CN109180776A - 通过用微细分的二氧化硅处理去除丝氨酸蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了降低源自血浆的蛋白质组合物的丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量的新型方法。还提供了制造丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量降低的源自血浆的蛋白质组合物的方法。在其它方面，本发明提供了丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量降低的源自血浆的蛋白质的水性和冻干组合物。其它方面包括治疗、处理和/或预防疾病的方法，所述方法包括施用丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原含量降低的源自血浆的蛋白质组合物。

Description

通过用微细分的二氧化硅处理去除丝氨酸蛋白酶
本申请是申请日为2011年5月26日、申请号为201180036374.3 (国际申请号为PCT/US2011/038247)、名称为“通过用微细分的二氧化硅处理去除丝氨酸蛋白酶”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年5月26日提交且作为澳大利亚专利号 2010202125颁布的AU专利申请号2010202125、2010年5月27日提交的美国专利申请序号12/789,365以及2010年7月23日提交的美国专利申请序号12/842,944的优先权，所述文献的公开内容据此以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的。
发明背景
源自血浆的血液产品不仅用以治疗多种血液病症，而且用于治疗其它来源的疾病。例如，1952年首次使用来自人类血浆的免疫球蛋白(IgG)产品来治疗免疫缺乏症。从那以后，IgG制剂被广泛用于至少三个主要类别的医学病状中：(1)免疫缺乏症，如X连锁无γ球蛋白血症、低γ球蛋白血症(原发性免疫缺乏症)以及后天免疫力低下病状 (继发性免疫缺乏症)，特征为抗体水平低；(2)发炎性和自体免疫性疾病；以及(3)急性感染。
同样地，因子H被暗示作为数种人类疾病病况的潜在治疗剂，所述病况包括年龄相关的黄斑变性(AMD)、溶血尿毒症综合症(aHUS) 以及膜增生性肾小球肾炎(MPGN)。具体来说，已经表征了因子H的补体控制蛋白(CCP)模块7中的单核苷酸多形现象(SNP)与年龄相关的黄斑变性(AMD)之间的因果关系。
研究已显示间α抑制蛋白(IaIp)血浆水平减低与患严重败血症的患者死亡率之间的关联性(Lim等,J Infect Dis.(2003)9月15日； 188(6):919-26和Opal等,Crit CareMed.(2007)2月；35(2):387-92)。此外，数种研究已显示施用IaIp可降低与败血症和败血性休克相关的死亡率(Jourdain等,Am J Respir Crit Care Med.(1997)12月； 156(6):1825-33；Yang等,Crit Care Med.(2002)3月；30(3):617-22；Lim 等,J Infect Dis.(2003)9月15日；188(6):919-26；以及Wu等,Crit Care Med.(2004)8月；32(8):1747-52；所述出版物的公开内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)。
当制造和配制源自血浆的生物治疗剂时必须考虑各种安全预防措施。这些措施包括去除和/或使由使用捐赠的血浆所产生的血浆携带的病原体(例如病毒性和细菌性病原体)、抗补体活性以及其它有害污染物灭活的方法。研究表明施用高水平的酰胺水解活性(amidolytic activity)会引起有害血栓栓塞事件(Wolberg AS等,Coagulation factorXI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations.Am J Hematol2000；65:30-34；和Alving BM等,Contact-activated factors: contaminants ofimmunoglobulins preparations with coagulant and vasoactive properties.J LabClin Med 1980；96:334-346；所述出版物的公开内容据此以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)。突显这一问题的是在有关血栓栓塞事件的报告增加之后，近来在美国自动撤销(Octapharma)和欧洲委员会(European Commission)中止和octagam 10％的销售授权。血栓事件增加可能由生物制剂中由丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原杂质如因子XI、因子XIa、因子XII以及因子XIIa引起的高水平的酰胺水解活性所致(FDA通知： 2010年9月23日，自市场自动撤销Octagam[静脉注射用免疫球蛋白 (人类)]5％液体制剂；AFSSAPS于2010年9月9日在线公布，检疫隔离所有批次的Octagam 50mg/ml输注药液(solution pour perfusion) (Octapharma France)；以及欧洲药品管理局(EuropeanMedicines Agency)于2010年9月23日在线公布的关于中止Octagam(人类正常免疫球蛋白5％和10％)的销售授权的问答)。
一般称为凝血因子的专用丝氨酸蛋白酶为凝血级联反应的接触活化与组织因子路径的必要组分。当刺激凝血路径时，作为无活性的酶前体的丝氨酸蛋白酶原成为可催化下一个蛋白酶原活化的活化蛋白酶，从而引起活化级联反应。这种凝血级联反应以活化凝血酶(因子IIa)和因子XIIIa而终结，凝血酶和因子XIIIa功能分别在于使纤维蛋白原(因子I)转化成纤维蛋白(因子Ia)和使纤维蛋白交联而形成纤维蛋白凝块。
还称为固有凝血路径的接触活化路径分别由激肽释放酶和因子 XIIa(FXIIa)自前激肽释放酶和因子XII的活化开始。所活化的丝氨酸蛋白酶FXIIa裂解因子XI(FXI)，使酶原转化成因子XIa(FXIa)，即一种活性丝氨酸蛋白酶，其会参与因子Xa(FXa)的后续活化。
由于对源自血浆的蛋白质组合物中存在丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原的担忧不断增加，因此本领域中仍存在对降低这些污染物并且尤其是FXI、FXIa、FXII以及FXIIa的水平的方法的需要。本发明通过提供所述方法和丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶原水平降低的源自血浆的蛋白质组合物来实现这些和其它需要。
发明概述
一方面，本发明是基于以下令人意外的发现：丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原，并且具体来说FXI、FXIa、FXII以及FXIIa可以通过用微细分的二氧化硅(SiO2)处理而自源自血浆的蛋白质组合物去除。以此方式，本发明提供降低源自血浆的蛋白质组合物的丝氨酸蛋白酶活性、丝氨酸蛋白酶含量以及丝氨酸蛋白酶原含量的方法。还提供丝氨酸蛋白酶活性、丝氨酸蛋白酶含量以及丝氨酸蛋白酶原含量降低的治疗性源自血浆的蛋白质组合物，以及通过施用所述组合物来治疗或预防疾病的方法。
在第一方面中，本发明提供一种用于降低源自血浆的目标蛋白质组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，该方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离以去除所结合的丝氨酸蛋白酶。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa (FXIIa)、因子XI(FXI)或因子XII(FXII)。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在一个实施方案中，第一目标蛋白质浓化步骤是蛋白质沉淀步骤。在一个特定实施方案中，蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤。在另一个实施方案中，第一目标蛋白质浓化步骤是超滤 /透滤步骤。
在上述方法的其它实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：执行第二目标蛋白质浓化步骤，然后使浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在一个实施方案中，第二目标蛋白质浓化步骤是蛋白质沉淀步骤。在一个特定实施方案中，蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤。在另一个实施方案中，第二目标蛋白质浓化步骤是超滤/透滤步骤。在另一个实施方案中，第二目标蛋白质浓化步骤是色谱浓化步骤。
在上述方法的其它实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：在使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触之后，执行第三目标蛋白质浓化步骤。在一个实施方案中，第三目标蛋白质浓化步骤是蛋白质沉淀步骤。在一个特定实施方案中，蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤。在另一个实施方案中，第三目标蛋白质浓化步骤是超滤/透滤步骤。在另一个实施方案中，第三目标蛋白质浓化步骤是色谱浓化步骤。
在上述方法的某些实施方案中，色谱浓化步骤包括以下子步骤： (i)在适合于结合源自血浆的目标蛋白质的条件下使源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和(ii)自色谱树脂洗脱源自血浆的目标蛋白质。在一个特定实施方案中，在子步骤(i)中杂质不结合至色谱树脂。在另一个特定实施方案中，在子步骤(i)中杂质结合至色谱树脂，但在子步骤(ii)中不会自色谱树脂洗脱。
在上述方法的其它某些实施方案中，色谱浓化步骤包括以下子步骤：(i)在适合于结合至少一种杂质的条件下使第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和(ii)使树脂与源自血浆的蛋白质组合物分离，其中在子步骤(i)中源自血浆的目标蛋白质不结合至色谱树脂。
在上述包括色谱浓化步骤的方法的某些实施方案中，色谱树脂选自由以下组成的组：阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、疏水性相互作用树脂、混合式树脂(mixed moderesin)、羟磷灰石树脂、配位体亲和树脂、免疫亲和树脂以及尺寸排阻树脂。
在上述包括色谱浓化步骤的方法的其它某些实施方案中，色谱浓化步骤包括使用尺寸排阻色谱法按大小和/或形状自目标蛋白质分离至少一种杂质。
在上述方法的某些实施方案中，源自血浆的目标蛋白质选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)。在一个特定实施方案中，补体系统的蛋白质选自由因子H(FH)、因子D、补体蛋白C3以及 C4结合蛋白组成的组。
在上述方法的另一个实施方案中，源自血浆的目标蛋白质组合物是制造中间物。
在第二方面中，本发明提供一种用于制备源自血浆的因子H组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；(c)在因子H仍保持结合的溶液条件下自SiO2洗脱丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)自SiO2洗脱因子H。
在上述方法的某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱，并且因子H仍保持结合的溶液条件包括大于约6.0的 pH。在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱，并且因子H仍保持结合的溶液条件包括大于约6.5的pH。在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱，并且因子H仍保持结合的溶液条件包括大于约7.0的pH。在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱，并且因子H仍保持结合的溶液条件包括至少约7.5的pH。
在上述方法的某些实施方案中，溶液条件包括不大于11.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括不大于10.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括不大于9.0的pH。
在上述方法的某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱，并且因子H仍保持结合的溶液条件包括大于约10 mS/cm的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱，并且因子H仍保持结合的溶液条件包括大于约20mS/cm的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱，并且因子H仍保持结合的溶液条件包括介于约10mS/cm与约50mS/cm之间的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱，并且因子H仍保持结合的溶液条件包括介于约20mS/cm与约 50mS/cm之间的电导率。
在第三方面中，本发明提供一种用于制备因子H组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)在丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合至SiO2的条件下自SiO2洗脱因子H。
在上述方法的某些实施方案中，因子H自SiO2洗脱，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括大于约6.0的 pH。在另一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括大于约6.5的pH。在另一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括大于约7.0的pH。在另一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括至少约7.5的pH。
在上述方法的某些实施方案中，溶液条件包括不大于11.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括不大于10.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括不大于9.0的pH。
在上述方法的某些实施方案中，因子H自SiO2洗脱，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括小于约20 mS/cm的电导率。在另一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括小于约10mS/cm的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括介于约2mS/cm与约20mS/cm之间的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括介于约2mS/cm与约10mS/cm之间的电导率。
在第四方面中，本发明提供一种用于制备因子H组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H，但不适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下，使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2) 接触；(b)使SiO2与所述组合物分离；以及(c)自SiO2洗脱因子H。
在上述方法的某些实施方案中，因子H结合至SiO2，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括大于约6.0 的pH。在另一个实施方案中，因子H结合至SiO2，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括大于约6.5的pH。在另一个实施方案中，因子H结合至SiO2，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括大于约7.0的pH。在另一个实施方案中，因子H结合至SiO2，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括至少约7.5的pH。
在上述方法的某些实施方案中，溶液条件包括不大于11.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括不大于10.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括不大于9.0的pH。
在上述方法的某些实施方案中，因子H结合至SiO2，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括大于约10 mS/cm的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，因子H结合至 SiO2，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括大于约20mS/cm的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，因子H结合至SiO2，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至 SiO2的溶液条件包括介于约10mS/cm与约50mS/cm之间的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，因子H结合至SiO2，并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括介于约20 mS/cm与约50mS/cm之间的电导率。
在第五方面中，本发明提供一种用于制备因子H组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，但不适合于结合因子H的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触，和(b)使SiO2与组合物分离。
在上述方法的某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且因子H不结合至SiO2的溶液条件包括大于约6.0 的pH。在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且因子H不结合至SiO2的溶液条件包括大于约6.5的pH。在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且因子H不结合至SiO2的溶液条件包括大于约7.0的pH。在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且因子H不结合至SiO2的溶液条件包括至少约7.5的pH。
在上述方法的某些实施方案中，溶液条件包括不大于11.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括不大于10.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括不大于9.0的pH。
在上述方法的某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且因子H不结合至SiO2的溶液条件包括小于约20 mS/cm的电导率。在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且因子H不结合至SiO2的溶液条件包括小于约10mS/cm的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且因子H不结合至SiO2的溶液条件包括介于约2mS/cm与约20mS/cm之间的电导率。在上述方法的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且因子H不结合至SiO2的溶液条件包括介于约2mS/cm与约10 mS/cm之间的电导率。
在第六方面中，本发明提供一种用于制备间α胰蛋白酶抑制剂 (IαI)组合物的方法，所述组合物具有降低的丝氨酸蛋白酶活性，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的条件下使含有IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的溶液与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；(c)在IαI仍保持结合的条件下自SiO2洗脱丝氨酸蛋白酶；以及(d)自SiO2洗脱IαI。
在第七方面中，本发明提供一种用于制备间α胰蛋白酶抑制剂 (IαI)组合物的方法，所述组合物具有降低的丝氨酸蛋白酶活性，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的条件下使含有IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的溶液与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)在丝氨酸蛋白酶仍保持结合至SiO2的条件下自SiO2洗脱IαI。
在第八方面中，本发明提供一种用于制备间α胰蛋白酶抑制剂 (IαI)组合物的方法，所述组合物具有降低的丝氨酸蛋白酶活性，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合IαI，但不适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶的条件下使含有IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的溶液与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)自 SiO2洗脱IαI。
在第九方面中，本发明提供一种用于制备间α胰蛋白酶抑制剂 (IαI)组合物的方法，所述组合物具有降低的丝氨酸蛋白酶活性，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合丝氨酸蛋白酶，但不适合于结合间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)的条件下，使含有间α胰蛋白酶抑制剂(IαI) 和至少一种丝氨酸蛋白酶的溶液与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和 (b)使SiO2与组合物分离。
在上述方面的某些实施方案中，使组合物与SiO2在每克蛋白质至少1克的SiO2的最终浓度下接触。在上述方面的另一个实施方案中，使组合物与SiO2在每克蛋白质至少2克的SiO2的最终浓度下接触。在上述方面的另一个实施方案中，使组合物与SiO2在每克蛋白质至少2.5克的SiO2的最终浓度下接触。
在上述方面的某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XI。在上述方面的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XIa。在上述方面的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XII。在上述方面的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XIIa。
在第十方面中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，其是通过包括根据任一上述方面的降低丝氨酸蛋白酶活性的方法的工艺来制备。在一个实施方案中，组合物被配制用于施用给受试者。在一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内、肌肉内或皮下施用。在一个实施方案中，组合物为水性的。在另一个实施方案中，组合物被冻干。
在第十一方面中，本发明提供一种用于治疗有需要的受试者的与血浆蛋白质的异常活性相关的疾病的方法，所述方法包括施用根据上述方面的源自血浆的蛋白质组合物。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)。
在第十二方面中，本发明提供一种用于制备因子H组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使含有因子H的悬浮血浆沉淀物部分与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)用包含低pH和低电导率的洗涤缓冲液洗涤SiO2；以及(c)用包含介于7.0与8.0之间的pH和至少10mS/cm的电导率的洗脱缓冲液自SiO2洗脱因子H。在特定实施方案中，含有因子H的血浆沉淀物部分是科恩部分(Cohn fraction)II+III 沉淀物、科恩部分I+II+III沉淀物、奇斯勒/尼赤曼沉淀物 (Kistler/Nitschmann Precipitate)A或奇斯勒/尼赤曼沉淀物B。在某些实施方案中，所述方法进一步包括一或多个选自以下的其它步骤：(d) 自因子H洗脱中沉淀并去除至少一种杂质；(e)自浓化组合物沉淀并回收因子H；(f)通过阴离子交换色谱法进一步浓化因子H；(g)通过肝素亲和色谱法进一步浓化因子H；(h)专用病毒灭活步骤；以及(i)通过超滤/透滤浓缩浓化的因子H组合物。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的目标蛋白质组合物中的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b) 使SiO2与组合物分离以去除所结合的丝氨酸蛋白酶，其中至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XIa(FXIa)、因子XIIa (FXIIa)、因子XI(FXI)或因子XII(FXII)。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在一个实施方案中，第一目标蛋白质浓化步骤是蛋白质沉淀步骤。在一个特定实施方案中，蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤。在另一个特定实施方案中，第一目标蛋白质浓化步骤是超滤/透滤步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：执行第二目标蛋白质浓化步骤，然后使所述浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在一个实施方案中，第二目标蛋白质浓化步骤是蛋白质沉淀步骤。在一个特定实施方案中，蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤。在一个实施方案中，第二目标蛋白质浓化步骤是超滤/透滤步骤。在一个实施方案中，第二目标蛋白质浓化步骤是色谱浓化步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：执行第三目标蛋白质浓化步骤，然后使所述浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在一个实施方案中，第三目标蛋白质浓化步骤是蛋白质沉淀步骤。在一个特定实施方案中，蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤。在一个实施方案中，第三目标蛋白质浓化步骤是超滤/透滤步骤。在一个实施方案中，第三目标蛋白质浓化步骤是色谱浓化步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述色谱浓化步骤包括以下子步骤：(i)在适合于结合源自血浆的目标蛋白质的条件下使源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和(ii)自色谱树脂洗脱源自血浆的目标蛋白质。在一个特定实施方案中，在子步骤(i)中至少一种杂质不结合至色谱树脂。在另一个特定实施方案中，在子步骤(i)中至少一种杂质结合至色谱树脂，但在子步骤(ii)中不会自色谱树脂洗脱。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述色谱浓化步骤包括以下子步骤：(i)在适合于结合至少一种杂质的条件下使第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和(ii)使树脂与源自血浆的蛋白质组合物分离，其中在子步骤(i)中源自血浆的目标蛋白质不结合至色谱树脂。
在上述方法的一个特定实施方案中，色谱树脂选自由以下组成的组：阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、疏水性相互作用树脂、混合式树脂、羟磷灰石树脂、配位体亲和树脂、免疫亲和树脂以及尺寸排阻树脂。在一个实施方案中，色谱树脂是阴离子交换树脂。在一个实施方案中，色谱树脂是阳离子交换树脂。在一个实施方案中，色谱树脂是疏水性相互作用树脂。在一个实施方案中，色谱树脂是混合式树脂。在一个实施方案中，色谱树脂是羟磷灰石树脂。在一个实施方案中，色谱树脂是配位体亲和树脂。在一个实施方案中，色谱树脂是免疫亲和树脂。在一个实施方案中，色谱浓化步骤包括使用尺寸排阻色谱法按大小和/或形状自所述目标蛋白质分离至少一种杂质。
在上述方法的一个特定实施方案中，源自血浆的目标蛋白质选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)。在一个实施方案中，源自血浆的蛋白质是免疫球蛋白(Ig)。在一个实施方案中，源自血浆的蛋白质是白蛋白。在一个实施方案中，源自血浆的蛋白质是α-1- 抗胰蛋白酶。在一个实施方案中，源自血浆的蛋白质是丁酰胆碱酯酶。在一个实施方案中，源自血浆的蛋白质是补体系统的蛋白质。在一个实施方案中，补体系统的蛋白质选自由因子H(FH)、因子D、补体蛋白C3和C4结合蛋白组成的组。在一个实施方案中，源自血浆的蛋白质是间α胰蛋白酶抑制剂。
在上述方法的一个特定实施方案中，源自血浆的目标蛋白质组合物为制造中间物。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备源自血浆的因子H 组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2) 接触；(b)使SiO2与组合物分离；(c)在实质部分的因子H仍保持结合的溶液条件下，自SiO2洗脱丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及 (d)自SiO2洗脱因子H。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合SiO2的溶液条件包括低于7.0的pH和小于11mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合SiO2的溶液条件包括介于4.5与6.5之间的pH和小于6mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合SiO2的溶液条件包括介于4.5与6.5之间的pH和介于0.5mS/cm与5mS/cm之间的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且实质部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括低于7.0的pH和小于11mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且实质部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括介于4.5与6.5之间的pH和小于6mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且实质部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和介于0.5mS/cm与5mS/cm之间的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H自SiO2洗脱的溶液条件包括至少6mS/cm的离子强度。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H自SiO2洗脱的溶液条件包括至少11mS/cm的离子强度。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H自SiO2洗脱的溶液条件包括介于5.0与7.0之间的pH。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H自SiO2洗脱的溶液条件包括介于7.0与8.0之间的pH和介于4mS/cm与7mS/cm之间的离子强度。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备因子H组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)在实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合至SiO2的条件下，自SiO2洗脱因子H。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合SiO2的溶液条件包括低于7.0的pH和小于11mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且实质部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括介于4.5与6.5之间的pH和小于6mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，适合于结合因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的溶液条件包括介于5.0与6.0 之间的pH和介于0.5mS/cm与5mS/cm之间的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H自SiO2洗脱并且实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括介于5.0与7.0之间的pH和至少11mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H自SiO2洗脱并且实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括介于7.0与8.0之间的pH和介于2mS/cm与10mS/cm之间的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，溶液条件的电导率介于4 mS/cm与7mS/cm之间。
在上述方法的一个特定实施方案中，溶液条件的电导率介于5 mS/cm与6mS/cm之间。
在一个实施方案中，本发明提供用于制备因子H组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H，但不适合于结合实质部分的至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下，使含有因子H 和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及
(c)自SiO2洗脱因子H。
在上述方法的一个特定实施方案中，因子H结合至SiO2，并且实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括介于5.0与7.0之间的pH和不大于14mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，溶液条件的电导率介于9 mS/cm与14mS/cm之间。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备因子H组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，但不适合于结合实质部分的因子H的条件下，使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且实质部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括介于5.0与7.0之间的pH和至少11mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，并且实质部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括介于7.0与8.0之间的pH和介于2mS/cm与10mS/cm之间的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，溶液条件的电导率介于4 mS/cm与7mS/cm之间。
在上述方法的一个特定实施方案中，溶液条件的电导率介于5 mS/cm与6mS/cm之间。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备因子H组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H的条件下，使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)用包含介于5.0与7.0之间的pH和小于4mS/cm的电导率的溶液洗涤SiO2；以及(c)用包含介于7.0 与8.0之间的pH和大于10mS/cm的电导率的溶液自SiO2洗脱因子 H。
在上述方法的一个特定实施方案中，用于洗涤SiO2的溶液包含介于5.5与6.5之间的pH。
在上述方法的一个特定实施方案中，用于洗涤SiO2的溶液包含介于6.0±0.2之间的pH。
在上述方法的一个特定实施方案中，用于洗脱因子H的溶液包含至少20mS/cm的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，用于洗脱因子H的溶液包含介于25mS/cm与40mS/cm之间的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，含有因子H的起始组合物是悬浮的科恩部分II+III沉淀物，或其等效部分。
在上述方法的一个特定实施方案中，含有因子H的起始组合物是悬浮的奇斯勒/尼赤曼沉淀物A，或其等效部分。
在上述方法的一个特定实施方案中，含有因子H的起始组合物是悬浮的奇斯勒/尼赤曼沉淀物B，或其等效部分。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：使至少一种杂质自回收的因子H溶液沉淀，其中因子H不沉淀。
在上述方法的一个特定实施方案中，沉淀步骤是PEG沉淀。
在上述方法的一个特定实施方案中，PEG沉淀包括用PEG 4000 在介于3％与7％之间的最终浓度下沉淀。
在上述方法的一个特定实施方案中，PEG 4000的最终浓度是 5±0.5％。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：使因子H自回收的因子H溶液沉淀。
在上述方法的一个特定实施方案中，沉淀步骤是PEG沉淀。
在上述方法的一个特定实施方案中，PEG沉淀包括用PEG 4000 在介于10％与15％之间的最终浓度下沉淀。
在上述方法的一个特定实施方案中，PEG 4000的最终浓度是 12±0.5％。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：通过色谱法浓化因子H。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述色谱浓化步骤包括阴离子交换色谱法。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述色谱浓化步骤包括肝素亲和色谱法。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述色谱浓化步骤包括阴离子交换色谱法，之后是肝素亲和色谱法。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括至少一个专用的病毒去除或灭活步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法包括纳滤步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括浓缩因子H组合物的步骤，所述步骤包括超滤/透滤。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的条件下使含有IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的溶液与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；(c)在实质部分的IαI仍保持结合的条件下，自SiO2洗脱丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)自SiO2洗脱IαI。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的条件下使含有IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的溶液与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c) 在实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合至SiO2的条件下，自SiO2洗脱IαI。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合IαI，但不适合于结合实质部分的至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下，使含有IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶的溶液与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)自SiO2洗脱IαI。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，但不适合于结合间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)的条件下，使含有间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)和至少一种丝氨酸蛋白酶的溶液与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备免疫球蛋白G(IgG) 组合物的方法，所述组合物具有降低量的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，所述方法包括以下步骤：(a)在第一沉淀步骤中，用介于约6％与约10％之间的醇，在介于约7.0与约7.5之间的pH下，使冷质粒上清液部分沉淀，以便获得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步骤中，用介于约20％与约25％之间的醇，在介于约6.7与约7.3之间的pH下，使IgG自第一上清液沉淀，以便形成第二沉淀物；(c)将第二沉淀物再悬浮，以形成悬浮液；(d)在适合于结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的溶液条件下，使所述悬浮液与微细分的二氧化硅 (SiO2)接触；以及(e)使SiO2与悬浮液分离，以形成净化悬浮液。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：(f)在第三沉淀步骤中，用介于约22％与约28％之间的醇，在介于约6.7与约7.3之间的pH下，使IgG自在步骤(e)中形成的净化悬浮液沉淀，以便形成第三沉淀物；(g)将第三沉淀物再悬浮，以形成悬浮液；以及(h)自步骤(e)中形成的悬浮液分离可溶性部分，从而形成浓化的IgG组合物。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括阴离子交换色谱法浓化步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括阳离子交换色谱法浓化步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括至少一个专用的病毒灭活或去除步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法包括溶剂/清洁剂 (S/D)病毒灭活步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法包括纳滤步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法包括在低pH下的培育步骤。
在上述方法的一个特定实施方案中，步骤(b)包括在介于约-7℃与约-9℃之间的温度下，将步骤(a)中形成的第一上清液的乙醇浓度调整至约25％(v/v)。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述温度是约-9℃。
在上述方法的一个特定实施方案中，步骤(c)包括用含有磷酸盐和乙酸盐的缓冲液将步骤(b)的沉淀物再悬浮，其中用每1000L缓冲液介于300mL与700mL之间的冰乙酸来调整述缓冲液的pH。
在上述方法的一个特定实施方案中，步骤(d)包括添加SiO2至对于步骤(b)中形成的每克沉淀物约0.02克与对于步骤(b)中形成的每克沉淀物约0.06克的最终浓度。
在上述方法的一个特定实施方案中，适合于结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的溶液条件包括介于4.5与6.0之间的pH和介于0.1 mS/cm与3mS/cm之间的电导率。
在上述方法的一个特定实施方案中，pH介于4.9与5.3之间。
在上述方法的一个特定实施方案中，电导率介于0.5mS/cm与2 mS/cm之间。
在上述方法的一个特定实施方案中，步骤(e)包括以下子步骤：(i) 用至少3个压滤机死体积的含有磷酸盐和乙酸盐的缓冲液洗涤压滤机，其中用每1000L缓冲液介于50mL与200mL之间的冰乙酸调整缓冲液的pH，从而形成洗涤溶液；和(ii)合并步骤(f)的滤液与步骤(g) 的洗涤溶液，从而形成溶液。
在上述方法的一个特定实施方案中，进一步包括以下子步骤：(iii) 用清洁剂处理所述溶液。
在上述方法的一个特定实施方案中，步骤(h)进一步包括浓化的 IgG组合物的溶剂和清洁剂(S/D)处理。
在上述方法的一个特定实施方案中，步骤(h)中获得的浓化的IgG 组合物含有步骤(a)中所用的冷血浆上清液部分中所发现的IgG含量的至少85％。
在上述方法的一个特定实施方案中，步骤(h)中获得的浓化的IgG 组合物含有步骤(a)中所用的冷血浆上清液部分中所发现的IgG含量的至少90％。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量已被降低至少90％。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量已被降低至少95％。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量已被降低至少98％。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量已被降低至少99％。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是FXIa。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述组合物与SiO2在每克蛋白质至少1克的SiO2的最终浓度下接触。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述组合物与SiO2在每克蛋白质至少2克的SiO2的最终浓度下接触。
