de la clarificación de la suspensión de la pasta II+III. Dentro del rango de pH de entre 4,5 y 5,0, la cantidad de IgA, IgM, transferrina y fibrinógeno no varia ampliamente, pero hay otras proteínas indeseables presentes en niveles mayores cuando se usan los amortiguadores con menores pH. Se calculó que estas otras impurezas constituyen 10% de las proteínas totales a pH 4,5, pero menos de 1% a pH 5. El contenido de IgG es máximo a pH 5,0, mientras que la dependencia de la temperatura del contenido de IgG y de los niveles de impurezas es insignificante entre 4°C y 25°C.
Tabla 7. Comparación de la reducción de las impurezas de las fracciones II+II disueltas por medio de la filtración VR06, con la variación del pH y de la temperatura durante una incubación de 1 hora posterior a la resuspensión de la pasta II+III, seguid por una filtración posterior a una extracción a bajo pH sin aditivos Como puede observarse en la tabla 8, al realizarse un análisis adicional de la fracción disuelta del PptG y del filtrado VR06, puede concluirse que el uso de amortiguadores con un pH de 4,5 para los pasos de clarificación de II+III y de tratamiento del filtrado II+III resulta en un nivel incrementado de agregados y de componentes de bajo peso molecular. Este efecto mejora aun más cuando los pasos se realizan a 25°C, en lugar de a 4°C. Por otra parte, cuando, las muestras se tratan a un pH mayor (pH 5,0), las suspensiones resultantes del PptG y el filtrado contienen niveles más altos de material de aproximadamente 350 kDa (IgG dimérica o IgA) que las soluciones tratadas a pH 4,5 (tabla 8) . Además, los tratamientos a pH más bajos dieron como resultado niveles más elevados de actividad amidolitica que el tratamiento a pH 5,0.
Tabla 8. Influencia del pH y la temperatura durante la incubación y la filtración la suspensión de la pasta II+III sobre las actividades del PKA y amidolitica precipitado G disuelto y sobre la distribución del peso molecular en el filtrado VR06 Ejemplo 8 Los resultados presentados en las tablas 7 y 8 reflejan que la resuspensión del precipitado II+III podría efectuarse a temperaturas de refrigeración (de entre 2°C y 8°C) y que el pH debería mantenerse en 5,0 con el objeto de minimizar la disolución de los componentes con pesos moleculares altos (> 450 kDa) y bajos (> 70 kDa) , y también los componentes con actividad amidolítica. La clarificación efectiva después de la suspensión de la pasta II+III servirá para reducir la carga de impurezas para el procesamiento ulterior por cromatografía del PptG, por lo que es fundamental para cumplir con los criterios de reproducción de la IVIG en el recipiente final. Para convalidar adicionalmente este descubrimiento, se disolvió y se procesó una pasta modificada II+III, como se describió con anterioridad, en amortiguadores que tenían pH de 4,5, 4,7 ó 5,0. Como se observa en la tabla 9, la IgM se elimina más eficientemente a un pH de 5,0 durante la suspensión y la clarificación de la pasta II+III que a un pH de 4,5. En este experimento, el rendimiento de IgG es similar a pH 5,0 y a pH 4,5.
Tabla 9. Rendimiento de IgG, IgA, IgM, transferrina ? fibrinógeno en diversos pasos resuspensión de la pasta II+III, la filtración y la precipitación del PptG Ejemplo 9 Para evaluar el pH óptimo para el paso de extracción de la pasta II+III, con el objeto de minimizar las actividades proteoliticas en el filtrado, se modificó el pH durante la extracción y la filtración en un rango más amplio, entre 3,8 y 7,8. Para este propósito, se extrajo la pasta modificada II+ III a bajo pH, en una proporción de 1+ 8. Después de un periodo de agitación breve, que dio como resultado una dispersión homogénea, la suspensión se dividió en 8 partes, cuyo pH se ajustó con ácido acético o con amortiguador Tris en 3,8, 4,2, 4,6, 5,0, 6,6, 7,0, 7,4 ó 7,8, para luego realizar una extracción durante 120 minutos adicionales. Posteriormente, el pH se ajustó en 5,1 y se efectuó la clarificación por centrifugación en tubos Falcon de 50 mi. El precipitado PptG se formó bajo condiciones convencionales. La actividad amidolitica y del PKA se midió en la fracción disuelta del PptG, como se indica en las figuras 5 y 6.
Como puede observarse en la muestra almacenada a 4°C en la figura 5, la actividad amidolitica se minimiza cuando la pasta II+III se extrae a pH 5,0. Como una razón más para no mantener las muestras a temperaturas elevadas (temperatura ambiente) durante periodos de tiempo extendidos, la actividad amidolitica fue elevada después de almacenar la fracción disuelta del PptG a temperatura ambiente durante una semana.
De manera similar, como se observa en la figura 6, la actividad del PKA se minimiza cuando la pasta II+III se extrae a un pH de 5,0 o más.
