ES2505465T3 - Retirada de serina proteasas por tratamiento con dióxido de silicio finamente dividido - Google Patents

Retirada de serina proteasas por tratamiento con dióxido de silicio finamente dividido Download PDF

Info

Publication number
ES2505465T3
ES2505465T3 ES11729200.3T ES11729200T ES2505465T3 ES 2505465 T3 ES2505465 T3 ES 2505465T3 ES 11729200 T ES11729200 T ES 11729200T ES 2505465 T3 ES2505465 T3 ES 2505465T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
var
serine protease
stage
composition
sio2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11729200.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Wolfgang Teschner
Hans-Peter Schwarz
Ruth Madlener
Sonja Svatos
Azra Pljevljakovic
Alfred Weber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
Original Assignee
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42727304&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2505465(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US12/842,944 external-priority patent/US8304524B2/en
Application filed by Baxter Healthcare SA, Baxter International Inc filed Critical Baxter Healthcare SA
Priority claimed from PCT/US2011/038247 external-priority patent/WO2011150284A2/en
Application granted granted Critical
Publication of ES2505465T3 publication Critical patent/ES2505465T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39516—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum from serum, plasma
    • A61K39/39525—Purification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0026—Blood substitute; Oxygen transporting formulations; Plasma extender
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/12—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the preparation of the feed
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

Un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de proteína diana derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición enriquecida; (b) poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa unida, en el que la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es Factor XIa (FXIa), Factor XIIa (FXIIa), Factor XI (FXI), o Factor XII (FXII); en el que la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de precipitación de proteína; en el que la etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol; y en el que la proteína diana derivada de plasma se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, una proteína del sistema del complemento, y un inhibidor inter-alfa-tripsina (Iα

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Retirada de serina proteasas por tratamiento con dióxido de silicio finamente dividido
5 Antecedentes de la invención
Se usan productos sanguíneos derivados de plasma no sólo para tratar una variedad de trastornos sanguíneos, sino también enfermedades de otro origen. Por ejemplo, los productos de inmunoglobulina (IgG) de plasma humano se usaron por primera vez en 1952 para tratar una inmunodeficiencia. Desde entonces, las preparaciones de IgG han encontrado un amplio uso en al menos tres categorías principales de afecciones médicas: (1) inmunodeficiencias tales como agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, hipogammaglobulinemia (inmunodeficiencias primarias), y afecciones de inmunidad deficiente adquirida (inmunodeficiencias secundarias), con niveles de anticuerpos bajos; (2) enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias; y (3) infecciones agudas.
15 Asimismo, el factor H ha estado implicado como agente terapéutico potencial para varios estados de enfermedades humanas, incluyendo degeneración macular senil (AMD), síndrome urémico hemolítico (aHUS) y glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN). Específicamente, se ha caracterizado una relación causal entre el polimorfismo mononucleotídico (SNP) en el módulo 7 de proteína de control del complemento (CCP) del factor H y la degeneración macular senil (AMD).
Los estudios han demostrado correlaciones entre la disminución de los niveles plasmáticos de las proteínas inter-alfa-inhibidoras (IaIp) y la mortalidad en pacientes con septicemia grave (Lim et al., J Infect Dis. (2003) Sep 15;188(6):919-26 y Opal et al, Crit Care Med. (2007) Feb;35(2):387-92). Además, varios estudios han demostrado que la administración de IaIp reduce la mortalidad asociada a septicemia y choque septicémico (Jourdain et al., Am J
25 Respir Crit Care Med. (1997) Dec;156(6):1825-33; Yang et al., Crit Care Med. (2002) Mar; 30(3):617-22; Lim et al., J Infect Dis. (2003) Sep 15;188(6):919-26; y Wu et al., Crit Care Med. (2004) Ag; 32(8):1747-52; de los que las divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad para todos los propósitos).
Se deben tener en consideración varias precauciones de seguridad en la fabricación y formulación de los tratamientos biológicos derivados de plasma. Estas incluyen procedimientos para retirar y/o inactivar patógenos de transmisión hemática (por ejemplo, patógenos víricos y bacterianos), actividad anticomplementaria, y otros contaminantes no deseados que surgen del uso de plasma donado. Los estudios han sugerido que la administración de niveles altos de actividad amidolítica puede dar como resultado acontecimientos tromboembólicos no deseados (Wolberg AS et al, Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations. Am J Hematol 2000;65:30-34; y 35 Alving BM et al, Contact-activated factors: contaminants of inmunoglobulinas preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med 1980; 96:334-346; de los que las divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Destacando esta preocupación fue la reciente retirada voluntaria de octagam® (Octapharma) en los EE. UU. y la suspensión de la autorización de comercialización para octagam® y octagam 10 % por la Comisión Europea después del aumento de informes de acontecimientos tromboembólicos. Es probable que el incremento de acontecimientos trombóticos estuviera provocado por niveles altos de actividad amidolítica en el biofármaco, provocado por impurezas de serina proteasas y zimógenos de serina proteasas, tales como factor XI, factor XIa, factor XII y factor XIIa (Notificación de la FDA: Voluntary Market Withdrawal -23 de septiembre de 2010 Octagam [Immune Globulin Intravenous (Human)] 5 % Liquid Preparation; Octagam 50 mg/ml, solution pour perfusion -Octapharma France -Mise en quarantaine de tous les lots, publicada en
45 Internet el 9 de septiembre de 2010 por AFSSAPS; y Questions and answers on the suspension of the marketing authorisations for Octagam (human normal immunoglobulin 5 % and 10 %), publicada en Internet el 23 de septiembre de 2010 por la Agencia Europea de Medicamentos).
El documento WO2007085626 divulga un procedimiento para fabricar una composición que contiene un factor purificado para mantener la cicatrización, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante beta, factor de crecimiento insulinoide y factor de crecimiento fibroblástico de fuentes, tales como sangre, en el que el procedimiento de fabricación comprende etapas de purificación que se realizan en presencia de antitrombina III.
55 En el documento US2009203580, se puede aislar el polipéptido natural de células o fuentes de tejidos por un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas estándar y a continuación se puede reducir notablemente o eliminar la actividad inhibidora de las serina proteasas.
Las serina proteasas dedicadas, conocidas genéricamente como factores de coagulación, son componentes integrales de ambas rutas de activación por contacto y del factor tisular de la cascada de coagulación. Tras un estímulo de las rutas de coagulación, los zimógenos de serina proteasas, que son precursores enzimáticos inactivos, se vuelven proteasas activadas que catalizan la activación del siguiente zimógeno de proteasa, dando como resultado una cascada de activación. Esta cascada de coagulación culmina en la activación de trombina (factor Ha) y factor Xllla, que cumple la función de convertir el fibrinógeno (factor I) en fibrina (factor la) y reticula la fibrina para
65 formar un coágulo de fibrina, respectivamente.
imagen2
La ruta de activación por contacto, también conocida como la ruta de coagulación intrínseca, comienza con la activación de calicreína y factor XIIa (FXIIa) a partir de precalicreína y factor XII, respectivamente. La serina proteasa activada FXIIa escinde el factor XI (FXI), convirtiendo el zimógeno en el factor XIa (FXIa), una serina proteasa activa que participa en la posterior activación del factor Xa (FXa).
5 Debido al aumento de la preocupación por la presencia de serina proteasa y zimógenos de serina proteasa en composiciones de proteínas derivadas de plasma, aún existe la necesidad en la técnica de obtener procedimientos para reducir los niveles de estos contaminantes, y en particular FXI, FXIa, FXII, y FXIIa. La presente invención cumple estas y otras necesidades proporcionando dichos procedimientos y composiciones de proteínas derivadas de plasma con niveles reducidos de serina proteasa y zimógeno de serina proteasa.
Breve sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que las serina proteasas y zimógenos
15 de serina proteasas, y específicamente, FXI, FXIa, FXII, y FXIIa, se pueden retirar de las composiciones de proteínas derivadas de plasma por tratamiento con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. De este modo, la presente invención proporciona procedimientos para reducir la actividad de serina proteasa, el contenido en serina proteasa, y el contenido en zimógeno de serina proteasa de las composiciones de proteínas derivadas de plasma. También se proporcionan composiciones de proteínas derivadas de plasma terapéuticas que tienen una actividad de serina proteasa, contenido en serina proteasa y contenido en zimógeno de serina proteasa reducidos, así como procedimientos para tratar o evitar la enfermedad por la administración de las mismas.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de proteína diana derivada de plasma,
25 comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (b) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa unida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), o factor XII (FXII), como se especifica en la reivindicación 1.
El procedimiento descrito anteriormente comprende además la etapa de realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición enriquecida, antes de poner en contacto la composición con el dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En un modo de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de precipitación de proteína. En un modo de realización específico, la
35 etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol. En otro modo de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de ultrafiltración/diafiltración.
En otros modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana antes de poner en contacto la composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En un modo de realización, la segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de precipitación de proteína. En un modo de realización específico, la etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol. En otro modo de realización, la segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de ultrafiltración/diafiltración. Aún en otro modo de realización, la segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de enriquecimiento cromatográfica.
45 En otros modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además la etapa de realizar una tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En un modo de realización, la tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de precipitación de proteína. En un modo de realización específico, la etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol. En otro modo de realización, la tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de ultrafiltración/diafiltración. Aún en otro modo de realización, la tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de enriquecimiento cromatográfica.
En determinados modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de enriquecimiento
55 cromatográfica comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la composición de proteína diana derivada de plasma con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir la proteína diana derivada de plasma; y
(ii) eluir la proteína diana derivada de plasma de la resina cromatográfica. En un modo de realización específico, la impureza no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i). En otro modo de realización específico, la impureza se une a la resina cromatográfica en a subetapa (i), pero no se eluye de la resina cromatográfica en la subetapa (ii).
En otros modos de realización determinados de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de enriquecimiento cromatográfica comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir al menos una impureza; y (ii) separar la resina de la composición de proteína derivada de plasma, en la que la
65 proteína diana derivada de plasma no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i).
imagen3
En determinados modos de realización de los procedimientos que comprenden una etapa de enriquecimiento cromatográfica descrita anteriormente, la resina cromatográfica se selecciona del grupo que consiste en una resina de intercambio aniónico, una resina de intercambio catiónico, una resina de interacción hidrófoba, una resina de modo mezclado, una resina de hidroxiapatita, una resina de afinidad por ligando, una resina de inmunoafinidad, y una resina
5 de exclusión por tamaño.
En otros modos de realización determinados de los procedimientos que comprenden una etapa de enriquecimiento cromatográfico descrita anteriormente, la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende separar al menos una impureza de la proteína diana por tamaño y/o forma usando cromatografía de exclusión por tamaño.
En determinados modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la proteína diana derivada de plasma se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, una proteína del sistema del complemento, y un inhibidor inter-alfa-tripsina (IαI). En un modo de realización específico, la proteína del sistema del complemento se selecciona del grupo que consiste en factor H (FH), factor D, proteína del
15 complemento C3, y proteína de unión C4.
Aún en otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la composición de proteína diana derivada de plasma es un intermedio de fabricación.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H derivado de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b)
25 separar el SiO2 de la composición; (c) eluir la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa del SiO2 bajo una condición de solución en la que el factor H permanece unido; y (d) eluir el factor H del SiO2.
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y el factor H permanece unido comprende un pH mayor de aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y el factor H permanece unido comprende un pH mayor de aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y el factor H permanece unido comprende un pH mayor de aproximadamente 7,0. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o
35 zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y el factor H permanece unido comprende un pH de al menos aproximadamente 7,5.
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución comprende un pH de no más de 11,0. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de no más de 10,0. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de no más de 9,0.
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y el factor H permanece unido comprende una conductividad mayor de aproximadamente 10 mS/cm. En otro modo de realización de los procedimientos
45 descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y el factor H permanece unido comprende una conductividad mayor de aproximadamente 20 mS/cm. En otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y el factor H permanece unido comprende una conductividad de entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 50 mS/cm. Aún en otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y el factor H permanece unido comprende una conductividad entre aproximadamente 20 mS/cm y aproximadamente 50 mS/cm.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H
55 que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H y al menos una serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el factor H del SiO2 bajo condiciones en las que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido al SiO2.
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido comprende un pH mayor de aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido comprende un pH mayor de 65 aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y
imagen4
la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido comprende un pH mayor de aproximadamente 7,0. Aún en otro modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido comprende un pH de al menos aproximadamente 7,5.
5 En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución comprende un pH de no más de 11,0. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de no más de 10,0. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de no más de 9,0.
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido comprende una conductividad menor de aproximadamente 20 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido comprende una conductividad menor de aproximadamente 10 mS/cm. En otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y la serina proteasa o
15 zimógeno de serina proteasa permanece unido comprende una conductividad entre aproximadamente 2 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm. Aún en otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido comprende una conductividad entre aproximadamente 2 mS/cm y aproximadamente 10 mS/cm.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H pero no la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la
25 composición; y (c) eluir el factor H del SiO2.
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no comprende un pH mayor de aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no comprende un pH mayor de aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no comprende un pH mayor de aproximadamente 7,0. Aún en otro modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no comprende un pH de al menos aproximadamente 7,5.
35 En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución comprende un pH de no más de 11,0. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de no más de 10,0. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de no más de 9,0.
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no comprende una conductividad mayor de aproximadamente 10 mS/cm. En otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no comprende una conductividad mayor de aproximadamente 20 mS/cm. En otro modo de realización de los
45 procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no comprende una conductividad entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 50 mS/cm. Aún en otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no comprende una conductividad entre aproximadamente 20 mS/cm y aproximadamente 50 mS/cm.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas
55 para unir la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa pero no el factor H y (b) separar el SiO2 de la composición.
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y el factor H no comprende un pH mayor de aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y el factor H no comprende un pH mayor de aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y el factor H no comprende un pH mayor de aproximadamente 7,0. Aún en otro modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y el factor H no
65 comprende un pH de al menos aproximadamente 7,5.
imagen5
En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución comprende un pH de no más de 11,0. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de no más de 10,0. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de no más de 9,0.
5 En un determinado modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y el factor H no comprende una conductividad menor de aproximadamente 20 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y el factor H no comprende una conductividad menor de aproximadamente 10 mS/cm. En otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y el factor H no comprende una conductividad entre aproximadamente 2 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm. Aún en otro modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y el factor H no comprende una conductividad entre aproximadamente 2 mS/cm y
15 aproximadamente 10 mS/cm.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) que tiene una actividad de serina proteasa reducida, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una solución que contiene IαI y al menos una serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el IαI y al menos una serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; (c) eluir la serina proteasa del SiO2 bajo condiciones en las que el IαI permanece unido; y (d) eluir el IαI del SiO2.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de
25 inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) que tiene una actividad de serina proteasa reducida, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una solución que contiene IαI y al menos una serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el IαI y al menos una serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el IαI del SiO2 bajo condiciones en las que la serina proteasa permanece unida al SiO2.
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) que tiene una actividad de serina proteasa reducida, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una solución que contiene IαI y al menos una serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el IαI pero no la al menos una serina
35 proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el IαI del SiO2.
En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) que tiene una actividad de serina proteasa reducida, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una solución que contiene inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) y al menos una serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir la serina proteasa pero no el inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI); y (b) separar el SiO2 de la composición.
En determinados modos de realización de los aspectos descritos anteriormente, la composición se pone en contacto con SiO2 a una concentración final de al menos 1 g SiO2/g proteína. En otro modo de realización de los aspectos
45 descritos anteriormente, la composición se pone en contacto con SiO2 a una concentración final de al menos 2 g SiO2/g proteína. En otro modo de realización de los aspectos descritos anteriormente, la composición se pone en contacto con SiO2 a una concentración final de al menos 2,5 g SiO2/g proteína.
En determinados modos de realización de los aspectos descritos anteriormente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es el factor XI. En otro modo de realización de los aspectos descritos anteriormente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es el factor XIa. En otro modo de realización de los aspectos descritos anteriormente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es el factor XII. Aún en otro modo de realización de los aspectos descritos anteriormente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es el factor XIIa.
55 En un décimo aspecto, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende un procedimiento para reducir la actividad de serina proteasa de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos descritos anteriormente. En un modo de realización, la composición se formula para su administración a un sujeto. En un modo de realización específico, la composición se formula para su administración intravenosa, intramuscular, o subcutánea. En un modo de realización, la composición es acuosa. En otro modo de realización, la composición está liofilizada.
En un undécimo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad asociada con una actividad aberrante de una proteína plasmática en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento administrar una composición de proteína derivada de plasma de acuerdo con el aspecto indicado 65 anteriormente. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma
imagen6
que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, una proteína del sistema del complemento, y un inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI). En un duodécimo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H que comprende las etapas de (a) poner en contacto una fracción de precipitado de plasma suspendido que
5 contiene factor H con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido, (b) lavar el SiO2 con un tampón de lavado que comprende un pH bajo y una conductividad baja, y (c) eluir el factor H del SiO2 con un tampón de elución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad de al menos 10 mS/cm. En modos de realización específicos, la fracción de precipitado de plasma que contiene el factor H es un precipitado de la fracción II+III de Cohn, un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn, un precipitado A de Kistler/Nitschmann, o un precipitado B de Kistler/Nitschmann. En determinados modos de realización, los procedimientos comprenden además una o más etapas adicionales seleccionadas de (d) precipitar y retirar al menos una impureza de la elución del factor H, (e) precipitar y recuperar el factor H de la composición enriquecida, (f) enriquecer además el factor H por cromatografía de intercambio aniónico, (g) enriquecer además el factor H por cromatografía de afinidad por heparina, (h) una etapa de inactivación vírica dedicada, y (i) concentrar la composición de factor H enriquecida por ultrafiltración/diafiltración.
15 En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de proteína diana derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (b) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa unida, en el que la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), o factor XII (FXII),
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende
25 además la etapa de realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición enriquecida, antes de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En un modo de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de precipitación de proteína. En un modo de realización específico, la etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol. En otro modo de realización específico, la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de ultrafiltración/diafiltración.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana antes de poner en contacto la composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En un modo de realización, la segunda etapa
35 de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de precipitación de proteína. En un modo de realización específico, la etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol. En un modo de realización, la segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de ultrafiltración/diafiltración. En un modo de realización, la segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de enriquecimiento cromatográfico.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además la etapa de realizar una tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En un modo de realización, la tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de precipitación de proteína. En un modo de realización específico, la
45 etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol. En un modo de realización, la tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de ultrafiltración/diafiltración. En un modo de realización, la tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de enriquecimiento cromatográfico.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la composición de proteína diana derivada de plasma con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir la proteína diana derivada de plasma; y
(ii) eluir la proteína diana derivada de plasma de la resina cromatográfica. En un modo de realización específico, al menos una impureza no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i). En otro modo de realización específico, al menos una impureza se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i), pero no se eluye de la resina
55 cromatográfica en la subetapa (ii).
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir al menos una impureza; y (ii) separar la resina de la composición de proteína derivada de plasma, en la que la proteína diana derivada de plasma no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i).
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la resina cromatográfica se selecciona del grupo que consiste en una resina de intercambio aniónico, una resina de intercambio catiónico, una
65 resina de interacción hidrófoba, una resina de modo mezclado, una resina de hidroxiapatita, una resina de afinidad por ligando, una resina de inmunoafinidad y una resina de exclusión por tamaño. En un modo de realización, la resina cromatográfica es una resina de intercambio aniónico. En un modo de realización, la resina cromatográfica es una resina de intercambio catiónico. En un modo de realización, la resina cromatográfica es una resina de interacción hidrófoba. En un modo de realización, la resina cromatográfica es una resina de modo mezclado. En un modo de
imagen7
5 realización, la resina cromatográfica es una resina de hidroxiapatita. En un modo de realización, la resina cromatográfica es una resina de afinidad por ligando. En un modo de realización, la resina cromatográfica es una resina de inmunoafinidad. En un modo de realización, la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende separar al menos una impureza de la proteína diana por tamaño y/o forma usando cromatografía de exclusión por tamaño.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la proteína diana derivada de plasma se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, una proteína del sistema del complemento, y un inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI). En un modo de realización, la proteína derivada de plasma es una inmunoglobulina (Ig). En un modo de realización, la proteína derivada de plasma es albúmina. En un modo de realización, la proteína derivada de plasma es alfa-1-antitripsina. En un modo de 15 realización, la proteína derivada de plasma es butirilcolinesterasa. En un modo de realización, la proteína derivada de plasma es una proteína del sistema del complemento. En un modo de realización, la proteína del sistema del complemento se selecciona del grupo que consiste en factor H (FH), factor D, proteína del complemento C3, y proteína de unión C4. En un modo de realización, la proteína derivada de plasma es un inhibidor de inter-alfa-tripsina .
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición de proteína diana derivada de plasma es un intermedio de fabricación.
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina
25 proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; (c) eluir la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa del SiO2 bajo una condición de solución en la que una fracción sustancial de factor H permanece unida; y (d) eluir el factor H del SiO2.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se unen al SiO2 comprende un pH inferior a 7,0 y una conductividad menor de 11 mS/cm.
35 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se unen al SiO2 comprende un pH entre 4,5 y 6,5 y una conductividad menor de 6 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se unen al SiO2 comprende un pH entre 4,5 y 6,5 y una conductividad entre 0,5 mS/cm y 5 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción sustancial del factor H
45 permanece unida comprende un pH inferior a 7,0 y una conductividad menor de 11 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción sustancial del factor H permanece unida comprende un pH entre 4,5 y 6,5 y una conductividad menor de 6 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción sustancial del factor H permanece unida comprende un pH entre 5,0 y 6,5 y una conductividad entre 0,5 mS/cm y 5 mS/cm.
55 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 comprende una fuerza iónica de al menos 6 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 comprende una fuerza iónica de al menos 11 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 comprende un pH entre 5,0 y 7,0.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la 65 que el factor H se eluye del SiO2 comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una fuerza iónica de entre 4 mS/cm y 7 mS/cm.
imagen8
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina
5 proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H y al menos una serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el factor H del SiO2 bajo condiciones en las que una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida al SiO2.
10 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se unen al SiO2 comprende un pH inferior a 7,0 y una conductividad menor de 11 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la 15 que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción sustancial del factor H permanece unida comprende un pH entre 4,5 y 6,5 y una conductividad menor de 6 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución adecuada para unir el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa comprende un pH entre 20 5,0 y 6,0 y una conductividad de entre 0,5 mS/cm y 5,0 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad de al menos 11 mS/cm.
25 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad de entre 2 mS/cm y 10 mS/cm.
30 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la conductividad de la condición de solución está entre 4 mS/cm y 7 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la conductividad de la condición de solución está entre 5 mS/cm y 6 mS/cm.
35 En un modo de realización, la presente invención proporciona procedimiento para preparar una composición de factor H que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas
40 para unir el factor H pero no una fracción sustancial de la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el factor H del SiO2.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se une al SiO2 y una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se 45 une al SiO2 comprende un pH de entre 5,0 y 7,0 y una conductividad de no más de 14 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la conductividad de la condición de solución está entre 9 mS/cm y 14 mS/cm.
50 En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa pero no una fracción sustancial del factor H;
55 y (b) separar el SiO2 de la composición.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y una fracción sustancial del factor H no se une al SiO2 comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad de al menos 11 mS/cm.
60 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une al SiO2 y una fracción sustancial del factor H no se une al SiO2 comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad de entre 2 mS/cm y 10 mS/cm.
imagen9
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la conductividad de la condición de solución está entre 4 mS/cm y 7 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la conductividad de la condición
5 de solución está entre 5 mS/cm y 6 mS/cm. En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H; (b) lavar el SiO2 con una solución que comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y
10 una conductividad menor de 4 mS/cm; y (c) eluir el factor H del SiO2 con una solución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad mayor de 10 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH entre 5,5 y 6,5.
15 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH entre de 6,0±0,2.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la solución usada para eluir el 20 factor H comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de entre 25 mS/cm y 40 mS/cm.
25 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición de partida que contiene el factor H es un precipitado de la fracción II+III de Cohn suspendida, o una fracción equivalente del mismo.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición de partida que contiene el factor H es un precipitado A de Kistler/Nitschmann suspendido, o una fracción equivalente del mismo.
30 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición de partida que contiene el factor H es un precipitado B de Kistler/Nitschmann suspendido, o una fracción equivalente del mismo.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende 35 además la etapa de precipitar al menos una impureza de la solución de factor H recuperada, en el que el factor H no se precipita.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de precipitación es precipitación con PEG.
40 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la precipitación con PEG comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 3 % y un 7 %.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la concentración final de 45 PEG4000 es de un 5±0,5 %.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además la etapa de precipitar el factor H de la solución de factor H recuperada.
50 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de precipitación es precipitación con PEG.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la precipitación con PEG comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 10 % y un 15 %.
55 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la concentración final de PEG4000 es de un 12±0,5 %.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende 60 además una etapa de enriquecer el factor H por cromatografía.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende cromatografía de intercambio aniónico.
imagen10
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende cromatografía de afinidad por heparina.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de enriquecimiento 5 cromatográfico comprende cromatografía de intercambio aniónico seguido de cromatografía de afinidad por heparina.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además al menos una etapa de retirada o inactivación vírica dedicada.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende una etapa de nanofiltración.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además una etapa de concentrar la composición de factor H que comprende ultrafiltración/diafiltración.
15 En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una solución que contiene IαI y al menos una serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el IαI y al menos una serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; (c) eluir la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa del SiO2 bajo condiciones en las que una fracción sustancial del IαI permanece unida; y (d) eluir el IαI del SiO2.
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de
25 inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una solución que contiene IαI y al menos una serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el IαI y al menos una serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el IαI del SiO2 bajo condiciones en las que una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida al SiO2.
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una solución que contiene IαI y al menos una serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el
35 IαI pero no una fracción sustancial de la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el IαI del SiO2.
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una solución que contiene inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI) y al menos una serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa pero no el inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI); y (b) separar el SiO2 de la composición.