在上述方法的一个特定实施方案中，所述组合物与SiO2在每克蛋白质至少2.5克的SiO2的最终浓度下接触。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XI。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XII。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XIa。
在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原是因子XIIa。
在一个实施方案中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，其是通过包括根据以上权利要求中任一项所述的降低丝氨酸蛋白酶活性的方法的工艺来制备。
在上述组合物的一个特定实施方案中，组合物被配制用于施用给受试者。
在上述组合物的一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内、肌肉内或皮下施用。
在上述组合物的一个特定实施方案中，所述组合物为水性的。
在上述组合物的一个特定实施方案中，组合物被冻干。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗有需要的受试者的与血浆蛋白质的异常活性相关的疾病的方法，所述方法包括施用根据权利要求124至128中任一项所述的源自血浆的蛋白质组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含源自血浆的蛋白质，所述源自血浆的蛋白质选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)。
附图简述
图1.示例性血浆分离方案的概要。
图2.如通过ELISA所测量的工业规模血浆蛋白质分离的所选部分中的因子H含量。
图3.在pH 7.5和不同电导率的溶液条件下自SiO2洗脱的因子H 和酰胺水解活性(如使用底物CS2166所测量)的图解说明。
发明详述
I.引言
考虑到治疗性源自血浆的血液蛋白质组合物(如免疫球蛋白组合物、血液凝固因子、凝血因子抑制剂以及补体系统的蛋白质)的广泛使用，确保这些组合物的安全性十分重要。近来对与施用源自血浆的蛋白质组合物的患者中发生血栓栓塞事件成对出现的这些组合物的酰胺水解含量的关注已经突显出了在本领域中需要在制造这些生物制剂期间降低丝氨酸蛋白酶(例如FXIa和FXIIa)和丝氨酸蛋白酶原 (例如FXI和FXII)的方法。本发明宜至少部分基于以下令人意外的发现：微细分的二氧化硅(SiO2)可以用来结合源自血浆的蛋白质组合物中存在的丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原。因而，本文提供用于在制造源自血浆的蛋白质组合物期间降低丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原的浓度的方法。
在某些方面中，本发明提供制造方法，所述方法是基于以下令人意外的发现：微细分的二氧化硅(SiO2)可以用来自源自血浆的蛋白质溶液去除大量丝氨酸蛋白酶(例如FXIa和FXIIa)和丝氨酸蛋白酶原 (例如FXI和FXII)。因而，可容易地将本文提供的方法整合到现有制造程序中，例如通过在冷却下用乙醇分离汇集的血浆样品，优选人类血浆样品(综述于Schultze H E,Heremans J F；Molecular Biology of Human Proteins.第I卷：Natureand Metabolism of Extracellular Proteins 1966,Elsevier Publishing Company；第236-317页中)。然而，本文提供的方法决不仅限于用于包括乙醇分离的制造方法。纯化源自血浆的蛋白质的其它方法也与本文提供的方法相容，所述其它方法例如有聚合物(例如PEG)分离和色谱方法(例如阴离子和/或阳离子交换色谱法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、疏水性相互作用色谱法、混合式色谱法以及类似方法)。
此外，不同于经由在宿主细胞系中DNA载体的重组表达所产生的其它生物制剂，源自血浆的蛋白质是自人类血液和血浆捐赠物分离而来。因此，这些产品的供应无法通过简单增加生产量(volume of production)来增加。相反地，市售血液产品的水平受可获得的血液和血浆捐赠物供应限制。这一动态导致用于制造商业市场尚未充分确立的新型源自血浆的血液因子的原始人类血浆的可用性不足，所述因子包括补体因子H(CFH)和间α胰蛋白酶抑制蛋白(IαIp)。
由于缺乏可用于制造新型源自血浆的产品的血浆，因此必须将新型源自血浆的产品的制造整合至如免疫球蛋白和白蛋白的源自血浆的产品的已确立的制造过程的现有构架中。因子H-被暗示作为AMD、 aHUS以及MPGN连同其它病状的潜在治疗剂-是一种如此的源自血浆的血液产品，其正逐渐引起医师的关注。然而，由于致力于例如IgGγ球蛋白制造的资源，因此需要可以被引入现有的制造方案中的制造因子H的方法。已经表明数种方法正好可实现这一目的，然而许多这些所提出的解决办法需要修改已确立产品的现有制造方案。对于已确立产品，所述变化将需要新的管理批准，并且甚至可能引起已确立产品的特征的变化。
例如，WO 2007/066017描述自冷沉淀物的上清液产生因子H制剂的方法。所公开的方法由以下组成：制备冷沉淀物的上清液，使所述上清液经受阴离子交换色谱法(AEC)，使来自AEC的流过物经受肝素亲和色谱法(HAC)，使有关的来自HAC的洗脱液经受强阳离子交换色谱法(CEC)，使有关的来自CEC的洗脱液经受强阴离子交换色谱法(sAEC)，以及自sAEC洗脱因子H。不利的是，在包括IgGγ球蛋白(IVIG和皮下)和白蛋白的许多商业上重要的源自血浆的血液产品的制造过程中，冷沉淀物上清液为常见中间物部分。使这一部分经受色谱法步骤将改变冷沉淀物上清液，并且将会要求以未知方式修改已确立的下游血液产品的制造过程。除了要求这些制造过程的完全重新生效和可能的重新设计之外，还需要关键管理机构对制造程序的管理再批准。
同样地，WO 2008/113589描述自人类血浆产生因子H制剂的方法。具体来说，这一公布描述了自三个已知的血浆处理部分，即科恩 -翁克莱(Cohn-Oncley)部分I上清液、科恩-翁克莱部分III沉淀物以及奇斯勒/尼赤曼沉淀物B部分来纯化因子H。关于第一种方法，WO 2008/113589公开因子H可以通过添加肝素亲和色谱法步骤而自科恩- 翁克莱部分I上清液去除。不利的是，在包括IgGγ球蛋白(IVIG和皮下)和白蛋白的许多商业上重要的源自血浆的血液产品的制造过程中，科恩-翁克莱部分I上清液为常见中间物部分。类似地，许多免疫球蛋白(例如IgG、IVIG等)制造过程并不依赖于科恩-翁克莱部分III 沉淀或奇斯勒/尼赤曼沉淀物B步骤，例如液体和Kiovig (Baxter International Inc.)。将如肝素亲和色谱法、部分III沉淀或沉淀物B步骤的其它步骤引入如上文所概述的已确立血液产品的制造方案中的缺点在于它要求使制造程序重新生效、关键管理机构对制造程序的管理再批准，并且对于其它已确立产品的产率和/或纯度可能进一步具有无法预见的后果。
因而，在本领域中仍然需要制造因子H的方法，所述方法不要求使用额外输入的血浆或对商业上重要的源自血浆的血液产品(如白蛋白和用于静脉内施用的IgGγ球蛋白(IVIG)或皮下施用的IgGγ球蛋白)的现有制造过程作出重新设计和管理再批准。本发明宜至少部分基于以下令人意外的发现：因子H、丝氨酸蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶原可同时结合至微细分的二氧化硅(SiO2)，从而使丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原与未结合的所关注的第一蛋白质(例如IgG)分离，然后，通过自SiO2有差别地洗脱因子H和丝氨酸蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶原来分离。类似地，本发明至少部分基于以下令人意外的发现：IαIp、丝氨酸蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶原可以同时结合至微细分的二氧化硅(SiO2)，然后通过自SiO2有差别地洗脱IαIp和丝氨酸蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶原来分离。
II.定义
如本文所用的“因子H”是指由补体因子H基因编码的补体替代路径的蛋白质组分(例如CFH；NM000186；GeneID:3075；UniProt ID P08603；Ripoche等,Biochem.J.249:593-602(1988))。将因子H翻译为1,213个氨基酸的前体多肽，通过去除18个氨基酸的信号肽对多肽进行加工，从而产生成熟因子H蛋白(氨基酸19-1231)。如本发明所用的因子H涵盖可见于例如人类血浆样品的血浆样品中的任何天然变异体、替代性序列、同功型或突变蛋白。可见于人群中的因子H 突变的实例包括但不限于Y402H；V62I；R78G；R127L；Δ224；Q400K；C431S；T493R；C536R；I551T；R567G；C630W；C673S；C673Y； E850K；S890I；H893R；C915S；E936D；Q950H；Y951H；T956M； C959Y；W978C；N997T；V1007I；V1007L；A1010T；T1017I；Y1021F； C1043R；N1050Y；I1059T；Q1076R；R1078S；D1119G；V1134G； Y1142D；Q1143E；W1157R；C1163W；W1183L；W1183R；T1184R； L1189R；S1191L；G1194D；V1197A；E1198A；F1199S；R1210C； R1215G；R1215Q；YPTCAKR1225:1231FQS；以及P1226S。已发现许多这些突变与多种疾病和病症相关，所述疾病和病症包括非典型溶血性尿毒症综合症(aHUS)、年龄相关的黄斑退化(AMD)、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGNII)、CFH缺乏症以及基底膜玻璃膜疣(basal laminar drusen)。因子H还包括含有翻译后修饰的蛋白质。例如，咸信因子H在残基529、718、802、822、882、911、1029以及1095 处由N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)修饰。
如本文所用的“间α抑制蛋白”或“IaIp”是指一类血浆蛋白酶抑制剂，所述抑制剂包括由以下一个或多个编码的多肽：α-1-微球蛋白/ 二库宁(bikunin)前体基因(AMBP；UniGene ID:231948，二库宁多肽)、间α(球蛋白)抑制剂H1基因(ITIH1；UniGene ID:224173，H1多肽)、间α(球蛋白)抑制剂H2基因(ITIH2；Unigene ID:139782，H2多肽)、间α(球蛋白)抑制剂H3基因(ITIH3；UniGene ID:140017，H3多肽) 或间α(球蛋白)抑制剂H4(血浆激肽释放酶敏感糖蛋白，H4多肽)基因(ITIH4；UniGene ID:3321613)。示例性IaIp蛋白酶抑制剂包括但不限于IaI(二库宁、H1以及H2多肽)；PaI(二库宁和H3多肽)、IaLI(二库宁和H2多肽)、IaIH4P(H4多肽)以及二库宁(上述Salier,J,等)。
如本文所用的“冷血浆上清液(cryo-poor plasma)”是指在去除通过在接近冷冻的温度下，例如在约10℃以下的温度下，优选在不高于约 6℃的温度下解冻血浆或汇集的血浆而形成的冷沉淀物之后所产生的上清液。在本发明的上下文中，血浆可以互换地指回收的血浆(即离体自全血分离的血浆)或源血浆(即经由血浆去除术收集的血浆)。冷沉淀通常例如通过解冻先前冷冻的汇集的血浆来执行，所述血浆的安全和质量因素已被测定，但也可以使用新鲜血浆。在低温下完全解冻冷冻血浆之后，在冷却(例如≤6℃)下通过过滤离心进行固体冷沉淀物与液体上清液的分离。
如本文所用的“科恩池”是指用于分离血浆样品或血浆样品池的起始材料。科恩池包括可能经受或可能未经受预处理步骤的全血浆、冷血浆上清液样品以及冷血浆上清液样品池。在某些实施方案中，科恩池为冷血浆上清液样品，所述样品在预处理步骤中已被去除一种或多种血液因子，所述预处理步骤例如吸附于固相(例如氢氧化铝、微细分的二氧化硅等)或色谱步骤(例如离子交换或肝素亲和色谱法)。包括但不限于因子8抑制剂旁路活性(FEIBA)、因子IX复合物、因子 VII浓缩物或抗凝血酶III复合物的各种血液因子可以自冷血浆上清液样品分离，以便形成科恩池。
如本文所用的“部分II+III滤饼”是指在过滤或离心科恩-翁克莱或等效部分II+III糊状物悬浮液之后所回收的固相。在一个优选实施方案中，部分II+III悬浮液将用例如微细分的二氧化硅的吸附材料进行处理来去除如脂质、纤维蛋白原、酰胺水解活性、前激肽释放酶活性以及脂蛋白的杂质。在另一个优选实施方案中，在离心或过滤之前，可以将助滤剂添加至部分II+III悬浮液中。在一个最优选的实施方案中，在离心或过滤之前部分II+III悬浮液将用吸附材料与助滤剂处理。在分离净化的部分II+III悬浮上清液后，将回收的固相材料称为部分 II+III滤饼。
如本文所用的“微细分的二氧化硅(finely divided silicon dioxide/finelydivided silica)”是指具有式SiO2的硅氧化物，其是以允许因子H吸附到它表面上的方式制造。适用于本发明方法的微细分的二氧化硅的示例性形式包括但不限于烟雾状二氧化硅、热解二氧化硅、Cab-O-SilTM、胶态二氧化硅、硅藻土以及类似物。在一个优选实施方案中，将商业亲水性烟雾状二氧化硅产品用于本文所提供的方法。这些产品的非限制性实例包括由Evonik Industries以商标名出售的那些产品(例如Aerosil90、Aerosil 130、Aerosil 150、Aerosil 200、Aerosil 300、Aerosil 380、Aerosil OX 50、Aerosil EG 50、Aerosil TT 600、Aerosil 200SP、Aerosil 300SP以及Aerosil 300/30)。
如本文所用的“与因子H功能障碍相关的疾病或病症”是指受试者的由受试者因子H活性水平降低所引起、特征在于受试者因子H 活性水平降低或导致受试者因子H活性水平降低的任何疾病、病症或病状。出于本发明的目的，因子H活性可以指因子H结合蛋白质或配位体(例如C3b、C3bBb、C3b2Bb、csbC3b、补体因子B(CFB)、 C反应蛋白、内皮细胞、葡糖胺聚糖(GAG))的能力，或者可以指它的因子I辅因子活性或它的加速C3bBb和C3b2Bb的不可逆的解离的能力。在一个实施方案中，与因子H功能障碍相关的疾病或病症会引起C3缺乏症和细菌感染易感性。在一些情况下，与因子H功能障碍相关的疾病或病症包括由编码因子H的CFH基因的突变和多形现象引起的或与其有关的病状(关于综述，参见Barlow等,Adv Exp MedBiol.2008；632:117-42，其公开内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)。与CFH基因的突变或多形现象有关的疾病包括但不限于因子H缺乏症、非典型溶血性尿毒症综合症(aHUS)、年龄相关的黄斑退化(AMD)、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGNII；de Cordoba&de Jorge,Clinical and Experimental Immunology 151,1-13(2008))、心肌梗塞(Kardys等,Journal of the American College of Cardiology 47, 1568-1575(2006)；Mooijaart等,Experimental Gerontology 42, 1116-1122(2007)；Nicaud等,Journal ofMolecular Medicine 85,771-775 (2007)；Pai等,European Heart Journal 28,1297-1303(2007)；Stark等, Clinical Science(Lond)113,213-218(2007))、冠心病/冠状动脉病 (CAD/CHD；Meng等,BMC Medical Genetics 8,62(2007)；Pulido等, Mayo ClinicProceedings 82,301-307(2007)；Topol等,Human Molecular Genetics 15Spec第2期，R117-R123(2006))以及阿兹海默氏病 (Alzheimer's disease)(Hamilton等,Neuromolecular Medicine 9,331-334 (2007)；Zetterberg等,American Journal ofOphthalmology 143, 1059-1060(2007))。描述CFH基因的突变和多形现象与与因子H功能障碍相关疾病之间的关联性的上述文献的公开内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的。
如本文所用的“与异常替代途径补体活性相关的疾病或病症”是指由补体的替代途径的不受控制或异常的活化导致的疾病、病症或病状。补体替代途径的不受控制或异常的活化一般会导致宿主细胞和组织的正常功能丧失(bystander damage)连同C3损耗和相应的病原体感染(例如真菌性、细菌性、病毒性以及原生生物性感染)易感性。与异常替代途径补体活性相关的疾病和病症的实例包括但不限于各种自体免疫疾病(如类风湿性关节炎、IgA肾病、哮喘、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、抗磷脂综合症、ANCA相关血管炎、天疱疮、葡萄膜炎、重症肌无力(myathemia gravis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis))、肾病(如IgA肾病、溶血尿毒症综合症、膜增生性肾小球肾炎)、其它疾病(如哮喘、阿兹海默氏病、成年黄斑退化、阵发性夜间血尿症(proximal nocturnalhemoglobinuria)、腹主动脉瘤、缺血以及败血症)。
如本文所用的术语“超滤(UF)”涵盖多种膜过滤方法，其中流体静压力迫使液体靠向半透膜。高分子量悬浮固体和溶质被保留下来，而水和低分子量溶质通过薄膜。这种分离过程经常用于纯化和浓缩巨分子(103至106Da)溶液，尤其是蛋白质溶液。根据膜保留的分子的大小，可获得许多超滤膜。超滤的典型特征在于薄膜孔径在1与1000kDa 之间并且操作压力在0.01与10巴之间。
如本文所用的术语“透滤”是用与超滤相同或类似的薄膜来执行并且典型地以切向流过滤模式来执行。在透滤期间，将缓冲液引入再循环槽中，同时自单元操作去除滤液。在产品为保留物(例如因子H) 的过程中，透滤尤其适用于分离蛋白质与小分子(像糖和盐)。在某些情况下，透滤可以用来交换溶液、缓冲液或缓冲系统的单个组分。
如本文所用的术语“混合”描述通过任何形式的搅动使两种或更多种不同化合物或物质在溶液或悬浮液中平均分布的行为。当术语“混合”用于本申请中时，不需要所有成分在溶液或悬浮液中完全平均分配作为“混合”的结果。
如本文所用的术语“溶剂”涵盖能够溶解或分散一或多种其它物质的任何液体物质。溶剂实质上可以是无机溶剂，如水，或可以是有机液体，如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。如术语“溶剂清洁剂处理”中所用的溶剂表示有机溶剂(例如磷酸三-正丁酯)，所述溶剂是用以使溶液中的脂质包膜的病毒灭活的溶剂清洁剂混合物的一部分。
如本文所用的术语“清洁剂”在本申请中可以与术语“表面活性剂”或“表面活化剂”互换使用。表面活性剂典型的是两亲型有机化合物，即含有疏水基(“尾部”)与亲水基(“头部”)的两亲型有机化合物，其使表面活性剂可溶于有机溶剂与水中。表面活性剂可以根据它头部的形式上带电的基团的存在来分类。非离子型表面活性剂在它的头部没有带电基团，而离子型表面活性剂在它的头部带有净电荷。两性离子表面活性剂含有具有两个带相反电荷的基团的头部。常见表面活性剂的一些实例包括：阴离子型表面活性剂(基于硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离子)：全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、全氟辛磺酸盐(PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸铵以及其它烷基硫酸盐、月桂醇醚硫酸钠(还称为月桂基醚硫酸钠或SLES)、烷基苯磺酸盐；阳离子型表面活性剂(基于季铵阳离子)：鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)(还称作十六烷基三甲基溴化铵)和其它烷基三甲基铵盐、鲸蜡基氯化吡锭鎓(CPC)、聚乙氧基化动物脂胺(POEA)、氯化苯甲烃铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)；长链脂肪酸和它们的盐：包括辛酸盐、辛酸、庚酸盐 (heptanoat)、己酸、庚酸、壬酸、癸酸等；两性离子型表面活性剂(两性)：十二烷基甜菜碱；椰油酰胺基丙基甜菜碱；椰油两性甘氨酸盐；非离子型表面活性剂：烷基聚(氧化乙烯)、烷基苯酚聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)与聚(氧化丙烯)的共聚物(商业上称为泊洛沙姆 (Poloxamers)或泊洛沙胺(Poloxamines))、烷基多聚葡糖苷(包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(例如鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨醇酯(Tween 20、Tween 80等)、曲拉通(Triton) 清洁剂以及十二烷基二甲基氧化胺。
如本文所用的术语“治疗有效量或剂量”或“足够/有效量或剂量”是指可在施用期间产生作用的剂量。精确剂量将取决于治疗目的并且将由本领域的技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,TheArt,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,DosageCalculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版，2003,Gennaro编,Lippincott,Williams&Wilkins；其公开内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)。
如本申请中所用的术语“喷雾”是指例如在醇沉淀步骤(如科恩分离I或II+III沉淀步骤)中将液体物质以液体物质的细滴或雾气形式传递至系统中的方法。喷雾可以通过如容器(例如喷雾瓶)的任何加压装置达成，所述装置具有喷头或喷嘴，并且手动或自动操作以由液体产生细雾。典型地，在将接受液体物质的系统连续搅拌或以其它方式混合以确保系统内的液体快速并且平均分布时执行喷雾。
如本文所用的术语“约”表示自指定值加上或减去10％的近似范围。例如，语言“约20％”涵盖18％至22％的范围。如本文所用的约还包括精确量。因此，“约20％”意指“约20％”和“20％”。如本文所用的“约”是指指定值或约指定值的范围。
术语“剂量(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可以互换使用。剂量是指各次施用时给予个体的活性成分的量。剂量将视许多因素而不同，所述因素包括施用频率；个体的体型和耐受性；病状的严重程度；副作用的风险；以及施用途径。本领域的技术人员将认识到剂量可以根据上述因素或基于治疗性进展而加以修改。术语“剂型”是指药物的特定型式，并取决于施用途径。例如，剂型可以是液体，例如注射用生理盐水溶液。
如本文所用的术语“预防”是指由与血液蛋白质的功能缺乏或功能失调相关的病状所产生的症状的可能性降低或症状的频率减小。
如本文所用的术语“疗法”、“治疗”以及“改善”是指由与血液蛋白质的功能缺乏或功能失调相关的病状所产生的症状的严重程度的任何降低。如本文所用的术语“治疗”和“预防”不意图为绝对术语。治疗可以指发作的任何延迟、症状的改善、患者存活的改进、存活时间或存活率增加等。治疗效果可以与未接受治疗的个体或个体集合相比。
如本文所用的术语“实质部分”是指组合物中特定蛋白质群体的至少10％。例如，当提及组合物中的丝氨酸蛋白酶的实质部分时，丝氨酸蛋白酶的实质部分与组合物中存在的丝氨酸蛋白酶的至少10％对应。在一个实施方案中，实质部分是指组合物中特定蛋白质群体的至少25％。在另一个实施方案中，实质部分是指组合物中特定蛋白质群体的至少50％。在另一个实施方案中，实质部分是指组合物中特定蛋白质群体的至少75％。在其它实施方案中，实质部分是指组合物中特定蛋白质群体的至少10％，或组合物中特定蛋白质群体的至少 15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上。
III.丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原含量的降低
在第一方面中，本发明提供一种用于降低源自血浆的目标蛋白质组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，该方法是通过使丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原结合至微细分的二氧化硅(SiO2) 并且分离SiO2与组合物来实现。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI) 和/或因子XII(FXII)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的蛋白质组合物中因子XI的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子XI的条件下使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离以去除结合的因子XI。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的蛋白质组合物中因子XIa的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子XIa的条件下使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离以去除结合的因子XIa。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的蛋白质组合物中因子XII的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子XII的条件下使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离以去除结合的因子XII。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的蛋白质组合物中因子XIIa的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子XIIa的条件下使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离以去除结合的因子XIIa。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一目标蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种降低源自血浆的目标蛋白质中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过使源自汇集的血浆的起始材料中的蛋白质部分沉淀而形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个实施方案中，使用醇实现部分沉淀。在一个优选实施方案中，醇为乙醇。在另一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的目标蛋白质中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过超滤和/或透滤源自汇集的血浆的起始材料而形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。
在另一个实施方案中，本发明提供一种降低源自血浆的目标蛋白质中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过使源自汇集的血浆的起始材料与色谱树脂接触而形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在某些实施方案中，色谱树脂选自阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、疏水性相互作用树脂、混合式树脂、羟磷灰石树脂、配位体亲和树脂、免疫亲和树脂以及尺寸排阻树脂。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：执行第二目标蛋白质浓化步骤以形成第二浓化组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一目标蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种降低源自血浆的目标蛋白质中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)执行第二目标蛋白质浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
表1.第一与第二浓化步骤的组合的示例性实施方案
*Ppt：沉淀
UF/DF：超滤/透滤
AEC：阴离子交换色谱法
CEC：阳离子交换色谱法
HIC：疏水性相互作用色谱法
HAC：羟磷灰石色谱法
MMC：混合式色谱法
LAC：配位体亲和色谱法
IAC：免疫亲和色谱法
SEC：尺寸排阻色谱法
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：在使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触之后，执行目标蛋白质浓化步骤。在某些实施方案中，目标蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的目标蛋白质中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)执行第二目标蛋白质浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
同样地，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的目标蛋白质中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)执行第二目标蛋白质浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(e)执行第三目标蛋白质浓化步骤以形成第三浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所见的变化形式101至变化形式 1100中的任一种变化形式。
表2.第一沉淀浓化步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表3.第一超滤/透滤步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表4.第一阴离子交换色谱步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表5.第一阳离子交换色谱步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表6.第一疏水性相互作用色谱步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表7.第一羟磷灰石色谱步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表8.第一混合式色谱步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表9.第一配位体亲和色谱步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表10.第一免疫亲和色谱步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
表11.第一尺寸排阻色谱步骤、第二浓化步骤以及第三浓化步骤的组合的示例性实施方案
*按照表1。
在上述方法的某些实施方案中，色谱浓化步骤包括以下子步骤： (i)在适合于结合源自血浆的目标蛋白质的条件下使源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和(ii)自色谱树脂洗脱源自血浆的目标蛋白质。在一个特定实施方案中，在子步骤(i)中杂质不结合至色谱树脂。在另一特定实施方案中，在子步骤(i)中杂质结合至色谱树脂，但在子步骤(ii)中不自色谱树脂洗脱。
在上述方法的其它某些实施方案中，色谱浓化步骤包括以下子步骤：(i)在适合于结合至少一种杂质的条件下使第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和(ii)使树脂与源自血浆的蛋白质组合物分离，其中在中子步骤(i)中所述源自血浆的目标蛋白质不结合至色谱树脂。
在上述方法的某些实施方案中，源自血浆的目标蛋白质选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、补体系统的蛋白质(例如因子H)以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)。在一个特定实施方案中，补体系统的蛋白质选自由因子H(FH)、因子D、补体蛋白C3以及C4结合蛋白组成的组。在一个优选实施方案中，蛋白质组合物为制造中间物。
在本文提供的方法的某些实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少10％。在另一个实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少25％。在另一个实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少50％。在另一个实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少75％。在另一个实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少90％。在其它实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少5％或至少10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或降低至低于测试系统的检测限的水平。
总体上，本文所述的方法所需的微细分的二氧化硅(SiO2)的量将根据数种因素变化，所述因素包括但不限于组合物中存在的蛋白质的总量、组合物中丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原(例如FXI、FXIa、 FXII以及FXIIa)的浓度、目标蛋白质以及溶液条件(例如pH、电导率等)。例如，可以将浓度介于每克蛋白质约0.01克与每克蛋白质约10 克之间的SiO2添加至目标组合物中。在另一个实施方案中，可以将浓度介于每克蛋白质约1克与每克蛋白质约5克之间的SiO2添加至目标组合物中。在另一个实施方案中，可以将浓度介于每克蛋白质约2 克与每克蛋白质约4克之间的SiO2添加至目标组合物中。在一个实施方案中，添加最终浓度为每克总蛋白质至少1克的SiO2。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少2克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少2.5克烟雾状二氧化硅。在另一个实施方案中，可以将浓度介于每克蛋白质约0.01克与每克蛋白质约5克的SiO2添加至目标组合物中。在另一个实施方案中，可以将浓度介于每克蛋白质约0.02克与每克蛋白质约4克的SiO2添加至目标组合物中。在一个实施方案中，添加最终浓度为每克总蛋白质至少0.1克的SiO2。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.2克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.25克的烟雾状二氧化硅。在其它特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.01 克或每克总蛋白质至少0.02克、0.03克、0.04克、0.05克、0.06克、 0.07克、0.08克、0.09克、0.1克、0.2克、0.3克、0.4克、0.5克、0.6 克、0.7克、0.8克、0.9克、1.0克、1.5克、2.0克、2.5克、3.0克、 3.5克、4.0克、4.5克、5.0克、5.5克、6.0克、6.5克、7.0克、7.5 克、8.0克、8.5克、9.0克、9.5克、10.0克或10.0克以上的微细分的二氧化硅。
在自悬浮的血浆沉淀物部分萃取目标蛋白质的某些实施方案中，在二氧化硅处理之后添加助滤剂(例如Celpure C300(Celpure)或 Hyflo-Supper-Cel(World Minerals))以有助于深度过滤。可以添加最终浓度为每千克沉淀物约0.01千克至每千克沉淀物约1.0千克、或每千克沉淀物约0.02千克至每千克沉淀物约0.8千克、或每千克沉淀物约 0.03千克至每千克沉淀物约0.7千克的助滤剂。在其它实施方案中，可以添加最终浓度为每千克沉淀物约0.01千克至每千克沉淀物约 0.07千克，或每千克沉淀物约0.02千克至每千克沉淀物约0.06千克、或每千克沉淀物约0.03千克至每千克沉淀物约0.05千克的助滤剂。在某些实施方案中，将添加最终浓度为每千克沉淀物约0.01千克或每千克沉淀物约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0千克的助滤剂。
A.免疫球蛋白
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的免疫球蛋白(Ig)组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使Ig组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与Ig组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI (FXI)和/或因子XII(FXII)。在一个实施方案中，Ig组合物为IgG组合物。在其它实施方案中，Ig组合物为IgA、IgM、IgG或其混合组合物。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：执行第一Ig 蛋白质浓化步骤以形成第一浓化Ig组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一Ig蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。在一个实施方案中，Ig组合物为IgG组合物。在其它实施方案中，Ig组合物为IgA、IgM、IgG或其混合组合物。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：执行第二Ig 蛋白质浓化步骤以形成第二浓化Ig组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一Ig蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的 Ig组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一Ig浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的 Ig组合物；(b)执行第二Ig浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的Ig 组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及 (d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子 XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：在使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触之后，执行Ig浓化步骤。在某些实施方案中，Ig浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/ 透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的 Ig组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一Ig浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的 Ig组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触； (c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)执行第二Ig浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的Ig组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
同样地，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的Ig组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一Ig浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的Ig组合物；(b)执行第二Ig浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的Ig组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(e)执行第三Ig浓化步骤以形成第三浓化的源自血浆的 Ig组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII (FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所见的变化形式101至变化形式1100中的任一种变化形式。
在一个特定实施方案中，Ig组合物为制造中间物。例如，在某些实施方案中，Ig组合物是来自以下的IgG制造中间物：科恩分离程序(J.Am.Chem.Soc.,1946,68(3):459-475；J.Am.Chem.Soc.72:465-474 (1950))、翁克莱分离程序(J.Am.Chem.Soc.,1949,71(2):541-550)、德驰纯化程序(Deutsch purification procedure)(J.Biol.Chem. 164:109-118)、好博纯化程序(Hoppe purification procedure)(Munch Med Wochenschr 1967(34):1749-1752)、法尔克斯韦登纯化程序 (Falksveden purification procedure)(瑞典专利号348942)、法尔克斯韦登与伦德布拉德纯化程序(Falksveden and Lundbladpurification procedure)(Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)、乐宾纯化程序(Lebing purification procedure)(Vox Sang 2003(84):193-201)、塔纳卡纯化程序(Tanaka purification procedure)(Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30))、泰仕弛纯化程序(Teschner purification procedure)(Vox Sang,2007(92):42-55)、尼赤曼分离程序(Helv.Chim.Acta 37:866-873)、奇斯勒/尼赤曼分离程序(Vox Sang.7:414-424(1962))、巴鲁德纯化程序(Barundern purification procedure)(Vox Sang.7:157-74(1962))、克波特纯化程序(Koblet purification procedure)(Vox Sang. 13:93-102(1967))、美国专利号5,122,373或5,177,194中所公开的纯化程序，其修改程序以及本领域中已知的类似或等效纯化程序。
在一个特定实施方案中，IgG组合物是冷科恩池上清液。在另一个特定实施方案中，IgG组合物是科恩部分I上清液或其等效部分。在另一个特定实施方案中，IgG组合物是再悬浮的科恩部分III沉淀物，或其等效部分。在另一个特定实施方案中，IgG组合物是再悬浮的科恩部分II+III沉淀物，或其等效部分。在另一个特定实施方案中， IgG组合物是再悬浮的科恩部分I+II+III沉淀物，或其等效部分。在另一个特定实施方案中，IgG组合物是再悬浮的沉淀物G沉淀物，或其等效部分。在另一个特定实施方案中，IgG组合物是再悬浮的奇斯勒/尼赤曼沉淀物B沉淀物，或其等效部分。
在一个特定实施方案中，本发明提供一种用于降低再悬浮的IgG 部分II+III沉淀物中丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原的量的方法。有利的是，已经发现，再悬浮的IgG部分II+III沉淀物中的因子XI、因子XII、因子XIa和/或因子XIIa的水平可以在过滤/离心之前通过添加预处理步骤而大大降低。在一个实施方案中，这一预处理步骤包括添加微细分的二氧化硅颗粒(例如烟雾状二氧化硅、)，之后是40至80分钟的培育期，期间不断混合悬浮液。在某些实施方案中，培育期将在约50分钟与约70分钟之间，或是约20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80分钟或80分钟以上。总体上，将在约0℃至约10℃、或约2℃至约8℃下执行所述处理。在某些实施方案中，可以在约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10°下执行处理。在一个特定实施方案中，在约2℃至约10℃下执行处理。
烟雾状二氧化硅处理的作用由实施例3、实施例6以及实施例7 中所见的结果来例证。在这些实施例中，将部分II+III沉淀物再悬浮并且用不同量的微细分的二氧化硅处理。可以如表22、表27、表28 以及表29中所见，因子XI和XII丝氨酸蛋白酶活性和酶原含量可通过用SiO2处理悬浮液而降低至少90％。
在某些实施方案中，添加浓度介于每千克II+III糊状物约20克与每千克II+III糊状物约100克的烟雾状二氧化硅(即对于以1:15的比率萃取的修改的部分II+III沉淀物来说，应添加浓度为每16千克II+III 悬浮液约20克至每16千克II+III悬浮液约100克或最终浓度为约 0.125％(w/w)至约0.625％(w/w)的烟雾状二氧化硅)。在某些实施方案中，可添加浓度为每千克II+III糊状物约20克或每千克II+III糊状物约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95或100克的烟雾状二氧化硅。在一个特定实施方案中，将烟雾状二氧化硅(例如Aerosil 380或等效物)添加至修改的部分II+III悬浮液中至最终浓度为每16千克II+III约40克。在约2℃至8℃下混合至少50 至70分钟。