Ejemplo 10 En este ejemplo se evalúa la dependencia del pH de la pérdida de rendimiento de IgG durante la extracción y la clarificación. En resumen, se suspendieron nuevamente 110 gramos de pasta modificada II+III, en una proporción de 15 gramos de agua purificada por gramo de pasta II+III, a lo que siguió una extracción durante 120 minutos. Luego se dividió la muestra en cuatro partes, cuyo pH se ajustó con ácido acético en 3,8, 4,2, 4,6 ó 5,0. Luego se clarificaron las muestras por medio de una filtración con Cuno 50SA a un pH igual al usado para cada extracción y para la precipitación del PptG. Los resultados de estos dos experimentos se resumen en las tablas 10 y 11 a continuación.
Tabla 10. Recuperación de proteínas y de IgG en los filtrados y resultados de SD CAE de los precipitados G disueltos nuevamente 5 10 15 Tabla 11. Pérdida de IgG durante la extracción y la clari icación, más la actividades proteoliticas y el fibrinógeno en el precipitado G disuelto nuevamente 15 Con los datos anteriores se confirman los resultados que se ilustran en las figuras 5 y 6, relacionados con la activación de las enzimas proteoliticas por medio de la extracción a bajo pH. En conjunto, estos datos sirven para demostrar que la extracción a bajo pH provoca una pérdida menor de IgG debido a la solubilidad incrementada de todas las proteínas. Estos resultados son consistentes con los ejemplos ' provistos con anterioridad. Adicionalmente, las pérdidas de IgG que se detallan en la tabla 11 serían indicativas de que las mayores concentraciones de ácido acético, que resultan en pH más reducidos, darían como resultado menos pérdidas de IgG en la torta de filtrado, pero mayores pérdidas de IgG en el sobrenadante del precipitado G. Este fenómeno podría explicarse por las concentraciones de acetato más elevadas en el paso de precipitación después de la extracción a pH bajo.
Ejemplo 11 Para determinar las condiciones apropiadas para la extracción II+III, se comparó un protocolo donde se empleó una extracción a bajo pH, con agua purificada ajustada con ácido acético a pH 4,3, con un reajuste a pH 4,9 antes de la filtración, con una extracción en acetato de sodio 5 mM/dihidrógeno fosfato de sodio 5 mM, con 600 g ácido acético por cada 1000 litros de amortiguador de extracción, lo que resulta en un pH de entre 4,8 y 4,9 para la disolución. Los experimentos se realizaron a escala piloto, comenzando con entre 3,8 y 5 kg de pasta modificada II+ III. Todos los experimentos incluyeron el tratamiento con 40 g de Aerosil por kg de pasta II+ III. Para la clarificación, se usó un filtro prensa Strassburger con marcos de filtro de 30 cm*30 cm, equipado con láminas de filtro Cuno 50SA. El lavado posterior se llevó a cabo con 4 volúmenes muertos del filtro prensa, con un amortiguador de acetato de sodio 5 mM/dihidrógeno fosfato de sodio 5 mM, con 150 gramos ácido acético por cada 1000 litros del amortiguador. La centrifugación de precipitado G se efectuó con una centrifuga Cepa® Z61H (con un rotor con un diámetro de 10,5 cm) , a 17000 rpm y con una velocidad de flujo de 40 litros por hora. Los resultados del experimento, que se realizó por triplicado, se detallan en la tabla 12.
Tabla 12. Comparación de la extracción a bajo pH, 4,3, con un cambio del pH hasta 4, antes del tratamiento con Aerosil, con una extracción bajo condiciones de GAMMAGARD LIQUID mejoradas, con 600 g de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador d extracción 10 15 Como puede observarse en la tabla 12, ambos protocolos de extracción resultan en recuperaciones similares de IgG. Si se tienen en cuenta los resultados de los ejemplos 3 a 10, donde se comprueba que es posible minimizar diversas impurezas extrayendo la pasta II+ III a pH 5,0, con los resultados que se proveen en la tabla 12 se demuestra que la extracción a un pH de entre 4,8 y 4,9, con 600 g de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador de extracción, es superior a la extracción a pH bajo, seguida por un ajuste del pH entre 4,8 y 5, 0.
Ejemplo 12 Durante la manufactura, los marcos del filtro prensa y las lineas aferentes y eferentes que lo conectan con los tanques tienen un volumen vacio significativo, que aún está relleno con la suspensión o con el filtrado, antes del comienzo del lavado posterior. Cuando se termina el lavado posterior, este volumen vacio permanece en el filtro prensa. En los protocolos convencionales, este volumen vacio se compensa realizando un lavado con entre uno y dos volúmenes muertos del filtro prensa. Con el fin de determinar si los lavados convencionales posteriores al filtrado permiten obtener una recuperación eficiente de la IgG total,- se llevaron a cabo experimentos usando volúmenes variables del amortiguador de lavado en purificaciones de manufactura de IgG a gran escala. En la figura 1 se ilustra la dependencia de los niveles de IgG residual y de proteínas totales de los volúmenes de lavado posterior (medidos a partir de los volúmenes muertos o vacíos) .
