PT2445482E - Método para preparar uma composição de igg enriquecida a partir do plasma - Google Patents

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PT2445482E
PT2445482E PT107275398T PT10727539T PT2445482E PT 2445482 E PT2445482 E PT 2445482E PT 107275398 T PT107275398 T PT 107275398T PT 10727539 T PT10727539 T PT 10727539T PT 2445482 E PT2445482 E PT 2445482E
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fraction
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iii
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Wolfgang Teschner
Sonja Svatos
Hans-Peter Schwarz
Azra Pljevljakovic
Leopold Bruckschwaiger
Julia Nürnberger
Harald Arno Butterweck
Thomas Gundinger
Bernhard Koelbl
Reinhard Grausenburger
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Baxter Healthcare Sa
Baxter Int
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Description

1
DESCRIÇÃO
"MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE IGG ENRIQUECIDA A PARTIR DO PLASMA"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Produtos de imunoglobulina de plasma humano foram utilizados por primeira vez em 1952 para tratar a imunodeficiência. Inicialmente, a administração intramuscular ou subcutânea do isotipo G (IgG) de Imunoglobulina eram os métodos de eleição. Para injetar maiores quantidades de IgG necessárias para o tratamento eficaz de várias doenças, contudo, foram desenvolvidos produtos administráveis por via intravenosa com IgG menos concentrada (50 mg/ml). Normalmente a imunoglobulina intravenosa (IGIV) contém agrupadas as imunoglobulinas de imunoglobulina G (IgG) do plasma de mais de mil dadores de sangue. Tipicamente contendo mais do que 95% de IgG não modificada, a qual tem funções efetoras dependentes de Fc intactas, e apenas quantidades vestigiais de imunoglobulina A (IgA) ou imunoglobulina M (IgM), as IGIV são produtos de IgG estéreis, purificados primariamente utilizados no tratamento de três categorias principais de condições médicas: (1) imunodeficiências tais como agamaglobulinémia ligada ao fator X, hipogamaglobulinémia (imunodeficiências primárias) e condições patológicas de imunidade comprometida adquirida (imunodeficiências secundárias), apresentando baixos níveis de anticorpos; (2) doenças inflamatórias e autoimunes e (3) infeções agudas.
Especificamente, muitas pessoas com distúrbios de imunodeficiência primária carecem de anticorpos necessários para resistir a infeção. Em determinados casos estas deficiências podem ser suplementadas através da infusão de IgG purificada, comumente através de administração intravenosa (isto é, terapêutica com IGIV). Vários 2 distúrbios de imunodeficiência primária são comumente tratados dessa forma, incluindo Agamaglobulinémia ligada ao fator X (XLA), Imunodeficiência Comum Variável (CVID), Sindrome de Hiper-IgM (HIM), Imunodeficiência Severa Combinada (SCID), e algumas subclasses de deficiências em IgG (Blaese e Winkelstein, J. Patient & Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson, MD: Immune Deficiency Foundation; 2007) .
Embora o tratamento com IGIV possa ser muito eficaz para gerir distúrbios de imunodeficiência primária, esta terapêutica é apenas uma substituição temporária para anticorpos que não estão a ser produzidos no corpo, em vez de uma cura para a doença. Consequentemente, os pacientes dependentes da terapêutica com IGIV requerem doses repetidas, tipicamente cerca de uma vez por mês, para toda a vida. Esta necessidade coloca uma grande demanda na produção continua de composições de IGIV. Contudo, ao contrário de outras biologias que são produzidas através de expressão in vitro de vetores recombinantes de ADN, a IGIV é fracionada do sangue humano e doações de plasma. Assim, os produtos de IGIV não podem ser aumentados através simplesmente do aumento do volume de produção. Pelo contrário, o nível de IGIV comercialmente disponível é limitado pelo fornecimento disponível de sangue e doações de plasma. Vários fatores movem a demanda de IGIV, incluindo a aceitação de tratamentos por IGIV, a identificação de indicações adicionais para as quais a terapêutica por IGIV é efetiva, e o aumento do diagnóstico de pacientes e prescrição de IGIV. Notavelmente a demanda global de IGIV mais do quadruplicou desde 1990 e continua a aumentar atualmente a uma taxa anual de entre 7% e 10% (Robert P., Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2009) 359-367). Por exemplo, a Autoridade Nacional Australiana do Sangue relatou que a demanda de IGIV na Austrália cresceu em 10,6% 3 para o ano fiscal de 2008-2009 (National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009).
Devido em parte à crescente demanda global e flutuações no fornecimento disponível de produtos de imunoglobulina, vários países, incluindo a Austrália e a Inglaterra, implementaram programas de gestão da demanda para proteger fornecimentos destes produtos para os pacientes de maior demanda durante períodos de escassez dos produtos.
Foi relatado que em 2007, 26, 5 milhões de litros de plasma foram fracionados, gerando 75,2 toneladas métricas de IGIV, com um rendimento médio de produção de 2,8 gramas por litro (Robert P., supra). Este mesmo relatório estimou que se espera que os rendimentos de produção globais de IGIV aumentem para cerca de 3,43 gramas por litro até 2012. No entanto, devido ao crescimento contínuo da demanda global de IGIV, projetada para entre 7% e 13% anualmente entre a atualidade e 2015, uma melhoria adicional do rendimento global de IGIV será necessária para corresponder à demanda global.
Um número de métodos de preparação de IGIV é utilizado por fornecedores comerciais de produtos de IGIV. Um problema comum com os atuais métodos de produção de IGIV consiste na perda substancial de IgG durante o processo de purificação, o qual se estima ser de pelo menos 30% a 35% do conteúdo total em IgG do material de partida. Um desafio consiste em manter a qualidade da inativação virai e ausência de impurezas que podem causar reações adversas, enquanto se reforça o rendimento de IgG. Frente aos atuais níveis de produção de IGIV, aquilo que pode ser considerado como pequenos aumentos no rendimento são de facto altamente significativos. Por exemplo, nos níveis de produção de 2007, um aumento de eficiência de 2%, igual a 56 miligramas por litro adicionais, podia gerar 1,5 toneladas métricas adicionais de IGIV. 4
Os documentos DE 100 08 619, EP 0 893 450 e US 4 550 019 divulgam métodos para o fabrico de composições de imunoglobulina. O mesmo se aplica aos documentos: US 6 150 471 e US 4 499 073; Cammerata-P.B., Cohen-P.P. Fractionation and Properties of Glutamic-Oxalacetic Transaminase. jbc.org. 1981. 53-62. Curling-J-M. Methods of Plasma Protein Fractionation. Academic Press. 1980.
No quarto fascículo de uma série de documentos influentes publicados sobre a preparação e propriedades de proteínas do soro e do plasma, Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475) descreveram pela primeira vez um método para o fracionamento com álcool de proteínas plasmáticas (método 6) , o qual permite o isolamento de uma fração enriquecida em IgG a partir do plasma humano. Vários anos mais tarde, Oncley et al. (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550) expandiu os métodos de Cohn ao publicar um método (método 9) que resultou no isolamento de uma preparação de IgG mais pura.
Estes métodos, embora tenham estabelecido a fundação para uma indústria inteira de fatores sanguíneos derivados do plasma, foram incapazes de proporcionar preparações de IgG que contivessem concentrações suficientemente altas para o tratamento de doenças relacionadas com o sistema imunitário, incluindo a síndrome de Kawasaki, a púrpura trombocitopénica imunológica e deficiências imunitárias primárias. Como tal, metodologias adicionais empregando várias técnicas, tal como a cromatografia de permuta iónica, foram desenvolvidas para proporcionar formulações de pureza e concentração de IgG mais elevadas. Hoppe et al. (Munch Med Wochenschr 1967 (34) : 1749-1752) e Falksveden (Patente Sueca N° 348942) e Falksveden e Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980) estiveram entre os primeiros a empregar a cromatografia de permuta iónica para este propósito. Vários métodos modernos empregam uma etapa de 5 precipitação, tal como precipitação com caprilato (Lebing et ai., Vox Sang 2003 (84):193-201) e precipitação com etanol da Fração de Cohn (1 + ) II + III (Tanaka et ai., Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30) acoplada a cromatografia de coluna. Mais recentemente, Teschner et ai. (Vox Sang, 2007 (92) :42-55) descreveram um método para a produção de um produto com 10% de IGIV no qual o crioprecipitado é primeiramente removido do plasma agrupado e é então realizado um fracionamento com etanol a frio de Cohn-Oncley modificado, seguido de um tratamento com S/D do intermediário, cromatografia de permuta iónica, nanofiltração e opcionalmente ultrafiltração/diafiltração.
Contudo, apesar da pureza melhorada, segurança e rendimento alcançados por estes métodos de fabrico de IgG, uma quantidade significativa de IgG é ainda perdida durante o processo de purificação. Por exemplo, Teshchner et ai. relatam que o seu método resulta num rendimento aumentado de IgG de 65% (Teschner et ai., supra). Como relatado durante várias conferências de produtos plasmáticos, os rendimentos médios da preparação em larga escala de IgG, tal como de Baxter, CSL Behring, Upfront Technology, Cangene, Prometric BioTherapeutics e a Finnish Red Cross, vão desde cerca de 61% a cerca de 65% no recipiente final. Isto representa uma perda de pelo menos cerca de um terço da IgG presente na fração de plasma agrupado durante o processo de fabrico.
Como tal, existe uma necessidade para métodos melhorados e mais eficientes para o fabrico de produtos de IGIV. A presente invenção satisfaz esta e outras necessidades ao proporcionar métodos para o fabrico de IGIV que produzem rendimentos que são pelo menos 6 a 10% mais elevados do que os atualmente alcançáveis, bem como composições de IGIV dai proporcionadas.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Num aspeto, a presente invenção proporciona métodos 6 para preparação de composições de IgG enriquecidas (por exemplo, composições de IGIV) a partir do plasma de acordo com a reivindicação 1. De forma vantajosa, os métodos proporcionados no presente documento proporcionam melhorias significativas sobre os métodos de fabrico do atual estado da técnica para preparação de composições de IGIV. Por exemplo, os métodos proporcionados no presente documento permitem rendimentos de IgG mais elevados na composição final total sem perder a pureza necessária para administração intravenosa.
Num aspeto, um método é proporcionado para preparar uma composição de IgG enriquecida a partir do plasma compreendendo as etapas de (a) precipitar uma fração plasmática pobre em crioprecipitado, numa primeira etapa de precipitação, com álcool a entre cerca de 6% e cerca de 10% a um pH de entre cerca de 7,0 e cerca de 7,5 para obter um primeiro precipitado e um primeiro sobrenadante, (b) precipitar a IgG do primeiro sobrenadante, numa segunda etapa de precipitação, com álcool a entre cerca de 20% e cerca de 25% a um pH de entre cerca 6,7 e cerca de 7,3 para formar um segundo precipitado, (c) ressuspender o segundo precipitado para formar uma suspensão, (d) precipitar a IgG da suspensão formada na etapa (c) , numa terceira etapa de precipitação, com álcool a entre cerca de 22% e cerca de 28% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um terceiro precipitado, (e) ressuspender o terceiro precipitado para formar uma suspensão, e (f) separar a fração solúvel da suspensão formada na etapa (e), formando deste modo uma composição de IgG enriquecida, em que pelo menos uma das primeira etapa de precipitação, segunda etapa de precipitação, ou terceira etapa de precipitação compreende a adição do álcool através pulverização. Numa forma de realização, o álcool é adicionado na primeira etapa de precipitação através de pulverização. Noutra forma de realização, o álcool é adicionado na segunda etapa de 7 precipitação através de pulverização. Ainda noutra forma de realização, o álcool é adicionado na terceira etapa de precipitação através de pulverização.
Em certas formas de realização, o pH de uma ou mais soluções pode ser ajustado pela adição de um agente modificador do pH através de pulverização. Em formas de realização relacionadas, o pH de pelo menos uma das primeira etapa de precipitação, segunda etapa de precipitação, ou terceira etapa de precipitação é alcançado através da adição de uma solução modificadora de pH após a adição do álcool, ou antes de e após a adição de álcool, durante e após a adição de álcool, ou antes de, durante, e após a adição de álcool. Ainda noutra forma de realização relacionada, o pH de uma etapa de precipitação pode ser mantido durante a totalidade da reação de precipitação através do ajuste continuo do pH.
Numa forma de realização especifica, o pH da primeira etapa de precipitação é ajustado após a adição de álcool, através de pulverização de um agente modificador de pH. Noutra forma de realização, o pH da segunda etapa de precipitação é ajustado após a adição de álcool, através de pulverização de um agente modificador de pH. Ainda noutra forma de realização, o pH da terceira etapa de precipitação é ajustado após a adição de álcool, através de pulverização de um agente modificador de pH.
Adicionalmente, os métodos preparatórios proporcionados no presente documento podem compreender ainda uma etapa de cromatografia de permuta iónica (isto é, cromatografia de permuta aniónica e/ou catiónica), uma etapa de nanof iltração, uma etapa de ultrafiltração/diafiltração, ou qualguer outra técnica de purificação adequada para melhorar ainda mais a pureza ou qualidade de preparações de IGIV.
Noutro aspeto, um método é proporcionado para preparação de uma composição de IgG enriquecida a partir do plasma compreendendo as etapas de ajustar o pH de uma fração plasmática pobre em crioprecipitado para igual a ou para cerca de 7,0, (b) ajustar a concentração de etanol da fração plasmática pobre em crioprecipitado da etapa (a) para um valor igual a ou de cerca de 25% (v/v) a uma temperatura entre um valor igual a ou de cerca de -7 °C e igual a ou cerca de -9 °C, formando assim uma mistura, (c) separar liquido e precipitado da mistura da etapa (b), (d) ressuspender o precipitado da etapa (c) com um tampão contendo fosfato ou acetato, em que o pH do tampão é ajustado com um valor igual a ou de cerca de 600 ml de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, formando deste modo uma suspensão, (e) misturar dióxido de silicio (Si02) finamente dividido com a suspensão da etapa (d) durante pelo menos cerca de 30 minutos, (f) filtrar a suspensão com um filtro prensa, formando deste modo um filtrado, (g) lavar o filtro prensa com pelo menos 3 volumes mortos do filtro prensa de um tampão contendo fosfato e acetato, em que o pH do tampão é ajustado com um valor igual a ou de cerca de 150 ml de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, formando deste modo uma solução de lavagem, (h) combinar o filtrado da etapa (f) com a solução de lavagem da etapa (g) , formando deste modo uma solução, e tratar a solução com um detergente, (i) ajustar o pH da solução da etapa (h) para um valor igual a ou de cerca de 7,0 e adicionar etanol até uma concentração final igual a ou de cerca de 25%, formando deste modo um precipitado, (j) separar liquido e precipitado da mistura da etapa (i), (k) dissolver o precipitado numa solução aquosa compreendendo um solvente ou um detergente e manter a solução durante pelo menos 60 minutos, (1) passar a solução após a etapa (k) através de uma coluna de cromatografia de permuta catiónica e eluir as proteínas absorvidas na coluna num eluato, (m) passar o eluato da etapa (1) através de uma coluna de cromatografia de permuta aniónica para gerar um 9 efluente, (n) passar o efluente da etapa (m) através de um nanofiltro para gerar um nanofiltrado, (o) passar o nanofiltrado da etapa (n) através de uma membrana de ultrafiltração para gerar um ultrafiltrado; e (p) diafiltrar o ultrafiltrado da etapa (o) contra um tampão de diafiltração para gerar um diafiltrado contendo uma concentração de proteínas entre cerca de 8% (p/v) e cerca de 12% (p/v) , obtendo assim uma composição de IgG concentrada.
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona composições aquosas de IgG preparadas pelos métodos descritos no presente documento. Geralmente, as composições de IgG têm pureza elevada (por exemplo, pelo menos 95%, 98%, 99%, ou mais de conteúdos de IgG) , contendo concentrações de proteína entre cerca de 20 g/L e cerca de 200 g/L, e contendo níveis extremamente baixos de contaminantes comuns de IGIV, tais como IgG, IgM, Fibrinogénio, Transferrina, ACA, atividade amidolítica, PKA e semelhantes.
Ainda noutro aspeto, composições e formulações farmacêuticas de IgG adequadas para a utilização em terapêuticas com IGIV são proporcionadas. As formulações farmacêuticas de IgG têm pureza elevada (por exemplo, pelo menos 98%, 99%, ou mais de conteúdos de IgG) , contendo concentrações de proteína entre cerca de 20 g/L e cerca de 200 g/L, e contendo níveis extremamente baixos de contaminantes comuns de IGIV, tais como IgG, IgM, Fibrinogénio, Transferrina, ACA, atividade amidolítica, PKA e semelhantes. Geralmente, as composições farmacêuticas são apropriadamente formuladas para administração intravenosa (isto é, para terapêutica com IGIV), administração subcutânea ou administração intramuscular.
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona métodos para o tratamento de uma imunodeficiência, uma doença autoimune, ou infeção aguda num humano com necessidade dos 10 mesmos, o método que compreende a administração de uma composição farmacêutica descrita no presente documento. Exemplos, não limitantes, de doenças e condições que podem ser tratadas ou geridas através dos métodos proporcionados no presente documento incluem transplante de medula óssea alogénico, leucemia linfocitica crónica, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), VIH pediátrico, imunodeficiências primárias, doença de Kawasaki, polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (CIDP), transplante renal com um recetor com anticorpos altos ou com um dador ABO incompatível, síndrome de fadiga crónica, colite por Clostridium difficile, dermatomiosite e polimiosite, oftalmopatia de Graves, síndrome de Guillian-Barré, distrofia muscular, miosite por corpos de inclusão, síndrome de Lambert-Eaton, Lupus eritematoso, neuropatia motora multifocal, esclerose múltipla (EM), miastenia gravis, trombocitopénia aloimune neonatal, infeção por Parvovirus B19, pênfigo, púrpura pós-transfusional, rejeição de transplante renal, aborto espontâneo, síndrome da pessoa rígida, opsoclonia mioclonia, septicémia severa e choque séptico em adultos criticamente doentes, necrólise epidérmica tóxica, leucemia linfocitica crónica, mieloma múltiplo, agamaglobulinémia ligada ao fator X, hipogamaglobulinémia, deficiência imunitária primária, EMSS, doença de Alzheimer e doença de Parkinson.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1: Concentração de IgG conforme determinada por ELISA (A) e métodos nefelométricos (·) e concentração proteica total () presente na Fração II+III da lavagem do filtrado como uma função do número de volumes mortos de tampão utilizados para lavar o dispositivo de filtração após a filtração.
Figura 2: Atividade média da PKA nas frações dissolvidas do Precipitado G depois de extração e clarificação a pH 3,8 a 5,0 através da adição de ácido 11 acético na presença e ausência de tratamento com
Aerosil (dióxido de silício).
Figura 3: Conteúdo médio de fibrinogénio nas frações dissolvidas do Precipitado G depois de extração e clarificação a pH 3,8 a 5,0 através da adição de ácido acético na presença e ausência de tratamento com
Aerosil (dióxido de silício).
Figura 4: Atividade média amidolítica nas frações dissolvidas do Precipitado G depois de extração e clarificação a pH 3,8 a 5,0 através adição de ácido acético na presença e ausência de tratamento com
Aerosil (dióxido de silício).
Figura 5: Atividade amidolítica nas frações dissolvidas do Precipitado G extraídas e clarificadas a pH 3,8 a 7,8 após incubação durante duas semanas a 4 °C (♦) ou durante uma semana adicional a temperatura ambiente () ·
Figura 6: Atividade da PKA nas frações dissolvidas do Precipitado G extraídas e clarificadas a pH 3,8 a 7,8. Figura 7: Diferença na pureza do filtrado da fração II+III modificada com e sem tratamento com sílica fumada. Gráfico de cromatografia da eletroforese em acetato de celulose do filtrado da fração II+III modificada (A) clarificada apenas com um adjuvante de filtração e (B) clarificada após tratamento com sílica fumada.
Figura 8: Desvio de pH de 6,9 do sobrenadante da Fração II+III após adição de álcool de precipitação no fabrico de IgG em larga escala.
Figura 9: Quantidade de ácido acético glacial versus pH no tampão de extração do precipitado da Fração II+III modificada.
Figura 10: Quantidade de ácido acético glacial versus pH no tampão após lavagem do filtro da suspensão da Fração II+III modificada. 12
DEFINIÇÕES
Conforme utilizado no presente documento, um "anticorpo" refere-se a um polipéptido substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulinas, ou fragmentos dos mesmos, os quais especificamente ligam e reconhecem um analito (antigénio). Os genes de imunoglobulinas reconhecidos incluem os genes de região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon e mu, bem como a miríade de genes de imunoglobulinas de regiões variáveis. As cadeias leves são classificadas tanto como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilon, as quais por sua vez definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respetivamente.
Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplar é composta por dois pares de cadeias de polipéptidos, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento antigénico. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leves e pesadas respetivamente.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "ultrafiltração (UF)" engloba uma variedade de métodos de filtração por membrana nos quais a pressão hidrostática força um líquido contra uma membrana semi-permeável. Os sólidos e solutos suspensos de alto peso molecular são retidos, enquanto a água e solutos de baixo peso molecular passam através da membrana. Este processo de separação é normalmente utilizado para purificar e concentrar soluções macromoleculares (103 - 106 Da) , especialmente soluções de proteínas. Um número de membranas de ultrafiltração está disponíveis dependendo do tamanho das moléculas que retêm. A ultrafiltração é tipicamente caracterizada por um poro de 13 membrana entre 1 e 1000 kDa e pressões de operação entre 0,01 e 10 bar, e é particularmente útil para separar colóides como proteínas de pequenas moléculas como açúcares ou sais.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "diafiltração" é realizado com as mesmas membranas da ultrafiltração e é uma filtração de fluxo tangencial. Durante a diafiltração, o tampão é introduzido no tanque de reciclagem enquanto o filtrado é removido da operação da unidade. Nos processos onde o produto está no retentado (por exemplo igG), a diafiltração lava os componentes para fora do agrupamento do produto para o filtrado, trocando assim tampões e reduzindo a concentração de espécies indesejáveis.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "cerca" denota um limite aproximado de mais ou menos 10% de um valor especificado. Por exemplo, a linguagem "cerca de 20%" engloba um limite de 18-22%.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "misturar" descreve um ato de provocar igual distribuição de dois ou mais compostos ou substâncias distintas numa solução ou suspensão através de qualquer forma de agitação. A distribuição igual completa de todos os ingredientes numa solução ou suspensão não é necessária como um resultado de "misturar" conforme o termo é utilizado neste pedido.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "solvente" engloba qualquer substância líquida capaz de dissolver ou dispersar uma ou mais de outras substâncias. Um solvente pode ser inorgânico por natureza, tal como água, ou pode ser um líquido orgânico, tal como o etanol, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, hexano, éter de petróleo, etc.. Conforme utilizado no termo "tratamento com solvente e detergente", solvente denota um solvente orgânico (por exemplo, fosfato tri-N-butílico), o qual faz parte da mistura de solvente e detergente utilizada para 14 inativar vírus com envelope lipídico na solução.
Como utilizado no presente documento, o termo "detergente" é utilizado neste pedido indistintamente com o termo "tensioativo" ou "agente de tensão superficial". Os tensioativos são compostos tipicamente orgânicos que são anfipáticos, isto é, que contêm tanto grupos hidrofóbicos ("caudas") e grupos hidrofílicos ("cabeças"), as quais tornam os tensioativos solúveis tanto em solventes orgânicos como em água. Um tensioativo pode ser classificado pela presença de grupos formalmente carregados na sua cabeça. Um tensioativo não iónico possui grupos sem carga na sua cabeça, enquanto um tensioativo iónico transporta uma carga total na sua cabeça. Um tensioativo zwiteriónico contém uma cabeça com dois grupos carregados de forma oposta. Alguns exemplos de tensioativos comuns incluem: Aniónicos (baseados em aniões de sulfato, sulfonato ou carboxilato): perfluoroctanoato (PFOA ou PFO), perfluoroctanossulfonato (PFOS), dodecil sulfato de sódio (SDS), lauril sulfato de amónio, e outros sais de sulfato de alquilo, lauril sulfato de sódio (também conhecido como lauril éter sulfato de sódio, ou SLES), sulfonato de alquil benzeno; catiónicos (baseados em catiões de amónio quaternário): brometo de cetil trimetilamónio (CTAB) também conhecido como brometo de trimetil amónio hexadecílico, e outros sais de alquiltrimetilamónio, cloreto de cetilpiridínio (CPC), amina de sebo polietoxilado (POEA), cloreto de benzalcónio (BAC), cloreto de benzetónio (BZT) ; ácidos gordos de cadeia longa e os seus sais: incluindo caprilato, ácido caprílico, heptanoato, ácido hexanóico, ácido heptanóico, ácido nanóico, ácido decanóico, e semelhantes; Zwiteriónicos (anfotéricos): dodecil betaína; cocamidopropil betaína; coco anfo glicinato, não iónicos: poli(óxido de etileno)de alquilo, poli(óxido de etileno) de alquilfenol, copolímeros de poli(óxido de etileno) e poli(óxido de propileno) (comercialmente conhecidos como 15
Poloxameros ou Poloxamidas), poliglucósidos de alquilo, incluindo octil glucósido, decil maltósido, alcóois gordos (por exemplo, álcool cetilico e álcool oléico), cocamida MEA, cocamida DEA, polissorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes Triton e óxido de dodecil dimetilamina.
Conforme utilizado no presente documento o termo tratamento com "IgG Intravenosa" ou "IGIV" refere-se geralmente a um método terapêutico de administrar por via intravenosa, subcutânea, ou intramuscular uma composição de imunoglobulinas IgG a um paciente para tratar um número de condições tais como imunodeficiências, doenças inflamatórias e doenças autoimunes. As imunoglobulinas IgG são tipicamente agrupadas e preparadas a partir do plasma. Podem ser utilizados anticorpos completos ou fragmentos. As imunoglobulinas IgG podem ser formuladas em concentrações mais elevadas (por exemplo, maiores que 10%) para administração subcutânea, ou formuladas para administração intramuscular. Isto é particularmente comum para preparações de IgG de especialidade as quais são preparadas com títulos mais altos que a média para antigénios específicos (por exemplo, fator Rho D, toxina da tosse convulsa, toxina do tétano, toxina do botulismo, raiva, etc.). Para facilitar a discussão, tais composições de IgG formuladas para via subcutânea ou intramuscular estão também incluídas no termo "IGIV" neste pedido.