在某些实施方案中，将浓度介于每克蛋白质约0.01克与每克蛋白质约10克之间的SiO2添加至IgG组合物中。在另一个实施方案中，将浓度介于每克蛋白质约0.01克与每克蛋白质约5克之间的SiO2添加至IgG组合物中。在另一个实施方案中，将浓度介于每克蛋白质约 0.02克与每克蛋白质约4克之间的SiO2添加至IgG组合物中。在一个实施方案中，添加最终浓度为每克总蛋白质至少0.1克的SiO2。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.2克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少 0.25克的烟雾状二氧化硅。在其它特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少1克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少2克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少2.5克的烟雾状二氧化硅。在其它特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.01克或每克总蛋白质至少0.02克、0.03克、0.04克、0.05克、0.06克、0.07克、 0.08克、0.09克、0.1克、0.2克、0.3克、0.4克、0.5克、0.6克、0.7 克、0.8克、0.9克、1.0克、1.5克、2.0克、2.5克、3.0克、3.5克、 4.0克、4.5克、5.0克、5.5克、6.0克、6.5克、7.0克、7.5克、8.0 克、8.5克、9.0克、9.5克、10.0克或10.0克以上的微细分的二氧化硅。
在某些实施方案中，将在二氧化硅处理之后添加助滤剂(例如 Celpure C300(Celpure)或Hyflo-Supper-Cel(World Minerals))以有助于深度过滤。可以添加最终浓度为每千克II+III糊状物约0.01千克至每千克II+III糊状物约1.0千克、或每千克II+III糊状物约0.02千克至每千克II+III糊状物约0.8千克、或每千克II+III糊状物约0.03千克至每千克II+III糊状物约0.7千克的助滤剂。在其它实施方案中，可以添加最终浓度为每千克II+III糊状物约0.01千克至每千克II+III糊状物约0.07千克、或每千克II+III糊状物约0.02千克至每千克II+III 糊状物约0.06千克、或每千克II+III糊状物约0.03千克至每千克II+III 糊状物约0.05千克的助滤剂。在某些实施方案中，将添加最终浓度为每千克II+III糊状物约0.01千克、或每千克II+III糊状物约0.02、 0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0千克的助滤剂。
在一个实施方案中，工艺改进是通过包括在过滤或离心净化部分 II+III悬浮液之前进行烟雾状二氧化硅处理来实现。在某些实施方案中，烟雾状二氧化硅处理将包括添加每千克II+III糊状物约0.01kg 至每千克II+III糊状物约0.07千克、或每千克II+III糊状物约0.02千克至每千克II+III糊状物约0.06千克、或每千克II+III糊状物约0.03 千克至每千克II+III糊状物约0.05千克、或每千克II+III糊状物约0.02 千克、每千克II+III糊状物0.03千克、每千克II+III糊状物0.04千克、每千克II+III糊状物0.05千克、每千克II+III糊状物0.06千克、每千克II+III糊状物0.07千克、每千克II+III糊状物0.08千克、每千克II+III 糊状物0.09千克或每千克II+III糊状物0.1千克的二氧化硅，且将在介于约2℃与约8℃之间的温度下培育混合物约50分钟至约70分钟、或约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80分钟或80分钟以上。在另一个实施方案中，工艺改进是通过包括降低残余纤维蛋白原水平、酰胺水解活性和/或前激肽释放酶活化剂活性的烟雾状二氧化硅处理来实现。在一个特定实施方案中，工艺改进是通过包括降低免疫球蛋白制剂中FXI、FXIa、FXII以及FXIIa的水平的烟雾状二氧化硅处理来实现。
总体上，自免疫球蛋白组合物去除丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原可以通过在丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2的 pH和电导率溶液条件下用微细分的二氧化硅(SiO2)处理含有免疫球蛋白的溶液来达成。如实施例中所示，适合的条件包括低pH和低电导率。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的免疫球蛋白组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括在约4.0至约7.0的pH下使组合物与SiO2接触以结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原并自组合物中去除SiO2。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.0与约6.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.0与约6.0 之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.0与约5.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.0与约5.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约 4.5与约7.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约6.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约6.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约5.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约5.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约7.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约6.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约6.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约5.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.6与约5.6之间的pH下使组合物与 SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.7与约5.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.8与约5.4之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.9与约5.3之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约 5.0与约5.2之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在约5.1的pH下使组合物与SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在约4.0或约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、 4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或不大于7.0的pH下使组合物与SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在不大于4.0 或不大于4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、 6.6、6.7、6.8、6.9或不大于7.0的pH下使组合物与SiO2接触。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的免疫球蛋白组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约3.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触以结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原并自组合物中去除SiO2。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.5mS/cm与约2.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约1.3mS/cm与约1.7mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.9mS/cm之间的离子强度下使组合物与 SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm 与约1.8mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.7mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.6mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm 与约1.5mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.4mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.3mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm 与约1.2mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.1mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm 与约0.9mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约0.8mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于0.2mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与 SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.3mS/cm 与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约0.4mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.5mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在约0.6mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.7mS/cm与约0.9mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在约0.8mS/cm的离子强度下使组合物与SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在约0.1mS/cm或不大于0.2mS/cm、0.3mS/cm、 0.4mS/cm、0.5mS/cm、0.6mS/cm、0.7mS/cm、0.8mS/cm、0.9mS/cm、1.0mS/cm、1.1mS/cm、1.2mS/cm、1.3mS/cm、1.4mS/cm、1.5mS/cm、 1.6mS/cm、1.7mS/cm、1.8mS/cm、1.9mS/cm、2.0mS/cm、2.1mS/cm、 2.2mS/cm、2.3mS/cm、2.4mS/cm、2.5mS/cm、2.6mS/cm、2.7mS/cm、 2.8mS/cm、2.9mS/cm或3.0mS/cm的离子强度下使组合物与SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在不大于0.1mS/cm或不大于0.2mS/cm、0.3mS/cm、0.4mS/cm、0.5mS/cm、0.6mS/cm、0.7mS/cm、0.8mS/cm、0.9mS/cm、1.0mS/cm、1.1mS/cm、1.2mS/cm、 1.3mS/cm、1.4mS/cm、1.5mS/cm、1.6mS/cm、1.7mS/cm、1.8mS/cm、 1.9mS/cm、2.0mS/cm、2.1mS/cm、2.2mS/cm、2.3mS/cm、2.4mS/cm、 2.5mS/cm、2.6mS/cm、2.7mS/cm、2.8mS/cm、2.9mS/cm或3.0mS/cm 的离子强度下使组合物与SiO2接触。
在某些实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的免疫球蛋白组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括在低pH和低离子强度下使组合物与SiO2接触以结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原并自组合物中去除SiO2。在一个特定实施方案中，所述方法包括在介于约4.8与约5.4之间的pH下，在介于约0.6 mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在一个更特定的实施方案中，所述方法包括在介于约4.9与约5.3之间的 pH下，在介于约0.7mS/cm与约0.9mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在一个更特定的实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约5.2之间的pH下，在约0.8mS/cm的离子强度下使组合物与SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在根据如表12、表 13、表14以及表15中所呈现的变化形式1222至3041中的任一种变化形式的pH和离子强度下使组合物与SiO2接触。
表12.可用于使丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2的溶液条件的示例性实施方案
表13.可用于使丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2的溶液条件的示例性实施方案
表14.可用于使丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2的溶液条件的示例性实施方案
NMT＝不大于
表15.可用于使丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2的溶液条件的示例性实施方案
NMT＝不大于
A.修改的醇沉淀/离子交换色谱分离方法
一方面，本发明提供改进的用于制造适用于IVIG疗法的IgG组合物的方法。总体上，与用于产生商业IVIG产品的当前方法相比，这些方法提供具有较高产率和可比(如果不是较高)纯度的IgG制剂。
在一个特定方面，本发明提供一种用于自血浆制备浓IgG(例如 10％IVIG)组合物的方法，所述方法包括执行至少一个醇沉淀步骤和至少一个离子交换色谱步骤。具体说来，改进的上游工艺中的数个步骤不同于现有技术的工艺，例如在低温下使用25％的乙醇、通过喷雾添加乙醇、通过喷雾进行pH调整，以及使用微细分的二氧化硅颗粒。
在某一实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在第一沉淀步骤中，用介于约6％与约10％之间的醇，在介于约6.7与约7.3之间的 pH下，使冷质粒上清液部分沉淀，以便获得IgG浓化的上清液；(b) 在用介于约20％与约30％之间的醇，在低温下并且在介于约6.7与约 7.3之间的pH下，使IgG自所述第一上清液沉淀，以便形成第一沉淀物；(c)将步骤(b)中形成的第一沉淀物再悬浮，以形成悬浮液；(d)用清洁剂处理步骤(c)中形成的悬浮液；(e)用介于约20％与约30％之间的醇，在介于约6.7与约7.3之间的pH下，使IgG自所述悬浮液沉淀，以形成第二沉淀物；(f)将步骤(e)中形成的第二沉淀物再悬浮，以形成悬浮液；(g)用溶剂和/或清洁剂处理步骤(f)中形成的悬浮液；以及(h) 执行至少一个离子交换色谱分离，从而制备浓IgG组合物。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在步骤(d)之前，用微细分的二氧化硅(SiO2)处理步骤(c)中形成的悬浮液并且过滤溶液。
在一个实施方案中，提供一种用于自血浆制备浓IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将冷血浆上清液部分的pH调整至约 7.0；(b)在介于约-5℃与约-9℃的温度下将步骤(a)的冷血浆上清液部分的乙醇浓度调整为或约为25％(v/v)，从而形成混合物，其中可以通过喷雾来调整乙醇浓度；(c)自步骤(b)的混合物分离液体和沉淀物； (d)用含有磷酸盐和乙酸盐的缓冲液将步骤(c)的沉淀物再悬浮，其中用每1000L缓冲液介于约400mL与约700mL之间的冰乙酸来调整缓冲液的pH，从而形成悬浮液；(e)将微细分的二氧化硅(SiO2)与步骤(d)的悬浮液混合至少约30分钟；(f)用压滤器过滤所述悬浮液，从而形成滤液；(g)用至少3个压滤器死体积的含有磷酸盐和乙酸盐的缓冲液洗涤压滤器，其中用每1000L缓冲液约150mL的冰乙酸调整所述缓冲液的pH，从而形成洗涤溶液；(h)合并步骤(f)的滤液与步骤(g) 的洗涤溶液，从而形成溶液，并且用清洁剂处理所述溶液；(i)将步骤(h)的溶液的pH调整至约7.0，并且添加乙醇至最终浓度为或约为 25％，从而形成沉淀物，其中可以通过喷雾来调整乙醇浓度和/或pH； (j)自步骤(i)的混合物分离液体和沉淀物；(k)将沉淀物溶解在包含溶剂或清洁剂的水性溶液中，并将溶液维持至少60分钟；(l)在步骤(k)之后，使溶液通过阳离子交换色谱柱，并将管柱上吸附的蛋白质洗脱到洗脱液中；(m)使步骤(l)的洗脱液通过阴离子交换色谱柱，以便产生流出物(即流过物)；(n)使步骤(m)的流出物通过纳滤器，以产生纳滤液；(o)使步骤(n)的纳滤液通过超滤膜，以产生超滤液；以及(p)相对于透滤缓冲液透滤步骤(o)的超滤液，以产生蛋白质浓度在约8％(w/v) 与约22％(w/v)之间的透滤液，从而获得浓IgG组合物。在一个实施方案中，步骤(b)的温度为或约为-7℃。在一个特定实施方案中，用约 600mL的冰乙酸调整步骤(d)的悬浮缓冲液。
在某些实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将在约8％与约12％之间，例如约8％或约9％、10％、11％或12％。在一个优选实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将为或约为10％。在另一个优选实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将为或约为11％。在另一个优选实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将为或约为12％。在其它实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将在约13％与约17％之间，例如约13％或约14％、15％、16％或17％。在其它实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将在约18％与约 22％之间，例如约18％或约19％、20％、21％或22％。在一个优选实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将为或约为20％。在另一个优选实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将为或约为21％。在另一个优选实施方案中，透滤液的蛋白质浓度将为或约为22％。
在本发明的某些实施方案中，本文提供的方法可以包括以上所述的两个或更多个分离工艺步骤的改进。例如，实施方案可以包括第一沉淀步骤、修改的部分II+III沉淀步骤、修改的部分II+III溶解步骤和/或修改的部分II+III悬浮液过滤步骤的改进。
在一个实施方案中，在第一沉淀步骤中进行的改进是通过喷雾添加醇。在另一个实施方案中，在第一沉淀步骤中进行的改进是通过喷雾添加pH调节剂。在又一个实施方案中，在第一沉淀步骤中进行的改进是在添加醇之后调整溶液的pH。在一个有关实施方案中，在第一沉淀步骤中进行的改进是在添加醇期间维持pH。在另一个有关实施方案中，在第一沉淀步骤中进行的改进是在沉淀培育时间期间通过连续调整溶液的pH来维持pH。在某些实施方案中，第一沉淀步骤可以通过实施这些改进中的一种以上来改进。在这一步骤中可以实现的其它改进从以下提供的讨论第一沉淀步骤-修改的分离I的章节中将显而易见。通过实施以上所述的一种或多种改进，在第一沉淀步骤的沉淀物部分中损失降低量的IgG，和/或在沉淀步骤期间，降低部分的 IgG被不可逆的变性。
在一个实施方案中，在修改的部分II+III沉淀步骤中进行的改进是通过喷雾添加醇。在另一个实施方案中，在修改的部分II+III沉淀步骤中进行的改进是通过喷雾添加pH调节剂。在又一个实施方案中，在修改的部分II+III沉淀步骤中进行的改进是在添加醇之后调整溶液的pH。在一个有关实施方案中，在修改的部分II+III沉淀步骤中进行的改进是在添加醇期间维持pH。在另一个有关实施方案中，在修改的部分II+III沉淀步骤中进行的改进是在沉淀培育时间期间通过连续调整溶液的pH来维持pH。在另一个方面，修改的部分II+III沉淀步骤是通过将醇的浓度增加为或约为25％来改进。在另一个实施方案中，修改的部分II+III沉淀步骤是通过将培育温度降低至约-7℃与-9℃之间来改进。在某些实施方案中，修改的部分II+III沉淀步骤可以通过实施这些改进中的一种以上来改进。在这一步骤中可以实现的其它改进从以下提供的讨论第二沉淀步骤-修改的分离II+III的章节中将显而易见。通过实施以上所述的一种或多种改进，在修改的部分II+III 沉淀步骤的上清液部分中损失降低量的IgG，和/或在沉淀步骤期间，降低部分的IgG被不可逆的变性。
在一个实施方案中，在修改的部分II+III溶解步骤中进行的改进是通过将溶解缓冲液的冰乙酸含量增加至约0.06％来实现。在另一个实施方案中，在修改的部分II+III溶解步骤中进行的改进是通过在溶解培育时间期间通过连续调整溶液的pH从而维持溶液的pH来实现。在另一个实施方案中，在修改的部分II+III溶解步骤中进行的改进是通过在过滤之前混合微细分的二氧化硅(SiO2)与部分II+III悬浮液来实现。在某些实施方案中，修改的部分II+III溶解步骤可以通过实施这些改进中的一种以上来改进。在这一步骤中可以实现的其它改进从以下提供的讨论修改的部分II+III溶解步骤-萃取修改的部分II+III沉淀物的章节中将显而易见。通过实施以上所述的一种或多种改进，增加量的IgG被回收到部分II+III悬浮液中，和/或部分II+III悬浮液中的杂质的量被降低。
在修改的部分II+III悬浮液过滤步骤中进行的示例性改进是通过用至少约3.6个死体积的每1000L含有150mL或约150mL的冰乙酸的溶解缓冲液来后洗涤过滤器来实现。在这一步骤中可以实现的其它改进从以下提供的讨论修改的部分II+III悬浮液过滤步骤-预处理和过滤修改的部分II+III悬浮液的章节中将显而易见。通过实施以上所述的一种或多种改进，在修改的部分II+III悬浮液过滤步骤中损失降低量的IgG。
在一个实施方案中，所述方法可以包括第一沉淀步骤和修改的部分II+III沉淀步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括第一沉淀步骤和修改的部分II+III溶解步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括第一沉淀步骤和修改的部分II+III悬浮液过滤步骤的改进.
在另一个实施方案中，所述方法可以包括修改的部分II+III沉淀步骤和修改的部分II+III溶解步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括修改的部分II+III沉淀步骤和修改的部分II+III悬浮液过滤步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括修改的部分II+III溶解步骤和修改的部分II+III悬浮液过滤步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括第一沉淀步骤、修改的部分II+III沉淀步骤以及修改的部分II+III溶解步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括第一沉淀步骤、修改的部分II+III沉淀步骤以及修改的部分II+III悬浮液过滤步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括第一沉淀步骤、修改的部分II+III溶解步骤以及修改的部分II+III悬浮液过滤步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括修改的部分II+III沉淀步骤、修改的部分II+III溶解步骤以及修改的部分II+III悬浮液过滤步骤的改进。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括第一沉淀步骤、修改的部分II+III沉淀步骤、修改的部分II+III溶解步骤以及修改的部分 II+III悬浮液过滤步骤中所有步骤的改进。
在某些实施方案中，在本文提供的IgG纯化方法中的一种工艺改进包括喷雾添加一种或多种溶液，所述溶液否则将通过流动添加引入到血浆部分中。例如，在某些实施方案中，工艺改进包括通过喷雾将醇(例如乙醇)添加至血浆部分中，以便使一种或多种蛋白质种类沉淀。在其它实施方案中，可以通过喷雾添加至血浆部分的溶液包括但不限于pH调节溶液、溶剂溶液、清洁剂溶液、稀释缓冲液、电导率调节溶液等。在一个优选实施方案中，通过喷雾将醇添加至血浆部分中，从而执行一个或多个醇沉淀步骤。在第二优选实施方案中，通过喷雾将pH调节溶液添加至血浆部分中，从而执行一个或多个pH调整步骤。
在某些实施方案中，可以与任何其它工艺改进相组合的另一种工艺改进包括在添加沉淀剂(例如醇或聚乙二醇)之前和/或与此同时调整被沉淀的血浆部分的pH。在一些实施方案中，提供工艺改进，其中通过连续监控和调整pH在整个沉淀培育或保持步骤中始终维持被主动沉淀的血浆部分的pH。在优选实施方案中，pH的调整是通过喷雾添加pH调节溶液来执行。
在其它实施方案中，可以与任何其它工艺改进相组合的另一种工艺改进包括使用微细分的二氧化硅以去除杂质的处理步骤。
1.制备冷血浆上清液
用于制备浓IgG组合物的起始材料一般由回收的血浆(即，离体自全血分离的血浆)或源血浆(即，即经由血浆去除术收集的血浆)组成。纯化过程典型地起始于将先前冷冻的汇集的血浆解冻，所述血浆的安全和质量因素已被测定。解冻典型地在不高于6℃的温度下进行。在低温下完全解冻冷冻的血浆之后，在冷却(例如≤6℃)下执行离心，以分离固体冷沉淀物与液体上清液。或者，分离步骤可以通过过滤而不是离心来执行。然后，在下一个步骤中处理液体上清液(还称为“冷血浆上清液”，在通过离心自新近解冻的血浆去除冷不溶性蛋白质之后)。在这一时刻，可以采用各种其它步骤来分离因子8抑制剂旁路活性(FEIBA)、因子IX复合物、因子VII浓缩物或抗凝血酶III 复合物。
2.第一沉淀事件-修改的分离I
在这一步骤中，冷血浆上清液典型地被冷却至约0±1℃，并且 pH被调整至约7.0至约7.5之间，优选地约7.1与约7.3之间，最优选地约7.2。在一个实施方案中，冷血浆上清液的pH被调整为或约为7.2的pH。然后，在搅拌血浆的同时，添加预先冷却的乙醇至乙醇为或约为8％v/v的目标浓度。同时，将温度进一步降低至约-4℃与约0℃之间。在一个优选实施方案中，温度被降低为或约为-2℃，以便使污染物沉淀，所述污染物如α2-巨球蛋白、β1A-球蛋白和β1C-球蛋白、纤维蛋白原以及因子VIII。典型地，沉淀事件将包括至少约1小时的保持时间，尽管也可以采用较短或较长的保持时间。随后，将理想地含有冷血浆上清液中存在的全部IgG含量的上清液(上清液I)然后通过离心、过滤或另一种适合的方法来收集。
与用作冷血浆上清液的第一分离步骤的常规方法(上文的Cohn 等；上文的Oncley等)相比，本发明在数个实施方案中提供了使得上清液I部分中的IgG产率提高的方法。在一个实施方案中，提高的IgG 产率是通过喷雾添加醇来实现。在另一个实施方案中，提高的IgG产率是通过喷雾添加pH调节剂来实现。在另一个实施方案中，提高的 IgG产率是通过在添加醇之后调整溶液的pH来实现。在一个有关实施方案中，提高的IgG产率是通过在添加醇期间调整溶液的pH来实现。
在一个特定方面，改进涉及在第一沉淀步骤的沉淀物部分中损失降低量的IgG的方法。例如，在某些实施方案中，与科恩方法6方案的第一沉淀步骤中损失的IgG的量相比，在第一沉淀步骤的沉淀物部分中损失降低量的IgG。
在某些实施方案中，工艺改进是通过在添加沉淀醇之后将溶液的 pH调整至约7.0与约7.5之间来实现。在其它实施方案中，在添加沉淀醇之后将溶液的pH调整至约7.1与约7.3之间。在其它实施方案中，在添加沉淀醇之后将溶液的pH调整至约7.0或约7.1、7.2、7,3、7.4 或7.5。在一个特定实施方案中，在添加沉淀醇之后将溶液的pH调整至约7.2。因而，在某实施方案中，与类似沉淀步骤相比，在第一沉淀步骤的沉淀物部分中损失降低量的IgG，在所述类似沉淀步骤中溶液的pH是在添加沉淀醇之前而不是之后调节。在一个实施方案中，在沉淀保持或培育时间期间，通过连续调整溶液的pH将pH维持在所需的pH。在一个实施方案中，醇是乙醇。
在其它某些实施方案中，工艺改进是通过喷雾，而不是流动添加来添加沉淀醇和/或用于调整pH的溶液来实现。因而，在某些实施方案中，与类似沉淀步骤相比，在第一沉淀步骤的沉淀物部分中损失降低量的IgG，在所述类似沉淀步骤中醇和/或用于调整pH的溶液是通过流动添加引入。在一个实施方案中，醇是乙醇。
在其它某些实施方案中，改进是通过将溶液的pH调整至约7.0 与约7.5之间来实现。在一个优选实施方案中，将溶液的pH调整至约7.1与约7.3之间。在其它实施方案中，在添加沉淀醇之后并且通过喷雾而不是流动添加来添加沉淀醇和/或用于调整pH的溶液，从而将溶液的pH调整为或约为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。在一个特定实施方案中，在添加沉淀醇之后并且通过喷雾而不是流动添加来添加沉淀醇和/或用于调整pH的溶液，从而将溶液的pH调整为或约为 7.2。在一个实施方案中，醇是乙醇。
3.第二沉淀事件-修改的分离II+III
为进一步浓化IgG含量和分离的纯度，使上清液I经受第二沉淀步骤，该步骤是修改的科恩-翁克莱部分II+III分离。总体上，将溶液的pH调整至约6.6与约6.8之间的pH。在一个优选实施方案中，将溶液的pH调整为或约为6.7。然后，在搅拌之时向溶液添加最终浓度为约20％至约25％(v/v)的醇(优选地乙醇)，以便使所述部分中的 IgG沉淀。在一个优选实施方案中，添加最终浓度为或约为25％(v/v) 的醇，以便使所述部分中的IgG沉淀。总体上，如α1-脂蛋白、α1-抗胰蛋白酶、Gc-球蛋白、α1X-糖蛋白、结合球蛋白、血浆铜蓝蛋白、转铁蛋白、血液结合素、克雷司马斯因子(Christmas factor)的部分、甲状腺素结合球蛋白、胆碱酯酶、高血压蛋白原以及白蛋白的污染物不会被这些条件沉淀。
在醇添加之前或与此同时，将溶液进一步冷却至约-7℃与约-9℃之间。在一个优选实施方案中，将溶液冷却为或约为-7℃的温度。在完成醇添加之后，立即将溶液的pH调整至约6.8与约7.0之间。在一个优选实施方案中，将溶液的pH调整为或约为6.9。典型地，沉淀事件将包括至少约10小时的保持时间，尽管也可以采用较短或较长保持时间。随后，通过离心、过滤或另一种适合的方法自上清液分离并收集沉淀物(修改的部分II+III)，该沉淀物理想地含有冷血浆上清液中存在的IgG内含物的至少约85％、优选地至少约90％、更优选地至少约95％。与用作冷血浆上清液的第二分离步骤的常规方法(上文的Cohn等；上文的Oncley等)相比，本发明在数个实施方案中提供了使得修改的部分II+III沉淀物中的IgG产率提高的方法。在一个有关实施方案中，本发明提供使得修改的II+III上清液中的IgG损失降低的方法。
与用作冷血浆上清液的第二分离步骤的常规方法(上文的Cohn 等；上文的Oncley等)相比，本发明在数个实施方案中提供了使得修改的部分II+III沉淀物中的IgG产率提高的方法。在一个实施方案中，改进是通过喷雾添加醇来实现。在另一个实施方案中，改进是通过喷雾添加pH调节剂来实现。在另一个实施方案中，改进是通过在添加醇之后调整溶液的pH来实现。在一个有关实施方案中，改进是通过在添加醇期间调整溶液的pH来实现。在另一个实施方案中，改进是通过将醇(例如乙醇)浓度增加至约25％(v/v)来实现。在另一个实施方案中，改进是通过将沉淀步骤的温度降低至约-7℃与-9℃之间来实现。在一个优选实施方案中，改进是通过将醇(例如乙醇)浓度增加至约25％(v/v)并将温度降低至约-7℃与-9℃之间来实现。相比之下， Cohn等与Oncley等在-5℃下执行沉淀，并且Oncley等使用20％的醇，以便降低沉淀物中的污染物水平。有利地是，本文提供的方法在最终产物中允许最大IgG产率，而无高污染水平。
已经发现当在添加沉淀醇之前将溶液的pH调整至约6.9的pH 时，溶液的pH自6.9移动至约7.4与约7.7之间，这部分是因为蛋白质沉淀。当溶液的pH移动远离6.9时，IgG的沉淀变得不太有利，并且某些污染物的沉淀变得更有利。有利地是，发明者已经发现通过在添加沉淀醇之后调整溶液的pH，在部分II+III沉淀物中回收到较高百分比的IgG。
因此，一方面，改进涉及其中在修改的部分II+III沉淀步骤的上清液部分中损失降低量的IgG的方法。换句话说，增加的百分比的起始IgG存在于部分II+III沉淀物中。在某些实施方案中，工艺改进是通过在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间将溶液的pH调整至约6.7与约7.1之间来实现。在另一个实施方案中，工艺改进是通过在沉淀培育期期间将溶液的pH连续维持在约6.7与约7.1之间来实现。在其它实施方案中，在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间将溶液的pH调整至约6.8与约7.0之间或在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间将溶液的pH调整至约6.7、6.8、6.9、7.0或7.1的pH 来实现。在一个特定实施方案中，在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间将溶液的pH调整至约6.9。在某些实施方案中，在沉淀培育期期间将溶液的pH连续维持在约6.8与约7.0之间，或在沉淀培育期期间将溶液的pH连续维持在约6.9的pH。因此，在某些实施方案中，与类似沉淀步骤相比，在第二沉淀步骤的上清液部分中损失降低量的IgG，在所述类似沉淀步骤中溶液的pH是在添加沉淀醇之前而不是之后调整，或在所述类似沉淀步骤中溶液的pH并未在整个沉淀培育期期间得以维持。在一个实施方案中，在沉淀保持或培育时间期间，通过连续调整溶液的pH将pH维持在所需的pH。在一个实施方案中，醇是乙醇。
在另一个实施方案中，工艺改进是通过喷雾而不是流动添加来添加沉淀醇和/或用于调整pH的溶液来实现。因而，在某些实施方案中，与类似沉淀步骤相比，在第二沉淀步骤的上清液部分中损失降低量的 IgG，在所述类似沉淀步骤中醇和/或用于调整pH的溶液是通过流动添加引入。在一个实施方案中，醇是乙醇。
在另一个实施方案中，工艺改进是通过在约-7℃与约-9℃之间的温度下执行沉淀步骤来实现。在一个实施方案中，沉淀步骤是在为或约为-7℃的温度下执行。在另一个实施方案中，沉淀步骤是在为或约为-8℃的温度下执行。在另一个实施方案中，沉淀步骤是在为或约为 -9℃的温度下执行。在某些实施方案中，沉淀步骤的醇浓度是在约 23％与约27％之间。在一个优选实施方案中，醇浓度是在约24％与约 26％之间。在另一个优选实施方案中，醇浓度为或约为25％。在其它实施方案中，醇浓度可以为或约为23％、24％、25％、26％或27％。在一个特定实施方案中，第二沉淀步骤是在为或约为-7℃的温度下执行，而醇浓度为或约为25％。在一个实施方案中，醇是乙醇。
将第二沉淀的醇浓度自如上文的Oncley等中所用的20％增加至 25％和将培育温度自Cohn和Oncley法中所用的-5℃降低为或约为 -7℃的作用是修改的部分II+III沉淀物的IgG含量增加5％至6％。
在另一个实施方案中，工艺改进是通过以下来实现：在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间，将溶液的pH调整至约6.7与约7.1 之间，优选地调整为或约为6.9；在沉淀培育期期间通过连续调整pH 将溶液的pH维持在约6.7与约7.1之间的pH下，优选地维持在6.9 或约6.9的pH下；并且通过喷雾而不是流动添加来添加沉淀醇和/或用于调整pH的溶液。在另一个特定实施方案中，工艺改进是通过以下来实现：在约-7℃与约-9℃之间的温度下，优选地在为或约为-7℃的温度下执行沉淀步骤，并且用在约23％与约27％之间的醇浓度，优选地用为或约为25％的醇浓度使IgG沉淀。在另一个特定实施方案中，工艺改进是通过将以上提供的修改的部分II+III改进全部并入来实现。在一个优选实施方案中，工艺改进是通过以下来实现：在为或约为-7℃的温度下用通过喷雾添加的为或约为25％的醇使IgG沉淀，然后在添加沉淀醇之后将溶液的pH调整为或约为6.9。在另一个优选实施方案中，针对整个沉淀培育或保持时间，将溶液的pH维持为或约为6.9。
4.萃取修改的部分II+III沉淀物
为了溶解修改的部分II+III沉淀物中的IgG内含物，使用冷萃取缓冲液以1份沉淀物比15份萃取缓冲液的典型比例将分离的II+III 沉淀物再悬浮。可以使用其它适合的再悬浮比例，例如约1:8至约 1:30，或约1:10至约1:20，或约1:12至约1:18，或约1:13至约1:17，或约1:14至约1:16。在某些实施方案中，再悬浮比例可以为约1:8、 1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、 1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30 或更高。
用于萃取修改的II+III沉淀物的适合的溶液一般将具有约4.0与约5.5之间的pH。在某些实施方案中，溶液将具有约4.5与约5.0之间的pH，在其它实施方案中，萃取溶液将具有约4.0、4.1、4.2、4.3、 4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5的pH。在一个优选实施方案中，萃取缓冲液的pH将为或约为4.5。在另一个优选实施方案中，萃取缓冲液的pH将为或约为4.7。在另一个优选实施方案中，萃取缓冲液的pH将为或约为4.9。总体上，使用选自以下的缓冲剂可以满足这些pH要求：例如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸二氢盐、磷酸一氢盐、其混合物，以及类似物。适合的缓冲液浓度典型地在约5至约100mM范围内，或在约10至约50mM范围内，或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95或100mM的缓冲剂。
萃取缓冲液优选地将具有约0.5mS·cm-1至约2.0mS·cm-1的电导率。例如在某些实施方案中，萃取缓冲液的电导率将为约0.5mS·cm-1或约0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、 1.8、1.9或约2.0mS·cm-1。本领域的一般技术人员将知道如何产生具有适当电导率的萃取缓冲液。
在一个特定实施方案中，示例性萃取缓冲液在为或约为4.5±0.2 的pH下和为或约为0.7至0.9mS/cm的电导率下，可以含有为或约为 5mM的磷酸二氢钠和为或约为5mM的乙酸盐，。
总体上，在约0℃至约10℃下或在约2℃至约8℃下执行萃取。在某些实施方案中，可以在约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、 7℃、8℃、9℃或10℃下执行萃取。在一个特定实施方案中，在约2℃至约10℃下执行萃取。典型地，萃取过程将进行约60至约300分钟，或约120至240分钟，或约150至210分钟，同时连续搅拌悬浮液。在某些实施方案中，萃取过程将进行约60、70、80、90、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或约300分钟。在一个优选实施方案中，萃取过程将在连续搅拌情况下进行至少160分钟。
已经发现采用含有5mM磷酸二氢钠、5mM乙酸盐以及0.051％至0.06％的冰乙酸(v/v)的萃取缓冲液，可以获得最终IgG组合物中产率增加的实质性增加，而不危害最终产物的纯度。在一个优选实施方案中，用为或约为1:15的糊状物与缓冲液比例(ration)在为或约为4.5±0.2的pH下萃取部分II+III沉淀物。
有利地是，已经发现与LIQUID(Baxter Healthcare)的当前制造方法相比，所述方法采用含有5mM磷酸二氢钠、5mM乙酸盐以及0.051％冰乙酸(v/v)的萃取缓冲液，通过将冰乙酸的含量增加为或约为0.06％(v/v)，可以获得最终IgG组合物中的产率增加的实质增加。与先前用于萃取通过第二沉淀步骤形成的沉淀物的方法(LIQUID)相比，本发明在数个实施方案中提供了使得修改的部分II+III悬浮液中的IgG产率提高的方法。
一方面，改进涉及其中在修改的部分II+III沉淀物的未溶解部分中损失降低量的IgG的方法。在一个实施方案中，工艺改进是通过以下来实现：在1:15(沉淀物:缓冲液)的比例下用含有5mM磷酸二氢钠、 5mM乙酸盐以及0.06％的冰乙酸(v/v)的溶液萃取修改的部分II+III 沉淀物。在另一个实施方案中，改进是通过在萃取过程持续期间维持溶液的pH来实现。在一个实施方案中，在萃取过程的持续期间，将溶液的pH维持在约4.1与约4.9之间。在一个优选实施方案中，在萃取过程的持续期间，将溶液的pH维持在约4.2与约4.8之间。在一个更优选实施方案中，在萃取过程的持续期间，将溶液的pH维持在约4.3与约4.7之间。在另一个优选实施方案中，在萃取过程的持续期间，将溶液的pH维持在约4.4与约4.6之间。在另一个优选实施方案中，在萃取过程的持续期间，将溶液的pH维持为或约为4.5之间。
在另一个方面，改进涉及其中在部分II+III溶解步骤中增加量的 IgG自部分II+III沉淀物溶解的方法。在一个实施方案中，工艺改进是通过将部分II+III沉淀物溶解在每1000L含有600mL冰乙酸的溶解缓冲液中来实现。在另一个实施方案中，改进涉及在部分II+III沉淀物中的IgG溶解之后杂质降低的方法。在一个实施方案中，工艺改进是通过将微细分的二氧化硅(SiO2)与部分II+III悬浮液混合至少约 30分钟来实现。
5.修改的部分II+III悬浮液的预处理和过滤
为了去除修改的部分II+III沉淀物(即修改的部分II+III滤饼)的未溶解部分，典型地使用深层过滤来过滤悬浮液。在本文提供的方法中可以采用的深层过滤器包括金属、玻璃、陶瓷、有机(如硅藻土)深层过滤器以及类似过滤器。适合的过滤器的实例包括但不限于Cuno 50SA、Cuno 90SA以及Cuno VR06过滤器(Cuno)。或者，可以通过离心而不是过滤来执行分离步骤。
尽管以上所述的制造工艺改进减小了纯化过程的初始步骤中的 IgG损失，但与萃取发生在约4.9至5.0的pH下时相比，当例如在pH 4.5或4.6下萃取II+III相时，包括PKA活性、酰胺水解活性以及纤维蛋白原含量的关键杂质非常高(参见实施例2至5)。
为了对抗本文提供的方法中所萃取的杂质，现在已经发现IgG组合物的纯度可以通过在过滤/离心之前添加预处理步骤而大大提高。在一个实施方案中，这一预处理步骤包括添加微细分的二氧化硅颗粒 (例如烟雾状二氧化硅，)，接着是40至80分钟的培育期，期间不断搅拌悬浮液。在某些实施方案中，培育期将在约50分钟与约 70分钟之间，或为约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80分钟或80分钟以上。总体上，在约0℃至约10℃下或在约2℃至约8℃下执行处理。在某些实施方案中，可以在约0℃、1℃、2℃、3℃、 4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下执行处理。在一个特定实施方案中，在约2℃至约10℃下执行处理。
烟雾状二氧化硅处理的作用是通过实施例17中所见的结果来例证。在这一实施例中，将部分II+III沉淀物悬浮并分成两个样品，其中一个样品在过滤之前只用助滤剂来净化，并且其中一个样品在添加助滤剂并过滤之前用烟雾状二氧化硅处理。如自色谱图和定量数据可见，与仅仅用助滤剂处理的样品相比，用烟雾状二氧化硅预处理的滤液样品具有更高的IgG纯度(68.8％对55.7％，分别比较表17和18)。
在某些实施方案中，添加浓度为每千克II+III糊状物约20克至每千克II+III糊状物约100g的烟雾状二氧化硅(即对于以1:15的比率萃取的修改的部分II+III沉淀物来说，应添加浓度为每16千克II+III悬浮液约20克至每16千克II+III悬浮液约100克或最终浓度为约 0.125％(w/w)至约0.625％(w/w)的烟雾状二氧化硅)。在某些实施方案中，可添加浓度为每千克II+III糊状物约20克或每千克II+III糊状物约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95或100克的烟雾状二氧化硅。在一个特定实施方案中，将烟雾状二氧化硅(例如Aerosil 380或等效物)添加至修改的部分II+III悬浮液中至最终浓度为每16千克II+III约40克。在约2℃至8℃下混合至少50至70分钟。
在某些实施方案中，将浓度为每克蛋白质约0.01克至每克蛋白质约10克的SiO2添加至IgG组合物中。在另一个实施方案中，将浓度为每克蛋白质约0.01克至每克蛋白质约5克的SiO2添加至IgG组合物中。在另一个实施方案中，将浓度为每克蛋白质约0.02克至每克蛋白质约4克的SiO2添加至IgG组合物中。在一个实施方案中，添加最终浓度为每克总蛋白质至少0.1克的SiO2。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.2克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.25克的烟雾状二氧化硅。在其它特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少1克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少2克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少2.5克的烟雾状二氧化硅。在其它特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.01克或每克总蛋白质至少0.02克、0.03克、0.04克、0.05克、0.06克、0.07克、0.08克、 0.09克、0.1克、0.2克、0.3克、0.4克、0.5克、0.6克、0.7克、0.8 克、0.9克、1.0克、1.5克、2.0克、2.5克、3.0克、3.5克、4.0克、 4.5克、5.0克、5.5克、6.0克、6.5克、7.0克、7.5克、8.0克、8.5 克、9.0克、9.5克、10.0克或10.0克以上的微细分的二氧化硅。