Notablemente, como se observa en la figura 1, un lavado posterior a la filtración usando aproximadamente el doble del volumen muerto del filtro prensa da como resultado una pérdida significativa de la IgG recuperada, ya que la solución de lavado contiene aproximadamente 1,5 gramos de IgG por 1 de solución de lavado. Sorprendentemente, se descubrió que se necesitan 3, 6 veces el volumen muerto del filtro prensa del amortiguador usado para el lavado posterior para obtener una recuperación eficiente de IgG (lo que se indica con una flecha en la figura 1) . No es necesario realizar un lavado posterior con más de 3,6 volúmenes muertos del filtro prensa, ya que esto resultará en la dilución del filtrado, sin una recuperación de IgG adicional.
Ejemplo 13 Durante los pasos de precipitación II+III, se incrementó la concentración de alcohol desde 20 hasta 25% y se redujo la temperatura desde -5°C hasta -7°C. Cuando se disolvió la pasta II+III, se usaron al menos 600 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de volumen para ajusfar el pH del amortiguador para la resuspensión de la pasta II+III, en contraste con la proporción usada con anterioridad, de 510 mi de ácido acético glacial/1000 1 de amortiguador. La proporción de extracción fue de 1+15 con el amortiguador de ácido acético. Para la clarificación, se agregaron entre 0,04 y 0,06 gramos de Aerosil (típicamente en el extremo inferior de este rango, por ejemplo, 0,04 g) por cada gramo de pasta II+III. Para el lavado posterior, se usaron aproximadamente cuatro (4x) volúmenes muertos del filtro prensa del amortiguador empleado para el lavado posterior. Por ejemplo, se usaron 4,3x volúmenes muertos del filtro prensa en un experimento particular, mientras que se usaron 3,6x volúmenes en otro experimento. Los volúmenes muertos del cuádruple o el triple del lavado posterior representaron un incremento respecto de los l,8x volúmenes muertos usados con anterioridad. El amortiguador se ajustó con 150 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, un incremento respecto de los 120 mi de ácido acético glacial/1000 1 de amortiguador usados con anterioridad. Estos cambios resultaron en un rendimiento de IgG 8% mayor y en una ?-globulina con una pureza de al menos 86%. Se hallaron cantidades residuales bajas de IgG en el extracto la torta de filtrado cuando la extracción se realizó con fosfato de sodio 0,1 M + NaCl 150 mM (pH 7,4, conductividad: 25,5 mS/cm) .
Ejemplo 1 A. Optimización del fraccionamiento I: adición del etanol por atomización en comparación con la adición en forma fluida; ajuste del pH en 7,0 ó 7,5 después de agregar el etanol En la tabla 13 se detalla el rendimiento de IgG obtenido con los métodos de manufactura usados en la actualidad y se provee una comparación con la referencia en los experimentos que se describirán más adelante. Se pierde 15-20% de la IgG del lote de Cohn después del filtrado. Se pierden aproximadamente 0,4 g de IgG por litro de plasma en el sobrenadante II+III.
Tabla 13 *plasma LA B5 recuperado de un lote de Cohn: menor concentración de IgG debido al uso de solución salina. Promedio de recuperación del plasma LA Bl del lote de Cohn: 8,52 g/1.
Método El lote de . Cohn se descongeló a 24-27°C durante 6-7 horas en un recipiente de 14 litros. Después, el material se mezcló durante la noche a 2-8°C. Luego se dividió el lote en cuatro partes (de 800 g cada una) : 1: Adición del etanol en forma fluida, seguida por el ajuste del pH en 7,0 2: Adición del etanol en forma fluida, seguida por el ajuste del pH en 7,5 3. Adición del etanol por atomización, seguida por el ajuste del pH en 7,0 4. Adición del etanol por atomización, seguida por el ajuste del pH en 7,5 Todas las partes primero se enfriaron a 0°C. Luego se agregó etanol al 8% en forma fluida a las partes 1 y 2 y por atomización a las partes 3 y 4, usando una cabeza atomizadora. En ambos métodos, se agregó etanol aproximadamente a la misma velocidad. Durante la adición del etanol, el crióstato se ajustó en -5°C y se agregaron 75 mi de etanol a cada parte mientras se mezclaba. El pH se ajustó en 7,0 ó 7,5 con ácido acético 1 M. Luego se incubó la solución durante 1 hora. Después de la incubación, la solución se centrifugó con una centrifuga de mesa (4600 rpm; 30 minutos; -2°C) .
Resultados Los rendimientos de IgG se midieron con un nefelómetro y se detallan en la tabla 14. Con el método mejorado, se obtuvo un rendimiento de IgG de casi 100% en el sobrenadante del fraccionamiento I (etanol por atomización) , mientras que con la adición convencional de etanol, . se perdieron entre 0,2 y 0,25 g/1 de plasma. Estos resultados reflejan que el método mejorado puede resultar en un incremento en el rendimiento de IgG de hasta 0,2 g/1 de plasma en la manufactura.