45 En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de inmunoglobulina G (IgG) que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento las etapas de; (a) precipitar una fracción de plásmido desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación, con alcohol entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 10 % a un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5 para obtener un primer precipitado y un primer sobrenadante; (b) precipitar la IgG del primer sobrenadante, en una segunda etapa de precipitación, con alcohol entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 25 % a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para formar un segundo precipitado; (c) resuspender el segundo precipitado para formar una suspensión; (d) poner en contacto la suspensión con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo una condición de solución adecuada para unir una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (e) separar el SiO2 de la suspensión para
55 formar una suspensión aclarada.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además las etapas de: (f) precipitar la IgG de la suspensión aclarada formada en la etapa (e), en una tercera etapa de precipitación, con alcohol entre aproximadamente un 22 % y aproximadamente un 28 % a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para formar un tercer precipitado; (g) resuspender el tercer precipitado para formar una suspensión; y (h) separar la fracción soluble de la suspensión formada en la etapa (e), formando de este modo una composición de IgG enriquecida.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende 65 además una etapa de enriquecimiento por cromatografía de intercambio aniónico.
imagen11
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además una etapa de enriquecimiento por cromatografía de intercambio catiónico.
5 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende además al menos una etapa de inactivación o retirada vírica dedicada.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende una etapa de inactivación vírica con disolvente/detergente (S/D).
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende una etapa de nanofiltración.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el procedimiento comprende 15 una etapa de incubación a pH bajo.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa (b) comprende ajustar la concentración de etanol del primer sobrenadante formado en la etapa (a) hasta aproximadamente un 25 % (v/v) a una temperatura de entre aproximadamente -7 ºC y aproximadamente -9 ºC.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la temperatura es de aproximadamente -9 ºC.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa (c) comprende
25 resuspender el precipitado de la etapa (b) con un tampón que contiene fosfato y acetato, en el que el pH del tampón se ajusta con entre 300 ml y 700 ml de ácido acético glacial por 1000 l de tampón.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa (d) comprende la adición de SiO2 hasta una concentración final de entre aproximadamente 0,02 gramos por gramo de precipitado formado en la etapa (b) y aproximadamente 0,06 gramos por gramo de precipitado formado en la etapa (b).
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución adecuada para unir una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa comprende un pH entre 4,5 y 6,0 y una conductividad de entre 0,1 mS/cm y 3 mS/cm.
35 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, el pH está entre 4,9 y 5,3.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la conductividad está entre 0,5 mS/cm y 2 mS/cm.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa (e) comprende the subetapas de: (i) lavar el filtro-prensa con al menos 3 volúmenes muertos de filtro-prensa de un tampón que contiene fosfato y acetato, en el que el pH del tampón se ajusta con entre 50 ml y 200 ml de ácido acético glacial por 1000 l de tampón, formando de este modo una solución de lavado; y (ii) combinar el filtrado de la etapa (f) con la solución de
45 lavado de la etapa (g), formando de este modo una solución.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, que comprende además la subetapa de: (iii) tratar la solución con un detergente.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa (h) comprende además tratamiento con disolvente y detergente (S/D) de la composición e IgG enriquecida.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición de IgG enriquecida obtenida en la etapa (h) contiene al menos un 85 % del contenido en IgG hallado en la fracción de plasma
55 desprovisto de crioprecipitado usada en la etapa (a).
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición de IgG enriquecida obtenida en la etapa (h) contiene al menos un 90 % del contenido en IgG hallado en la fracción de plasma desprovisto de crioprecipitado usada en la etapa (a).
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa se ha reducido en al menos un 90 %.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la cantidad de una serina 65 proteasa o un zimógeno de serina proteasa se ha reducido en al menos un 95 %.
imagen12
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa se ha reducido en al menos un 98 %.
5 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa se ha reducido en al menos un 99 %.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa es FXIa.
10 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición se pone en contacto con SiO2 a una concentración final de al menos 1 g SiO2/g proteína.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición se pone en 15 contacto con SiO2 a una concentración final de al menos 2 g SiO2/g proteína.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la composición se pone en contacto con SiO2 a una concentración final de al menos 2,5 g SiO2/g proteína.
20 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es el factor XI.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es el factor XII.
25 En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es el factor XIa.
En un modo de realización específico de los procedimientos descritos anteriormente, la serina proteasa o zimógeno 30 de serina proteasa es el factor XIIa.
En un modo de realización, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende un procedimiento para reducir la actividad de serina proteasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
35 En un modo de realización específico de las composiciones descritas anteriormente, la composición se formula para su administración a un sujeto.
En un modo de realización específico de las composiciones descritas anteriormente, la composición se formula para 40 su administración intravenosa, intramuscular o subcutánea.
En un modo de realización específico de las composiciones descritas anteriormente, la composición es acuosa.
En un modo de realización específico de las composiciones descritas anteriormente, la composición está liofilizada.
45 En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad asociada con una actividad aberrante de una proteína plasmática en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento administrar una composición de proteína derivada de plasma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 124 a 128. En un modo de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma
50 que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, una proteína del sistema del complemento, y un inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI).
Breve descripción de los dibujos
55 Figura 1. Visión general de un esquema de fraccionamiento de plasma de ejemplo.
Figura 2. Contenido de factor H en fracciones seleccionadas de un fraccionamiento de proteínas plasmáticas a escala industrial, medido por ELISA
60 Figura 3. Ilustración del factor H y la actividad amidolítica (medida usando el sustrato CS2166) eluido de SiO2 bajo condiciones de solución con conductividades variables a pH 7,5.
Descripción detallada de la invención
65 I. Introducción
imagen13
Dado el amplio uso de las composiciones terapéuticas de proteínas sanguíneas derivadas de plasma, tales como composiciones de inmunoglobulinas, factores de coagulación sanguínea, inhibidores de los factores de coagulación, y proteínas del sistema del complemento, es de primordial importancia garantizar la seguridad de estas 5 composiciones. Las recientes preocupaciones sobre el contenido amidolítico de estas composiciones combinadas con la aparición de acontecimientos tromboembólicos en pacientes a los que se les administraron composiciones de proteínas derivadas de plasma, ha destacado una necesitad en la técnica de un procedimiento para reducir serina proteasas (por ejemplo, FXIa y FXIIa) y zimógenos de serina proteasas (por ejemplo, FXI y FXII) durante la fabricación de estos productos biológicos. De forma ventajosa, la presente invención se basa al menos en parte en el
10 sorprendente hallazgo de que se puede usar dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido para unir serina proteasas y zimógenos de serina proteasas presentes en composiciones de proteínas derivadas de plasma. Como tales, en el presente documento se proporcionan procedimientos para reducir la concentración de serina proteasas y zimógenos de serina proteasas durante la fabricación de composiciones de proteínas derivadas de plasma.
15 En determinados aspectos, la presente invención proporciona la fabricación de procedimientos basados en el sorprendente hallazgo de que se puede usar dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido para retirar cantidades significativas de serina proteasa (por ejemplo, FXIa y FXIIa) y zimógeno de serina proteasa (por ejemplo, FXI y FXII) de soluciones de proteínas derivadas de plasma. Como tales, los procedimientos proporcionados en el presente documento se pueden integrar fácilmente en procedimientos de fabricación existentes, por ejemplo, el
20 fraccionamiento de muestras de mezcla de plasmas, preferentemente muestras de plasma humano, por etanol en frío (revisado en Schultze H E, Heremans J F; Molecular Biology of Human Proteins. Volume I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p. 236-317). Sin embargo, los procedimientos proporcionados en el presente documento no están limitados en modo alguno en su uso para la fabricación de procedimientos incluyendo el fraccionamiento con etanol. También son compatibles otras metodologías para la
25 purificación de proteínas derivadas de plasma con los procedimientos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, fraccionamiento de polímeros (por ejemplo, PEG) y metodologías cromatográficas (por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico y/o catiónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de modo mezclado, y similares).
30 Además, a diferencia de otros productos biológicos que se producen por medio de la expresión recombinante de vectores de ADN en líneas de células huésped, las proteínas derivadas de plasma se fraccionan a partir de donaciones de sangre y plasma humanos. Por lo tanto, no se puede incrementar el suministro de estos productos incrementando simplemente el volumen de producción. Más bien el nivel de productos sanguíneos disponibles
35 comercialmente está limitado por el suministro disponible de donaciones de sangre y plasma. Esta dinámica da como resultado una escasez en la disponibilidad de plasma humano natural para la fabricación de nuevos factores sanguíneos derivados de plasma que tengan mercados comerciales menos establecidos, incluyendo el factor del complemento H (CFH) y proteínas inhibidoras de inter-alfa-tripsina (IαIp).
40 Debido a la ausencia de plasma disponible para la fabricación de nuevos productos derivados de plasma, su fabricación se debe integrar en el marco existente de los procedimientos de fabricación establecidos para productos derivados de plasma tales como inmunoglobulinas y albúmina. El factor H, implicado como fármaco potencial para AMD, aHUS, y MPGN, entre otras afecciones, es un producto sanguíneo derivado de plasma que está ganando la atención de los médicos. Sin embargo, debido a los recursos destinados a, por ejemplo, la fabricación de
45 gammaglobulina IgG, se necesitan procedimientos para la fabricación del factor H que se puede introducir en los esquemas de fabricación existentes. Se ha sugerido que varios procedimientos logran justo esto, sin embargo, muchas de estas soluciones propuestas requieren la modificación del esquema de fabricación existente para los productos establecidos. Dichos cambios requerirán nuevas aprobaciones reguladoras para los productos establecidos e incluso pueden dar como resultado alteraciones de las características de los productos establecidos.
50 Por ejemplo, el documento WO 2007/066017 describe procedimientos para la producción de preparaciones del factor H a partir de sobrenadante de un crioprecipitado. El procedimiento divulgado consiste en preparar un sobrenadante de un crioprecipitado, someter el sobrenadante a cromatografía de intercambio aniónico (AEC), someter el flujo a través de la AEC a cromatografía de afinidad por heparina (HAC), someter el eluato relevante de la HAC a
55 cromatografía de intercambio catiónico fuerte (CEC), someter el eluato relevante de la CEC a cromatografía de intercambio aniónico fuerte (sAEC) y eluir el factor H de la sAEC. De forma desfavorable, los sobrenadantes del crioprecipitado son fracciones intermedias comunes en los procedimientos de fabricación de muchos productos sanguíneos derivados de plasma comercialmente importantes, incluyendo gammaglobulinas IgG (IVIG y subcutáneas) y albúmina. Someter esta fracción a etapas de cromatografía alterará el sobrenadante del
60 crioprecipitado y se requeriría que los procedimientos de fabricación de los productos sanguíneos posteriores establecidos estuvieran adaptados de maneras desconocidas. Además de requerir una revalidación completa y un posible rediseño de estos procedimientos de fabricación, se necesita una reaprobación reguladora de los procedimientos de fabricación de las agencias reguladoras clave.
imagen14
Asimismo, el documento WO 2008/113589 describe procedimientos para la producción de preparaciones del factor H a partir de plasma humano. Específicamente, esta publicación describe la purificación del factor H a partir de tres fracciones de procesamiento de plasma conocidas, a saber un sobrenadante de la fracción I de Cohn-Oncley, un precipitado de la fracción III de Cohn-Oncley y una fracción de precipitado B de Kistler/Nitschmann. Con respecto al 5 primer procedimiento, el documento WO 2008/113589 divulga que el factor H se puede retirar de un sobrenadante de la fracción I de Cohn-Oncley por la adición de una etapa de cromatografía de afinidad por heparina. De forma desfavorable, el sobrenadante de la fracción I de Cohn-Oncley es una fracción intermedia común en los procedimientos de fabricación de muchos productos sanguíneos derivados de plasma comercialmente importantes, incluyendo gammaglobulinas IgG (IVIG y subcutáneas) y albúmina. De forma similar, muchos procedimientos de fabricación de inmunoglobulinas (por ejemplo, IgG, IVIG, etc.) no se basan en la precipitación de la fracción III de Cohn-Oncley o en etapas del precipitado B de Kistler/Nitschmann, por ejemplo Gammagard® Liquid y Kiovig (Baxter International Inc.). La desventaja de la introducción de etapas adicionales, tales como una cromatografía de afinidad por heparina, precipitación de la fracción III, o etapas del precipitado B, en los esquemas de fabricación de los productos sanguíneos establecidos, como se indica anteriormente, es que se requiere una revalidación del
15 procedimiento de fabricación, la reaprobación reguladora de los procedimientos de fabricación de las agencias reguladoras clave, y pueden tener además consecuencias imprevistas para el rendimiento y/o la pureza del producto establecido de otro modo.
Como tal, se mantiene una necesidad en la técnica de obtener procedimientos de fabricación del factor H que no requieran el uso de plasma de aportación adicional o el rediseño y la reaprobación reguladora de procedimientos de fabricación existentes para productos sanguíneos derivados de plasma comercialmente importantes, tales como albúmina y gammaglobulinas IgG para administración intravenosa (IVIG) o subcutánea. De forma ventajosa, la presente invención se basa al menos en parte en el sorprendente descubrimiento de que factor H, serina proteasas, y zimógenos de serina proteasas se pueden unir simultáneamente a dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido
25 separando de este modo serina proteasas y zimógeno de serina proteasa de una primera proteína de interés que no se ha unido (por ejemplo, IgG) y a continuación se pueden separar eluyendo de forma diferencial el factor H y la serina proteasa y zimógenos de serina proteasas del SiO2. De forma similar, la presente invención se basa al menos en parte en el sorprendente descubrimiento de que IaIp, serina proteasas, y zimógenos de serina proteasas se pueden unir simultáneamente a dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido y a continuación se pueden separar eluyendo de forma diferencial IaIp y la serina proteasa y zimógenos de serina proteasas del SiO2.
II. Definiciones
Como se usa en el presente documento, "factor H" se refiere a un componente de proteína de la ruta alternativa del
35 complemento codificada por el gen del factor H del complemento (por ejemplo, CFH; NM000186; GeneID:3075; UniProt ID P08603; Ripoche et al., Biochem. J. 249:593-602(1988)). El factor H se traduce como un polipéptido precursor de 1.213 aminoácidos que se procesa por la retirada de un péptido señal de 18 aminoácidos, dando como resultado la proteína de factor H madura (aminoácidos 19-1231). Como se usa en la presente invención, el factor H engloba cualquier variante natural, secuencias alternativas, isoformas o proteínas mutantes que se pueden encontrar en una muestra de plasma, por ejemplo una muestra de plasma humana. Los ejemplos de mutaciones de factor H halladas en la población humana incluyen, sin limitación, Y402H; V62I; R78G; R127L; A224; Q400K; C431S; T493R; C536R; 155 IT; R567G; C630W; C673S; C673Y; E850K; S890I; H893R; C915S; E936D; Q950H; Y951H; T956M; C959Y; W978C; N997T; V1007I; V1007L; A1010T; T1017I; Y1021F; C1043R; N1050Y; I1059T; Q1076R; R1078S; D1119G; V1134G; Y1I42D; Q1143E; W1157R; C1163W; WI183L; W1183R; T1184R; L1I89R; S1191L; GU94D;
45 V1197A; E1198A; F1199S; R1210C; R1215G; R1215Q; YPTCAKR1225:1231FQS; y P1226S. Se ha descubierto que muchas de estas mutaciones están asociadas con una variedad de enfermedades y trastornos, incluyendo, síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), degeneración macular senil (AMD), glomulonefritis membranoproliferativa tipo II (MPGNII), deficiencia de CFH , y drusas laminares basales. El factor H también incluye proteínas que contienen modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, se cree que el factor H se modifica por N-acetilglucosamina (GlcNAc) en los residuos 529, 718, 802, 822, 882, 911, 1029, y 1095.
Como se usa en el presente documento, "proteínas inter-alfa-inhibidoras" o "IaIp" se refiere a una familia de inhibidores de proteasas plasmáticas compuesta de polipéptidos codificados por uno o más de gen precursor de alfa-1-microglobulina/bikunina (AMBP; UniGene ID:231948, polipéptido de bikunina), gen H1 inter-alfa
55 (globulina)-inhibidor (ITIH1; UniGene ID:224173, polipéptido H1), gen H2 inter-alfa (globulina)-inhibidor (ITIH2; UniGene ID:139782, polipéptido H2), gen H3 inter-alfa (globulin)-inhibidor (ITIH3; UniGene ID: 140017, polipéptido H3), o gen inter-alfa (globulina)-inhibidor (glucoproteína sensible a calicreína plasmática, polipéptido H4) (ITIH4; UniGene ID:3321613). Los inhibidores de proteasas IaIp de ejemplo incluyen, sin limitación, IαI (polipéptidos de bikunina, H1, y H2); Pal (polipéptidos de bikunina y H3), IaLI (polipéptidos de bikunina y H2), IaIH4P (polipéptido H4), y bikunina (Salier, J, et al., supra).
Como se usa en el presente documento, "plasma desprovisto de crioprecipitado" se refiere al sobrenadante creado después de la retirada de crioprecipitado formado descongelando plasma o mezcla de plasmas a temperaturas próximas a la congelación, por ejemplo, a temperaturas inferiores a aproximadamente 10 ºC, preferentemente a una 65 temperatura no mayor de aproximadamente 6 ºC. En el contexto de la presente invención, plasma se puede referir de
imagen15
manera intercambiable a plasma recuperado (es decir, plasma que se ha separado de la sangre completa ex vivo) o plasma de fuente (es decir, plasma recogido por medio de plasmaféresis). La crioprecipitación se realiza comúnmente, por ejemplo, descongelando mezcla de plasmas previamente congelado, que ya se ha sometido a ensayo para determinar consideraciones de seguridad y calidad, aunque también se puede usar plasma fresco.
5 Después de la completa descongelación del plasma congelado a baja temperatura, se lleva a cabo la separación de los crioprecipitados sólidos del sobrenadante líquido en frío (por ejemplo, ≤ 6 ºC) por centrifugación o filtración.
Como se usa en el presente documento, una "reserva de Cohn" se refiere al material de partida usado para el fraccionamiento de una muestra de plasma o reserva de muestras de plasma. Las reservas de Cohn incluyen plasma complejo, muestras de plasma desprovisto de crioprecipitado y reservas de muestras de plasma desprovisto de crioprecipitado que se pueden haber sometido o no a una etapa de preprocesamiento. En determinados modos de realización, una reserva de Cohn es una muestra de plasma desprovisto de crioprecipitado de la que se ha retirado uno o más factores sanguíneos en una etapa de preprocesamiento, por ejemplo, adsorción sobre una fase sólida (por ejemplo, hidróxido de aluminio, dióxido de silicio finamente dividido, etc.), o etapa cromatográfica (por ejemplo,
15 cromatografía de intercambio iónico o de afinidad por heparina). Se pueden aislar varios factores sanguíneos, incluyendo pero sin limitarse a, actividad de derivación inhibidora del factor ocho (FEIBA), complejo de factor IX, concentrado de factor Vll, o complejo antitrombina III, a partir de la muestra de plasma desprovisto de crioprecipitado para formar una reserva de Cohn.
Como se usa en el presente documento, una "torta de filtro de la fracción II+III" se refiere a una fase sólida recuperada después de la filtración o centrifugación de una suspensión de Cohn-Oncley o suspensión de pasta de la fracción II+III equivalente. En un modo de realización preferente, se tratará una suspensión de la fracción II+III con un material adsorbente, por ejemplo, dióxido de silicio finamente dividido, para retirar impurezas tales como lípidos, fibrinógeno, actividad amidolítica, actividad precalicreína, y lipoproteínas. En otro modo de realización preferente, se
25 puede añadir un coadyuvante de filtro a la suspensión de la fracción II+III antes de la centrifugación o filtración. En el modo de realización más preferente, se tratará una suspensión de la fracción II+III tanto con un material adsorbente como con un coadyuvante de filtro antes de la centrifugación o filtración. Tras la separación del sobrenadante de suspensión de la fracción II+III aclarada, el material de fase sólida recuperado se denomina torta de filtro de la fracción II+III.
Como se usa en el presente documento, "dióxido de silicio finamente dividido" o "sílice finamente dividido" se refiere a un óxido de silicio que tiene la fórmula SiO2, fabricado de forma que permita la adsorción del factor H sobre su superficie. Las formas de ejemplo de dióxido de silicio finamente dividido adecuadas para su uso en los procedimientos de la presente invención incluyen, sin limitación, sílice de combustión, sílice pirógena, Aerosil®,
35 Cab-O-Sil™, sílice coloidal, tierra de diatomeas, y similares. En un modo de realización preferente, se usa un producto de sílice de combustión hidrófilo comercial para los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de estos productos incluyen los comercializados por Evonik Industries bajo el nombre comercial Aerosil® (por ejemplo, Aerosil 90, Aerosil 130, Aerosil 150, Aerosil 200, Aerosil 300, Aerosil 380, Aerosil OX 50, Aerosil EG 50, Aerosil TT 600, Aerosil 200 SP, Aerosil 300 SP, y Aerosil 300/30).
Como se usa en el presente documento, una "enfermedad o trastorno asociado con disfunción del factor H" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno o afección en un sujeto que está provocado por, o caracterizado por, o que da como resultado una reducción en el nivel de actividad del factor H en el sujeto. Para los propósitos de la presente invención, la actividad del factor H se puede referir a la capacidad del factor H para unirse a una proteína o ligando, 45 por ejemplo, C3b, C3bBb, C3b2Bb, csbC3b, factor del complemento B (CFB), proteína C-reactiva, células endoteliales, glucosaminoglucanos (GAG), o de forma alternativa, se puede referir a su actividad de cofactor del factor I o su capacidad para acelerar la disociación irreversible de C3bBb y C3b2Bb. En un modo de realización, una enfermedad o trastorno asociado con la disfunción del factor H da como resultado una deficiencia de C3 y susceptibilidad a infecciones bacterianas. En algunos casos, las enfermedades o trastornos asociados con la disfunción del factor H incluyen afecciones que están provocadas por o ligadas a mutaciones y polimorfismo en el gen CFH que codifica el factor H (para revisión, véase, Barlow et al., Adv Exp Med Biol. 2008;632:117-42, del que la divulgación se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las enfermedades que se han ligado a mutaciones o polimorfismos en el gen CFH incluyen, sin limitación, deficiencia de factor H, síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), degeneración macular senil (AMD), glomulonefritis 55 membranoproliferativa tipo II (MPGNII; de Cordoba y de Jorge, Clinical y Experimental inmunology 151,1-13 (2008)), infarto de miocardio (Kardys et al., Journal of the American College of Cardiology 47, 1568-1575 (2006); Mooijaart et al., Experimental Gerontology 42, 1116-1122 (2007); Nicaud et al., Journal of Molecular Medicine 85,771-775 (2007); Pai et al., European Heart Journal 28, 1297-1303 (2007); Stark et al., Clinical Science (Lond) 113, 213-218 (2007)), cardiopatía coronaria/arteriopatía coronaria (CAD/CHD; (Meng et al., BMC Medical Genetics 8, 62 (2007); Pulido et al,, Mayo Clinic Proceedings 82, 301-307 (2007); Topol et al., Human Molecular Genetics 15 Spec No 2, Rl 17-R123 (2006)), y enfermedad de Alzheimer (Hamilton.et al., Neuromolecular Medicine 9, 331-334 (2007); Zetterberg et al., American Journal of Ophthalmology 143,1059-1060 (2007)). Las divulgaciones de las referencias anteriores que describen las asociaciones entre mutaciones y polimorfismos en el gen CFH y las enfermedades asociadas con la disfunción del factor H se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los
65 propósitos.
imagen16
Como se usa en el presente documento, una "enfermedad o trastorno asociado con la actividad del complemento en la ruta alternativa anormal" se refiere a una enfermedad, trastorno o afección que resulta de la activación incontrolada
o aberrante de la ruta alternativa del complemento. En general, la activación incontrolada o aberrante de la ruta
5 alternativa del complemento puede dar como resultado el daño por vecindad de tejidos y célula huésped, así como una reducción de C3 y la correspondiente susceptibilidad a infecciones patógenas (por ejemplo, fúngica, bacteriana, vírica y protista). Los ejemplos de enfermedades y trastornos asociados con la actividad del complemento en la ruta alternativa anormal incluyen, sin limitación, diversas enfermedades autoinmunitarias (tales como artritis reumatoide, nefropatía IgA, asma, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, síndrome antifosfolipídico, vasculitis asociada a ANCA, pénfigo, uveítis, miastenia grave, tiroiditis de Hashimoto), enfermedades renales (tales como nefropatía IgA, síndrome urémico hemolítico, glomerulonefritis membranoproliferativa) otras enfermedades tales como asma, enfermedad de Alzheimer, degeneración macular adulta, hemoglobinuria próxima nocturna, aneurisma aórtico abdominal, isquemia y septicemia.
15 Como se usa en el presente documento, el término "ultrafiltración (UF)" engloba una variedad de procedimientos de filtración de membrana en los que la presión hidrostática fuerza un líquido contra una membrana semipermeable. Los sólidos suspendidos y solutos de alto peso molecular quedan retenidos, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular pasan a través de la membrana. Este procedimiento de separación se usa a menudo para purificar y concentrar soluciones macromoleculares (103 -106 Da), en especial soluciones de proteínas. Están disponibles varias membranas de ultrafiltración dependiendo del tamaño de las moléculas que retienen. Típicamente, la ultrafiltración se caracteriza por una un tamaño de poro de membrana entre 1 y 1000 kDa y presiones de funcionamiento entre 0,01 y 10 bar (0,01 x 105 y 10 x 105 Pa).
Como se usa en el presente documento, el término "diafiltración" se realiza con la misma o una membrana similar a la
25 ultrafiltración y típicamente, se realiza en un modo de filtración de flujo tangencial. Durante la diafiltración, se introduce el tampón en el depósito de reciclado mientras que se retira el filtrado del funcionamiento de la unidad. En procedimientos en los que el producto es el retenido (por ejemplo, factor H), la diafiltración es particularmente útil para separar la proteína de moléculas pequeñas como azúcares y sales. En determinados casos, se puede usar diafiltración para intercambiar la solución, tampón o componentes individuales de un sistema tamponador.
Como se usa en el presente documento, el término "mezclar" describe un acto de provocar una distribución equitativa de dos o más compuestos o sustancias distintas en una solución o suspensión por cualquier forma de agitación. No se requiere la distribución equitativa completa de todos los ingredientes en una solución o suspensión como resultado de "mezclar" como se usa el término en esta solicitud.
35 Como se usa en el presente documento, el término "disolvente" engloba cualquier sustancia líquida que puede disolver o dispersar una o más de otras sustancias. Un disolvente puede ser de naturaleza inorgánica, tal como agua,
o puede ser un líquido orgánico, tal como etanol, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, hexano,éter de petróleo, etc. Como se usa en el término "tratamiento de detergente de disolvente", disolvente indica un disolvente orgánico (por ejemplo, tri-N-butilfosfato), que es parte de la mezcla de detergente de disolvente usada para inactivar los virus con envoltura lipídica en solución.