在某些实施方案中，将在二氧化硅处理之后添加助滤剂(例如 Celpure C300(Celpure)或Hyflo-Supper-Cel(World Minerals))以有助于深度过滤。可以添加最终浓度为每千克II+III糊状物约0.01千克至每千克II+III糊状物约1.0千克、或每千克II+III糊状物约0.02千克至每千克II+III糊状物约0.8千克、或每千克II+III糊状物约0.03千克至每千克II+III糊状物约0.7千克的助滤剂。在其它实施方案中，可以添加最终浓度为每千克II+III糊状物约0.01千克至每千克II+III糊状物约0.07千克、或每千克II+III糊状物约0.02千克至每千克II+III 糊状物约0.06千克、或每千克II+III糊状物约0.03千克至每千克II+III 糊状物约0.05千克的助滤剂。在某些实施方案中，将添加最终浓度为每千克II+III糊状物约0.01千克、或每千克II+III糊状物约0.02、 0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9或1.0千克的助滤剂。
在LIQUID制造过程的过滤步骤中损失了显著部分的IgG。发现过滤后使用1.8个死体积的悬浮缓冲液洗涤以净化压滤器框和线的当前方法在这一步骤中足以最大回收IgG。令人意外的是，需要至少3.0个死体积，优选地至少3.6个死体积的悬浮缓冲液，以便有效回收修改的部分II+III净化悬浮液中的总IgG(参见实施例12和图1)。在某些实施方案中，压滤器可以用任何适合的悬浮缓冲来洗涤。在一个特定实施方案中，洗涤缓冲液将包括例如5mM磷酸二氢钠、5mM乙酸盐以及0.015％冰乙酸(v/v)。
一方面，改进涉及其中在部分II+III悬浮液过滤步骤中损失降低量的IgG的方法。在一个实施方案中，工艺改进是通过以下来实现：用至少约3.6个死体积的每1000L含有150mL冰乙酸的溶解缓冲液后洗涤过滤器。在一个实施方案中，后洗涤萃取缓冲液的pH是在约4.6与约5.3 之间。在一个优选实施方案中，后洗涤缓冲液的pH是在约4.7与约 5.2之间。在另一个优选实施方案中，后洗涤缓冲液的pH是在约4.8 与约5.1之间。在另一个优选实施方案中，后洗涤缓冲液的pH是在约4.9与约5.0之间。
与先前用于净化来自第二沉淀步骤的所形成的悬浮液 (LIQUID)的方法相比，本发明在数个实施方案中提供了使得净化的部分II+III悬浮液中的IgG产率提高的方法。一方面，改进涉及其中在修改的部分II+III滤饼中损失降低量的IgG的方法。在其它方面，改进涉及其中在净化的部分II+III悬浮液中发现降低量的杂质的方法。
在一个实施方案中，工艺改进是通过包括在过滤或离心净化部分II+III悬浮液之前进行烟雾状二氧化硅处理来实现。在某些实施方案中，烟雾状二氧化硅处理将包括添加每千克II+III糊状物约0.01kg 至每千克II+III糊状物约0.07千克、或每千克II+III糊状物约0.02千克至每千克II+III糊状物约0.06千克、或每千克II+III糊状物约0.03 千克至每千克II+III糊状物约0.05千克、或每千克II+III糊状物约0.02 千克、每千克II+III糊状物0.03千克、每千克II+III糊状物0.04千克、每千克II+III糊状物0.05千克、每千克II+III糊状物0.06千克、每千克II+III糊状物0.07千克、每千克II+III糊状物0.08千克、每千克II+III 糊状物0.09千克或每千克II+III糊状物0.1千克的二氧化硅，并将在介于约2℃与约8℃之间的温度下培育混合物约50分钟至约70分钟、或约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80分钟或80分钟以上。在另一个实施方案中，工艺改进是通过包括降低残余纤维蛋白原水平、酰胺水解活性和/或前激肽释放酶活化剂活性的烟雾状二氧化硅处理来实现。在一个特定实施方案中，工艺改进是通过包括降低免疫球蛋白制剂中FXI、FXIa、FXII以及FXIIa的水平的烟雾状二氧化硅处理来实现。
在另一个实施方案中，工艺改进是通过以下来实现：在完成修改的部分II+III悬浮液过滤步骤之后，用约3至约5体积的过滤器死体积来洗涤深度过滤器。在某些实施方案中，将用约3.5体积至约4.5 体积，或至少约2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、 4.8、4.9、5.0体积的过滤器死体积洗涤过滤器。在一个特定实施方案中，将用至少约3.6个死体积的悬浮缓冲液洗涤压滤器。
6.清洁剂处理
为了自修改的部分II+III滤液去除其它污染物，接下来使样品经受清洁剂处理。在本领域中熟知对源自血浆的部分进行清洁剂处理的方法。总体上，任何标准的非离子型清洁剂处理可以与本文提供的方法结合使用。例如，以下提供了用于清洁剂处理的示例性方案。
简单地说，在搅拌情况下将最终浓度为约0.2％(w/v)的聚山梨醇酯-80添加至修改的部分II+III滤液，并且将样品在约2℃至8℃的温度下培育至少30分钟。然后将最终浓度为约8g/L的柠檬酸钠脱水物混合到溶液中，并且在连续搅拌情况下在约2℃至8℃的温度下将样品再培育30分钟。
在某些实施方案中，可以使用任何适合的非离子型清洁剂。适合的非离子型清洁剂的实例包括但不限于辛基葡糖苷、毛地黄皂苷、 C12E8、卢布若尔(Lubrol)、曲拉通X-100、诺乃清洁剂(Nonidet)P-40、吐温-20(即聚山梨醇酯-20)、吐温-80(即聚山梨醇酯-80)、烷基聚合(氧化乙烯)、Brij清洁剂、烷基苯酚聚(氧化乙烯)、泊洛沙姆、辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷，以及类似清洁剂。
在一个实施方案中，工艺改进是通过喷雾而不是流动添加来添加清洁剂(例如聚山梨醇酯-80和柠檬酸钠脱水物)来实现。在其它实施方案中，可以将呈固体形式的清洁剂试剂添加至修改的部分II+III滤液中，同时混合样品以确保添加剂的快速分布。在某些实施方案中，优选的是通过将固体撒在滤液的非局部表面积上来添加固体试剂，这样使得如在流动添加中的局部过浓集不会出现。
7.第三沉淀事件-沉淀G
为了去除数种残余的小蛋白质，如白蛋白和转铁蛋白，在25％的醇浓度下执行第三沉淀。简单地说，用适合的pH调节溶液(例如1 M氢氧化钠或1M乙酸)将清洁剂处理的II+III滤液的pH调整至约6.8 与7.2之间，优选地约6.9与约7.1之间，最优选地约7.0。然后，将最终浓度为约25％(v/v)的冷醇添加至溶液中，并在搅拌之时，将混合物在约-6℃至约-10℃下培育至少1小时，以形成第三沉淀物(即沉淀物G)。在一个实施方案中，将混合物培育至少2小时，或至少3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24小时或24小时以上。在一个优选实施方案中，将混合物培育至少2小时。在一个更优选实施方案中，将混合物培育至少 4小时。在一个甚至更优选实施方案中，将混合物培育至少8小时。
一方面，工艺改进涉及其中在第三沉淀步骤的上清液部分中损失降低量的IgG的方法。在某些实施方案中，工艺改进是通过在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间将溶液的pH调整至约6.8与约7.2 之间来实现。在另一个实施方案中，工艺改进是通过在沉淀培育期期间将溶液的pH连续维持在约6.8与约7.2之间来实现。在其它实施方案中，在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间将溶液的pH调整至约6.9与约7.1之间或在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间将溶液的pH调整至约6.8、6.9、7.0、7.1或7.2的pH来实现。在一个特定实施方案中，在添加沉淀醇之后立即或在添加沉淀醇期间将溶液的pH调整至约7.0。在某些实施方案中，在沉淀培育期期间将溶液的pH连续维持在约6.9与约7.1之间，或在沉淀培育期期间将溶液的pH连续维持在约7.0的pH。因此，在某些实施方案中，与类似沉淀步骤相比，在第三沉淀步骤的上清液部分中损失降低量的IgG，在所述类似沉淀步骤中溶液的pH是在添加沉淀醇之前而不是之后调整，或在所述类似沉淀步骤中溶液的pH并未在整个沉淀培育期期间得以维持。在一个实施方案中，在沉淀保持或培育时间期间，通过连续调整溶液的pH将pH维持在所需的pH。在一个实施方案中，醇是乙醇。
在另一个实施方案中，工艺改进是通过喷雾而不是流动添加来添加沉淀醇和/或用于调整pH的溶液来实现。因而，在某些实施方案中，与类似沉淀步骤相比，在第三沉淀步骤的上清液部分中损失降低量的 IgG，在所述类似沉淀步骤中醇和/或用于调整pH的溶液是通过流动添加引入。在一个实施方案中，醇是乙醇。
8.沉淀物G(PptG)的悬浮和过滤
为了溶解沉淀物G中的IgG内含物，使用冷萃取缓冲液将PptG 再悬浮。简单地说，在约0℃至约8℃下，将沉淀物G按1:3.5溶解在注射用水(WFI)中，以取得约40至95的AU280-320值。然后，将被搅拌至少2小时的溶液的最终pH调整为或约为5.2±0.2。在一个实施方案中，所述pH调整是用1M乙酸执行。为了增加IgG的溶解性，使悬浮液的电导率增加至约2.5mS/cm与约6.0mS/cm之间。在一个实施方案中，通过添加氯化钠使电导率增加。然后用适合的深层过滤器过滤悬浮的PptG溶液，所述过滤器的标称孔径在约0.1μm与约0.4 μm之间，以便去除任何未溶解的颗粒。在一个实施方案中，深层过滤器的标称孔径为约0.2μm(例如Cuno VR06过滤器或等效物)，以获得净化的滤液。在另一个实施方案中，离心悬浮的PptG溶液，以回收净化的上清液。使用电导率在约2.5mS/cm与约6.0mS/cm之间的氯化钠溶液执行过滤器的后洗涤。典型地，用于萃取沉淀物G的适合的溶液包括WFI和低电导率缓冲液。在一个实施方案中，低电导率缓冲液具有小于约10mS/cm的电导率。在一个优选实施方案中，低电导率缓冲液具有小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mS/cm的电导率。在一个优选实施方案中，低电导率缓冲液具有小于约6mS/cm 的电导率。在另一个优选实施方案中，低电导率缓冲液具有小于约4 mS/cm的电导率。在另一个优选实施方案中，低电导率缓冲液具有小于约2mS/cm的电导率。
9.溶剂清洁剂处理
为了将可能存在于源自血浆的产物中的各种病毒污染物灭活，接下来使净化的PptG滤液经受溶剂清洁剂(S/D)处理。在本领域中熟知对源自血浆的部分进行清洁剂处理的方法(对于综述，参见Pelletier JP 等.,Best Pract Res Clin Haematol.2006；19(1):205-42)。总体上，任何标准S/D处理可以结合本文提供的方法使用。例如，以下提供用于 S/D处理的示例性方案。
简单地说，将最终浓度分别为约1.0％、0.3％以及0.3％的曲拉通 X-100、吐温-20以及磷酸三(正丁基)酯(TNBP)添加至净化的PptG滤液。然后，在约18℃与约25℃之间的温度下将混合物搅拌至少约1 小时。
在一个实施方案中，工艺改进是通过喷雾而不是流动添加来添加 S/D试剂(例如曲拉通X-100、吐温-20以及TNBP)来实现。在其它实施方案中，可以将呈固体形式的清洁剂试剂添加至净化的PptG滤液中，同时混合样品以确保S/D组份的快速分布。在某些实施方案中，优选的是通过将固体撒在滤液的非局部表面积上来添加固体试剂，这样使得如在流动添加中的局部过浓集不会出现。
10.离子交换色谱法
为了进一步自S/D处理的PptG滤液纯化并浓缩IgG，可以采用阳离子交换和/或阴离子交换色谱法。在本领域中熟知用于使用离子交换色谱法来纯化并浓缩IgG的方法。例如，美国专利号5,886,154 描述了一种方法，其中在低pH下(约3.8与4.5之间)萃取部分II+III 沉淀物，接着是使用辛酸沉淀IgG，并且最后实施两个阴离子交换色谱步骤。美国专利号6,069,236描述了完全不依赖于醇沉淀的色谱IgG 纯化方案。PCT公布号WO 2005/073252描述了包括以下的IgG纯化方法：萃取部分II+III沉淀物、辛酸处理、PEG处理以及单一阴离子交换色谱步骤。美国专利号7,186,410描述了包括以下的IgG纯化方法：萃取部分I+II+III或部分II沉淀物，接着在碱性pH下执行单一阴离子交换步骤。美国专利号7,553,938描述了包括以下的方法：萃取部分I+II+III或部分II+III沉淀物、锌酸盐处理以及一个或两个阴离子交换色谱步骤。美国专利号6,093,324描述了包括以下的纯化方法：使用在约6.0与约6.6之间的pH下操作的大孔阴离子交换树脂。美国专利号6,835,379描述了在醇分离不存在下依赖于阳离子交换色谱法的纯化方法。以上公布的公开内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的。
在本发明的方法的一个实施方案中，可以使S/D处理的PptG滤液经受阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。例如，在一个实施方案中，使S/D处理的PptG滤液通过结合溶液中的IgG的阳离子交换柱。然后，可以将S/D试剂自吸附的IgG洗涤掉，吸附的IgG随后用pH为约8.0至9.0的高pH洗脱缓冲液自管柱上洗脱下来。以这种方式，可以使用阳离子交换色谱步骤自制剂去除S/D试剂、浓缩含有IgG 的溶液，或两者。在某些实施方案中，pH洗脱缓冲液的pH可以在约 8.2与约8.8之间，在约8.4与约8.6之间，或为约8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的pH。在一个优选实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.5±0.1。
在某些实施方案中，可以将来自阳离子交换柱的洗脱液调整至例如约5.5与约6.5之间的低pH并用适当的缓冲液稀释，使得溶液的电导率降低。在某些实施方案中，可以将阳离子交换洗脱液的pH调整至约5.7与约6.3之间或约5.9与约6.1之间的pH，或调整为约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5的pH。在一个优选实施方案中，将洗脱液的pH调整至约6.0±0.1的pH。然后，将洗脱液装载在结合制剂中所发现的数种污染物的阴离子交换柱上。在管柱装载和洗涤期间，收集含有IgG部分的管柱流过物。在某些实施方案中，本发明的离子交换色谱步骤可以以管柱模式、分批模式或两者的组合来执行。
在某些实施方案中，工艺改进是通过喷雾而不是流动添加来添加用于调整pH的溶液来实现。
11.纳滤和超/透滤
为了进一步降低本文提供的IgG组合物的病毒负荷，可以使用适合的纳滤装置将阴离子交换柱流出物进行纳滤。在某些实施方案中，纳滤装置的将平均孔径将在约15nm与约200nm之间。适用于这一用途的纳滤器的实例包括但不限于DVD、DV 50、DV 20(Pall)、Viresolve NFP、Viresolve NFR(Millipore)、Planova 15N、20N、35N 以及75N(Planova)。在一个特定实施方案中，纳滤器的平均孔径可以在约15nm与约72nm之间或在约19nm与约35nm之间，或为约15 nm、19nm、35nm或72nm。在一个优选实施方案中，纳滤器的平均孔径将为约35nm，如Asahi PLANOVA 35N过滤器或其等效物。
任选地，可以执行超滤/透滤以进一步浓缩纳滤液。在一个实施方案中，使用开放通道膜与特别设计的后洗涤，并且与本领域IVIG (例如LIQUID)的进展相比，在接近产生过程结束时的制剂使所得IgG组合物的蛋白质浓度为约2倍高(200mg/mL)，而同时产率和存储稳定性不受影响。用大部分商购超滤膜，无法在无较多蛋白质损失的情况下，达到200mg/mL IgG的浓度。这些薄膜被过早地阻断，并因此难以达成充分后洗涤。因此，必须使用开放通道膜构型。即使用开放通道膜，还必须使用特别设计的后洗涤程度，以便在无显著蛋白质损失情况下(小于2％的损失)获得所需浓度。甚至更令人惊讶的是以下事实：200mg/mL的较高蛋白质浓度并不影响低pH 储存步骤的病毒灭活能力。
纳滤后，可以通过超滤/透滤来进一步浓缩滤液。在一个实施方案中，可以通过超滤将纳滤液浓缩至约2％与约10％(w/v)之间的蛋白质浓度。在某些实施方案中，在具有开放通道筛的匣中进行超滤，并且超滤膜的标称截留分子量(NMWCO)小于约100kDa或小于约90、 80、70、60、50、40、30kDa或30kDa以下。在一个优选实施方案中，超滤膜的NMWCO不大于50kDa。
在超滤步骤完成之后，可以经由相对于适合于静脉内或肌肉内施用的溶液透滤来进一步浓缩浓缩物。在某些实施方案中，透滤溶液可以包括稳定和/或缓冲剂。在一个优选实施方案中，稳定和缓冲剂是在例如约0.20M与约0.30M之间、或约0.22M与约0.28M之间、或约0.24M与约0.26mM之间的适当浓度或浓度为约2.0、2.1、2.2、 2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0的甘氨酸。在一个优选实施方案中，透滤缓冲液含有0.25M或约0.25M的甘氨酸。
典型地，最低交换体积是原始浓缩物体积的至少约3倍，或原始浓缩物体积的至少约4、5、6、7、8、9倍或9倍以上。可以将IgG 溶液浓缩至约5％与约25％(w/v)之间，或约6％与约18％(w/v)之间，或约7％与约16％(w/v)之间，或约8％与约14％(w/v)之间，或约9％与约12％之间的最终浓度，或浓缩至约5％，或6％、7％、8％、9％、 10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、 21％、22％、23％、24％、25％或25％以上的最终浓度。在一个实施方案中，在不将后洗涤部分添加至浓缩溶液的情况下，达成至少约 23％的最终蛋白质浓度。在另一个实施方案中，在不将后洗涤部分添加至浓缩溶液的情况下，达成至少约24％的最终蛋白质浓度。在不将后洗涤部分添加至浓缩溶液的情况下，达成至少约25％的最终蛋白质浓度。典型地，在浓缩过程结束时，溶液的pH将在约4.6至5.1之间。
在一个示例性实施方案中，在超滤之前，将IgG组合物的pH调整至约4.5。通过超滤将溶液浓缩至5±2％w/v的蛋白质浓度。UF 膜的标称截留分子量(NMWCO)为50,000道尔顿或50,000道尔顿以下 (Millipore Pellicon聚醚砜膜)。相对于10体积的0.25M甘氨酸溶液pH 4.5±0.2透滤浓缩物。在整个超-透滤操作期间，将溶液始终维持在约2℃至约8℃之间的温度下。透滤后，将溶液浓缩至至少11％(w/v) 的蛋白质浓度。
12.制剂
在完成透滤步骤之后，用透滤缓冲液将溶液的蛋白质浓度调整至最终浓度在约5％与约20％(w/v)之间，或在约6％与约18％(w/v)之间，或在约7％与约16％(w/v)之间，或在约8％与约14％(w/v)之间，或在约9％与约12％之间，或调整至最终浓度为约5％、or6％、7％、8％、 9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一个优选实施方案中，溶液的最终蛋白质浓度是在约9％与约11％之间，更优选地为约10％。
通过用膜过滤器过滤将配制的本体溶液进一步灭菌，所述膜过滤器的绝对孔径不大于约0.22微米，例如约0.2微米。然后，将溶液无菌分配到最终容器中，用于适当密封，其中取样品进行测试。
在一个实施方案中，用透滤缓冲液将IgG组合物进一步调整至约 10.2±0.2％(w/v)的浓度。必要时，将pH调整至约4.4至约4.9。最后，将溶液无菌过滤并在30℃或约30℃下培育3周。
B.因子H
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的因子H 组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使因子H组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与因子H组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI) 和/或因子XII(FXII)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：执行第一因子H蛋白质浓化步骤以形成第一浓化因子H组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一因子 H蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：执行第二因子H蛋白质浓化步骤以形成第二浓化因子H组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一因子 H蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的因子H组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一因子H浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的因子H组合物；(b)执行第二因子H浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的因子H组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI (FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：在使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触之后，执行因子H浓化步骤。在某些实施方案中，因子H浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的因子H组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一因子H浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的因子H组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)执行第二因子H浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的因子H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子 XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
同样地，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的因子H组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一因子H浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的因子H组合物；(b)执行第二因子H浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的因子H组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(e)执行第三因子H浓化步骤以形成第三浓化的源自血浆的因子H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa (FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所见的变化形式101至变化形式1100中的任一种变化形式。
1.制造源自血浆的因子H的方法
关于产生，所要求保护的由人类血浆起始的方法应基于通过例如在冷却时通过乙醇分离沉淀所获得的典型工业中间物的子分离(综述于Schultze H E,Heremans J F；Molecular Biology of Human Proteins.第 I卷：Nature and Metabolism ofExtracellular Proteins 1966,Elsevier Publishing Company；第236-317页中)。所述纯化的优选实施方案为纯化来自工业规模血浆分离的副部分(side fraction)的功能因子H，使得医药管理机构控制的血浆产品(如免疫球蛋白)的已确立并许可的制造过程不影响受。例如，在过滤部分II+III糊状物悬浮液(Teschner W等,Vox Sang.2007年1月；92(1):42-55)、部分I沉淀物(上文的Cohn 等,(1946))、沉淀物III(Schultze H E,Heremans J F；Molecular Biology of Human Proteins.第I卷：Nature and Metabolism ofExtracellular Proteins 1966,Elsevier Publishing Company；第236-317页,在第253页)以及沉淀物B(奇斯勒/尼赤曼方法；上文，第253页)之后所获得的滤饼为因子H的所述工业来源的实例。由所述副部分起始，可以使用本领域中已知的纯化程序来纯化因子H。这些化程序可以基于用聚乙二醇沉淀(Nagasawa S,Stroud R M；Mol Immunol 1980；17:1365-72)、经由固定肝素亲和色谱法(如以上的引用)、离子交换色谱(Crossley L G,Porter RR；Biochem J 1980；191:173-82)以及疏水性相互作用色谱 (Ripoche J,Al Salihi A,Rousseaux J,Fontaine M；Biochem J 1984；221, 89-96)。
在一个实施方案中，使用科恩部分制备本发明的起始材料。这一分离是熟知的用于制备可以由供体血清或单克隆或重组免疫球蛋白制备的免疫球蛋白制剂的分离。在典型实例中，自健康供体收集血液。通常，自与将施用免疫球蛋白制剂的受试者相同的物种的动物收集血液(典型地称为“同源”免疫球蛋白)。通过如科恩分离、超速离心、电泳制备、离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱、聚乙二醇分离或类似程序的适合程序自血液分离免疫球蛋白。(参见例如Cohn等,J. Am.Chem.Soc.68:459-75(1946)；Oncley等,J.Am.Chem.Soc.71:541-50(1949)；Barundern等,Vox Sang.7:157-74(1962)；Koblet等, Vox Sang.13:93-102(1967)；美国专利号5,122,373和5,177,194；其公开内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的。)在一个实施方案中，本发明使用来自免疫球蛋白制备的废弃部分。在一个特定实施方案中，本发明使用过滤部分II+III萃取物后在SiO2滤饼中所发现的部分。
总体上，根据本发明的因子H制剂可以由例如回收的血浆或源血浆的任何适合的起始材料来制备。在典型实例中，自健康供体收集血液或血浆。通常，自与将施用因子H制剂的受试者相同的物种的动物收集血液(典型地称为“同源”因子H)。通过如沉淀(醇分离或聚乙二醇分离)、色谱法(离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱等)、超速离心以及电泳制备以及类似程序的适合程序自血液或血浆分离因子H。(参见例如Cohn等,J.Am.Chem.Soc.68:459-75(1946)；Deutsch 等,J.Biol.Chem.164:109-118；Oncley等,J.Am.Chem.Soc.71:541-50 (1949)；Cohn等,J.Am.Chem.Soc.72:465-474(1950)；Cohn等,Blood Cells andPlasma Proteins:Their State in Nature(J.L.Tullis编)，第1-58 页，Academic Press,NewYork and London(1953)；Nitschmann等,Helv. Chim.Acta 37:866-873；Kistler&Nitschmann,Vox Sang.7:414-424 (1962)；Barundern等,Vox Sang.7:157-74(1962)；Koblet等,Vox Sang. 13:93-102(1967)；美国专利号5,122,373和5,177,194；其公开内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)。
在某些实施方案中，在通过血浆分离制造其它商业上重要的血液产品期间，自否则废弃的材料回收因子H。例如，在示例性实施方案中，自部分I沉淀物萃取和/或自再悬浮部分II+III糊状物离心或过滤之后所形成的滤饼萃取因子H。有利的是，根据本文所提供的方法，工业规模的因子H制备可在不需要额外输入血浆或对其它商业上重要的源自血浆的血液产品(如用于静脉内(IVIG)或皮下施用的IgGγ球蛋白)的现有制造过程作出重新设计和管理再批准的情况下达成。
一方面，本发明提供一种用于由血浆制备丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量降低的浓化因子H组合物的方法，其是通过自血浆部分萃取因子H并用本文所提供的SiO2处理方法降低FXI、FXIa、 FXII和/或FXIIa的含量来达成。
在一个实施方案中，提供一种用于由血浆制备浓化因子H组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一沉淀步骤中在介于约 7.0与约7.5之间的pH下用介于约6％与约10％之间的醇由冷血浆上清液部分沉淀析出蛋白质，获得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步骤中在介于约6.7与约7.3之间的pH下用介于约20％与约 30％之间的醇自第一上清液沉淀析出因子H，形成第二沉淀物；(c) 使第二沉淀物再悬浮以形成悬浮液；(d)混合微细分的二氧化硅(SiO2) 与步骤(c)的悬浮液；(e)分离悬浮液形成滤饼和上清液；以及(f)在可降低最终组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的水平的溶液条件下自SiO2滤饼萃取因子H。在一个优选实施方案中，通过用含有适合过滤器的压滤器过滤悬浮液使滤饼与上清液分离。在一个实施方案中，可以使萃取缓冲液再循环通过含有滤饼的压滤器来萃取因子H。
在第二方面中，本发明提供一种用于通过自部分I沉淀物萃取因子H而由血浆制备丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量降低的浓化因子H组合物的方法。
在一个优选实施方案中，提供一种用于由血浆制备浓化因子H 组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一沉淀步骤中在介于约7.0与约7.5之间的pH下用介于约6％与约10％之间的醇自冷血浆上清液部分沉淀析出蛋白质，以获得第一沉淀物和第一上清液；(b) 用因子H萃取缓冲液自沉淀物萃取因子H，以及(c)使用本文所提供的适合方法通过用SiO2处理组合物来降低丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的水平。
一方面，提供一种用于由血浆制备浓化因子H组合物的方法，其是通过自通过被设计以提供第二血液蛋白质(例如IgGγ球蛋白)的方法所产生的两种或更多种制造副产物部分的池萃取因子H来实现。在一个实施方案中，所述方法包括汇集制造IgGγ球蛋白(例如IVIG) 期间所形成的部分I沉淀物和部分II+III滤饼并自汇集部分萃取因子 H。
在某些实施方案中，可在自部分I沉淀物和/或部分II+III滤饼萃取之后进一步纯化丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量降低的浓化因子H组合物。各种方法可用于进一步纯化因子H，包括但不限于其它沉淀步骤或分离、亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱法、溶剂/清洁剂(S/D)处理、奈滤、超滤、透滤以及类似方法。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括自浓化因子H组合物沉淀析出杂质。在某些实施方案中，这一步骤包括自组合物沉淀析出至少一种杂质，例如脂质或蛋白质，然后使沉淀物与含有因子H的上清液分离。任选地，然后在单独的沉淀中自上清液沉淀析出因子H。
在一个特定实施方案中，通过使用最终浓度介于约2.5％与约 7.5％之间的PEG自溶液中沉淀析出至少一种杂质来进一步浓化自血浆部分(例如部分I沉淀物、部分II+III沉淀物、沉淀物B沉淀物等) 萃取的因子H组合物。在另一个实施方案中，使用最终浓度介于约3％与约7％之间的PEG。在另一个实施方案中，使用最终浓度介于约 4％与约6％之间的PEG。在另一个实施方案中，使用最终浓度为约 5％的PEG。
在另一个特定实施方案中，通过使用最终浓度介于约9％与15％之间的PEG自溶液中沉淀析出因子H来进一步浓化自血浆部分(例如部分I沉淀物、部分II+III沉淀物、沉淀物B沉淀物等)萃取的因子H 组合物。在另一个实施方案中，使用最终浓度介于约10％与约14％之间的PEG。在另一个实施方案中，使用最终浓度介于约11％与约 13％之间的PEG。在另一个实施方案中，使用最终浓度为约12％的 PEG。
在另一个特定实施方案中，通过以下进一步浓化自血浆部分(例如部分I沉淀物、部分II+III沉淀物、沉淀物B沉淀物等)萃取的因子 H组合物：(a)自溶液中沉淀析出至少一种杂质；(b)自溶液中沉淀析出因子H；以及(c)回收含有因子H的沉淀物。在某些实施方案中，用醇(例如甲醇或乙醇)、PEG或其组合执行沉淀步骤。在一个特定实施方案中，用PEG执行沉淀步骤。在某些实施方案中，第一沉淀步骤的PEG浓度介于约2.5％与约7.5％之间，并且第二沉淀步骤的PEG 浓度介于约9％与约15％之间。在一个特定实施方案中，第一步骤的PEG浓度介于约4％与约6％之间，并且第二步骤的PEG浓度介于约 11％与约13％之间。在一个更特定的实施方案中，第一沉淀步骤的 PEG浓度为约5％且第二沉淀步骤的PEG浓度为约12％。在其它实施方案中，第一和第二沉淀步骤的PEG浓度是选自表16中所列举的变化形式1101和变化形式1221的变化形式。
表16.用于浓化因子H组合物的PEG浓度
在某些实施方案中，制备浓化因子H组合物的方法进一步包括至少一个、优选两个色谱步骤以进一步浓化组合物的纯度。总体上，可采用任何适合的色谱法来进一步浓化因子H组合物，例如自部分I 沉淀物或部分II+III滤饼萃取。在某些实施方案中，在色谱浓化之前，萃取的因子H组合物将经受一个或多个如上所述的其它沉淀步骤，以降低组合物中存在的杂质、降低色谱步骤的装载体积和/或交换组合物的缓冲液。
在某些实施方案中，可以通过色谱步骤来进一步浓化因子H组合物，所述色谱步骤包括阴离子交换色谱法(AEC)、阳离子交换色谱法(CEC)、肝素亲和色谱法、疏水性交换色谱法(HIC)、羟磷灰石色谱法(HAP)、免疫亲和色谱法、尺寸排阻色谱法(即凝胶过滤)或其它适合的色谱步骤。可以分批或以管柱模式执行色谱步骤。
在一个优选实施方案中，所述方法包括使用阴离子交换色谱法和肝素亲和色谱法。
在某些实施方案中，本文所提供用于制备浓化因子H组合物的方法将进一步包括至少一个、优选至少两个、最优选至少三个病毒灭活或去除步骤。本文提供的方法可以采用的病毒灭活或去除步骤的非限制性实例包括溶剂清洁剂处理(Horowitz等,Blood CoagulFibrinolysis 1994(5增刊3):S21-S28和Kreil等,Transfusion 2003 (43):1023-1028，两个文献皆明确地以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)、纳滤(Hamamoto等,VoxSang 1989(56)230-236和 Yuasa等,J Gen Virol.1991(72(第8部分)):2021-2024，两个文献明确地以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)、高温下低pH培育(Kempf等,Transfusion 1991(31)423-427和Louie等,Biologicals 1994(22):13-19)以及冻干因子H组合物的热处理(Piszkiewicz等, Thromb Res.1987年7月15日；47(2):235-41；Piszkiewicz等,Curr Stud Hematol Blood Transfus.1989；(56):44-54；Epstein&Fricke,Arch Pathol Lab Med.1990年3月；114(3):335-40)。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种制备丝氨酸蛋白酶和/ 或丝氨酸蛋白酶原含量降低的病毒上安全的浓化因子H组合物的方法，所述方法包括(i)使用SiO2自部分II+III滤饼萃取因子H，(ii)执行第一沉淀步骤以自因子H组合物沉淀析出至少一种杂质，(iii)执行第二沉淀步骤以自组合物沉淀析出因子H，以及(iv)执行至少一个病毒灭活或去除步骤，从而制备病毒上安全的浓化因子H组合物。在一个实施方案中，沉淀步骤包括PEG沉淀。在一个特定实施方案中，第一和第二沉淀步骤的PEG浓度是选自表16中所列举的变化形式 1101和变化形式1221的变化形式。
2.共同结合和有差别的洗脱
一方面，本发明提供一种用于制备丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量降低的源自血浆的因子H组合物的方法，所述方法包括通过使蛋白质结合至微细分的二氧化硅(SiO2)自源自汇集的血浆的组合物共同萃取因子H和丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原，在第一溶液条件下自SiO2洗脱丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原，以及随后在第二溶液条件下自SiO2洗脱因子H。在一个优选实施方案中，起始组合物为再悬浮的部分II+III沉淀物或其等效沉淀物。
在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；(c)在因子H 仍保持结合的溶液条件下自SiO2洗脱丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)自SiO2洗脱因子H。
在某些实施方案中，因子H仍保持结合的溶液条件是指优先洗脱丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，而实质部分的因子H仍保持结合至SiO2的条件。在一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的因子H的至少10％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的因子H的至少25％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至 SiO2的因子H的至少50％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的因子H的至少75％。在其它实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的因子H的至少10％或结合至SiO2的因子H的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上。
在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原和因子H 的有差别的洗脱是通过使SiO2与适合于洗脱大部分丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，但不适合洗脱实质部分的结合的因子H的第一溶液条件(例如第一洗脱缓冲液)和适合于自SiO2洗脱实质部分的结合的因子H的第二溶液条件(例如第二洗脱缓冲液)依序接触(即逐步洗脱)来达成。
在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原和因子H 的有差别的洗脱是通过由适合于洗脱大部分丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，但不适合于洗脱实质部分的结合的因子H的第一溶液条件至适合于自SiO2洗脱实质部分的结合的因子H的第二溶液条件逐渐改变溶液条件(即在洗脱梯度下)来达成。以此方式，自SiO2洗脱出的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原和因子H含量可部分重迭。通过分离洗脱和表征单个部分，可以由因子H含量高并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原含量低的部分产生因子H池。
可以被改变以达成上述方法的所需结果的溶液条件包括但不限于溶液的pH、溶液的电导率、溶液的温度、组合物中因子H的浓度以及用于所述方法中的SiO2的浓度。总体上，适用于降低因子H浓化组合物中丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量的方法的pH范围在约3至约11的范围内。适用于上述方法的电导率在约0.1mS/cm 至约100mS/cm的范围内。适用于执行上述方法的温度在约-10℃至约90℃的范围内。可使用最终浓度在每克蛋白质约0.01克至每克蛋白质约10克范围内的微细分的二氧化硅。最终，因子H组合物的浓度可自约0.001mg/mL至约100mg/mL不等。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且显著部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括介于约5.0与约 11.0之间的pH。在另一个实施方案中，pH介于约6.0与约1.0之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.0与约9.0之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.5与约8.5之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.0与约8.0之间。
在一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且显著部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括约7.0的pH。在另一个实施方案中，pH为约7.5。在另一个实施方案中，pH为约 8.0。在其它实施方案中，pH为约3.0或约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、 4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、 6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、 8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、 10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且显著部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括至少6.0的pH。在另一个实施方案中，pH为至少6.5。在另一个实施方案中，pH为至少7.0。在另一个实施方案中，pH为至少7.5。在其它实施方案中，溶液的pH为至少3.0或至少3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或更高。
在任何上述方法的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且显著部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括不大于约11.0的pH。在另一个实施方案中，pH不大于约10.0。在另一个实施方案中，pH不大于约9.0。在另一个实施方案中，pH不大于约8.0。在其它实施方案中，pH不大于约11.0或10.5、10.0、9.5、 9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或更低。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且显著部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括至少10mS/cm 的电导率。在另一个实施方案中，电导率为至少20mS/cm。在其它实施方案中，溶液条件的电导率为至少2mS/cm或至少3mS/cm、4 mS/cm、5mS/cm、6mS/cm、7mS/cm、8mS/cm、9mS/cm、10mS/cm、 11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、 17mS/cm、18mS/cm、19mS/cm、20mS/cm、21mS/cm、22mS/cm、 23mS/cm、24mS/cm、25mS/cm、26mS/cm、27mS/cm、28mS/cm、 29mS/cm、30mS/cm、31mS/cm、32mS/cm、33mS/cm、34mS/cm、 35mS/cm、36mS/cm、37mS/cm、38mS/cm、39mS/cm、40mS/cm、 41mS/cm、42mS/cm、43mS/cm、44mS/cm、45mS/cm、46mS/cm、 47mS/cm、48mS/cm、49mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、 65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、 95mS/cm、100mS/cm或更大。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且显著部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括介于约10 mS/cm与约100mS/cm之间的电导率。在另一个实施方案中，电导率在约10mS/cm与约50mS/cm之间。在另一个实施方案中，电导率介于约20mS/cm与约100mS/cm之间。在另一个实施方案中，电导率在约20mS/cm与约50mS/cm之间。
如实施例5中所示并且如图3中所图示，发现使用pH大于6.0(例如7.5)和电导率增加(例如大于6.0mS/cm)的溶液条件会引起丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原自SiO2的洗脱作用增大和因子H自SiO2的洗脱作用降低。有利的是，这些发现可以用来提供降低因子H组合物中存在的丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原水平的方法。在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且显著部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括至少约10 mS/cm的电导率和至少7.0的pH。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括至少10mS/cm的电导率和为至少7.5的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括至少20mS/cm的电导率和至少7.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括至少20mS/cm的电导率和至少7.5 的pH。
3.共同结合和优先的因子H洗脱
一方面，本发明提供一种用于制备丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量降低的源自血浆的因子H组合物的方法，所述方法包括通过使蛋白质结合至微细分的二氧化硅(SiO2)自源自汇集的血浆的组合物共同萃取因子H和丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原，以及在实质部分的结合的丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合至SiO2的条件下自SiO2洗脱因子H。在一个优选实施方案中，起始组合物为再悬浮的部分II+III沉淀物或其等效沉淀物。
在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)在丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件下自SiO2洗脱因子H。