Tabla 14 B . Escala piloto; fraccionamiento I (atomización en comparación con la forma fluida; ajuste del pH en 7,4 después de agregar el etanol) y fraccionamiento II+III (ajuste del pH en 6,7 antes de agregar el etanol, reajuste en 6,9 después de agregar el etanol) Ejemplo 15 Método Se descongelaron 2,8 kg de plasma mientras se mezclaba a 2°C. Fracción I: se agregó etanol al 8% y se ajustó el pH en 7,4 usando ácido acético 5 M. Mientras se mezclaba, la suspensión se enfrió a una temperatura de -2°C. Las condiciones de la atomización se obtuvieron usando una cabeza atomizadora. En ambos métodos, la adición del etanol y el ácido acético 5 M se realizó aproximadamente a la misma velocidad. Después de incubar durante 1 hora, la solución se centrifugó usando una centrifuga CEPA a una temperatura de -4°C.
Fracciones II+ III: el pH se ajustó en 6,7 usando un amortiguador a pH 4, luego se agregó etanol al 25% (1) por atomización o (2) en forma fluida, de manera convencional. Luego se reajustó el pH en 6,9. La incubación se llevó a cabo durante 10 horas a -7°C.
Resultados La pérdida de IgG durante el tratamiento de las fracciones II+III con etanol al 25% se midió con un nefelómetro y se detalla en la tabla 15. Las mediciones de la IgG presentaron una cierta variación, por lo que se tomó el valor promedio del método optimizado.
Tabla 15 Hasta el punto en el que se precipitaron las fracciones II+III, solamente se habían perdido 0,35 g de IgG/1 de plasma. Se obtuvo un incremento del rendimiento de 0,04 g de IgG por litro de plasma durante el fraccionamiento II+III usando el método de atomización, en comparación con la adición de etanol al 25% en forma fluida, y se obtuvo un incremento del rendimiento de 0,3 g de IgG por litro de plasma (promediado para el rango de entre 0,4 y 0,06 g/1), en comparación con la adición de etanol 20% en forma fluida, lo que constituye el uso actual en la manufactura. El rendimiento de IgG en el filtrado es significativamente mayor que la referencia, y es muy superior al valor de 80-86% que puede alcanzarse actualmente en la manufactura, con la adición de etanol al 20% en forma fluida en la precipitación II+III .
C . Fraccionamiento II+III (etanol al 20%) : se mantiene el pH inicial durante el fraccionamiento II+III completo Ejemplo 16 Método Se descongelaron 50 litros de plasma mientras se mezclaba a 17-20°C durante 27 horas. El fraccionamiento I se realizó como se mencionó en las secciones anteriores, en forma de un proceso optimizado. El sobrenadante I se separó en dos partes: (1) peor caso de ajuste del pH: ajuste del pH antes y después de la adición de etanol, pero no durante el periodo de incubación; (2) ajuste optimizado del pH: ajuste del pH antes y después de la adición de etanol, más otro ajuste del pH durante el periodo de retención. La solución se agitó constantemente durante el período de retención.
El pH del sobrenadante de I se ajustó en ambas. partes en 6,7, antes de agregar etanol usando un amortiguador a pH 4. El etanol se agregó por atomización y el pH se reajustó en 6,9 después de agregar el etanol.
En la parte (1), el ajuste del pH se llevó a cabo con menos cuidado, para simular el peor escenario posible. El pH de la solución se ajustó directamente después de agregar el etanol, pero durante la incubación. En la parte (2), el pH se reajustó en un valor constante de entre 6,8 y 7,0 durante el período de incubación de 10 horas.
Resultados La IgG se midió nuevamente con un nefelómetro, y se detalla en la tabla 16. Mediante el reajuste constante del pH en un valor constante de aproximadamente 6, 9 durante el período de retención, solamente se perdieron 0,13 g de IgG por litro de plasma en comparación con un promedio de 0,4 g/1 de plasma en la manufactura a gran escala. Se alcanzó un incremento del rendimiento de 0,07 g de IgG por litro de plasma en comparación con la referencia (sin la atomización, pero con una agitación constante durante el período de retención) . Se obtuvo un incremento del rendimiento de aproximadamente 0,25 g de IgG por litro de plasma, en comparación con el método convencional usado en la actualidad (que resultó en ' una pérdida de 0,38 g de IgG por litro plasma, véase la tabla 13) .
Tabla 16 Conclusión La pérdida de IgG en el sobrenadante II+III se reduce desde el nivel actual de 0,4 g de IgG/1 de plasma en los lotes de manufactura hasta un nivel de 0,13 g/1 de plasma al realizar la precipitación con etanol al 20%, y hasta un nivel menor que 0,08 g/1 de plasma al realizar la precipitación con etanol al 25%, cuando el etanol se agrega por atomización y cuando se mantiene continuamente un pH de 6,9 ± 0,1 durante la precipitación.
En la precipitación I, la adición de etanol antes del ajuste del pH por atomización da como resultado un incremento en el rendimiento de IgG de entre 0,1 y 0,2 g/1 de plasma en el sobrenadante del fraccionamiento I.