Como se usa en el presente documento, el término "detergente" se usa en esta solicitud de manera intercambiable con el término "tensioactivo" o "agente de acción en superficie". Típicamente, los tensioactivos son compuestos 45 orgánicos que son anfifílicos, es decir, que contienen tanto grupos hidrófobos ("colas") como grupos hidrófilos ("cabezas"), que hacen que los tensioactivos sean solubles tanto en disolventes orgánicos como en agua. Se puede clasificar un tensioactivo por la presencia de grupos formalmente cargados en su cabeza. Un tensioactivo no iónico no tiene grupos cargados en su cabeza, mientras que un tensioactivo iónico lleva una carga neta en su cabeza. Un tensioactivo bipolar contiene una cabeza con dos grupos con carga opuesta. Algunos ejemplos de tensioactivos comunes incluyen: aniónicos (basados en aniones sulfato, sulfonato o carboxilato): perfluorooctanoato (PFOA o PFO), sulfonato de perfluorooctano (PFOS), dodecilsulfato de sodio (SDS), laurilsulfato de amonio, y otras sales de sulfato de alquilo, laurilétersulfato de sodio (también conocido como lauril éter sulfato de sodio, o SLES), sulfonato de alquilbenceno; catiónicos (basados en cationes de amonio cuaternario): bromuro de cetil-trimetilamonio (CTAB) a.k.a. bromuro de hexadeciltrimetilamonio, y otras sales de alquiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio (CPC), amina de
55 sebo polietoxilado (POEA), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio (BZT); ácidos grasos de cadena larga y sus sales: incluyendo caprilato, ácido caprílico, heptanoato, ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido nanoico, ácido decanoico, y similares; bipolares (anfóteros): dodecilbetaína; cocamidopropilbetaína; cocoanfoglicinato; no iónicos: poli(óxido de etileno) de alquilo, poli(óxido de etileno) de alquilfenol, copolímeros de poli(óxido de etileno) y poli(óxido de polipropileno) (comercialmente conocidos como poloxámeros o poloxaminas), alquilpoliglucósidos, incluyendo octilglucósido, decilmaltósido, alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetílico y alcohol oleílico), cocamida MEA, cocamida DEA, polisorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes Triton, y óxido de dodecildimetilamina.
Como se usa en el presente documento, el término "cantidad o dosis terapéuticamente eficaz" o "cantidad o dosis suficiente/eficaz”, se refiere a una dosis que produce efectos por los que se administra. La dosis exacta dependerá 65 del propósito del tratamiento, y será determinable por un experto en la técnica usando técnicas conocidas (véase, por
imagen17
ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª edición, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins; de los que sus divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos).
5 Como se usa en esta solicitud, el término "pulverizar" se refiere a un medio de administrar una sustancia líquida en un sistema, por ejemplo, durante una etapa de precipitación de alcohol, tal como una etapa de precipitación I o II+III de fraccionamiento de Cohn, en forma de gotitas o vaporización fina de la sustancia líquida. Se puede lograr la pulverización por cualquier dispositivo presurizado, tal como un recipiente (por ejemplo, un frasco pulverizador), que
10 tiene una cabeza de pulverización o una boquilla y se hace funcionar de forma manual o automática para generar una vaporización fina de un líquido. Típicamente, se realiza la pulverización mientras el sistema que recibe la sustancia líquida se agita de forma continua o se mezcla de otro modo para garantizar una distribución rápida y equitativa del líquido dentro del sistema.
15 Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" indica un intervalo aproximado de más o menos un 10 % de un valor específico. Por ejemplo, el lenguaje "aproximadamente un 20 %" engloba un intervalo de un 18-22 %. Como se usa en el presente documento, aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por tanto, "aproximadamente un 20 %" quiere decir “aproximadamente un 20 %" y además "20 %". Como se usa en el presente documento, "aproximadamente" se refiere a un intervalo de o aproximadamente el valor especificado.
20 Los términos "dosis" y "dosificación" se usan de manera intercambiable en el presente documento. Una dosis se refiere a la cantidad de ingrediente activo dado para un individuo en cada administración. La dosis variará dependiendo de varios factores, incluyendo frecuencia de administración; tamaño y tolerancia del individuo; gravedad de la afección; riesgo de efectos secundarios; y la ruta de administración. Un experto en la técnica reconocerá que la
25 dosis se puede modificar dependiendo de los factores anteriores o basarse en el progreso terapéutico. El término "forma de dosificación" se refiere al formato particular del producto farmacéutico, y depende de la ruta de administración. Por ejemplo, una forma de dosificación puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina para inyección.
30 Como se usa en el presente documento, el término "prevenir" se refiere a una disminución de la probabilidad o una reducción de la frecuencia de los síntomas que surgen de una afección asociada con la ausencia de función o la disfunción de una proteína sanguínea.
Como se usa en el presente documento, el término "terapia", "tratamiento”, y "mejoría" se refieren a cualquier
35 reducción en la gravedad de los síntomas que surgen de una afección asociada con la ausencia de función o la disfunción de una proteína sanguínea. Como se usa en el presente documento, los términos "tratar" y "prevenir" no están destinados a ser términos absolutos. Tratamiento se puede referir a cualquier retraso en la aparición, mejoría de los síntomas, mejora en la supervivencia del paciente, incremento en el tiempo o la tasa de supervivencia, etc. El efecto del tratamiento se puede comparar con un individuo o un conjunto de individuos que no reciben en tratamiento.
40 Como se usa en el presente documento, el término "fracción sustancial" se refiere al menos a un 10 % de la población de una proteína particular de una composición. Por ejemplo, cuando se hace referencia a una fracción sustancial de una serina proteasa en una composición, una fracción sustancial de la serina proteasa corresponde al menos a un 10 % de la serina proteasa presente en la composición. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere
45 al menos a un 25 % de la población de una proteína particular en una composición. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % de la población de una proteína particular en una composición. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % de la población de una proteína particular en una composición. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la población de una proteína particular en una composición, o al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,
50 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o más de la población de una proteína particular en una composición. III. Reducción del contenido en serina proteasa y zimógeno de serina proteasa
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina
55 proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de proteína diana derivada de plasma uniendo la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa a dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido y separar el SiO2 de la composición.
En un modo de realización, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto la composición con
60 dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (b) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII).
imagen18
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de factor XI en una composición de proteína derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor XI; y (b) separar el SiO2 de la composición para retirar el factor XI unido.
5 En otro modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de factor XIa en una composición de proteína derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor XIa; y (b) separar el SiO2 de la composición para retirar el factor XIa unido.
10 En otro modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de factor XII en una composición de proteína derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor XII; y (b) separar el SiO2 de la composición para retirar el factor XII unido.
15 Aún en otro modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de factor XIIa en una composición de proteína derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor XIIa; y (b) separar el SiO2 de la composición para retirar el factor XIIa unido.
20 En determinados modos de realización, el procedimiento descrito anteriormente comprende además la etapa de realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición enriquecida, antes de poner en contacto la composición con el dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana se selecciona de una etapa de precipitación de
25 proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una proteína diana derivada de plasma, el procedimiento 30 comprende las etapas de: (a) formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida precipitando parcialmente proteína en un material de partida derivado de mezcla de plasmas; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido (véase la reivindicación 1). En un modo de realización, la
35 precipitación parcial se logra usando alcohol. En un modo de realización preferente, el alcohol es etanol. En otro modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII).
En otro modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina
40 proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una proteína diana derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida ultrafiltrando y/o diafiltrando un material de partida derivado de mezcla de plasmas; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o
45 zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII).
Aún en otro modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una proteína diana derivada de plasma, el procedimiento comprende 50 las etapas de: (a) formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida poniendo en contacto un material de partida derivado de mezcla de plasmas con una resina cromatográfica; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En determinados modos de realización, la resina
55 cromatográfica se selecciona de una resina de intercambio aniónico, una resina de intercambio catiónico, una resina de interacción hidrófoba, una resina de modo mezclado, una resina de hidroxiapatita, una resina de afinidad por ligando, una resina de inmunoafinidad, y una resina de exclusión por tamaño. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII).
60 En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una segunda composición enriquecida, antes de poner en contacto la composición con el dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
imagen19
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de
5 una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una proteína diana derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una segunda composición de proteína diana derivada de plasma; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo
10 condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (d) separar el SiO2  
15
imagen20
Tabla 1. Modos de realización de ejemplo para la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda.
Primera etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Segunda etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 1 Var. 11 Var. 21 Var. 31 Var. 41 Var. 51 Var. 61 Var. 71 Var. 81 Var. 91
UF/DF
Var. 2 Var. 12 Var. 22 Var. 32 Var. 42 Var. 52 Var. 62 Var. 72 Var. 82 Var. 92
AEC
Var. 3 Var. 13 Var. 23 Var. 33 Var. 43 Var. 53 Var. 63 Var. 73 Var. 83 Var. 93
CEC
Var. 4 Var. 14 Var. 24 Var. 34 Var. 44 Var. 54 Var. 64 Var. 74 Var. 84 Var. 94
HIC
Var. 5 Var. 15 Var. 25 Var. 35 Var. 45 Var. 55 Var. 65 Var. 75 Var. 85 Var. 95
HAC
Var. 6 Var. 16 Var. 26 Var. 36 Var. 46 Var. 56 Var. 66 Var. 76 Var. 86 Var. 96
MMC
Var. 7 Var. 17 Var. 27 Var. 37 Var. 47 Var. 57 Var. 67 Var. 77 Var. 87 Var. 97
LAC
Var. 8 Var. 18 Var. 28 Var. 38 Var. 48 Var. 58 Var. 68 Var. 78 Var. 88 Var. 98
IAC
Var. 9 Var. 19 Var. 29 Var. 39 Var. 49 Var. 59 Var. 69 Var. 79 Var. 89 Var. 99
SEC
Var. 10 Var. 20 Var. 30 Var. 40 Var. 50 Var. 60 Var. 70 Var. 80 Var. 90 Var. 100
* Ppt: Precipitación UF/DF; Ultrafiltración/Diafiltración
5 AEC; Cromatografía de intercambio aniónico CEC: Cromatografía de intercambio catiónico HIC: Cromatografía de interacción hidrófoba HAC; Cromatografía de hidroxiapatita MMC: Cromatografía de modo mezclado
10 LAC: Cromatografía de afinidad por ligando IAC: Cromatografía de inmunoafinidad SEC: Cromatografía de exclusión por tamaño
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de
15 realizar una etapa de enriquecimiento de proteína diana después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la etapa de enriquecimiento de proteína diana se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración y una etapa cromatográfica.
20 En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una proteína diana derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina
25 proteasa o zimógeno de serina proteasa; (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (d) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una segunda composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera
30 y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
Asimismo, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una proteína diana derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una
35 primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una segunda composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (e) realizar una tercera
40 etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una tercera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 101 a Var. 1100, encontradas en la tabla 2, tabla 3, tabla 4, tabla 5, tabla 6, tabla 7, tabla 8, tabla 9, tabla 10 o tabla 11.
imagen21
Tabla 2. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de enriquecimiento de precipitación, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 101 Var. 111 Var. 121 Var. 131 Var. 141 Var. 151 Var. 161 Var. 171 Var. 181 Var. 191
UF/DF
Var. 102 Var. 112 Var. 122 Var. 132 Var. 142 Var. 152 Var. 162 Var. 172 Var. 182 Var. 192
AEC
Var. 103 Var. 113 Var. 123 Var. 133 Var. 143 Var. 153 Var. 163 Var. 173 Var. 183 Var. 193
CEC
Var. 104 Var. 114 Var. 124 Var. 134 Var. 144 Var. 154 Var. 164 Var. 174 Var. 184 Var. 194
HIC
Var. 105 Var. 115 Var. 125 Var. 135 Var. 145 Var. 155 Var. 165 Var. 175 Var. 185 Var. 195
HAC
Var. 106 Var. 116 Var. 126 Var. 136 Var. 146 Var. 156 Var. 166 Var. 176 Var. 186 Var. 196
MMC
Var. 107 Var. 117 Var. 127 Var. 137 Var. 147 Var. 157 Var. 167 Var. 177 Var. 187 Var. 197
LAC
Var. 108 Var. 118 Var. 128 Var. 138 Var. 148 Var. 158 Var. 168 Var. 178 Var. 188 Var. 198
IAC
Var. 109 Var. 119 Var. 129 Var. 139 Var. 149 Var. 159 Var. 169 Var. 179 Var. 189 Var. 199
SEC
Var. 110 Var. 120 Var. 130 Var. 140 Var. 150 Var. 160 Var. 170 Var. 180 Var. 190 Var. 200
10 * Igual que para la tabla 1.
Tabla 3. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de ultrafiltración/diafiltración, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 201 Var. 211 Var. 221 Var. 231 Var. 241 Var. 251 Var. 261 Var. 271 Var. 281 Var. 291
UF/DF
Var. 202 Var. 212 Var. 222 Var. 232 Var. 242 Var. 252 Var. 262 Var. 272 Var. 282 Var. 292
AEC
Var. 203 Var. 213 Var. 223 Var. 233 Var. 243 Var. 253 Var. 263 Var. 273 Var. 283 Var. 293
CEC
Var. 204 Var. 214 Var. 224 Var. 234 Var. 244 Var. 254 Var. 264 Var. 274 Var. 284 Var. 294
HIC
Var. 205 Var. 215 Var. 225 Var. 235 Var. 245 Var. 255 Var. 265 Var. 275 Var. 285 Var. 295
HAC
Var. 206 Var. 216 Var. 226 Var. 236 Var. 246 Var. 256 Var. 266 Var. 276 Var. 286 Var. 296
MMC
Var. 207 Var. 217 Var. 227 Var. 237 Var. 247 Var. 257 Var. 267 Var. 277 Var. 287 Var. 297
LAC
Var. 208 Var. 218 Var. 228 Var. 238 Var. 248 Var. 258 Var. 268 Var. 278 Var. 288 Var. 298
IAC
Var. 209 Var. 219 Var. 229 Var. 239 Var. 249 Var. 259 Var. 269 Var. 279 Var. 289 Var. 299
SEC
Var. 210 Var. 220 Var. 230 Var. 240 Var. 250 Var. 260 Var. 270 Var. 280 Var. 290 Var. 300
imagen22
*
Igual que para la tabla 1. Tabla 4. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
*
Igual que para la tabla 1.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 301 Var. 311 Var. 321 Var. 331 Var. 341 Var. 351 Var. 361 Var. 371 Var. 381 Var. 391
UF/DF
Var. 302 Var. 312 Var. 322 Var. 332 Var. 342 Var. 352 Var. 362 Var. 372 Var. 382 Var. 392
AEC
Var. 303 Var. 313 Var. 323 Var. 333 Var. 343 Var. 353 Var. 363 Var. 373 Var. 383 Var. 393
CEC
Var. 304 Var. 314 Var. 324 Var. 334 Var. 344 Var. 354 Var. 364 Var. 374 Var. 384 Var. 394
HIC
Var. 305 Var. 315 Var. 325 Var. 335 Var. 345 Var. 355 Var. 365 Var. 375 Var. 385 Var. 395
HAC
Var. 306 Var. 316 Var. 326 Var. 336 Var. 346 Var. 356 Var. 366 Var. 376 Var. 386 Var. 396
MMC
Var. 307 Var. 317 Var. 327 Var. 337 Var. 347 Var. 357 Var. 367 Var. 377 Var. 387 Var. 397
LAC
Var. 308 Var. 318 Var. 328 Var. 338 Var. 348 Var. 358 Var. 368 Var. 378 Var. 388 Var. 398
IAC
Var. 309 Var. 319 Var. 329 Var. 339 Var. 349 Var. 359 Var. 369 Var. 379 Var. 389 Var. 399
SEC
Var. 310 Var. 320 Var. 330 Var. 340 Var. 350 Var. 360 Var. 370 Var. 380 Var. 390 Var. 400
Tabla 5. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de cromatografía de intercambio catiónico, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 401 Var. 411 Var. 421 Var. 431 Var. 441 Var. 451 Var. 461 Var. 471 Var. 481 Var. 491
UF/DF
Var. 402 Var. 412 Var. 422 Var. 432 Var. 442 Var. 452 Var. 462 Var. 472 Var. 482 Var. 492
AEC
Var. 403 Var. 413 Var. 423 Var. 433 Var. 443 Var. 453 Var. 463 Var. 473 Var. 483 Var. 493
CEC
Var. 404 Var. 414 Var. 424 Var. 434 Var. 444 Var. 454 Var. 464 Var. 474 Var. 484 Var. 494
HIC
Var. 405 Var. 415 Var. 425 Var. 435 Var. 445 Var. 455 Var. 465 Var. 475 Var. 485 Var. 495
HAC
Var. 406 Var. 416 Var. 426 Var. 436 Var. 446 Var. 456 Var. 466 Var. 476 Var. 486 Var. 496
MMC
Var. 407 Var. 417 Var. 427 Var. 437 Var. 447 Var. 457 Var. 467 Var. 477 Var. 487 Var. 497
LAC
Var. 408 Var. 418 Var. 428 Var. 438 Var. 448 Var. 458 Var. 468 Var. 478 Var. 488 Var. 498
IAC
Var. 409 Var. 419 Var. 429 Var. 439 Var. 449 Var. 459 Var. 469 Var. 479 Var. 489 Var. 499
SEC
Var. 410 Var. 420 Var. 430 Var. 440 Var. 450 Var. 460 Var. 470 Var. 480 Var. 490 Var. 500
10 * Igual que para la tabla 1.
imagen23
Tabla 6. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de cromatografía de interacción hidrófoba, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 501 Var. 511 Var. 521 Var. 531 Var. 541 Var. 551 Var. 561 Var. 571 Var. 581 Var. 591
UF/DF
Var. 502 Var. 512 Var. 522 Var. 532 Var. 542 Var. 552 Var. 562 Var. 572 Var. 582 Var. 592
AEC
Var. 503 Var. 513 Var. 523 Var. 533 Var. 543 Var. 553 Var. 563 Var. 573 Var. 583 Var. 593
CEC
Var. 504 Var. 514 Var. 524 Var. 534 Var. 544 Var. 554 Var. 564 Var. 574 Var. 584 Var. 594
HIC
Var. 505 Var. 515 Var. 525 Var. 535 Var. 545 Var. 555 Var. 565 Var. 575 Var. 585 Var. 595
HAC
Var. 506 Var. 516 Var. 526 Var. 536 Var. 546 Var. 556 Var. 566 Var. 576 Var. 586 Var. 596
MMC
Var. 507 Var. 517 Var. 527 Var. 537 Var. 547 Var. 557 Var. 567 Var. 577 Var. 587 Var. 597
LAC
Var. 508 Var. 518 Var. 528 Var. 538 Var. 548 Var. 558 Var. 568 Var. 578 Var. 588 Var. 598
IAC
Var. 509 Var. 519 Var. 529 Var. 539 Var. 549 Var. 559 Var. 569 Var. 579 Var. 589 Var. 599
SEC
Var. 510 Var. 520 Var. 530 Var. 540 Var. 550 Var. 560 Var. 570 Var. 580 Var. 590 Var. 600
* Igual que para la tabla 1.
Tabla 7. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de cromatografía de hidroxiapatita, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 601 Var. 611 Var. 621 Var. 631 Var. 641 Var. 651 Var. 661 Var. 671 Var. 681 Var. 691
UF/DF
Var. 602 Var. 612 Var. 622 Var. 632 Var. 642 Var. 652 Var. 662 Var. 672 Var. 682 Var. 692
AEC
Var. 603 Var. 613 Var. 623 Var. 633 Var. 643 Var. 653 Var. 663 Var. 673 Var. 683 Var. 693
CEC
Var. 604 Var. 614 Var. 624 Var. 634 Var. 644 Var. 654 Var. 664 Var. 674 Var. 684 Var. 694
HIC
Var. 605 Var. 615 Var. 625 Var. 635 Var. 645 Var. 655 Var. 665 Var. 675 Var. 685 Var. 695
HAC
Var. 606 Var. 616 Var. 626 Var. 636 Var. 646 Var. 656 Var. 666 Var. 676 Var. 686 Var. 696
MMC
Var. 607 Var. 617 Var. 627 Var. 637 Var. 647 Var. 657 Var. 667 Var. 677 Var. 687 Var. 697
LAC
Var. 608 Var. 618 Var. 628 Var. 638 Var. 648 Var. 658 Var. 668 Var. 678 Var. 688 Var. 698
IAC
Var. 609 Var. 619 Var. 629 Var. 639 Var. 649 Var. 659 Var. 669 Var. 679 Var. 689 Var. 699
SEC
Var. 610 Var. 620 Var. 630 Var. 640 Var. 650 Var. 660 Var. 670 Var. 680 Var. 690 Var. 700
* Igual que para la tabla 1.
10
24
imagen24
Tabla 8. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de cromatografía de modo mezclado, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 701 Var. 711 Var. 721 Var. 731 Var. 741 Var. 751 Var. 761 Var. 771 Var. 781 Var. 791
UF/DF
Var. 702 Var. 712 Var. 722 Var. 732 Var. 742 Var. 752 Var. 762 Var. 772 Var. 782 Var. 792
AEC
Var. 703 Var. 713 Var. 723 Var. 733 Var. 743 Var. 753 Var. 763 Var. 773 Var. 783 Var. 793
CEC
Var. 704 Var. 714 Var. 724 Var. 734 Var. 744 Var. 754 Var. 764 Var. 774 Var. 784 Var. 794
HIC
Var. 705 Var. 715 Var. 725 Var. 735 Var. 745 Var. 755 Var. 765 Var. 775 Var. 785 Var. 795
HAC
Var. 706 Var. 716 Var. 726 Var. 736 Var. 746 Var. 756 Var. 766 Var. 776 Var. 786 Var. 796
MMC
Var. 707 Var. 717 Var. 727 Var. 737 Var. 747 Var. 757 Var. 767 Var. 777 Var. 787 Var. 797
LAC
Var. 708 Var. 718 Var. 728 Var. 738 Var. 748 Var. 758 Var. 768 Var. 778 Var. 788 Var. 798
IAC
Var. 709 Var. 719 Var. 729 Var. 739 Var. 749 Var. 759 Var. 769 Var. 779 Var. 789 Var. 799
SEC
Var. 710 Var. 720 Var. 730 Var. 740 Var. 750 Var. 760 Var. 770 Var. 780 Var. 790 Var. 800
*
Igual que para la tabla 1.
Tabla 9. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de cromatografía de afinidad por ligando, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
*
Igual que para la tabla 1.
* Igual que para la tabla 1.
*
Igual que para la tabla 1.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 801 Var. 811 Var. 821 Var. 831 Var. 841 Var. 851 Var. 861 Var. 871 Var. 881 Var. 891
UF/DF
Var. 802 Var. 812 Var. 822 Var. 832 Var. 842 Var. 852 Var. 862 Var. 872 Var. 882 Var. 892
AEC
Var. 803 Var. 813 Var. 823 Var. 833 Var. 843 Var. 853 Var. 863 Var. 873 Var. 883 Var. 893
CEC
Var. 804 Var. 814 Var. 824 Var. 834 Var. 844 Var. 854 Var. 864 Var. 874 Var. 884 Var. 894
HIC
Var. 805 Var. 815 Var. 825 Var. 835 Var. 845 Var. 855 Var. 865 Var. 875 Var. 885 Var. 895
HAC
Var. 806 Var. 816 Var. 826 Var. 836 Var. 846 Var. 856 Var. 866 Var. 876 Var. 886 Var. 896
MMC
Var. 807 Var. 817 Var. 827 Var. 837 Var. 847 Var. 857 Var. 867 Var. 877 Var. 887 Var. 897
LAC
Var. 808 Var. 818 Var. 828 Var. 838 Var. 848 Var. 858 Var. 868 Var. 878 Var. 888 Var. 898
IAC
Var. 809 Var. 819 Var. 829 Var. 839 Var. 849 Var. 859 Var. 869 Var. 879 Var. 889 Var. 899
SEC
Var. 810 Var. 820 Var. 830 Var. 840 Var. 850 Var. 860 Var. 870 Var. 880 Var. 890 Var. 900
imagen25
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 901 Var. 911 Var. 921 Var. 931 Var. 941 Var. 951 Var. 961 Var. 971 Var. 981 Var. 991
UF/DF
Var. 902 Var. 912 Var. 922 Var. 932 Var. 942 Var. 952 Var. 962 Var. 972 Var. 982 Var. 992
AEC
Var. 903 Var. 913 Var. 923 Var. 933 Var. 943 Var. 953 Var. 963 Var. 973 Var. 983 Var. 993
CEC
Var. 904 Var. 914 Var. 924 Var. 934 Var. 944 Var. 954 Var. 964 Var. 974 Var. 984 Var. 994
HIC
Var. 905 Var. 915 Var. 925 Var. 935 Var. 945 Var. 955 Var. 965 Var. 975 Var. 985 Var. 995
HAC
Var. 906 Var. 916 Var. 926 Var. 936 Var. 946 Var. 956 Var. 966 Var. 976 Var. 986 Var. 996
MMC
Var. 907 Var. 917 Var. 927 Var. 937 Var. 947 Var. 957 Var. 967 Var. 977 Var. 987 Var. 997
LAC
Var. 908 Var. 918 Var. 928 Var. 938 Var. 948 Var. 958 Var. 968 Var. 978 Var. 988 Var. 998
IAC
Var. 909 Var. 919 Var. 929 Var. 939 Var. 949 Var. 959 Var. 969 Var. 979 Var. 989 Var. 999
SEC
Var. 910 Var. 920 Var. 930 Var. 940 Var. 950 Var. 960 Var. 970 Var. 980 Var. 990 Var. 1000

Tabla 11. Modos de realización de ejemplo para la combinación de una primera etapa de cromatografía de exclusión por tamaño, una segunda, y una tercera etapa de enriquecimiento.