在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件是指优先洗脱因子H，而实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合至SiO2的条件。在一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少10％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少25％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少50％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少75％。在其它实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少10％或结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少15％、20％、25％、30％、35％、 40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上。
可被改变以达成上述方法的所需结果的溶液条件包括但不限于溶液的pH、溶液的电导率、溶液的温度、组合物中因子H的浓度以及用于所述方法中的SiO2的浓度。总体上，适用于降低因子H浓化组合物中丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量的方法的pH范围在约3至约11的范围内。适用于上述方法的电导率在约0.1mS/cm 至约100mS/cm的范围内。适用于执行上述方法的温度在约-10℃至约90℃的范围内。可使用最终浓度在每克蛋白质约0.01克至每克蛋白质约10克范围内的微细分的二氧化硅。最终，因子H组合物的浓度可自约0.001mg/mL至约100mg/mL不等。
在一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括介于约5.0与约 11.0之间的pH。在另一个实施方案中，pH介于约6.0与约1.0之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.0与约9.0之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.5与约8.5之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.0与约8.0之间。
在一个特定实施方案中，因子H自SiO2洗脱并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括约7.0的 pH。在另一个实施方案中，pH为约7.5。在另一个实施方案中，pH 为约8.0。在其它实施方案中，pH为约3.0或约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、 4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、 7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、 8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、 10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0。
在一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括至少6.0的pH。在另一个实施方案中，pH为至少6.5。在另一个实施方案中，pH为至少7.0。在另一个实施方案中，pH为至少7.5。在其它实施方案中，溶液的pH为至少3.0或至少3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或更高。
在任何上述方法的另一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括不大于约11.0的pH。在另一个实施方案中，pH不大于约10.0。在另一个实施方案中，pH不大于约9.0。在另一个实施方案中，pH 不大于约8.0。在其它实施方案中，pH不大于约11.0或10.5、10.0、 9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或更低。
在一个实施方案中，因子H自SiO2洗脱并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括不大于约20 mS/cm的电导率。在另一个实施方案中，电导率不大于约10mS/cm。在其它实施方案中，溶液条件的电导率不大于约20mS/cm或不大于约19mS/cm、18mS/cm、17mS/cm、16mS/cm、15mS/cm、14mS/cm、 13mS/cm、12mS/cm、11mS/cm、10mS/cm、9mS/cm、8mS/cm、7 mS/cm、6mS/cm、5mS/cm、4mS/cm、3mS/cm、2mS/cm或更小。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱并且显著部分的因子H仍保持结合的溶液条件包括介于约2mS/cm 与约20mS/cm之间的电导率。在另一个实施方案中，电导率介于约 2mS/cm与约10mS/cm之间。在另一个实施方案中，电导率介于约20mS/cm与约6mS/cm之间。在另一个实施方案中，电导率介于约 10mS/cm与约6mS/cm之间。
如实施例5中所示并且如图3中所图示，发现使用pH大于6.0(例如7.5)和电导率减小(例如小于20mS/cm)的溶液条件会引起因子H自SiO2洗脱的作用增大和丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原自SiO2洗脱的作用降低。有利的是，这些发现可以用来提供降低因子H组合物中存在的丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原水平的方法。在上述方法的一个特定实施方案中，因子H自SiO2洗脱并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件包括不大于约20 mS/cm的电导率和至少7.0的pH。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括不大于约10mS/cm的电导率和至少7.5的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于约10mS/cm与约2mS/cm之间的电导率和至少7.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于约10 mS/cm与约2mS/cm之间的电导率和至少7.5的pH。
4.因子H的优先结合
一方面，本发明提供一种用于制备丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原量降低的源自血浆的因子H组合物的方法，所述方法包括：(a)在适合于结合因子H，但不适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)自SiO2洗脱因子H。
在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至 SiO2的溶液条件是指在溶液中优先允许因子H结合至SiO2，而实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持未结合的条件。在一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少10％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少25％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少 50％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少75％。在其它实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少10％或起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上。
可被改变以达成上述方法的所需结果的溶液条件包括但不限于溶液的pH、溶液的电导率、溶液的温度、组合物中因子H的浓度以及用于所述方法中的SiO2的浓度。总体上，适用于降低因子H浓化组合物中丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量的方法的pH范围在约3至约11的范围内。适用于上述方法的电导率在约0.1mS/cm 至约100mS/cm的范围内。适用于执行上述方法的温度在约-10℃至约90℃的范围内。可使用最终浓度在每克蛋白质约0.01克至每克蛋白质约10克范围内的微细分的二氧化硅。最终，因子H组合物的浓度可自约0.001mg/mL至约100mg/mL不等。
在一个实施方案中，因子H结合至SiO2并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括介于约5.0与约11.0之间的pH。在另一个实施方案中，pH介于约6.0与约1.0之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.0与约9.0之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.5与约8.5之间。在另一个实施方案中，pH 介于约7.0与约8.0之间。
在一个特定实施方案中，因子H结合至SiO2并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括约7.0的 pH。在另一个特定实施方案中，pH为约7.5。在另一个实施方案中， pH为约8.0。在其它实施方案中，pH为约3.0或约3.1、3.2、3.3、3.4、 3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、 4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、 7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、 8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、 10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0。
在一个实施方案中，因子H结合至SiO2并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括至少6.0的 pH。在另一个实施方案中，pH为至少6.5。在另一个实施方案中，pH 为至少7.0。在另一个实施方案中，pH为至少7.5。在其它实施方案中，溶液的pH为至少3.0或至少3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或更高。
在任何上述方法的另一个实施方案中，因子H结合至SiO2并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括不大于约11.0的pH。在另一个实施方案中，pH不大于约10.0。在另一个实施方案中，pH不大于约9.0。在另一个实施方案中，pH不大于约8.0。在其它实施方案中，pH不大于约11.0或10.5、10.0、 9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或更低。
在一个实施方案中，因子H结合至SiO2并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括至少10 mS/cm的电导率。在另一个实施方案中，电导率为至少20mS/cm。在其它实施方案中，溶液条件的电导率为至少2mS/cm或至少3 mS/cm、4mS/cm、5mS/cm、6mS/cm、7mS/cm、8mS/cm、9mS/cm、 10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、 16mS/cm、17mS/cm、18mS/cm、19mS/cm、20mS/cm、21mS/cm、 22mS/cm、23mS/cm、24mS/cm、25mS/cm、26mS/cm、27mS/cm、 28mS/cm、29mS/cm、30mS/cm、31mS/cm、32mS/cm、33mS/cm、 34mS/cm、35mS/cm、36mS/cm、37mS/cm、38mS/cm、39mS/cm、 40mS/cm、41mS/cm、42mS/cm、43mS/cm、44mS/cm、45mS/cm、 46mS/cm、47mS/cm、48mS/cm、49mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、 60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、 90mS/cm、95mS/cm、100mS/cm或更大。
在一个实施方案中，因子H结合至SiO2并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括介于约10 mS/cm与约100mS/cm之间的电导率。在另一个实施方案中，电导率介于约10mS/cm与约50mS/cm。在另一个实施方案中，电导率介于约20mS/cm与约100mS/cm。在另一个实施方案中，电导率介于约 20mS/cm与约50mS/cm之间。
如实施例5中所示并且如图3中所图示，发现使用pH大于6.0(例如7.5)和电导率增加(例如大于6.0mS/cm)的溶液条件会引起丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原对SiO2的亲和力降低并且因子H对SiO2的亲和力增加。有利的是，这些发现可以用来提供降低因子H组合物中存在的丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原水平的方法。在上述方法的一个特定实施方案中，因子H结合至SiO2并且显著部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至SiO2的溶液条件包括至少约10 mS/cm的电导率和至少7.0的pH。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括至少10mS/cm的电导率和至少7.5的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括至少20mS/cm的电导率和至少7.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括至少20mS/cm的电导率和至少7.5 的pH。
5.丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的优先结合
一方面，本发明提供一种用于制备丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原量降低的源自血浆的因子H组合物的方法，所述方法包括：(a)在适合于结合丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原，但不适合于结合因子H的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与组合物分离。
在某些实施方案中，因子H不结合至SiO2的溶液条件是指在溶液中优先允许丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，而实质部分的因子H保留未结合的条件。在一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中因子H的至少10％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中因子H的至少25％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中因子H的至少50％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中因子H的至少75％。在其它实施方案中，实质部分是指起始组合物中因子H的至少10％或起始组合物中因子 H的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或99％以上。
可以被改变以达成上述方法的所需结果的溶液条件包括但不限于溶液的pH、溶液的电导率、溶液的温度、组合物中因子H的浓度以及用于所述方法中的SiO2的浓度。总体上，适用于降低因子H浓化组合物中丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原含量的方法的pH范围在约3至约11的范围内。适用于上述方法的电导率在约0.1mS/cm 至约100mS/cm的范围内。适用于执行上述方法的温度在约-10℃至约90℃的范围内。可以使用最终浓度在每克蛋白质约0.01克至每克蛋白质约10克范围内的微细分的二氧化硅。最终，因子H组合物的浓度可自约0.001mg/mL至约100mg/mL不等。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2并且显著部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括介于约5.0与约 11.0之间的pH。在另一个实施方案中，pH介于约6.0与约1.0之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.0与约9.0之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.5与约8.5之间。在另一个实施方案中，pH介于约7.0与约8.0之间。
在一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至 SiO2并且显著部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括约7.0的 pH。在另一个特定实施方案中，pH为约7.5。在另一个实施方案中， pH为约8.0。在其它实施方案中，pH为约3.0或约3.1、3.2、3.3、3.4、 3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、 7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、 8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、 10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2并且显著部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括至少6.0的pH。在另一个实施方案中，pH为至少6.5。在另一个实施方案中，pH为至少7.0。在另一个实施方案中，pH为至少7.5。在其它实施方案中，溶液的pH为至少3.0或至少3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或更高。
在任何上述方法的另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2并且显著部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括不大于约11.0的pH。在另一个实施方案中，pH不大于约10.0。在另一个实施方案中，pH不大于约9.0。在另一个实施方案中，pH不大于约8.0。在其它实施方案中，pH不大于约11.0或10.5、10.0、 9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或更低。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2并且显著部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括不大于约20 mS/cm的电导率。在另一个实施方案中，电导率不大于约10mS/cm。在其它实施方案中，溶液条件的电导率不大于约20mS/cm或不大于约19mS/cm、18mS/cm、17mS/cm、16mS/cm、15mS/cm、14mS/cm、 13mS/cm、12mS/cm、11mS/cm、10mS/cm、9mS/cm、8mS/cm、7 mS/cm、6mS/cm、5mS/cm、4mS/cm、3mS/cm、2mS/cm或更小。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2并且显著部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括介于约2 mS/cm与约20mS/cm之间的电导率。在另一个实施方案中，电导率介于约2mS/cm与约10mS/cm之间。在另一个实施方案中，电导率介于约20mS/cm与约6mS/cm之间。在另一个实施方案中，电导率介于约10mS/cm与约6mS/cm之间。
如实施例5中所示并且如图3中所图示，发现使用pH大于6.0(例如7.5)和电导率降低(例如小于20mS/cm)的溶液条件会引起因子H对 SiO2的亲和力增加并且丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原对SiO2的亲和力降低。有利的是，这些发现可以用来提供用于降低因子H组合物中存在的丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原水平的方法。在上述方法的一个特定实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至 SiO2并且显著部分的因子H不结合至SiO2的溶液条件包括不大于约 20mS/cm的电导率和至少7.0的pH。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括不大于约10mS/cm的电导率和至少7.5的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于约10mS/cm与约2mS/cm之间的电导率和至少7.0的pH。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于约 10mS/cm与约2mS/cm之间的电导率和至少7.5的pH。
6.自血浆沉淀物萃取因子H的方法
一方面，本发明提供一种用于制备因子H组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H的条件下使含有因子H 和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的悬浮血浆沉淀物组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触，(b)用包含介于5.0与7.0之间的 pH和小于4mS/cm的电导率的溶液洗涤SiO2，以及(c)用包含介于7.0 与8.0之间的pH和大于10mS/cm的电导率的溶液自SiO2洗脱因子H，从而提供浓化因子H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为FXI、FXIa、FXII以及FXIIa中的一种或多种。在某些实施方案中，血浆沉淀物为科恩部分I沉淀物、科恩部分II+III 沉淀物、科恩部分I+II+III沉淀物、奇斯勒/尼赤曼沉淀物A、奇斯勒 /尼赤曼沉淀物B或其等效部分。在一个实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含介于5.5与6.5之间的pH。在一个特定实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含至少20mS/cm的电导率。在一个特定实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含介于25mS/cm与40mS/cm之间的电导率。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括浓化步骤，所述浓化步骤包括自浓化因子H组合物沉淀析出至少一种杂质，其中因子H并未共同沉淀析出。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤： (a)在适合于结合因子H的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的悬浮血浆沉淀物组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触，(b)用包含介于5.0与7.0之间的pH和小于4mS/cm的电导率的溶液洗涤SiO2，(c)用包含介于7.0与8.0之间的pH和大于 10mS/cm的电导率的溶液自SiO2洗脱因子H，以及(d)自因子H洗脱物沉淀析出至少一种杂质，其中因子H未沉淀析出，从而提供浓化因子H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为FXI、FXIa、FXII以及FXIIa中的一种或多种。在某些实施方案中，血浆沉淀物为科恩部分I沉淀物、科恩部分II+III沉淀物、科恩部分I+II+III沉淀物、奇斯勒/尼赤曼沉淀物A、奇斯勒/尼赤曼沉淀物B或其等效部分。在一个实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含介于5.5与6.5之间的pH。在一个特定实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含至少20mS/cm的电导率。在一个特定实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含介于25mS/cm与40mS/cm之间的电导率。在一个实施方案中，杂质沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，杂质PEG沉淀包括用最终浓度介于3％与7％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，杂质沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为5±0.5％。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括浓化步骤，所述浓化步骤包括自浓化因子H组合物沉淀析出因子H。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的悬浮血浆沉淀物组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触，(b)用包含介于5.0与7.0 之间的pH和小于4mS/cm的电导率的溶液洗涤SiO2，(c)用包含介于 7.0与8.0之间的pH和大于10mS/cm的电导率的溶液自SiO2洗脱因子H，(d)自因子H洗脱物沉淀析出至少一种杂质，以形成包含因子H 的上清液，以及(e)自所述上清液沉淀析出因子H，从而提供浓化因子 H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为FXI、FXIa、FXII以及FXIIa中的一种或多种。在某些实施方案中，血浆沉淀物为科恩部分I沉淀物、科恩部分II+III沉淀物、科恩部分I+II+III沉淀物、奇斯勒/尼赤曼沉淀物A、奇斯勒/尼赤曼沉淀物B或其等效部分。在一个实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含介于5.5 与6.5之间的pH。在一个特定实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含至少20mS/cm的电导率。在一个特定实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含介于25mS/cm与40mS/cm之间的电导率。在一个实施方案中，杂质沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，杂质PEG 沉淀包括用最终浓度介于3％与7％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，杂质沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为5±0.5％。在一个实施方案中，因子H沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，因子H PEG沉淀包括用最终浓度介于10％与15％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，在因子H沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为12±0.5％。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括浓化步骤，所述浓化步骤包括用浓化因子H组合物执行阴离子交换色谱法。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的悬浮血浆沉淀物组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触，(b)用包含介于5.0 与7.0之间的pH和小于4mS/cm的电导率的溶液洗涤SiO2，(c)用包含介于7.0与8.0之间的pH和大于10mS/cm的电导率的溶液自SiO2洗脱因子H，(d)自因子H洗脱物沉淀析出至少一种杂质，以形成包含因子H的上清液，(e)自所述上清液沉淀析出因子H，(f)使包含因子H的沉淀物再悬浮，(g)使再悬浮的沉淀物中存在的因子H结合至阴离子交换树脂，以及(h)自阴离子交换树脂洗脱因子H，从而提供浓化因子H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为FXI、FXIa、FXII以及FXIIa中的一种或多种。在某些实施方案中，血浆沉淀物为科恩部分I沉淀物、科恩部分II+III沉淀物、科恩部分I+II+III沉淀物、奇斯勒/尼赤曼沉淀物A、奇斯勒/尼赤曼沉淀物B或其等效部分。在一个实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含介于5.5与6.5之间的pH。在一个特定实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含至少20mS/cm的电导率。在一个特定实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含介于25mS/cm与40mS/cm之间的电导率。在一个实施方案中，杂质沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，杂质PEG沉淀包括用最终浓度介于3％与7％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，杂质沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为5±0.5％。在一个实施方案中，因子H沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，因子H PEG沉淀包括用最终浓度介于10％与15％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，在因子H沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为12±0.5％。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括浓化步骤，所述浓化步骤包括用浓化因子H组合物执行肝素亲和色谱法。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的悬浮血浆沉淀物组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触，(b)用包含介于5.0 与7.0之间的pH和小于4mS/cm的电导率的溶液洗涤SiO2，(c)用包含介于7.0与8.0之间的pH和大于10mS/cm的电导率的溶液自SiO2洗脱因子H，(d)自因子H洗脱物沉淀析出至少一种杂质，以形成包含因子H的上清液，(e)自所述上清液沉淀析出因子H，(f)使包含因子H的沉淀物再悬浮，(g)使再悬浮的沉淀物中存在的因子H结合至阴离子交换树脂，(h)自阴离子交换树脂洗脱因子H，(i)使阴离子交换洗脱液中存在的因子H结合至肝素亲和树脂，以及(j)自肝素亲和树脂洗脱因子H，从而提供浓化因子H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为FXI、FXIa、FXII以及FXIIa中的一种或多种。在某些实施方案中，血浆沉淀物为科恩部分I沉淀物、科恩部分II+III沉淀物、科恩部分I+II+III沉淀物、奇斯勒/尼赤曼沉淀物A、奇斯勒/尼赤曼沉淀物B或其等效部分。在一个实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含介于5.5与6.5之间的pH。在一个特定实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含至少20mS/cm的电导率。在一个特定实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含介于25mS/cm与40 mS/cm之间的电导率。在一个实施方案中，杂质沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，杂质PEG沉淀包括用最终浓度介于3％与7％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，杂质沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为5±0.5％。在一个实施方案中，因子 H沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，因子H PEG沉淀包括用最终浓度介于10％与15％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，在因子H沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为 12±0.5％。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括使因子H组合物经受专用病毒去除和/或灭活步骤。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的悬浮血浆沉淀物组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触，(b)用包含介于5.0与7.0之间的pH和小于4mS/cm的电导率的溶液洗涤SiO2，(c)用包含介于7.0与8.0之间的pH和大于10mS/cm的电导率的溶液自SiO2洗脱因子H，(d)自因子H洗脱物沉淀析出至少一种杂质，以形成包含因子H的上清液，(e)自所述上清液沉淀析出因子H，(f)使包含因子H的沉淀物再悬浮， (g)使再悬浮的沉淀物中存在的因子H结合至阴离子交换树脂，(h)自阴离子交换树脂洗脱因子H，(i)使阴离子交换洗脱液中存在的因子H 结合至肝素亲和树脂，(j)自肝素亲和树脂洗脱因子H，以及(k)执行选自纳滤、溶剂/清洁剂(S/D)处理、热处理以及在低pH下培育的专用病毒去除和/或灭活步骤，从而提供浓化因子H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为FXI、FXIa、FXII 以及FXIIa中的一种或多种。在某些实施方案中，血浆沉淀物为科恩部分I沉淀物、科恩部分II+III沉淀物、科恩部分I+II+III沉淀物、奇斯勒/尼赤曼沉淀物A、奇斯勒/尼赤曼沉淀物B或其等效部分。在一个实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含介于5.5与6.5之间的pH。在一个特定实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含至少20mS/cm的电导率。在一个特定实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含介于25 mS/cm与40mS/cm之间的电导率。在一个实施方案中，杂质沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，杂质PEG沉淀包括用最终浓度在3％与7％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，杂质沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为5±0.5％。在一个实施方案中，因子H沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，因子H PEG沉淀包括用最终浓度介于10％与15％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，在因子H沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为 12±0.5％。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括通过超滤/透滤浓缩浓化因子H组合物的步骤。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合因子H的条件下使含有因子H和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的悬浮血浆沉淀物组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触，(b)用包含介于5.0与7.0之间的pH和小于4 mS/cm的电导率的溶液洗涤SiO2，(c)用包含介于7.0与8.0之间的pH 和大于10mS/cm的电导率的溶液自SiO2洗脱因子H，(d)自因子H洗脱物沉淀析出至少一种杂质，以形成包含因子H的上清液，(e)自所述上清液沉淀析出因子H，(f)使包含因子H的沉淀物再悬浮，(g)使再悬浮的沉淀物中存在的因子H结合至阴离子交换树脂，(h)自阴离子交换树脂洗脱因子H，(i)使阴离子交换洗脱液中存在的因子H结合至肝素亲和树脂，(j)自肝素亲和树脂洗脱因子H，(k)执行选自纳滤、溶剂/清洁剂(S/D)处理、热处理以及在低pH下培育的专用病毒去除和/或灭活步骤，以及(l)通过超滤/透滤浓缩因子H，从而提供浓化因子H组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为FXI、FXIa、FXII以及FXIIa中的一种或多种。在某些实施方案中，血浆沉淀物为科恩部分I沉淀物、科恩部分II+III沉淀物、科恩部分I+II+III沉淀物、奇斯勒/尼赤曼沉淀物A、奇斯勒/尼赤曼沉淀物B或其等效部分。在一个实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含介于5.5与6.5之间的pH。在一个特定实施方案中，用以洗涤SiO2的溶液包含6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含至少20mS/cm的电导率。在一个特定实施方案中，用以洗脱因子H的溶液包含介于25mS/cm与40mS/cm之间的电导率。在一个实施方案中，杂质沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，杂质PEG沉淀包含用最终浓度介于3％与7％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，杂质沉淀步骤中PEG4000的最终浓度为5±0.5％。在一个实施方案中，因子H沉淀步骤为PEG沉淀。在一个特定实施方案中，因子H PEG沉淀包括用最终浓度介于10％与15％之间的PEG 4000沉淀。在一个更特定的实施方案中，在因子H沉淀步骤中PEG 4000的最终浓度为12±0.5％。
C.间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的IαI组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使IαI组合物与微细分的二氧化硅 (SiO2)接触；和(b)使SiO2与IαI组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/ 或因子XII(FXII)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：执行第一IαI 蛋白质浓化步骤以形成第一浓化IαI组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一IαI蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：执行第二IαI 蛋白质浓化步骤以形成第二浓化IαI组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一IαI蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的 IαI组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一IαI浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的IαI组合物；(b)执行第二IαI浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的IαI组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII (FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1 中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：在使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触之后执行IαI浓化步骤。在某些实施方案中，IαI浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/ 透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的 IαI组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一IαI浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的IαI组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)执行第二IαI浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的 IαI组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1 中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
同样地，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的IαI组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一IαI浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的IαI组合物；(b)执行第二IαI浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的IαI组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(e)执行第三IαI浓化步骤以形成第三浓化的源自血浆的 IαI组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII (FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所见的变化形式101至变化形式1100中的任一种变化形式。
1.共同结合和有差别的洗脱
一方面，本发明提供一种用于制备丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量降低的源自血浆的IαI组合物的方法，所述方法包括通过使蛋白质结合至微细分的二氧化硅(SiO2)自源自汇集的血浆的组合物共同萃取IαI和丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原，在第一溶液条件下自 SiO2洗脱丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原，以及随后在第二溶液条件下自SiO2洗脱IαI。在一个优选实施方案中，起始组合物为再悬浮部分II+III沉淀物或其等效沉淀物。
在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使含有 IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；(c)在IαI仍保持结合的溶液条件下自SiO2洗脱丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d) 自SiO2洗脱IαI。
在某些实施方案中，IαI仍保持结合的溶液条件是指优先洗脱丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，而实质部分的IαI仍保持结合至SiO2的条件。在一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的IαI的至少 10％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的IαI的至少 25％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的IαI的至少 50％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的IαI的至少 75％。在其它实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的IαI的至少10％或结合至SiO2的IαI的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或99％以上。
在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原和IαI的有差别的洗脱是通过使SiO2与适合于洗脱大部分丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，但不适合于洗脱实质部分的结合的IαI的第一溶液条件 (例如第一洗脱缓冲液)和适合于自SiO2洗脱实质部分的结合的IαI的第二溶液条件(例如第二洗脱缓冲液)依序接触(亦即逐步洗脱)来达成。
在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原和IαI的有差别的洗脱是通过由适合于洗脱大部分丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原，但不适合于洗脱实质部分的结合的IαI的第一溶液条件至适合于自SiO2洗脱实质部分的结合的IαI的第二溶液条件逐渐改变溶液条件(亦即在洗脱梯度下)来达成。以此方式，自SiO2洗脱出的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原和IαI含量可以部分重迭。通过分离洗脱物和表征单个部分，可由IαI含量高并且丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原含量低的部分产生IαI池。