Por "quantidade ou dose terapeuticamente eficaz" ou "quantidade ou dose suficiente/eficaz", entende-se uma dose que produz efeitos para os quais é administrada. A dose exata irá depender do propósito do tratamento, e será verificável por um perito na especialidade utilizando técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); e Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, 16
Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
Conforme utilizado no presente pedido, o termo "pulverizar" refere-se a um meio de entregar uma substância liquida a um sistema, por exemplo, durante uma etapa de precipitação de um álcool, tal como uma etapa de precipitação de fracionamento I ou II+III de Cohn modificado, sob a forma de finas goticulas ou névoa da substância liquida. A pulverização pode ser alcançada por qualquer dispositivo pressurizado, tal como um contentor (por exemplo, um pulverizador), que tenha uma cabeça de pulverização ou um bocal e seja operado manualmente ou automaticamente para gerar uma fina névoa de um liquido. Tipicamente, a pulverização é realizada enquanto o sistema que recebe o liquido é continuamente agitado ou de outra forma, misturado para assegurar uma distribuição rápida e igual do liquido dentro do sistema. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Visão Global
Conforme praticado rotineiramente na medicina moderna, preparações esterilizadas de imunoglobulinas concentradas (especialmente IgGs) são utilizadas para tratar condições médicas que entram dentro de três classes principais: imunodeficiências, doenças inflamatórias e autoimunes e infeções agudas. Um produto de IgG comumente utilizado, a imunoglobulina intravenosa ou IGIV, é formulada para administração intravenosa, por exemplo, a uma concentração igual ou de cerca de 10% de IgG. Imunoglobulinas concentradas podem também ser formuladas para administração subcutânea ou intramuscular, por exemplo, a uma concentração igual ou de cerca de 20% IgG. Para facilitar a discussão, tais composições de IgG formuladas para via subcutânea ou intramuscular estão também incluídas no termo "IGIV" neste pedido.
Em determinados aspetos, a presente invenção proporciona métodos para o fabrico de IGIV que aumentam o 17 rendimento final do produto, enquanto ainda proporcionam composições de IGIV de qualidade igual ou superior e em alguns casos de concentrações mais elevadas. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona métodos de fracionamento de Cohn modificados que reduzem a perda de IgG numa ou mais etapas de precipitação.
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona composições de IgG preparadas de acordo com os métodos de fabrico melhorados proporcionados no presente documento. De forma vantajosa, estas composições são menos dispendiosas de preparar que os produtos comerciais atualmente disponíveis devido ao rendimento melhorado alcançado com os métodos proporcionados no presente documento. Adicionalmente, estas composições são tão puras, senão mais puras, que composições fabricadas utilizando métodos comerciais. De forma importante, estas composições são adequadas para utilização na utilização de terapêutica com IGIV para imunodeficiências, doenças inflamatórias e autoimunes e infeções agudas. Numa forma de realização, a composição de IgG está num valor igual a ou em cerca de 10% de IgG para administração intravenosa. Noutra forma de realização, a composição de IgG está num valor igual a ou em cerca de 20% para administração subcutânea ou intramuscular.
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona composições e formulações farmacêuticas de composições de IgG preparadas de acordo com as metodologias de fabrico melhoradas proporcionadas no presente documento. Em certas formas de realização, estas composições e formulações proporcionam propriedades melhoradas quando comparadas com outras composições de IGIV atualmente no mercado. Por exemplo, em certas formas de realização, as composições e formulações proporcionadas no presente documento são estáveis durante um período de tempo prolongado.
Ainda noutra forma de realização, a presente invenção 18 proporciona um método para tratamento de imunodeficiências, doenças inflamatórias e autoimunes, e infeções agudas compreendendo a administração de uma composição de IgG preparada utilizando os métodos melhorados proporcionados no presente documento.
II. Métodos de Fabrico de IGIV
Geralmente, as preparações de imunoglobulinas de acordo com a presente invenção podem ser preparadas de quaisquer materiais de iniciação adequados, por exemplo, plasma recuperado ou plasma de origem. Num exemplo típico, sangue ou plasma é recolhido de dadores saudáveis. Normalmente, o sangue é recolhido da mesma espécie de animal do sujeito ao qual a preparação de imunoglobulina será administrada (tipicamente referida como imunoglobulinas "homólogas". As imunoglobulinas são isoladas do sangue através de procedimentos adequados, tais como, por exemplo, precipitação (fracionamento com álcool ou fracionamento com polietilenoglicol), métodos de cromatografia (cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, cromatografia de imunoafinidade, etc.) ultracentrifugação, e preparação eletroforética, e semelhantes. (Ver, por exemplo, Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundem et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); Patentes US N° 5.122.373 e 5.177.194; as divulgações das quais são aqui incorporadas como referência na sua totalidade para todos os fins.
Em muitos casos, as imunoglobulinas são preparadas de produtos que contêm gama globulinas produzidos por fracionamento com álcool e/ou cromatografia de permuta iónica e afinidade, métodos bem conhecidos para os peritos na especialidade. Por exemplo, a Fração II de Cohn purificada é comumente utilizada como ponto de partida para o isolamento de imunoglobulinas. A pasta de Fração II de 19
Cohn de iniciação é tipicamente cerca de 95% de IgG e está composta pelos quatro subtipos de IgG. Os diferentes subtipos estão presentes na Fração II aproximadamente, na mesma razão com que são encontrados no plasma humano agrupado do qual são obtidos. A Fração II é ainda mais purificada antes da formulação num produto administrável. Por exemplo, a pasta da Fração II pode ser dissolvida numa solução aquosa purificada de álcool a frio e as impurezas removidas através de precipitação e filtração. A seguir à filtração final, a suspensão de imunoglobulinas pode ser dialisada ou diafiltrada (por exemplo, utilizando membranas de ultrafiltração tendo um limite de massa molecular nominal de menos de ou igual a 100.000 daltons) para remover o álcool. A solução pode ser concentrada ou diluída para obter a concentração de proteínas desejada e pode ser ainda mais purificada por técnicas bem conhecidas para os peritos na especialidade.
Adicionalmente, etapas preparativas adicionais podem ser utilizadas para enriquecer um isotipo ou subtipo particular de imunoglobulina. Por exemplo, a cromatografia de sefarose da proteína A, proteína G ou proteína H pode ser utilizada para enriquecer uma mistura de imunoglobulinas para IgG, ou para subtipos específicos de IgG. Ver geralmente Harlow e Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); e Patente US N° 5.180.810, as divulgações da qual são aqui incorporadas como referência na sua totalidade para qualquer fim.
Ao contrário dos métodos acima descritos, num aspeto a presente invenção proporciona métodos de preparação de composições de IgG concentradas que utilizam um material de iniciação pobre em crioprecipitado. Geralmente, os métodos proporcionados no presente documento utilizam ambas as etapas de fracionamento com álcool de Cohn-Oncley 20 modificado e cromatografia de permuta iónica para proporcionar rendimentos de IgG superiores enquanto mantêm a mesma, senão melhorada, qualidade conforme encontrada nas preparações de IGIV comerciais atualmente disponíveis. Por exemplo, em certas formas de realização são proporcionados métodos que rendem uma composição final total de IgG contendo perto de 75% do conteúdo de IgG encontrado no material de iniciação de plasma bruto. Estes métodos representam pelo menos um aumento de 10% a 12% no rendimento global de IgG acima dos métodos de purificação existentes no estado da técnica. Por exemplo, é estimado que o processo de fabrico do GAMMAGARD® LIQUID proporciona um rendimento final de entre 60% a 65% do conteúdo de IgG encontrado no material de iniciação. Como tal, os métodos proporcionados no presente documento proporcionam uma melhoria significativa sobre as tecnologias de purificação de IgG existentes.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição de IgG purificada que contém pelo menos 70% do conteúdo de IgG encontrado no material de iniciação de plasma bruto. Numa outra forma de realização, é proporcionada uma composição de IgG purificada que contém pelo menos 75% do conteúdo de IgG encontrado no material de iniciação de plasma bruto. Noutras formas de realização, uma composição de IgG purificada proporcionada no presente documento irá conter pelo menos cerca de 65% do conteúdo de IgG encontrado no material de iniciação de plasma bruto, ou pelo menos 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, ou mais do conteúdo de IgG encontrado no material de iniciação de plasma bruto. A. Métodos Modificados de Precipitação com Álcool/Fracionamento por Cromatografia de permuta iónica
Num aspeto, a presente invenção proporciona métodos melhorados para o fabrico de composições de IgG adequadas para utilização em terapêutica com IGIV. Geralmente, estes 21 métodos proporcionam preparações de IgG contendo rendimentos mais elevados e pureza comparável, senão mais elevada, que os atuais métodos empregues para a produção de produtos de IGIV comerciais.
Num aspeto especifico, a presente invenção proporciona um método para preparar uma composição de IgG concentrada a partir do plasma, por exemplo, 10% de IGIV, o método que compreende realizar pelo menos uma etapa de precipitação com álcool e pelo menos uma etapa de cromatograf ia de permuta iónica. Em particular, várias etapas no processo a montante melhorado são diferentes de processos anteriores, por exemplo, a utilização de etanol a 25% a temperaturas mais baixas, a adição de etanol através de pulverização, o ajuste de pH através de pulverização, e a utilização de partículas de sílica finamente divididas.
Numa determinada forma de realização, o método compreende as etapas de (a) precipitar uma fração de plasma pobre em crioprecipitado, numa primeira etapa de precipitação, com álcool entre cerca de 6% e cerca de 10% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para obter um sobrenadante enriquecido em IgG, (b) precipitar IgG do sobrenadante com álcool entre cerca de 20% e cerca de 30% a uma temperatura mais baixa e a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um primeiro precipitado, (c) ressuspender o primeiro precipitado formado na etapa (b) para formar uma suspensão, (d) tratar a suspensão formada na etapa (c) com um detergente, (e) precipitar a IgG da suspensão com álcool entre cerca de 20% e cerca de 30% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um segundo precipitado, (f) ressuspender o segundo precipitado formado na etapa (e) para formar uma suspensão, (g) tratar a suspensão formada na etapa (f) com um solvente e/ou detergente, e (h) realizar pelo menos um fracionamento por cromatografia de permuta iónica preparando assim uma composição de IgG concentrada. Numa forma de realização, o 22 método compreende ainda tratar a suspensão formada na etapa (c) com dióxido de sílica (Si02) finamente dividida e filtrar a solução antes da etapa (d).
Numa forma de realização, um método para preparação de uma composição de IgG concentrada a partir do plasma é proporcionado, o método que compreende as etapas de (a) ajustar o pH de uma fração plasmática pobre em crioprecipitado para cerca de 7,0, (b) ajustar a concentração de etanol da fração plasmática pobre em crioprecipitado da etapa (a) para um valor igual a ou de cerca de 25% (v/v) a uma temperatura entre cerca de -5 °C e cerca de -9 °C, formando assim uma mistura, em que a concentração de etanol pode ser ajustada através de pulverização, (c) separar líquido e precipitado da mistura da etapa (b) , (d) ressuspender o precipitado da etapa (c) com um tampão contendo fosfato ou acetato, em que o pH do tampão é ajustado com entre cerca de 400 e cerca de 700 ml de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, formando deste modo uma suspensão, (e) misturar dióxido de silício (S1O2) finamente dividido com a suspensão da etapa (d) durante pelo menos cerca de 30 minutos, (f) filtrar a suspensão com um filtro prensa, formando deste modo um filtrado, (g) lavar o filtro prensa com pelo menos 3 volumes mortos de filtro prensa de um tampão contendo fosfato e acetato, em que o pH do tampão é ajustado com cerca de 150 ml de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, formando deste modo uma solução de lavagem, (h) combinar o filtrado da etapa (f) com a solução de lavagem da etapa (g) , formando deste modo uma solução, e tratar a solução com um detergente, (i) ajustar o pH da solução da etapa (h) para cerca de 7,0 e adicionar etanol até uma concentração final igual a ou de cerca de 25%, formando deste modo um precipitado, em que a concentração de etanol e/ou pH podem ser ajustados através de pulverização (j) separar líquido e precipitado da mistura da etapa (i), (k) 23 dissolver o precipitado numa solução aquosa compreendendo um solvente ou um detergente e manter a solução durante pelo menos 60 minutos, (1) passar a solução após a etapa (k) através de uma coluna de cromatografia de permuta catiónica e eluir as proteínas absorvidas na coluna num eluato, (m) passar o eluato da etapa (1) através de uma coluna de cromatografia de permuta aniónica para gerar um efluente (isto é, fluxo contínuo), (n) passar o efluente da etapa (m) através de um nanofiltro para gerar um nanofiltrado, (o) passar o nanofiltrado da etapa (n) através de uma membrana de ultrafiltração para gerar um ultrafiltrado; e (p) diafiltrar o ultrafiltrado da etapa (o) contra um tampão de diafiltração para gerar um diafiltrado contendo uma concentração de proteínas entre cerca de 8% (p/v) e cerca de 22% (p/v), obtendo assim uma composição de IgG concentrada. Numa forma de realização, a temperatura da etapa (b) é igual a ou de cerca de -7 °C. Numa forma de realização específica, o tampão de suspensão na etapa (d) é ajustado com cerca de 600 ml de ácido acético glacial.
Em certas formas de realização, o diafiltrado terá uma concentração de proteínas entre cerca de 8% e cerca de 12%, por exemplo, cerca de 8%, ou cerca de 9%, 10%, 11%, ou 12% Numa forma de realização preferida, o diafiltrado terá uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 10%. Noutra forma de realização preferida, o diafiltrado terá uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 11%. Ainda noutra forma de realização preferida, o diafiltrado terá uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 12%. Noutras formas de realização, o diafiltrado terá uma concentração de proteínas entre cerca de 13% e cerca de 17%, por exemplo, cerca de 13%, ou cerca de 14%, 15%, 16%, ou 17% Ainda noutras formas de realização, o diafiltrado terá uma concentração de proteínas entre cerca de 18% e cerca de 22%, por exemplo, cerca de 18%, ou cerca de 19%, 24 20%, 21%, ou 22% Numa forma de realização preferida, o diafiltrado terá uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 20%. Noutra forma de realização preferida, o diafiltrado terá uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 21%. Ainda noutra forma de realização preferida, o diafiltrado terá uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 22%.
Em certas formas de realização da presente invenção, os métodos proporcionados no presente documento podem compreender melhorias em duas ou mais das etapas do processo de fracionamento acima descritas. Por exemplo, formas de realização podem incluir melhorias na primeira etapa de precipitação, na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada, na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada, e/ou na etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Numa forma de realização, a melhoria feita na primeira etapa de precipitação é a adição de álcool através de pulverização. Noutra forma de realização, a melhoria feita na primeira etapa de precipitação é a adição de um agente modificador de pH através de pulverização. Ainda noutra forma de realização, a melhoria feita na primeira etapa de precipitação é o ajuste do pH da primeira solução após adição do álcool. Numa forma de realização relacionada, a melhoria feita na primeira etapa de precipitação é a manutenção do pH durante a adição do álcool. Noutra forma de realização relacionada, a melhoria feita na primeira etapa de precipitação é a manutenção do pH durante o tempo de incubação da precipitação através do ajuste contínuo do pH da solução. Em certas formas de realização, a primeira etapa de precipitação pode ser melhorada através da implementação de mais de uma destas melhorias. Melhorias adicionais que podem ser realizadas nesta etapa serão evidentes da secção proporcionada abaixo que discute a primeira etapa de precipitação - Fracionamento Modificado 25 I. Através da implementação de uma ou mais das melhorias acima descritas, uma reduzida quantidade de IgG é perdida na fração de precipitado da primeira etapa de precipitação e/ou uma fração reduzida de IgG é irreversivelmente desnaturada durante o processo de precipitação.
Numa forma de realização, a melhoria feita na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada é a adição de álcool através de pulverização. Noutra forma de realização, a melhoria feita na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada é a adição de um agente modificador de pH através de pulverização. Ainda noutra forma de realização, a melhoria feita na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada é o ajuste do pH da solução após adição do álcool. Numa forma de realização relacionada, a melhoria feita na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada é a manutenção do pH durante a adição do álcool. Noutra forma de realização relacionada, a melhoria feita na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada é a manutenção do pH durante o tempo de incubação da precipitação através do ajuste continuo do pH da solução. Noutro aspeto, a etapa de precipitação da Fração II+III Modificada é melhorada através do aumento da concentração do álcool para igual a ou para cerca de 25%. Ainda noutra forma de realização, a etapa de precipitação da Fração II+III Modificada é melhorada através da diminuição da temperatura de incubação para entre cerca de -7 °C e -9 °C. Em certas formas de realização, a etapa de precipitação da Fração II+III Modificada pode ser melhorada através da implementação de mais de uma destas melhorias. Ainda mais melhorias que podem ser realizadas nesta etapa serão evidentes da secção proporcionada abaixo a qual discute a segunda etapa de precipitação - Fracionamento II+II Modificado. Através da implementação de uma ou mais das melhorias acima descritas, uma reduzida quantidade de IgG é perdida na fração do sobrenadante da etapa de precipitação da Fração II+III 26
Modificada e/ou uma fração reduzida de IgG é desnaturada de forma irreversível durante a etapa de precipitação.
Numa forma de realização, a melhoria feita na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada é alcançada através do aumento do conteúdo em ácido acético glacial do tampão de dissolução para cerca de 0,06%. Noutra forma de realização, a melhoria feita na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada é alcançada através da manutenção do pH da solução durante o tempo de incubação da dissolução através do ajuste contínuo do pH da solução. Noutra forma de realização, a melhoria realizada na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada é alcançada através da mistura de dióxido de silício (Si02) finamente dividido com a suspensão da Fração II+III antes da filtração. Em determinadas formas de realização, a etapa de dissolução da Fração II+III Modificada pode ser melhorada através da implementação de mais de uma destas melhorias. Ainda mais melhorias que podem ser realizadas nesta etapa serão evidentes da secção proporcionada abaixo a qual discute a segunda etapa de dissolução da Fração II+III Modificada -Extração do Precipitado da Fração II+III Modificada. Ao implementar uma ou mais das melhorias acima descritas, uma quantidade mais elevada de IgG é recuperada na suspensão da Fração II+III e/ou a quantidade de impurezas é reduzida na suspensão da Fração II+III.
Uma forma de realização exemplar feita na etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada é realizada através da pós-lavagem do filtro com pelo menos 3, 6 volumes mortos de tampão de dissolução contendo um valor igual a ou de cerca de 150 ml de ácido acético glacial por 1000 L. Ainda mais melhorias que podem ser realizadas nesta etapa serão evidentes da secção proporcionada abaixo que discute a etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada - Pré-tratamento e Filtração da Suspensão da Fração II+III Modificada. Ao 27 implementar uma ou mais das melhorias acima descritas, uma quantidade reduzida de IgG é perdida durante a etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Numa forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na primeira etapa de precipitação e na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na primeira etapa de precipitação e na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na primeira etapa de precipitação e na etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada e na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada e na etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada e na etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na primeira etapa de precipitação, na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada e na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na primeira etapa de precipitação, na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada e na etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na primeira etapa de precipitação, na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada e na etapa de 28 filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada, na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada e na etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Noutra forma de realização, o método pode compreender uma melhoria em todas a primeira etapa de precipitação, a etapa de precipitação da Fração II+III Modificada, a etapa de dissolução da Fração II+III Modificada e a etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Em determinadas formas de realização, uma melhoria do processo nos métodos de purificação de IgG proporcionados no presente documento compreende a adição através de pulverização de uma ou mais soluções que de outra forma seriam introduzidas numa fração do plasma através de adição fluida. Por exemplo, em determinadas formas de realização a melhoria do processo compreende a adição de álcool (por exemplo, etanol) numa fração do plasma para os propósitos de precipitação de uma ou mais espécies de proteína através de pulverização. Noutras formas de realização, as soluções que podem ser adicionadas a uma fração de plasma através de pulverização incluem, sem limitação, uma solução modificadora do pH, uma solução solvente, uma solução detergente, um tampão de diluição, uma solução modificadora da condutividade e semelhantes. Numa forma de realização preferida, uma ou mais etapas de precipitação com álcool são realizadas através da adição de álcool a uma fração do plasma através de pulverização. Numa segunda forma de realização preferida, uma ou mais das etapas de ajuste de pH são realizadas através da adição de uma solução modificadora do pH a uma fração do plasma através de pulverização.
Em determinadas formas de realização, outra melhoria do processo, a qual pode ser combinada com qualquer outra 29 melhoria do processo, compreende o ajuste do pH de uma fração do plasma a ser precipitada antes e/ou concomitantemente com a adição do agente de precipitação (por exemplo, álcool ou polietilenoglicol). Em algumas formas de realização, uma melhoria do processo é proporcionada na qual o pH de uma fração do plasma a ser ativamente precipitada é mantido ao longo de toda a incubação da precipitação ou etapa de espera através da monitorização e ajuste do pH contínuos. Em formas de realização preferidas o ajuste do pH é realizado pela adição através de pulverização de uma solução modificadora do pH.
Noutras formas de realização, outra melhoria do processo, a qual pode ser combinada com qualquer outra melhoria do processo, compreende a utlização de uma etapa de tratamento com sílica finamente dividida para remover as impurezas. 1. Preparação do Plasma Pobre em Crioprecipitado 0 material de iniciação utilizado para a preparação de composições de IgG concentradas geralmente consiste ou de plasma recuperado (isto é, plasma que foi separado do sangue inteiro ex vivo) ou plasma de origem (isto é, plasma recolhido através de plasmaforese). 0 processo de purificação incia-se tipicamente com a descongelação de plasma agrupado previamente congelado, o qual foi já analisado quanto a considerações de segurança e qualidade. A descongelação é tipicamente levada a cabo a uma temperatura não superior a 6 °C. Após a descongelação completa do plasma congelado a baixa temperatura, a centrifugação é realizada a frio (por exemplo, ^62 °C para separar crioprecipitado sólido do sobrenadante líquido. Alternativamente, a etapa de separação pode ser realizada através de filtração em vez de centrifugação. 0 sobrenadante líquido (também referido como "plasma pobre em crioprecipitado", após remoção de proteínas insolúveis a 30 frio do plasma fresco descongelado através de centrifugação) é então processado na próxima etapa. Várias etapas adicionais podem ser tomadas neste momento para o isolamento da atividade de desvio inibidora do fator 8 (FEIBA), complexo do Fator IX, concentrado do Fator VII, ou complexo da Antitrombina III. 2. Primeiro Evento de Precipitação - Fracionamento I Modificado
Nesta etapa, plasma pobre em crioprecipitado é tipicamente arrefecido até cerca de 0 ± 1 °C e o pH é ajustado para entre cerca de 7,0 e cerca de 7,5, preferentemente entre cerca de 7,1 e cerca de 7,3, mais preferentemente cerca de 7,2. Numa forma de realização, o pH do plasma pobre em crioprecipitado é ajustado para um pH igual a ou de cerca de 7,2. Etanol pré-arrefecido é então adicionado enquanto o plasma é agitado até uma concentração alvo de etanol igual a ou de cerca de 8% v/v. Ao mesmo tempo a temperatura é reduzida ainda mais para entre cerca de -4 e cerca de 0 °C. Numa forma de realização preferida, a temperatura é reduzida até um valor igual a ou de cerca de -2 °C, para precipitar os contaminantes tais como macroglobulina a2, globulinas βιΑ e βι0, fibrinogénio e Fator VIII. Tipicamente, o evento de precipitação irá incluir um tempo de espera de pelo menos cerca de 1 hora, no entanto tempos de espera mais curtos ou mais longos também podem ser empregues. Subsequentemente, o sobrenadante (Sobrenadante I), que contém idealmente a totalidade do conteúdo de IgG presente no plasma pobre em crioprecipitado, é então recolhido por centrifugação, filtração, ou outro método adequado.
Como comparado com métodos convencionais empregues como uma primeira etapa de fracionamento para plasma pobre em crioprecipitado (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), a presente invenção proporciona, em várias formas de realização, métodos que resultam em rendimentos de IgG 31 melhorados na fração de Sobrenadante I. Numa forma de realização, o rendimento melhorado de IgG é alcançado através da adição de álcool através de pulverização. Noutra forma de realização, o rendimento melhorado de IgG é alcançado através da adição de um agente modificador de pH através de pulverização. Ainda noutra forma de realização, o rendimento melhorado de IgG é alcançado através do ajuste de pH da solução após adição do álcool. Numa forma de realização relacionada, o rendimento melhorado de IgG é alcançado através do ajuste de pH da solução durante a adição do álcool.
Num aspeto específico, a melhoria relaciona-se com um método no qual uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de precipitado da primeira etapa de precipitação. Por exemplo, em determinadas formas de realização, uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de precipitado da primeira etapa de precipitação quando comparada com a quantidade de IgG perdida na primeira etapa de precipitação do protocolo do método 6 de Cohn.
Em determinadas formas de realização, a melhoria do processo é realizada através do ajuste do pH da solução para entre cerca de 7,0 e cerca de 7,5 após a adição do álcool de precipitação. Noutras formas de realização, o pH da solução é ajustado para entre cerca de 7,1 e cerca de 7,3 após a adição do álcool de precipitação. Ainda noutra forma de realização, o pH da solução é ajustado para cerca de 7,0 ou cerca de 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5 após a adição do álcool de precipitação. Numa forma de realização particular, o pH da solução é ajustado para cerca de 7,2 após a adição do álcool de precipitação. Como tal, em determinadas formas de realização, uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de precipitado da primeira etapa de precipitação quando comparada com uma etapa de precipitação análoga na qual o pH da solução é ajustado antes mas não após a adição do álcool de precipitação. Numa 32 forma de realização, o pH é mantido no pH desejado durante o tempo de espera da precipitação ou de incubação através do ajuste continuo do pH da solução. Numa forma de realização, o álcool é etanol.
Noutras determinadas formas de realização, a melhoria do processo é realizada através da adição do álcool de precipitação e/ou da solução utilizada para ajustar o pH através de pulverização, em vez de por adição fluida. Como tal, em determinadas formas de realização, uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de precipitado da primeira etapa de precipitação quando comparada com uma etapa de precipitação análoga na qual o álcool e/ou solução utilizada para ajustar o pH é introduzida através de adição fluida. Numa forma de realização, o álcool é etanol.
Ainda noutras determinadas formas de realização, a melhoria é realizada através do ajuste do pH da solução para entre cerca de 7,0 e cerca de 7,5. Numa forma de realização preferida, o pH da solução é ajustado para entre cerca de 7,1 e cerca de 7,3. Noutras formas de realização, o pH da solução é ajustado para valores iguais a ou de cerca de 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, ou 7,5 após a adição do álcool de precipitação e através da adição do álcool de precipitação e/ou da solução utilizada para ajustar o pH através de pulverização, em vez de por adição fluida. Numa forma de realização particular, o pH da solução é ajustado para um valor igual a ou de cerca de 7,2 após a adição do álcool de precipitação e através da adição do álcool de precipitação e/ou da solução utilizada para ajustar o pH através de pulverização, em vez de por adição fluida. Numa forma de realização, o álcool é etanol. 3. Segundo Evento de Precipitação - Fracionamento II+III Modificado
Para enriquecer ainda mais o conteúdo em IgG e a pureza do fracionamento, o Sobrenadante I é sujeito a uma segunda etapa de precipitação, a qual é um fracionamento da 33
Fração II+III de Cohn-Oncley Modificada. Geralmente, o pH da solução é ajustado para um pH entre cerca de 6,6 e cerca de 6,8. Numa forma de realização preferida, o pH da solução é ajustado para um valor igual a ou cerca de 6,7. 0 álcool, preferentemente etanol, é então adicionado à solução enquanto é agitada até uma concentração final de entre cerca de 20% e cerca de 25% (v/v) para precipitar a IgG na fração. Numa forma de realização preferida, o álcool é adicionado até uma concentração final igual a ou de cerca de 25% (v/v) para precipitar a fração de IgG. Geralmente, contaminantes tais como lipoproteina oíi, antitripsina cg, globulinas Gc, glicoproteina oqx, haptoglobina, ceruloplasmina, transferrina, hemopexina, uma fração do fator de Christmas, globulina de ligação à tiroxina, colinesterase, hipertensinogénio, e albumina não serão precipitados através destas condições.