Segunda etapa de enriquecimiento*
Ppt
UF/DF AEC CEC HIC HAC MMC LAC IAC SEC
Tercera etapa de enriquecimiento
Ppt Var. 1001 Var. 1011 Var. 1021 Var. 1031 Var. 1041 Var. 1051 Var. 1061 Var. 1071 Var. 1081 Var. 1091
UF/DF
Var. 1002 Var. 1012 Var. 1022 Var. 1032 Var. 1042 Var. 1052 Var. 1062 Var. 1072 Var. 1082 Var. 1092
AEC
Var. 1003 Var. 1013 Var. 1023 Var. 1033 Var. 1043 Var. 1053 Var. 1063 Var. 1073 Var. 1083 Var. 1093
CEC
Var. 1004 Var. 1014 Var. 1024 Var. 1034 Var. 1044 Var. 1054 Var. 1064 Var. 1074 Var. 1084 Var. 1094
HIC
Var. 1005 Var. 1015 Var. 1025 Var. 1035 Var. 1045 Var. 1055 Var. 1065 Var. 1075 Var. 1085 Var. 1095
HAC
Var. 1006 Var. 1016 Var. 1026 Var. 1036 Var. 1046 Var. 1056 Var. 1066 Var. 1076 Var. 1086 Var. 1096
MMC
Var. 1007 Var. 1017 Var. 1027 Var. 1037 Var. 1047 Var. 1057 Var. 1067 Var. 1077 Var. 1087 Var. 1097
LAC
Var. 1008 Var. 1018 Var. 1028 Var. 1038 Var. 1048 Var. 1058 Var. 1068 Var. 1078 Var. 1088 Var. 1098
IAC
Var. 1009 Var. 1019 Var. 1029 Var. 1039 Var. 1049 Var. 1059 Var. 1069 Var. 1079 Var. 1089 Var. 1099
SEC
Var. 1010 Var. 1020 Var. 1030 Var. 1040 Var. 1050 Var. 1060 Var. 1070 Var. 1080 Var. 1090 Var. 1100
En determinados modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente, una etapa de enriquecimiento 10 cromatográfica comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la composición de proteína diana derivada de plasma con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir la proteína diana derivada de plasma; y
imagen26
(ii) eluir la proteína diana derivada de plasma de la resina cromatográfica. En un modo de realización específico, la impureza no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i). En otro modo de realización específico, la impureza se une a la resina cromatográfica en a subetapa (i), pero no se eluye de la resina cromatográfica en la subetapa (ii).
5 En otros modos de realización determinados de los procedimientos descritos anteriormente, una etapa de enriquecimiento cromatográfica comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir al menos una impureza; y (ii) separar la resina de la composición de proteína derivada de plasma, en la que la proteína diana derivada de plasma no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i).
En determinados modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente, la proteína diana derivada de plasma se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, una proteína del sistema del complemento (por ejemplo, factor H), y un inhibidor inter-alfa-tripsina (IαI). En un modo de realización específico, la proteína del sistema del complemento se selecciona del grupo que consiste en factor H
15 (FH), factor D, proteína del complemento C3, y proteína de unión C4. En un modo de realización preferente, la composición de proteína es un intermedio de fabricación.
En determinados modos de realización de los procedimientos proporcionados en el presente documento, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 10 %. En otro modo de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 25 %. En otro modo de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 50 %. En otro modo de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 75 %. En otro modo de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 90 %. Aún en otros modos de realización, la
25 cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 5 %, o al menos en un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o hasta niveles por debajo del límite de detección del sistema de prueba.
En general, la cantidad de dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido requerido para los procedimientos descritos en el presente documento variará dependiendo de diversos factores, incluyendo sin limitación, la cantidad total de proteína presente en la composición, la concentración de serina proteasa y zimógeno de serina proteasa (por ejemplo, FXI, FXIa, FXII, y FXIIa) en la composición, la proteína diana, y las condiciones de solución (por ejemplo, pH, conductividad, etc.). Por ejemplo, se puede añadir SiO2 a la composición diana a una concentración entre 35 aproximadamente 0,01 g/g proteína y aproximadamente 10 g/g proteína. En otro modo de realización, se puede añadir SiO2 a la composición diana a una concentración entre aproximadamente 1 g/g proteína y aproximadamente 5 g/g proteína. En otro modo de realización, se puede añadir SiO2 a la composición diana a una concentración entre aproximadamente 2 g/g proteína y aproximadamente 4 g/g proteína. En un modo de realización, se añade SiO2 a una concentración final de al menos 1 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 2 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 2,5 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización, se puede añadir SiO2 a la composición diana a una concentración entre aproximadamente 0,01 g/g proteína y aproximadamente 5 g/g proteína. En otro modo de realización, se puede añadir SiO2 a la composición diana a una concentración entre aproximadamente 0,02 g/g proteína y aproximadamente 4 g/g proteína. En un modo
45 de realización, se añade SiO2 a una concentración final de al menos 0,1 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 0,2 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 0,25 g por gramo de proteína total. Aún en otros modos de realización específicos, se añade dióxido de silicio finamente dividido a una concentración de al menos 0,01 g/g proteína total o al menos 0,02 g, 0,03 g, 0,04 g, 0,05 g, 0,06 g, 0,07 g, 0,08 g, 0,09 g, 0,1 g, 0,2 g, 0,3 g, 0,4 g, 0,5 g, 0,6 g, 0,7 g, 0,8 g, 0,9 g, 1,0 g, 1,5 g, 2,0 g, 2,5 g, 3,0 g, 3,5 g, 4,0 g, 4,5 g, 5,0 g, 5,5 g, 6,0 g, 6,5 g, 7,0 g, 7,5 g, 8,0 g, 8,5 g, 9,0 g, 9,5 g, 10,0 g, o más g/g proteína total.
En determinados modos de realización en los que se extrae una proteína diana de una fracción de precipitado de plasma suspendido, se añadirá coadyuvante de filtro, por ejemplo Celpure C300 (Celpure) o Hyflo-Supper-Cel (World
55 Minerals), después del tratamiento con dióxido de sílice, para facilitar la filtración en profundidad. Se puede añadir un coadyuvante de filtro a una concentración final de desde aproximadamente 0,01 kg/kg precipitado a aproximadamente 1,0 kg/kg precipitado, o desde aproximadamente 0,02 kg/kg precipitado a aproximadamente 0,8 kg/kg precipitado, o desde aproximadamente 0,03 kg/kg precipitado a aproximadamente 0,7 kg/kg precipitado. En otros modos de realización, se puede añadir un coadyuvante de filtro a una concentración final de desde aproximadamente 0,01 kg/kg precipitado a aproximadamente 0,07 kg/kg precipitado, o desde aproximadamente 0,02 kg/kg precipitado a aproximadamente 0,06 kg/kg precipitado, o desde aproximadamente 0,03 kg/kg precipitado a aproximadamente 0,05 kg/kg precipitado. En determinados modos de realización, se puede añadir el coadyuvante de filtro a una concentración final de aproximadamente 0,01 kg/kg precipitado, o aproximadamente 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7,0,8, 0,9, o 1,0 kg/kg precipitado.
65 A. Inmunoglobulinas
imagen27
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de inmunoglobulina (Ig) derivada de plasma. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto la composición de
5 Ig con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (b) separar el SiO2 de la composición de Ig para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En un modo de realización, la composición de Ig es una composición de IgG. En otros modos de realización, la composición de Ig es una composición de IgA, IgM, IgG, o composición mezclada de las mismas.
En un modo de realización, el procedimiento comprende además la etapa de realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína de Ig para formar una primera composición de Ig enriquecida, antes de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera
15 etapa de enriquecimiento de proteína Ig se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica. En un modo de realización, la composición de Ig es una composición de IgG. En otros modos de realización, la composición de Ig es una composición de IgA, IgM, IgG, o composición mezclada de las mismas.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína Ig para formar una segunda composición enriquecida, antes de poner en contacto la composición de Ig con el dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína Ig se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una
25 etapa cromatográfica.
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de Ig derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de Ig para formar una primera composición de Ig derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de Ig para formar una segunda composición de Ig derivada de plasma; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina
35 proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una etapa de enriquecimiento de Ig después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la etapa de enriquecimiento de Ig se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
45 En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de Ig derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de Ig para formar una primera composición de Ig derivada de plasma enriquecida; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (d) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de Ig para formar una segunda composición de Ig derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se
55 selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
Asimismo, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de Ig derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de Ig para formar una primera composición de Ig derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de Ig para formar una segunda composición de Ig derivada de plasma enriquecida; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (e) realizar una tercera etapa de enriquecimiento de Ig para formar 65 una tercera composición de Ig derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina
imagen28
proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 101 a Var. 1100, encontradas en la tabla 2, tabla 3, tabla 4, tabla 5, tabla 6, tabla 7, tabla 8, tabla 9, tabla 10 o tabla 11.
5 En un modo de realización particular, la composición de Ig es un intermedio de fabricación. Por ejemplo, en determinados modos de realización, la composición de Ig es un intermedio de fabricación de IgG de un procedimiento de fraccionamiento de Cohn (J. Am. Chem, Soc., 1946, 68(3): 459-475; J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950)), un procedimiento de fraccionamiento de Oncley (J. Am. Chem. Soc, 1949,71(2): 541-550), un procedimiento de purificación de Deutsch (J. Biol. Chem. 164:109-118), un procedimiento de purificación de Hoppe (Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752), un procedimiento de purificación de Falksveden (patente sueca n.º 348942), un procedimiento de purificación de Falksveden y Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980), un procedimiento de purificación de Lebing (Vox Sang 2003 (84):193-201), un procedimiento de purificación de Tanaka (Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30)), un procedimiento de purificación de Teschner (Vox Sang, 2007 (92):42-55),
15 un procedimiento de fraccionamiento de Nitschmann (Helv. Chim. Acta 37:866-873), un procedimiento de fraccionamiento de Kistler/Nitschmann (Vox Sang. 7:414-424 (1962)), un procedimiento de purificación de Barundern (Vox Sang. 7:157-74 (1962)), un procedimiento de purificación de Koblet (Vox Sang. 13:93-102 (1967)) un procedimiento de purificación divulgado en las patentes de EE. UU. n.º 5.122.373 o 5.177.194, procedimientos modificados del mismo, y procedimientos de purificación similares o equivalentes conocidos en la técnica.
En un modo de realización particular, la composición de IgG es una reserva de Cohn desprovista de crioprecipitado. En otro modo de realización particular, la composición de IgG es un sobrenadante de la fracción I de Cohn o fracción equivalente del mismo. En otro modo de realización particular, la composición de IgG es un precipitado de la fracción III de Cohn resuspendida, o fracción equivalente del mismo. En otro modo de realización particular, la composición de
25 IgG es un precipitado de la fracción II+III de Cohn resuspendida, o fracción equivalente del mismo. En otro modo de realización particular, la composición de IgG es un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn resuspendida, o fracción equivalente del mismo. En otro modo de realización particular, la composición de IgG es un precipitado del Precipitado G resuspendido, o fracción equivalente del mismo. En otro modo de realización particular, la composición IgG es un precipitado del Precipitado B de Kistler/Nitschmann resuspendido, o fracción equivalente del mismo.
En un modo de realización específico, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa en un precipitado de la fracción II+III de IgG resuspendida. De forma ventajosa, se ha descubierto que los niveles de factor XI, factor XII, factor XIa, y/o factor XIIa en un precipitado de la fracción II+III de IgG resuspendida se pueden reducir considerablemente por la adición de una etapa de
35 pretratamiento anterior a la filtración/centrifugación. En un modo de realización, esta etapa de pretratamiento comprende la adición de partículas de dióxido de sílice finamente dividido (por ejemplo, sílice de combustión, Aerosil®) seguido de un periodo de incubación de 40 a 80 minutos durante el que se mezcla de forma constante la suspensión. En determinados modos de realización, el periodo de incubación estará entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más minutos. En general, el tratamiento se realizará entre aproximadamente 0 ºC y aproximadamente 10 ºC, o entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC. En determinados modos de realización, el tratamiento se puede realizar a aproximadamente 0 ºC, 1 ºC, 2 ºC, 3 ºC, 4 ºC, 5 ºC, 6 ºC, 7 ºC, 8 ºC, 9 ºC, o 10 ºC. En un modo de realización particular, el tratamiento se realiza entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 10 ºC.
45 El efecto del tratamiento de sílice de combustión está ejemplificado por los resultados hallados en los ejemplos 3, 6, y
7. En estos ejemplos, se resuspenden los precipitados de la fracción II+III y se tratan con cantidades variables de dióxido de silicio finamente dividido. Como se puede observar en la tabla 22, tabla 27, tabla 28, y tabla 29, la actividad de serina proteasa y el contenido en zimógeno del factor XI y XII se pueden reducir al menos un 90 % tratando la suspensión con SiO2.
En determinados modos de realización, se añade sílice de combustión a una concentración de entre aproximadamente 20 g/kg pasta II+III y aproximadamente 100 g/kg pasta II+III (es decir, para un precipitado de la fracción II+III modificada que se extrae en una proporción de 1:15, se debe añadir sílice de combustión a una concentración de aproximadamente 20 g/16 kg suspensión II+III a aproximadamente 100 g/16 kg suspensión II+III, o
55 a una concentración final de aproximadamente un 0,125 % (p/p) a aproximadamente 0,625 % (p/p)). En determinados modos de realización, se puede añadir el sílice de combustión a una concentración de aproximadamente 20 g/kg pasta II+III, o aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 g/kg pasta II+III. En un modo de realización específico, se añade sílice de combustión (por ejemplo, Aerosil 380 o equivalente) a la suspensión de la fracción II+III modificada hasta una concentración final de aproximadamente 40 g/16 kg II+III. El mezclado tiene lugar aproximadamente a de 2 a 8 ºC durante al menos de 50 a 70 minutos.
En determinados modos de realización, se añade SiO2 a una composición de IgG a una concentración de entre aproximadamente 0,01 g/g proteína y aproximadamente 10 g/g proteína. En otro modo de realización, se añade SiO2 a una composición de IgG a una concentración de entre aproximadamente 0,01 g/g proteína y aproximadamente 5 65 g/g proteína. En otro modo de realización, se añade SiO2 a una composición de IgG a una concentración de entre
imagen29
aproximadamente 0,02 g/g proteína y aproximadamente 4 g/g proteína. En un modo de realización, se añade SiO2 a una concentración final de al menos 0,1 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 0,2 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 0,25 g por gramo de proteína
5 total. En otros modos de realización específicos, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 1 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 2 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 2,5 g por gramo de proteína total. Aún en otros modos de realización específicos, se añade dióxido de silicio finamente dividido a una concentración de al menos 0,01 g/g proteína total o al menos 0,02 g, 0,03 g, 0,04 g, 0,05 g, 0,06 g, 0,07 g, 0,08 g, 0,09 g, 0,1 g, 0,2 g, 03 g, 0,4 g, 0,5 g, 0,6 g, 0,7 g, 0,8 g, 0,9 g, 1,0 g, 1,5 g, 2,0 g, 2,5 g, 3,0 g, 3,5 g, 4,0 g, 4,5 g, 5,0 g, 5,5 g, 6,0 g, 6,5 g, 7,0 g, 7,5 g, 8,0 g, 8,5 g, 9,0 g, 9,5 g, 10,0 g, o más por gramo de proteína total.
En determinados modos de realización, se añadirá coadyuvante de filtro, por ejemplo Celpure C300 (Celpure) o
15 Hyflo-Supper-Cel (World Minerals), después del tratamiento con dióxido de sílice, para facilitar la filtración en profundidad. Se puede añadir coadyuvante de filtro a una concentración final de desde aproximadamente 0,01 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 1,0 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,02 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,8 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,03 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,7 kg/kg pasta II+III. En otros modos de realización, se puede añadir coadyuvante de filtro a una concentración final de desde aproximadamente 0,01 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,07 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,02 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,06 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,03 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,05 kg/kg pasta II+III. En determinados modos de realización, se añadirá el coadyuvante de filtro a una concentración final de aproximadamente 0,01 kg/kg pasta II+III, o aproximadamente 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o 1,0 kg/kg pasta II+III.
25 En un modo de realización, las mejoras del procedimiento se producen por la inclusión de un tratamiento de sílice de combustión anterior a la filtración o aclarado por centrífuga de una suspensión de la fracción II+III. En determinados modos de realización, el tratamiento con sílice de combustión incluirá la adición de desde aproximadamente 0,01 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,07 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,02 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,06 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,03 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,05 kg/kg pasta II+III, o aproximadamente 0,02 kg/kg pasta II+III, 0,03 kg/kg pasta II+III, 0,04 kg/kg pasta II+III, 0,05 kg/kg pasta II+III, 0,06 kg/kg pasta II+III, 0,07 kg/kg pasta II+III, 0,08 kg/kg pasta II+III, 0,09 kg/kg pasta II+III, o 0,1 kg/kg pasta II+III, y se incubará la mezcla durante entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más minutos a una temperatura de entre
35 aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC. En otro modo de realización, las mejoras del procedimiento se producen por inclusión de un tratamiento de sílice de combustión que redujo los niveles de fibrinógeno residual, actividad amidolítica, y/o actividad del activador de precalicreína. En un modo de realización específico, las mejoras del procedimiento se producen por la inclusión de un tratamiento de sílice de combustión, que reduce los niveles de FXI, FXIa, FXII, y FXIIa en la preparación de inmunoglobulina.
En general, la retirada de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa de las composiciones de inmunoglobulina se puede lograr tratando la solución que contiene inmunoglobulina con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones de solución de pH y conductividad en las que la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa se unen al SiO2. Como se muestra en los ejemplos, las condiciones adecuadas incluyen pH bajo y baja conductividad.
45 En consecuencia, en un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de inmunoglobulina derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 7,0 para unir una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa y retirar el SiO2 de la composición. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,5. En otro modo de realización, el procedimiento
55 comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 7,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 7,0. En otro modo de realización, el procedimiento
65 comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,5.
imagen30
En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 5,5. Aún en otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5 4,6 y aproximadamente 5,6. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,7 y aproximadamente 5,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,8 y aproximadamente 5,4. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,9 y aproximadamente 5,3. En otro modo de realización, el procedimiento 10 comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 5,2. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH de aproximadamente 5,1. En otros modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH de aproximadamente 4,0 o aproximadamente 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, o no más de 7,0. Aún en otros modos de
15 realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH de no más de 4,0 o no más de 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4,6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, o no más de 7,0.
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina
20 proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de inmunoglobulina derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 3,0 mS/cm para unir una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa y retirar el SiO2 de la composición. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,5 mS/cm y aproximadamente 2,0
25 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 1,3 mS/cm y aproximadamente 1,7 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,9 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,8 mS/cm. En
30 otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,7 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,6 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,5 mS/cm. En otro
35 modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,4 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,3 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,2 mS/cm. En otro
40 modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,1 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 0,9 mS/cm. En otro
45 modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 0,8 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,2 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,3 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro
50 modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 0,4 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,5 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,6 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro
55 modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,7 mS/cm y aproximadamente 0,9 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica de aproximadamente 0,8 mS/cm. En otros modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica de aproximadamente 0,1 mS/cm o no más de 0,2 mS/cm, 0,3 mS/cm, 0,4 mS/cm, 0,5 mS/cm, 0,6 mS/cm, 0,7 mS/cm,
60 0,8 mS/cm, 0,9 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,1 mS/cm, 1,2 mS/cm, 1,3 mS/cm, 1,4 mS/cm, 1,5 mS/cm, 1,6 mS/cm, 1,7 mS/cm, 1,8 mS/cm, 1,9 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,1 mS/cm, 2,2 mS/cm, 2,3 mS/cm, 2,4 mS/cm, 2,5 mS/cm, 2,6 mS/cm, 2,7 mS/cm, 2,8 mS/cm, 2,9 mS/cm, o 3,0 mS/cm. Aún en otros modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica de no más de 0,1 mS/cm o no más de 0,2 mS/cm, 0,3 mS/cm, 0,4 mS/cm, 0,5 mS/cm, 0,6 mS/cm, 0,7 mS/cm, 0,8 mS/cm, 0,9 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,1 mS/cm, 1,2 mS/cm, 1,3 mS/cm, 1,4 mS/cm, 1,5 mS/cm, 1,6 mS/cm, 1,7 mS/cm, 1,8 mS/cm, 1,9 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,1 mS/cm, 2,2 mS/cm, 2,3 mS/cm, 2,4 mS/cm, 2,5 mS/cm, 2,6 mS/cm, 2,7 mS/cm, 2,8 mS/cm, 2,9 mS/cm, o 3,0 mS/cm.
imagen31
En determinados modos de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad
5 de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de inmunoglobulina derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la composición con SiO2 a un pH bajo y fuerza iónica baja para unir una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa y retirar el SiO2 de la composición. En un modo de realización particular, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,8 y aproximadamente 5,4 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,6 mS/cm y
10 aproximadamente 1,0 mS/cm. En un modo de realización más particular, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,9 y aproximadamente 5,3 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,7 mS/cm y aproximadamente 0,9 mS/cm. En un modo de realización aún más particular, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 5,2 a una fuerza iónica de aproximadamente 0,8 mS/cm. Aún en otros modos de realización, el
15 procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH y fuerza iónica de acuerdo con una cualquiera de las variaciones Var. 1222 a 3041, presentadas en la tabla 12, tabla 13, tabla 14, y tabla 15.
Tabla 12. Modos de realización de ejemplo de condiciones de solución útiles para unir serina proteasas y/o zimógenos de serina proteasas a SiO2.
pH
4,0-7,0
4,5-5,0 4,5-5,0 4,5-5,0 4,5-5,0 4,5-5,0 4,5-5,0 4,5-5,0 4,5-5,0
Fuerza iónica (mS/cm)
0,1-2,0 Var. 1222 Var. 1638 Var. 1638 Var. 1638 Var. 1638 Var. 1638 Var. 1638 Var. 1638 Var. 1638
0,1-1-9
Var. 1223 Var. 1639 Var. 1639 Var. 1639 Var. 1639 Var. 1639 Var. 1639 Var. 1639 Var. 1639
0,1-1,8
Var. 1224 Var. 1640 Var. 1640 Var. 1640 Var. 1640 Var. 1640 Var. 1640 Var. 1640 Var. 1640
0,1-1,7
Var. 1225 Var. 1641 Var. 1641 Var. 1641 Var. 1641 Var. 1641 Var. 1641 Var. 1641 Var. 1641
0,1-1,6
Var. 1226 Var. 1642 Var. 1642 Var. 1642 Var. 1642 Var. 1642 Var. 1642 Var. 1642 Var. 1642
0,1-1,5
Var. 1227 Var. 1643 Var. 1643 Var. 1643 Var. 1643 Var. 1643 Var. 1643 Var. 1643 Var. 1643
0,1-1,4
Var. 1228 Var. 1644 Var. 1644 Var. 1644 Var. 1644 Var. 1644 Var. 1644 Var. 1644 Var. 1644
0,1-1,3
Var. 1229 Var. 1645 Var. 1645 Var. 1645 Var. 1645 Var. 1645 Var. 1645 Var. 1645 Var. 1645
0,1-1,2
Var. 1230 Var. 1646 Var. 1646 Var. 1646 Var. 1646 Var. 1646 Var. 1646 Var. 1646 Var. 1646
0,1-1,1
Var. 1231 Var. 1647 Var. 1647 Var. 1647 Var. 1647 Var. 1647 Var. 1647 Var. 1647 Var. 1647
0,1-1,0
Var. 1232 Var. 1648 Var. 1648 Var. 1648 Var. 1648 Var. 1648 Var. 1648 Var. 1648 Var. 1648
0,1-0,9
Var. 1233 Var. 1649 Var. 1649 Var. 1649 Var. 1649 Var. 1649 Var. 1649 Var. 1649 Var. 1649
6,1-0,8
Var. 1234 Var. 1650 Var. 1650 Var. 1650 Var. 1650 Var. 1650 Var. 1650 Var. 1650 Var. 1650
0,2-2,0
Var. 1235 Var. 1651 Var. 1651 Var. 1651 Var. 1651 Var. 1651 Var. 1651 Var. 1651 Var. 1651
0,2-1,5
Var. 1236 Var. 1652 Var. 1652 Var. 1652 Var. 1652 Var. 1652 Var. 1652 Var. 1652 Var. 1652
0,2-1,0
Var. 1237 Var. 1653 Var. 1653 Var. 1653 Var. 1653 Var. 1653 Var. 1653 Var. 1653 Var. 1653
0,2-0,9
Var. 1238 Var. 1654 Var. 1654 Var. 1654 Var. 1654 Var. 1654 Var. 1654 Var. 1654 Var. 1654
0,2-0,8
Var. 1239 Var. 1655 Var. 1655 Var. 1655 Var. 1655 Var. 1655 Var. 1655 Var. 1655 Var. 1655
0,3-1,0
Var. 1240 Var. 1656 Var. 1656 Var. 1656 Var. 1656 Var. 1656 Var. 1656 Var. 1656 Var. 1656
0,3-0,9
Var. 1241 Var. 1657 Var. 1657 Var. 1657 Var. 1657 Var. 1657 Var. 1657 Var. 1657 Var. 1657
0,3-0,8
Var. 1242 Var. 1658 Var. 1658 Var. 1658 Var. 1658 Var. 1658 Var. 1658 Var. 1658 Var. 1658
0,4-1,0
Var. 1243 Var. 1659 Var. 1659 Var. 1659 Var. 1659 Var. 1659 Var. 1659 Var. 1659 Var. 1659
0,4-0,9
Var. 1244 Var. 1660 Var. 1660 Var. 1660 Var. 1660 Var. 1660 Var. 1660 Var. 1660 Var. 1660
0,4-0,8
Var. 1245 Var. 1661 Var. 1661 Var. 1661 Var. 1661 Var. 1661 Var. 1661 Var. 1661 Var. 1661
0,5-1,0
Var. 1246 Var. 1662 Var. 1662 Var. 1662 Var. 1662 Var. 1662 Var. 1662 Var. 1662 Var. 1662
0,5-0,9
Var. 1247 Var. 1663 Var. 1663 Var. 1663 Var. 1663 Var. 1663 Var. 1663 Var. 1663 Var. 1663
0,5-0,8
Var. 1248 Var. 1664 Var. 1664 Var. 1664 Var. 1664 Var. 1664 Var. 1664 Var. 1664 Var. 1664
0,6-1,0
Var. 1249 Var. 1665 Var. 1665 Var. 1665 Var. 1665 Var. 1665 Var. 1665 Var. 1665 Var. 1665
0,6-0,9
Var. 1250 Var. 1666 Var. 1666 Var. 1666 Var. 1666 Var. 1666 Var. 1666 Var. 1666 Var. 1666
0,6-0,8
Var. 1251 Var. 1667 Var. 1667 Var. 1667 Var. 1667 Var. 1667 Var. 1667 Var. 1667 Var. 1667
0,7-1,0
Var. 1252 Var. 1668 Var. 1668 Var. 1668 Var. 1668 Var. 1668 Var. 1668 Var. 1668 Var. 1668
0,7-0,9
Var. 1253 Var. 1669 Var. 1669 Var. 1669 Var. 1669 Var. 1669 Var. 1669 Var. 1669 Var. 1669
0,1
Var. 1254 Var. 1670 Var. 1670 Var. 1670 Var. 1670 Var. 1670 Var. 1670 Var. 1670 Var. 1670
0,2
Var. 1255 Var. 1671 Var. 1671 Var. 1671 Var. 1671 Var. 1671 Var. 1671 Var. 1671 Var. 1671
03
Var. 1256 Var. 1672 Var. 1672 Var. 1672 Var. 1672 Var. 1672 Var. 1672 Var. 1672 Var. 1672
0,4
Var. 1257 Var. 1673 Var. 1673 Var. 1673 Var. 1673 Var. 1673 Var. 1673 Var. 1673 Var. 1673
05
Var. 1258 Var. 1674 Var. 1674 Var. 1674 Var. 1674 Var. 1674 Var. 1674 Var. 1674 Var. 1674
0,6
Var. 1259 Var. 1675 Var. 1675 Var. 1675 Var. 1675 Var. 1675 Var. 1675 Var. 1675 Var. 1675
0,7
Var. 1260 Var. 1676 Var. 1676 Var. 1676 Var. 1676 Var. 1676 Var. 1676 Var. 1676 Var. 1676
0,8
Var. 1261 Var. 1677 Var. 1677 Var. 1677 Var. 1677 Var. 1677 Var. 1677 Var. 1677 Var. 1677
0,9
Var. 1262 Var. 1678 Var. 1678 Var. 1678 Var. 1678 Var. 1678 Var. 1678 Var. 1678 Var. 1678
1
Var. 1263 Var. 1679 Var. 1679 Var. 1679 Var. 1679 Var. 1679 Var. 1679 Var. 1679 Var. 1679
1,1
Var. 1264 Var. 1680 Var. 1680 Var. 1680 Var. 1680 Var. 1680 Var. 1680 Var. 1680 Var. 1680
1,2
Var. 1265 Var. 1681 Var. 1681 Var. 1681 Var. 1681 Var. 1681 Var. 1681 Var. 1681 Var. 1681
1,3
Var. 1266 Var. 1682 Var. 1682 Var. 1682 Var. 1682 Var. 1682 Var. 1682 Var. 1682 Var. 1682
imagen32
1,4
Var. 1267 Var. 1683 Var. 1683 Var. 1683 Var. 1683 Var. 1683 Var. 1683 Var. 1683 Var. 1683
1,5
Var. 1268 Var. 1684 Var. 1684 Var. 1684 Var. 1684 Var. 1684 Var. 1684 Var. 1684 Var. 1684
1,6
Var. 1269 Var. 1685 Var. 1685 Var. 1685 Var. 1685 Var. 1685 Var. 1685 Var. 1685 Var. 1685
1,7
Var. 1270 Var. 1686 Var. 1686 Var. 1686 Var. 1686 Var. 1686 Var. 1686 Var. 1686 Var. 1686
1,8
Var. 1271 Var. 1687 Var. 1687 Var. 1687 Var. 1687 Var. 1687 Var. 1687 Var. 1687 Var. 1687
1,9
Var. 1272 Var. 1688 Var. 1688 Var. 1688 Var. 1688 Var. 1688 Var. 1688 Var. 1688 Var. 1688
2
Var. 1273 Var. 1689 Var. 1689 Var. 1689 Var. 1689 Var. 1689 Var. 1689 Var. 1689 Var. 1689

Tabla 13. Modos de realización de ejemplo de condiciones de solución útiles para unir serina proteasas y/o zimógenos de serina proteasas a SiO2.