2.共同结合和优先的IαI洗脱
一方面，本发明提供一种用于制备丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量降低的源自血浆的IαI组合物的方法，所述方法包括通过使蛋白质结合至微细分的二氧化硅(SiO2)自源自汇集的血浆的组合物共同萃取IαI和丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原，和在实质部分的结合的丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合至SiO2的条件下自 SiO2洗脱IαI。在一个优选实施方案中，起始组合物为再悬浮的部分 II+III沉淀物或其等效沉淀物。
在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使含有 IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)在丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件下自SiO2洗脱IαI。
在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合的溶液条件是指优先洗脱IαI，而实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合至SiO2的条件。在一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少10％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少25％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少50％。在另一个实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少75％。在其它实施方案中，实质部分是指结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少10％或结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或99％以上。
3.IαI的优先结合
一方面，本发明提供一种用于制备丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原量降低的源自血浆的IαI组合物的方法，所述方法包括：(a)在适合于结合IαI，但不适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使含有IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(b)使SiO2与组合物分离；以及(c)自SiO2洗脱IαI。
在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原不结合至 SiO2的溶液条件是指在溶液中优先允许IαI结合至SiO2，而实质部分的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原仍保持未结合的条件。在一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少10％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少25％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少50％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少75％。在其它实施方案中，实质部分是指起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少10％或起始组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的至少15％、20％、25％、30％、35％、 40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或99％以上。
4.丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的优先结合
一方面，本发明提供一种用于制备丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原量降低的源自血浆的IαI组合物的方法，所述方法包括：(a)在适合于结合丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原，但不适合于结合IαI的条件下使含有IαI和至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(b)使SiO2与组合物分离。
在某些实施方案中，IαI不结合至SiO2的溶液条件是指在溶液中优先允许丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2，而实质部分的 IαI仍保持未结合的条件。在一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中IαI的至少10％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中IαI的至少25％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中IαI的至少50％。在另一个实施方案中，实质部分是指起始组合物中IαI的至少75％。在其它实施方案中，实质部分是指起始组合物中IαI的至少10％或起始组合物中IαI的至少15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上。
D.α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的α-1- 抗胰蛋白酶(A1PI)组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法。在一个特定实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使A1PI组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)使SiO2与A1PI组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa (FXIIa)、因子XI(FXI)和/或因子XII(FXII)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：执行第一 A1PI蛋白质浓化步骤以形成第一浓化A1PI组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一A1PI 蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：执行第二 A1PI蛋白质浓化步骤以形成第二浓化A1PI组合物，然后使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一A1PI 蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的 A1PI组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一A1PI浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的A1PI组合物；(b)执行第二A1PI浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的A1PI组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)和/ 或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一变化形式。
在某些实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：在使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触之后执行A1PI浓化步骤。在某些实施方案中，A1PI浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤 /透滤步骤以及色谱步骤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的 A1PI组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一A1PI浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的A1PI组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第一浓化组合物与微细分的二氧化硅 (SiO2)接触；(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)执行第二A1PI浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的A1PI组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI) 和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。
同样地，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的A1PI组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行第一A1PI浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的A1PI组合物；(b)执行第二A1PI浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的Ig组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使所述第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(e)执行第三A1PI浓化步骤以形成第三浓化的源自血浆的A1PI组合物。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原为因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI) 和/或因子XII(FXII)。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所见的变化形式101至变化形式1100中的任一种变化形式。
在一个特定实施方案中，A1PI组合物为制造中间物。例如，在某些实施方案中，A1PI组合物为来自以下的制造中间物：科恩分离程序(J.Am.Chem.Soc.,1946,68(3):459-475；J.Am.Chem.Soc. 72:465-474(1950))、翁克莱分离程序(J.Am.Chem.Soc.,1949, 71(2):541-550)、奇斯勒/尼赤曼分离程序(Vox Sang.7:414-424(1962))、美国专利号6,974,792或7,807,435中所公开的纯化程序、其修改程序以及本领域中已知的类似或等效纯化程序。前述参考文献据此以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的。
例如，已知A1PI的许多产生方法，其包括用聚乙二醇4000将血浆分离沉淀，以及各种血浆部分(科恩部分IV-1-沉淀物或奇斯勒和尼赤曼上清液A或A+1)的加工(Feldman&Winkelman,Blood Separation and Plasma Fractionation(1991),Wiley-Liss,Inc.,第341-383页)。在更精细的纯化中，各别血液部分已借助于DEAE纤维素纯化(例如Basis 等(Vopr.Med.Khim.33(1)(1987),54-59))、用亲和色谱材料或阳离子交换剂色谱材料处理(EP 0 698 615A1)。美国专利号6,974,792描述利用科恩部分V沉淀物产生高比活性的A1PI的纯化方法。美国专利号 7,807,435描述利用科恩部分IV-1和/或部分IV-4沉淀物提供较高产率的A1PI的纯化方法。
在一个特定实施方案中，A1PI组合物为冷科恩池上清液。在另一个特定实施方案中，A1PI组合物为再悬浮的科恩部分V沉淀物或其等效部分。在另一个特定实施方案中，A1PI组合物为再悬浮的科恩部分IV-1沉淀物或其等效部分。在另一个特定实施方案中，A1PI 组合物为再悬浮的科恩部分IV-4沉淀物或其等效部分。在另一个特定实施方案中，A1PI组合物为奇斯勒/尼赤曼上清液A或其等效部分。
总体上，自A1PI组合物去除丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原可以通过在使丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原结合至SiO2的pH 和电导率溶液条件下用微细分的二氧化硅(SiO2)处理含有A1PI的组合物来达成。
在一个实施方案中，工艺改进是通过包括在过滤或离心净化包含 A1PI的血浆沉淀物之前进行烟雾状二氧化硅处理来实现。在一个实施方案中，SiO2处理步骤包含添加微细分的二氧化硅颗粒(例如烟雾状二氧化硅、)，之后是40分钟至16小时的培育期，期间不断混合悬浮液。在某些实施方案中，培育期将介于约50分钟与约70 分钟之间，或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80分钟或80分钟以上。在其它实施方案中，培育期将为至少1 小时，或至少2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8 小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时或16小时以上。在一个特定实施方案中，培育期将为至少15小时。总体上，将在约0℃与约25℃之间，或约2℃与约8℃之间执行所述处理。在某些实施方案中，可以在约0℃、1℃、2℃、3℃、 4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、 15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃下执行所述处理。在一个特定实施方案中，在约2℃与约25℃之间执行所述处理。在一个特定实施方案中，工艺改进是通过包括降低免疫球蛋白制剂中FXI、FXIa、FXII以及FXIIa的水平的烟雾状二氧化硅处理来实现。
在某些实施方案中，添加浓度介于每千克沉淀物约20克与每千克沉淀物约100克之间的烟雾状二氧化硅。在某些实施方案中，可以添加浓度为每千克沉淀物约20克或每千克沉淀物约25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100克的烟雾状二氧化硅。在一个特定实施方案中，将烟雾状二氧化硅(例如Aerosil 380 或等效物)添加至沉淀物再悬浮液中达到最终浓度为每千克沉淀物约 40克。
在某些实施方案中，将浓度介于每克蛋白质约0.01克与每克蛋白质约10克之间的SiO2添加至A1PI组合物中。在另一个实施方案中，将浓度介于每克蛋白质约0.01克与每克蛋白质约5克之间的SiO2添加至A1PI组合物中。在另一个实施方案中，将浓度介于每克蛋白质约0.02克与每克蛋白质约4克之间的SiO2添加至A1PI组合物中。在一个实施方案中，将最终浓度为每克总蛋白质至少0.1克的SiO2添加至A1PI组合物中。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.2克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.25克的烟雾状二氧化硅。在其它特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少1克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少2克的烟雾状二氧化硅。在另一个特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少2.5克的烟雾状二氧化硅。在其它特定实施方案中，添加浓度为每克总蛋白质至少0.01克或每克总蛋白质至少0.02克、0.03克、 0.04克、0.05克、0.06克、0.07克、0.08克、0.09克、0.1克、0.2克、 0.3克、0.4克、0.5克、0.6克、0.7克、0.8克、0.9克、1.0克、1.5 克、2.0克、2.5克、3.0克、3.5克、4.0克、4.5克、5.0克、5.5克、 6.0克、6.5克、7.0克、7.5克、8.0克、8.5克、9.0克、9.5克、10.0 克或10.0克以上的微细分的二氧化硅。
在某些实施方案中，将在二氧化硅处理之后添加助滤剂(例如 Celpure C300(Celpure)或Hyflo-Supper-Cel(World Minerals))以有助于深度过滤。可以添加最终浓度为每千克沉淀物约0.01千克至每千克沉淀物约1.0千克，或每千克沉淀物约0.02千克至每千克沉淀物约0.8 千克、或每千克沉淀物约0.03千克至每千克沉淀物约0.7千克的助滤剂。在某些实施方案中，将添加最终浓度为每千克沉淀物至少0.01 千克或每千克沉淀物至少0.02千克、0.03千克、0.04千克、0.05千克、 0.06千克、0.07千克、0.08千克、0.09千克、0.1千克、0.2千克、0.3 千克、0.4千克、0.5千克、0.6千克、0.7千克、0.8千克、0.9千克或 1.0千克的助滤剂。在某些实施方案中，将添加最终浓度为每千克沉淀物约0.01千克或每千克沉淀物约0.02千克、0.03千克、0.04千克、 0.05千克、0.06千克、0.07千克、0.08千克、0.09千克、0.1千克、 0.2千克、0.3千克、0.4千克、0.5千克、0.6千克、0.7千克、0.8千克、 0.9千克或1.0千克的助滤剂。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的 A1PI组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括在介于约4.0与约7.0之间的pH下使组合物与SiO2接触以结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.0与约6.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.0与约6.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约 4.0与约5.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.0与约5.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约7.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约6.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约6.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约5.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.5与约5.0之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约7.0之间的pH 下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约6.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约6.0之间的pH下使组合物与 SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约5.5 之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.6与约5.6之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.7与约5.5之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约 4.8与约5.4之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约4.9与约5.3之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约5.2之间的pH下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在约5.1的pH下使组合物与SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在约4.0或约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、 6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或不大于7.0的pH下使组合物与 SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在不大于4.0或不大于 4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、 5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、 6.7、6.8、6.9或不大于7.0的pH下使组合物与SiO2接触。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的A1PI 组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约2.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与 SiO2接触以结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.9mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.8mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约 1.7mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.6mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.5mS/cm之间的离子强度下使组合物与 SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm 与约1.4mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.3mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.2mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm 与约1.1mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm与约0.9mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm 与约0.8mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.2mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.3mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.1mS/cm 与约0.4mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.5mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.6mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在介于约0.7mS/cm 与约0.9mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在另一个实施方案中，所述方法包括在约0.8mS/cm的离子强度下使组合物与 SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在约0.1mS/cm或不大于0.2mS/cm、0.3mS/cm、0.4mS/cm、0.5mS/cm、0.6mS/cm、0.7 mS/cm、0.8mS/cm、0.9mS/cm、1.0mS/cm、1.1mS/cm、1.2mS/cm、 1.3mS/cm、1.4mS/cm、1.5mS/cm、1.6mS/cm、1.7mS/cm、1.8mS/cm、1.9mS/cm、2.0mS/cm、2.1mS/cm、2.2mS/cm、2.3mS/cm、2.4mS/cm、 2.5mS/cm、2.6mS/cm、2.7mS/cm、2.8mS/cm、2.9mS/cm或3.0mS/cm 的离子强度下使组合物与SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在不大于0.1mS/cm或不大于0.2mS/cm、0.3mS/cm、0.4mS/cm、0.5mS/cm、0.6mS/cm、0.7mS/cm、0.8mS/cm、0.9mS/cm、1.0mS/cm、 1.1mS/cm、1.2mS/cm、1.3mS/cm、1.4mS/cm、1.5mS/cm、1.6mS/cm、 1.7mS/cm、1.8mS/cm、1.9mS/cm、2.0mS/cm、2.1mS/cm、2.2mS/cm、 2.3mS/cm、2.4mS/cm、2.5mS/cm、2.6mS/cm、2.7mS/cm、2.8mS/cm、2.9mS/cm或3.0mS/cm的离子强度下使组合物与SiO2接触。
在某些实施方案中，本发明提供一种用于降低源自血浆的A1PI 组合物中丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括在低pH和低离子强度下使组合物与SiO2接触以结合丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个特定实施方案中，所述方法包括在介于约 4.8与约5.4之间的pH下在介于约0.6mS/cm与约1.0mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在一个更特定的实施方案中，所述方法包括在介于约4.9与约5.3之间的pH下在介于约0.7mS/cm与约0.9mS/cm之间的离子强度下使组合物与SiO2接触。在一个更特定的实施方案中，所述方法包括在介于约5.0与约5.2之间的pH下在约 0.8mS/cm的离子强度下使组合物与SiO2接触。在其它实施方案中，所述方法包括在根据如表12、表13、表14以及表15中所呈现的变化形式1222至3041中的任一种变化形式的pH和离子强度下使组合物与SiO2接触。
1.丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的结合和洗脱
一方面，本发明提供一种用于降低包含A1PI的再悬浮血浆沉淀物中丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原的量的方法。总体上，沉淀物可为在汇集的血浆、优选地人类血浆分离期间沉淀的任何物质。在一个实施方案中，所述方法包括在结合丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原并且使A1PI保持在不可溶状态的第一低pH溶液条件下，使包含不可溶状态的A1PI的再悬浮血浆沉淀物与微细分的二氧化硅 (SiO2)接触；使悬浮液的可溶和不可溶部分分离；在适合于使实质部分的A1PI保持在不可溶状态的第二低pH溶液条件下，自SiO2洗脱丝胺酸和/或丝氨酸蛋白酶原；使悬浮液的可溶和不可溶部分分离；以及自不可溶部分萃取A1PI。在一个实施方案中，在沉淀反应之前或期间混合SiO2并且连同沉淀物一起回收。在一个特定实施方案中，沉淀物为科恩部分IV-1沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为科恩部分IV-4沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为科恩部分V沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为奇斯勒/尼赤曼沉淀物IV。在另一个实施方案中，沉淀物为奇斯勒/尼赤曼沉淀物C。
在上文所提供的方法的一个实施方案中，第一低pH溶液条件包括介于4.0与7.0之间的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0至7.0之间的pH和小于约5.0 mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.0之间的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在一个特定实施方案中，溶液条件包括5.5±0.2的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括6.0±0.2的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。
在上文所提供的方法的另一个实施方案中，第一低pH溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约4.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约 3.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约2.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约1.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的 pH和小于约0.5mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约4.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约 3.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5 与6.0之间的pH和小于约2.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约1.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的 pH和小于约0.5mS/cm的离子强度。在一个特定实施方案中，溶液条件包括5.5±0.2的pH和小于约3.0mS/cm的离子强度。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括6.0±0.2的pH和小于约3.0mS/cm的离子强度。在其它实施方案中，所述第一低pH溶液条件包括根据如表 12、表13、表14以及表15中所呈现的变化形式1222至3041中的任一种变化形式的pH和离子强度。
在上文所提供的方法的一个实施方案中，第二低pH溶液条件包括介于4.0与7.0之间的pH和大于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与7.0之间的pH和大于约5.0 mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和大于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.0之间的pH和大于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和大于约5.0mS/cm的离子强度。在一个特定实施方案中，溶液条件包括5.5±0.2的pH和大于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括6.0±0.2的pH和大于约5.0mS/cm的离子强度。
在上文所提供的方法的另一个实施方案中，第二低pH溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和大于约3.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和大于约 4.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和大于约6.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和大于约7.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的 pH和大于约10mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和大于约3.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和大于约 4.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5 与6.0之间的pH和大于约6.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和大于约7.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的 pH和大于约10mS/cm的离子强度。在一个特定实施方案中，溶液条件包括5.5±0.2的pH和大于约10mS/cm的离子强度。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括6.0±0.2的pH和大于约10mS/cm的离子强度。
在一个特定实施方案中，本发明提供一种用于降低包含A1PI的再悬浮血浆沉淀物中丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原的量的方法，所述方法包括以下步骤：在包含介于约5.0与约6.5之间的pH和小于5.0mS的离子强度，结合丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原并且使A1PI保持在不可溶状态的第一低pH溶液条件下，使包含不可溶状态的A1PI的再悬浮血浆沈淀物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；分离悬浮液的可溶和不可溶部分；在包含介于约5.0与约6.5之间的 pH和大于5.0mS的离子强度，使实质部分的A1PI保持在不可溶状态的第二低pH溶液条件下自SiO2洗脱丝胺酸及/或丝胺酸蛋白酶原；分离悬浮液的可溶和不可溶部分，以及自不可溶部分萃取A1PI。在一个实施方案中，在沉淀反应之前或期间混合SiO2并且连同沉淀物一起回收。在一个特定实施方案中，沉淀物为科恩部分IV-1沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为科恩部分IV-4沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为科恩部分V沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为奇斯勒/尼赤曼沉淀物IV。在另一个实施方案中，沉淀物为奇斯勒/尼赤曼沉淀物C。
2.丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的结合和A1PI的萃取
另一方面，本发明提供一种用于降低包含A1PI的再悬浮血浆沉淀物中丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原的量的方法。总体上，沉淀物可为在汇集的血浆、优选地人类血浆分离期间沉淀的任何物质。在一个实施方案中，所述方法包括在包含低pH，结合丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原并且使A1PI保持在不可溶状态的第一溶液条件下，使包含不可溶状态的A1PI的再悬浮血浆沉淀物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；使悬浮液的可溶和不可溶部分分离；在包含高pH 的第二溶液条件下自不可溶部分萃取A1PI；以及使可溶部分与不可溶部分分离，其中在自不可溶部分萃取A1PI期间实质部分的丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原仍保持结合至SiO2。在一个实施方案中，在沉淀反应之前或期间混合SiO2并且连同沉淀物一起回收。在一个特定实施方案中，沉淀物为科恩部分IV-1沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为科恩部分IV-4沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为科恩部分V沉淀物。在另一个实施方案中，沉淀物为奇斯勒/尼赤曼沉淀物IV。在另一个实施方案中，沉淀物为奇斯勒/尼赤曼沉淀物C。
在上文所提供的方法的一个实施方案中，第一溶液条件包括介于 4.0与7.0之间的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与7.0之间的pH和小于约5.0mS/cm 的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.0之间的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在一个特定实施方案中，溶液条件包括 5.5±0.2的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括6.0±0.2的pH和小于约5.0mS/cm的离子强度。
在上文所提供的方法的另一个实施方案中，第一溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约4.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约3.0mS/cm 的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约2.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约1.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.0与6.5之间的pH和小于约0.5mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约4.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约3.0mS/cm 的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约2.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约1.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于5.5与6.0之间的pH和小于约0.5mS/cm的离子强度。在一个特定实施方案中，溶液条件包括 5.5±0.2的pH和小于约3.0mS/cm的离子强度。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括6.0±0.2的pH和小于约3.0mS/cm的离子强度。在其它实施方案中，所述第一低pH溶液条件包括根据如表12、表 13、表14以及表15中所呈现的变化形式1222至3041中的任一种变化形式的pH和离子强度。
在上文所提供的方法的一个实施方案中，第二溶液条件包括介于 7.0与10.0之间的pH和小于约10.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与9.0之间的pH和小于约10.0 mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和小于约10.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.5之间的pH和小于约10.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约10.0mS/cm的离子强度。在一个特定实施方案中，溶液条件包括7.5±0.2的pH和小于约10.0mS/cm的离子强度。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括8.0±0.2的pH和小于约10.0mS/cm 的离子强度。
在上文所提供的方法的另一个实施方案中，第二溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和小于约9.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和小于约8.0mS/cm 的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和小于约7.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和小于约6.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和小于约5mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于 7.0与8.5之间的pH和小于约4.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和小于约3.0mS/cm 的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和小于约2mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.0与8.5之间的pH和介于2mS/cm与10mS/cm之间的离子强度。
在上文所提供的方法的另一个实施方案中，第二溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约9.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约8.0mS/cm 的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约7.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约6.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约5mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约4.0mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约3.0mS/cm 的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.0之间的pH和小于约2mS/cm的离子强度。在另一个实施方案中，溶液条件包括介于7.5与8.5之间的pH和介于2mS/cm与10mS/cm之间的离子强度。在一个特定实施方案中，溶液条件包括7.5±0.2的pH 和介于2mS/cm与10mS/cm之间的离子强度。在另一个特定实施方案中，溶液条件包括8.0±0.2的pH和介于2mS/cm与10mS/cm之间的离子强度。
IV.医药组合物
一方面，本发明提供丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原水平降低的源自血浆的蛋白质的组合物，其是根据任何本文所述的方法来制备。在某些实施方案中，这些组合物将被配制成用于医药施用(即，医药组合物)。总体上，根据本文所提供的方法制备的源自血浆的血液蛋白质组合物的酰胺水解活性将降低并且将提供与当前可获得的现有源自血浆的生物制剂相比更好的安全概况。在一个优选实施方案中，本文所提供的组合物的因子XI、因子XIa、因子XII和/或因子 XIIa的含量将降低。
在一个实施方案中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，所述组合物是通过包括以下步骤的方法来制备：(a)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和(b)分离SiO2与组合物以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个实施方案中，组合物被配制成用于医药施用。在一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内施用。在另一个特定实施方案中，组合物被配制成用于肌肉内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于皮下施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于眼内施用。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在某些实施方案中，上述组合物是通过进一步包括以下步骤的方法来制备：执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化组合物，然后使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一目标蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤 /透滤步骤以及色谱步骤。