Antes de ou concomitantemente com a adição de álcool, a solução é ainda mais arrefecida para entre cerca de -7 °C e cerca de -9 °C. Numa forma de realização preferida, a solução é arrefecida a uma temperatura igual a ou de cerca de -7 °C. Depois de se completar a adição de álcool, o pH da solução é imediatamente ajustado para entre cerca de 6,8 e cerca de 7,0. Numa forma de realização preferida, o pH da solução é ajustado para um valor igual a ou cerca de 6,9. Tipicamente, o evento de precipitação irá incluir um tempo de espera de pelo menos cerca de 10 horas, no entanto tempos de espera mais curtos ou mais longos também podem ser empregues. Subsequentemente, o precipitado (Fração II+III Modificada), o qual idealmente contém pelo menos cerca de 85%, preferentemente pelo menos cerca de 90%, mais preferentemente pelo menos cerca de 95%, do conteúdo de IgG presente no plasma pobre em crioprecipitado, é separado do sobrenadante através de centrifugação, filtração ou outro método adequado e recolhido. Conforme comparado com métodos convencionais empregues como uma segunda etapa de 34 fracionamento para plasma pobre em crioprecipitado (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), a presente invenção proporciona, em várias formas de realização, métodos que resultam em rendimentos de IgG melhorados no precipitado da Fração II+III Modificada. Numa forma de realização relacionada, a presente invenção proporciona métodos que resultam numa perda de IgG reduzida no sobrenadante II+III Modificado.
Conforme comparado com métodos convencionais empregues como uma segunda etapa de fracionamento para plasma pobre em crioprecipitado (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), a presente invenção proporciona, em várias formas de realização, métodos que resultam em rendimentos de IgG melhorados no precipitado da Fração II+III Modificada. Numa forma de realização, a melhoria é realizada através da adição de álcool através de pulverização. Noutra forma de realização, a melhoria é realizada através da adição de um agente modificador de pH através de pulverização. Noutra forma de realização, a melhoria é realizada através do ajuste de pH da solução após adição do álcool. Numa forma de realização relacionada, a melhoria é realizada através do ajuste de pH da solução durante adição do álcool. Noutra forma de realização, a melhoria é realizada através do aumento da concentração de álcool (por exemplo, etanol) até cerca de 25% (v/v). Noutra forma de realização, a melhoria é realizada através da redução da temperatura da etapa de precipitação até entre cerca de -7 °C e -9 °C. Numa forma de realização preferida, a melhoria é realizada através do aumento da concentração do álcool (por exemplo, etanol) para até cerca de 25% (v/v) e reduzindo a temperatura para entre cerca de -7 °C e -9 °C. Em comparação, ambos Cohn et al. e Oncley et al. realizam a precipitação a -5 °C e Oncley et al. utilizam álcool a 20%, de forma a reduzir o nível de contaminantes no precipitado. De forna vantajosa, os métodos proporcionados no presente documento permitem um 35 rendimento máximo de IgG sem níveis elevados de contaminação no produto final.
Foi descoberto que quando o pH da solução é ajustado para um pH de cerca de 6, 9 antes da adição do álcool de precipitação, o pH da solução desvia-se de 6,9 para entre cerca de 7,4 e cerca de 7,7, devido em parte à precipitação de proteínas (ver, Figura 8) . Conforme o pH da solução desvia-se além de 6,9, a precipitação da IgG torna-se menos favorável e a precipitação de determinados contaminantes torna-se mais favorável. De forma vantajosa, os inventores encontraram que ao ajustar o pH da solução após a adição do álcool de precipitação, uma percentagem mais alta de IgG é recuperada no precipitado da Fração II+III.
De acordo, num aspeto, a melhoria relaciona-se com um método no qual uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de sobrenadante da etapa de precipitação da Fração II+III Modificada. Por outras palavras, uma percentagem mais elevada da IgG de iniciação presente no precipitado da Fração II+III. Em determinadas formas de realização, a melhoria do processo é realizada através do ajuste do pH da solução para entre cerca de 6,7 e cerca de 7,1 imediatamente após ou durante a adição do álcool de precipitação. Noutra forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da manutenção do pH da solução para entre cerca de 6,7 e cerca de 7,1 de forma contínua durante o período de incubação da precipitação. Noutra forma de realização, o pH da solução é ajustado para entre cerca de 6,8 e cerca de 7,0 imediatamente após ou durante a adição do álcool de precipitação, ou para um pH de cerca de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, ou 7,1 imediatamente após ou durante a adição do álcool de precipitação. Numa forma de realização particular, o pH da solução é ajustado para cerca de 6, 9 imediatamente após ou durante a adição do álcool de precipitação. Em determinadas formas de realização, o pH da solução é mantido entre cerca de 6,8 até cerca de 7,0 de 36 forma contínua durante o período de incubação da precipitação, ou a um pH de cerca de 6,9 de forma contínua durante o período de incubação da precipitação. Como tal, em determinadas formas de realização, uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de sobrenadante da segunda etapa de precipitação quando comparada com uma etapa de precipitação análoga na qual o pH da solução é ajustado antes mas não após a adição do álcool de precipitação ou com uma etapa de precipitação análoga na qual o pH da solução não é mantido durante a totalidade do período de incubação da precipitação. Numa forma de realização, o pH é mantido no pH desejado durante o tempo de espera da precipitação ou de incubação através do ajuste contínuo do pH da solução. Numa forma de realização, o álcool é etanol.
Noutra forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da adição do álcool de precipitação e/ou da solução utilizada para ajustar o pH através de pulverização, em vez de por adição fluida. Como tal, em determinadas formas de realização, uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de sobrenadante da segunda etapa de precipitação quando comparada com uma etapa de precipitação análoga na qual o álcool e/ou solução utilizada para ajustar o pH é introduzida através de adição fluida. Numa forma de realização, o álcool é etanol.
Noutra forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da realização da etapa de precipitação a uma temperatura entre cerca de -7 °C e cerca de -9 °C. Numa forma de realização, a etapa de precipitação é realizada a uma temperatura igual a ou de cerca de -7 °C. Noutra forma de realização, a etapa de precipitação é realizada a uma temperatura igual a ou de cerca de -8 °C. Noutra forma de realização, a etapa de precipitação é realizada a uma temperatura igual a ou de cerca de -9 °C. Em determinadas formas de realização, a concentração do álcool da etapa de 37 precipitação está entre cerca de 23% e cerca de 27%. Numa forma de realização preferida, a concentração do álcool está entre cerca de 24% e cerca de 26%. Noutra forma de realização preferida, a concentração do álcool é igual a ou de cerca de 25%. Noutras formas de realização, a concentração de álcool pode ser igual a ou de cerca de 23%, 24%, 25%, 26%, ou 27%. Numa forma de realização particular, a segunda etapa de precipitação é realizada a uma temperatura igual a ou de cerca de -7 °C com uma concentração de álcool igual a ou de cerca de 25%. Numa forma de realização, o álcool é etanol. 0 efeito de aumentar a concentração do álcool da segunda precipitação de 20%, como utilizado em Oncley et ai., supra, para 25% e reduzir a temperatura da incubação de -5 °C, como utilizado nos métodos de Cohn e Oncley, para igual a ou de cerca de -7 °C representa um aumento de 5% a 6% no conteúdo de IgG do precipitado da Fração II+III modificada.
Noutra forma de realização, a melhoria do processo é realizada através do ajuste do pH da solução para entre cerca de 6,7 e cerca de 7,1, preferentemente para igual a ou cerca de 6,9, imediatamente após ou durante a adição do álcool de precipitação, mantendo o pH da solução a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,1, preferentemente para igual a ou cerca de 6,9, através do ajuste continuo do pH durante o periodo de incubação da precipitação, e através da adição do álcool de precipitação e/ou da solução utilizada para ajustar o pH através de pulverização, em vez de por adição fluida. Noutra forma de realização particular, a melhoria do processo é realizada através da realização da etapa de precipitação a uma temperatura entre cerca de -7 °C e cerca de -9 °C, preferentemente igual a ou de cerca de -7 °C e através da precipitação de IgG com uma concentração de álcool de entre cerca de 23% e cerca de 27%, preferentemente igual a ou de cerca de 25%. Noutra 38 forma de realização particular, a melhoria do processo é realizada através da incorporação de todas as melhorias da Fração II+III Modificada proporcionadas acima. Numa forma de realização preferida, a melhoria do processo é realizada através da precipitação de IgG a uma temperatura igual a ou de cerca de -7 °C com etanol a ou a cerca de 25% adicionado através de pulverização e ajustando depois o pH da solução para igual a ou cerca de 6, 9 após a adição do álcool de precipitação. Ainda noutra forma de realização preferida, o pH da solução é mantido igual a ou a cerca de 6,9 durante a totalidade do tempo de espera de incubação da percipitação. 4. Extração do Precipitado da Fração II+III Modificada
De forma a solubilizar o conteúdo de IgG do precipitado da Fração II+III modificada, um tampão de extração a frio é utilizado para ressuspender o precipitado do Fracionamento II+III numa razão típica de 1 parte de precipitado para 15 partes de tampão de extração. Outras razões de ressuspensão adequadas podem ser utilizadas, por exemplo desde cerca de 1:8 até cerca de 1:30, ou desde cerca de 1:10 até cerca de 1:20, ou desde cerca de 1:12 até cerca de 1:18, ou desde cerca de 1:13 até cerca de 1:17, ou desde cerca de 1:14 até cerca de 1:16. Em determinadas formas de realização, a razão de ressuspensão pode ser de cerca de 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, ou mais alta.
Soluções adequadas para a extração do precipitado II+III modificado terão geralmente um pH entre cerca de 4,0 e cerca de 5,5. Em determinadas formas de realização, a solução terá um pH entre cerca de 4,5 e cerca de 5,0, noutras formas de realização, a solução de extração terá um pH de cerca de 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 ou 5,5. Numa forma de realização preferida, o pH do tampão de extração será igual a ou de cerca de 4,5. Noutra forma de realização preferida, 39 ο ρΗ do tampão de extração será igual a ou de cerca de 4,7. Noutra forma de realização preferida, o pH do tampão de extração será igual a ou de cerca de 4,9. Geralmente, estes reguisitos de pH podem ser cumpridos utilizando um agente de tamponamento selecionado de, por exemplo, acetato, citrato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, misturas dos mesmos e semelhantes. Concentrações de tampões adequadas variam tipicamente desde até desde 100 mM, ou desde cerca de 10 até cerca de 50 mM, ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 mM de agente de tamponamento. O tampão de extração terá preferentemente uma condutividade de desde cerca de 0,5 mS · cm-1 até cerca de 2.0 mS·cm 1. Por exemplo, em determinadas formas de realização, a condutividade do tampão de extração será de cerca de 0,5 mS-cirf1, ou cerca de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, ou cerca de 2.0 mS·cm-1. Um perito comum na especialidade saberá como gerar tampões de extração que têm uma condutividade apropriada.
Numa forma de realização particular, um tampão de extração exemplar contém fosfato de sódio monobásico a um valor igual a ou de cerca de 5 mM de acetato a um valor igual a ou de cerca de 5 mM a um pH igual a ou de cerca de 4,5 ± 0,2 e uma condutividade igual a ou de cerca de 0,7 a 0,9 mS/cm.
Geralmente, a extração é realizada a entre cerca de 0 °C e cerca de 10 °C, ou entre cerca de 2 °C e cerca de 8 °C. Em determinadas formas de realização, a extração pode ser realizada a entre 0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, ou 10°C. Numa forma de realização particular, a extração é realizada a entre cerca de 2 °C e cerca de 10 °C. Tipicamente, o processo de extração irá proceder durante entre cerca de 60 e 300 minutos, ou durante entre cerca de 120 e 240 minutos, ou durante entre 40 cerca de 150 e 210 minutos, enquanto a suspensão é agitada de forma continua. Em determinadas formas de realização, o processo de extração irá proceder durante cerca de 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, ou cerca de 300 minutos. Numa forma de realização preferida, o processo de extração irá proceder durante pelo menos 160 minutos com agitação continua.
Foi encontrado que ao empregar um tampão de extração que contém fosfato de sódio monobásico a 5 mM, acetato a 5 mM e ácido acético glacial a 0,051% a 0,06% (v/v), um aumento substancial no aumento de rendimento na composição final de IgG pode ser obtido sem prejudicar a pureza do produto final. A correlação entre a quantidade de ácido acético glacial e pH do tampão de extração é demonstrada na Figura 9. Numa forma de realização preferida, o precipitado da Fração II+III é extraído com uma razão de pasta para tampão igual a ou de cerca de 1:15 a um pH igual a ou de cerca de 4,5 ± 0,2.
De forma vantajosa, foi encontrado que em comparação com o atual processo de fabrico do GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare), o qual emprega um tampão de extração contendo fosfato de sódio monobásico a 5 mM, acetato a 5mM, e ácido acético glacial a 0,051% (v/v), ao aumentar o conteúdo de ácido acético glacial para um valor igual a ou de cerca de 0,06% (v/v), um aumento substancial no aumento de rendimento na composição final de IgG pode ser obtido. Conforme comparado com métodos empregues previamente para a extração do precipitado formado pela segunda etapa de precipitação (GAMMAGARD® LIQUID), a presente invenção proporciona, em várias formas de realização, métodos que resultam em rendimentos de IgG melhorados na suspensão da Fração II+III Modificada.
Num aspeto, a melhoria relaciona-se com um método no qual uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração não 41 solubilizada do precipitado da Fração II+III Modificada. Numa forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da extração do precipitado da Fração II+III Modificada numa razão de 1:15 (precipitado para tampão) com uma solução que contém fosfato de sódio monobásico a 5 mM, acetato a 5 mM e ácido acético glacial a 0,06% (v/v). Noutra forma de realização, a melhoria é realizada através da manutenção do pH da solução ao longo da duração do processo de extração. Numa forma de realização, o pH da solução é mantido entre cerca de 4,1 e cerca de 4,9 ao longo da duração do processo de extração. Numa forma de realização preferida, o pH da solução é mantido entre cerca de 4,2 e cerca de 4,8 ao longo da duração do processo de extração. Numa forma de realização mais preferida, o pH da solução é mantido entre cerca de 4,3 e cerca de 4,7 ao longo da duração do processo de extração. Noutra forma de realização preferida, o pH da solução é mantido entre cerca de 4,4 e cerca de 4,6 ao longo da duração do processo de extração. Ainda noutra forma de realização preferida, o pH da solução é mantido num valor igual a ou de cerca de 4,5 ao longo da duração do processo de extração.
Noutro aspeto, a melhoria relaciona-se com um método no qual uma quantidade aumentada de IgG é solubilizada do precipitado da Fração II+III na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada. Numa forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da solubilização do precipitado da Fração II+III num tampão de dissolução que contém 600 mL de ácido acético glacial por 1000 L. Noutra forma de realização, a melhoria relaciona-se com um método no qual as impurezas são reduzidas depois que a IgG no precipitado da Fração II+III é solubilizada. Numa forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da mistura de dióxido de silício (SiCh) finamente dividido com a suspensão da Fração II+III durante pelo menos 30 42 minutos . 5. Pré-tratamento e Filtração da Suspensão da Fração II+III Modificada
De forma a remover a fração não solubilizada do precipitado da Fração II+III Modificada (isto é, o bolo de filtro da Fração II+III Modificada), a suspensão é filtrada, tipicamente utilizando filtração de profundidade. Filtros de profundidade que podem ser empregues nos métodos proporcionados no presente documento, incluem filtros de profundidade metálicos, de vidro, de cerâmica, orgânicos (tal como terra de diatomáceas) e semelhantes. Exemplos de filtros adequados incluem, sem limitação, filtros Cuno 50SA, Cuno 90SA, e Cuno VR06 (Cuno) . Alternativamente, a etapa de separação pode ser realizada através de centrifugação em vez de por filtração.
Embora as melhorias do processo de fabrico acima descritas minimizem as perdas de IgG nas etapas iniciais do processo de purificação, as impurezas criticas, incluindo atividade da PKA, atividade aminolitica e conteúdo de fibrinogénio, são muito mais elevadas do que quando, por exemplo, a pasta II+III é extraída a um pH de 4,5 ou 4,6, em comparação com quando a extração ocorre a um pH de cerca de 4,9 a 5,0 (ver, Exemplos 2 a 5) .
De forma a neutralizar as impurezas extraídas nos métodos proporcionados no presente documento, foi agora encontrado que a pureza da composição de IgG pode ser bastante melhorada através da adição de uma etapa de pré-tratamento anterior à filtração/centrifugação. Numa forma de realização, esta etapa de pré-tratamento compreende a adição de partículas de dióxido de sílica (por exemplo, sílica fumada, Aerosil®) finamente divididas seguida de um período de incubação de 40 a 80 minutos durante o qual a suspensão é misturada de forma constante. Em determinadas formas de realização, o período de incubação será de entre cerca de 50 minutos e cerca de 70 minutos, ou cerca de 30, 43 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, ou mais minutos. Geralmente, o tratamento será realizado entre cerca de 0 °C e cerca de 10 °C, ou entre cerca de 2 °C e cerca de 8 °C. Em determinadas formas de realização, o tratamento pode ser realizado a cerca de 0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, ou 10°C. Numa forma de realização particular, o tratamento é realizado entre cerca de 2 °C e cerca de 10 °C. O efeito do tratamento com sílica fumada é exemplificado através dos resultados encontrados no Exemplo 17. Neste exemplo, um precipitado da Fração II+III é suspenso e separado em duas amostras, uma das quais é clarificada com adjuvante de filtração apenas antes da filtração (Figura 7A) e uma das quais é tratada com sílica fumada antes da adição do adjuvante de filtração e filtração (Figura 7B). Como pode ser observado nos gráficos de cromatografia e nos dados quantificados, a amostra de filtrado pré-tratada com sílica fumada tinha uma pureza muito mais alta de IgG do que a amostra tratada apenas com o adjuvante de filtração (68,8% vs. 55,7%; comparar os Quadros 17 e 18, respetivamente).
Em determinadas formas de realização, a sílica fumada é adicionada numa concentração entre cerca de 20 g/kg de pasta II + III e cerca de 100 g/Kg de pasta II+III (isto é, para um precipitado da Fração II+III Modificada que é extraído numa razão de 1:15, a sílica fumada deve ser adicionada a uma concentração de cerca de 20 g/16 kg de suspensão II + III até cerca de 100 g/16 kg de suspensão II+III, ou numa concentração final de cerca de 0,125% (p/p) até cerca de 0,625% (p/p)). Em determinadas formas de realização, a sílica fumada pode ser adicionada numa concentração de cerca de 20g/kg de pasta II+III, ou cerca de 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 g/kg de pasta II + III. Numa forma de realização específica, a sílica fumada (por exemplo, Aerosil 380 ou 44 equivalente) é adicionada à suspensão de Fração II+III Modificada até uma concentração final de cerca de 40 g/16 kg de II + III. A mistura acontece a cerca de 2 a 8 °C durante pelo menos 50 a 70 minutos.
Em determinadas formas de realização, o adjuvante de filtração, por exemplo Celpure C300 (Celpure) ou Hyflo-Supper-Cel (World Minerais), será adicionado após o tratamento com dióxido de sílica, para facilitar a filtração de profundidade. 0 adjuvante de filtração pode ser adicionado numa concentração final de desde cerca 0,1 kg/kg de pasta II + III ou cerca de 0,07 Kg/kg de pasta II+III, ou desde cerca de 0,2 kg/kg de pasta II+III até cerca de 0,06 kg/kg de pasta II+III, ou desde cerca de 0,3 kg/kg de pasta II + III até cerca de 0,05 kg/kg de pasta II+III. Em determinadas formas de realização, o adjuvante de filtração pode ser adicionado numa concentração final de cerca de 0,1 kg/kg de pasta II+III, ou cerca de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, ou 0,7 kg/kg de pasta II+III.
Uma fração significativa de IgG estava a ser perdida durante a etapa de filtração do processo de fabrico do GAMMAGARD® LIQUID. Foi encontrado que os atuais métodos de lavagem pós-filtração, utilizando 1,8 volumes mortos de tampão de suspensão para purgar as linhas e armações do filtro prensa, eram insuficientes para a recuperação máxima de IgG nesta etapa. Surpreendentemente, foi encontrado que pelo menos 3,0 volumes mortos, preferentemente 3,6 volumes mortos, de tampão de suspensão eram necessários de forma a conseguir uma recuperação eficaz da IgG total na suspensão clarificada de Fração II+III Modificada (ver, Exemplo 12 e Figura 1) . Em determinadas formas de realização, o filtro prensa pode ser lavado com qualquer tampão de suspensão adequado. Numa forma de realização particular, o tampão de lavagem irá compreender, por exemplo, fosfato de sódio monobásico a 5 mM, acetato a 5 mM e ácido acético glacial a 0, 015% (v/v) . 45
Num aspeto, a melhoria relaciona-se com um método no qual uma quantidade reduzida de IgG é perdida durante a etapa de filtração da suspensão da Fração II+III. Numa forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da pós-lavagem do filtro com pelo menos cerca de 3,6 volumes mortos de tampão de dissolução contendo 150 mL de ácido acético glacial por 1000 L. A relação entre a quantidade de ácido acético glacial e o pH no tampão de pós-lavagem é mostrada na Figura 10. Numa forma de realização, o pH do tampão de extração de pós-lavagem é ajustado para entre cerca de 4,6 e cerca de 5,3. Numa forma de realização preferida, o pH do tampão de extração de pós-lavagem está entre cerca de 4,7 e cerca de 5,2. Noutra forma de realização preferida, o pH do tampão de extração de pós-lavagem está entre cerca de 4,8 e cerca de 5,1. Ainda noutra forma de realização preferida, o pH do tampão de extração de pós-lavagem está entre cerca de 4,9 e cerca de 5,0.
Conforme comparado com métodos empregues previamente para a clarificação da suspensão formada da segunda etapa de precipitação (GAMMAGARD® LIQUID), a presente invenção proporciona, em várias formas de realização, métodos que resultam em rendimentos e pureza de IgG melhorados na suspensão da Fração II+III clarificada. Num aspeto, a melhoria relaciona-se com um método no qual uma quantidade reduzida de IgG é perdida no bolo de filtro da Fração II+III Modificada. Noutro aspeto, a melhoria relaciona-se com um método no qual uma quantidade reduzida de uma impureza é encontrada na suspensão da Fração II+III clarificada.
Numa forma de realização, as melhorias do processo são realizadas através da inclusão de tratamento por sílica fumada antes da filtração ou clarificação centrífuga da suspensão da Fração II+III Modificada. Em determinadas formas de realização, o tratamento com sílica fumada irá 46 incluir adição de desde cerca de 0,1 kg/kg de pasta II+III até cerca de 0,07 kg/kg de pasta II+III, ou desde cerca de 0,2 kg/kg de pasta II+III até cerca de 0,06 kg/kg de pasta II+III, ou desde cerca de 0,3 kg/kg de pasta II+III até cerca de 0,05 kg/kg de pasta II+III, ou cerca de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, ou 0,7 kg/kg pasta II+III, e a mistura será incubada entre durante cerca de 50 minutos e cerca de 70 minutos, ou cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, ou mais minutos a uma temperatura entre cerca de 2°C e cerca de 8°C. Noutra forma de realização, as melhorias do processo são realizadas através da inclusão de um tratamento com sílica fumada o qual reduz os níveis de fibrinogénio residual, atividade aminolítica e/ou atividade ativadora de pré-calicreína.
Noutra forma de realização, as melhorias do processo são realizadas através da lavagem do filtro de profundidade com entre cerca de 3 e 5 volumes do volume morto do filtro depois de se completar a etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada. Em determinadas formas de realização, o filtro será lavado com entre cerca de 3,5 volumes e cerca de 4,5 volumes, ou pelo menos cerca de 2,5, 2, 6, 2,7, 2, 8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3, 6, 3,7, 3, 8, 3,9, 4, C\1 1-1 o 4,3, 4,4, 4,5, 4, 6, 4,7, 4,8, 4, 9, 5, 0 volumes do volume morto do filtro. Numa forma de realização particular, o filtro prensa será lavado com pelo menos cerca de 3,6 volumes mortos de tampão de suspensão. 6. Tratamento Com Detergente
De forma a remover os contaminantes adicionais do filtrado da Fração II+III Modificada, a amostra é seguidamente sujeita a um tratamento com detergente. Métodos para o tratamento com detergente de frações derivadas do plasma são bem conhecidos na técnica. Geralmente, qualquer tratamento com detergente não iónico padrão pode ser utilizado em conjunto com os métodos proporcionados no presente documento. Por exemplo, um 47 protocolo exemplar para um tratamento com detergente é proporcionado abaixo.
De forma breve, polissorbato-80 é adicionado ao filtrado da Fração II+III Modificada numa concentração final de cerca de 0,2% (p/v) com agitação e a amostra é incubada durante pelo menos 30 minutos a uma temperatura entre cerca de 2 a 8 °C. Citrato de sódio desidratado é depois misturado na solução a uma concentração final de cerca de 8 g/L e a amostra é incubada durante 30 minutos adicionais, com agitação continua a uma temperatura entre cerca de 2 a 8 °C.
Em certas formas de realização, qualquer detergente não iónico adeguado pode ser utilizado. Exemplos de detergentes não iónicos adeguados incluem, sem limitação, Octilglucósido, Digitonina, C12E8, Lubrol, Triton X-100, Nonidet P-40, Tween-20 (isto é, polissorbato-20) , Tween-80 (isto é, polissorbato-80), um poli(óxido de etileno) de alquilo, um detergente Brij, um poli(óxido de etileno) de alquilfenol, um poloxamero, octil glucósido, decil maltósido e semelhantes.
Numa forma de realização, uma melhoria do processo é realizada através da adição de reagentes detergentes (por exemplo, polissorbato-80 e citrato de sódio desidratado) através de pulverização em vez de por adição fluida. Noutras formas de realização, os reagentes detergentes podem ser adicionados como sólidos ao filtrado da Fração II+III Modificada enquanto a mistura está a ser misturada para assegurar uma rápida distribuição dos aditivos. Em determinadas formas de realização, é preferível adicionar reagentes sólidos através de aspersão dos sólidos sobre uma área de superfície deslocalizada do filtrado de tal forma que a superconcentração não ocorra, tal como na adição fluida.
7. Terceiro Evento de Precipitação - Precipitação G
De forma a remover várias proteínas pequenas 48 residuais, tais como albumina ou transferrina, uma terceira precipitação é realizada a uma concentração de álcool a 25%. De forma breve, o pH do filtrado II+III tratado com detergente é ajustado para entre cerca de 6,8 e 7,2, preferentemente entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1, mais preferentemente cerca de 7,0 com uma solução modificadora de pH adequada (por exemplo, hidróxido de sódio a 1 M ou ácido acético a 1 M) . Álcool a frio é então adicionado à solução até uma concentração final de cerca de 25% (v/v) e a mistura é incubada enquanto se agita a entre cerca de -6 °C até cerca de -10 °C durante pelo menos 1 hora para formar um terceiro precipitado (isto é, precipitado G) . Numa forma de realização, a mistura é incubada durante pelo menos 2 horas, ou pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mais horas. Numa forma de realização preferida, a mistura é incubada durante pelo menos 2 horas. Numa forma de realização mais preferida, a mistura é incubada durante pelo menos 4 horas. Numa forma de realização ainda mais preferida, a mistura é incubada durante pelo menos 8 horas.