pH
5,0-7,0
5,0-6,5 5,0-6,0 5,0-5,5 4,6-5,6 4,7-5,5 4,8-5,4 4,9-5,3 5,0-5,2
Fuerza iónica (mS/cm)
0,1-2,0 Var. 1690 Var. 1742 Var. 1794 Var. 1846 Var. 1898 Var. 1950 Var. 2002 Var. 2054 Var. 2106
0,1-1,9
Var. 1691 Var. 1743 Var. 1795 Var. 1847 Var. 1899 Var. 1951 Var. 2003 Var. 2055 Var. 2107
0,1-1,8
Var. 1692 Var. 1744 Var. 1796 Var. 1848 Var. 1900 Var. 1952 Var. 2004 Var. 2056 Var. 2108
0-1-1,7
Var. 1693 Var. 1745 Var. 1797 Var. 1849 Var. 1901 Var. 1953 Var. 2005 Var. 2057 Var. 2109
0,1-1,6
Var. 1694 Var. 1746 Var. 1798 Var. 1850 Var. 1902 Var. 1954 Var. 2006 Var. 2058 Var. 2110
0,1-1,5
Var. 1695 Var. 1747 Var. 1799 Var. 1851 Var. 1903 Var. 1955 Var. 2007 Var. 2059 Var. 2111
0,1-1,4
Var. 1696 Var. 1748 Var. 1800 Var. 1852 Var. 1904 Var. 1956 Var. 2008 Var. 2060 Var. 2112
0,1-1,3
Var. 1697 Var. 1749 Var. 1801 Var. 1853 Var. 1905 Var. 1957 Var. 2009 Var. 2061 Var. 2113
0,1-1,2
Var. 1698 Var. 1750 Var. 1802 Var. 1854 Var. 1906 Var. 1958 Var. 2010 Var. 2062 Var. 2114
0,1-1,1
Var. 1699 Var. 1751 Var. 1803 Var. 1855 Var. 1907 Var. 1959 Var. 2011 Var. 2063 Var. 2115
0,1-1,0
Var. 1700 Var. 1752 Var. 1804 Var. 1856 Var. 1908 Var. 1960 Var. 2012 Var. 2064 Var. 2116
0,1-0,9
Var. 1701 Var. 1753 Var. 1805 Var. 1857 Var. 1909 Var. 1961 Var. 2013 Var. 2065 Var. 2117
0,1-0,8
Var. 1702 Var. 1754 Var. 1806 Var. 1858 Var. 1910 Var. 1962 Var. 2014 Var. 2066 Var. 2118
0,2-2,0
Var. 1703 Var. 1755 Var. 1807 Var. 1859 Var. 1911 Var. 1963 Var. 2015 Var. 2067 Var. 2119
0,2-1,5
Var. 1704 Var. 1756 Var. 1808 Var. 1860 Var. 1912 Var. 1964 Var. 2016 Var. 2068 Var. 2120
0,2-1,0
Var. 1705 Var. 1757 Var. 1809 Var. 1861 Var. 1913 Var. 1965 Var. 2017 Var. 2069 Var. 2121
0,2-0,9
Var. 1706 Var. 1758 Var. 1810 Var. 1862 Var. 1914 Var. 1966 Var. 2018 Var. 2070 Var. 2122
0,2-0,8
Var. 1707 Var. 1759 Var. 1811 Var. 1863 Var. 1915 Var. 1967 Var. 2019 Var. 2071 Var. 2123
0,3-1,0
Var. 1708 Var. 1760 Var. 1812 Var. 1864 Var. 1916 Var. 1968 Var. 2020 Var. 2072 Var. 2124
0,3-0,9
Var. 1709 Var. 1761 Var. 1813 Var. 1865 Var. 1917 Var. 1969 Var. 2021 Var. 2073 Var. 2125
0,3-0,8
Var. 1710 Var. 1762 Var. 1814 Var. 1866 Var. 1918 Var. 1970 Var. 2022 Var. 2074 Var. 2126
0-4-1,0
Var. 1711 Var. 1763 Var. 1815 Var. 1867 Var. 1919 Var. 1971 Var. 2023 Var. 2075 Var. 2127
0,4-0,9
Var. 1712 Var. 1764 Var. 1816 Var. 1868 Var. 1920 Var. 1972 Var. 2024 Var. 2076 Var. 2128
0,4-0,8
Var. 1713 Var. 1765 Var. 1817 Var. 1869 Var. 1921 Var. 1973 Var. 2025 Var. 2077 Var. 2129
0,5-1,0
Var. 1714 Var. 1766 Var. 1818 Var. 1870 Var. 1922 Var. 1974 Var. 2026 Var. 2078 Var. 2130
0,5-0,9
Var. 1715 Var. 1767 Var. 1819 Var. 1871 Var. 1923 Var. 1975 Var. 2027 Var. 2079 Var. 2131
0,5-0,8
Var. 1716 Var. 1768 Var. 1820 Var. 1872 Var. 1924 Var. 1976 Var. 2028 Var. 2080 Var. 2132
0,6-1,0
Var. 1717 Var. 1769 Var. 1821 Var. 1873 Var. 1925 Var. 1977 Var. 2029 Var. 2081 Var. 2133
0,6-0,9
Var. 1718 Var. 1770 Var. 1822 Var. 1874 Var. 1926 Var. 1978 Var. 2030 Var. 2082 Var. 2134
0,6-0,8
Var. 1719 Var. 1771 Var. 1823 Var. 1875 Var. 1927 Var. 1979 Var. 2031 Var. 2083 Var. 2135
0,7-1,0
Var. 1720 Var. 1772 Var. 1824 Var. 1876 Var. 1928 Var. 1980 Var. 2032 Var. 2084 Var. 2136
0,7-0,9
Var. 1721 Var. 1773 Var. 1825 Var. 1877 Var. 1929 Var. 1981 Var. 2033 Var. 2085 Var. 2137
0,1
Var. 1722 Var. 1774 Var. 1826 Var. 1878 Var. 1930 Var. 1982 Var. 2034 Var. 2086 Var. 2138
0,2
Var. 1723 Var. 1775 Var. 1827 Var. 1879 Var. 1931 Var. 1983 Var. 2035 Var. 2087 Var. 2139
03
Var. 1724 Var. 1776 Var. 1828 Var. 1880 Var. 1932 Var. 1984 Var. 2036 Var. 2088 Var. 2140
0,4
Var. 1725 Var. 1777 Var. 1829 Var. 1881 Var. 1933 Var. 1985 Var. 2037 Var. 2089 Var. 2141
0,5
Var. 1726 Var. 1778 Var. 1830 Var. 1882 Var. 1934 Var. 1986 Var. 2038 Var. 2090 Var. 2142
0,6
Var. 1727 Var. 1779 Var. 1831 Var. 1883 Var. 1935 Var. 1987 Var. 2039 Var. 2091 Var. 2143
0,7
Var. 1728 Var. 1780 Var. 1832 Var. 1884 Var. 1936 Var. 1988 Var. 2040 Var. 2092 Var. 2144
0,8
Var. 1729 Var. 1781 Var. 1833 Var. 1885 Var. 1937 Var. 1989 Var. 2041 Var. 2093 Var. 2145
0,9
Var. 1730 Var. 1782 Var. 1834 Var. 1886 Var. 1938 Var. 1990 Var. 2042 Var. 2094 Var. 2146
1
Var. 1731 Var. 1783 Var. 1835 Var. 1887 Var. 1939 Var. 1991 Var. 2043 Var. 2095 Var. 2147
1,1
Var. 1732 Var. 1784 Var. 1836 Var. 1888 Var. 1940 Var. 1992 Var. 2044 Var. 2096 Var. 2148
1,2
Var. 1733 Var. 1785 Var. 1837 Var. 1889 Var. 1941 Var. 1993 Var. 2045 Var. 2097 Var. 2149
13
Var. 1734 Var. 1786 Var. 1838 Var. 1890 Var. 1942 Var. 1994 Var. 2046 Var. 2098 Var. 2150
1,4
Var. 1735 Var. 1787 Var. 1839 Var. 1891 Var. 1943 Var. 1995 Var. 2047 Var. 2099 Var. 2151
1,5
Var. 1736 Var. 1788 Var. 1840 Var. 1892 Var. 1944 Var. 1996 Var. 2048 Var. 2100 Var. 2152
1,6
Var. 1737 Var. 1789 Var. 1841 Var. 1893 Var. 1945 Var. 1997 Var. 2049 Var. 2101 Var. 2153
1,7
Var. 1738 Var. 1790 Var. 1842 Var. 1894 Var. 1946 Var. 1998 Var. 2050 Var. 2102 Var. 2154
1,8
Var. 1739 Var. 1791 Var. 1843 Var. 1895 Var. 1947 Var. 1999 Var. 2051 Var. 2103 Var. 2155
1,9
Var. 1740 Var. 1792 Var. 1844 Var. 1896 Var. 1948 Var. 2000 Var. 2052 Var. 2104 Var. 2156
2
Var. 1741 Var. 1793 Var. 1845 Var. 1897 Var. 1949 Var. 2001 Var. 2053 Var. 2105 Var. 2157
imagen33
pH
5,1
NMT 4,0 NMT 4,2 NMT 4,4 NMT 4,6 NMT 4,8 NMT 5,0 NMT 5,2 NMT 5,4
Fuerza iónica (mS/cm)
0,1-2,0 Var. 2158 Var. 2210 Var. 2262 Var. 2314 Var. 2366 Var. 2418 Var. 2470 Var. 2522 Var. 2574
0,1-1,9
Var. 2159 Var. 2211 Var. 2263 Var. 2315 Var. 2367 Var. 2419 Var. 2471 Var. 2523 Var. 2575
0,1-1,8
Var. 2160 Var. 2212 Var. 2264 Var. 2316 Var. 2368 Var. 2420 Var. 2472 Var. 2524 Var. 2576
0,1-1,7
Var. 2161 Var. 2213 Var. 2265 Var. 2317 Var. 2369 Var. 2421 Var. 2473 Var. 2525 Var. 2577
0,1-1,6
Var. 2162 Var. 2214 Var. 2266 Var. 2318 Var. 2370 Var. 2422 Var. 2474 Var. 2526 Var. 2578
0,1-1,5
Var. 2163 Var. 2215 Var. 2267 Var. 2319 Var. 2371 Var. 2423 Var. 2475 Var. 2527 Var. 2579
0,1-1,4
Var. 2164 Var. 2216 Var. 2268 Var. 2320 Var. 2372 Var. 2424 Var. 2476 Var. 2528 Var. 2580
0,1-1,3
Var. 2165 Var. 2217 Var. 2269 Var. 2321 Var. 2373 Var. 2425 Var. 2477 Var. 2529 Var. 2581
0,1-1,2
Var. 2166 Var. 2218 Var. 2270 Var. 2322 Var. 2374 Var. 2426 Var. 2478 Var. 2530 Var. 2582
0,1-1,1
Var. 2167 Var. 2219 Var. 2271 Var. 2323 Var. 2375 Var. 2427 Var. 2479 Var. 2531 Var. 2583
0,1-1,0
Var. 2168 Var. 2220 Var. 2272 Var. 2324 Var. 2376 Var. 2428 Var. 2480 Var. 2532 Var. 2584
0,1-0,9
Var. 2169 Var. 2221 Var. 2273 Var. 2325 Var. 2377 Var. 2429 Var. 2481 Var. 2533 Var. 2585
0,1-0,8
Var. 2170 Var. 2222 Var. 2274 Var. 2326 Var. 2378 Var. 2430 Var. 2482 Var. 2534 Var. 2586
0,2-2,0
Var. 2171 Var. 2223 Var. 2275 Var. 2327 Var. 2379 Var. 2431 Var. 2483 Var. 2535 Var. 2587
0,2-1,5
Var. 2172 Var. 2224 Var. 2276 Var. 2328 Var. 2380 Var. 2432 Var. 2484 Var. 2536 Var. 2588
0,2-1,0
Var. 2173 Var. 2225 Var. 2277 Var. 2329 Var. 2381 Var. 2433 Var. 2485 Var. 2537 Var. 2589
0,2-0,9
Var. 2174 Var. 2226 Var. 2278 Var. 2330 Var. 2382 Var. 2434 Var. 2486 Var. 2538 Var. 2590
0,2-0,8
Var. 2175 Var. 2227 Var. 2279 Var. 2331 Var. 2383 Var. 2435 Var. 2487 Var. 2539 Var. 2591
0,3-1,0
Var. 2176 Var. 2228 Var. 2280 Var. 2332 Var. 2384 Var. 2436 Var. 2488 Var. 2540 Var. 2592
0,3-0,9
Var. 2177 Var. 2229 Var. 2281 Var. 2333 Var. 2385 Var. 2437 Var. 2489 Var. 2541 Var. 2593
0,3-0,8
Var. 2178 Var. 2230 Var. 2282 Var. 2334 Var. 2386 Var. 2438 Var. 2490 Var. 2542 Var. 2594
0,4-1,0
Var. 2179 Var. 2231 Var. 2283 Var. 2335 Var. 2387 Var. 2439 Var. 2491 Var. 2543 Var. 2595
0,4-0,9
Var. 2180 Var. 2232 Var. 2284 Var. 2336 Var. 2388 Var. 2440 Var. 2492 Var. 2544 Var. 2596
0,4-0,8
Var. 2181 Var. 2233 Var. 2285 Var. 2337 Var. 2389 Var. 2441 Var. 2493 Var. 2545 Var. 2597
0,5-1,0
Var. 2182 Var. 2234 Var. 2286 Var. 2338 Var. 2390 Var. 2442 Var. 2494 Var. 2546 Var. 2598
0,5-0,9
Var. 2183 Var. 2235 Var. 2287 Var. 2339 Var. 2391 Var. 2443 Var. 2495 Var. 2547 Var. 2599
0,5-0,8
Var. 2184 Var. 2236 Var. 2288 Var. 2340 Var. 2392 Var. 2444 Var. 2496 Var. 2548 Var. 2600
0,6-1,0
Var. 2185 Var. 2237 Var. 2289 Var. 2341 Var. 2393 Var. 2445 Var. 2497 Var. 2549 Var. 2601
0,6-0,9
Var. 2186 Var. 2238 Var. 2290 Var. 2342 Var. 2394 Var. 2446 Var. 2498 Var. 2550 Var. 2602
0,6-0,8
Var. 2187 Var. 2239 Var. 2291 Var. 2343 Var. 2395 Var. 2447 Var. 2499 Var. 2551 Var. 2603
0,7-1,0
Var. 2188 Var. 2240 Var. 2292 Var. 2344 Var. 2396 Var. 2448 Var. 2500 Var. 2552 Var. 2604
0,7-0,9
Var. 2189 Var. 2241 Var. 2293 Var. 2345 Var. 2397 Var. 2449 Var. 2501 Var. 2553 Var. 2605
0,1
Var. 2190 Var. 2242 Var. 2294 Var. 2346 Var. 2398 Var. 2450 Var. 2502 Var. 2554 Var. 2606
0,2
Var. 2191 Var. 2243 Var. 2295 Var. 2347 Var. 2399 Var. 2451 Var. 2503 Var. 2555 Var. 2607
03
Var. 2192 Var. 2244 Var. 2296 Var. 2348 Var. 2400 Var. 2452 Var. 2504 Var. 2556 Var. 2608
0,4
Var. 2193 Var. 2245 Var. 2297 Var. 2349 Var. 2401 Var. 2453 Var. 2505 Var. 2557 Var. 2609
0,5
Var. 2194 Var. 2246 Var. 2298 Var. 2350 Var. 2402 Var. 2454 Var. 2506 Var. 2558 Var. 2610
0,6
Var. 2195 Var. 2247 Var. 2299 Var. 2351 Var. 2403 Var. 2455 Var. 2507 Var. 2559 Var. 2611
0,7
Var. 2196 Var. 2248 Var. 2300 Var. 2352 Var. 2404 Var. 2456 Var. 2508 Var. 2560 Var. 2612
0,8
Var. 2197 Var. 2249 Var. 2301 Var. 2353 Var. 2405 Var. 2457 Var. 2509 Var. 2561 Var. 2613
0,9
Var. 2198 Var. 2250 Var. 2302 Var. 2354 Var. 2406 Var. 2458 Var. 2510 Var. 2562 Var. 2614
1
Var. 2199 Var. 2251 Var. 2303 Var. 2355 Var. 2407 Var. 2459 Var. 2511 Var. 2563 Var. 2615
1,1
Var. 2200 Var. 2252 Var. 2304 Var. 2356 Var. 2408 Var. 2460 Var. 2512 Var. 2564 Var. 2616
1,2
Var. 2201 Var. 2253 Var. 2305 Var. 2357 Var. 2409 Var. 2461 Var. 2513 Var. 2565 Var. 2617
13
Var. 2202 Var. 2254 Var. 2306 Var. 2358 Var. 2410 Var. 2462 Var. 2514 Var. 2566 Var. 2618
1,4
Var. 2203 Var. 2255 Var. 2307 Var. 2359 Var. 2411 Var. 2463 Var. 2515 Var. 2567 Var. 2619
1,5
Var. 2204 Var. 2256 Var. 2308 Var. 2360 Var. 2412 Var. 2464 Var. 2516 Var. 2568 Var. 2620
1,6
Var. 2205 Var. 2257 Var. 2309 Var. 2361 Var. 2413 Var. 2465 Var. 2517 Var. 2569 Var. 2621
1,7
Var. 2206 Var. 2258 Var. 2310 Var. 2362 Var. 2414 Var. 2466 Var. 2518 Var. 2570 Var. 2622
1,8
Var. 2207 Var. 2259 Var. 2311 Var. 2363 Var. 2415 Var. 2467 Var. 2519 Var. 2571 Var. 2623
1,9
Var. 2208 Var. 2260 Var. 2312 Var. 2364 Var. 2416 Var. 2468 Var. 2520 Var. 2572 Var. 2624
2
Var. 2209 Var. 2261 Var. 2313 Var. 2365 Var. 2417 Var. 2469 Var. 2521 Var. 2573 Var. 2625
NMT = No más de
imagen34
pH
NMT 5,6
NMT 5,8 NMT 6,0 NMT 6,2 NMT 6,4 NMT 6,6 NMT 6,8 NMT 7,0
Fuerza iónica (mS/cm)
0,1-2,0 Var. 2626 Var. 2678 Var. 2730 Var. 2782 Var. 2834 Var. 2886 Var. 2938 Var. 2990
0,1-1,9
Var. 2627 Var. 2679 Var. 2731 Var. 2783 Var. 2835 Var. 2887 Var. 2939 Var. 2991
0,1-1,8
Var. 2628 Var. 2680 Var. 2732 Var. 2784 Var. 2836 Var. 2888 Var. 2940 Var. 2992
0,1-1,7
Var. 2629 Var. 2681 Var. 2733 Var. 2785 Var. 2837 Var. 2889 Var. 2941 Var. 2993
0,1-1,6
Var. 2630 Var. 2682 Var. 2734 Var. 2786 Var. 2838 Var. 2890 Var. 2942 Var. 2994
0,1-1,5
Var. 2631 Var. 2683 Var. 2735 Var. 2787 Var. 2839 Var. 2891 Var. 2943 Var. 2995
0,1-1,4
Var. 2632 Var. 2684 Var. 2736 Var. 2788 Var. 2840 Var. 2892 Var. 2944 Var. 2996
0,1-1,3
Var. 2633 Var. 2685 Var. 2737 Var. 2789 Var. 2841 Var. 2893 Var. 2945 Var. 2997
0,1-1,2
Var. 2634 Var. 2686 Var. 2738 Var. 2790 Var. 2842 Var. 2894 Var. 2946 Var. 2998
0,1-1,1
Var. 2635 Var. 2687 Var. 2739 Var. 2791 Var. 2843 Var. 2895 Var. 2947 Var. 2999
0,1-1,0
Var. 2636 Var. 2688 Var. 2740 Var. 2792 Var. 2844 Var. 2896 Var. 2948 Var. 3000
0,1-0,9
Var. 2637 Var. 2689 Var. 2741 Var. 2793 Var. 2845 Var. 2897 Var. 2949 Var. 3001
0,1-0,8
Var. 2638 Var. 2690 Var. 2742 Var. 2794 Var. 2846 Var. 2898 Var. 2950 Var. 3002
0,2-2,0
Var. 2639 Var. 2691 Var. 2743 Var. 2795 Var. 2847 Var. 2899 Var. 2951 Var. 3003
0,2-1,5
Var. 2640 Var. 2692 Var. 2744 Var. 2796 Var. 2848 Var. 2900 Var. 2952 Var. 3004
0,2-1,0
Var. 2641 Var. 2693 Var. 2745 Var. 2797 Var. 2849 Var. 2901 Var. 2953 Var. 3005
0,2-0,9
Var. 2642 Var. 2694 Var. 2746 Var. 2798 Var. 2850 Var. 2902 Var. 2954 Var. 3006
0,2-0,8
Var. 2643 Var. 2695 Var. 2747 Var. 2799 Var. 2851 Var. 2903 Var. 2955 Var. 3007
0,3-1,0
Var. 2644 Var. 2696 Var. 2748 Var. 2800 Var. 2852 Var. 2904 Var. 2956 Var. 3008
03-0,9
Var. 2645 Var. 2697 Var. 2749 Var. 2801 Var. 2853 Var. 2905 Var. 2957 Var. 3009
0,3-0,8
Var. 2646 Var. 2698 Var. 2750 Var. 2802 Var. 2854 Var. 2906 Var. 2958 Var. 3010
0,4-1,0
Var. 2647 Var. 2699 Var. 2751 Var. 2803 Var. 2855 Var. 2907 Var. 2959 Var. 3011
0,4-0,9
Var. 2648 Var. 2700 Var. 2752 Var. 2804 Var. 2856 Var. 2908 Var. 2960 Var. 3012
0,4-0,8
Var. 2649 Var. 2701 Var. 2753 Var. 2805 Var. 2857 Var. 2909 Var. 2961 Var. 3013
0,5-1,0
Var. 2650 Var. 2702 Var. 2754 Var. 2806 Var. 2858 Var. 2910 Var. 2962 Var. 3014
0,5-0,9
Var. 2651 Var. 2703 Var. 2755 Var. 2807 Var. 2859 Var. 2911 Var. 2963 Var. 3015
0,5-0,8
Var. 2652 Var. 2704 Var. 2756 Var. 2808 Var. 2860 Var. 2912 Var. 2964 Var. 3016
0,6-1,0
Var. 2653 Var. 2705 Var. 2757 Var. 2809 Var. 2861 Var. 2913 Var. 2965 Var. 3017
0,6-0,9
Var. 2654 Var. 2706 Var. 2758 Var. 2810 Var. 2862 Var. 2914 Var. 2966 Var. 3018
0,6-0,8
Var. 2655 Var. 2707 Var. 2759 Var. 2811 Var. 2863 Var. 2915 Var. 2967 Var. 3019
0,7-1,0
Var. 2656 Var. 2708 Var. 2760 Var. 2812 Var. 2864 Var. 2916 Var. 2968 Var. 3020
0,7-0,9
Var. 2657 Var. 2709 Var. 2763 Var. 2813 Var. 2865 Var. 2917 Var. 2969 Var. 3021
0,1
Var. 2658 Var. 2710 Var. 2762 Var. 2814 Var. 2866 Var. 2918 Var. 2970 Var. 3022
0,2
Var. 2659 Var. 2711 Var. 2763 Var. 2815 Var. 2867 Var. 2919 Var. 2971 Var. 3023
03
Var. 2660 Var. 2712 Var. 2764 Var. 2816 Var. 2868 Var. 2920 Var. 2972 Var. 3024
0,4
Var. 2661 Var. 2713 Var. 2765 Var. 2817 Var. 2869 Var. 2921 Var. 2973 Var. 3025
0,5
Var. 2662 Var. 2714 Var. 2766 Var. 2818 Var. 2870 Var. 2922 Var. 2974 Var. 3026
0,6
Var. 2663 Var. 2715 Var. 2767 Var. 2819 Var. 2871 Var. 2923 Var. 2975 Var. 3027
0,7
Var. 2664 Var. 2716 Var. 2768 Var. 2820 Var. 2872 Var. 2924 Var. 2976 Var. 3028
0,8
Var. 2665 Var. 2717 Var. 2769 Var. 2821 Var. 2873 Var. 2925 Var. 2977 Var. 3029
0,9
Var. 2666 Var. 2718 Var. 2770 Var. 2822 Var. 2874 Var. 2926 Var. 2978 Var. 3030
1
Var. 2667 Var. 2719 Var. 2771 Var. 2823 Var. 2875 Var. 2927 Var. 2979 Var. 3031
1,1
Var. 2668 Var. 2720 Var. 2772 Var. 2824 Var. 2876 Var. 2928 Var. 2980 Var. 3032
1,2
Var. 2669 Var. 2721 Var. 2773 Var. 2825 Var. 2877 Var. 2929 Var. 2981 Var. 3033
1,3
Var. 2670 Var. 2722 Var. 2774 Var. 2826 Var. 2878 Var. 2930 Var. 2982 Var. 3034
1,4
Var. 2671 Var. 2723 Var. 2775 Var. 2827 Var. 2879 Var. 2931 Var. 2983 Var. 3035
1,5
Var. 2672 Var. 2724 Var. 2776 Var. 2828 Var. 2880 Var. 2932 Var. 2984 Var. 3036
1,6
Var. 2673 Var. 2725 Var. 2777 Var. 2829 Var. 2881 Var. 2933 Var. 2985 Var. 3037
1,7
Var. 2674 Var. 2726 Var. 2778 Var. 2830 Var. 2882 Var. 2934 Var. 2986 Var. 3038
1,8
Var. 2675 Var. 2727 Var. 2779 Var. 2831 Var. 2883 Var. 2935 Var. 2987 Var. 3039
1,9
Var. 2676 Var. 2728 Var. 2780 Var. 2832 Var. 2884 Var. 2936 Var. 2988 Var. 3040
2
Var. 2677 Var. 2729 Var. 2781 Var. 2833 Var. 2885 Var. 2937 Var. 2989 Var. 3041
NMT = No más de
imagen35
A. Procedimientos de fraccionamiento de precipitación de alcohólico modificado/cromatografía de intercambio iónico
En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos mejorados para la fabricación de composiciones de
5 IgG adecuadas para su uso en tratamiento con IVIG. En general, estos procedimientos proporcionan preparaciones de IgG que tiene mayores rendimientos y pureza comparable, si no mayor, que los procedimientos actuales empleados para la producción de productos de IVIG comerciales.