Discusión La IgG se midió con un nefelómetro en todos los experimentos y puede presentar una variación de al menos -/+ 5,0% (como lo indica el fabricante del nefelómetro, Siemens AG) . Entonces, es posible que el rendimiento real obtenido con el método mejorado durante la manufactura pueda ser ligeramente menor o mayor que el indicado en los ejemplos.
Como una prueba adicional del incremento del rendimiento que puede obtenerse con el método novedoso y mejorado, se comparó el peso del precipitado de IgG con el peso promedio del precipitado de IgG obtenido de la misma fuente de plasma en la manufactura. Se obtienen 18 kg del precipitado de IgG por cada 1000 litros de la fuente combinada US de Cohn con el método de manufactura usado actualmente, en contraste con el estudio a escala piloto (sección B anterior), donde se obtuvieron 20,8 kg del precipitado de IgG (con etanol al 20% y con un ajuste optimizado del pH en el fraccionamiento II+III; la adición del amortiguador y del etanol se efectuó por atomización) . Se trata de un incremento de más de 2 kg de precipitado de IgG por cada 1000 litros de la fuente combinada de Cohn.
Ejemplo 17 En este ejemplo se demuestra que la adición de un paso de tratamiento con sílice esfumado antes de la filtración de la suspensión de las fracciones II+III resulta en filtrados con IgG de mayor pureza. En resumen, se fraccionó plasma con bajo contenido de crioprecipitados como se describió con anterioridad, hasta la etapa de las fracciones II+III, momento en el cual se lo separó en dos muestras. La primera muestra se clarificó solamente mediante la adición de un coadyuvante de filtrado, antes de la suspensión convencional del filtrado de las fracciones II+III (figura 7A) . La segunda muestra se sometió a un tratamiento preliminar con sílice esfumado, como se describe en la presente, antes de agregar el coadyuvante de filtrado y realizar la suspensión convencional del filtrado de las fracciones II+III (figura 7B) .
Luego se separaron los componentes proteicos de los filtrados por medio de una electroforesis con acetato de celulosa, y las áreas de los picos se calcularon usando métodos convencionales. Como puede observarse en las cromatografías y en los datos cuantificados, la segunda muestra, que había sido tratada con sílice esfumado antes de la filtración, dio como resultado un filtrado con IgG con una pureza mucho mayor que la muestra no tratada con sílice esfumado (68,8% en comparación con 55,7% de ?-globulina, compárese la tabla 18 con la tabla 16) .
Tabla 17. Cuantificación de los picos de las proteínas, las cuales se separaron por medio de una electroforesis con acetato de celulosa a partir de la suspensión de las fracciones II+III, que había sido clarificada solamente con un coadyuvante de filtrado antes de la filtración, como se ilustra en la figura 7A Tabla 18. Cuantificación de los picos de las proteínas, las cuales se separaron por medio de una electroforesis con acetato de celulosa a partir de la suspensión de las fracciones II+III, que había sido tratada previamente con sílice esfumado y había sido clarificada mediante la adición de un coadyuvante de filtrado antes de la filtración, como se ilustra en la figura 7B Ejemplo 18 En este ejemplo se ¦ ilustra la ultrafiltración y la formulación de una preparación con 20% de IgG apropiada para la administración subcutánea. Esta información se obtuvo durante la producción de preparaciones con 20% de IgG a mayor escala y preclinicas. El proceso usado para manufacturar los lotes de 20% antes del paso de nanofiltración fue como se describió con anterioridad. La ultra/diafiltración se mejoró para concentrar la solución hasta 20%. Con el fin de reducir las pérdidas de rendimiento al mínimo, el lavado posterior del dispositivo de ultrafiltración usado para la diafiltración se concentra con un segundo dispositivo más pequeño equipado con las mismas membranas, y luego se agrega a la solución en lotes.
Sorprendentemente, se demostró que la inactivación del virus durante el almacenamiento a bajo pH no es influida por la concentración de las proteínas en la solución. La reducción de los virus se efectuó de manera similar en la solución al 10% ( GAMMAGARD® LIQUID) y en la solución al 20%. Por lo tanto, el almacenamiento a bajo pH, como un paso para reducir los virus, se mantiene para el producto al 20%.
Antes de la nanofiltración, la concentración de glicina en la solución de IgG se ajusta en el valor deseado: 0,25 M. Luego se concentra la solución por ultrafiltración (UF) hasta obtener una concentración de proteínas de 6 ± 2% p/v. El pH se ajusta en 5,2 ± 0,2. La membrana de UF usada tiene un límite nominal de peso molecular ( MWCO) de 50000 daltons o menos, y está diseñada especialmente para productos de gran viscosidad (por ejemplo, la pantalla V de Millipore) .
Luego se somete el concentrado a una diafiltración contra una solución de glicina 0,25 M, con un pH de 4,2 ± 0,2. El volumen de intercambio mínimo es 10 veces el volumen del concentrado original. Durante la operación de ultrafiltración/diafiltración, la solución se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente 4°C y 20°C.