Num aspeto, uma melhoria do processo relaciona-se com um método no qual uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de sobrenadante da terceira etapa de precipitação. Em determinadas formas de realização, a melhoria do processo é realizada através do ajuste do pH da solução para entre cerca de 6,8 e cerca de 7,2 imediatamente após ou durante a adição do álcool de precipitação. Noutra forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da manutenção do pH da solução para entre cerca de 6,8 e cerca de 7,2 de forma continua durante o período de incubação da precipitação. Noutras formas de realização, o pH da solução é ajustado para entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1 imediatamente após ou durante a adição do álcool de precipitação, ou para um pH de cerca de 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, ou 7,2 imediatamente após ou durante a 49 adição do álcool de precipitação. Numa forma de realização particular, o pH da solução é ajustado para cerca de 7,0 imediatamente após ou durante a adição do álcool de precipitação. Em determinadas formas de realização, o pH da solução é mantido entre cerca de 6,9 até cerca de 7,1 de forma continua durante o período de incubação da precipitação, ou a um pH de cerca de 7,0 de forma contínua durante o período de incubação da precipitação. Como tal, em determinadas formas de realização, uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de sobrenadante da terceira etapa de precipitação quando comparada com uma etapa de precipitação análoga na qual o pH da solução é ajustado antes mas não após a adição do álcool de precipitação ou com uma etapa de precipitação análoga na qual o pH da solução não é mantido durante a totalidade do período de incubação da precipitação. Numa forma de realização, o pH é mantido no pH desejado durante o tempo de espera da precipitação ou de incubação através do ajuste contínuo do pH da solução. Numa forma de realização, o álcool é etanol.
Noutra forma de realização, a melhoria do processo é realizada através da adição do álcool de precipitação e/ou da solução utilizada para ajustar o pH através de pulverização, em vez de por adição fluida. Como tal, em determinadas formas de realização, uma quantidade reduzida de IgG é perdida na fração de sobrenadante da terceira etapa de precipitação quando comparada com uma etapa de precipitação análoga na qual o álcool e/ou solução utilizada para ajustar o pH é introduzida através de adição fluida. Numa forma de realização, o álcool é etanol. 8. Suspensão e Filtração do Precipitado G (PptG)
De forma a solubilizar o conteúdo do precipitado G, um tampão de extração a frio é utilizado para ressuspender o PptG. De forma breve, o precipitado G é dissolvido 1 a 3,5 em Água para Injeção (WFI) a entre cerca de 0 °C e cerca de 50 8 °C para alcançar um valor de AU280-320 entre cerca de 40 a 95. O pH final da solução, a qual é agitada durante pelo menos 2 horas, é então ajustado para um valor igual a ou de cerca de 5,2 ± 0,2. Numa forma de realização, este ajuste de pH é realizado com ácido acético a 1 M. Para aumentar a solubilidade da IgG, a condutividade da suspensão é aumentada até entre cerca de 2,5 e cerca de 6,0 mS/cm. Numa forma de realização, a condutividade é aumentada através da adição de cloreto de sódio. A solução de PptG suspensa é então filtrada com um filtro de profundidade adequado tendo um tamanho de poro nominal entre cerca de 0,1 pm e cerca de 0,4 pm de forma a remover quaisquer partículas não dissolvidas. Numa forma de realização, o tamanho de poro nominal do filtro de profundidade é cerca de 0,2 pm (por exemplo, filtro Cuno VR0 6 ou equivalente) para obter um filtrado clarificado. Noutra forma de realização, a solução de PptG suspensa é centrifugada para recuperar um sobrenadante clarificado. A pós-lavagem do filtro é realizada utilizando uma solução de cloreto de sódio com uma condutividade entre cerca de 2,5 e cerca de 6,0 mS/cm. Tipicamente, soluções adequadas para a extração do precipitado G incluem, WFI e tampões de baixa condutividade. Numa forma de realização, um tampão de baixa condutividade tem uma condutividade de menos de cerca de 10 mS/cm. Numa forma de realização preferida, o tampão de baixa condutividade tem uma condutividade de menos de cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 mS/cm. Numa forma de realização preferida, o tampão de baixa condutividade tem uma condutividade de menos de cerca de 6 mS/cm. Noutra forma de realização preferida, o tampão de baixa condutividade tem uma condutividade de menos de cerca de 4 mS/cm. Noutra forma de realização preferida, o tampão de baixa condutividade tem uma condutividade de menos de cerca de 2 mS/cm. 9. Tratamento com Solvente e Detergente 51
De forma a inativar vários contaminantes virais os quais podem estar presentes nos produtos derivados do plasma, o filtrado de PptG clarificado é sujeito em seguida a um tratamento com solvente e detergente (S/D). Métodos para o tratamento com detergente de frações derivadas do plasma são bem conhecidos na técnica (para revisão ver, Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006; 19 (1) :205-42) . Geralmente, qualquer tratamento com S/D padrão pode ser utilizado em conjunto com os métodos proporcionados no presente documento. Por exemplo, um protocolo exemplar para um tratamento com S/D é proporcionado abaixo.
De forma breve, Triton X-100, Tween-20, e tri(n-butil)fosfato (TNBP) são adicionados ao filtrado de PptG clarificado em concentrações finais de cerca de 1.0%, 0.3%, e 0.3%, respetivamente. A mistura é então agitada a uma temperatura entre cerca de 18 °C e cerca de 25 °C durante pelo menos cerca de uma hora.
Numa forma de realização, uma melhoria do processo é realizada através da adição de reagentes S/D (por exemplo, Triton X-100, Tween-20, e TNBP) através de pulverização em vez de por adição fluida. Noutras formas de realização, os reagentes detergentes podem ser adicionados como sólidos ao filtrado PptG clarificado, o qual está a ser misturado para assegurar uma rápida distribuição dos componentes S/D. Em determinadas formas de realização, é preferível adicionar reagentes sólidos através de aspersão dos sólidos sobre uma área de superfície deslocalizada do filtrado de tal forma que a superconcentração não ocorra, tal como na adição fluida. 10. Cromatografia de permuta iónica
De forma a purificar e concentrar ainda mais a IgG do filtrado de PptG tratado com S/D, cromatografia de permuta catiónica e/ou aniónica pode ser empregue. Métodos para purificar e concentrar a IgG utilizando cromatografia de 52 permuta iónica são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a Patente US N° 5.886.154 descreve um método no qual o precipitado da Fração II+III é extraido a um pH baixo (entre cerca de 3,8 e 4,5), seguido de precipitação de IgG utilizando ácido caprílico, e finalmente implementação de duas etapas de cromatografia de permuta aniónica. A Patente US 6.069.236 descreve um esquema de purificação de IgG cromatográfica que não se baseia de todo na precipitação com álcool. A Publicação do PCT N° WO 2005/073252 descreve um método de purificação de IgG envolvendo a extração de um precipitado da Fração II+III, tratamento com ácido caprilico, tratamento com PEG e uma etapa única de cromatografia de permuta aniónica. A Patente US N° 7.186.410 descreve um método de purificação de IgG envolvendo a extração tanto de uma Fração I+II+III ou de um precipitado da Fração II seguida de uma etapa única de permuta aniónica realizada num pH alcalino. A Patente US N° 7.553.938 descreve um método que envolve a extração tanto de uma Fração I+II+III ou de um precipitado da Fração II+III, tratamento com caprilato, e tanto uma ou duas etapas de cromatografia de permuta aniónica. A Patente US N° 6.093.324 descreve um método de purificação que compreende a utilização de uma resina de permuta aniónica macroporosa operada a um pH entre cerca de 6,0 e cerca de 6,6. A Patente US N° 6.835.379 descreve um método de purificação que se baseia na cromatografia de permuta catiónica na ausência de fracionamento com álcool. As divulgações das publicações acima referidas são aqui incorporadas como referência na sua totalidade para qualquer fim.
Numa forma de realização dos métodos da presente invenção, o filtrado PptG tratado com S/D pode ser sujeito a ambas cromatografia de permuta catiónica e cromatografia de permuta aniónica. Por exemplo, numa forma de realização, o filtrado PptG tratado com S/D é passado através de uma 53 coluna de permuta catiónica, a qual liga a IgG na solução. Os reagentes S/D podem então ser lavados da IgG absorvida, a qual é subsequentemente eluída da coluna com um tampão de eluição de pH elevado contendo um pH entre cerca de 8,0 e 9.0. Desta forma, a etapa de cromatografia de permuta catiónica pode ser utilizada para remover os reagentes S/D da preparação, concentrar a solução que contém a IgG, ou ambos. Em determinadas formas de realização, o tampão de eluição terá um pH entre cerca de 8,2 e cerca de 8,8, ou entre cerca de 8,4 e cerca de 8,6, ou um pH de cerca de 8.0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, ou 9,0. Numa forma de realização preferida, o pH do tampão de eluição é cerca de 8,5 ± 0,1.
Em determinadas formas de realização, o eluato da coluna de permuta catiónica pode ser ajustado a um pH mais baixo, por exemplo entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5, e diluído com um tampão apropriado de tal forma que a condutividade da solução seja reduzida. Em determinadas formas de realização, o pH do eluato de permuta catiónica pode ser ajustado a um pH entre cerca de 5,7 e cerca de 6,3, ou entre cerca de 5,9 e cerca de 6,1, ou um pH de cerca de 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, ou 6,5. Numa forma de realização preferida, o pH do eluato é ajustado para um pH de cerca de 6,0 ± 0,1. O eluato é então carregado numa coluna de permuta aniónica, a qual liga vários contaminantes encontrados na preparação. O fluxo contínuo da coluna, contendo a fração de IgG, é recolhido durante o carregamento e lavagem da coluna. Em determinadas formas de realização, as etapas cromatográficas de permuta iónica da presente invenção podem ser realizadas no modo de coluna, modo de lote, ou numa combinação dos dois.
Em determinadas formas de realização, uma melhoria do processo é realizada através da adição da solução utilizada para ajustar o pH através de pulverização, em vez de por 54 adição fluida. 11. Nanofiltração e Ultra/Diafiltração
De forma a reduzir ainda mais a carga virai da composição de IgG proporcionada no presente documento, o efluente da coluna de permuta aniónica pode ser nanofiltrado utilizando um dispositivo de nanofiltração adequado. Em determinadas formas de realização, o dispositivo de nanofiltração terá um tamanho de poro médio entre cerca de 15 nm e cerca de 200 nm. Exemplos de nanofiltros adequados para esta utilização incluem, sem limitação, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP,
Viresolve NFR (Millipore) , Planova 15N, 20N, 35N e 75N (Planova). Numa forma de realização especifica, o nanofiltro pode ter um tamanho médio de poro de entre cerca de 15 nm e cerca de 72 nm, ou entre cerca de 19 nm e cerca de 35 nm, ou de cerca de 15 nm, 19 nm, 35 nm ou 72 nm. Numa forma de realização preferida, o nanofiltro terá um tamanho médio de poro de cerca de 35 nm, tal como um filtro Asahi PLANOVA 35N ou equivalente do mesmo.
Opcionalmente, a ultrafiltração/diafiltração pode ser realizada para concentrar ainda mais o nanofiltrado. Numa forma de realização, uma membrana de canal aberto é utilizada com uma pós-lavagem especificamente concebida e a formulação perto do final do processo de produção torna as composições de IgG resultantes com quase mais do dobro da concentração em proteína (200 mg/mL) quando comparadas com as IGIV do estado da técnica (por exemplo, GAMMAGARD® LIQUID) sem afetar o rendimento e estabilidade de armazenamento. Com a maioria das membranas de ultrafiltração disponíveis uma concentração de 200 mg/mL de IgG não pode ser alcançada sem grandes perdas de proteínas. Estas membranas serão bloqueadas inicialmente e desta forma uma pós-lavagem é difícil de alcançar. Desta forma configurações de membranas de canais abertos têm de ser utilizadas. Mesmo com as membranas de canais abertos, um 55 procedimento de pós-lavagem especialmente desenhado tem de ser utilizado para obter a concentração desejada sem perda significativa de proteína (uma perda de menos de 2%) . Ainda mais surpreendente é o facto de que a concentração mais alta de proteína de 200 mg/mL não afeta a capacidade de inativação de vírus da etapa de armazenamento a baixo pH.
Subsequentemente à nanofiltração, o filtrado pode ser ainda mais concentrado através de ultrafiltração/diafiltração. Numa forma de realização, o nanofiltrado pode ser concentrado através de ultrafiltração até uma concentração de proteína entre cerca de 2% e cerca de 10% (p/v). Em determinadas formas de realização, a ultrafiltração é levada a cabo numa cassete com um ecrã de canais abertos e a membrana de ultrafiltração tem um corte do peso molecular nominal (NMWCO) de menos de cerca de 100 kDa ou menos de cerca de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ou menos kDa. Numa forma de realização preferida, a membrana de ultrafiltração tem uma NMWCO de não mais do que 50 kDa.
Após conclusão da etapa de ultrafiltração, o concentrado pode ser ainda mais concentrado através de diafiltração contra uma solução adequada para administração intravenosa ou intramuscular. Em determinadas formas de realização, a solução de diafiltração pode compreender um agente estabilizante e/ou de tamponamento. Numa forma de realização preferida, o agente estabilizante e de tamponamento é a glicina numa concentração apropriada, por exemplo entre cerca de 0,20 M e cerca de 0,30 M, ou entre cerca de 0,22 M e cerca de 0,28 M, ou entre cerca de 0,24 M e cerca de 0,26 mM, ou numa concentração de cerca de 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, ou 3,0. Numa forma de realização preferida, o tampão de diafiltração contém um valor igual ou de cerca de 0,25 M de glicina.
Tipicamente, o volume de permuta mínimo é pelo menos cerca de 3 vezes o volume de concentrado original ou pelo menos de cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais vezes o volume 56 do concentrado original. A solução de IgG pode ser concentrada até uma concentração de proteína final de entre cerca de 5% e cerca de 25% (p/v), ou entre cerca de 6% e cerca de 18% (p/v), ou entre cerca de 7% e cerca de 16% (p/v), ou entre cerca de 8% e cerca de 14% (p/v), ou entre cerca de 9% e cerca de 12%, ou até uma concentração final de cerca de 5%, ou 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% ou mais elevada. Numa forma de realização, uma concentração de proteína final de pelo menos cerca de 23% é alcançada sem adição da fração pós-lavagem à solução concentrada. Noutra forma de realização, uma concentração de proteína final de pelo menos cerca de 24% é alcançada sem adição da fração de pós-lavagem à solução concentrada, uma concentração de proteína final de pelo menos cerca de 25% é alcançada sem adição da fração de pós-lavagem à solução concentrada. Tipicamente, no final do processo de concentração, o pH da solução estará entre cerca de 4,6 a 5,1.
Numa forma de realização exemplar, o pH da composição de IgG é ajustado para cerca de 4,5 antes da ultrafiltração. A solução é concentrada até uma concentração de proteína de 2% p/v através de ultraf iltração. A membrana de UF tem um corte do peso molecular nominal (NMWCO) de 50.000 Daltons ou menos (membrana Millipore Pelicon de Polieterssulfona). O concentrado é diafiltrado contra dez volumes de uma solução de glicina de 0,25 M, pH 4,5 ± 0,2. Ao longo da operação de ultrafiltração a solução é mantida a uma temperatura entre cerca de 2 °C até cerca de 8 °C. Após a diaf iltração, a solução é concentrada até uma concentração de proteína de pelo menos 11% (p/v). 12. Formulação
Após conclusão da etapa de diafiltração, a concentração de proteína da solução é ajustada com o tampão de diafiltração até uma concentração final de entre cerca 57 de 5% e cerca de 20% (p/v), ou entre cerca de 6% e cerca de 18% (p/v), ou entre cerca de 7% e cerca de 16% (p/v), ou entre cerca de 8% e cerca de 14% (p/v), ou entre cerca de 9% e cerca de 12%, ou até uma concentração final igual a ou de cerca de 5%, ou 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20%. Numa forma de realização preferida, a concentração de proteína final da solução está entre cerca de 9% e cerca de 11%, mais preferentemente cerca de 10%. A solução total formulada é ainda esterilizada através de filtração através de um filtro de membrana com um tamanho de poro absoluto de não mais de cerca de 0,22 micras, por exemplo cerca de 0,2 micras. Depois a solução é dispensada de forma asséptica para dentro de contentores finais para selagem apropriada, com amostras tomadas para testagem.
Numa forma de realização, a composição de IgG é ainda ajustada até uma concentração de cerca de 10,2 ± 0,2% (p/v) com um tampão de diaf iltração. O pH é ajustado para cerca de 4,4 até cerca de 4,9 se necessário. Finalmente, a solução é filtrada estéril e incubada durante 3 semanas a um valor igual a ou de cerca de 30 °C. 13. Adição de Álcool
De forma vantajosa, foi encontrado que, para propósitos de fracionamento de IgG a partir do plasma, a adição de álcool através de pulverização em vez de por adição fluida resulta em rendimentos de perda de IgG reduzidos. Sem estar limitado pela teoria, durante a adição fluida a uma fração do plasma, a superconcentração local transiente do álcool no ingresso de fluido pode levar a desnaturação de proteínas e perda e/ou precipitação irreversível de IgG durante as etapas nas quais a IgG deve permanecer no sobrenadante. Além disso, estes efeitos podem ser amplificados quando se necessitam adicionar grandes volumes de álcool, tal como nas purificações a escala 58 industrial envolvendo o fracionamento de pelo menos 100 L de plasma agrupado. O efeito da adição do álcool através de pulverização é exemplificado no Exemplo 14, no qual amostras de plasma pobre em crioprecipitado são precipitadas com etanol a 8% introduzido seja através de adição fluida (1 ou 2) ou adição através de pulverização (3 e 4) . Conforme pode ser observado no Quadro 14, quase 100% da IgG presente no plasma pobre em crioprecipitado é recuperada no sobrenadante quando o etanol é adicionado à amostra através de pulverização, enquanto 4 a 5% da IgG é perdida aquando
da adição fluida do álcool. Isto resulta numa perda de IgG entre cerca de 0,20 e 0,25 g/L nesta etapa apenas. Em termos de niveis de produção de 2007, isto traduz-se numa perda de cerca de 5,3 milhões de gramas (5.300 quilogramas) de IgG. Dado o atual preço de mercado para a IGIV, o qual vai desde $50 e $100 por grama, uma perda de 4 a 5% nesta etapa representa uma perda económica global de até meio bilião de dólares anualmente.
De acordo, num aspeto dos métodos proporcionados no presente documento, uma ou mais etapas de precipitação são realizadas pela adição do álcool através de pulverização. Em determinadas formas de realização, a adição através de pulverização pode ser realizada através da utilização de qualquer dispositivo pressurizado, tal como um contentor (por exemplo, um pulverizador) , que tenha uma cabeça de pulverização ou um bocal e seja operado manualmente ou automaticamente para gerar uma fina névoa de um liquido. Em determinadas formas de realização, a adição através de pulverização é realizada enquanto o sistema é continuamente agitado ou de outra forma, misturado para assegurar uma distribuição rápida e uniforme do liquido dentro do sistema.
14. Ajuste do pH
Os perfis de precipitação de proteinas das frações do 59 plasma são altamente dependentes do pH da solução da qual as proteínas plasmáticas estão a ser precipitadas. Este facto foi explorado por cientistas fracionando as proteínas plasmáticas desde a introdução dos métodos de Cohn e Oncley em 1946 e 1949, respetivamente. Tradicionalmente, o pH da fração do plasma é ajustado antes da adição do álcool para facilitar os rendimentos de recuperação mais elevados para o componente de interesse. De forma vantajosa, foi agora descoberto que o ajuste do pH da solução diretamente após a adição do álcool ou concomitantemente com a adição do álcool resulta numa precipitação mais definida e reproduzível. Foi descoberto que a adição de etanol a frações do plasma resulta em flutuações do pH da solução, geralmente através do aumento do pH da solução. Como tal, ao ajustar o pH de uma fração do plasma para um pH determinado antes mas não após a adição de álcool, a reação de precipitação irá ocorrer a um pH não ótimo.
Da mesma forma, a precipitação de proteínas de uma fração do plasma irá afetar o ambiente eletrostático e irá assim alterar o pH da solução. De acordo, à medida que é permitido a um evento de precipitação progredir, o pH da solução irá começar a divergir do valor de pH pré-determinado que permite uma recuperação máxima das espécies de proteínas de interesse. Isto é especialmente verdade para eventos de precipitação nos quais uma grande fração da proteína está a ser precipitada, eventos de precipitação nos quais um alto conteúdo de álcool é utilizado e eventos de precipitação que requerem um periodo de incubação longo. 0 efeito do ajuste do pH de uma fração do plasma é exemplificado através dos resultados encontrados no Exemplo 16. Neste exemplo, a IgG foi precipitada de duas amostras de uma fração do Sobrenadante I após adição de um álcool através de pulverização. 0 pH de ambas as amostras foi ajustado para 6,7 antes da adição do álcool e reajustado para 6, 9 após a adição do álcool mas antes da etapa de 60 incubação da precipitação de 10 horas. Na primeira amostra (referência), o pH não foi ajustado durante a incubação de 10 horas, enquanto na amostra dois (ajuste continuo), o pH foi constantemente ajustado para pH igual a 6,9 durante a incubação de 10 horas. Conforme pode ser observado no Quadro 16, após a remoção do precipitado da Fração II+III modificada das amostras, o primeiro sobrenadante continha 0,2 g de IgG/L de plasma, enquanto na segunda amostra, na qual o pH foi mantido constante durante a incubação da precipitação, continha apenas 0,13 g de IgG/ L de plasma. A perda reduzida de 0,07 g de IgG/L de plasma na segunda amostra representa, em termos de níveis de produção de 2007, uma perda de cerca de 1,9 milhões de gramas (1.900 quilogramas) de IgG. Dado o atual preço de mercado para a IGIV, o qual vai desde $50 e $100 por grama, uma perda de 1,5% nesta etapa representa uma perda económica global de até $200 milhões de dólares anualmente.
De acordo, num aspeto dos métodos proporcionados na presente invenção, o pH da fração do plasma é ajustado diretamente após a adição do álcool. Em formas de realização relacionadas, o pH pode ser ajustado antes e depois da adição de álcool, ou durante e depois da adição de álcool, ou antes, durante, e depois da adição de álcool. Numa forma de realização relacionada, o pH de uma solução é ajustado de forma contínua durante um ou mais eventos de precipitação ou incubações. Em determinadas formas de realização, o pH de uma solução é ajustado ou mantido enquanto o sistema é continuamente agitado ou de outra forma, misturado para assegurar uma distribuição igual do agente modificador de pH dentro do sistema.
De forma semelhante ao caso da adição fluida de álcool, foi agora descoberto que a adição fluida de grandes volumes de um agente modificador do pH pode causar variações do pH transientes e locais, resultando na desnaturação ou precipitação indesejável de proteínas. De 61 acordo, numa forma de realização dos métodos proporcionados no presente documento, os agentes modificadores de pH podem ser introduzidos numa ou mais etapas de fracionamento de plasma pela adição através de pulverização. Noutra forma de realização dos métodos proporcionados no presente documento, o pH de uma fração do plasma ou etapa de precipitação pode ser ajustado pela adição através de pulverização de um agente modificador do pH. Em determinadas formas de realização, a adição através de pulverização pode ser realizada através da utilização de gualquer dispositivo pressurizado, tal como um contentor (por exemplo, um pulverizador), que tenha uma cabeça de pulverização ou um bocal e seja operado manualmente ou automaticamente para gerar uma fina névoa de um liquido. Em determinadas formas de realização, a adição através de pulverização é realizada enquanto o sistema é continuamente agitado ou de outra forma, misturado para assegurar uma distribuição rápida e uniforme do liquido dentro do sistema.
III. Composições Concentradas de IgG
As composições de IGIV que compreendem anticorpos completos foram descritas para o tratamento de determinadas condições autoimunes. (Ver, por exemplo, as Publicações de Patentes US N° 2002/0114802, 2003/0099635 e 2002/0098182.)
As composições de IGIV divulgadas nestas referências incluem anticorpos policlonais.
1. Composições Aquosas de IgG
Num aspeto, a presente invenção refere-se a composições aquosas de IgG preparadas pelos métodos proporcionados no presente documento. Geralmente, as composições de IgG preparadas pelos novos métodos descritos no presente documento terão conteúdo de IgG e pureza elevados. Por exemplo, as composições de IgG proporcionadas no presente documento podem ter uma concentração de proteina de pelo menos cerca de 3% (p/v) e um conteúdo de 62
IgG de pureza maior do que cerca de 90%. Estas composições de IgG de elevada pureza são adequadas para administração terapêutica, por exemplo, para terapêutica com IGIV. Numa forma de realização, a concentração de IgG é cerca de 10% e é utilizada para administração intravenosa. Noutra forma de realização, a concentração é cerca de 20% e é utilizada para administração subcutânea ou intramuscular.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição aquosa de IgG preparada através de um método que compreende as etapas de (a) precipitar uma fração de plasma pobre em crioprecipitado, numa primeira etapa de precipitação, com álcool entre cerca de 6% e cerca de 10% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para obter um sobrenadante enriquecido em IgG, (b) precipitar IgG do sobrenadante com álcool entre cerca de 20% e cerca de 30% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um primeiro precipitado, (c) ressuspender o primeiro precipitado formado na etapa (b) para formar uma suspensão, (d) tratar a suspensão formada na etapa (c) com um detergente, (e) precipitar a IgG da suspensão com álcool entre cerca de 20% e cerca de 30% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um segundo precipitado, (f) ressuspender o segundo precipitado formado na etapa (e) para formar uma suspensão, (g) tratar a suspensão formada na etapa (f) com um solvente e/ou detergente, e (h) realizar pelo menos um fracionamento de cromatografia de permuta iónica preparando assim uma composição concentrada de IgG.