En un aspecto específico, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de IgG concentrada de plasma, por ejemplo, IVIG al 10 %, comprendiendo el procedimiento realizar al menos una etapa de precipitación de alcohol y al menos una etapa de cromatografía de intercambio iónico. En particular, varias etapas en el proceso previo mejorado son diferentes de los procedimientos anteriores, por ejemplo, el uso de etanol al 25 % a temperaturas menores, adición de etanol por pulverización, ajuste de pH por pulverización y el uso de partículas de sílice finamente dividido.
15 En un determinado modo de realización, el procedimiento comprende las etapas de (a) precipitar una fracción de plásmido desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación, con alcohol entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 10 % a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para obtener un sobrenadante enriquecido en IgG, (b) precipitar IgG del sobrenadante con alcohol entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 30 % a una temperatura menor y a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para formar un primer precipitado, (c) resuspender el primer precipitado formado en la etapa (b) para formar una suspensión, (d) tratar la suspensión formada en la etapa (c) con un detergente, (e) precipitar IgG de la suspensión con alcohol entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 30 % a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para formar un segundo precipitado, (f) resuspender el segunda precipitado formado en la
25 etapa (e) para formar una suspensión, (g) tratar la suspensión formada en la etapa (f) con un disolvente y/o detergente, y (h) realizar al menos un fraccionamiento por cromatografía de intercambio iónico preparando de este modo una composición de IgG concentrada. En un modo de realización, el procedimiento comprende además tratar la suspensión formada en la etapa (c) con dióxido de sílice (SiO2) finamente dividido y filtrar la solución anterior a la etapa (d).
En un modo de realización, se proporciona un procedimiento para preparar una composición de IgG concentrada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) ajustar el pH de una fracción de plasma desprovisto de crioprecipitado hasta aproximadamente 7,0, (b) ajustar la concentración de etanol de la fracción de plasma desprovisto de crioprecipitado de la etapa (a) hasta un o aproximadamente un 25 % (v/v) a una temperatura entre 35 aproximadamente -5 ºC y aproximadamente -9 ºC, formando de este modo una mezcla, en el que la concentración de etanol se puede ajustar por pulverización, (c) separar líquido y precipitado de la mezcla de la etapa (b), (d) resuspender el precipitado de la etapa (c) con un tampón que contiene fosfato y acetato, en el que el pH del tampón se ajusta con entre aproximadamente 400 y aproximadamente 700 ml de ácido acético glacial por 1000 l de tampón, formando de este modo una suspensión, (e) mezclar dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido con la suspensión de la etapa (d) durante al menos aproximadamente 30 minutos, (f) filtrar la suspensión con un filtro-prensa, formando de este modo un filtrado, (g) lavar el filtro-prensa con al menos 3 volúmenes muertos de filtro-prensa de un tampón que contiene fosfato y acetato, en el que el pH del tampón se ajusta con aproximadamente 150 ml de ácido acético glacial por 1000 l de tampón, formando de este modo una solución de lavado, (h) combinar el filtrado de la etapa (f) con la solución de lavado de la etapa (g), formando de este modo una solución, y tratar la solución con un detergente, (i) 45 ajustar el pH de la solución de la etapa (h) hasta aproximadamente 7,0 y añadir etanol hasta una concentración final de un o aproximadamente un 25 %, formando de este modo un precipitado, en el que la concentración de etanol y/o el pH se pueden ajustar por pulverización (j) separar líquido y precipitado de la mezcla de la etapa (i), (k) disolver el precipitado en una solución acuosa que comprende un disolvente o detergente y mantener la solución durante al menos 60 minutos, (1) hacer pasar la solución después de la etapa (k) a través de una columna de cromatografía de intercambio catiónico y eluir las proteínas absorbidas en la columna en un eluato, (m) hacer pasar el eluato de la etapa (1) a través de una columna de cromatografía de intercambio aniónico para generar un efluente (es decir, flujo a través), (n) hacer pasar el efluente de la etapa (m) a través de un nanofiltro para generar un nanofiltrado, (o) hacer pasar el nanofiltrado de la etapa (n) a través de una membrana de ultrafiltración para generar un ultrafiltrado, y (p) someter a diafiltración el ultrafiltrado de la etapa (o) contra un tampón de diafiltración para generar un diafiltrado que
55 tiene una concentración de proteína entre aproximadamente un 8 % (p/v) y aproximadamente un 22 % (p/v), obteniendo de este modo una composición de IgG concentrada. En un modo de realización, la temperatura de la etapa (b) es de o aproximadamente de -7 ºC. En un modo de realización específico, el tampón de suspensión en la etapa (d) se ajusta con aproximadamente 600 ml de ácido acético glacial.
En determinados modos de realización, el diafiltrado tendrá una concentración de proteínas entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 12 %, por ejemplo, aproximadamente un 8 %, o aproximadamente un 9 %, 10 %, 11 %, o 12 %. En un modo de realización preferente, el diafiltrado tendrá una concentración de proteína de un o aproximadamente un 10 %. En otro modo de realización preferente, el diafiltrado tendrá una concentración de proteína de un o aproximadamente un 11 %. Aún en otro modo de realización preferente, el diafiltrado tendrá una 65 concentración de proteína de un o aproximadamente un 12 %. En otros modos de realización, el diafiltrado tendrá una
imagen36
concentración de proteína entre aproximadamente un 13 % y aproximadamente un 17 %, por ejemplo, aproximadamente un 13 %, o aproximadamente un 14 %, 15 %, 16 %, o 17 %. Aún en otros modos de realización, el diafiltrado tendrá una concentración de proteína entre aproximadamente un 18 % y aproximadamente un 22 %, por ejemplo, aproximadamente un 18 %, o aproximadamente un 19 %, 20 %, 21 %, o 22 %. En un modo de realización
5 preferente, el diafiltrado tendrá una concentración de proteína de un o aproximadamente un 20 %. En otro modo de realización preferente, el diafiltrado tendrá una concentración de proteína de un o aproximadamente un 21 %. Aún en otro modo de realización preferente, el diafiltrado tendrá una concentración de proteína de un o aproximadamente un 22 %.
En determinados modos de realización de la presente invención, los procedimientos proporcionados en el presente documento pueden comprender mejoras en dos o más de las etapa del procedimiento de fraccionamiento descritas anteriormente. Por ejemplo, los modos de realización pueden incluir mejoras en la etapa de precipitación, la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada, la etapa de disolución de la fracción II+III modificada, y/o la etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada.
15 En un modo de realización, la mejora realizada en la primera etapa de precipitación es la adición de alcohol por pulverización. En otro modo de realización, la mejora realizada en la primera etapa de precipitación es la adición de un agente modificador de pH por pulverización. Aún en otro modo de realización, la mejora realizada en la primera etapa de precipitación es el ajuste del pH de la solución después de la adición del alcohol. En un modo de realización relacionado, la mejora realizada en la primera etapa de precipitación es el mantenimiento del pH de la solución durante la adición del alcohol. En otro modo de realización relacionado, la mejora realizada en la primera etapa de precipitación es el mantenimiento del pH durante el tiempo de incubación de precipitación ajustando de forma continua el pH de la solución. En determinados modos de realización, la primera etapa de precipitación se puede mejorar implementando más de una de estas mejoras. Otras mejoras que se pueden producir en esta etapa serán
25 evidentes a partir de la sección proporcionada a continuación que analiza la primera etapa de precipitación (Fraccionamiento I modificado). Al implementar una o más de las mejoras descritas anteriormente, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de precipitado de la primera etapa de precipitación y/o se desnaturaliza de forma irreversible una fracción reducida de IgG durante la etapa de precipitación.
En un modo de realización, la mejora realizada en la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada es la adición de alcohol por pulverización. En otro modo de realización, la mejora realizada en la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada es la adición de un agente modificador de pH por pulverización. Aún en otro modo de realización, la mejora realizada en la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada es el ajuste del pH de la solución después de la adición del alcohol. En un modo de realización relacionado, la mejora realizada en la etapa de 35 precipitación de la fracción II+III modificada es el mantenimiento del pH de la solución durante la adición del alcohol. En otro modo de realización relacionado, la mejora realizada en la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada es el mantenimiento del pH durante el tiempo de incubación de precipitación ajustando de forma continua el pH de la solución. En otro aspecto, la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada se mejora incrementando la concentración de alcohol hasta un o aproximadamente un 25 %. Aún en otro modo de realización, la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada se mejora disminuyendo la temperatura de incubación hasta entre aproximadamente -7 ºC y -9 ºC. En determinados modos de realización, la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada se puede mejorar implementando más de una de estas mejoras. Otras mejoras que se pueden producir en esta etapa serán evidentes a partir de la sección proporcionada a continuación que analiza la segunda etapa de precipitación (Fraccionamiento II+III modificado). Al implementar una o más de las mejoras descritas
45 anteriormente, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción sobrenadante de la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada y/o se desnaturaliza de forma irreversible una fracción reducida de IgG durante la etapa de precipitación.
En un modo de realización, la mejora realizada en la etapa de disolución de la fracción II+III modificada se logra incrementando el contenido en ácido acético glacial del tampón de disolución hasta aproximadamente un 0,06 %. En otro modo de realización, la mejora realizada en la etapa de disolución de la fracción II+III modificada se logra manteniendo el pH de la solución durante el tiempo de incubación de disolución ajustando de forma continua el pH de la solución. En otro modo de realización, la mejora realizada en la etapa de disolución de la facción II+III modificada se logra mezclando dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido con la suspensión de la fracción II+III antes de la
55 filtración. En determinados modos de realización, la etapa de disolución de la fracción II+III modificada se puede mejorar implementando más de una de estas mejoras. Otras mejoras que se pueden producir en esta etapa serán evidentes a partir de la sección proporcionada a continuación que analiza la etapa de disolución de la fracción II+III modificada (Extracción del precipitado de la fracción II+III modificada). Al implementar una o más de las mejoras descritas anteriormente, se recupera una cantidad incrementada de IgG en la suspensión de la fracción II+III y/o se reduce la cantidad de impurezas en la suspensión de la fracción II+III.
Una mejora de ejemplo realizada en la etapa de filtración de la suspensión de la fracción II+III modificada se produce lavando posteriormente el filtro con al menos aproximadamente 3,6 volúmenes muertos de un tampón de disolución que contiene o que contiene aproximadamente 150 ml de ácido acético glacial por 1000 l. Otras mejoras que se 65 pueden producir en esta etapa serán evidentes a partir de la sección proporcionada a continuación que analiza la
imagen37
etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada (Pretratamiento y filtración de la suspensión de la fracción II+III modificada). Al implementar una o más de las mejoras descritas anteriormente, se pierde una cantidad reducida de IgG durante la etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada. En un modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la primera etapa de precipitación y la
5 etapa de precipitación de la fracción II+III modificada.
En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la primera etapa de precipitación y la etapa de disolución de la fracción II+III modificada.
10 En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la primera etapa de precipitación y la etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada.
En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada y la etapa de disolución de la fracción II+III modificada.
15 En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada y la etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada.
En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la etapa de disolución de la fracción 20 II+III modificada y la etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada.
En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la primera etapa de precipitación, la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada y la etapa de disolución de la fracción II+III modificada.
25 En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la primera etapa de precipitación, la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada y la etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada.
En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la primera etapa de precipitación, la 30 etapa de disolución de la fracción II+III modificada y la etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada.
En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada, la etapa de disolución de la fracción II+III modificada y la etapa de filtración de suspensión 35 de la fracción II+III modificada.
En otro modo de realización, el procedimiento puede comprender una mejora en la totalidad de la primera etapa de precipitación, la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada, la etapa de disolución de la fracción II+III modificada y la etapa de filtración de suspensión de la fracción II+III modificada.
40 En determinados modos de realización, una mejora del procedimiento en los procedimientos de purificación de IgG proporcionados en el presente documento comprende la adición por pulverización de una o más soluciones que se introducirían de otro modo en una fracción de plasma por adición de fluyente. Por ejemplo, en determinados modos de realización la mejora del procedimiento comprende la adición de alcohol (por ejemplo, etanol) en una fracción de
45 plasma para los propósitos de precipitación de una o más especies de proteínas por pulverización. En otros modos de realización, las soluciones que se pueden añadir a una fracción de plasma por pulverización incluyen, sin limitación, una solución modificadora de pH, una solución de disolvente, una solución de detergente, un tampón de dilución, una solución modificadora de conductividad, y similares. En un modo de realización preferente, se realizan una o más etapas de precipitación por la adición de alcohol a una fracción de plasma por pulverización. En un segundo modo de
50 realización preferente, se realizan una o más etapas de ajuste de pH por la adición de una solución modificadora de pH a una fracción de plasma por pulverización.
En determinados modos de realización, otra mejora del procedimiento, que se pueden combinar con cualquier otra mejora del procedimiento, comprende el ajuste del pH de una fracción de plasma que se precipita después de y/o
55 concomitante con la adición del agente de precipitación (por ejemplo, alcohol o polietilenglicol). En algunos modos de realización, se proporciona una mejora del procedimiento en la que el pH de una fracción de plasma que se precipita activamente se mantiene en toda la etapa completa de incubación de precipitación o retención por la monitorización continua y el ajuste del pH. En modos de realización preferentes, el ajuste del pH se realiza por la adición por pulverización de una solución modificadora de pH.
60 En otros modos de realización, otra mejora del procedimiento, que se puede combinar con cualquier otra mejora del procedimiento, comprende el uso de una etapa de tratamiento de sílice finamente dividido para retirar impurezas.
1. Preparación de plasma desprovisto de crioprecipitado
65 El material de partida usado para la preparación de composiciones de IgG concentradas consiste en general en plasma recuperado (es decir, plasma que se ha separado de sangre completa ex vivo) o bien plasma de fuente (es decir, plasma recogido por medio de plasmaféresis). Típicamente, el procedimiento de purificación comienza descongelando mezcla de plasmas previamente congelados, lo que ya se ha sometido a ensayo para determinar las
imagen38
5 consideraciones de seguridad y calidad. Típicamente, se lleva a cabo la descongelación a una temperatura no mayor de 6 ºC. Después de una descongelación completa del plasma congelado a baja temperatura, se realiza la centrifugación en frío (por ejemplo, ≤ 6 ºC) para separar los crioprecipitados sólidos del sobrenadante líquido. De forma alternativa, se puede realizar la etapa de separación por filtración en vez de centrifugación. El sobrenadante líquido (también denominado "plasma desprovisto de crioprecipitado”, después de que se retiren las proteínas insolubles en frío por centrifugación del plasma recién descongelado) se procesa a continuación en la siguiente etapa. Se pueden tomar varias etapas adicionales en este momento para el aislamiento de la actividad de derivación inhibidora del factor ocho (FEIBA), complejo de factor IX, concentrado de factor Vll, o complejo de antitrombina III.
2. Primer acontecimiento de precipitación -Fraccionamiento I modificado
15 En esta etapa, típicamente se enfría el plasma desprovisto de crioprecipitado hasta aproximadamente 0 ± 1 ºC y se ajusta el pH hasta entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5, preferentemente entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,3, lo más preferentemente a aproximadamente 7,2. En un modo de realización, se ajusta el pH del plasma desprovisto de crioprecipitado hasta un pH de o de aproximadamente 7,2. A continuación, se añade el etanol preenfriado mientras que se agita el plasma hasta una concentración objetivo de etanol a un o aproximadamente a un 8 % v/v. Al mismo tiempo, se reduce adicionalmente la temperatura hasta entre aproximadamente -4 y aproximadamente 0 ºC. En un modo de realización preferente, se reduce la temperatura hasta
o aproximadamente hasta -2 ºC, para precipitar contaminantes tales como α2-macrogIobulina, β1C-y β1C-globulina, fibrinógeno, y factor VIII. Típicamente, el acontecimiento de precipitación incluirá un tiempo de retención de al menos
25 aproximadamente 1 hora, aunque también se pueden emplear tiempos de retención más cortos o más largos. Posteriormente, se recoge a continuación el sobrenadante (sobrenadante I), que contiene idealmente la totalidad del contenido en IgG presente en el plasma desprovisto de crioprecipitado, por centrifugación, filtración, u otro procedimiento adecuado.
En comparación con procedimientos convencionales empleados como primera etapa de fraccionamiento para el plasma desprovisto de crioprecipitado (Cohn et al, supra; Oncley et al, supra), la presente invención proporciona, en diversos modos de realización, procedimientos que dan como resultado una mejora en los rendimientos de IgG en la fracción I de sobrenadante. En un modo de realización, la mejora en el rendimiento de IgG se logra añadiendo el alcohol por pulverización. En otro modo de realización, la mejora en el rendimiento de IgG se logra añadiendo un
35 agente modificador de pH por pulverización. Aún en otro modo de realización, la mejora en el rendimiento de IgG se logra ajustando el pH de la solución después de la adición del alcohol. en un modo de realización relacionado, la mejora en el rendimiento de IgG se logra ajustando el pH de la solución durante la adición del alcohol.
En un aspecto específico, la mejora se refiere a un procedimiento en el que se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de precipitado de la primera etapa de precipitación. Por ejemplo, en determinados modos de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de precipitado de la primera etapa de precipitación en comparación con la cantidad de IgG perdida en la primera etapa de precipitación del protocolo del procedimiento 6 de Cohn.
45 En determinados modos de realización, la mejora del procedimiento se produce ajustando el pH de la solución hasta entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5 después de la adición del alcohol en precipitación. En otros modos de realización, se ajusta el pH de la solución hasta entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,3 después de la adición del alcohol en precipitación. Aún en otros modos de realización, se ajusta el pH de la solución hasta aproximadamente 7,0 o aproximadamente 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, o 7,5 después de la adición del alcohol en precipitación. En un modo de realización particular, se ajusta el pH de la solución hasta aproximadamente 7,2 después de la adición del alcohol en precipitación. Como tal, en determinados modos de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de precipitado de la primera etapa de precipitación en comparación con una etapa de precipitación análoga en la que se ajusta el pH de la solución antes pero no después de la adición del alcohol en precipitación. En un modo de realización, se mantiene el pH al pH deseado durante el tiempo de retención
55 o de incubación de la precipitación ajustando de forma continua el pH de la solución. En un modo de realización, el alcohol es etanol.
En otros modos de realización determinados, la mejora del procedimiento se produce añadiendo el alcohol en precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por pulverización, en vez de por adición de fluyente. Como tal, en determinados modos de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de precipitado de la primera etapa de precipitación en comparación con una etapa de precipitación análoga en la que se introduce el alcohol y/o solución usados para ajustar el pH por adición de fluyente. En un modo de realización, el alcohol es etanol.
Aún en otros modos de realización determinados, la mejora se produce ajustando el pH de la solución hasta entre 65 aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5. En un modo de realización preferente, se ajusta el pH de la solución hasta entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,3. En otros modos de realización, se ajusta el pH de la solución hasta o aproximadamente hasta 7,0, 7,1, 7,2, 7,3,7,4, o 7,5 después de la adición del alcohol en precipitación y añadiendo el alcohol en precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por pulverización, en vez de por adición de fluyente. En un modo de realización particular, se ajusta el pH de la solución hasta o aproximadamente
imagen39
5 hasta 7,2 después de la adición del alcohol en precipitación y añadiendo el alcohol en precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por pulverización, en vez de por adición de fluyente. En un modo de realización, el alcohol es etanol.
3. Segundo acontecimiento de precipitación -Fraccionamiento II+III modificado
Para enriquecer adicionalmente el contenido en IgG y la pureza del fraccionamiento, se somete el sobrenadante I a una segunda etapa de precipitación, que es un fraccionamiento de la fracción II+III de Cohn-Oncley modificado. En general, se ajusta el pH de la solución hasta un pH de entre aproximadamente 6,6 y aproximadamente 6,8. En un modo de realización preferente, se ajusta el pH de la solución hasta o aproximadamente hasta 6,7. A continuación, se
15 añade alcohol, preferentemente etanol, a la solución mientras que se agita hasta una concentración final de entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 25 % (v/v) para precipitar la IgG en la fracción. En un modo de realización preferente, se añade alcohol hasta una concentración final de un o aproximadamente de un 25 % (v/v) para precipitar la IgG en la fracción. En general, los contaminantes tales como α1-lipoproteína, α1-antitripsina, Gc-globulinas, α1x-glucoproteína, haptoglobulina, ceruloplasmina, transferrina, hemopexina, una fracción del factor de Christmas, globulina de unión a tiroxina, colinesterasa, hipertensinógeno, y albúmina no se precipitarán por estas condiciones.
Antes de o concomitante con la adición de alcohol, se enfría adicionalmente la solución hasta entre aproximadamente -7 ºC y aproximadamente -9 ºC. En un modo de realización preferente, se enfría la solución hasta una temperatura de 25 o aproximadamente de -7 ºC. Después de la finalización de la adición de alcohol, se ajusta de inmediato el pH de la solución hasta entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,0. En un modo de realización preferente, se ajusta el pH de la solución hasta o aproximadamente hasta 6,9. Típicamente, el acontecimiento de precipitación incluirá un tiempo de retención de al menos aproximadamente 30 horas, aunque también se pueden emplear tiempos de retención más cortos o más largos. Posteriormente, el precipitado (Fracción II+III modificada), que contiene idealmente al menos aproximadamente un 85 %, preferentemente al menos aproximadamente un 90 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 %, del contenido en IgG presente en el plasma desprovisto de crioprecipitado, se separa del sobrenadante por centrifugación, filtración, u otro procedimiento adecuado y se recoge. En comparación con procedimientos convencionales empleados como segunda etapa de fraccionamiento para el plasma desprovisto de crioprecipitado (Cohn et al, supra; Oncley et al, supra), la presente invención proporciona, en
35 diversos modos de realización, procedimientos que dan como resultado una mejora en los rendimientos de IgG en el precipitado de la fracción II+III modificada. En un modo de realización relacionado, la presente invención proporciona procedimientos que dan como resultado una pérdida reducida de IgG en el sobrenadante de II+III modificada.
En comparación con procedimientos convencionales empleados como segunda etapa de fraccionamiento para el plasma desprovisto de crioprecipitado (Cohn et al, supra; Oncley et al, supra), la presente invención proporciona, en diversos modos de realización, procedimientos que dan como resultado una mejora en los rendimientos de IgG en el precipitado de la fracción II+III modificada. En un modo de realización, la mejora se produce por la adición de alcohol por pulverización. En otro modo de realización, la mejora se produce por la adición de un agente modificador de pH por pulverización. En otro modo de realización, la mejora se produce ajustando el pH de la solución después de la
45 adición del alcohol. En un modo de realización relacionado, la mejora se produce ajustando el pH de la solución durante la adición del alcohol. En otro modo de realización, la mejora se produce incrementando concentración de alcohol (por ejemplo, etanol) hasta aproximadamente un 25 % (v/v). En otro modo de realización, la mejora se produce disminuyendo la temperatura de la etapa de precipitación hasta entre aproximadamente -7 ºC y -9 ºC. En un modo de realización preferente, la mejora se produce incrementando la concentración de alcohol (por ejemplo, etanol) hasta aproximadamente un 25 % (v/v) y disminuyendo la temperatura hasta entre aproximadamente -7 ºC y -9 ºC. En comparación, tanto Cohn et al. como Oncley et al realizan la precipitación a -5 ºC y Oncley et al. usan alcohol al 20 %, para reducir el nivel de contaminantes en el precipitado. De forma ventajosa, los procedimientos proporcionados en el presente documento permiten un rendimiento máximo de IgG sin niveles altos de contaminación en el producto final.