Después de la diafiltración, la solución se concentra hasta alcanzar una concentración de proteínas de al menos 22% (p/v) . La temperatura de la solución se ajusta entre 2°C y 8°C.
Con el fin de recuperar las proteínas residuales completas en el sistema, el lavado posterior del primer sistema de ultrafiltración mayor se efectúa con al menos el doble del volumen muerto en el modo de recirculación, para asegurar el lavado completo de todas las proteínas. Luego se concentra el lavado posterior del primer sistema de ultrafiltración hasta obtener una concentración de proteínas de al menos 22% p/v, con un segundo sistema de ultra/diafiltración equipado con el mismo tipo de membrana, que tiene un décimo de las dimensiones de la primera. El concentrado del lavado posterior se agrega a la solución en bruto. Después, el segundo sistema de ultrafiltración se somete a un lavado posterior. Este lavado posterior se usa para ajustar la concentración de proteínas de la formulación final. La temperatura de la solución se mantiene aproximadamente entre 2°C y 8°C.
Con el fin de formular la solución final, la concentración de proteínas se ajusta aproximadamente en 20,4 ± 0,4% (p/v) con el lavado posterior del segundo sistema de ultrafiltración menor, y/o con el amortiguador de diafiltración . El pH se ajusta aproximadamente entre 4,4 y 4,9, de ser necesario.
Ha de comprenderse que los ejemplos y las formas de realización que se describen en la presente se proveen solamente con fines ilustrativos, y que, a la luz de dichos ejemplos y formas de formas de realización, aquellos versados en la técnica han de poder sugerir diversas modificaciones y cambios, los cuales quedarán incluidos dentro del espíritu y el alcance de esta solicitud, en función de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, las patentes y las solicitudes de patentes que se citan en la presente se incorporan en la presente a modo de referencia, en su totalidad y para todo propósito.

Claims (58)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar una composición enriquecida en IgG a partir de plasma, CARACTERIZADO PORQUE comprende los siguientes pasos: (a) precipitar una fracción con bajo contenido de crioprecipitados en un primer paso de precipitación, con entre aproximadamente 6% y aproximadamente 10% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5, para obtener un primer precipitado y un primer sobrenadante; (b) precipitar la IgG del primer sobrenadante en un segundo paso de precipitación, con entre aproximadamente 20% y aproximadamente 25% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un segundo precipitado; (c) suspender nuevamente el segundo precipitado para formar una suspensión; (d) precipitar la IgG de la suspensión formada en el paso (c) en un tercer paso de precipitación, con entre aproximadamente 22% y aproximadamente 28% de alcohol, a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3, para formar un tercer precipitado; (e) suspender nuevamente el tercer precipitado para formar una suspensión; y (f) separar la fracción soluble de la suspensión formada en el paso (e) , con lo que se forma una composición enriquecida en IgG, donde al menos uno de los pasos de precipitación, el primero, el segundo o el tercero, comprende la adición del alcohol por atomización.
2. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE los tres pasos de precipitación, el primero, el segundo y el tercero, comprenden la adición del alcohol por atomización .
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE el pH de al menos uno de los pasos de precipitación, el primero, el segundo o el tercero, se alcanza agregando una solución modificadora del pH después de agregar el alcohol.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, CARACTERIZADO PORQUE el pH de los tres pasos de precipitación, el primero, el segundo y el tercero, se alcanza agregando una solución modificadora del pH después de agregar el alcohol.
5. El método de la reivindicación 3 ó 4, CARACTERIZADO PORQUE la adición de una solución modificadora del pH comprende la adición de una solución modificadora del pH por atomización .
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, CARACTERIZADO PORQUE el pH del paso de precipitación se modifica antes y después de la adición del alcohol, durante la adición del alcohol y después de ella, o antes de la adición del alcohol, durante dicha adición y después de ella.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, CARACTERIZADO PORQUE el pH de al menos uno de los pasos de precipitación se mantiene durante dicho paso de precipitación completo, mediante un ajuste continuo del pH.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO PORQUE también comprende un paso de purificación por cromatografía de intercambio iónico.
9. El método de la reivindicación 8, CARACTERIZADO PORQUE comprende un paso de cromatografía de intercambio aniónico y un paso de cromatografía de intercambio catiónico.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, CARACTERIZADO PORQUE también comprende un paso de nanofiltración y/o un paso de ultrafiltración/diafiltración.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, CARACTERIZADO PORQUE la composición enriquecida en IgG obtenida en el paso (f) presenta al menos 85% del contenido de IgG hallado en la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados usada en el paso (a) .
12. El método de la reivindicación 11, CARACTERIZADO PORQUE la composición enriquecida en IgG obtenida en el paso (f) contiene al menos 90% del contenido de IgG hallado en la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados usada en el paso (a) .
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, CARACTERIZADO PORQUE la pureza de las D-globulinas en la composición final de IgG es de al menos aproximadamente 95%.