在一个实施方案中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，所述组合物是通过包括以下步骤的方法来制备：(a)通过在源自汇集的血浆的起始材料中部分沉淀析出蛋白质而形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2) 接触；以及(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个实施方案中，使用醇实现部分沉淀。在一个实施方案中，组合物被配制成用于医药施用。在一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内施用。在另一个特定实施方案中，组合物被配制成用于肌肉内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于皮下施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于眼内施用。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，所述组合物是通过包括以下步骤的方法来制备：(a)通过超滤和/或透滤源自汇集的血浆的起始材料而形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个实施方案中，使用醇实现部分沉淀。在一个实施方案中，组合物被配制成用于医药施用。在一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内施用。在另一个特定实施方案中，组合物被配制成用于肌肉内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于皮下施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于眼内施用。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，所述组合物是通过包括以下步骤的方法来制备：(a)通过使源自汇集的血浆的起始材料与色谱树脂接触而形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在一个实施方案中，使用醇实现部分沉淀。在一个实施方案中，组合物被配制成用于医药施用。在一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内施用。在另一个特定实施方案中，组合物被配制成用于肌肉内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于皮下施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于眼内施用。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白 (Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在某些实施方案中，上述组合物通过进一步包括以下步骤的方法来制备：执行第二目标蛋白质浓化步骤以形成第二浓化组合物，然后使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。在某些实施方案中，第一目标蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/ 透滤步骤以及色谱步骤。
在一个实施方案中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，所述组合物是通过包括以下步骤的方法来制备：(a)执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)执行第二目标蛋白质浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；以及(d) 使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。在一个实施方案中，组合物被配制成用于医药施用。在一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内施用。在另一个特定实施方案中，组合物被配制成用于肌肉内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于皮下施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于眼内施用。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在某些实施方案中，上述组合物通过进一步包括以下步骤的方法来制备：在使组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触之后，执行目标蛋白质浓化步骤。在某些实施方案中，目标蛋白质浓化步骤选自蛋白质沉淀步骤(例如醇分离步骤)、超滤/透滤步骤以及色谱步骤。
在一个实施方案中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，所述组合物是通过包括以下步骤的方法来制备：(a)执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使第一浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(c)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(d)执行第二目标蛋白质浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表1中所见的变化形式1至变化形式100中的任一种变化形式。在一个实施方案中，组合物被配制成用于医药施用。在一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内施用。在另一个特定实施方案中，组合物被配制成用于肌肉内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于皮下施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于眼内施用。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
一方面，本发明提供一种丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原水平降低的源自血浆的蛋白质组合物，所述组合物是用于治疗与血液蛋白质缺乏或功能障碍相关的病状。在某些实施方案中，源自血浆的蛋白质选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供一种源自血浆的蛋白质组合物，其是通过包括以下步骤的方法来制备：(a)执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物；(b)执行第二目标蛋白质浓化步骤以形成第二浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物； (c)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的条件下使第二浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；(d)使SiO2与组合物分离以去除结合的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原；以及(e)执行第三目标蛋白质浓化步骤以形成第三浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物。在某些实施方案中，第一与第二浓化步骤的组合是选自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所见的变化形式101至变化形式1100中的任一种变化形式。在一个实施方案中，组合物被配制成用于医药施用。在一个特定实施方案中，组合物被配制成用于静脉内施用。在另一个特定实施方案中，组合物被配制成用于肌肉内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制成用于皮下施用。在另一个实施方案中，组合物经配制用于眼内施用。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白 (Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在上述组合物的某些实施方案中，色谱浓化步骤包括以下子步骤：(i)在适合于结合源自血浆的目标蛋白质的条件下使源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和(ii)自色谱树脂洗脱源自血浆的目标蛋白质。在一个特定实施方案中，在子步骤(i)中杂质不结合至色谱树脂。在另一个特定实施方案中，在子步骤(i)中杂质结合至色谱树脂，但在子步骤(ii)中不会自色谱树脂洗脱。
在上述组合物的其它某些实施方案中，色谱浓化步骤包括以下子步骤：(i)在适合于结合至少一种杂质的条件下使第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和(ii)使树脂与源自血浆的蛋白质组合物分离，其中在子步骤(i)中源自血浆的目标蛋白质不结合至色谱树脂。
在本文提供的组合物的某些实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少10％。在另一个实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少25％。在另一个实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少50％。在另一个实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少75％。在另一个实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少90％。在其它实施方案中，特定丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的量被降低至少5％或至少10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的降低是指在单个 SiO2处理步骤内所达成的降低。在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶原的降低是指与除SiO2处理步骤外的类似方式制备的组合物相比的最终组合物中污染物的水平。
在一个实施方案中，本文所提供的医药组合物是通过配制使用本文所提供的方法分离的源自血浆的蛋白质组合物来制备。总体上，配制的组合物将经受至少一个、优选至少两个、最优选至少三个病毒灭活或去除步骤。本文提供的方法可采用的病毒灭活或去除步骤的非限制性实例包括溶剂清洁剂处理(Horowitz等,Blood Coagul Fibrinolysis 1994(5增刊3):S21-S28和Kreil等，Transfusion 2003(43):1023-1028，两个文献皆明确地以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)、纳滤(Hamamoto等,Vox Sang 1989(56)230-236和Yuasa等，J Gen Virol.1991(72(第8部分)):2021-2024，两个文献皆明确地以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的)以及高温下的低pH培育 (Kempf等,Transfusion1991(31)423-427和Louie等,Biologicals 1994 (22):13-19)。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在一个实施方案中，本文所提供的医药组合物将包含适用于静脉内、皮下、肌肉内和/或眼内施用的一或多种缓冲剂或pH稳定剂。适用于配制本文所提供的源自血浆的蛋白质组合物的缓冲剂的非限制性实例包括甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、谷氨酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、组氨酸或其它氨基酸、葡糖酸盐、苹果酸盐、丁二酸盐、甲酸盐、丙酸盐、碳酸盐或调节至适当pH的其任何组合。总体上，缓冲剂足以使制剂中的适合pH保持较长时间。在一个优选实施方案中，缓冲剂为甘氨酸。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
在一些实施方案中，本文提供的医药组合物可任选地进一步包含用于调节组合物的渗透性的试剂。渗透压试剂的非限制性实例包括甘露糖醇、山梨糖醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、左旋糖、果糖乳糖、聚乙二醇、磷酸盐、氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖庚酸钙(calcium gluconoglucoheptonate)、二甲基砜以及类似物。
本文提供的制剂典型地将具有可与生理渗透压相比的渗透压，为约285至295mOsmol/kg(Lacy等,Drug Information Handbook-Lexi-Comp 1999:1254)。在某些实施方案中，制剂的渗透压介于约200mOsmol/kg与约350mOsmol/kg之间、优选地介于约240mOsmol/kg与约300mOsmol/kg之间。在特定实施方案中，制剂的渗透压为约200mOsmol/kg或210mOsmol/kg、220mOsmol/kg、230 mOsmol/kg、240mOsmol/kg、245mOsmol/kg、250mOsmol/kg、255 mOsmol/kg、260mOsmol/kg、265mOsmol/kg、270mOsmol/kg、275 mOsmol/kg、280mOsmol/kg、285mOsmol/kg、290mOsmol/kg、295 mOsmol/kg、300mOsmol/kg、310mOsmol/kg、320mOsmol/kg、330 mOsmol/kg、340mOsmol/kg、340mOsmol/kg或350mOsmol/kg。
本文提供的源自血浆的制剂一般以液体形式稳定较长时间。在某些实施方案中，制剂在室温下稳定至少约3个月，或在室温下稳定至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23或24个月。制剂在冷藏条件(典型地在约2℃与约8℃之间)下一般也将稳定6个月或至少约18个月，或在冷藏条件下稳定至少约21、24、27、30、33、36、39、42或45个月。
V.治疗方法
一方面，本发明提供通过施用治疗有效剂量的根据本文所提供的方法制备的丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原水平降低的源自血浆的蛋白质组合物，来治疗有需要的受试者的与血液蛋白质缺乏或功能障碍相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，组合物包含选自以下的源自血浆的蛋白质：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白质。
一方面，本发明提供丝氨酸蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶原水平降低的源自血浆的蛋白质组合物的用途，其是用于制造用以治疗与血液蛋白质缺乏或功能障碍相关的病状的药剂。在某些实施方案中，源自血浆的蛋白质选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间α胰蛋白酶抑制剂 (IαI)蛋白质。
A.免疫球蛋白
如现代医学中通常所实践，将浓缩免疫球蛋白(尤其IgG)的灭菌制剂用于治疗属于以下这三个主要种类的医学病状：免疫缺乏症、发炎性和自体免疫疾病以及急性感染。这些IgG制剂还可能适用于治疗多发性硬化症(尤其是复发缓解型多发性硬化症或RRMS)、阿兹海默氏病以及帕金森氏病(Parkinson's disease)。本发明的纯化IgG制剂适合于这些目的，连同IgG制剂的其它临床上认可的用途。
FDA已批准使用IVIG来治疗各种适应症，包括同种异体骨髓移植、慢性淋巴球性白血病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、小儿HIV、原发性免疫缺乏症、川崎氏病(Kawasakidisease)、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)以及高抗体接受者或ABO不相容供体的肾脏移植。在某些实施方案中，本文提供的IVIG组合物适用于治疗或处理这些疾病和病状。
此外，患者通常标示外使用IVIG以治疗或处理各种适应症，例如慢性疲劳综合症、难辨梭菌结肠炎(clostridium difficile colitis)、皮肌炎以及多发性肌炎、格雷氏眼病(Graves'ophthalmopathy)、格林-巴利综合症(Guillain-Barrésyndrome)、肌肉萎缩症、包涵体肌炎、兰伯特-伊顿综合症(Lambert-Eaton syndrome)、红斑性狼疮、多灶性运动神经病、多发性硬化症(MS)、重症肌无力、新生儿同种免疫性血小板减少症、细小病毒B19感染、天疱疮、输血后紫癜、肾脏移植排斥反应、自发性流产(spontaneous Abortion/Miscarriage)、僵人综合症、斜视性眼阵挛、垂危成年人中的严重败血症和败血性休克、中毒性表皮坏死溶解、慢性淋巴球性白血病、多发性骨髓瘤、X连锁γ球蛋白缺乏血症以及低γ球蛋白血症。在某些实施方案中，本文提供的IVIG 组合物适用于治疗或处理这些疾病和病状。
最终，已提出IVIG用于治疗或处理包括原发性免疫缺乏症、 RRMS、阿兹海默氏病以及帕金森氏病的疾病的实验性用途(美国专利申请公开号U.S.2009/0148463，所述公开是以引用的方式全文并入本文中以便达成所有目的)。在某些实施方案中，本文提供的IVIG组合物适用于治疗或处理原发性免疫缺乏症、RRMS、阿兹海默氏病或帕金森氏病。在包含每天施用的某些实施方案中，施用给受试者的有效量可以由医师考虑年龄、体重、疾病严重程度、施用途径(例如静脉内施用对比皮下施用)以及对疗法的反应的个体差异来判定。在某些实施方案中，每天可将约5mg/kg至约2000mg/kg的本发明的免疫球蛋白制剂施用给受试者。在其它实施方案中，可以施用量为至少约 10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg、至少30mg/kg 或至少50mg/kg的免疫球蛋白制剂。在其它实施方案中，每天可以向受试者施用剂量高达约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约300mg/kg、约400mg/kg的免疫球蛋白制剂。在其它实施方案中，免疫球蛋白制剂的剂量可以更大或更小。此外，每天可以施用一个或多个剂量的免疫球蛋白制剂。熟悉IgG制剂所治疗的疾病的临床医师可以根据本领域中已知的标准确定用于患者的适当剂量。
根据本发明，完成疗程所需的时间可以由医师确定并且可以在短至一天至一个月以上的范围内。在某些实施方案中，疗程可以为1至 6个月。
通过静脉内方式向受试者施用有效量的IVIG制剂。术语“有效量”是指使受试者的疾病或病状改善或矫正的IVIG制剂的量。施用给受试者的有效量可以由医师考虑年龄、体重、所治疗的疾病或病状、疾病严重程度以及对疗法的反应的个体差异来确定。在某些实施方案中，每次施用可将剂量为约5mg/kg至约2000mg/kg的IVIG制剂施用给受试者。在某些实施方案中，剂量可以为至少约5mg/kg、或至少约10mg/kg、或至少约20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、 60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、 150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、 400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、 700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、 1000mg/kg、1100mg/kg、1200mg/kg、1300mg/kg、1400mg/kg、1500 mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、1800mg/kg、1900mg/kg或至少约 2000mg/kg。
IVIG治疗的剂量和频率将尤其取决于以下因素：所治疗的疾病或病状和患者中疾病或病状的严重程度。总体上，对于原发性免疫功能障碍，约每3至4周将施用介于每千克体重约100毫克至约400毫克之间的剂量。对于神经学和自体免疫疾病，1个月1次经5天过程实施每千克体重高达2克，持续3至6个月。此举一般补充有维持疗法，所述维持疗法包括约每3至4周一次施与每千克体重约100毫克至约400毫克。总体上，患者约每14至35天或约每21至28天将接受剂量或治疗一次。治疗频率将尤其取决于以下因素：所治疗的疾病或病状和患者中疾病或病状的严重程度。
在一个优选实施方案中，提供一种治疗有需要的人的免疫缺乏症、自体免疫疾病或急性感染的方法，所述方法包括施用本发明的医药IVIG组合物。在相关实施方案中，本发明提供根据本文所提供的方法制造的IVIG组合物，所述IVIG组合物是用于治疗有需要的人的免疫缺乏症、自体免疫疾病或急性感染。
在某些实施方案中，免疫缺乏症，自体免疫疾病或急性感染选自同种异体骨髓移植、慢性淋巴球性白血病、特发性血小板减少性紫癜 (ITP)、小儿HIV、原发性免疫缺乏症、川崎氏病、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)、高抗体接受者或ABO不相容供体的肾脏移植、慢性疲劳综合症、难辨梭菌结肠炎、皮肤肌炎和多发性肌炎、格雷氏眼病、格林-巴利综合症、肌肉萎缩症、包涵体肌炎、兰伯特-伊顿综合症、红斑性狼疮、多灶性运动神经病、多发性硬化症(MS)、重症肌无力、新生儿同种免疫性血小板减少症、细小病毒B19感染、天疱疮、输血后紫癜、肾脏移植排斥反应、自发性流产、僵人综合症、斜视性眼阵挛、垂危成年人中的严重败血症和败血性休克、中毒性表皮坏死溶解、慢性淋巴球性白血病、多发性骨髓瘤、X连锁γ球蛋白缺乏血症、低γ球蛋白血症、原发性免疫缺乏症，RRMS、阿兹海默氏病以及帕金森氏病症。
B.因子H
一方面，本发明提供通过施用治疗有效剂量的根据本文所提供的方法制备的因子H组合物，来治疗有需要的受试者的与因子H功能障碍或异常替代途径补体活性相关的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，因子H组合物通过自部分I沉淀物萃取因子H来制备。在另一个实施方案中，因子H组合物通过自部分II+III滤饼萃取因子H来制备。
在某些实施方案中，与因子H功能障碍相关的疾病或病症选自非典型溶血性尿毒症综合症(aHUS)、年龄相关的黄斑退化(AMD)、II 型膜增生性肾小球肾炎(MPGNII)、心肌梗塞、冠心病/冠状动脉病 (CAD/CHD)以及阿兹海默氏病。在一个特定实施方案中，疾病为非典型溶血性尿毒症综合症(aHUS)。在另一个特定实施方案中，疾病为年龄相关的黄斑退化(AMD)。在另一个特定实施方案中，疾病为II 型膜增生性肾小球肾炎(MPGNII)。
在某些实施方案中，提供一种通过向受试者施用治疗有效剂量的本文提供的因子H组合物，来治疗有需要的受试者的与异常替代途径补体活性相关的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，因子H 组合物是通过自部分I沉淀物萃取因子H来制备。在另一个实施方案中，因子H组合物是通过自部分II+III滤饼萃取因子H来制备。
在某些实施方案中，与异常替代途径补体活性相关的疾病或病症选自自体免疫疾病(如类风湿性关节炎、IgA肾病、哮喘、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、抗磷脂综合症、ANCA相关血管炎、天疱疮、葡萄膜炎、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎)、肾病(如IgA肾病、溶血性尿毒综合症、膜增生性肾小球肾炎)哮喘、阿兹海默氏病、成年黄斑退化、阵发性夜间血尿症、腹主动脉瘤、缺血性再灌注损伤以及败血症。
本发明所提供的医药组合物可单独或结合其它治疗剂施用。可以并入这些药剂作为同一药物的一部分。
1.施用
根据本发明，完成疗程所需的时间可以由医师确定且可以在短至一天至一个月以上的范围内。在某些实施方案中，疗程可为1至6个月。
通过任何合适方式向受试者施用有效量的因子H制剂以治疗疾病或病症。例如，在某些实施方案中，可以通过静脉内、眼内、皮下和/或肌肉内方式施用因子H。在一个优选实施方案中，提供一种用于治疗有需要的受试者的年龄相关的黄斑退化的方法，该方法包括向患者眼内施用因子H组合物。
在某些实施方案中，本文提供的因子H组合物可以全身性或局部施用。全身性施用包括：口服、经皮、皮下(subdermal)、腹膜内、皮下(subcutaneous)、经鼻、舌下或直肠施用。最优选的全身性施用途径为口服。用于眼部施用的局部施用包括：表面、玻璃体内、眼周、经巩膜、眼球后、近强膜、结膜下或经由眼内装置施用。优选的局部递送方法包括通过后近强膜施用经巩膜递送至黄斑；经由玻璃体内注射；或经由套管，如美国专利号6,413,245中所述的方法，所述专利的公开内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的。或者，抑制剂可以经由玻璃体内或经巩膜植入的持续递送装置，或通过其它已知的局部眼部递送方式来递送。
在某些实施方案中，术语“有效量”是指使受试者的疾病或病状改善或矫正的因子H制剂的量。施用给受试者的有效量可以由医师考虑年龄、体重、所治疗的疾病或病状、疾病严重程度以及对疗法的反应的个体差异来确定。在某些实施方案中，每次施用可以将剂量在或约在5mg/kg与2000mg/kg之间的因子H制剂施用给受试者。在某些实施方案中，剂量可为至少或约5mg/kg、或至少或约10mg/kg、或至少或约20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、 70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、 175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、 450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、 750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg、1100mg/kg、1200mg/kg、1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600 mg/kg、1700mg/kg、1800mg/kg,、1900mg/kg或2000mg/kg。因子 H治疗的剂量和频率将尤其取决于以下因素：所治疗的疾病或病状和患者中疾病或病状的严重程度。
2.年龄相关的黄斑退化(AMD)
在一个优选实施方案中，本发明提供一种通过向受试者施用治疗有效剂量的本文提供的因子H组合物来治疗有需要的受试者的年龄相关的黄斑退化的方法。
年龄相关的黄斑退化(AMD)为使60岁以上的老年人群失明的头号原因。现今，据估计75岁以上的人中有35％至40％患有一定程度的AMD。估计全世界约5千万人受影响，仅美国就有1千万。目前，每年新确诊的AMD约有155,000例。随着全世界人群继续老龄化，截至2020年，年确诊数目预期为三倍。所述疾病为一种破坏性疾病，它破坏受影响个体的中央视觉，剥夺他们执行日常生活所需的活动 (如阅读和驾驶)的能力。
AMD为缓慢进行性疾病，它涉及外视网膜层的细胞(包括感光体和支撑感光体的视网膜色素上皮(RPE)细胞)连同称为脉络膜的邻近眼睛血管层的细胞。黄斑退化的特征为破环黄斑，即造成高锐度视力的中央视网膜的一小部分(直径为约2mm)。一般将迟发性黄斑退化 (即AMD)定义为“干性”或“湿性”的。AMD的湿性(“渗出性”)新生血管形成影响约10％患有所述疾病的患者，并且其特征为经由RPE由脉络膜膜毛细血管层生长的异常血管，典型地会引起出血、渗出、结疤和/或血清视网膜脱离。约90％的患有AMD的患者具有非新生血管性，或干式的疾病，其特征为RPE萎缩和黄斑部感光体损失。
AMD的特征为存在称为“脉络膜小疣”的碎片样物质的沈积物，它会积聚于布鲁赫膜(Bruch's membrane)上，布鲁赫膜为一种使 RPE(视网膜的最外层)与底层脉络膜分离的细胞外基质组分的多层复合物。脉络膜小疣可以通过眼底镜眼睛检查观测到。在患有AMD的患者的供体眼睛的显微镜研究中已经广泛表征这些沈积物。根据包括沈积物的相对大小、丰度以及形状的数种标准，将临床检查时在活眼睛中观测到的沈积物分类为软脉络膜小疣或硬脉络膜小疣。组织化学和免疫细胞化学研究显示出脉络膜小疣含有多种脂质、多醣、葡糖胺聚糖以及蛋白质。
目前，已知尚无法治愈AMD，但已显示数种类型的治疗对处理所述疾病有效。湿式疾病中异常血管的雷射光凝固(Laser photocoagulation)为标准治疗。这种治疗受到以下事实限制：仅已充分界定的新生血管性病变可以以此方式来治疗并且50％的患者将经历血管渗漏的复发情况(Fine等,2000)。由于这种治疗需要雷射能量，故治疗区域中的感光体也将死亡并且患者通常还将在治疗之后立即经历中央失明。最终将发展新的新生血管性病变，从而需要重复治疗。其它干预包括通过戒烟来改变生活方式和开始用抗氧化剂治疗。还已经提出使用VEGF抑制剂来进行抗血管生成治疗，例如玻璃体内注射兰尼单抗(ranibizumab)或贝伐单抗(bevacizumab)。
近来已发现，约35％的个体在他们的因子H基因的一个或两个复本中携带有单核苷酸多形现象(SNP)风险。纯合个体发展年龄相关的黄斑退化的可能性增加约七倍，而杂合体发展所述疾病的可能性增加两至三倍。位于因子H的CCP模块7中的这种SNP已显示出会影响因子H与C反应蛋白和肝素之间的相互作用，从而指示SNP与疾病的间的因果关系。所述多形现象为Y420H多形现象。
在限制补体活化从而使受试者发展年龄相关的黄斑退化(AMD) 的进行或发作延迟的方法的一个实施方案中，受试者不具有任何 AMD症状。
在限制补体活化从而使受试者发展年龄相关的黄斑退化(AMD) 的进行或发作延迟的方法的另一个实施方案中，受试者具有脉络膜小疣。
在限制补体活化从而使受试者发展年龄相关的黄斑退化(AMD) 的进行或发作延迟的方法的另一个实施方案中，受试者发展AMD的风险增加。
在限制补体活化从而使受试者发展年龄相关的黄斑退化(AMD) 的进行或发作延迟的方法的另一个实施方案中，施用为静脉内施用。
在限制补体活化从而使受试者发展年龄相关的黄斑退化(AMD) 的进行或发作延迟的方法的另一个实施方案中，所述方法进一步包括治疗有AMD的病征和/或症状的受试者。
在限制补体活化从而使受试者发展年龄相关的黄斑退化(AMD) 的进行或发作延迟的方法的另一个实施方案中，受试者已经被诊断患有AMD。
另一方面，本发明提供一种治疗断定有发展年龄相关的黄斑退化的风险的人类受试者的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用预防或治疗有效量的本文提供的因子H制剂并且周期性地重复所述施用。
在治疗断定有发展年龄相关的黄斑退化的风险的人类受试者的方法的一个实施方案中，重复所述施用一段时间以有效延迟所述受试者发展黄斑退化的进行或发作。
在治疗断定有发展年龄相关的黄斑退化的风险的人类受试者的方法的另一个实施方案中，如基于存在一种或多种与发展年龄相关的黄斑退化相关的遗传标记物所鉴定，断定人类受试者有发展年龄相关的黄斑退化的风险。
在治疗断定有发展年龄相关的黄斑退化的风险的人类受试者的方法的另一个实施方案中，遗传标记物为多形现象。
在限制补体活化从而使受试者发展年龄相关的黄斑退化(AMD) 的进行或发作延迟的方法的另一个实施方案中，受试者未被诊断患有 AMD。
C.间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)
在其它方面中，本发明的一个目标是提供通过施用治疗有效量的本文提供的IaIp组合物，来治疗与IaIp功能降低或IaIp功能障碍相关的病症和疾病的方法。在一个实施方案中，与IaIp功能降低或IaIp 功能障碍相关的疾病或病症为败血症。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有效剂量的通过本文所公开的方法制备的IaIp组合物，它是用于治疗有需要的受试者的与 IaIp功能降低或IaIp功能障碍相关的疾病或病症的方法中。在一个实施方案中，与IaIp功能降低或IaIp功能障碍相关的疾病或病症为败血症。
另一方面，本发明的一个目标是提供通过施用治疗有效量的本文提供的IaIp组合物来治疗与血浆丝氨酸蛋白酶活性增加相关的疾病和病症的方法。在一个实施方案中，与血浆丝氨酸蛋白酶活性增加相关的疾病或病症选自败血症、败血性休克、内毒素性休克、弥漫性血管内凝血、纤维增生症、炭疽中毒、癌转移、手术期间的组织损伤、肾病、血管病、凝血、糖尿病以及全身性炎症。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有效剂量的通过本文所公开的方法制备的IaIp组合物，它是用于治疗有需要的受试者的与血浆丝氨酸蛋白酶活性增加相关的疾病或病症的方法中。在一个实施方案中，与血浆丝氨酸蛋白酶活性增加相关的疾病或病症选自败血症、败血性休克、内毒素性休克、弥漫性血管内凝血、纤维增生症、炭疽中毒、癌转移、手术期间的组织损伤、肾病、血管病、凝血、糖尿病以及全身性炎症。
A.施用
根据本发明，完成疗程所需的时间可以由医师确定并且可以在短至一天至一个月以上的范围内。在某些实施方案中，疗程可以为1至 6个月。
通过任何合适方式向受试者施用有效量的IaIp制剂以治疗疾病或病症。例如，在某些实施方案中，可以通过静脉内、皮下和/或肌肉内方式施用IaIp。在一个优选实施方案中，提供治疗有需要的受试者的败血症的方法，所述方法包括向患者静脉内(IV)施用IaIp组合物。
在某些实施方案中，本文提供的IaIp组合物可以全身性或局部施用。全身性施用包括：口服、皮下(subdermal)、腹膜内、皮下 (subcutaneous)、经鼻、舌下或直肠施用途径。局部施用包括：表面、皮下、肌肉内以及腹膜内施用途径。
在某些实施方案中，术语“有效量”是指使受试者的疾病或病状改善或矫正的IaIp制剂的量。施用给受试者的有效量可由医师考虑年龄、体重、所治疗的疾病或病状、疾病严重程度以及对疗法的反应的个体差异来确定。在某些实施方案中，每次施用可以将剂量为约5 mg/kg至约2000mg/kg的IaIp制剂施用给受试者。在某些实施方案中，剂量可以为至少约5mg/kg、或至少约10mg/kg、或至少约20mg/kg、 30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90 mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、 250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、 550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、 850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg、1100mg/kg、1200 mg/kg、1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、 1800mg/kg、1900mg/kg或至少约2000mg/kg。IaIp治疗的剂量和频率将尤其取决于以下因素：所治疗的疾病或病状和患者的疾病或病状的严重程度。
实施例
实施例1
为测定源自血浆的蛋白质组合物中存在的残余丝氨酸蛋白酶含量和活性，测定以下各物的酰胺水解活性概况：两种在不使用SiO2处理情况下制造的市售IgG制剂：(5％静脉内免疫球蛋白；Octapharma)和Subcuvia(16％皮下免疫球蛋白；Baxter)；两批在使用SiO2处理下制造的市售IgG制剂：Gammagard液体(10％静脉内免疫球蛋白；Baxter)和目前正开发的因子H纯化方法。值得注意的是，如上所述通过结合和随后自微细分的SiO2洗脱因子H来纯化因子H组合物。
简单地说，源自血浆的蛋白质组合物各自的酰胺水解活性概况是通过用具有不同酶特异性的以下发色底物进行测定来测定：PL-1(广谱)、S-2288(广谱)、S-2266(FXIa、腺激肽释放酶)、S-2222(FXa、胰蛋白酶)、S-2251(纤维蛋白溶酶)以及S-2302(激肽释放酶、FXIa以及FXIIa)。还测定了前激肽释放酶活化剂活性(PKKA)和因子XIa单元的量。如表17中所示，在不使用SiO2吸附步骤情况下制造的源自血浆的IgG组合物含有显著水平的酰胺水解活性和FXIa含量。相比之下，两批所测试的Gammagard液体含有最小的酰胺水解活性和FXIa含量。与这些结果一致的是，通过结合和自微细分的SiO2洗脱制备的因子H组合物含有极高水平的酰胺水解活性和FXIa含量。
表17.各种源自血浆的蛋白质组合物的酰胺水解活性
实施例2
为了确定经济上有益的用于自血浆样品制造因子H并且允许自同一血浆样品回收其它血液因子的方案，根据图1所示的流程图中所概括的方案使一批汇集的人类血浆经受分离。如图2中所示，冷人类血浆上清液科恩池中存在的大部分因子H(约90％)可在部分II+III沉淀物中找到。在部分I沉淀物中还可以发现较小但仍显著的量的因子 H(约10％)。这与PCT公开号WO 2011/011753中所示的结果一致，所述公开的内容是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的。
通过使因子H萃取缓冲液再循环通过压滤器，自由于过滤直接位于组合物6上游的“Aerosil处理”组合物(“部分II+III滤液”)所形成的微细分的SiO2滤饼副产物萃取因子H。然后，通过在pH 8.0下经由添加乙醇至最终浓度为15％且在-6℃下至少培育4小时所执行的第一沉淀步骤自滤饼萃取物去除盐和各种杂质。在培育1小时之后将沉淀反应的pH再调整至8.0。然后，通过离心自上清液去除沉淀物。通过在pH 6.0下经由添加乙醇至最终浓度为25％且在-10℃下培育至少8小时所执行的第二沉淀步骤来进一步浓化因子H。然后，通过离心回收含有因子H的沉淀物。
将通过第二沉淀步骤形成的沉淀物以1:9的比率溶解于低离子强度的溶解缓冲液中并且进行S/D处理以使脂质包膜病毒灭活。随后通过阴离子交换色谱法使用DEAE-琼脂糖FF树脂来浓化因子H。简单地说，在低离子强度条件下使因子H结合至DEAE-琼脂糖树脂并且通过增加溶液的离子强度来洗脱。然后，降低DEAE-琼脂糖洗脱液的电导率并且通过肝素亲和色谱法进一步浓化因子H。简单地说，在低离子强度条件下使因子H结合至肝素-琼脂糖FF树脂并且通过增加溶液的离子强度来洗脱。如表18中所示，大部分因子H结合至DEAE 和肝素树脂。
表18.因子H与色谱树脂的结合
然后，根据标准程序使自肝素树脂洗脱的因子H经受超滤/透滤，之后是在Superdex 200管柱上进行尺寸排阻色谱法。然后，通过超滤浓缩自尺寸排阻色谱法回收因子H，无菌过滤且用PBS缓冲液配制成最终蛋白质浓度为50mg/mL。
然后，表征最终因子H组合物(FH012)的均质性、杂质以及酰胺水解活性。因子H组合物的单分散性通过尺寸排阻色谱法来表征。如表19中所示，当装载于HP-SEC管柱上时，因子H最终组合物中存在的估计大小为400kDa的大部分蛋白质迁移。
表19.如通过HP-SEC所测定的最终FH012组合物的分子大小分布
然后，测定最终因子H组合物的内毒素水平、pH、目测外观以及最终蛋白质浓度。如表20中所示，如通过鲎变形细胞溶菌液(LAL) 测定所测定，组合物的内毒素含量低(<0.5EU/mL)。
表20.最终FH012组合物的LAL、pH、目测外观以及蛋白质含量
LAL <0.5EU/mL(无热原质)
pH 7.1
目测外观 无色并且不含可见颗粒
蛋白质浓度 4.54％
然后，测定最终因子H组合物中各种蛋白质杂质的水平。如表 21中所示，补体蛋白和IgG免疫球蛋白占因子H组合物中最终蛋白质浓度的1％以下。
表21.最终FH012组合物中的杂质
杂质 浓度 占总蛋白的百分比
IgG 51μg/mL 0.11％
C3 321.5μg/mL 0.71％
C3a 17.5μg/mL 0.04％
C5a 3.7ng/mL <0.01％
C4 1.94μg/mL <0.01％
EDTA 72μg/mL
最终，如实施例1中所报告测定酰胺水解活性水平和蛋白酶含量。如表17中所示，根据这一实施例中所述的方案纯化的源自血浆的因子H含有高水平的酰胺水解活性和FXIa含量。
实施例3
为了显示自源自血浆的蛋白质组合物去除酰胺水解活性的能力，用微细分的二氧化硅(SiO2)处理再悬浮的科恩部分II+III沉淀物。简单地说，根据本文所述的IgG纯化方案分离汇集的冷人类血浆上清液，以得到部分II+III沉淀物。在保持于介于0℃与8℃之间的温度下使部分II+III沉淀物再悬浮于低电导率萃取缓冲液(pH 5.1±0.2；约 0.8mS/cm)中。添加380(Evonik Industries AG)至最终浓度介于每千克II+III沉淀物40克与60克之间。在添加C300 助滤剂(Advanced Minerals Corporation)至最终浓度为每千克II+III沉淀物0.5千克之后，使用深度过滤器过滤悬浮液。然后，测试滤液中的免疫球蛋白组合物的FXI酶原含量。如表22中所示，用微细分的 SiO2处理部分II+III悬浮液使组合物的因子XI酶原含量几乎降低 90％。
表22.最终FH012组合物中的杂质。
实施例4
为了评估丝氨酸蛋白酶自如实施例3中所制备的微细分的SiO2滤饼的洗脱，在两种不同pH(6.0、7.5)下使用含有不同浓度的磷酸盐缓冲液(100、50、25以及5mM)的洗脱缓冲液自SiO2洗脱蛋白质。简单地说，用适当的缓冲系统以1:5的比率溶解滤饼并且经由深度过滤器(Cuno 50SA)过滤。然后，测定各洗脱液的酰胺水解活性和因子 H组合物(表23和表24)。如表23中所示，在较低电导率和pH(即6.0) 下，用底物CS2166(FXIa、活化蛋白质C)测量的酰胺水解活性的洗脱减少。
在pH 7.5的洗脱条件(表24)下，因子H洗脱随着电导率的增加而减少，而丝氨酸蛋白酶洗脱随着电导率的增加而增加。令人意外地，在极低电导率(5mM磷酸盐；0.882mS/cm)下，丝氨酸蛋白酶洗脱实质上增加，而因子H洗脱减少。在pH 7.5下关于洗脱所获得的数据被示出在图3中。
表23.因子H和丝氨酸蛋白酶活性在pH 6.0下自微细分的SiO2的洗脱
表24.因子H和丝氨酸蛋白酶活性在pH 7.5下自微细分的SiO2的洗脱
实施例5
为了证明有差别地洗脱共同结合至SiO2的丝氨酸蛋白酶和因子 H的能力，开发一种两步洗脱程序。简单地说，如前所述制备在SiO2处理之后所形成的部分II+III滤饼。然后，在包含介于0.882mS/cm 与11.88mS/cm之间的离子强度，pH 6.0的溶液条件下使滤饼经受第一洗脱。如实施例4中所证明，在低pH(pH 6.0)和低离子强度(小于 6.5mS/cm)下处理结合的SiO2会引起丝氨酸蛋白酶(例如FXIa)洗脱，而实质部分的因子H仍保持结合。在高pH(pH 7.5)和高离子强度下的后续处理会引起因子H自SiO2洗脱(表25)。此外，与实施例4中所提供的结果相一致的是，在高pH(7.5)下用SiO2初始处理会引起因子H洗脱(表26)。正如所示，在较低电导率和pH 6.0下初始洗脱可以用来部分降低滤饼的酰胺水解活性，并且然后可以在100mM磷酸盐浓度、150mM NaCl、pH 7.6下洗脱因子H。这一程序产生因子H 的产率为每升血浆0.31克并且酰胺水解活性降低(CS2166)的滤液，以进行进一步处理。
表25.丝氨酸蛋白酶和因子H在pH 6.0/7.6下自SiO2的两步有差别的洗脱
表26.丝氨酸蛋白酶和因子H在pH 7.5/7.6下自SiO2的两步有差别的洗脱
实施例6
为了确定自源自血浆的蛋白质组合物有效去除丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶原所需的微细分的SiO2的量，将部分II+III沉淀物(即 II+III滤饼)溶解，过滤，用SiO2处理，混合助滤剂并且经受第二次过滤。简单地说，首先将部分II+III滤饼溶解于含有150mM氯化钠的 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5；30mS/cm)中。然后，经由Cuno 50SA 过滤器过滤这个悬浮液并且收集滤液。使Aerosil 380与滤液混合，最终浓度为每克蛋白质1.0克或2.5克，并且然后培育至少50分钟。添加CELPURE助滤剂并且使用Cuno 50SA过滤器执行过滤。然后，如表27中所报告表征所得滤液的酰胺水解活性。结果明显显示与用最终浓度为每克蛋白质1.0克的Aerosil处理的样品相比，添加最终浓度为每克蛋白质2.5克的Aerosil会将组合物中激肽释放酶、FXIa以及FXIIa的酰胺水解活性降低90％以上。
表27.在用微细分的二氧化硅处理之后再悬浮部分II+III沉淀物中所存在的酰胺水解活性
实施例7
为了评估在源自血浆的蛋白质组合物的工业规模制造期间SiO2处理去除因子XI酶原的效率，表征6个工业规模制造批次的FXI酶原含量。表28和表29显示在相同制造位置所执行的三个纯化的各上游工艺步骤的平均FXI酶原含量。表28和表29中的数据证明制造规模的纯化的SiO2处理可以将组合物的FXI酶原含量降低至少90％。值得注意的是，制造位置1混合最终浓度为每千克II+III沉淀物50 克的Aerosil，而位置2使用最终浓度为每千克II+III沉淀物40克的 Aerosil。令人意外地是，在aerosil处理之后，所用的aerosil量的这种小差异引起滤液的因子XI酶原含量的显著差异(位置2的8.1％科恩起始池对位置1的2.8％科恩起始池)。
表28.在位置1处理的三个大规模制造批次的各部分中因子XI 酶原含量的平均值
表29.在位置2处理的三个大规模制造批次的各部分中因子XI 酶原含量的平均值
应了解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且，本领域技术人员可以想到根据所述实施例和实施方案的各种修改或变化并且所述修改或变化包括在本申请案的精神和权限以及随附申请专利范围的范围内。本文所引用的所有公开、专利以及专利申请是以全文引用的方式并入本文中以便达成所有目的。

Claims (13)

1.微细分的二氧化硅(SiO2)在从源自血浆的目标蛋白质组合物中除去丝氨酸蛋白酶中的应用，
所述应用是在一种降低源自血浆的目标蛋白质组合物中的丝氨酸蛋白酶的量的方法中的应用，所述方法包括以下步骤：
(a)执行第一目标蛋白质浓化步骤以形成第一浓化组合物；
(b)在适合于结合至少一种丝氨酸蛋白酶的条件下使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触；和
(c)使所述SiO2与所述组合物分离以去除所结合的丝氨酸蛋白酶；
其中所述至少一种丝氨酸蛋白酶为因子XIa(FXIa)；
其中所述第一目标蛋白质浓化步骤是蛋白质沉淀步骤；
其中所述蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤；和
其中所述源自血浆的目标蛋白质是免疫球蛋白(Ig)。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述方法进一步包括以下步骤：执行第二目标蛋白质浓化步骤，然后使所述浓化组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述第二目标蛋白质浓化步骤是：
(i)蛋白质沉淀步骤；
(ii)超滤/透滤步骤；或
(iii)色谱浓化步骤。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其中所述方法进一步包括以下步骤：在使所述组合物与微细分的二氧化硅(SiO2)接触之后，执行第三目标蛋白质浓化步骤。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述第三目标蛋白质浓化步骤是：
(i)蛋白质沉淀步骤；
(ii)超滤/透滤步骤；或
(iii)色谱浓化步骤。
7.根据权利要求6所述的应用，其中所述蛋白质沉淀步骤是醇分离步骤。
8.根据权利要求3或6所述的应用，其中所述色谱浓化步骤包括以下子步骤：
(i)在适合于结合所述源自血浆的目标蛋白质的条件下使所述源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和
(ii)自所述色谱树脂洗脱所述源自血浆的目标蛋白质。
9.根据权利要求3或6所述的应用，其中所述色谱浓化步骤包括以下子步骤：
(i)在适合于结合至少一种杂质的条件下使所述第一浓化的源自血浆的目标蛋白质组合物与色谱树脂接触；和
(ii)使所述树脂与所述源自血浆的蛋白质组合物分离，
其中在子步骤(i)中所述源自血浆的目标蛋白质不结合至所述色谱树脂。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其中所述色谱树脂选自由以下组成的组：阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、疏水性相互作用树脂、混合式树脂、羟磷灰石树脂、配位体亲和树脂、免疫亲和树脂以及尺寸排阻树脂。
11.根据权利要求3或6所述的应用，其中所述色谱浓化步骤包括使用尺寸排阻色谱法按大小和/或形状自所述目标蛋白质分离至少一种杂质。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的应用，其中所述源自血浆的目标蛋白质组合物为制造中间物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中所述组合物与SiO2在以下最终浓度下接触：
(i)每克蛋白质至少1克的SiO2；
(ii)每克蛋白质至少2克的SiO2；或
(iii)每克蛋白质至少2.5克的SiO2。