55 Se ha descubierto que cuando se ajusta el pH de la solución hasta un pH de aproximadamente 6,9 antes de la adición del alcohol en precipitación, el pH de la solución se desplaza de 6,9 a entre aproximadamente 7,4 y aproximadamente 7,7, debido en parte a la precipitación de proteína (véase la figura 8). A medida que el pH de la solución se aleja de 6,9, la precipitación de IgG se vuelve menos favorable y la precipitación de determinados contaminantes se vuelve más favorable. De forma ventajosa, los inventores han descubierto que ajustando el pH de la solución después de la adición del alcohol en precipitación, se recupera un mayor porcentaje de IgG en el precipitado de la fracción II+III.
En consecuencia, en un aspecto, la mejora se refiere a un procedimiento en el que se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de sobrenadante de la etapa de precipitación de la fracción II+III modificada. En otras palabras, 65 un incremento en el porcentaje de la IgG de partida está presente en el precipitado de la fracción II+III. En determinados modos de realización, la mejora del procedimiento se produce ajustando el pH de la solución hasta entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,1 inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación. En otro modo de realización, la mejora del procedimiento se produce manteniendo el pH de la solución hasta entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,1 de forma continua durante el periodo de incubación de 5 precipitación. En otros modos de realización, se ajusta el pH de la solución hasta entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,0 inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación, o hasta un pH de aproximadamente 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, o 7,1 inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación. En un modo de realización particular, se ajusta el pH de la solución hasta aproximadamente 6,9 inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación. En determinados modos de realización, se mantiene el pH de la solución a entre aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,0 de forma continua durante el periodo de incubación de precipitación, o a un pH de aproximadamente 6,9 de forma continua durante el periodo de incubación de precipitación. Como tal, en determinados modos de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de sobrenadante de la segunda etapa de precipitación en comparación con una etapa de precipitación análoga en la que se ajusta el pH de la solución antes pero no después de la adición del alcohol en precipitación o
imagen40
15 con una etapa de precipitación análoga en la que no se mantiene el pH de la solución durante la totalidad del periodo de incubación de precipitación. En un modo de realización, se mantiene el pH al pH deseado durante el tiempo de retención o de incubación de la precipitación ajustando de forma continua el pH de la solución. En un modo de realización, el alcohol es etanol.
En otro modo de realización, la mejora del procedimiento se produce añadiendo el alcohol en precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por pulverización, en vez de por adición de fluyente. Como tal, en determinados modos de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de sobrenadante de la segunda etapa de precipitación en comparación con una etapa de precipitación análoga en la que se introduce el alcohol y/o solución usados para ajustar el pH por adición de fluyente. En un modo de realización, el alcohol es etanol.
25 En otro modo de realización, la mejora del procedimiento se produce realizando la etapa de precipitación a una temperatura entre aproximadamente -7 ºC y aproximadamente -9 ºC. En un modo de realización, la etapa de precipitación se realiza a una temperatura de o aproximadamente de -7 ºC. En otro modo de realización, la etapa de precipitación se realiza a una temperatura de o aproximadamente de -8 ºC. En otro modo de realización, la etapa de precipitación se realiza a una temperatura de o aproximadamente de -9 ºC. En determinados modos de realización, la concentración de alcohol de la etapa de precipitación está entre aproximadamente un 23 % y aproximadamente un 27 %. En un modo de realización preferente, la concentración de alcohol está entre aproximadamente un 24 % y aproximadamente un 26 %. En otro modo de realización preferente, la concentración de alcohol es de un o aproximadamente de un 25 %. En otros modos de realización, la concentración de alcohol puede estar en un o
35 aproximadamente en un 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, o 27 %. En un modo de realización particular, la segunda etapa de precipitación se realiza a una temperatura de o aproximadamente de -7 ºC con una concentración de alcohol de un o aproximadamente un 25 %. En un modo de realización, el alcohol es etanol.
El efecto del incremento de la concentración de alcohol de la segunda precipitación de un 20 %, usado en Oncley et at., supra, a un 25 % y la disminución de la temperatura de la incubación de -5 ºC, usado en los procedimientos de Cohn y Oncley, a o aproximadamente a -7 ºC es un incremento de un 5 % a un 6 % en el contenido de IgG del precipitado de la fracción II+III modificado.
En otro modo de realización, la mejora del procedimiento se produce ajustando el pH de la solución hasta entre
45 aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,1, preferentemente a o aproximadamente a 6,9, inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación, manteniendo el pH de la solución a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,1, preferentemente a o aproximadamente a 6,9, ajustando de forma continua el pH durante el periodo de incubación de precipitación, y añadiendo el alcohol en precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por pulverización, en vez de por adición de fluyente. En otro modo de realización particular, la mejora del procedimiento se produce realizando la etapa de precipitación a una temperatura entre aproximadamente -7 ºC y aproximadamente -9 ºC, preferentemente a o aproximadamente a -7 ºC y precipitando la IgG con una concentración de alcohol de entre aproximadamente un 23 % y aproximadamente un 27 %, preferentemente a un o aproximadamente a un 25 %. Aún en otro modo de realización particular, la mejora del procedimiento se produce incorporando todas las mejoras de la fracción II+III modificada proporcionadas
55 anteriormente. En un modo de realización preferente, la mejora del procedimiento se produce precipitando IgG a una temperatura de o aproximadamente de -7 ºC con etanol a un o aproximadamente a un 25 % añadido por pulverización y a continuación ajustando el pH de la solución hasta o aproximadamente hasta 6,9 después de la adición del alcohol en precipitación. Aún en otro modo de realización preferente, el pH de la solución se mantiene a o aproximadamente a 6,9 durante la totalidad del periodo de incubación o de retención de precipitación.
4. Extracción del precipitado de la fracción II+III modificada
Para solubilizar el contenido en IgG del precipitado de la fracción II+III modificada, se usa un tampón de extracción en frío para resuspender el precipitado del fraccionamiento II+III en una proporción típica de 1 parte de precipitado con
65 respecto a 15 partes del tampón de extracción. Se pueden usar otras proporciones de resuspensión adecuadas, por ejemplo de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 1:30, o de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:20, o de aproximadamente 1:12 a aproximadamente 1:18, o de aproximadamente 1:13 a aproximadamente 1:17, o de aproximadamente 1:14 a aproximadamente 1:16. En determinados modos de realización, la proporción de resuspensión puede ser de aproximadamente 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20,
imagen41
5 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, o mayor.
En general, las soluciones adecuadas para la extracción del precipitado II+III modificado tendrán un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,5. En determinados modos de realización, la solución tendrá un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,0, en otros modos de realización, la solución de extracción tendrá un pH de aproximadamente 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 o 5,5. En un modo de realización preferente, el pH del tampón de extracción será de o aproximadamente de 4,5. En otro modo de realización preferente, el pH del tampón de extracción será de o aproximadamente de 4,7. En otro modo de realización preferente, el pH del tampón de extracción será de o aproximadamente de 4,9. En general, estos requisitos de pH se pueden cumplir usando un agente de tamponación seleccionado de, por ejemplo, acetato, citrato,
15 fosfato monobásico, fosfato dibásico, mezclas de los mismos, y similares. Típicamente, las concentraciones de tampón adecuadas varían de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mM, o de agente tamponador aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mM.
Preferentemente, el tampón de extracción tendrá una conductividad de desde aproximadamente 0,5 mS·cm-1 a aproximadamente 2,0 mS·cm-1. Por ejemplo, en determinados modos de realización, la conductividad del tampón de extracción será de aproximadamente 0,5 mS·cm-1, o aproximadamente 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, o aproximadamente 2,0 mS·cm-1 . Un experto en la técnica sabrá cómo generar tampones de extracción que tengan una conductividad apropiada.
25 En un modo de realización particular, un tampón de extracción de ejemplo puede contener fosfato de sodio monobásico 5 mM o aproximadamente 5 mM y acetato 5 mM o aproximadamente 5 mM a un pH de o aproximadamente de 4,5 ± 0,2 y conductividad de o aproximadamente de 0,7 a 0,9 mS/cm.
En general, la extracción se realiza a entre aproximadamente 6 ºC y aproximadamente 10 ºC, o entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC. En determinados modos de realización, la extracción se puede realizar a aproximadamente 0 ºC, 1 ºC, 2 ºC, 3 ºC, 4 ºC, 5 ºC, 6 ºC, 1 ºC, 8 ºC, 9 ºC, o 10 ºC. En un modo de realización particular, la extracción se realiza a entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 10 ºC. Típicamente, el procedimiento de extracción proseguirá durante entre aproximadamente 60 y aproximadamente 300 minutos, o
35 durante entre aproximadamente 120 y 240 min, o durante entre aproximadamente 150 y 210 minutos, mientras que se agita de forma continua la suspensión. En determinados modos de realización, el procedimiento de extracción proseguirá durante aproximadamente 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180,190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, o aproximadamente 300 minutos. En un modo de realización preferente, el procedimiento de extracción proseguirá durante al menos 160 minutos con agitación continua.
Se ha descubierto que empleando un tampón de extracción que contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM, y ácido acético glacial de un 0,051 % a un 0,06 % (v/v), a se puede obtener un incremento sustancial en el incremento del rendimiento en la composición de IgG final sin poner en peligro la pureza del producto final. La correlación de la cantidad de ácido acético y el pH del tampón de extracción se demuestra en la figura 9. En un modo
45 de realización preferente, se extrae el precipitado de la fracción II+III con una proporción de pasta con respecto a tampón de o aproximadamente de 1:15 a un pH de o aproximadamente de 4,5 ± 0,2.
De forma ventajosa, se ha descubierto que en comparación con el procedimiento de fabricación actual para GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare), que emplea un tampón de extracción que contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM, y ácido acético glacial al 0,051 % (v/v), que incrementando el contenido en ácido acético glacial hasta un o aproximadamente hasta un 0,06 % (v/v), se puede obtener un incremento sustancial en el incremento del rendimiento en la composición de IgG final. En comparación con procedimientos empleados previamente para la extracción del precipitado formado por la segunda etapa de precipitación (GAMMAGARD® LIQUID), la presente invención proporciona, en varios modos de realización, procedimientos que dan como resultado
55 rendimientos de IgG mejorados en la suspensión de la fracción II+III modificada.
En un aspecto, la mejora se refiere a un procedimiento en el que se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción no solubilizada del precipitado de la fracción II+III modificada. En un modo de realización, la mejora del procedimiento se produce extrayendo el precipitado de la fracción II+III modificada en una proporción de 1:15 (precipitado con respecto al tampón) con una solución que contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM, y ácido acético glacial al 0,06 % (v/v). En otro modo de realización, la mejora se produce manteniendo el pH de la solución durante la duración del procedimiento de extracción. En un modo de realización, el pH de la solución se mantiene a entre aproximadamente 4,1 y aproximadamente 4,9 durante la duración del procedimiento de extracción. En un modo de realización preferente, el pH de la solución se mantiene a entre aproximadamente 4,2 y 65 aproximadamente 4,8 durante la duración del procedimiento de extracción. En un modo de realización más
imagen42
preferente, el pH de la solución se mantiene a entre aproximadamente 4,3 y aproximadamente 4,7 durante la duración del procedimiento de extracción. En otro modo de realización preferente, el pH de la solución se mantiene a entre aproximadamente 4,4 y aproximadamente 4,6 durante la duración del procedimiento de extracción. Aún en otro modo de realización preferente, el pH de la solución se mantiene a o aproximadamente a 4,5 durante la duración del
5 procedimiento de extracción.
En otro aspecto, la mejora se refiere a un procedimiento en el que se solubiliza una cantidad incrementada de IgG del precipitado de la fracción II+III en la etapa de disolución de la fracción II+III. En un modo de realización, la mejora del procedimiento se produce solubilizando el precipitado de la fracción II+III en un tampón de disolución que contiene 600 ml de ácido acético glacial por 1000 l. En otro modo de realización, la mejora se refiere a un procedimiento en el que se reducen las impurezas después de que se solubiliza la IgG en el precipitado de la fracción II+III. En un modo de realización, la mejora del procedimiento se produce mezclando dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido con la suspensión de la fracción II+III durante al menos aproximadamente 30 minutos.
15 5. Pretratamiento y filtración de la suspensión de la fracción II+III modificada
Para retirar la fracción no solubilizada del precipitado de la fracción II+III modificada (es decir, la torta de filtro de la fracción II+III modificada), se filtra la suspensión, usando típicamente filtración de profundidad. Los filtros de profundidad que se pueden emplear en los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen, filtros de profundidad metálicos, de vidrio, cerámicos, orgánicos (tales como tierra de diatomeas), y similares. Ejemplos de filtros adecuados incluyen, sin limitación, filtros Cuno 50SA, Cuno 90SA, y Cuno VR06 (Cuno). De forma alternativa, la etapa de separación se puede realizar por centrifugación en vez de filtración.
Aunque las mejoras en el procedimiento de fabricación descritas anteriormente minimizan las pérdidas de IgG en las
25 etapas iniciales del procedimiento de purificación, impurezas críticas, incluyendo actividad de PKA, actividad amidolítica, y contenido en fibrinógeno, son mucho mayores cuando, por ejemplo, se extrae la pasta II+III a pH 4,5 o 4,6, en comparación a cuando se produce la extracción a un pH alrededor de 4,9 a 5,0 (véase, los ejemplos 2 a 5).
Para contrarrestar las impurezas extraídas en los procedimientos proporcionados en el presente documento, se ha descubierto que la pureza de la composición de IgG se puede potenciar considerablemente por la adición de una etapa de pretratamiento anterior a la filtración/centrifugación. En un modo de realización, esta etapa de pretratamiento comprende la adición de partículas de dióxido de sílice finamente dividido (por ejemplo, sílice de combustión, Aerosil®) seguido de un periodo de incubación de 40 a 80 minutos durante el que se mezcla de forma constante la suspensión. En determinados modos de realización, el periodo de incubación estará entre
35 aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más minutos. En general, el tratamiento se realizará a entre aproximadamente 0 ºC y aproximadamente 10 ºC, o entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC. En determinados modos de realización, el tratamiento se puede realizar a aproximadamente 0 ºC, 1 ºC, 2 ºC, 3 ºC, 4 ºC, 5 ºC, 6 ºC, 7 ºC, 8 ºC, 9 ºC, o 10 ºC. En un modo de realización particular, el tratamiento se realiza entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 10 ºC.
El efecto del tratamiento con sílice de combustión se ejemplifica por los resultados hallados en el ejemplo 17. En este ejemplo, se suspende un precipitado de la fracción II+III y se divide en dos muestras, de las que una se aclara con coadyuvante de filtro sólo antes de la filtración (figura 7A) y de las que una se trata con sílice de combustión antes de la adición del coadyuvante de filtro y la filtración (figura 7B). Como se puede observar en las cromatografías y en los
45 datos cuantificados, la muestra de filtrado pretratada con sílice de combustión tenía una pureza de IgG mucho mayor que la muestra tratada sólo con coadyuvante de filtro (68,8 % frente al 55,7 %; comparar las tablas 17 y 18, respectivamente).
En determinados modos de realización, se añade sílice de combustión a una concentración de entre aproximadamente 20 g/kg pasta II+III y aproximadamente 100 g/kg pasta II+III (es decir, para un precipitado de la fracción II+III modificada que se extrae en una proporción de 1:15, se debe añadir sílice de combustión a una concentración de aproximadamente 20 g/16 kg suspensión II+III a aproximadamente 100 g/16 kg suspensión II+III, o a una concentración final de aproximadamente un 0,125 % (p/p) a aproximadamente 0,625 % (p/p)). En determinados modos de realización, se puede añadir el sílice de combustión a una concentración de aproximadamente 20 g/kg
55 pasta II+III, o aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 g/kg pasta II+III. En un modo de realización específico, se añade sílice de combustión (por ejemplo, Aerosil 380 o equivalente) a la suspensión de la fracción II+III modificada hasta una concentración final de aproximadamente 40 g/16 kg II+III. El mezclado tiene lugar a aproximadamente de 2 a 8 ºC durante al menos de 50 a 70 minutos.
En determinados modos de realización, se añade SiO2 a una composición de IgG a una concentración de entre aproximadamente 0,01 g/g proteína y aproximadamente 10 g/g proteína. En otro modo de realización, se añade SiO a una composición de IgG a una concentración de entre aproximadamente 0,01 g/g proteína y aproximadamente 5 g/g proteína. En otro modo de realización, se añade SiO2 a una composición de IgG a una concentración de entre aproximadamente 0,02 g/g proteína y aproximadamente 4 g/g proteína. En un modo de realización, se añade SiO2 a 65 una concentración final de al menos 0,1 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se
imagen43
añade sílice de combustión a una concentración de al menos 0,2 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 0,25 g por gramo de proteína total. En otros modos de realización específicos, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 1 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una
5 concentración de al menos 2 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 2,5 g por gramo de proteína total. Aún en otros modos de realización específicos, se añade dióxido de silicio finamente dividido a una concentración de al menos 0,01 g/g proteína total o al menos 0,02 g, 0,03 g, 0,04 g, 0,05 g, 0,06 g, 0,07 g, 0,08 g, 0,09 g, 0,1 g, 0,2 g, 0,3 g, 0,4 g, 0,5 g, 0,6 g, 0,7 g, 0,8 g, 0,9 g, 1,0 g, 1,5 g, 2,0 g, 2,5 g, 3,0 g, 3,5 g, 4,0 g, 4,5 g, 5,0 g, 5,5 g, 6,0 g, 6,5 g, 7,0 g, 7,5 g, 8,0 g, 8,5 g, 9,0 g, 9,5 g, 10,0 g, o más por gramo de proteína total.
En determinados modos de realización, se añadirá coadyuvante de filtro, por ejemplo Celpure C300 (Celpure) o Hyflo-Supper-Cel (World Minerals), después del tratamiento con dióxido de sílice, para facilitar la filtración en profundidad. Se puede añadir coadyuvante de filtro a una concentración final de desde aproximadamente 0,01 kg/kg
15 pasta II+III a aproximadamente 1,0 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,02 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,8 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,03 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,7 kg/kg pasta II+III. En otros modos de realización, se puede añadir coadyuvante de filtro a una concentración final de desde aproximadamente 0,01 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,07 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,02 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,06 kg/kg pasta II+III, o desde aproximadamente 0,03 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,05 kg/kg pasta II+III. En determinados modos de realización, se añadirá el coadyuvante de filtro a una concentración final de aproximadamente 0,01 kg/kg pasta II+III, o aproximadamente 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o 1,0 kg/kg pasta II+III.
Se perdió una fracción significativa de IgG durante la etapa de filtración del procedimiento de fabricación
25 GAMMAGARD® LIQUID. Se descubrió que los procedimientos actuales de lavado post-filtración, usando 1,8 volúmenes muertos de tampón de suspensión para purgar los bastidores y líneas del filtro-prensa, eran insuficientes para una recuperación máxima de la IgG en esta etapa. De manera sorprendente, se descubrió que se requirieron al menos 3,0 volúmenes muertos, preferentemente 3,6 volúmenes muertos, del tampón de suspensión para la recuperación eficaz de IgG total en la suspensión aclarada de la fracción II+III modificada (véase, ejemplo 12 y figura 1). En determinados modos de realización, se puede lavar el filtro-prensa con cualquier tampón de suspensión adecuado. En un modo de realización particular, el tampón de lavado comprenderá, por ejemplo, fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM, y ácido acético glacial al 0,015 % (v/v).
En un aspecto, la mejora se refiere a un procedimiento en el que se pierde una cantidad reducida de IgG durante la
35 etapa de filtración de la suspensión de la fracción II+III. En un modo de realización, la mejora del procedimiento se produce postlavando el filtro con al menos aproximadamente 3,6 volúmenes muertos de tampón de disolución que contiene 150 ml de ácido acético glacial por 1000 l. La relación entre la cantidad de ácido acético glacial y el pH en el tampón de postlavado se muestra en la figura 10. En un modo de realización, el pH del tampón de extracción postlavado está entre aproximadamente 4,6 y aproximadamente 5,3. En un modo de realización preferente, el pH del tampón postlavado está entre aproximadamente 4,7 y aproximadamente 5,2. En otro modo de realización preferente, el pH del tampón postlavado está entre aproximadamente 4,8 y aproximadamente 5,1. Aún en otro modo de realización preferente, el pH del tampón postlavado está entre aproximadamente 4,9 y aproximadamente 5,0.
En comparación con los procedimientos empleados previamente para el aclarado de la suspensión formada a partir
45 de la segunda etapa de precipitación (GAMMAGARD® LIQUID), la presente invención proporciona, en varios modos de realización, procedimientos que dan como resultado una mejora en los rendimientos de IgG y la pureza en la suspensión de fracción II+III aclarada. En un aspecto, la mejora se refiere a un procedimiento en el que se pierde una cantidad reducida de IgG en la torta de filtro de la fracción II+III modificada. En otro aspecto, la mejora se refiere a un procedimiento en el que se encuentra una cantidad reducida de una impureza en la suspensión de la fracción II+III aclarada.
En un modo de realización, las mejoras del procedimiento se producen por la inclusión de un tratamiento de sílice de combustión anterior a la filtración o aclarado por centrífuga de una suspensión de la fracción II+III. En determinados modos de realización, el tratamiento de sílice de combustión incluirá la adición de desde aproximadamente 0,01 kg/kg 55 pasta II+III a aproximadamente 0,07 kg/kg pasta II+III, o de aproximadamente 0,02 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,06 kg/kg pasta II+III, o de aproximadamente 0,03 kg/kg pasta II+III a aproximadamente 0,05 kg/kg pasta II+III, o aproximadamente 0,02 kg/kg pasta II+III, 0,03 kg/kg pasta II+III, 0,04 kg/kg pasta II+III, 0,05 kg/kg pasta II+III, 0,06 kg/kg pasta II+III, 0,07 kg/kg pasta II+III, 0,08 kg/kg pasta II+III, 0,09 kg/kg pasta II+III, o 0,1 kg/kg pasta II+III, y se incubará la mezcla durante entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más minutos a una temperatura de entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC. En otro modo de realización, las mejoras del procedimiento se producen por inclusión de un tratamiento con sílice de combustión que redujo los niveles de fibrinógeno residual, actividad amidolítica, y/o actividad del activador de precalicreína. En un modo de realización específico, las mejoras del procedimiento se producen por la inclusión de un tratamiento de sílice de combustión, que reduce los niveles de
65 FXI, FXIa, FXII, y FXIIa en la preparación de inmunoglobulina.
imagen44
En otro modo de realización, las mejoras del procedimiento se producen lavando el filtro de profundidad con entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5 volúmenes del volumen muerto del filtro después de completar la etapa de filtración de la suspensión de la fracción II+III modificada. En determinados modos de realización, se lavará el filtro
5 con entre aproximadamente 3,5 volúmenes y aproximadamente 4,5 volúmenes, o al menos aproximadamente 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7,3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0 volúmenes del volumen muerto del filtro. En un modo de realización particular, se lavará el filtro-prensa con al menos aproximadamente 3,6 volúmenes muertos del tampón de suspensión.
6. Tratamiento con detergente
Para retirar los contaminantes adicionales del filtrado de la fracción II+III modificada, a continuación se somete la muestra a un tratamiento con detergente. Los procedimientos para el tratamiento con detergente de fracciones derivadas de plasma son bien conocidos en la técnica. En general, se puede usar cualquier tratamiento con
15 detergente no iónico estándar junto con los procedimientos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, a continuación se proporciona un protocolo de ejemplo para un tratamiento con detergente. En resumen, se añade polisorbato-80 al filtrado de la fracción II+III modificada a una concentración final de aproximadamente un 0,2 % (p/v) con agitación y se incuba la muestra durante al menos 30 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 2 a 8 ºC. A continuación se mezcla el citrato de sodio deshidratado en la solución a una concentración final de aproximadamente 8 g/l y se incuba la muestra durante 30 minutos adicionales, con agitación continua a una temperatura de entre aproximadamente 2 a 8 ºC.
En determinados modos de realización, se puede usar cualquier detergente no iónico adecuado. Los ejemplos de detergentes no iónicos adecuados incluyen, sin limitación, octilglucósido, digitonina, C12E8, Lubrol, Triton X-100,
25 NonidetP-40, Tween-20 (es decir, polisorbato-20), Tween-80 (es decir, polisorbato-80), un poli(óxido de etileno) de alquilo, un detergente Brij, un poIi(óxido de etileno) de alquilfenol, apoloxámero, octilglucósido, decilmaltósido, y similares.
En un modo de realización, una mejora del procedimiento se produce añadiendo los reactivos de detergente (por ejemplo, polisorbato-80 y citrato de sodio deshidratado) por pulverización en vez de por adición de fluyente. En otros modos de realización, los reactivos de detergente se pueden añadir como sólidos al filtrado de la fracción II+III modificada mientras se está mezclando la muestra para garantizar una rápida distribución de los aditivos. En determinados modos de realización, es preferente añadir reactivos sólidos rociando los sólidos sobre un área de superficie deslocalizada del filtrado de modo que no se produce una sobreconcentración local, tal como en la adición
35 de fluyente.
7. Tercer acontecimiento de precipitación -Precipitación G
Para retirar varias proteínas pequeñas residuales, tal como albúmina y transferrina, se realiza una tercera precipitación a una concentración de alcohol al 25 %. En resumen, se ajusta el pH del filtrado II+III tratado con detergente hasta entre aproximadamente 6,8 y 7,2, preferentemente entre aproximadamente 6,9 y aproximadamente 7,1, lo más preferentemente aproximadamente 7,0 con una solución modificadora de pH adecuada (por ejemplo, hidróxido de sodio 1 M o ácido acético 1 M). A continuación, se añade alcohol frío a la solución hasta una concentración final de aproximadamente un 25 % (v/v) y se incuba la mezcla mientras se agita a entre
45 aproximadamente -6 ºC a aproximadamente -10 ºC durante al menos 1 hora para formar un tercer precipitado (es decir, precipitado G). En un modo de realización, se incuba la mezcla durante al menos 2 horas, o al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o más horas. En un modo de realización preferente, se incuba la mezcla durante al menos 2 horas. En un modo de realización más preferente, se incuba la mezcla durante al menos 4 horas. En un modo de realización aún más preferente, se incuba la mezcla durante al menos 8 horas.