14. El método de la reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE la pureza de las D-globulinas en la composición final de IgG es de al menos aproximadamente 98%.
15. El método de la reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE la pureza de las D-globulinas en la composición final de IgG es de al menos aproximadamente 99%.
16. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE comprende los siguientes pasos: (a) ajustar el pH de la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados en aproximadamente 7,0; (b) ajustar la concentración de etanol de la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados del paso (a) en aproximadamente 25% (v/v) , a una temperatura de entre aproximadamente -7°C y aproximadamente -9°C, para formar una mezcla; (c) separar el líquido y el precipitado de la mezcla del paso (b) ; (d) suspender nuevamente el precipitado del paso (c) con un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con 600 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con el fin de formar una suspensión; (e) mezclar dióxido de silicio (Si02) finamente dividido con la suspensión del paso (d) durante al menos aproximadamente 30 minutos; (f) filtrar la suspensión con un filtro prensa para formar un filtrado; (g) lavar el filtro prensa con al menos 3 volúmenes muertos del filtro prensa de un amortiguador que contiene fosfato y acetato, donde el pH del amortiguador se ajusta con 150 mi de ácido acético glacial por cada 1000 1 de amortiguador, con lo que se forma una solución de lavado; (h) combinar el filtrado del paso (f) con la solución de lavado del paso (g) , con lo que se forma una solución, y tratar la solución con un detergente; (i) ajustar el pH de la solución del paso (h) en aproximadamente 7,0 y agregar etanol hasta una concentración final de aproximadamente 25%, con lo que se forma una precipitado; (j) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (i) ; (k) disolver el precipitado en una solución acuosa que comprende un solvente o un detergente y mantener la solución durante al menos 60 minutos; (1) después del paso (k) , hacer pasar la solución a través de una columna de cromatografía de intercambio catiónico y eluir las proteínas absorbidas en la columna para obtener una fracción eluida; (m) hacer pasar la fracción eluida del paso (1) a través de una columna de cromatografía de intercambio aniónico para generar un efluente; (n) hacer pasar el efluente del paso ( ) a través de un nanofiltro para generar un nanofiltrado; (o) hacer pasar el nanofiltrado del paso (n) a través de una membrana de ultrafiltración para generar un ultrafiltrado ; y (p) diafiltrar el ultrafiltrado del paso (o) contra un amortiguador de diafiltración para generar un diafiltrado con una concentración de proteínas de entre aproximadamente 8% (p/v) y aproximadamente 12% (p/v) , de manera de obtener una composición de IgG concentrada.
17. El método de la reivindicación 16, CARACTERIZADO PORQUE, en al menos uno de los pasos (b) e (i) , la concentración de etanol se ajusta introduciendo etanol en la fracción por atomización.
18. El método de la reivindicación 16 ó 17, CARACTERIZADO PORQUE, después de agregar el etanol en al menos uno de los pasos (b) e (i), se ajusta el pH hasta alcanzar el pH apropiado.
19. El método de la reivindicación 18, CARACTERIZADO PORQUE el pH se mantiene durante la reacción de precipitación completa, mediante el ajuste continuo del pH en al menos uno de los pasos (b) e (i) .
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, CARACTERIZADO PORQUE el pH se ajusta en al menos un paso mediante la atomización de una solución capaz de ajustar el pH.
21. El método de la reivindicación 20, CARACTERIZADO PORQUE el pH se ajusta atomizando ácido acético glacial.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, CARACTERIZADO- PORQUE también comprende filtrar el diafiltrado a través de un filtro de 0,22 pm- o menos.
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, CARACTERIZADO PORQUE el plasma es plasma humano.
24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, CARACTERIZADO PORQUE la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados se forma con un método que comprende los siguientes pasos: (i) enfriar una mezcla de donaciones de plasma combinadas hasta una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 10°C; (ii) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (i) por centrifugación; (iii) agregar por mezclado etanol en el liquido sobrenadante formado en el paso (ii) hasta alcanzar una concentración final de entre aproximadamente 5% (v/v) y aproximadamente 10% (v/v) de etanol, con lo que se forma una mezcla; (iv) enfriar la mezcla formada en el paso (iii) a entre aproximadamente -4°C y aproximadamente 0°C; (v) separar el liquido y el precipitado de la mezcla del paso (iv) por centrifugación y aislar el sobrenadante, con lo que se forma una fracción de plasma con bajo contenido de' crioprecipitados .
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, CARACTERIZADO PORQUE la temperatura de la mezcla del paso (b) es de aproximadamente -7°C.
26. El método- de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, CARACTERIZADO PORQUE el precipitado formado en el paso (c) se suspende nuevamente con entre aproximadamente 12 1 y aproximadamente 18 1 de amortiguador por kg de precipitado.
27. El método de la reivindicación 26, CARACTERIZADO PORQUE el precipitado se suspende nuevamente con aproximadamente 15 1 de amortiguador por kg de precipitado.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27, CARACTERIZADO PORQUE la cantidad de dióxido de silicio agregado a la suspensión en el paso (e) es de entre aproximadamente 0,02 gramos por gramo del precipitado formado en el paso (c) y aproximadamente 0,06 gramos por gramo del precipitado formado en el paso (c) .