Numa forma de realização especifica, uma composição de IgG é proporcionada a qual é preparada por um método que compreende as etapas de (a) ajustar o pH de uma fração plasmática pobre em crioprecipitado para cerca de 7,0, (b) ajustar a concentração de etanol da fração plasmática pobre em crioprecipitado da etapa (a) para cerca de 25% (v/v) a uma temperatura entre cerca de -5 °C e cerca de -9 °C, 63 formando assim uma mistura, (c) separar liquido e precipitado da mistura da etapa (b) , (d) ressuspender o precipitado da etapa (c) com um tampão contendo fosfato ou acetato, em que o pH do tampão é ajustado com 600 ml de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, formando deste modo uma suspensão, (e) misturar dióxido de silicio (Si02) finamente dividido com a suspensão da etapa (d) durante pelo menos cerca de 30 minutos, (f) filtrar a suspensão com um filtro prensa, formando deste modo um filtrado, (g) lavar o filtro prensa com pelo menos 3 volumes mortos de filtro prensa de um tampão contendo fosfato e acetato, em que o pH do tampão é ajustado com 150 ml de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, formando deste modo uma solução de lavagem, (h) combinar o filtrado da etapa (f) com a solução de lavagem da etapa (g) , formando deste modo uma solução, e tratar a solução com um detergente, (i) ajustar o pH da solução da etapa (h) para cerca de 7,0 e adicionar etanol para uma concentração final de cerca de 25%, formando deste modo um precipitado, (j) separar liquido e precipitado da mistura da etapa (i), (k) dissolver o precipitado numa solução aquosa compreendendo um solvente ou um detergente e manter a solução durante pelo menos 60 minutos, (1) passar a solução após a etapa (k) através de uma coluna de cromatografia de permuta catiónica e eluir as proteinas absorvidas na coluna num eluato, (m) passar o eluato da etapa (1) através de uma coluna de cromatografia de permuta aniónica para gerar um efluente, (n) passar o efluente da etapa (m) através de um nanofiltro para gerar um nanofiltrado, (o) passar o nanofiltrado da etapa (n) através de uma membrana de ultrafiltração para gerar um ultrafiltrado; e (p) diafiltrar o ultrafiltrado da etapa (o) contra um tampão de diafiltração para gerar um diafiltrado contendo uma concentração de proteinas entre cerca de 8% (p/v) e cerca de 12% (p/v), obtendo assim uma composição concentrada de 64
IgG.
Em determinadas formas de realização, composições aquosas de IgG são preparadas utilizando um método proporcionado no presente documento que compreende melhorias em duas ou mais das etapas do processo de fracionamento acima descritas. Por exemplo, em determinadas formas de realização as melhorias podem ser encontradas na primeira etapa de precipitação, na etapa de precipitação da Fração II+III Modificada, na etapa de dissolução da Fração II+III Modificada, e/ou na etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Numa forma de realização, é proporcionada uma composição aquosa de IgG a qual é preparada através de um método de purificação descrito no presente documento, em que o método compreende a adição através de pulverização de uma ou mais soluções que de outra forma seriam introduzidas numa fração do plasma através de adição fluida. Por exemplo, em determinadas formas de realização o método irá compreender a introdução do álcool (por exemplo etanol) numa fração do plasma através de pulverização. Noutras formas de realização, as soluções que podem ser adicionadas a uma fração de plasma através de pulverização incluem, sem limitação, uma solução modificadora do pH, uma solução solvente, uma solução detergente, um tampão de diluição, uma solução modificadora da condutividade e semelhantes. Numa forma de realização preferida, uma ou mais etapas de precipitação com álcool são realizadas através da adição de álcool a uma fração do plasma através de pulverização. Numa segunda forma de realização preferida, uma ou mais etapas de ajuste de pH são realizadas através da adição de uma solução modificadora do pH a uma fração do plasma através de pulverização.
Em determinadas formas de realização, é proporcionada uma composição aquosa de IgG a qual é preparada por um método de purificação descrito no presente documento, em 65 que o método compreende o ajuste do pH de uma fração do plasma a ser precipitada antes e/ou concomitantemente com a adição do agente de precipitação (por exemplo, álcool ou polietilenoglicol). Em algumas formas de realização, uma melhoria do processo é proporcionada na qual o pH de uma fração do plasma a ser ativamente precipitada é mantido ao longo de toda a incubação da precipitação ou etapa de espera através da monitorização e ajuste contínuos do pH. Em formas de realização preferidas o ajuste do pH é realizado pela adição através de pulverização de uma solução modificadora do pH.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona composições aquosas de IgG que compreendem uma concentração de proteínas de entre cerca de 30 g/L e cerca de 250 g/L. Em determinadas formas de realização, a concentração de proteínas da composição de IgG está entre cerca de 50 g/L e cerca de 200 g/L, ou entre cerca de 70 g/L e cerca de 150 g/L, ou entre cerca de 90 g/L e cerca de 120 g/L, ou qualquer concentração adequada dentro destes limites, por exemplo cerca de 30 g/L, ou cerca de 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 55 g/L, 60 g/L, 65 g/L, 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85 g/L, 90 g/L, 95 g/L, 100 g/L, 105 g/L, 110 g/L, 115 g/L, 120 g/L, 125 g/L, 130 g/L, 135 g/L, 140 g/L, 145 g/L, 150 g/L, 155 g/L, 160 g/L, 165 g/L, 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, 230 g/L, 235 g/L, 240 g/L, 245 g/L, 250 g/L, ou mais alta. Numa forma de realização preferida, a composição aquosa de IgG terá uma concentração igual a ou de cerca de 10%. Numa forma de realização particularmente preferida, a composição terá uma concentração de 10,2 ± 0,2% (p/v). Noutra forma de realização preferida a composição aquosa de IgG terá uma concentração igual a ou de cerca de 20%. Os métodos proporcionados no presente documento permitem a preparação de composições de IgG tendo níveis muito altos de pureza. 66
Numa forma de realização, pelo menos cerca de 95% da proteína total numa composição proporcionada no presente documento será IgG. Noutras formas de realização, pelo menos cerca de 96% da proteína é IgG, ou pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5%, ou mais da proteína total da composição será IgG. Numa forma de realização preferida, pelo menos 97% da proteína total da composição será IgG. Noutra forma de realização preferida, pelo menos 98% da proteína total da composição será IgG. Noutra forma de realização preferida, pelo menos 99% da proteína total da composição será IgG.
De forma semelhante, os métodos proporcionados no presente documento permitem a preparação de composições de IgG as guais contêm níveis extremamente baixos de agentes contaminantes. Por exemplo, o Quadro 19 proporciona os resultados da testagem de impurezas para três soluções totais de IgG preparadas pelos métodos melhorados proporcionados no presente documento. Em determinadas formas de realização, são proporcionadas composições de IgG que contêm menos do que cerca de 140 mg/L de IgA. Noutras formas de realização, a composição de IgG irá conter menos do que cerca de 60 mg/L de IgA, preferentemente menos do que cerca de 40 mg/L de IgA, ainda mais preferentemente menos do que cerca de 30 mg/L IgA.
Noutra forma de realização, são proporcionadas composições de IgG que contêm menos do que cerca de 50 mg/L de IgM. Noutras formas de realização, a composição de IgG irá conter menos do que cerca de 25 mg/L de IgM, preferentemente menos do que cerca de 10 mg/L de IgM, mais preferentemente menos do que cerca de 5 mg/L IgM, mais preferentemente menos do que cerca de 4 mg/L IgM, mais preferentemente menos do que cerca de 3 mg/ L de IgM, ainda mais preferentemente menos do que 2,5 mg/L de IgM.
Noutra forma de realização, são proporcionadas composições de IgG que contêm menos do que cerca de 100 PL- 67 1 nmol/mL min de atividade amidolitica. Noutras formas de realização, a composição de IgG irá conter menos do que cerca de 50 PL-1 nmol/mL min de atividade amidolitica, preferentemente menos do que cerca de 25 PL-1 nmol/mL min de atividade amidolitica, mais preferentemente menos do que cerca de 20 PL-1 nmol/mL min de atividade amidolitica, mais preferentemente menos do que cerca de 15 PL-1 nmol/mL min de atividade amidolitica, ainda mais preferentemente menos do que cerca de 10 PL-1 nmol/mL min de atividade amidolitica.
Noutra forma de realização, são proporcionadas composições de IgG as quais contêm menos do que cerca de 20 mg/L de fibrinogénio. Noutras formas de realização, a composição de IgG irá conter menos do que cerca de 10 mg/L de fibrinogénio, preferentemente menos do que cerca de 5 mg/L de fibrinogénio, mais preferentemente menos do que cerca de 2,5 mg/L de f ibrinogénio, mais preferentemente menos do que 1 mg/L de fibrinogénio, mais preferentemente menos do que 0,5 mg/L de f ibrinogénio, ainda mais preferentemente menos do que 0,25 mg/L de fibrinogénio.
Ainda noutra forma de realização, são proporcionadas composições de IgG as quais consistem primariamente de monómeros/dimeros de IgG. Numa forma de realização, é proporcionada uma composição de IgG na qual pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, ou 99,9% da IgG é monomérica ou dimérica. Numa forma de realização preferida, é proporcionada uma composição de IgG na qual pelo menos 97% da IgG é monomérica ou dimérica. Numa forma de realização mais preferida, pelo menos 99% da IgG é monomérica ou dimérica. Numa forma de realização mais preferida, pelo menos 99,5% da IgG é monomérica ou dimérica. Numa forma de realização mais preferida, pelo menos 99,7% da IgG é monomérica ou dimérica. 2. Composições Farmacêuticas 68
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona composições e formulações farmacêuticas que compreendem IgG purificada preparada através dos métodos proporcionados no presente documento. Geralmente, as composições e formulações farmacêuticas de IgG preparadas pelos novos métodos descritos no presente documento terão conteúdo e pureza de IgG elevados. Por exemplo, as composições e formulações farmacêuticas de IgG proporcionadas no presente documento podem ter uma concentração de proteína de pelo menos cerca de 7% (p/v) e um conteúdo de IgG de pureza maior do que cerca de 95%. Estas composições e formulações de IgG de elevada pureza são adequadas para administração terapêutica, por exemplo, para terapêutica com IGIV. Numa forma de realização preferida, uma composição farmacêutica de IgG é formulada para administração intravenosa (por exemplo, terapêutica com IGIV).
Numa forma de realização, as composições farmacêuticas proporcionadas no presente documento são preparadas através da formulação de uma composição aquosa de IgG isolada utilizando um método proporcionado no presente documento. Geralmente, a composição formulada terá de ser sujeita a pelo menos uma, preferentemente pelo menos duas, ainda mais preferentemente pelo menos três, etapas de inativação ou remoção virai. Exemplos não limitantes de etapas de inativação ou remoção virai que podem ser empregues com os métodos proporcionados no presente documento incluem, tratamento com solvente e detergente (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 e Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, ambos os quais são aqui expressamente incorporados como referência na sua totalidade para qualquer fim), nanofiltração (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 e Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, ambos os quais são aqui expressamente incorporados como referência na sua totalidade para qualquer fim), e incubação a baixo pH a 69 altas temperaturas (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 e Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19).
Em determinadas formas de realização, formulações farmacêuticas são proporcionadas tendo um conteúdo de IgG entre cerca de 80 g/L de IgG e cerca de 120 g/L de IgG. Geralmente, estas formulações de IGIV são preparadas através do isolamento de uma composição de IgG a partir do plasma utilizando um método descrito no presente documento, concentração da composição, e formulação da composição concentrada numa solução adeguada para administração intravenosa. As composições de IgG podem ser concentradas utilizando qualquer método adequado conhecido para um perito na especialidade. Numa forma de realização, a composição é concentrada através de ultrafiltração/diafiltração. Em algumas formas de realização, o dispositivo de ultrafiltração utilizado para concentrar a composição irá empregar uma membrana de ultrafiltração tendo um corte do peso molecular nominal (NMWCO) de menos de cerca de 100 kDa ou menos de cerca de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ou menos kDa. Numa forma de realização preferida, a membrana de ultrafiltração tem uma NMWCO de não mais do que 50 kDa. A permuta de tampão pode ser alcançada utilizando qualquer técnica adequado conhecido para um perito na especialidade. Numa forma de realização específica, a permuta de tampão é alcançada através de diafiltração.
Numa forma de realização específica, é proporcionada uma composição farmacêutica de IgG, em que a composição de IgG foi purificada a partir do plasma utilizando um método que compreende as etapas de (a) precipitar uma fração de plasma pobre em crioprecipitado, numa primeira etapa de precipitação, com álcool entre cerca de 6% e cerca de 10% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para obter um sobrenadante enriquecido em IgG, (b) precipitar IgG do sobrenadante com álcool entre cerca de 20% e cerca de 30% a 70 uma temperatura mais baixa e a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um primeiro precipitado, (c) ressuspender o primeiro precipitado formado na etapa (b) para formar uma suspensão, (d) tratar a suspensão formada na etapa (c) com um detergente, (e) precipitar a IgG da suspensão com álcool entre cerca de 20% e cerca de 30% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um segundo precipitado, (f) ressuspender o segundo precipitado formado na etapa (e) para formar uma suspensão, (g) tratar a suspensão formada na etapa (f) com um solvente e/ou detergente, (h) realizar pelo menos um fracionamento de cromatografia de permuta iónica; (i) realizar um tratamento com solvente e detergente, preparando assim uma composição de IgG.
Numa forma de realização especifica, é proporcionada uma composição farmacêutica de IgG, em que a composição de IgG foi purificada a partir do plasma utilizando um método que compreende as etapas de (a) ajustar o pH de uma fração plasmática pobre em crioprecipitado para cerca de 7,0, (b) ajustar a concentração de etanol da fração plasmática pobre em crioprecipitado da etapa (a) para cerca de 25% (v/v) a uma temperatura entre cerca de -5 °C e cerca de -9 °C, formando assim uma mistura, (c) separar liquido e precipitado da mistura da etapa (b) , (d) ressuspender o precipitado da etapa (c) com um tampão contendo fosfato ou acetato, em que o pH do tampão é ajustado com 600 ml de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, formando deste modo uma suspensão, (e) misturando dióxido de silício (Si02) finamente dividido com a suspensão da etapa (d) durante pelo menos cerca de 30 minutos, (f) filtrar a suspensão com um filtro prensa, formando deste modo um filtrado, (g) lavar o filtro prensa com pelo menos 3 volumes mortos de tampão de filtro prensa contendo fosfato e acetato, em que o pH do tampão é ajustado com 150 ml de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, formando deste 71 modo uma solução de lavagem, (h) combinar o filtrado da etapa (f) com a solução de lavagem da etapa (g) , formando deste modo uma solução, e tratar a solução com um detergente, (i) ajustar o pH da solução da etapa (h) para cerca de 7,0 e adicionar etanol para uma concentração final de cerca de 25%, formando deste modo um precipitado, (j) separar liquido e precipitado da mistura da etapa (i), (k) dissolver o precipitado numa solução aquosa compreendendo um solvente ou um detergente e manter a solução durante pelo menos 60 minutos, (1) passar a solução após a etapa (k) através de uma coluna de cromatografia de permuta catiónica e eluir as proteínas absorvidas na coluna num eluato, (m) passar o eluato da etapa (1) através de uma coluna de cromatografia de permuta aniónica para gerar um efluente, (n) passar o efluente da etapa (m) através de um nanofiltro para gerar um nanofiltrado, (o) passar o nanofiltrado da etapa (n) através de uma membrana de ultrafiltração para gerar um ultrafiltrado; e (p)
diafiltrar o ultrafiltrado da etapa (o) contra um tampão de diafiltração para gerar um diafiltrado contendo uma concentração de proteínas entre cerca de 8% (p/v) e cerca de 12% (p/v) , obtendo assim uma composição de IgG concentrada.
Em determinadas formas de realização, é proporcionada uma composição farmacêutica de IgG, em que a composição de IgG é preparada utilizando um método proporcionado no presente documento que compreende melhorias em duas ou mais das etapas do processo de fracionamento acima descritas. Por exemplo, em determinadas formas de realização as melhorias podem ser encontradas na primeira etapa de precipitação, a etapa de precipitação da Fração II+III Modificada, a etapa de dissolução da Fração II+III Modificada, e/ou a etapa de filtração da suspensão da Fração II+III Modificada.
Em determinadas formas de realização, é proporcionada 72 uma composição farmacêutica de IgG, em que a composição de IgG é preparada utilizando um método de purificação descrito no presente documento, em que o método compreende a adição através de pulverização de uma ou mais soluções que de outra forma seriam introduzidas numa fração do plasma através de adição fluida. Por exemplo, em determinadas formas de realização o método irá compreender a introdução do álcool (por exemplo etanol) numa fração do plasma através de pulverização. Noutras formas de realização, as soluções que podem ser adicionadas a uma fração de plasma através de pulverização incluem, sem limitação, uma solução modificadora do pH, uma solução solvente, uma solução detergente, um tampão de diluição, uma solução modificadora da condutividade e semelhantes. Numa forma de realização preferida, uma ou mais etapas de precipitação de álcool são realizadas através da adição de álcool a uma fração do plasma através de pulverização. Numa segunda forma de realização preferida, uma ou mais etapas de ajuste de pH são realizadas através da adição de uma solução modificadora do pH a uma fração do plasma através de pulverização.
Em determinadas formas de realização, é proporcionada uma composição farmacêutica de IgG, em que a composição de IgG é preparada por um método de purificação descrito no presente documento, em que o método compreende o ajuste do pH de uma fração do plasma a ser precipitada antes e/ou concomitantemente com a adição do agente de precipitação (por exemplo, álcool ou polietilenoglicol). Em algumas formas de realização, uma melhoria do processo é proporcionada na qual o pH de uma fração do plasma a ser ativamente precipitada é mantido ao longo de toda a incubação da precipitação ou etapa de espera através da monitorização e ajuste contínuos do pH. Em formas de realização preferidas o ajuste do pH é realizado pela adição através de pulverização de uma solução modificadora 73 do pH.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica de IgG que compreende uma concentração de proteínas de entre cerca de 7 0 g/L e cerca de 130 g/L. Em determinadas formas de realização, a concentração de proteína da composição de IgG está entre cerca de 80 g/L e cerca de 120 g/L, preferentemente entre cerca de 90 g/L e cerca de 110 g/L, ainda mais preferentemente entre cerca de 100 g/L, ou qualquer concentração adequada dentro destes limites, por exemplo cerca de 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85 g/L, 90 g/L, 95 g/L, 100 g/L, 105 g/L, 110 g/L, 115 g/L, 120 g/L, 125 g/L, ou 130 g/L. Numa forma de realização preferida, é proporcionada uma composição farmacêutica que tem uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 100 g/L. Numa forma de realização particularmente preferida, a composição farmacêutica terá uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 102 g/L.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica de IgG que compreende uma concentração de proteínas de entre cerca de 170 g/L e cerca de 230 g/L. Em determinadas formas de realização, a concentração de proteína da composição de IgG está entre cerca de 180 g/L e cerca de 220 g/L, preferentemente entre cerca de 190 g/L e cerca de 210 g/L, ainda mais preferentemente entre cerca de 200 g/L, ou qualquer concentração adequada dentro destes limites, por exemplo cerca de 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, ou 230 g/L. Numa forma de realização preferida, é proporcionada uma composição farmacêutica que tem uma concentração de proteína igual a ou de cerca de 200 g/L.
Os métodos proporcionados no presente documento permitem a preparação de composições farmacêuticas de IgG tendo níveis muito altos de pureza. Por exemplo, numa forma de realização, pelo menos cerca de 95% da proteína total numa composição proporcionada no presente documento será IgG. Noutras formas de realização, pelo menos cerca de 96% da proteína é IgG, ou pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5%, ou mais da proteína total da composição será IgG. Numa forma de realização preferida, pelo menos 97% da proteína total da composição será IgG. Noutra forma de realização preferida, pelo menos 98% da proteína total da composição será IgG. Noutra forma de realização preferida, pelo menos 99% da proteína total da composição será IgG.
De forma semelhante, os métodos proporcionados no presente documento permitem a preparação de composições farmacêuticas de IgG as quais contêm níveis extremamente baixos de agentes contaminantes. Por exemplo, em determinadas formas de realização, são proporcionadas composições de IgG que contêm menos do que cerca de 100 mg/L de IgA. Noutras formas de realização, a composição de IgG irá conter menos do que cerca de 50 mg/L de IgA, preferentemente menos do que cerca de 35 mg/L de IgA, mais preferentemente menos do que cerca de 20 mg/L IgA.
As composições farmacêuticas proporcionadas no presente documento irão tipicamente compreender um ou mais agentes de tamponamento ou agentes estabilizadores do pH adequados para administração intravenosa, subcutânea e/ou intramuscular. Exemplos não limitantes de agentes de tamponamento adequados para formular uma composição de IgG proporcionada no presente documento incluem glicina, citrato, fosfato, acetato, glutamato, tartarato, benzoato, lactato, histidina, ou outros aminoácidos, gluconato, malato, sucinato, formato, propionato, carbonato, ou qualquer combinação dos mesmos ajustada a um pH apropriado. Geralmente, o agente de tamponamento será suficiente para manter um pH adequado na formulação durante um período de tempo alargado. Numa forma de realização preferida, o agente de tamponamento é a glicina. 75
Em algumas formas de realização, a concentração do agente de tamponamento na formulação estará entre cerca de 100 mM e cerca de 400 mM, preferentemente entre cerca de 150 mM e cerca de 350 mM, mais preferentemente entre cerca de 200 mM e cerca de 300 mM, ainda mais preferentemente cerca de 250 mM. Numa forma de realização particularmente preferida, a composição de IGIV irá compreender glicina entre cerca de 200 mM e cerca de 300 mM, ainda mais preferentemente glicina a cerca de 250 mM.
Em determinadas formas de realização, o pH da formulação estará entre cerca de 4,1 e cerca de 5,6, preferentemente entre cerca de 4,4 e cerca de 5,3, ainda mais preferentemente entre cerca de 4,6 mM e cerca de 5,1. Em formas de realização particulares, o pH da formulação será de cerca de 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5 ou 5,6. Numa forma de realização preferida, o pH da formulação estará entre cerca de 4,6 e cerca de 5,1.
Em algumas formas de realização, as composições farmacêuticas proporcionadas no presente documento podem ainda compreender opcionalmente um agente para o ajuste da osmolaridade da composição. Exemplos não limitantes de agentes de osmolaridade incluem manitol, sorbitol, glicerol, sacarose, glucose, dextrose, levulose, frutose, lactose, polietilenoglicóis, fosfatos, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, gluconoglucoheptonato de cálcio, dimetil sulfona e semelhantes. Tipicamente, as formulações proporcionadas no presente documento terão osmolaridades que são comparáveis com a osmolaridade fisiológica, cerca de 285 a 295 mOsmol/kg (Lacy et al., Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999:1254). Em determinadas formas de realização, a osmolaridade da formulação estará entre cerca de 200 mOsmol/kg e cerca de 350 mOsmol/kg, preferentemente entre cerca de 240 mOsmol/kg e cerca de 300 mOsmol/kg. Em formas 76 de realização particulares, a osmolaridade da formulação será de cerca de 200 mOsmol/kg, ou 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, ou 350 mOsmol/kg.
As formulações de IgG proporcionadas no presente documento são geralmente estáveis na forma líquida durante um período de tempo prolongado. Em determinadas formas de realização, as formulações são estáveis durante pelo menos 3 meses a temperatura ambiente, ou pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 meses a temperatura ambiente. A formulação geralmente também será estável durante pelo menos 18 meses sob condições de refrigeração (tipicamente entre cerca de 2 °C e cerca de 8 °C) ou durante pelo menos cerca de 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, ou 45 meses sob condições de refrigeração. IV. Métodos de Tratamento
Conforme praticado rotineiramente na medicina moderna, preparações esterilizadas de imunoglobulinas concentradas (especialmente IgGs) são utilizadas para tratar condições médicas que entram dentro destas três classes principais: imunodeficiências, doenças inflamatórias e autoimunes e infeções agudas. Estas preparações de IgG podem também ser úteis para tratar esclerose múltipla (especialmente esclerose múltipla recidivante remitente ou EMRR), doença de Alzheimer e doença de Parkinson. A preparação de IgG purificada desta invenção é adequada para estes propósitos, bem como outras utilizações clinicamente aceites de preparações de IgG. A FDA aprovou a utilização de IGIV para tratar várias indicações, incluindo o transplante de medula óssea 77 alogénico, leucemia linfocítica crónica, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), VIH pediátrico, imunodeficiências primárias, doença de Kawasako, polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (CIDP), e transplante renal com um recetor com anticorpos altos ou com um dador ABO incompatível. Em determinadas formas de realização, as composições de IGIV proporcionadas no presente documento são úteis para o tratamento ou gestão destas doenças e condições.
Além disso, utilizações fora da indicação terapêutica para a IGIV são comumente proporcionados a pacientes para o tratamento e gestão de várias indicações, por exemplo, síndrome de fadiga crónica, colite por Clostridium difficile, dermatomiosite e polimiosite, oftalmopatia de Graves, síndrome de Guillian-Barré, distrofia muscular, miosite por corpos de inclusão, síndrome de Lambert-Eaton, Lupus eritematoso, neuropatia motora multifocal, esclerose múltipla (EM), miastenia gravis, trombocitopenia aloimune neonatal, infeção por Parvovirus B19, pênfigo, púrpura pós-transfusional, rejeição de transplante renal, aborto espontâneo, síndrome da pessoa rígida, opsoclonia mioclonia, septicémia severa e chogue séptico em adultos criticamente doentes, necrólise epidérmica tóxica, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiplo, agamaglobulinémia ligada ao fator X e hipogamaglobulinémia. Em determinadas formas de realização, as composições de IGIV proporcionadas no presente documento são úteis para o tratamento ou gestão destas doenças e condições.
Finalmente, a utilização experimental de IGIV para o tratamento ou gestão de doenças incluindo deficiência imunitária primária, EMSS, doença de Alzheimer e doença de Parkinson foi proposta (Publicação de Pedido de Patente US N° 2009/0148463, a qual é aqui incorporada como referência na sua totalidade para qualquer fim). Em determinadas formas de realização, as composições de IGIV proporcionadas 78 no presente documento são úteis para o tratamento ou gestão de deficiência imunitária primária, EMSS, doença de Alzheimer ou doença de Parkinson. Em determinadas formas de realização que compreendem administração diária, uma quantidade eficaz a ser administrada ao sujeito pode ser determinada por um médico com consideração a diferenças individuais na idade, peso, severidade da doença, via de administração (por exemplo, intravenosa vs. subcutânea) e resposta à terapêutica. Em determinadas formas de realização, uma preparação de imunoglobulina desta invenção pode ser administrada a um sujeito em cerca de 5 mg/quilograma até cerca de 2000 mg/quilograma cada dia. Em formas de realização adicionais, a preparação de imunoglobulina pode ser administrada em quantidades de pelo menos 10 mg/quilograma, pelo menos 15 mg/quilograma, pelo menos 20 mg/quilograma, pelo menos 25 mg/quilograma, pelo menos 30 mg/quilograma, ou pelo menos 50 mg/quilograma. Em formas de realização adicionais, a preparação de imunoglobulina podem ser administradas a um sujeito em doses até cerca de 100 mg/quilograma, até cerca de 150 mg/quilograma, até cerca de 200 mg/quilograma, até cerca de 250 mg/quilograma, até cerca de 300 mg/quilograma, até cerca de 400 mg/quilograma cada dia. Noutras formas de realização, as doses da preparação de imunoglobulina podem ser maiores ou menores. Além disso, as preparações de imunoglobulina podem ser administradas numa ou mais doses por dia. Clinicos familiares com as doenças tratadas pelas composições de IgG podem determinar a dose apropriada para um paciente de acordo com os critérios conhecidos na técnica.