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Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI532498B (zh) 2008-03-17 2016-05-11 巴克斯特保健公司 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
WO2011034604A2 (en) * 2009-09-17 2011-03-24 Baxter Healthcare, S.A. Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, and methods of use thereof
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
AU2010202125B1 (en) * 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
US8772462B2 (en) 2010-05-26 2014-07-08 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
AU2011280907B2 (en) * 2010-07-23 2016-02-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Manufacture of inter -alpha - inhibitor proteins (IaIp) from plasma
AU2011364724B2 (en) * 2011-04-08 2016-11-17 Universidad De Costa Rica Method for producing injectable formulations of blood-derived protein materials, and materials obtained using said method
HUE038441T2 (hu) 2011-12-13 2018-10-29 Baxalta GmbH Autoantitestek mérése alacsony vezetõképességû körülmények között
TWI629283B (zh) * 2012-02-23 2018-07-11 巴克斯歐塔公司 來自血漿中的免疫球蛋白之ｉ-ｉｖ-１部分沉澱
RU2487725C1 (ru) * 2012-03-15 2013-07-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГУП "НПО "Микроген" Минздрава России) Способ получения концентрированного иммуноглобулинового препарата для подкожного введения
AU2013203043B2 (en) * 2013-03-15 2016-10-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods to produce a human plasma-derived igg preparation enriched in brain disease-related natural iggs
CN103197053B (zh) * 2013-03-15 2015-02-18 上海市血液中心 一种抗IgA抗体检测试剂盒
CN104072601A (zh) * 2014-07-03 2014-10-01 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fii沉淀的制备方法
CN104086642A (zh) * 2014-07-03 2014-10-08 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fi+iii上清的制备方法
CN104086646B (zh) * 2014-07-03 2018-10-09 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fv沉淀的制备方法
GB201413227D0 (en) * 2014-07-25 2014-09-10 Bioproducts Lab Ltd Process
US20170313767A1 (en) 2014-10-21 2017-11-02 The General Hospital Corporation Methods of diagnosis and treatment of tuberculosis and infection
CN204424090U (zh) 2014-11-28 2015-06-24 比亚迪股份有限公司 薄膜电容器
US10583179B2 (en) * 2015-04-02 2020-03-10 Kieu Hoang Method of manufacturing and purifying prothrombin complex concentrate from Fraction III for intravenous injection and a method of curing and preventing Hemophilia A with inhibitors or Hemophilia B in patients infected with HIV-1 and HIV-2
WO2016161423A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Kieu Hoang Process of cloning and further purification to make a recombinant intravenous immunoglobulin
US20160289300A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Kieu Hoang Method of manufacturing intravenous immunoglobulin from fraction iii
CN108495860A (zh) * 2015-09-29 2018-09-04 K·黄 一种从组分iii制备静脉注射免疫球蛋白的方法
US20170232079A1 (en) * 2015-10-06 2017-08-17 Kieu Hoang Method of manufacturing prothrombin complex concentrate from fraction iii and non-prothrombin complex concentrate from fraction iv
CN106800583A (zh) * 2015-11-26 2017-06-06 上海洲跃生物科技有限公司 一种速溶无析出的冻干人纤维蛋白原制备工艺
EP3275897A1 (en) 2016-07-27 2018-01-31 Biotest AG Process for preparing immunoglobulin compositions
US11510871B2 (en) 2016-09-16 2022-11-29 Leukocare Ag Method for producing low viscous and highly concentrated biopharmaceutical drug products in liquid formulation
WO2018050870A1 (en) * 2016-09-16 2018-03-22 Leukocare Ag A novel method for stabilization of a biopharmaceutical drug product during processing
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
JP7275044B2 (ja) * 2017-04-21 2023-05-17 ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト 慢性炎症性脱髄性多発神経炎の治療における使用のための免疫グロブリン製品
EP3728287B1 (en) * 2017-12-19 2024-04-10 CSL Behring Lengnau AG Protein purification and virus inactivation with alkyl glycosides
AU2019250882A1 (en) * 2018-04-12 2020-11-05 Amgen Inc. Methods for making stable protein compositions
CN108733099B (zh) * 2018-05-31 2020-08-11 上海药明生物技术有限公司 低pH孵育和中和的自动调节系统及方法
EP4041774A4 (en) * 2019-10-11 2023-03-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited HEPARIN INSENSITIVE ASSAY FOR FACTOR XLA
EP4054597A4 (en) * 2019-11-04 2024-02-21 Alkahest, Inc. BLOOD PLASMA FRACTIONS FOR USE IN MUSCLE REGENERATION
KR20230024885A (ko) * 2020-04-10 2023-02-21 플라즈마 테크놀로지스, 엘엘씨 간소화된 고효율 단백질 단리를 위한 조성물 및 방법 (compositions and methods for simplified high efficiency isolation of proteins)
CN111961130B (zh) * 2020-08-31 2021-09-10 华兰生物工程重庆有限公司 一种从血浆中提取并分离IgM和IgG的方法
JP2023545948A (ja) * 2020-10-01 2023-11-01 武田薬品工業株式会社 噴霧乾燥ヒト血漿を利用した血漿分画プロセス
JP2024501025A (ja) 2020-12-28 2024-01-10 プラズマ テクノロジーズ エルエルシー 免疫グロブリンｇのプロセススケールでの単離のためのシステム及び方法
CN112574296B (zh) * 2020-12-30 2023-05-19 中国医学科学院输血研究所 一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法
AU2022317368A1 (en) 2021-07-29 2024-02-22 Csl Behring Ag Method of purifying immunoglobulin g and uses thereof
JP2024537490A (ja) 2021-10-27 2024-10-10 プラズマ テクノロジーズ エルエルシー タンパク質を単離するための構成及び方法
KR20230121373A (ko) * 2022-02-11 2023-08-18 주식회사 녹십자 인자 xiii의 정제방법
WO2023170553A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Affinity chromatographic production of clinical human igg products
AU2023232562A1 (en) 2022-03-08 2024-09-05 Equashield Medical Ltd Fluid transfer station in a robotic pharmaceutical preparation system
WO2023215722A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of preparing cohn pool concentrate from blood plasma through ultrafiltration
WO2023247736A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Ageronix SA Alpha1-antitrypsin for use in the treatment of diseases or disorders of the nervous system such as chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
WO2024200757A1 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Csl Behring Ag Methods of identifying immunoglobulin associated with adverse reactions

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4357272A (en) * 1978-03-22 1982-11-02 The South African Inventions Development Corporation Recovering purified antibodies from egg yolk
US4378346A (en) * 1979-08-15 1983-03-29 Tankersley Donald L Intravenously injectable solution of plasma protein fraction free from bradykinin, kininogen and prekallikrein activators and processes for its production
EP0893450A1 (en) * 1997-06-20 1999-01-27 Bayer Corporation Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
US6093324A (en) * 1996-08-07 2000-07-25 Csl Limited Purification of immunoglobulins
DE10008619A1 (de) * 2000-02-24 2001-09-06 Immuno Vet As Lynge Mikroorganismenfreies IgG-Präparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung in der Tieraufzucht und in der Tiermast
WO2004103398A1 (en) * 2003-05-23 2004-12-02 Novo Nordisk Health Care Ag Protein stabilization in solution
WO2007085626A1 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 Octapharma Ag Purification and use of a factor for supporting wound healing
WO2008113589A1 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Csl Behring Gmbh Methods for industrial scale production of therapeutic complement factor h preparations from human plasma
CN101437853A (zh) * 2006-05-05 2009-05-20 白血球保健股份有限公司 用于固定生物物质的生物相容性三维基体
US20090203580A1 (en) * 2005-06-07 2009-08-13 Dinarello Charles A Compositions and methods of use for alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2390074A (en) * 1942-02-09 1945-12-04 Research Corp Protein product and process
SE348942B (zh) 1970-06-02 1972-09-18 Statens Bakteriologiska Labor
US4056614A (en) 1972-09-22 1977-11-01 Marc Bonneau Immunity depressant medicine
US3998946A (en) * 1975-04-23 1976-12-21 The Regents Of The University Of Minnesota Fibrinogen-free plasminogen-plasmin-free plasma and method of preparing and using same
DE2801123C2 (de) * 1977-01-26 1986-01-02 Armour Pharma GmbH & Co KG, 3440 Eschwege Verfahren zur Herstellung eines intravenös applizierbaren Serumeiweiß-Präparates
US4136094A (en) 1977-08-31 1979-01-23 The Regents Of The University Of Minnesota Preparation of intravenous human and animal gamma globulins and isolation of albumin
US4296027A (en) 1977-08-31 1981-10-20 The Regents Of The University Of Minnesota Pure intravenous human and animal gamma globulins
US4550019A (en) * 1978-03-22 1985-10-29 South Africa Inventions Development Corporation Manufacture and use of fowl egg antibodies
DE2901822A1 (de) * 1979-01-18 1980-07-31 Biotest Serum Institut Gmbh Verfahren zur herstellung einer fuer die intravenoese applikation geeigneten immunglobulinloesung, die igm in ankonzentrierter form enthaelt
DE2902158A1 (de) 1979-01-20 1980-07-31 Biotest Serum Institut Gmbh Verfahren zur herstellung von fibrinogen, einem die gerinnungsfaktoren ii, vii, ix und x enthaltenden prothrombinkomplex, antithrombin iii und einer loesung von lagerstabilen serumproteinen
US4228154A (en) 1979-02-26 1980-10-14 Armour Pharmaceutical Company Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography
US4499073A (en) * 1981-08-24 1985-02-12 Cutter Laboratories, Inc. Intravenously injectable immune serum globulin
JPS5855432A (ja) 1981-09-29 1983-04-01 Fujirebio Inc 静脈注射用免疫グロブリンの製法
US4439358A (en) 1982-06-17 1984-03-27 Miles Laboratories, Inc. Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor
US4624780A (en) 1982-06-28 1986-11-25 Alpha Therapeutic Corporation Fractionation of blood plasma
DE3247150A1 (de) 1982-12-21 1984-06-28 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Gerinnungsaktive plasmaproteinloesung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur behandlung von stoerungen des haemostasesystems
DK166763B1 (da) 1983-03-16 1993-07-12 Immuno Ag Immunoglobulin-g-holdig fraktion
US5061237A (en) 1985-07-02 1991-10-29 Cytomed Medizintechnik Gmbh Method of purifying whole blood
DE3523615A1 (de) 1985-07-02 1987-01-15 Cytomed Medizintechnik Medizinisches geraet, insbesondere kanuele, katheter oder implantat
JPH0742235B2 (ja) 1985-11-08 1995-05-10 三共株式会社 自己免疫性疾病の予防・治療剤
US5136094A (en) 1988-03-10 1992-08-04 Air Products And Chemicals, Inc. Process for the synthesis of secondary formamides
US5055447A (en) 1988-07-28 1991-10-08 Genentech, Inc. Method and compositions for the treatment and prevention of septic shock
JP2871709B2 (ja) 1988-11-21 1999-03-17 住友製薬株式会社 免疫グロブリンｇ結合活性を有する新規な蛋白質プロテインｈ、該蛋白質をコードする遺伝子及び該蛋白質の製造法
US5177194A (en) 1990-02-01 1993-01-05 Baxter International, Inc. Process for purifying immune serum globulins
EP0440509A3 (en) * 1990-02-02 1991-12-18 Common Services Agency Novel cell growth medium components and process for producing same
ATE122054T1 (de) * 1990-03-22 1995-05-15 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur herstellung eines intravenös verträglichen immunglobulin-g-präparates.
US5130451A (en) * 1991-03-28 1992-07-14 Amoco Corporation Process for preparing carboxyaryl phosphates
US5324425A (en) * 1992-08-26 1994-06-28 Ellison Billy L Method and apparatus for removing solids from aqueous wash solutions
FR2706466B1 (fr) 1993-06-14 1995-08-25 Aetsrn Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré.
FR2711371B1 (fr) 1993-10-18 1995-12-29 Aetsrn Procédé de préparation d'un concentré d'inter-alpha-trypsine inhibiteur à usage thérapeutique et concentré obtenu.
US5610285A (en) 1994-08-24 1997-03-11 Bayer Corporation Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions
DE4435485C1 (de) 1994-10-04 1996-03-21 Immuno Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor
AUPN858596A0 (en) * 1996-03-08 1996-04-04 Csl Limited Filtration of plasma precipitates using cellulose filter aid
US5783640A (en) * 1997-03-04 1998-07-21 The Goodyear Tire & Rubber Company Rubber compositions containing a disodium salt of 2, 2'-dithiosalicyclic acid
US6124437A (en) 1997-03-19 2000-09-26 Welfide Corporation Immunoglobulin preparation and preparation process thereof
GB9705810D0 (en) 1997-03-20 1997-05-07 Common Services Agency Intravenous immune globulin
AT407114B (de) 1997-06-10 2000-12-27 Immuno Ag Alpha 1-antitrypsin-präparation sowie verfahren zu deren herstellung
US6159471A (en) 1997-10-23 2000-12-12 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Room temperature storable immunoglobulin preparation for intravenous injection
US20020114802A1 (en) 1998-02-10 2002-08-22 Tjellstrom Bo Arthur Einar Oral immunoglobulin treatment for inflammatory bowel disease
AT406873B (de) 1998-02-25 2000-10-25 Immuno Ag Verfahren zur abreicherung von pathogenen aus proteinhaltigen lösungen
DE19932782A1 (de) * 1999-07-14 2001-01-18 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung von Plasma oder Serum, so erhaltene Präparate und deren Verwendung
US6413245B1 (en) 1999-10-21 2002-07-02 Alcon Universal Ltd. Sub-tenon drug delivery
DE10008519C1 (de) 2000-02-21 2001-07-12 Dica Technologies Ag Verfahren und Kommunikationseinrichtungen zum Aufbau von gesicherten E-Mail-Verkehr zwischen Mail-Domains des Internet
SE0001128D0 (sv) 2000-03-30 2000-03-30 Amersham Pharm Biotech Ab A method of producing IgG
US20020098182A1 (en) 2000-09-28 2002-07-25 Richard Weisbart Treatment of immune-mediated diseases by oral administration of plasma fractions enriched in immunoglobulin G
JP2004511492A (ja) 2000-10-13 2004-04-15 オクタファルマ　アクチェン　ゲゼルシャフト ビクニンを含む血漿画分、その調製方法、およびその使用
FR2824568B1 (fr) 2001-05-11 2004-04-09 Lab Francais Du Fractionnement Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique
WO2003028668A2 (en) 2001-10-04 2003-04-10 Protein Therapeutics, Inc. Gammaglobulin treatment of immune disorders
US6893639B2 (en) 2001-10-19 2005-05-17 Hemacare Corporation Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates
US7777006B2 (en) * 2002-12-31 2010-08-17 Csl Behring L.L.C. Method for purification of alpha-1-antitrypsin
WO2005012354A1 (en) 2003-07-31 2005-02-10 Zlb Behring Gmbh Method for extending the half-life of fviii
US20050054003A1 (en) 2003-09-10 2005-03-10 Stenland Christopher J. Prion clearance using particulate metal oxides
EP1691820A4 (en) 2003-11-08 2010-03-03 Prothera Biolog PREPARATION AND COMPOSITION OF INTER-ALPHA INHIBITOR PROTEINS FROM HUMAN PLASMA FOR THERAPEUTIC USE
MXPA06008435A (es) 2004-01-30 2007-05-23 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Proceso de manufactura de una inmunoglobulina libre de virus.
UA87836C2 (ru) 2004-02-27 2009-08-25 Октафарма Аг Способ получения очищенных, безопасных с вирусологической точки зрения препаратов антител
CN103920142A (zh) 2005-02-14 2014-07-16 爱荷华大学研究基金会 治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂
US7807435B2 (en) 2005-08-11 2010-10-05 Baxter International Inc. Method for the purification of alpha-1 proteinase inhibitor (a1PI)
AU2006299293B2 (en) 2005-09-19 2011-08-18 Csl Behring Gmbh Factor H for the treatment of chronic nephropathies and production thereof
FR2894145B1 (fr) 2005-12-07 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation de facteur h du complement a titre de medicament
US8476234B2 (en) 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
DE102007001521A1 (de) * 2007-01-10 2008-07-17 Matthias, Torsten, Dr. Verwendung von Cohn-Oncley-Fraktionen II und II/III zur Behandlung des systemischen Lupus erythematodes
DE202007004346U1 (de) 2007-03-21 2007-10-31 Rehau Ag + Co Rohranordnung
AU2008270951A1 (en) * 2007-04-20 2009-01-08 Regents Of The University Of Colorado Alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity
JP2010529155A (ja) 2007-06-13 2010-08-26 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー 出血性疾患の治療及び予防的処置における血管外投与のためのｖｗｆ安定化ｆｖｉｉｉ製剤及びｆｖｉｉｉなしのｖｗｆ製剤の使用
ES2477294T3 (es) 2007-08-13 2014-07-16 Baxter International Inc Modulación por IVIG de quimioquinas para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson
AU2008307144B2 (en) * 2007-10-02 2012-12-20 Csl Limited Therapeutic antibody purification method and method of use
EP3936116A1 (en) 2007-12-28 2022-01-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Rrecombinant vwf containing formulations
CN101249265B (zh) * 2008-04-11 2010-10-27 三九集团湛江开发区双林药业有限公司 静脉注射用人乙肝免疫球蛋白及其制备方法
DK2291654T3 (en) 2008-05-28 2018-06-14 Prothera Biologics Inc PREPARATION AND COMPOSITION OF BLOOD INTER-ALPHA INHIBITOR PROTEINS
CA2728012C (en) 2008-06-24 2017-10-31 Csl Behring Gmbh Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life
CN201169579Y (zh) * 2008-06-30 2008-12-24 山东泰邦生物制品有限公司 一种人血白蛋白分离用乙醇雾化扩散装置
PT2349314E (pt) 2008-10-21 2013-05-28 Baxter Int Formulações de vwf recombinante liofilizado
CA2742994A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Baxter International Inc. Purification of butyrylcholinesterase using membrane adsorption
SG176256A1 (en) 2009-05-27 2012-01-30 Baxter Int A method to produce a highly concentrated immunoglobulin preparation for subcutaneous use
WO2011011753A1 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Baxter International Inc. Manufacture of factor h (fh) and fh-derivatives from plasma
US8772462B2 (en) 2010-05-26 2014-07-08 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
IL286298B (en) 2010-07-08 2022-08-01 Baxalta Inc A method to generate high molecular weight substituted vwf in cell culture
AU2011280907B2 (en) * 2010-07-23 2016-02-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Manufacture of inter -alpha - inhibitor proteins (IaIp) from plasma

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4357272A (en) * 1978-03-22 1982-11-02 The South African Inventions Development Corporation Recovering purified antibodies from egg yolk
US4378346A (en) * 1979-08-15 1983-03-29 Tankersley Donald L Intravenously injectable solution of plasma protein fraction free from bradykinin, kininogen and prekallikrein activators and processes for its production
US6093324A (en) * 1996-08-07 2000-07-25 Csl Limited Purification of immunoglobulins
TW491855B (en) * 1996-08-07 2002-06-21 Csl Ltd Purification of immunoglobulins
EP0893450A1 (en) * 1997-06-20 1999-01-27 Bayer Corporation Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
DE10008619A1 (de) * 2000-02-24 2001-09-06 Immuno Vet As Lynge Mikroorganismenfreies IgG-Präparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung in der Tieraufzucht und in der Tiermast
WO2004103398A1 (en) * 2003-05-23 2004-12-02 Novo Nordisk Health Care Ag Protein stabilization in solution
US20090203580A1 (en) * 2005-06-07 2009-08-13 Dinarello Charles A Compositions and methods of use for alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity
WO2007085626A1 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 Octapharma Ag Purification and use of a factor for supporting wound healing
CN101437853A (zh) * 2006-05-05 2009-05-20 白血球保健股份有限公司 用于固定生物物质的生物相容性三维基体
WO2008113589A1 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Csl Behring Gmbh Methods for industrial scale production of therapeutic complement factor h preparations from human plasma

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALISA S. WOLBERG 等: "Coagulation Factor XI Is a Contaminant in Intravenous Immunoglobulin Preparations", 《AMERICAN JOURNAL OF HEMATOLOGY》 *
程凡亮 等: "氨基化二氧化硅颗粒固定木瓜蛋白酶研究", 《生物工程学报》 *
许晓海 等: "《耐火材料技术手册》", 31 January 2001, 冶金工业出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016202973B2 (en) 2017-12-07
TW201542584A (zh) 2015-11-16
BR112012029893B1 (pt) 2022-09-06
MX337028B (es) 2016-02-09
HRP20150484T1 (hr) 2015-08-14
EP2803349A1 (en) 2014-11-19
IL223149A0 (en) 2013-02-03
JP6363676B2 (ja) 2018-07-25
JP2017014297A (ja) 2017-01-19
US20130101579A1 (en) 2013-04-25
DK2554160T3 (da) 2015-04-27
HUE064400T2 (hu) 2024-03-28
AU2018201371B2 (en) 2019-10-31
CN104958761A (zh) 2015-10-07
HK1183449A1 (zh) 2013-12-27
CN104840946A (zh) 2015-08-19
HK1215931A1 (zh) 2016-09-30
BR112012029897A2 (pt) 2016-08-16
TWI543989B (zh) 2016-08-01
MX2012013682A (es) 2013-01-28
DK2575762T3 (da) 2014-10-13
JP6592120B2 (ja) 2019-10-16
EP2554160B1 (en) 2015-02-25
EA034602B1 (ru) 2020-02-25
US11136350B2 (en) 2021-10-05
AR121861A2 (es) 2022-07-20
AR082093A1 (es) 2012-11-14
KR20160014119A (ko) 2016-02-05
CN109180776B (zh) 2022-12-13
HK1170168A1 (zh) 2013-02-22
CN103068365B (zh) 2015-07-08
PL2575762T3 (pl) 2015-01-30
EA034530B1 (ru) 2020-02-18
HK1203838A1 (zh) 2015-11-06
EA201291367A1 (ru) 2013-09-30
EP2803349B1 (en) 2023-09-27
EA201500848A1 (ru) 2016-06-30
PL2445482T3 (pl) 2015-01-30
AU2021286395A1 (en) 2022-01-20
PT2445482E (pt) 2014-11-03
WO2011149472A1 (en) 2011-12-01
JP5866345B2 (ja) 2016-02-17
CN103068365A (zh) 2013-04-24
US20210403504A1 (en) 2021-12-30
ES2536093T3 (es) 2015-05-20
JP2018080207A (ja) 2018-05-24
EP2575762B1 (en) 2014-07-09
AU2010202125B1 (en) 2010-09-02
CL2012003291A1 (es) 2013-10-04
MX2019004482A (es) 2019-08-30
AU2011258111B2 (en) 2016-02-11
CO6660438A2 (es) 2013-04-30
EP2575762A2 (en) 2013-04-10
US8940877B2 (en) 2015-01-27
JP2016155798A (ja) 2016-09-01
ES2959234T3 (es) 2024-02-22
PT2554160E (pt) 2015-06-11
US20240117009A1 (en) 2024-04-11
CA2800155A1 (en) 2011-12-01
CL2014003430A1 (es) 2015-05-04
KR20130080450A (ko) 2013-07-12
DK2445482T3 (da) 2014-09-22
AU2024204779A1 (en) 2024-08-01
EP2445482B1 (en) 2014-08-27
AR114228A2 (es) 2020-08-05
AR076800A1 (es) 2011-07-06
AU2020200373B2 (en) 2022-01-13
SG185724A1 (en) 2013-01-30
MY161617A (en) 2017-04-28
IL223150A0 (en) 2013-02-03
PL2803349T3 (pl) 2024-02-26
TW201202263A (en) 2012-01-16
AU2018201371A1 (en) 2018-03-22
SG10201505161SA (en) 2015-08-28
PL2554160T3 (pl) 2015-07-31
EA201691558A1 (ru) 2017-05-31
TWI531577B (zh) 2016-05-01
EP2554160A1 (en) 2013-02-06
KR101593265B1 (ko) 2016-02-11
KR101716534B1 (ko) 2017-03-14
US8993734B2 (en) 2015-03-31
HK1213790A1 (zh) 2016-07-15
ES2505465T3 (es) 2014-10-10
HK1181682A1 (zh) 2013-11-15
CN102970975B (zh) 2015-05-06
CL2012003290A1 (es) 2013-10-18
EA023446B1 (ru) 2016-06-30
HRP20140944T1 (hr) 2014-12-05
EP2803349C0 (en) 2023-09-27
AU2011258111A1 (en) 2012-12-13
JP2013527201A (ja) 2013-06-27
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