29. El método de la reivindicación 28, CARACTERIZADO PORQUE la cantidad de dióxido de silicio agregado a la suspensión en el paso (e) es de aproximadamente 0,04 gramos por gramo del precipitado formado en el paso (c) .
30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 29, CARACTERIZADO PORQUE a la mezcla se le agrega un coadyuvante de filtrado antes de la filtración en el paso (f ) ·
31. El método de la reivindicación 30, CARACTERIZADO PORQUE el coadyuvante de filtrado comprende tierra de diatomeas.
32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 31, CARACTERIZADO PORQUE la pureza de las D-globulinas en el filtrado formado en el paso (f) es de al menos aproximadamente 85%.
33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 32, CARACTERIZADO PORQUE el filtrado formado en el paso (f) contiene menos de aproximadamente 10 mg de fibrinógeno por gramo de proteínas totales.
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33, CARACTERIZADO PORQUE el filtrado formado en el paso (f) contiene menos de aproximadamente 500 UI de actividad del PKA por gramo de proteínas totales.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 34, CARACTERIZADO PORQUE el detergente usado en el paso (h) comprende entre aproximadamente 0,1% (p/v) y aproximadamente 0,3% (p/v) de polisorbato-80.
36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 35, CARACTERIZADO PORQUE la solución acuosa usada en el paso (k) comprende Triton-X 100, polisorbato-80 y TNBP.
37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 36, CARACTERIZADO PORQUE la solución en el paso (k) se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente 18°C y aproximadamente 25°C.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 38, CARACTERIZADO PORQUE el nanofiltro del paso (n) tiene poros con un tamaño promedio de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 72 nm.
39. El método de la reivindicación 38, CARACTERIZADO PORQUE el nanofiltro tiene poros con un tamaño promedio de entre aproximadamente 19 nm y aproximadamente 35 nm.
40. El método de la reivindicación 39, CARACTERIZADO PORQUE el nanofiltro tiene poros con un tamaño promedio de aproximadamente 35 nm.
41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 40, CARACTERIZADO PORQUE la membrana de ultrafiltración del paso (o) tiene un limite nominal de peso molecular (NM CO) de aproximadamente 100 kDa o ráenos.
42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 41, CARACTERIZADO PORQUE la concentración de proteínas de la composición es de aproximadamente 10% (p/v) .
43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 42, CARACTERIZADO PORQUE la solución formada en el paso (h) contiene al menos aproximadamente 85% de la IgG presente en la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados del paso (a) .
44. El método de la reivindicación 43, CARACTERIZADO PORQUE la solución formada en el paso (h) contiene al menos aproximadamente 90% de la IgG presente en la fracción de plasma con bajo contenido de crioprecipitados del paso (a) .
45. Una composición acuosa de IgG CARACTERIZADA PORQUE ha sido preparada con un método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
46. La composición acuosa de IgG de la reivindicación 45, CARACTERIZADA PORQUE comprende al menos aproximadamente 80 gramos de proteínas por litro de la composición.
47. La composición acuosa de IgG de la reivindicación 45 ó 46, CARACTERIZADA PORQUE al menos 95% de las proteínas son IgG.
48. La composición acuosa de IgG de la reivindicación 47, CARACTERIZADA PORQUE al menos 98% de las proteínas son IgG.
49. La composición acuosa de IgG de cualquiera de las reivindicaciones 45 a 48, CARACTERIZADA PORQUE contiene menos de aproximadamente 35 µg/ml de IgA.
50. Una composición farmacéutica CARACTERIZADA PORQUE comprende una composición acuosa de IgG preparada de acuerdo con un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44.
51. La composición farmacéutica de la reivindicación 50, CARACTERIZADA PORQUE comprende aproximadamente 100 gramos de proteínas por litro de' la composición.
52. La composición farmacéutica de la reivindicación 50 ó 51, CARACTERIZADA PORQUE también comprende glicina en una concentración de entre aproximadamente 200 m y aproximadamente 300 mM.
53. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, CARACTERIZADA PORQUE el pH de la composición es de entre aproximadamente 4,6 y aproximadamente 5,1.
5 . La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 53, CARACTERIZADA PORQUE la osmolaridad de la composición es de entre aproximadamente 240 mOsmol/kg y aproximadamente 300 mOsmol/kg.
55. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 54, CARACTERIZADA PORQUE es estable a temperatura ambiente durante al menos aproximadamente 9 meses.
56. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 55, CARACTERIZADA PORQUE es estable a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C durante al menos aproximadamente 36 meses.
57. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 56, CARACTERIZADA PORQUE se formula para una administración intravenosa.
58. Un método para tratar una inmunodeficiencia, una enfermedad autoinmune o una infección aguda en un ser humano que lo necesita, CARACTERIZADO PORQUE comprende administrar una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 57.
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