De acordo com a presente invenção, o tempo necessário para completar um curso do tratamento pode ser determinado por um médico e pode variar entre curto como de um só dia até mais de um mês. Em determinadas formas de realização, um curso do tratamento pode ir desde 1 a 6 meses. 79
Uma quantidade eficaz de uma preparação de IGIV é administrada ao sujeito através de meios intravenosos. 0 termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de uma preparação de IGIV que resulta numa melhoria ou remediação da doença ou condição no sujeito. Uma quantidade eficaz a ser administrada ao sujeito pode ser determinada por um médico com consideração a diferenças individuais na idade, peso, doença ou condição a ser tratada, severidade da doença e resposta à terapêutica. Em determinadas formas de realização, uma preparação de IGIV pode ser administrada a um sujeito numa dose de cerca de 5 mg/quilograma até cerca de 2000 mg/quilograma por administração. Em determinadas formas de realização, a dose pode ser pelo menos cerca de 5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 10 mg/kg, ou pelo menos cerca de 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2000 mg/kg. A dosagem e frequência do tratamento com IGIV irão depender de, entre outros fatores, da doença ou condição a ser tratada e a severidade da doença ou condição no paciente. Geralmente, para uma disfunção imunitária primária uma dose de entre cerca de 100 mg/kg e cerca de 400 mg/kg de peso corporal será administrada a cada 3 a 4 semanas. Para doenças neurológicas e autoimunes, até 2 g/kg de peso corporal é implementada durante três a seis meses num curso de 5 dias uma vez por mês. Tal é geralmente suplementado com a terapêutica de manutenção que compreende a administração entre cerca de 100 mg/kg e cerca de 400 mg/kg de peso corporal cerca de uma vez cada 3 a 4 semanas. Geralmente, um paciente irá receber uma dose ou tratamento 80 cerca de uma vez cada 14 a 35 dias, ou cerca de cada 21 a 28 dias. A frequência do tratamento irá depender, entre outros fatores, da doença ou condição a ser tratada e a severidade da doença ou condição no paciente.
Numa forma de realização preferida, um método para o tratamento de uma imunodeficiência, uma doença autoimune, ou infeção aguda num humano com necessidade dos mesmos, o método que compreende a administração de uma composição farmacêutica de IGIV da presente invenção. Numa forma de realização relacionada, a presente invenção proporciona composições de IGIV fabricadas de acordo com um método proporcionado no presente documento para o tratamento de uma imunodeficiência, doença autoimune, ou infeção aguda num humano com necessidade dos mesmos. trombocitopénica imunodeficiências polineuropatia
Em determinadas formas de realização, a imunodeficiência, doença autoimune, ou infeção aguda é selecionada de transplante de medula óssea alogénico, leucemia linfocitica crónica, púrpura idiopática (ITP), VIH pediátrico, primárias, doença de Kawasaki, desmielinizante inflamatória crónica (CIDP) , transplante renal com um recetor com anticorpos altos ou com um dador ABO incompatível, síndrome de fadiga crónica, colite por Clostridium difficile, dermatomiosite e polimiosite, oftalmopatia de Graves, síndrome de Guillian-Barré, distrofia muscular, miosite de corpos de inclusão, síndrome de Lambert-Eaton, Lupus eritematoso, neuropatia motora multifocal, esclerose múltipla (EM), miastenia gravis, trombocitopenia aloimune neonatal, infeção por Parvovirus B19, pênfigo, púrpura pós-transfusional, rejeição de transplante renal, aborto espontâneo, síndrome da pessoa rígida, opsoclonia mioclonia, septicémia severa e choque séptico em adultos criticamente doentes, necrólise epidérmica tóxica, leucemia linfocitica crónica, mieloma múltiplo, agamaglobulinémia ligada ao fator X, 81 hipogamaglobulinémia, deficiência imunitária primária, EMSS, doença de Alzheimer e doença de Parkinson.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são fornecidos por meio de ilustração somente e não por meio de limitação. Os peritos na especialidade reconhecerão uma variedade de parâmetros não críticos que poderiam ser mudados ou modificados para proporcionar essencialmente os mesmos resultados ou semelhantes.
Exemplo 1 0 presente exemplo demonstra que quantidades significativas de fibrinogênio, atividade amidolítica, atividade da pré-calicreína, e lipoproteínas podem ser removidas de uma suspensão de pasta da Fração II+III modificada extraída por tratamento com Aerosil antes de filtração. A sílica fumada (Aerosil 380) é atualmente utilizada para adsorver fibrinogênio, atividade amidolítica, atividade da pré-calicreína, e lipoproteínas. Para investigar o efeito do Aerosil em mais pormenor, seis suspensões da Fração II+III modificada foram tratadas com quantidades variáveis de Aerosil antes da filtração. De forma breve, um tampão de dissolução contendo um tampão de acetato de sódio a 5 mM/di-hidrogenofosfato de sódio a 5 mM pH 4,5 foi utilizado para ressuspender a pasta II+III modificada, preparada como descrito no presente documento, numa razão de 15 gramas de tampão de dissolução por grama de pasta II+III. Após a adição da pasta, a suspensão foi agitada durante uma hora a entre 2 °C e 8 °C num ambiente de pH controlado (limites de IPC de pH: de 4,9 a 5,3) . Descobrimos que o pH desta suspensão normalmente se desvia a um pH de cerca de 5,1, e assim um ajuste de pH adicional não é necessário. Após uma extração adicional, durante pelo menos 120 minutos, o Aerosil 380, a entre 0 e 100 mg por grama de pasta II+III, foi adicionado aos contentores e as 82 suspensões foram incubadas durante uma hora. A terra de diatomáceas foi adicionada antes da filtração de profundidade com um filtro Cuno 50SA. Após a filtração, os filtros foram lavados com o tampão de extração contendo 8 g L-1 de citrato e polissorbato 80 a 0,2% (pH 5,0) e a lavagem foi adicionada ao filtrado. 0 filtrado combinado e a solução de lavagem foram então tratados com Polissorbato 80 para solubilizar adicionalmente impurezas hidrofóbicas, por exemplo, lipoproteínas, e a IgG foi precipitada com etanol a 25% (pH 7) a entre -8 °C e -10 °C. O precipitado de Ppt G resultante foi quase branco e possuía maior pureza de IgG. O precipitado foi então dissolvido em água purificada a uma razão de 7 gramas de água por 2 gramas de Ppt G precipitado.
As soluções de IgG foram analisadas para recuperação de IgG e impurezas seguindo a etapa de filtração Cuno. Especificamente, os níveis da atividade amidolítica (PL-1), atividade de PKA, e fibrinogênio foram medidos (Quadro 3). De maneira notável, como observado no Quadro 3, os protocolos de extração utilizando de 40 a 60 mg de Aerosil 380 por g de pasta II+III resultou em níveis aceitáveis de recuperação de IgG com diminuição significativa na atividade amidolítica e de PKA, bem como uma diminuição significativa no nível de fibrinogênio no filtrado. Em comparação com as extrações realizadas sem tratamento de Aerosil, a adição de 40 mg de Aerosil 380 por grama de pasta II+III resultou numa redução de quase 90% de atividade de PKA e conteúdo de fibrinogênio e uma redução de 60% da atividade amidolítica, enquanto mantém recuperação similar de IgG (73%). 83
Quadro 1.
Efeito da quantidade de Aerosil 380 na etapa de Filtração II+III Cuno (Extração com Condições GAMMAGARD® LIQUID)_
Aerosil IgG IgG PL-1 PKA Fibrinogénio mg g-1 de pasta II+III 0 gL_1 de plasma Recuperação umol min-1 g -1 de proteína (Ppt G) IU g"l de proteína (Ppt G) mg g-1 de proteína (Ppt G) 4,9 72% 1,3 2403 19,5 20 5,2 82% 0,7 974 8,2 40 60 4,8 73% 0,5 290 2,1 4,8 71% 0,3 90 0,1 80 4,2 63% abaixo do limite de detecção 37 0,0 100 4,3 65% abaixo do limite de detecção 16 0,0
Exemplo 2 0 presente exemplo demonstra que quantidades significativas de fibrinogénio podem ser removidas de uma suspensão da pasta de Fração II+III modificada extraida por meio de tratamento com Aerosil antes da filtração. Um propósito da presente experiência foi encontrar condições adequadas para a remoção eficaz de fibrinogénio sem incorrer perdas significativas de IgG. A pasta II+III modificada, preparada de acordo com o método fornecido no presente documento, foi dissolvida num tampão de acetato de sódio a 5 mM/ fosfato de sódio monobásico a 5 mM pH 4,5. A razão de dissolução foi de 15 kg de tampão para 1 kg de pasta II + III. A quantidade de ácido acético adicionada ao tampão foi escolhida de maneira 84 que o pH após sessenta minutos de agitação foi de 4,9. Com a finalidade de homogeneizar completamente a suspensão, a mesma foi agitada até vinte horas a de 2 a 8 °C antes de ser separada em 6 porções de 50 ml cada em copos de 100 ml, onde quantidades variáveis de Aerosil 380 já estavam presentes, como representado no Quadro 2. As soluções de suspensão II+III foram então agitadas durante 80 minutos na presença do Aerosil, antes de processamento e análise. Após a agitação todas as amostras foram centrifugadas com uma Heraeus Cryofuge 8500i a 4600 RPM durante 30 minutos a 4 °C em tubos falcon de 50 ml.
Nesta experiência, as medições de IgG foram feitas utilizando o teste nefelométrico, que foi escolhido devido aos valores mais precisos, em comparação com o teste ELISA, nas altas concentrações encontrada em soluções de suspensão II+III. Para minimizar a irritação de turbidez inespecifica, as amostras foram filtradas através de filtros de 0,45 mm antes de testagem. Para IgM, IgA, e fibrinogénio, os testes de ELISA foram preferidos devido às menores concentrações destas impurezas na suspensão. Os resultados da experiência são mostrados a seguir no Quadro 2.
Para caracterizar adicionalmente o efeito do tratamento com Aerosil sobre a remoção de fibrinogénio e perda de IgG como descrito no Exemplo 1, as concentrações de Aerosil foram ainda tituladas entre 0 mg e 40 mg por grama de pasta II+III modificada. Os resultados mostrados no Quadro 2 confirmam a alta capacidade do Aerosil reduzir fibrinogénio nesta fração. De maneira notável, a utilização de 40 mg por grama de pasta II+III resulta em quase 90% de redução de fibrinogénio, enquanto somente reduz a recuperação de IgG no bolo de filtro em 10%.
Quadro 2.
Resultados da variação de condições de dissolução após extração de II+III com NaAc a 5 mM/NaH2P04 a 5 mM pH 4,5 a 85 uma razão de dissolução de 1 kg de II+III mais 15 kg de tampão após a centrifugação 86
Valores em sobrenadante
Condições de Dissolução Proteína (Biuret) IqM ELISA IgG neph. IqA ELISA Fibrinogênio ELISA Condiçoes Tempo de agitaçao adicional X Cu conductividade (mScm—1) tn tn (gL-1) de plasma pg ml—1 (gL—1) de plasma Mg ml-1 (gL—1) de plasma pg ml-1 (gL—1) de plasma pg ml-1 (gL-Ι) de plasma Branco 8 0 mm mg/g-1 de pasta II+III 80 5, 0 1,5 13, 76 0, 69 8,5 476 0,29 7, 19 4, 44 993 0, 61 400 0,25 Aerosil 5 80 5, 0 1,5 13, 40 0, 67 8, 3 457 0,28 7, 30 4,51 983 0, 61 353 0,22 Aerosil 10 80 5, 0 1,5 13, 44 0, 67 8, 3 4 64 0,29 6, 97 4, 30 1009 0, 62 272 0, 17 Aerosil 15 80 5 : 0 1,5 12, 01 0, 60 7, 4 451 0,28 7, 04 4, 35 1005 0, 62 230 0, 14 Aerosil 30 80 5, 0 1,5 12, 49 0, 62 7, 7 468 0,29 6, 77 4, 18 944 0,68 95 0,06 Aerosil 40 80 5, 0 1,5 12,21 0, 61 7,5 449 0,28 6, 71 4, 14 899 0, 66 41 0, 03
Exemplo 3 0 presente exemplo demonstra condições adequadas que permitem a extração altamente eficiente de IgG de uma pasta II+III da Fração modificada, enquanto limita os niveis de impurezas prejudiciais. Especificamente, parâmetros incluindo a concentração de ácido acético utilizada no tampão de dissolução II+III e o tratamento com aerosil da solução extraida antes da filtração foram examinados. A pasta II+III foi extraida em acetato de sódio a 5 mM, di-hidrogenofosfato de sódio a 5 mM e quantidades variáveis de ácido acético concentrado, como mostrado no Quadro 1, durante 180 minutos a entre 2 °C e 8 °C, seguido pela adição de Aerosil 380 como mostrado no Quadro 1. Após uma hora de agitação, a suspensão foi clarificada por meio de filtração com Cuno 50A na presença de terra de diatomáceas. A pós-lavagem do filtro foi levada a cabo com o mesmo tampão que para a extração exceto a quantidade 87
diferente de ácido acético, como dado no Quadro 1, utilizando 40% do volume da suspensão antes da filtração. A precipitação do precipitado G na presença de álcool etílico a 25%; 8 g L_1 de citrato de sódio, e Tween 80 a 0,2% (pH 7) a -8 °C foi realizada e após um tempo de retenção de 8 horas, a separação foi realizada por meio de centrifugação com Heraeus Cryofuge 8500i em copos de aço inoxidável a 4600 RPM durante 30 minutos a -10 °C. O precipitado foi dissolvido numa razão de 1:2 em água purificada.
Quadro 3.
Quadro 3. A influência da guantidade de ácido acético no ajuste do pH do tampão de extração e a quantidade de Aerosil para a clarificação no rendimento de IgG e pureza no PptG e perc a de IgG no bolo de filtro.
Aerosil (mg g 1 II + III) 0 20 40 40 tampão de dissolução ácido acético (g L_1) 0,40 0,40 0,40 0,51 PH 4,52 4,52 4,52 4,46 extrato II+III pH 5, 00 5, 00 % condutividade (mS cm-1) 1,340 1,340 1,340 1,344 tampão de pré/pós-lavagem ácido acético (g L"1) 0, 12 0,12 0, 12 0, 12 pH 5, 02 5, 02 5, 02 5, 02 filtrado II+III albumina CAE (%) 11,9 12,5 12,3 10,7 a/β-globulina CAE 25, 5 22, 9 18, 9 17,2 proteína desnaturada CAE 3,2 0, 0 0,0 0,0 CAE (% γ-globulina) 59, 4 64, 6 68,8 72, 1 PH 5, 00 5, 03 5, 04 4,92 perda de IgG no bolo de filtro (g L"1 plasma) 0,09 0,20 0, 56 PptG dissolvido albumina CAE (%) 0,3 0,5 0,3 0,3 α/β-globulina CAE 16,2 14,3 12,5 13, 0 proteína desnaturada CAE 0,0 0,0 0,0 0, 0 CAE (% γ-globulina) tí b f S, 2 tf., Ί fibrinogénio (mg L"1 plasma) 129 32 <4 4 PKA (UI mg-1 proteína) 126 60 9 10 PL-1 (pmol mlT1 g"1) 0,9 0,6 0,5 0, 6 sobrenadante do PptG PH 7,20 7,35 7,30 6, 96 88
Aerosil (mg g 1 II+III) 0 20 40 40 perda de IgG no PptG sobrenadante (g L”1 plasma) 0,14 0,13 0, 11 0,09
Como pode ser visto no Quadro 1, a adição de Aerosil à suspensão da pasta II+III tem uma marcada influência sobre a pureza de γ-globulina na fração Ppt G. Sem Aerosil a pureza de γ-globulina é de somente 83,5%, enquanto a adição de 40 mg de Aerosil por grama de pasta II + III à suspensão de pasta II+III aumenta a pureza de γ-globulina a 87,2%. Como foi evidenciado, o tratamento com Aerosil leva a uma redução significativa de fibrinogénio, PKA e atividade amidolitica. Um inconveniente da adsorção de impurezas em Aerosil é que a perda de IgG no bolo de filtro é aumentada com quantidades crescentes de Aerosil. No entanto, como mostrado no Quadro 1, maiores concentrações de ácido acético no tampão de extração parcialmente contrabalançam o efeito do Aerosil na perda de IgG no bolo de filtro, e reduziu adicionalmente a perda de IgG na fração de Ppt G do sobrenadante. Como pode ser visto no Quadro 1, aumentar a quantidade de ácido acético no tampão de dissolução desde 400 mL por L de pasta até 510 mL por L de pasta, reduziu a quantidade de IgG perdida no bolo de filtro em quase 50%. Vantajosamente, a maior concentração de ácido acético não afeta a pureza da γ-globulina na fração de Ppt G (87,2% pura utilizando 400 mL por L de pasta vs. 86,7% pura utilizando 510 mL por L de pasta). Além disso, os resultados mostram que a diferença no valor de pH causada pela quantidade diferente de ácido acético é insignificante, devido à alta capacidade do tampão do ácido acético próximo do seu valor de pka de 4,75 (Merck). Isto sugere que para melhor precisão no fabrico em grande escala, o ácido acético deve ser adicionado em peso. Assim, a influência de Aerosil sobre a pureza é muito maior que a influência de ácido acético sobre a pureza, no intervalo 89 investigado, como mostrado com o conteúdo de γ-globulina medidos por CAE.
Exemplo 4
Os resultados encontrados no Exemplo 3 sugeriram que a quantidade de IgG perdida no bolo de filtro é fortemente dependente da quantidade de ácido acético utilizada para o ajuste do pH do tampão de extração a uma dada concentração de Aerosil. Com a finalidade de caracterizar adicionalmente este efeito, a pasta II+III modificada foi extraida em água purificada durante cerca de 120 minutos para obter uma suspensão homogénea e dividida em 4 partes. Estas partes foram ajustadas a pH 3,8, 4,2, 4,6, e 5,0, respetivamente, com ácido acético a 1 M seguido por um segundo tempo de extração durante outros 120 minutos. Depois disso, o tratamento com Aerosil foi feito com 40 mg de Aerosil 380 por grama de pasta II + III. Após uma hora de agitação a suspensão foi clarificada por meio de filtração com Cuno 50SA na presença de terra de diatomáceas. A pós-lavagem do filtro foi levada a cabo com 100 por cento do volume da suspensão antes da filtração com tampão de extração ajustado ao pH como dado anteriormente. O filtrado foi tratado com 8 g L_1 de citrato de sódio e Tween 80 a 0,2%, ajustado a pH 7,0, e IgG foi precipitada com álcool a 25% a -8 °C. O precipitado de PptG foi recuperado por meio de centrifugação a 4600 RPM durante 30 minutos a -10 °C num Heraeus Cryofuge 8500i utilizando copos de aço inoxidável. O precipitado foi então dissolvido em água purificada a uma razão de 7 gramas de água por 2 gramas de precipitado de Ppt G. As frações relevantes foram então submetidas a ensaio para recuperação de IgG, atividade de PKA, conteúdo de fibrinogénio, e atividade amidolitica, para determinar a dependência do pH de recuperação (Quadro 4). 90
Quadro 4. remoção de fibrinogénio dependente do pH, atividade de PKA extração e clarificação com tratamento com Aerosil e amidolitica através de Precipitado G pH de extração e clarificação do ácido acético concentração do ácido acético após ajuste do pH (mM) perda de IgG no bolo de filtro (g Lf 1 plasma) perda de IgG no sobrenadante do PptG (g L"1 plasma) perda de IgG Σ (g L"1 plasma) PKA (UI mg'1) fibrinogénio (mg L"1 plasma) PL-l (pmol mL"1 g"1) 3,8 75 0,02 0,85 0,87 138 243 - 4,2 25 0,04 0,53 0,57 35 182 - 4,6 10 0,07 0,05 0,12 2 99 2 5,0 5 0,19 0,06 0,25 0, 6 3 0,5 3,8 75 - - - 116 304 3,8 4,2 25 0,02 0,34 0,36 44 313 2, 6 4, 6 10 0,04 0,52 0,56 8 148 1,7 5,0 5 0,14 0,09 0,23 3 10 <0,2 0 Quadro 4 mostra que PKA, atividade amidolitica (PL-1), e remoção de fibrinogénio com Aerosil é menos efetiva a menor pH durante a clarificação. Pode ser visto a partir dos resultados obtidos aqui, que o pH mais eficaz para a remoção eficaz de PKA, atividade amidolitica (PL-1), e fibrinogénio, enquanto mantém a recuperação eficiente de IgG na fração Ppt G, é cerca de pH 5. Altas concentrações de ácido acético levam a uma perda significativa de IgG no sobrenadante de Ppt G (0,85g L-1 na presença de 75 mM de ácido acético) enquanto a perda de IgG no bolo de filtro é minimizada.
Exemplo 5
Para determinar a dependência do tratamento com Aerosil sobre os resultados encontrados no Exemplo 4, a experiência foi repetida, mas com a etapa de tratamento com Aerosil omitida. Brevemente, a pasta II+III foi extraída em água purificada durante cerca de 120 minutos para obter uma suspensão homogénea e dividida em 4 partes. Estas partes 91 foram ajustadas a pH 3,8, 4,2, 4,6, e 5,0, respetivamente, com ácido acético a 1 M seguido por um segundo tempo de extração durante outros 120 minutos. Depois disso, a suspensão foi clarificada por meio de filtração com Cuno 50SA na presença de terra de diatomáceas. A pós-lavagem do filtro foi levada a cabo com 100 por cento do volume da suspensão antes da filtração com tampão de extração ajustado ao pH como dado anteriormente. O filtrado foi tratado com 8 g L_1 de citrato de sódio e Tween 80 a 0,2%, ajustado a pH 7,0, e IgG foi precipitada com álcool a 25% a -8 °C. O precipitado de Ppt G foi recuperado por meio de centrifugação a 4600 RPM durante 30 minutos a -10 °C num Heraeus Cryofuge 8500i utilizando copos de aço inoxidável. O precipitado foi então dissolvido em água purificada numa razão de 7 gramas de água por 2 gramas de precipitado de Ppt G. As frações relevantes foram então submetidas a ensaio para recuperação de IgG, atividade de PKA, conteúdo de fibrinogênio, e atividade amidolitica, para determinar a dependência do pH de recuperação (Quadro 5).
Quadro 5. remoção de fibrinogénio dependente do pH, atividade da PKA e amidolitica através de extração e clarificação com tratamento com Aerosil Precipitado G pH de extração e clarificação do ácido acét ico concent ração do ácido acético após ajuste do pH (rnM) perda de IgG no bolo de filtro(g ΙΓ1 plasma) perda de IgG no sobrenadante do PptG (g L”1 plasma) perda de IgG Σ (g ΙΓ1 plasma) PKA (UI mg'1) fibrinogénio (mg L"1 plasma) PL—1 (pmol mL”1 g"1) 3,8 75 0,00 0,42 0,42 214 173 3, 9 4,2 25 0,01 0,19 0,20 170 134 3,2 4, 6 10 0,01 0,09 0,10 38 193 1, 4 5,0 5 0,09 0, 04 0, 13 6, 4 114 0, 4 3, 8 75 0, 00 0,53 0,53 193 355 3, 8 4,2 25 0, 00 0,28 0,28 171 346 3,2 4, 6 10 0, 01 0, 14 0, 15 131 340 1,5 5, 0 5 0,16 0, 05 0,21 5,3 189 <0,2 92
Consistente com os resultados encontrados no Exemplo 4, aumentar o pH do tampão de extração/dissolução para 5,0 resultou num pequeno aumento na IgG perdida no bolo de filtro, no entanto, esta perda foi mais que compensada por uma maior diminuição na perda de IgG no sobrenadante de Ppt G.
Quando os resultados dos Exemplo 4 e Exemplo 5 são comparados, pode ser visto que o tratamento com Aerosil reduz a quantidade de atividade de PKA residual encontrada na fração de PptG dissolvida quando a pasta II+III é extraída a pHs menores (3,8, 4,2, e 4,6), mas não a pH 5,0 (Figura 2). De modo inverso, o tratamento com Aerosil reduz significativamente o conteúdo de fibrinogénio da fração de Ppt G dissolvida quando a pasta II+III é extraída a pHs mais altos (Figura 3; compara pH 4,6 e 5,0 a pH 3,8 e 4,2). O tratamento com Aerosil não parece afetar o nível de atividade amidolítica residual encontrado na fração de Ppt G dissolvida (Figura 4) . De maneira notável, o nível de todos os três contaminantes na fração de Ppt G dissolvida é reduzido consideravelmente quando a pasta II+III é extraída a pH 5,0, como em comparação com pH 3,8, 4,2, e 4,6.
Exemplo 6
Como pode ser observado nos Exemplos anteriores, as perdas de IgG no bolo de filtro e sobrenadante do Ppt G são minimizadas quando a pasta II+III é extraída a um pH de ao redor de 4,5 a 4,6. No entanto, é também evidenciado nos exemplos anteriores, que impurezas críticas, incluindo atividade de PKA, atividade amidolítica, e conteúdo de fibrinogénio, são muito maiores quando a pasta II+III é extraída a pH 4,5 ou 4,6 em comparação com quando a extração ocorre a um pH ao redor de 4,9 a 5,0. Consequentemente, o presente exemplo foi realizado para determinar se os níveis de impureza mais altos vistos quando a pasta II+III é extraída a pH 4,5 poderiam ser compensados aumentando a quantidade de Aerosil utilizada 93 para adsorver contaminantes, enquanto mantêm níveis de perda de IgG baixos no bolo de filtro e sobrenadante de Ppt G.
Ao longo destas linhas, a extração de pasta II+III modificada foi realizada como anteriormente, com tampão de extração tendo um pH de 4,5. Quantidades crescentes de Aerosil 380, até 200 mg por g de pasta II+III, foram então adicionadas e a suspensão foi agitada durante uma hora. O processamento adicional da amostra foi realizado como anteriormente.
Como pode ser visto no Quadro 6, tanto a remoção de fibrinogénio como de atividade de PKA é significativamente melhorada pela clarificação com altas quantidades de Aerosil. A perda de IgG no bolo de filtro devido à ligação sobre Aerosil é aumentada com altas quantidades de Aerosil, embora este efeito tenha sido algo compensado por uma diminuição na perda de IgG no sobrenadante de Ppt G. Significativamente, no entanto, a atividade amidolítica não pôde ser reduzida por altas quantidades de Aerosil quando a pasta II + III é extraída a pH 4,5. Além disso, embora a pureza de γ-globulina seja melhorada com quantidades mais altas de Aerosil, em todos os casos ainda é abaixo do limite de especificação de >86% para Ppt G. Provavelmente devido ao baixo pH na extração e clarificação.
Quadro 6. O Quadro 6 fornece os resultados da variação na concentração de Aerosil com extração e clarificação de pH 4,5 Precipitado G quantidade de Aerosil em mg/grama II+III perda de IgG no bolo de filtro (g ir1 plasma) perda de IgG no sobrenadante do PptG (g L"1 plasma) perda de IgG Σ (g L"1 plasma) PKA (UI mg"1) fibrinogénio (mg L"1 plasma) PL-1 (pmol mL"1 g”1) CAE (% gama globulina) 0 0,01 0,21 0,22 177, 1 272 5, 4 69, 1 40 0,13 0,50 0, 63 9,3 173 1,8 76, 8 100 0,11 0,30 0,41 0,1 76 6, 1 79, 4 94 O Quadro 6 fornece os resultados da variação na concentração de Aerosil com extração e clarificação de pH 4,5
Precipitado G 200 0,25 0, 08 0,33 Abaixo do limite de det. 10 4,5 sT co
Exemplo 7 0 presente exemplo demonstra o efeito do tampão de extração pH sobre a remoção de impurezas após a ressuspensão e clarificação da pasta II+III. A extração da pasta II+III modificada em pH baixo foi realizada a pH 4,2 utilizando uma razão de 15 gramas de tampão por grama de pasta II+III. A suspensão foi então dividida em 3 partes e o pH ajustado a 4,5, 4,7, ou 5,0 respetivamente com Tris a 3 M. Depois disso, cada solução foi ainda dividida em duas partes, que foram incubadas durante uma hora a 4 °C ou 25 °C. A filtração com Cuno 50(90)SA foi realizada utilizando um tampão pós-lavagem de acetato de sódio a 10 mM tendo o mesmo pH como o respetivo tampão de clarificação. Os filtrados foram tratados com 8 g L”1 de citrato e Tween 80 a 0,2%, e então IgG foi precipitada pela adição de 25% álcool etílico a -10 °C durante pelo menos 8 horas. O precipitado foi recuperado por meio de centrifugação como descrito anteriormente, e o precipitado foi dissolvido em um volume de água purificada de 2 vezes. A suspensão resultante foi filtrada utilizando um dispositivo de filtração Cuno VR06, numa solução final tendo um condutividade de cerca de 1,3 mS cirT1
Para avaliar as diversas condições, o nível de IgG, IgA, IgM, transferrina, fibrinogénio, e outras impurezas foram determinados. Os resultados desta análise são dados no Quadro 7, que mostra a dependência do pH de clarificação da suspensão da pasta II+III. Dentro do intervalo de pH de 4,5 a 5,0 a quantidade de IgA, IgM, transferrina, e 95 fibrinogénio não varia num amplo intervalo, mas outras proteínas indesejadas estão presentes a níveis mais altos quando os tampões de pH menores são utilizados. Foi calculado que estas outras impurezas compreendem 10% da proteína total a pH 4,5, mas menos de 1% a pH 5. O conteúdo de IgG é o mais alto a pH 5,0, enquanto a dependência de temperatura do conteúdo de IgG e níveis de impureza, entre 4 °C e 25 °C, é insignificante.
Quadro 7.
O Quadro 7 compara a redução de impurezas da II+III dissolvida para o filtrado VR06 através de variação no pH e temperatura durante 1 hora de incubação após ressuspensão da pasta II+III e filtração subsequente após extração a pH baixo sem aditivos pH da incubação e ambas etapas de filtração Temperatura de incubação e primeira etapa de filtração etapa % de Proteína IgG nefelométrica IgA ELISA IgM ELISA transferrina ELISA Fibrinogénio ELISA Outras impurezas calculadas 4,5 4 ° C II-III dissolvido 55, 0 7, 9 3, 6 1, 3 3, 0 29, 3 filtrado Cuno 90 51, 7 8,5 4, 0 1, 6 2,5 31, 7 Ppt G dissolvido 64, 4 8, 3 4, 4 0, 1 2, 8 20, 0 filtrado VR06 71, 8 9, 5 5, 1 0, 1 3, 0 10, 6 250 C II+III dissolvido 55, 0 7, 9 3, 6 1, 3 3, 0 29, 3 filtrado Cuno 90 52, 3 8, 0 4,2 1, 6 2, 6 31, 3 Ppt G dissolvido 64,5 7, 4 4, 8 0, 1 3, 8 19, 4 filtrado VR06 72,5 9, 1 5, 0 0, 1 3, 3 9, 9 96 O Quadro 7 compara a redução de impurezas da II+III dissolvida para o filtrado VR06 através de variação no pH e temperatura durante 1 hora de incubação após ressuspensão da pasta II+III e filtração subsequente após extração a pH baixo sem aditivos pH da incubação e ambas etapas de filtração Temperatura de incubação e primeira etapa de filtração etapa % de Proteína IgG nefelométrica IgA ELISA IgM ELISA transferrina ELISA Fibrinogénio ELISA Outras impurezas calculadas 4, 7 4 0 C II+III dissolvido 55, 0 7, 9 3, 6 1, 3 3, 0 29, 3 filtrado Cuno 50 49, 4 8,2 3, 7 1, 6 2,5 34, 6 Ppt G dissolvido 68, 8 9, 5 5, 0 0, 1 3,5 13,2 filtrado VR06 76, 5 9, 8 5, 4 0, 1 3,5 4, 7 25 0 C II+III dissolvido 55, 0 7, 9 3, 6 1, 3 3, 0 29, 3 filtrado Cuno 50 49, 6 8, 6 3, 7 1,5 3, 1 33, 6 Ppt G dissolvido 66, 9 8, 8 4, 9 0, 1 4, 1 15,2 filtrado VR06 75, 8 10,2 5, 3 0, 1 4, 3 4, 3 5, 0 4 0 C II+III dissolvido 55, 0 7, 9 3, 6 1, 3 3, 0 29, 3 filtrado Cuno 50 52,5 9, 3 3, 4 1, 7 2, 1 31, 0 Ppt G dissolvido 76, 9 10, 1 4, 9 0, 1 3, 0 5, 0 filtrado VR06 83, 6 10, 6 4,5 0, 1 3, 0 0, 0 25 0 C II+III dissolvido 55, 0 7, 9 3, 6 1, 3 3, 0 29, 3 filtrado Cuno 50 53, 4 8, 9 3, 4 1, 8 2, 6 30, 0 Ppt G dissolvido 76, 6 10, 3 4, 8 0, 1 3, 9 4, 3 filtrado VR06 79, 9 10, 9 4, 7 0, 1 3, 6 0, 8 97
Como pode ser observado no Quadro 8, a análise adicional da fração de Ppt G dissolvida e filtrado VR06 indicam que a utilização de tampões tendo um pH de 4,5 para as etapas de clarificação de II+III e tratamento do filtrado II+III, resulta num nivel aumentado de agregados e componentes de baixo peso molecular. Este efeito é melhorado adicionalmente quando as etapas são realizadas a 25 °C, em vez de 4 °C. De modo inverso, quando as amostras são tratadas a maior pH (pH 5,0), as suspensões de Ppt G e filtrado resultantes contêm maiores níveis de material de ~350 kDa (IgG ou IgA dimérica) que das soluções tratadas a pH 4,5 (Quadro 8). Além disso, os tratamentos de pH menores resultaram em maiores níveis de atividade amidolítica que o tratamento a pH 5,0.
Quadro 8.
Influência do pH e temperatura durante a incubação e filtração da suspensão da pasta II+III na atividade da PKA e amidolítica do Precipitado G dissolvido e na distribuição de tamanho molecular no filtrado VR06. pH da incubação e ambas etapas de filtração temperatura de incubação e primeira etapa de filtração Ppt G dissolvido Filtrado VR08 atividade da PKA atividade amidolítica (PL-1) distribuição do tamanho molecular(%) PH temp. °C UI mL'1 UI g 1 nmol mL-1. min-1 nmoL min-1. g"1 >450 kDa -350 kDa -160 kDa <60 kDa 4,5 4 60,2 2028 171,8 5788 28,33 6, 61 63,21 1,85 4,5 25 103,4 3569 239, 4 8264 29, 44 6, 02 61,76 2,79 4,7 4 1343,2 38029 152,1 4306 23,71 8,82 65,82 1, 64 4,7 25 2215,9 67702 180,2 5506 24,54 8,02 65,06 2,38 5,0 4 134,5 4009 67, 6 2015 17,81 10,78 70,03 1,38 5,0 25 186, 6 5738 87,3 2685 19,16 10,54 68,84 1,46
Exemplo 8
Os resultados apresentados nos Quadros 7 e 8 mostram que a ressuspensão do precipitado de II+III deveria ser realizada a temperaturas refrigeradas (de 2 °C a 8 °C) e que o pH deveria ser mantido a pH 5,0 com a finalidade de 98 minimizar a dissolução de componentes de alto (>450KDa) e baixo (>70KDa) peso molecular, bem como componentes tendo atividade amidolitica. A clarificação eficaz após a suspensão de pasta de II+III reduzirá a carga de impureza para processamento a jusante de cromatografia de Ppt G e é, portanto, chave para cumprir as especificações do contentor final de IGIV de forma reproduzível. Para validar adicionalmente este achado, a pasta II+III modificada foi dissolvida e processada, como anteriormente, a pasta II+III modificada foi dissolvida a pH 4,2 e então ajustada a pH de 4,5, 4,7, ou 5,0. Como visto no Quadro 9, IgM é removida mais eficientemente por um pH de 5,0 durante a suspensão e clarificação da pasta II+III que a remoção a pH 4,5. Nesta experiência o rendimento de IgG é similar a pH 5,0 e 4,5.
Quadro 9
Rendimento de IgG, IgA, IgM, transferrina e fibrinogénio em várias etapas de ressuspensáo da pasta II+III, filtração e precipitação de PptG rendimento % pH da incubação e ambas etapas de filt ração temperatu ra de incubação e primeira etapa de filtração etapa proteína total IgG nef./ ELISA1 IqA ELISA IqM ELISA transferrina ELISA fibrinogéni o ELISA 4,5 4°C II+III dissolvid o 100,0 100, 0 100, 0 100, 0 100,0 100, 0 filtrado Cuno 5 0 100,2 92, 9 100, 2 97,8 118,7 86, 3 filtrado Cuno 90 97,0 91, 1 105, 3 108, 6 123,2 80, 1 Ppt G sobrenada nte 33,5 4,4 - - - - Ppt G dissolvid o 71,7 83, 9 75, 6 89, 6 5,0 66, 5 filtrado VR0 6 65,3 85,2 78,8 93, 1 5,2 64,8 25 °C II+III dissolvid o 100,0 100, 0 100, 0 100, 0 100,0 100, 0 filtrado Cuno 5 0 101,0 92, 3 100, 9 104,4 113,2 96,7 filtrado Cuno 90 97,2 92,4 98, 9 113,4 123, 9 84, 6 99
Rendimento de IgG, IgA, IgM, transferrina e fibrinogénio em várias etapas de ressuspensão da pasta II+III, filtração e precipitação de PptG rendimento % pH da incubação e ambas etapas de filtração temperatu ra de incubação e primeira etapa de filtração etapa proteína total IgG nef. / ELISA1 IgA ELISA IgM ELISA transferrina ELISA fibrinogéni o ELISA Ppt G sobrenada nte 33,8 5,1 - - - - Ppt G dissolvid o 72, 9 85,5 68,8 97,5 4,7 89, 9 filtrado VRO 6 68, 3 90, 0 78, 9 95, 9 5, 5 75, 0 4, 7 4 0 C II+III dissolvid o 100,0 100, 0 100, 0 100, 0 100,0 100, 0 filtrado Cuno 5 0 93, 5 83, 9 98, 0 98, 0 115,9 75, 3 Ppt G sobrenada nte 27,5 2,7 - - - - Ppt G dissolvid o 64, 8 81, 1 78,2 90,2 4, 5 73, 9 filtrado VRO 6 60, 5 84, 1 75, 0 92,1 5, 1 70,2 2 5 0 C II+III dissolvid o 100,0 100, 0 100, 0 100, 0 100,0 100, 0 filtrado Cuno 5 0 94, 7 85, 3 103, 1 98, 5 113,8 95, 8 Ppt G sobrenada nte 28,5 4, 1 - - - - Ppt G dissolvid o 65, 3 79,5 73, 1 90, 9 5, 0 87, 0 filtrado VRO 6 61, 9 85, 3 80, 7 93, 0 5, 3 86,9 5, 0 4 0 C II+III dissolvid o 100,0 100, 0 100, 0 100, 0 100,0 100, 0 filtrado Cuno 5 0 86, 1 82,3 101, 5 81, 5 117,5 59,8 Ppt G sobrenada nte 26,0 4, 1 - - - - Ppt G dissolvid o 58, 1 81,2 74, 8 79, 3 4, 5 57, 0 filtrado VRO 6 54, 0 82,1 72,5 67, 8 4, 7 52,5 II+III dissolvid o 100,0 100,0 100, 0 100,0 100,0 100, 0 100
Rendimento de IgG, IgA, IgM, transferrina e fibrinogénio em várias etapas de ressuspensão da pasta XX+III, filtração e precipitação de PptG rendimento % pH da incubação e ambas etapas de filt ração temperatu ra de incubação e primeira etapa de filtração etapa proteína total IgG nef./ ELISA1 IqA ELISA IgM ELISA transferrina ELISA fibrinogéni o ELISA 25°C filtrado Cuno 50 88,0 85,4 99,7 83,2 124,1 75,4 Ppt G sobrenada nte 23,4 1,5 - - - - Ppt G dissolvid o 60,5 84,2 79,0 81,6 4,5 78,2 filtrado VR06 59, 0 85,7 82,0 77,6 4,5 69, 0
Exemplo 9
Para avaliar o pH ótimo na etapa de extração de pasta II+III, para atividades proteoliticas minimizadas no filtrado, o pH durante extração e filtração foi variado num intervalo mais amplo desde pH 3,8 até 7,8. Para este propósito, a pasta II+III modificada foi extraída a baixo pH numa razão de 1+8. Após um tempo curto de agitação, para obter uma dispersão homogénea, a suspensão foi dividida em 8 partes, o pH ajustado com tampão de ácido acético ou Tris a pH 3,8, 4,2, 4,6, 5,0, 6,6, 7,0, 7,4 ou 7,8, e extraída durante 120 minutos adicionais. Depois disso, o pH foi ajustado a 5,1 e a clarificação foi feita por centrifugação em Tubos falcon de 50 mL. A precipitação de Ppt G foi realizada sob condições padrão. A atividade amidolítica e de PKA foram medidas na fração de Ppt G dissolvido como indicado nas Figuras 5 e 6.
Como pode ser visto na amostra armazenada a 4 °C na Figura 5, a atividade amidolítica é minimizada quando a pasta II+III é extraída a pH 5,0. Enfatizando adicionalmente o ponto que as amostras não devem ser mantidas a temperatura elevada (ambiente) durante longos períodos de tempo, a atividade amidolítica foi elevada após 101 o armazenamento da fração de Ppt G dissolvido a temperatura ambiente durante uma semana. De forma semelhante, como observado na Figura 6, a atividade de PKA é minimizada quando a pasta II+III é extraída a pH 5,0 ou maior.
Exemplo 10 O presente exemplo avalia a dependência do pH sobre a perda de rendimento de IgG durante a extração e clarificação. Brevemente, 110 gramas de pasta II+III modificada foi ressuspensa numa razão de 15 gramas de água purificada por grama de pasta II+III, seguido por extração durante 120 minutos. A amostra foi então dividida em quatro partes e o pH ajustado com ácido acético a pH 3,8, 4,2, 4,6, ou 5,0. A pré-extração foi feita antes de dividir em quatro partes a pH nativo para garantir quatro partes idênticas que foram então ajustadas ao pH mencionado e ainda extraída durante uma hora adicional. As amostras foram então clarificadas por meio de filtração com Cuno 50SA ao mesmo pH utilizado para cada extração e precipitação de Ppt G. Após a filtração com Cuno, todas as partes foram tratadas da mesma maneira, o que significa precipitação padrão do precipitado G a pH 7,0 para todas as partes. Os resultados das duas experiências são resumidos a seguir nos Quadros 10 e 11. 102 Quadro 10. Recuperações de proteína e IgG nos filtrados bem como os resultados de MSD e CAE do Precipitado G redissolvido 38/1 41 pH da extração e clarificação 3,8 4,2 4, 6 5,0 3,8 4,2 4, 6 5,0 concentração de ácido acético após ajuste do pH 75 25 10 5 75 25 10 5 filtrado recuperação de proteína (%) 100,3 9 9,6 92, 8 76,0 106, 4 107,5 99, 7 81,0 recuperação de IgG , , . lllllli -m-i-s Precipitado G MSD (% área) >4S0kDa 19,2 20,5 14, 8 13,2 22,5 22, 8 20, 7 16,8 ~350kDa 8, 7 7, 6 10,5 11, 7 5,2 5, 0 7,7 9,4 ~160*Da 69,5 69,2 72, 9 74,2 66, 0 65, 6 67,5 72, 0 <70kDa 2, 7 2,7 1, 8 1, 0 6,2 5, 6 4,1 1, 9 CAE (% gama globulina) 67t4 68,3 78, 1 86,7 68,3 69, 8 77,5 85,1
Quadro 11
Perda de IgG durante a extração e clarificação bem como atividades proteolíticas e de fibrinogénio no Precipitado G redissolvido
Precipitado G pH de extração e clarificação do ácido acético concentração do ácido acético após ajuste do pH (mM) perda de IgG no bolo de filtro (g L"1 plasma) perda de IgG no sobrenadante PptG (g L'1 plasma) perda de IgG Σ (g L"1 plasma) PKA (UI mg'1) fibrinogénio (mg L”1 plasma) PL-1 (pmol mL”1 g”1 3, 8 75 0,00 0,42 0,42 214 173 3, 9 4,2 25 0,01 0,19 0,20 170 134 3,2 4, 6 JO 0,01 0,09 0, 10 38 193 1,4 5, 0 5 , 0,04 0, 13 6, 4 114 0,4 3, 8 75 0,00 0,53 0,53 193 355 3,8 42 25 0,00 0,28 0,28 171 346 3,2 4, 6 10 0,01 0, 14 0, 15 131 340 1,5 5, 0 5 pa-s 0,05 0,21 5,3 189 0,2 103
Os dados anteriores confirmam os resultados mostrados nas Figuras 5 e 6 no que diz respeito à ativação de enzimas proteoliticas por extração em pH baixo, tomados juntamente, os dados demonstram a extração a baixo pH causa menos perda de IgG devido à solubilidade aumentada de todas as proteínas. Estes resultados são consistentes com os exemplos fornecidos anteriormente. Adicionalmente, a perda de IgG mostrada no Quadro 11 sugere que maiores concentrações de ácido acético, resultando em menor pH, resultam em menos perda de IgG no bolo de filtro, mas maior perda de IgG em sobrenadante de Precipitado G. Este fenómeno poderia ser explicado pelas maiores concentrações de acetato na etapa de precipitação após extração em pH baixo.
Exemplo 11
Para determinar condições de extração de II+III adequadas, um protocolo empregando a extração em pH baixo com água purificada ajustado com ácido acético a pH 4,3 e reajuste a pH 4,9 antes da filtração foi comparado com extração em acetato de sódio a 5 mM/di-hidrogenofosfato de sódio a 5 mM com 600 g de ácido acético por 1000 litros de tampão de extração, resultando num pH de dissolução de 4,8 a 4,9. As experiências foram realizadas em escala piloto, começando com 3, 8 a 5 kg de pasta II + III modificada. Todas as experiências incluíram tratamento com Aerosil com 40 g de Aerosil por kg de pasta II+III. Para a clarificação, um filtro prensa Strassburger com armações de filtro de 30cm*30cm equipadas com lâminas de filtro Cuno 50SA foi utilizado. A pós-lavagem foi realizada com 4 volumes mortos do filtro prensa, com um tampão de acetato de sódio a 5 mM/di-hidrogenofosf ato de sódio a 5 mM com 150 gramas de ácido acético por 1000 litros de tampão. A centrifugação de precipitado G foi realizada com uma centrífuga Cepa® Z61H a 17000 RPM (diâmetro de rotor de 10,5 cm) a uma taxa de fluxo de 40 litros por hora. Os resultados da experiência, 104 feita em triplicado, são mostrados no Quadro 12.
Quadro 12
Comparação de extração a pH baixo a pH de 4,3 e desvio de pH para 4,9 antes do tratamento com Aerosil com extração através de condições melhoradas de GAMMAGARD® LIQUID com 600 g de ácido acético glacial por 1000 L de tampão de extração. experiência Unidade P00809N G2 P00909N G2 P01509N G2 P02209N G2 P02509N G2 P02609N G2 método extração a pH baixo 600 g HAc por 1000 L de tampão de extração Pasta II+III #Lote WfKCníftt * 2 ',Í1CBU"Í í> VMíW? f 6 viJGBdíf* 2 WS&J03· 9 kg 5, 00 5, 00 4,97 4, 96 4, 96 3, 86 PEQ L 106,65 118,70 123,32 123,31 117,65 82,35
extrato II+III proteína g 1316 1310 1364 1336 1347 1022 n (BIURETO) q 1, r\ í 11, 0 11,1 10,8 i J-li; 12,4 ..... Is* ^«Jllllllll <3 í .............h-m ............§ν·8·3· 6, 25 % 5tí 6,06 rendimento de IgA (ELISA) g l_1 1,06 0,96 0,98 1, 00 1,01 1,10 rei-õrmenr c de IgM (ELISA) g - 0,40 0, 40 0, 47' 0, 40 0,4 3 filtrado proteína g 957 1007 1038 955 926 731 randíiaersto g ÍT: - p-oreína , &, . - , I. --, -i (BIUREXO)...................... reíi<jiÍ!®0nt-O g 3L~: III í ej.35 ε lllllllllll a, &2 .................1 II 11 rendimento g L de IgA (ELISA) 1,03 0,88 0,96 0,90 1,01 1,10 irmer.rc g L g-- :, 32 0,37 :,-=3 105 extrato do bolo de filtro j||ndimè i i; 1 t * llllliiillllll 0,(T 0,0'* f;· " t
sobrenadante PptG proteína g 1 96 130 188 197 168 109 ilbndimeni!! de protelíiâ Í&IURETO) . 1,5 t,5 1,4 1, 3 §£ ígQ lllll Hm 3ã.} III 1.......1 |. : ........III 11 "' 11 11 |! o, ............ôtôi ...........
Como visto no Quadro 12, ambos os protocolos de extração resultam em recuperações de IgG semelhantes. Dados os resultados dos Exemplos 3 a 10, que mostram que diversas impurezas podem ser minimizadas pela extração de pasta II+III a pH 5,0, os resultados fornecidos no Quadro 12 mostram que a extração a pH 4,8 a 4,9 com 600 g de ácido acético glacial por 1000 L de tampão de extração é superior à extração a baixo pH e subsequente ajuste do pH 4,8 a 5,0. Exemplo 12
Durante o fabrico, armações e linhas do filtro prensa que ligam a e a partir dos tanques têm um volume nulo significativo, que é ainda preenchido com a suspensão ou o filtrado antes da pós-lavagem ser iniciada. Quando a pós-lavagem é finalizada este volume nulo permanece no filtro prensa. Os protocolos padrão consideram este volume nulo por lavagem com entre um ou dois volumes mortos do filtro prensa. Com a finalidade de determinar se a lavagem pós-filtro padrão permite a recuperação eficiente da IgG total, experiências utilizando volumes variáveis de tampão de lavagem foram realizadas em purificações de IgG em fabrico em grande escala. A figura 1 mostra a dependência dos volumes pós-lavagem (como medidos por volumes mortos ou nulos) sobre os níveis de IgG residual e proteína total.
De maneira notável, como observado na Figura 1, uma lavagem de pós filtração utilizando cerca de 2 vezes o 106 volume morto do filtro prensa resulta na perda significativa de recuperação de IgG, como a solução de lavagem contém cerca de 1,5 grama IgG por L solução de lavagem. Surpreendentemente, foi encontrado que 3,6 vezes o volume morto do filtro prensa de tampão de pós-lavagem é necessário para a recuperação eficiente de IgG (denotada pela seta na Figura 1) . Pós-lavagem adicional além de 3,6 volumes mortos do filtro não é conveniente, já que leva à diluição do filtrado sem recuperação adicional de IgG. Exemplo 13
Durante a etapa de precipitação II+III, a concentração do álcool foi aumentada de 20 para 25% e a temperatura reduzida de -5 °C até -7 °C. Aquando da dissolução da pasta II+III, pelo menos 600 mL de ácido acético glacial foram utilizados por 1000 L de volume para ajustar o pH do tampão de ressuspensão da pasta II+III, em contraste à razão anteriormente utilizada de 510 mL de ácido acético glacial / 1000 L de tampão. A razão de extração foi 1 + 15 com o tampão de ácido acético. Para clarificação, 0,04 a 0,06 gramas de Aerosil (tipicamente no limite inferior deste intervalo, por exemplo, 0,04 gramas) foram adicionados por cada grama de pasta II+III. Para a pós-lavagem, cerca de quatro (4x) volumes mortos do filtro prensa de tampão de pós-lavagem foram utilizados. Por exemplo, 4,3 x os volumes mortos do filtro prensa foram utilizados numa experiência particular enquanto 3,6 x os volumes foram utilizados noutra experiência. As quatro ou mais vezes de pós-lavagem de volumes mortos foram aumentadas relativamente às previamente utilizadas 1,8 x de volumes mortos. O tampão foi ajustado com 150 mL de ácido acético glacial utilizado por 1000 L de tampão, um aumento dos anteriores 120 mL de ácido acético glacial / 1000 L de tampão. Estas mudanças levaram a um rendimento 8% mais elevado de IgG e uma pureza de pelo menos 86% de γ-globulina. Uma muito pequena quantidade de IgG residual foi encontrada no extrato do 107 bolo de filtro, quando extraído com fosfato de sódio a 0,1 M + NaCl a 150 mM (pH 7,4, condutividade 25,5 mS/cm). Exemplo 14 A. Otimização do fracionamento I: adição de etanol através de pulverização versus adição de forma fluida; ajuste do pH para pH 7,0 ou 7,5 após a adição de etanol O Quadro 13 mostra o rendimento de IgG pelos métodos de fabrico atualmente em utilização e proporciona uma referência de comparação nas experiências descritas abaixo. 15-20% de IgG é perdida do agrupamento de Cohn para o filtrado. Cerca de 0,4 g de IgG por litro de plasma é perdida no sobrenadante II+III.
Quadro 13
Rendimento de IgG (2009) g/L plasma % de agrupamento de Cohn Fração LA Bl (origem) Viena (origem) LA B5 (Rec.) L.A. (origem) Viena (origem) L.A. (Rec.) Agrupamento de Cohn 6, 18 (5,28-7,02) 6,26 (5,43-6,68) 7,49* (6,41-8,41) 100 100 100 Sobrenadante II+III 0, 41 (0,23-0,63) 0, 39 (0,33-0,47) 0,37 (0,23-0,48) 6, 6 6, 2 4, 9 Precipitado II+III (calculado) 5, 77 5, 87 7, 12 93, 4 93, 8 95, 1 Filtrado II+III 4, 93 (4,21-5,57) 5,19 (4,11-5,48) 6,43 (6,11-7,02) 80 83 86 * LA B5 recuperada de agrupamento de Cohn do plasma: concentração de IgG menor devido à captura com solução salina. Média de LA Bl recuperada de agrupamento de Cohn do plasma: 8,52 g/L.___ Método 0 agrupamento de Cohn foi descongelado a 24-27 °C durante 6-7 horas num balde de 14 litros. Depois o material foi misturado durante a noite a 2-8 °C. 0 agrupamento foi então dividido em 4 partes (de 800 g cada): 1: Adição do etanol de forma fluida, seguida de ajuste do pH para 7,0 108 2: Adição do etanol de forma fluida, seguida de ajuste do pH para 7,5 3. Adição do etanol através de pulverização, seguida de ajuste do pH para 7,0 4. Adição do etanol através de pulverização, seguida de ajuste do pH para 7,5
Todas as partes foram primeiro arrefecidas até 0 °C.
Etanol a 8% foi então adicionado às partes 1 e 2 de forma fluida e através de pulverização às partes 3 e 4 utilizando uma cabeça de pulverização. Em ambos os métodos, o etanol foi adicionado aproximadamente à mesma velocidade. Durante a adição do etanol, o criostato foi ajustado para -5 °C e 75 ml de etanol foram adicionados a cada parte enquanto se misturava. 0 pH foi ajustado para 7,0 ou para 7,5 através de ácido acético a 1 Μ. A solução foi então incubada durante 1 hora. Após a incubação, a solução foi centrifugada com uma centrífuga de provetas (4600 rpm; 30 min; -2 °C).
Resultados
Os rendimentos de IgG foram medidos de forma nefelométrica e são mostrados no Quadro 14. Um rendimento de IgG de quase 100% no sobrenadante do fracionamento I foi obtido com o método melhorado (pulverização de etanol) enquanto com a adição convencional do etanol 0,2 a 0,25 g/L de plasma foram perdidas. Estes resultados indicam que o método melhorado pode levar a um aumento do rendimento de IgG de até 0,2 g/L de plasma no fabrico.
Quadro 14
Amostra Peso (g) IgG nef (média de 3) mg/ml g o. o Pureza (%) g/L Plasma Plasma pobre em crioprecipitado 800 5,72 4,57 100,00 12,2 5,72 Sobrenadante 1 856 5,10 4,37 95, 57 12, 6 5, 46 Sobrenadante 2 853 5,16 4,41 96, 36 12,7 5, 51 Sobrenadante 3 853 5,36 4,58 100,14 13, 1 5, 72 109
Amostra Peso (g) IgG nef (média de 3) mg/ml g o, "0 Pureza (%) g/L Plasma Sobrenadante 4 848 5,33 4,52 98,90 13, 0 5, 65 Β. Escala Piloto: Fracionamento I (pulverização vs. forma fluida; ajuste do pH para 7,4 após a adição do etanol) e Fracionamento II+III (ajuste do pH para 6,7 antes da adição de etanol, reajuste para 6,9 após a adição do etanol) Exemplo 15 Método 2,8 kg de plasma foram descongelados enquanto se misturava a 2 °C. Fração I: Etanol a 8% foi adicionado e o pH ajustado para 7,4 utilizando ácido acético a 5 M.
Enquanto se misturava, a suspensão foi arrefecida até uma temperatura de -2 °C. As condições de pulverização foram obtidas utilizando uma cabeça de pulverização. Em ambos os métodos, a adição de etanol e ácido acético a 5 M foi realizada aproximadamente à mesma velocidade. Após 1 hora de incubação, a solução foi centrifugada utilizando uma centrífuga CEPA a uma temperatura de -4 °C.
Fração II+III: o pH foi ajustado para 6,7 utilizando um tampão de pH igual a 4, depois etanol a 25% foi adicionado (1) através de pulverização ou (2) de forma fluida conforme realizado convencionalmente. O pH foi então reajustado para 6,9. A incubação foi realizada durante 10 horas a -7 °C.
Resultados A perda de IgG durante a fração II+III em etanol a 25% foi medida de forma nefelométrica e é mostrada no Quadro 15. As medições de IgG tiveram uma certa variação, foi portanto tomado o valor médio do método otimizado. 110
Quadro 15
Perda IgG na Fração I Sobrenadante da Fração II+III, adicionado etanol a 25% IgG no filtrado Experiência g por litro de plasma g por litro de plasma % de agrupamento de Cohn NG2C73 0,47 0,08 85,28 NG2C73-1 0,34 0,03 92,27 NG2C73-2 0,05 0,06 95, 94 Média 0,29 0,06 91,16 Referência (adição de etanol por via fluida) 0,29 0,10 87,38
Até ao ponto do precipitado da fração II+III apenas 0,35 g IgG / L de plasma foram perdidas. Um aumento do rendimento de 0,04 g de IgG por litro de plasma foi alcançado durante o fracionamento II+III utilizando o método de pulverização, comparado com a adição de etanol a 25% de forma fluida; e um aumento do rendimento de 0,3 g IgG por litro de plasma foi alcançado (em média, a partir do intervalo de 0,4 a 0,06 g/L), comparado com a adição de etanol a 20% de forma fluida como atualmente utilizado no fabrico. O rendimento de IgG no filtrado é significativamente mais alto quando comparado com a referência e muito mais alto do que os 80 a 86% alcançados atualmente no fabrico com a adição do etanol a 20% de forma fluida na precipitação II+III. C. Fracionamento II+III (etanol a 20%): manter o pH inicial ao longo de todo o fracionamento II+III Exemplo 16 Método 50 litros de plasma foram descongelados enquanto se misturava a 17-20 °C durante 27 horas. O fracionamento I foi realizado conforme mencionado nas secções anteriores como o processo otimizado. O sobrenadante I foi separado em 111 duas partes: (1) pior caso do ajuste do pH: ajuste do pH antes e depois da adição de etanol mas não durante o período de incubação. (2) ajuste do pH otimizado: ajuste do pH antes e depois da adição do etanol e ainda mais reajuste do pH durante o tempo de espera. A solução foi agitada constantemente durante o tempo de espera. 0 pH do sobrenadante de I foi ajustado em ambas as partes para 6,7 antes da adição de etanol utilizando um tampão de pH igual a 4. 0 etanol foi adicionado através de pulverização e o pH reajustado para 6,9 após a adição do etanol.
Na parte (1) o ajuste do pH foi levado a cabo com menor cuidado para simular a pior das hipóteses. 0 pH da solução foi ajustado diretamente depois da adição do etanol mas não durante a incubação. Na parte (2) o pH foi reajustado para um valor constante de 6,8 a 7,0 durante o tempo de incubação de 10 horas.
Resultados
A IgG foi novamente medida de forma nefelométrica e é mostrada no Quadro 16. Através do ajuste contínuo do pH para um valor constante de cerca de 6,9 durante o tempo de espera, apenas 0,13 g IgG por litro de plasma foram perdidas quando comparadas com uma média de 0,4 g/L de plasma no fabrico a larga escala. O aumento do rendimento de 0,07 g IgG por litro de plasma foi alcançado em comparação com a referência (sem pulverização mas com agitação constante durante o período de espera). O aumento de rendimento de cerca de 0,20 g para cerca de 0,30 g IgG por litro de plasma foi alcançado em comparação com o método convencional atualmente em utilização (perda de 0,38 g IgG por litro de plasma, ver Quadro 13). 112
Quadro 16
Volume IgG medida por nefelometria Amostra kg Rendimento (%) g/L plasma Agrupament o Plasma 45,20 100,00 4, 90 Fração I Sobrenadante I 68,66 102,61 5, 03 pH otimizado Sobrenadante II+III 53,09 0,26 0,13 ajuste Referência Sobrenadante II+III 52, 69 0,41 0,20
Conclusão A perda de IgG no sobrenadante II+III é reduzida desde o atual nível de 0,4 g IgG/ L de plasma nos lotes de fabrico para um nível de 0,13 g/L de plasma na precipitação com etanol a 20%, e para um nível de menos de 0,08 g/L de plasma na precipitação com etanol a 25% quando o etanol é adicionado através de pulverização e um pH contínuo de 6,9 ± 0,1 é mantido durante a precipitação.
Na precipitação I, a adição de etanol através de pulverização antes do ajuste do pH leva a um aumento do rendimento de IgG de 0,1 a 0,2 g/L de plasma no sobrenadante do fracionamento I.
Discussão A IgG foi medida de forma nefelométrica em todas as experiências e pode ter uma variância de pelo menos -/ + 5,0% (conforme indicado pelo fabricante do nefelómetro, Siemens AG) . É portanto possível que o atual aumento de rendimento obtido através do método melhorado durante o fabrico seja ligeiramente mais baixo ou mais alto do que o indicado nos exemplos.
Como prova adicional do aumento do rendimento através do novo e melhorado método, o peso da IgG precipitada foi comparado com o peso médio da IgG precipitada obtida da mesma origem de plasma no fabrico. 18 kg de IgG precipitada 113 são obtidos por 1000 litros de agrupamento de Cohn de origem dos US através do método atualmente utilizado no fabrico, em contraste com o estudo de escala piloto (secção B acima) onde 20,8 kg de IgG precipitada foram obtidos (etanol a 20% e ajuste do pH otimizado no fracionamento II+III, adição de ambos tampão e etanol através de pulverização). Isto consiste num aumento de mais de 2 kg de IgG precipitada por 1000 litros de agrupamento de Cohn. Exemplo 17
Este exemplo demonstra que a adição de uma etapa de tratamento com sílica fumada antes da filtração da suspensão da Fração II+III resulta em filtrados de IgG com pureza mais elevada. De forma breve, o plasma pobre em crioprecipitado foi fracionado conforme descrito acima até à etapa de Fração II+III, ponto no qual foi separado em duas amostras. A primeira amostra foi clarificada apenas através da adição do adjuvante de filtração antes da filtração padrão da suspensão da Fração II+III (Figura 7A). A segunda amostra foi sujeita a um pré-tratamento com sílica fumada, conforme descrito no presente documento, antes da adição do adjuvante de filtração e filtração padrão da suspensão da Fração II+III (Figura 7B).
Os componentes proteicos dos filtrados foram então separados através de eletroforese em acetato de celulose e as áreas dos picos individuais foram calculadas utilizando métodos padrão. Conforme pode ser observado nos gráficos de cromatografia e dados quantificados, a segunda amostra, a qual foi tratada com sílica fumada antes da filtração, resultou num filtrado com uma pureza de IgG muito mais elevada do que a amostra não tratada com sílica fumada (68,8% vs. 55,7 de γ-globulina; comparar o Quadro 18 com o Quadro 16). 114
Quadro 17. Quantificação de picos de proteína separadas por eletroforese em acetato de celulose da suspensão da Fração II+III clarificada através da adição do adjuvante de filtração apenas antes da filtração, mostrado na Figura 7A. número de pico da esquerda para a direita área (%) fração 1 55,7 γ-globulina 2 3,2 proteína desnaturada 3 3,7 γ-globulina 4 25,5 a/β-globulina 5 11,9 albumina
Quadro 18. Quantificação de picos de proteína separadas por eletroforese em acetato de celulose da suspensão da Fração II+III pré-tratada com sílica fumada e clarificada através da adição do adjuvante de filtração apenas antes da filtração, mostrado na Figura 7A._ número de pico da esquerda para a direita área (%) fração 1 68,8 γ-globulina 2 18,9 a/β-globulina 3 12,3 albumina
Exemplo 18 0 presente exemplo ilustra a ultrafiltração e formulação de uma preparação de IgG a 20% adequada para administração subcutânea. Esta informação foi reunida durante a produção de preparações de IgG a 2 0% de aumento de escala e pré-clínicas. O processo utilizado para o fabrico de lotes de 20% antes da etapa de nanofiltração foi descrito acima. A ultra/diafiltração foi melhorada para concentrar a solução para 20%. De forma a reduzir a perda de rendimento a um mínimo, a pós-lavagem do dispositivo de ultrafiltração utilizado para diafiltração é concentrada por um segundo dispositivo mais pequeno equipado com as 115 mesmas membranas e depois adicionada à solução total.
Surpreendentemente pôde ser mostrado que a inativação de virus durante o armazenamento a baixo pH não é influenciada pela concentração proteica da solução. Uma redução semelhante de virus foi alcançada em ambas a solução a 10% (GAMMAGARD® LIQUID) e a solução a 20%. Assim sendo, o armazenamento a baixo pH foi mantido para o produto a 20%, enquanto uma etapa de redução de virus.
Antes da nanofiltração, a concentração de glicina da solução de IgG é ajustada até um alvo de 0,25 Μ. A solução é então concentrada até uma concentração de proteína de 6 ± 2% p/v através de ultrafiltração (UF). O pH é ajustado até 5,2 ± 0,2. A membrana de UF utilizada tem um Corte do Peso Molecular Nominal (NMWCO) de 50.000 daltons ou menos e está especialmente concebida para produtos de elevada viscosidade (por exemplo, V screen de Millipore). O concentrado é então diafiltrado contra uma solução de glicina a 0,25 M, pH 4,2 (+-) 0,2. O volume mínimo de permuta é 10 vezes o volume concentrado original. Ao longo da operação de ultrafiltração/diafiltração, a solução é mantida entre cerca de 4 °C a 20 °C.
Após a diafiltração, a solução é concentrada até uma concentração de proteína de pelo menos 22% (p/v). A temperatura da solução é ajustada para 2 °C a 8 °C.
De forma a recuperar a proteína residual completa no sistema, a pós-lavagem do primeiro sistema de ultrafiltração maior é feita com pelo menos 2 vezes o volume morto em modo de recirculação para garantir que toda a proteína é lavada. Depois a pós-lavagem do primeiro sistema de ultrafiltração é concentrada até uma concentração de proteína de pelo menos 22% p/v com um segundo sistema de ultra/diafiltração equipado com o mesmo tipo de membrana a qual está dimensionada a um décimo ou menos da primeira. O concentrado da pós-lavagem é adicionado à solução total. O segundo sistema de 116 ultrafiltração é então pós-lavado. Esta pós-lavagem é utilizada para o ajuste da concentração de proteína da primeira formulação. A temperatura da solução é mantida entre cerca de 2 °C a 8 °C.
De forma a formular a solução final, a concentração de proteína é ajustada para cerca de 20,4 (+-) 0,4% (p/v) com a pós-lavagem do segundo sistema menor de ultrafiltração e/ou com o tampão de diafiltração. O pH é ajustado para entre cerca de 4,4 a 4,9, se necessário.
Exemplo 19
De forma a comparar a fração da IgG recuperada não filtrado da Fração II+III no atual processo de fabrico do GAMMAGARD® LIQUID, cinco purificações de IgG de escala de fabrico foram realizadas utilizando os métodos melhorados de precipitação e dissolução da Fração II+III proporcionados no presente documento. De forma breve, a precipitação de agrupamentos de Cohn de IgG foi realizada com uma concentração de iniciação de IgG de cerca de 6,14 g/L a -7 °C com etanol a 25% incorporado por adição fluida, quando comparado com -5 °C e etanol a 20%, conforme empregue no processo de fabrico atual. O precipitado da Fração II+III modificada foi então extraído de 1 a 15 com um tampão de dissolução tendo um pH de 4,3 ou ajustado com 0,06% de ácido acético glacial, e subsequentemente filtrado através de m filtro de profundidade com uma lavagem final de 4,3 volumes mortos do filtro de tampão de dissolução. Conforme observado no Quadro 18, o filtrado da Fração II+III modificada preparado de acordo com os métodos melhorados proporcionados no presente documento continha uma percentagem significativamente mais elevada (pelo menos um aumento de 8,0%) da IgG presente no agrupamento de Cohn inicial do que a que continha o filtrado da Fração II+III preparado de acordo com o atual procedimento de fabrico (91,1% e 91,6% vs. 83,1% e 83,8%, respetivamente). 117
Quadro 18. Recuperação média de IgG no filtrado da Fraçao
II+III de todos os ensaios da Baxter realizados em Viena durante 2008 € parte de 2009, como comparado com a recuperação de IgG em lotes fabricados de acordo com os métodos melhorados proporcionados no presente documento. Processo Fabrico em Viena Aumento de Escala R&D** atual 2008 IgG no agrupamento Cohn (g/L) de 6,26 6,31 6, 14 6, 13 Álcool em precip. II+III (%) 20 20 25 25 mL de ácido acético/ Dissolução a 1000 L de tampão de PH 4,3; dissolução 510 510 desvio para 4,9 após 600 filtração Aerosil (g/g pasta) 0,045 0,04 0,04 0,04 Pós-lavagem em volumes mortos filtro prensa do 1,8 1,8 4,3 4,3 IgG média no filtrado (% do agrupamento de 83, 1% 83, 8% 91, 1% 91,6% Cohn) 57 Lotes 200 lotes 3 lotes 2 ! lotes IgG adicional no filtrado ...........— n. a. Exemplo 20 De forma a determinar a pureza das composições de IgG proporcionadas no presente documento, três lotes de IgG foram preparados de acordo com os métodos melhorados proporcionados no presente documento. Os produtos de IgG finais destas purificações foram então testados para vários contaminantes, incluindo IgA, IgM, atividade Amidolitica, C3 e fibrinogénio bem como para determinar a percentagem de monómeros/dimeros de IgG na composição final. Tal como pode ser observado no Quadro 19 abaixo, os métodos melhorados de fabrico proporcionados no presente documento resultam em 118 composições finais totais com recuperação de IgG aumentada, 73,6% a 78,5% do material de iniciação quando comparado com 60% a 70% para os métodos atualmente empregues, enquanto mantém os perfis de pureza que são tão bons, senão melhores, do que os atuais padrões de fabrico de IgG.
Quadro 19. Níveis de impurezas e composição monómero/dímero de IgG na composição de IgG preparada de acordo com os métodos de fabrico melhorados proporcionados no presente documento.
Opção 1 3 6 Experiência # (P0.10NG2) 19 20 21 Rendimento de Proteína no fluxo contínuo de ANX [g/L plasma] 4,35 4,35 4,38 Recuperação de IgG: Material de iniciação de Cohn para total [%] 73, 6 78,5 78,5 Caracterização do total final IgA[pg/mL em 10% proteína] 29 26 pend. IgM [pg/mL em 10% proteína] 1,1 1, 1 pend. Atividade amidolitica [PL-1 nmol/mL min] pend. <10 <10 Monómeros/dímeros MSD [%] 99,7 99, 9 99,7 C3 [pg/mL em 10% proteína] pend. pend. pend. Fibrinogénio [pg/mL em 10% proteína] <0,2 pend. pend. 119
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição DE 10008619 [0008] EP 0893450 A [0008] US 4550019 A [0008] US 6150471 A [0008] US 4499073 A [0008] ES 348942 [0010] US 5122373 A [0040] US 5177194 A [0040] US 5180810 A [0042] US 5886154 A [0116] US 6069236 A [0116] wo 2005073252 A [0116] US 7186410 B [0116] US 7553938 B [0116] US 6093324 A [0116] US 6835379 B [0116] US 20020114802 A [0137] US 20030099635 A [0137] US 20020098182 A [0137] US 20090148463 A [0172]
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Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a preparação de uma composição de IgG enriquecida a partir do plasma, o método compreendendo as etapas de: (a) precipitar uma fração de plasma pobre em crioprecipitado, numa primeira etapa de precipitação, com álcool a entre cerca de 6% e cerca de 10% a um pH de entre cerca de 7,0 e cerca de 7,5 para obter um primeiro precipitado e um primeiro sobrenadante; (b) precipitar IgG a partir do primeiro sobrenadante, numa segunda etapa de precipitação, com álcool a entre cerca de 20% e cerca de 25% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um segundo precipitado; (c) ressuspender o segundo precipitado para formar uma suspensão; (d) precipitar IgG a partir da suspensão formada na etapa (c), numa terceira etapa de precipitação, com álcool a entre cerca de 22% e cerca de 28% a um pH de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,3 para formar um terceiro precipitado; (e) ressuspender o terceiro precipitado para formar uma suspensão; e (f) separar a fração solúvel a partir da suspensão formada na etapa (e) , deste modo formando uma composição de IgG enriquecida, em que pelo menos uma da primeira etapa de precipitação, segunda etapa de precipitação, ou terceira etapa de precipitação compreende adição do álcool através de pulverização.
2. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira etapa de precipitação, segunda etapa de precipitação, e terceira etapa de precipitação compreendem todas a adição do álcool através de pulverização. 2 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que 0 pH de pelo menos uma da primeira etapa de precipitação, segunda etapa de precipitação, ou terceira etapa de precipitação é conseguido pela adição de uma solução modificadora do pH após a adição do álcool. 4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o pH do conjunto da primeira etapa de precipitação, segunda etapa de precipitação, e terceira etapa de precipitação é conseguido pela adição de uma solução modificadora do pH após a adição do álcool. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que a adição de uma solução modificadora do pH compreende a adição da solução modificadora do pH através de pulverização. 6. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, em que o pH da etapa de precipitação é modificado antes de e após a adição de álcool, durante e após a adição de álcool, ou antes de, durante, e após a adição de álcool. 7. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o pH de pelo menos uma etapa de precipitação é mantido durante toda a etapa de precipitação por meio do ajuste continuo do pH. 8. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o método compreende ainda uma etapa de purificação através de cromatografia de permuta iónica. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 8, em que o método compreende tanto uma etapa de purificação por meio de cromatografia de permuta aniónica e uma etapa de 3 cromatografia de permuta catiónica.
10. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o método compreende ainda uma etapa de nanofiltração e/ou uma etapa de ultrafiltração/diafiltração.
11. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a composição de IgG enriquecida obtida na etapa (f) contém pelo menos 85%, preferentemente pelo menos 90% do conteúdo de IgG encontrado na fração de plasma pobre em crioprecipitado utilizada na etapa (a).
12. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a pureza de γ-globulinas na composição final de IgG é pelo menos cerca de 95%, preferentemente pelo menos cerca de 98%, mais preferentemente pelo menos cerca de 99%. 13. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o método compreende as etapas de: (a) ajustar o pH de uma fração de plasma pobre em crioprecipitado a cerca de 7,0; (b) ajustar a concentração de etanol da fração de plasma pobre em crioprecipitado da etapa (a) a cerca de 25% (v/v) a uma temperatura entre cerca de -7 °C e cerca de -9 °C, deste modo formando uma mistura; (c) separar o liquido e o precipitado da mistura da etapa (b) ; (d) ressuspender o precipitado da etapa (c) com um tampão contendo fosfato e acetato, em que o pH do tampão é ajustado com entre 300 mL e 700 mL de ácido acético glacial por 1000 L de tampão, deste modo formando uma suspensão; (e) misturar dióxido de silicio (SiCt) dividido finamente 4 com a suspensão da etapa (d) durante pelo menos cerca de 30 minutos; (f) filtrar a suspensão com um filtro prensa, deste modo formando um filtrado; (g) lavar o filtro prensa com pelo menos 3 volumes mortos do filtro prensa de um tampão contendo fosfato e acetato, em que o pH do tampão é ajustado com entre 50 mL e 200 mL de ácido acético glacial por 1000L de tampão, deste modo formando uma solução de lavagem; (h) combinar o filtrado da etapa (f) com a solução de lavagem da etapa (g) , deste modo formando uma solução, e tratar a solução com um detergente; (i) ajustar o pH da solução da etapa (h) até cerca de 7,0 e adicionar etanol a uma concentração final de cerca de 25%, deste modo formando um precipitado; (j) separar liquido e precipitado da mistura da etapa (i) ; (k) dissolver o precipitado numa solução aquosa compreendendo um solvente ou detergente e manter a solução durante pelo menos 60 minutos; (l) passar a solução após a etapa (k) através de uma coluna de cromatografia de permuta catiónica e eluir as proteínas absorvidas na coluna num eluato; (m) passar o eluato da etapa (1) através de uma coluna de cromatografia de permuta aniónica para gerar um efluente; (n) passar o efluente da etapa (m) através de um nanofiltro para gerar um nanofiltrado; (o) passar o nanofiltrado da etapa (n) através de um membrana de ultrafiltração para gerar um ultrafiltrado; e (p) diafiltrar o ultrafiltrado da etapa (o) contra um tampão de diafiltração para gerar um diafiltrado tendo uma concentração de proteína entre cerca de 8% (p/v) e cerca de 12% (p/v), deste modo obtendo uma composição de IgG concentrada. 5 14. 0 método de acordo com a reivindicação 13, em que a concentração de etanol é ajustado em pelo menos uma das etapas (b) e (i) pela introdução de etanol na fração através de pulverização. 15. 0 método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que o pH é ajustado até o pH apropriado após a adição de etanol em pelo menos uma das etapas (b) e (i). 16. 0 método de acordo com a reivindicação 15, em que o pH é mantido durante toda a reação de precipitação por meio do ajuste continuo do pH em pelo menos uma das etapas (b) e (i) · 17. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, em que o pH é ajustado em pelo menos uma etapa através de pulverização de uma solução capaz de ajustar o pH. 18. 0 método de acordo com a reivindicação 17, em que o pH é ajustado através de pulverização de ácido acético glacial. 19. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, em que o método compreende ainda filtrar o diafiltrado através de um filtro de 0,22 pm ou menos. 20. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, em que o plasma é plasma humano. 21. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, em que a fração de plasma pobre em crioprecipitado é formada por um método compreendendo as etapas de: (i) arrefecer uma mistura de doações de plasma agrupados a uma temperatura entre cerca de 2 °C e cerca de 10 °C; 6 (ii) separar o líquido e o precipitado da mistura da etapa (i) por meio de centrifugação; (iii) misturar etanol no líquido sobrenadante formado na etapa (ii) a uma concentração final de entre cerca de 5% (v/v) a cerca de 10% (v/v) de etanol, deste modo formando uma mistura; (iv) arrefecer a mistura formada na etapa (iii) até entre cerca de -4 °C e cerca de 0 °C; (v) separar o líquido e o precipitado da mistura da etapa (iv) por meio de centrifugação; e isolar o sobrenadante, deste modo formando uma fração de plasma pobre em crioprecipitado.
22. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, em que a temperatura da mistura da etapa (b) é cerca de -7 °C.
23. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 22, em que o precipitado formado na etapa (c) é ressuspenso com entre cerca de 12 L e cerca de 18 L de tampão por kg precipitado, preferentemente com cerca de 15 L de tampão por kg precipitado.
24. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, em que a quantidade de dióxido de silício adicionada à suspensão na etapa (e) é entre cerca de 0,02 gramas por grama de precipitado formado na etapa (c) e cerca de 0,0 6 gramas por grama de precipitado formado na etapa (c) , preferentemente em que a quantidade de dióxido de silício adicionada à suspensão na etapa (e) é cerca de 0,04 gramas por grama de precipitado formado na etapa (c).
25. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 24, em que um adjuvante de filtração é adicionado à mistura antes de filtração na etapa (f). 7 26. 0 método de acordo com a reivindicação 25, em que o adjuvante de filtração é terra de diatomáceas. 27. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 26, em que a pureza das γ-globulinas no filtrado formado na etapa (f) é pelo menos cerca de 85%. 28. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 27, em que o filtrado formado na etapa (f) contém menos de cerca de 10 mg de fibrinogénio por grama de proteína total.
29. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 28, em que o filtrado formado na etapa (f) contém menos de cerca de 500 UI de atividade de PKA por grama de proteína total.
30. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 29, em que o detergente utilizado na etapa (h) compreende entre cerca de 0,1 % (p/v) e cerca de 0,3% (p/v) polissorbato-80.
31. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 30, em que a solução aquosa utilizada na etapa (k) compreende Triton-X 100, polissorbato-80, e TNBP.
32. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 31, em que a solução na etapa (k) é mantida a uma temperatura entre cerca de 18 °C e cerca de 25 °C.
33. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 32, em que o nanofiltro da etapa (n) tem um tamanho de poro médio de entre cerca de 15 nm e cerca de 72 nm, preferentemente de entre cerca de 19 nm e cerca de 35 nm, mais preferentemente de cerca de 35 nm. 34. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 33, em que a membrana de ultrafiltração da etapa (o) tem um peso molecular de corte nominal (NMWCO) de cerca de 100 kDa ou menos.
35. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 34, em que a concentração de proteína da composição é cerca de 10% (p/v).
36. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 35, em que a solução formada na etapa (h) contém pelo menos cerca de 85%, preferentemente pelo menos cerca de 90% da IgG presente na fração de plasma pobre em crioprecipitado da etapa (a).
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