En un aspecto, una mejora del procedimiento se refiere a un procedimiento en el que se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de sobrenadante de la tercera etapa de precipitación. En determinados modos de realización, la mejora del procedimiento se produce ajustando el pH de la solución hasta entre aproximadamente 6,8 y 55 aproximadamente 7,2 inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación. En otro modo de realización, la mejora del procedimiento se produce manteniendo el pH de la solución hasta entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,2 de forma continua durante el periodo de incubación de precipitación. En otros modos de realización, se ajusta el pH de la solución hasta entre aproximadamente 6,9 y aproximadamente 7,1 inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación, o hasta un pH de aproximadamente 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, o 7,2 inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación. En un modo de realización particular, se ajusta el pH de la solución hasta aproximadamente 7,0 inmediatamente después de o durante la adición del alcohol en precipitación. En determinados modos de realización, se mantiene el pH de la solución a entre aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1 de forma continua durante el periodo de incubación de precipitación, o a un pH de aproximadamente 7,0 de forma continua durante el periodo de incubación de precipitación. Como tal, en 65 determinados modos de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de sobrenadante de la
imagen45
tercera etapa de precipitación en comparación con una etapa de precipitación análoga en la que se ajusta el pH de la solución antes pero no después de la adición del alcohol en precipitación o con una etapa de precipitación análoga en la que no se mantiene el pH de la solución durante la totalidad del periodo de incubación de precipitación. En un modo de realización, se mantiene el pH al pH deseado durante el tiempo de retención o de incubación de la precipitación
5 ajustando de forma continua el pH de la solución. En un modo de realización, el alcohol es etanol.
En otro modo de realización, la mejora del procedimiento se produce añadiendo el alcohol en precipitación y/o la solución usada para ajustar el pH por pulverización, en vez de por adición de fluyente. Como tal, en determinados modos de realización, se pierde una cantidad reducida de IgG en la fracción de sobrenadante de la tercera etapa de precipitación en comparación con una etapa de precipitación análoga en la que se introduce el alcohol y/o solución usados para ajustar el pH por adición de fluyente. En un modo de realización, el alcohol es etanol.
8. Suspensión y filtración del precipitado G (PptG)
15 Para solubilizar el contenido en IgG del precipitado G, se usa un tampón de extracción frío para resuspender el PptG. En resumen, se disuelve el precipitado G 1 a 3,5 en agua para inyectables (WFI) a entre aproximadamente 0 ºC y aproximadamente 8 ºC para lograr un valor de AU280-320 de entre aproximadamente 40 a 95. A continuación se ajusta el pH final de la solución, que se agita durante al menos 2 horas, hasta o aproximadamente hasta 5,2 ± 0,2. En un modo de realización, este ajuste de pH se realiza con ácido acético 1 M. Para incrementar la solubilidad de la IgG, se incrementa la conductividad de la suspensión hasta entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6,0 mS/cm. En un modo de realización, se incrementa la conductividad por la adición de cloruro de sodio. A continuación, se filtra la solución de PptG suspendido con un filtro de profundidad adecuado que tiene un tamaño de poro nominal de entre aproximadamente 0,1 μm y aproximadamente 0,4 μm para retirar cualquier partícula no disuelta. En un modo de realización, el tamaño de poro nominal del filtro de profundidad es de aproximadamente 0,2 μm (por ejemplo, filtro
25 Cuno VR06 o equivalente) para obtener un filtrado aclarado. En otro modo de realización, se filtra la solución de PptG suspendido para recuperar un sobrenadante aclarado. El postlavado del filtro se realiza usando una solución de cloruro de sodio con una conductividad de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6,0 mS/cm. Típicamente, las soluciones adecuadas para la extracción del precipitado G incluyen, WFI y tampones con conductividad baja. En un modo de realización, un tampón de conductividad baja tiene una conductividad menor de aproximadamente 10 mS/cm. En un modo de realización preferente, el tampón de conductividad baja tiene una conductividad menor de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 mS/cm. En un modo de realización preferente, el tampón de conductividad baja tiene una conductividad de menos de aproximadamente 6 mS/cm. En otro modo de realización preferente, el tampón de conductividad baja tiene una conductividad de menos de aproximadamente 4 mS/cm. En otro modo de realización preferente, el tampón de conductividad baja tiene una conductividad de menos de aproximadamente 2
35 mS/cm.
9. Tratamiento con disolvente-detergente
Para inactivar diversos contaminantes víricos que pueden estar presentes en productos derivados de plasma, a continuación se somete el filtrado de PptG aclarado a un tratamiento con disolvente-detergente (S/D). Los procedimientos para el tratamiento con detergente de fracciones derivadas de plasma son bien conocidos en la técnica (para revisión véase, Pelletier JP et al, Best Tract Res Clin Haematol. 2006;19(l):205-42). En general, se puede usar cualquier tratamiento S/D estándar junto con los procedimientos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, a continuación se proporciona un protocolo de ejemplo para un tratamiento S/D.
45 En resumen, se añaden Triton X-100, Tween-20, y fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) al filtrado de PptG aclarado a concentraciones finales de aproximadamente un 1,0 %, 0,3 %, y 0,3 %, respectivamente. A continuación, se agita la mezcla a una temperatura de entre aproximadamente 18 ºC y aproximadamente 25 ºC durante al menos aproximadamente una hora.
En un modo de realización, una mejora del procedimiento se produce añadiendo los reactivos S/D (por ejemplo, Triton X-100, Tween-20, y TNBP) por pulverización en vez de por adición de fluyente. En otros modos de realización, se pueden añadir los reactivos de detergente como sólidos al filtrado de PptG aclarado, que se está mezclando para garantizar una rápida distribución de los componentes S/D. En determinados modos de realización, es preferente
55 añadir reactivos sólidos rociando los sólidos sobre un área de superficie deslocalizada del filtrado de modo que no se produce una sobreconcentración local, tal como en la adición de fluyente.
10. Cromatografía de intercambio iónico
Para purificar y concentrar adicionalmente la IgG del filtrado de PptG tratado con S/D, se puede emplear la cromatografía de intercambio catiónico y/o intercambio aniónico. Los procedimientos para purificar y concentrar la IgG usando cromatografía de intercambio iónico son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º
5.886.154 describe un procedimiento en el que se extrae un precipitado de la fracción II+III a pH bajo (entre
aproximadamente 3,8 y 4,5), seguido de precipitación de IgG usando ácido caprílico, y finalmente la implementación 65 de dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico. La patente de EE. UU. N.º 6.069.236 describe un esquema
imagen46
de purificación de IgG cromatográfico que no se basa en modo alguno en la precipitación de alcohol. La publicación PCT N.º WO 2005/073252 describe un procedimiento de purificación de IgG que implica la extracción de un precipitado de la fracción II+III, tratamiento con ácido caprílico, tratamiento con PEG, y una única etapa de cromatografía de intercambio aniónico. La patente de EE. UU. N.º 7.186.410 describe un procedimiento de 5 purificación de IgG que implica la extracción de un precipitado de la fracción I+II+III o bien la fracción II seguido de una única etapa de intercambio aniónico realizada a pH alcalino. La patente de EE. UU. N.º 7.553.938 describe un procedimiento que implica la extracción de un precipitado de la fracción I+II+III o bien la fracción II+III, tratamiento con caprilato, y una o bien dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico. La patente de EE. UU. N.º 6.093.324 describe un procedimiento de purificación que comprende el uso de una resina de intercambio aniónico macroporosa que se hace funcionar a un pH de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 6,6. La patente de EE. UU. N.º
6.835.379 describe un procedimiento de purificación que se basa en cromatografía de intercambio catiónico en ausencia de fraccionamiento de alcohol. Las divulgaciones de las publicaciones anteriores se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
15 En un modo de realización de los procedimientos de la presente invención, se puede someter el filtrado de PptG tratado con S/D tanto a cromatografía de intercambio catiónico como a cromatografía de intercambio aniónico. Por ejemplo, en un modo de realización, el filtrado de PptG tratado con S/D se pasa a través de una columna de intercambio catiónico, que une la IgG en la solución. A continuación, los reactivos S/D se pueden separar por lavado de la IgG absorbida, que posteriormente se separa por elución de la columna con un tampón de elución de pH alto que tiene un pH de entre aproximadamente 8,0 y 9,0. De esta forma, se puede usar la etapa de cromatografía de intercambio catiónico para retirar los reactivos S/D de la preparación, para concentrar la solución que contiene la IgG,
o ambos. En determinados modos de realización, el tampón de elución de pH puede tener un pH de entre aproximadamente 8,2 y aproximadamente 8,8, o entre aproximadamente 8,4 y aproximadamente 8,6, o un pH de aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, o 9,0. En un modo de realización preferente, el pH del
25 tampón de elución es aproximadamente de 8,5 ±0,1.
En determinados modos de realización, el eluato de la columna de intercambio catiónico se puede ajustar hasta un pH menor, por ejemplo entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 6,5, y diluirse con un tampón apropiado de modo que se reduzca la conductividad de la solución. En determinados modos de realización, el pH del eluato de intercambio catiónico se puede ajustar hasta un pH de entre aproximadamente 5,7 y aproximadamente 6,3, o entre aproximadamente 5,9 y aproximadamente 6,1, o un pH de aproximadamente 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, o 6,5. En un modo de realización preferente, el pH del eluato se ajusta hasta un pH de aproximadamente 6,0 ± 0,1. A continuación, se carga el eluato sobre una columna de intercambio aniónico, que une varios contaminantes descubiertos en la preparación. El flujo a través de la columna, que contiene la fracción de IgG, se recoge durante la
35 carga y el lavado de la columna. En determinados modos de realización, las etapas cromatográficas de intercambio iónico de la presente invención se pueden realizar en modo de columna, en modo de lote, o en una combinación de los dos.
En determinados modos de realización, una mejora del procedimiento se produce añadiendo la solución usada para ajustar el pH por pulverización, en vez de por adición de fluyente.
11. Nanofiltración y ultra/diafiltración
Para reducir adicionalmente la carga vírica de la composición de IgG proporcionada en el presente documento, se
45 puede nanofiltrar el efluyente de la columna de intercambio aniónico usando un dispositivo de nanofiltración adecuado. En determinados modos de realización, el dispositivo de nanofiltración tendrá un tamaño de poro medio de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 200 nm. Los ejemplos de nanofiltros adecuados para este uso incluyen, sin limitación, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresoive NFP, ViresolveNFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N, y 75N (Planova). En un modo de realización específico, el nanofiltro puede tener un tamaño de poro medio de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 72 nm, o entre aproximadamente 19 nm y aproximadamente 35 nm, o de aproximadamente 15 nm, 19 nm, 35 nm, o 72 nm. En un modo de realización preferente, nanofiltro tendrá un tamaño de poro medio de aproximadamente 35 nm, tal como un filtro Asahi PLANOVA 35N o equivalente del mismo.
Opcionalmente, se puede realizar una ultrafiltración/diafiltración para concentrar adicionalmente el nanofiltrado. En un
55 modo de realización, se usa una membrana de canal abierto con un postlavado específicamente diseñado y la formulación cerca del final del procedimiento de producción hace que las composiciones de IgG resultantes tengan una concentración de proteína aproximadamente dos veces mayor (200mg/ml) en comparación con las IVIG del estado de la técnica (por ejemplo, GAMMAGARD® LIQUID) sin afectar al rendimiento y a la estabilidad en almacenamiento. Con la mayoría de las membranas de ultrafiltración disponibles comercialmente no se puede alcanzar una concentración de 200 mg/ml de IgG sin pérdidas importantes de proteína. Estas membranas se bloquearán pronto y por tanto, es difícil lograr un postlavado adecuado. Por lo tanto, se deben usar configuraciones de membrana de canal abierto. Incluso con membranas de canal abierto, se debe usar un procedimiento de postlavado diseñado específicamente para obtener la concentración requerida sin una pérdida significativa de proteína (pérdida menor de un 2 %). Aún más sorprendente es el hecho de que la mayor concentración de proteína
65 de 200 mg/ml no logra la capacidad de inactivación del virus de la etapa de almacenamiento a pH bajo.
imagen47
Posterior a la nanofiltración, se puede concentrar adicionalmente el filtrado por ultrafiltración/diafiltración. En un modo de realización, se puede concentrar el nanofiltrado por ultrafiltración hasta una concentración de proteína de entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 10 % (p/v). En determinados modos de realización, la ultrafiltración
5 se lleva a cabo en un casete con una pantalla de canal abierto y la membrana de ultrafiltración tiene un límite de peso molecular nominal (NMWCO) menor de aproximadamente 100 kDa o menor de aproximadamente 90, 80, 70, 60, 50,40, 30 kDa, o menos kDa. En un modo de realización preferente, la membrana de ultrafiltración tiene un NMWCO de no más de 50 kDa.
10 Tras la finalización de la etapa de ultrafiltración, se puede concentrar adicionalmente el concentrado por medio de diafiltración frente a una solución adecuada para su administración intravenosa o intramuscular. En determinados modos de realización, la solución de diafiltración puede comprender un agente estabilizante y/o tamponador. En un modo de realización preferente, el agente estabilizante y tamponador es glicina en una concentración apropiada, por ejemplo entre aproximadamente 0,20 M y aproximadamente 0,30 M, o entre aproximadamente 0,22 M y
15 aproximadamente 0,28 M, o entre aproximadamente 0,24 M y aproximadamente 0,26 mM, o a una concentración de aproximadamente 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, o 3,0. En un modo de realización preferente, el tampón de diafiltración contiene glicina 0,25 M o aproximadamente 0,25 M.
Típicamente, el volumen de intercambio mínimo es al menos aproximadamente 3 veces el volumen de concentrado
20 original o al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más veces el volumen de concentrado original. La solución de IgG se puede concentrar hasta una concentración de proteína de aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 25 % (p/v), o entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 18 % (p/v), o entre aproximadamente un 7 % y aproximadamente un 16 % (p/v), o entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 14 % (p/v), o entre aproximadamente un 9 % y aproximadamente un 12 %, o hasta una concentración final de aproximadamente un 5 %,
25 o un 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24 %, 25 % o mayor. En un modo de realización, se logra una concentración de proteína final de al menos aproximadamente un 23 % sin añadir la fracción de postlavado a la solución concentrada. En otro modo de realización, se logra una concentración de proteína final de al menos aproximadamente un 24 % sin añadir la fracción de postlavado a la solución concentrada. Se logra una concentración de proteína final de al menos aproximadamente
30 un 25 % sin añadir la fracción de postlavado a la solución concentrada. Típicamente, al final del procedimiento de concentración, el pH de la solución estará entre aproximadamente 4,6 a 5,1.
En un modo de realización ejemplar, el pH de la composición de IgG se ajusta hasta aproximadamente 4,5 antes de la ultrafiltración. La solución se concentra hasta una concentración de proteína de un 5 ± 2 % p/v a través de
35 ultrafiltración. La membrana UF tiene un límite de peso molecular nominal (NMWCO) de 50.000 Dalton o menos (membrana de poliéter-sulfona de Millipore Pellicon). El concentrado se somete a diafiltración frente a diez volúmenes de solución de glicina 0,25 M, pH 4,5 ± 0,2. En toda la operación de ultradiafiltración, se mantiene la solución a una temperatura de entre aproximadamente 2 ºC a aproximadamente 8 ºC. Después de la diafiltración, se concentra la solución hasta una concentración de proteína de al menos un 11 % (p/v).
40
12. Formulación
Tras la finalización de la etapa de diafiltración, se ajusta la concentración de proteína de la solución con el tampón de diafiltración hasta una concentración final de entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 20 % (p/v), o 45 entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 18 % (p/v), o entre aproximadamente un 7 % y aproximadamente un 16 % (p/v), o entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 14 % (p/v), o entre aproximadamente un 9 % y aproximadamente un 12 %, o hasta una concentración final de aproximadamente un 5 %,
o un 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20%. En un modo de
realización preferente, la concentración de proteína final de la solución está entre aproximadamente un 9 % y 50 aproximadamente un 11 %, más preferentemente es de aproximadamente un 10 %.
La solución en masa formulada se esteriliza adicionalmente filtrando a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro absoluto de no más de aproximadamente 0,22 micrómetros, por ejemplo aproximadamente 0,2 micrómetros.
55 A continuación, la solución se dispensa asépticamente en recipientes finales para un sellado apropiado, con muestras tomadas para muestreo.
En un modo de realización, la composición de IgG se ajusta adicionalmente hasta una concentración de aproximadamente un 10,2 ± 0,2 % (p/v) con un tampón de diafiltración. El pH se ajusta hasta de aproximadamente
60 4,4 a aproximadamente 4,9 en caso necesario. Finalmente, la solución se filtra de forma estéril y se incuba durante tres semanas a o aproximadamente a 30 ºC.
B. Factor H
imagen48
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de factor H derivado de plasma. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto la composición de factor H con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o
5 zimógeno de serina proteasa; y (b) separar el SiO2  
En un modo de realización, el procedimiento comprende además la etapa de realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína de factor H para formar una primera composición de factor H enriquecida, antes de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína factor H se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
15 En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína factor H para formar una segunda composición de factor H enriquecida, antes de poner en contacto la composición con el dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína factor H se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de factor H derivada de plasma, el
25 procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de factor H para formar una primera composición de factor H derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de factor H para formar una segunda composición de factor H derivada de plasma enriquecida; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
35 En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una etapa de enriquecimiento de factor H después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la etapa de enriquecimiento de factor H se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de factor H derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de factor H para formar una primera composición de factor H derivada de plasma enriquecida; (b) poner en contacto la primera composición
45 enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (d) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de factor H para formar una segunda composición de factor H derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
Asimismo, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de factor H derivada de plasma, 55 comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de factor H para formar una primera composición de factor H derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de factor H para formar una segunda composición de factor H derivada de plasma enriquecida; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (e) realizar una tercera etapa de enriquecimiento de factor H para formar una tercera composición de factor H derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 101 a Var. 1100,
65 encontradas en la tabla 2, tabla 3, tabla 4, tabla 5, tabla 6, tabla 7, tabla 8, tabla 9, tabla 10 o tabla 11.
imagen49
1. Procedimientos para la fabricación de factor H derivado de plasma
Con respecto a la producción, los procedimientos reivindicados que comienzan a partir de plasma humano deben
5 basarse en el subfraccionamiento de intermedios industriales típicos obtenidos, por ejemplo, por la precipitación fraccionada por etanol en frío (revisado en Schultze H E, Heremans J F; Molecular Biology of Human Proteins. Volume I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p. 236-317). Un modo de realización preferente de dicha purificación es la purificación del factor H funcional de fracciones secundarias del fraccionamiento de plasma a escala industrial de tal modo que los procedimientos de fabricación establecidos y autorizados de productos de plasma, que están bajo el control de autoridades reguladoras farmacéuticas, como las inmunoglobulinas, no se vean afectados. Por ejemplo, la torta de filtro obtenida después de la filtración de una suspensión de pasta de la fracción II+III (Teschner W et al, Vox Sang. Enero 2007; 92(l):42-55), precipitado de la fracción I (Cohn et al, (1946) supra), precipitado III (Schultze H E, Heremans J F; Molecular Biology of Human Proteins. Volume I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p, 236-317 a
15 p. 253) y precipitado B (procedimiento de Kistler y Nitschmann; supra en p. 253) son ejemplos de dichas fuentes industriales para el factor H. Al comenzar a partir de estas fracciones secundarias, se pueden usar procedimientos de purificación conocidos en la técnica para purificar el factor H. Éstos se pueden basar en la precipitación con polietilenglicol (Nagasawa S, Stroud R M; Mol inmunol 1980; 17:1365-72), cromatografía de afinidad por medio de heparina inmovilizada (cita como antes), cromatografía de intercambio iónico (Crossley L G, Porter R R; Biochern J 1980; 191:173-82) y cromatografía de interacción hidrófoba (Ripoche J, Al Salihi A, Rousseaux J, Fontaine M; Biochern J 1984; 221, 89-96).
En un modo de realización, el material de partida para la invención se prepara usando fracciones de Cohn. Este fraccionamiento es un fraccionamiento bien conocido usado para la preparación de preparaciones de 25 inmunoglobulina se puede preparar a partir de inmunoglobulinas recombinantes o monoclonales o de suero de donante. En un ejemplo típico, se recoge sangre de donantes sanos. Normalmente, se recoge sangre de la misma especie de animal que el sujeto al que se le administrará la preparación de inmunoglobulina (denominadas típicamente inmunoglobulinas "homólogas"). Las inmunoglobulinas se aíslan de la sangre por procedimientos adecuados, tales como, por ejemplo, fraccionamiento de Cohn, ultracentrifugación, preparación electroforética, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, fraccionamiento con polietilenglicol, o similares. (Véase, por ejemplo, Cohn et al, J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1940; Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); patentes de EE. UU. N.º 5.122.373 y 5.177.194; de los que las divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos.) En un modo de realización, la presente invención
35 usa las fracciones descartadas de la preparación de inmunoglobulinas. En un modo de realización particular, la presente invención usa la fracción que se encuentra en una torta de filtración de SiO2 una vez que se filtra el extracto de la II+III.
En general, se pueden preparar preparaciones del factor H de acuerdo con la presente invención a partir de cualquier material de partida adecuado, por ejemplo, plasma recuperado o plasma de fuente. En un ejemplo típico, se recoge sangre o plasma de donantes sanos. Normalmente, se recoge sangre de la misma especie de animal que el sujeto al que se le administrará la preparación de factor H (denominado típicamente factor H "homólogo"). El factor H se aísla de la sangre o plasma por procedimientos adecuados, tales como, por ejemplo, precipitación (fraccionamiento de alcohol o fraccionamiento de polietilenglicol), procedimientos cromatográficos (cromatografía de intercambio iónico,
45 cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, etc.) ultracentrifugación, y preparación electroforética, y similares. (Véase, por ejemplo, Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Deutsch et al., J. Biol. Chem. 164:109-118; Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Cohn et al., h Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950); Cohn et al., Blood Cells and Plasma Proteins: Their State In Nature (J.L., Tullis, ed), p. 1-58, Academic Press, NewYork and London (1953); Nitschmann et al., Helv. Chim. Acta 37:866-873; Kistler y Nitschmann, Vox Sang. 7:414-424 (1962); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al. Vox Sang. 13:93-102 (1967); patente de EE. UU. N.º 5.122.373 y 5.177.194; de los que las divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos).
En determinados modos de realización, el factor H se recupera a partir de material descartado de otro modo durante
55 la fabricación de otros productos sanguíneos comercialmente importantes por fraccionamiento de plasma. Por ejemplo, en un modo de realización de ejemplo, el factor H se extrae a partir de un precipitado de la fracción I y/o se extrae a partir de una torta de filtro formada después de centrifugación o filtración de una pasta de la fracción II+III resuspendida. De forma ventajosa, de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento, se puede lograr la preparación a escala industrial del factor H sin la necesidad de plasma de aportación adicional ni el rediseño y la reaprobación reguladora de procedimientos de fabricación existentes para otros productos sanguíneos derivados de plasma comercialmente importantes, tales como gammaglobulinas IgG para su administración intravenosa (IVIG) o subcutánea.
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H 65 enriquecida que tiene un contenido reducido en serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa de plasma extrayendo el factor H de una fracción de plasma y reduciendo el contenido en FXI, FXIa, FXII, y/o FXIIa con un procedimiento de tratamiento con SiO2 proporcionado en el presente documento.
imagen50
En un modo de realización, se proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H enriquecida
5 a partir de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) precipitar proteínas a partir de una fracción de plasma desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación, con alcohol entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 10 % a un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5 para obtener un primer precipitado y un primer sobrenadante; (b) precipitar el factor H del primer sobrenadante, en una segunda etapa de precipitación, con alcohol entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 30 % a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para formar un segundo precipitado; (c) resuspender el segundo precipitado para formar una suspensión; (d) mezclar dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido con la suspensión de la etapa (c); (e) separar la suspensión para formar una torta de filtro y un sobrenadante; y (f) extraer el factor H de la torta de filtro de SiO2 bajo condiciones de solución que reducen el nivel una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición final. En un modo de realización preferente, se separa la torta de filtro del sobrenadante
15 filtrando la suspensión a través de un filtro-prensa que contiene un filtro adecuado. En un modo de realización, el factor H se puede extraer recirculando un tampón de extracción a través de un filtro-prensa que contiene una torta de filtro.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H enriquecida con reducción en el contenido de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa de plasma extrayendo el factor H de un precipitado de la fracción I.
En un modo de realización preferente, se proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H enriquecida a partir de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) precipitar proteínas de una
25 fracción de plasma desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación, con alcohol entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 10 % a un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5 para obtener un primer precipitado y un primer sobrenadante; (b) extraer el factor H del precipitado con un tampón de extracción de factor H, y (c) reducir el nivel de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa tratando la composición con SiO2, usando un procedimiento adecuado proporcionado en el presente documento. En un aspecto, se proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H enriquecida a partir de plasma, extrayendo el factor H de una reserva de dos o más fracciones de subproducto de fabricación creadas por un procedimiento diseñado para proporcionar una segunda proteína sanguínea, por ejemplo, gammaglobulinas IgG. En un modo de realización, el procedimiento comprende mezclar un precipitado de la fracción I y una torta de filtro de la fracción II+III formada durante la fabricación de gammaglobulinas IgG (por ejemplo, IVIG) y extraer el factor H de la
35 mezcla de fracciones.
En determinados modos de realización, una composición de factor H enriquecida que tiene una reducción en el contenido de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa se puede purificar adicionalmente después de la extracción a partir de un precipitado de la fracción I y/o de la torta de filtro de la fracción II+III. Están disponibles diversos procedimientos para purificar adicionalmente el factor H, incluyendo sin limitación, etapas de precipitación o fraccionamientos adicionales, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de exclusión por tamaño, tratamiento disolvente/detergente (S/D), nanofiltración, ultrafiltración, diafiltración, y similares.
45 En un modo de realización, el procedimiento comprende además precipitar impurezas a partir de una composición de factor H enriquecida. En determinados modos de realización, esta etapa comprende precipitar al menos una impureza, por ejemplo un lípido o proteína, de la composición y a continuación separar el precipitado del sobrenadante que contiene factor H. Opcionalmente, a continuación, se puede precipitar el factor H del sobrenadante en una precipitación separada.
En un modo de realización específico, una composición de factor H extraída de una fracción de plasma (por ejemplo, precipitado de la fracción I, precipitado de la fracción II+III, precipitado del Precipitado B, etc.) se enriquece adicionalmente separando por precipitado al menos una impureza de la solución usando PEG a una concentración final de entre aproximadamente un 2,5 % y aproximadamente un 7,5 %. En otro modo de realización, se usa PEG a
55 una concentración final de entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 7 %. En otro modo de realización, se usa PEG a una concentración final de entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 6 %. Aún en otro modo de realización, se usa PEG a una concentración final de aproximadamente un 5 %.
En otro modo de realización específico, una composición de factor H extraída de una fracción de plasma (por ejemplo, precipitado de la fracción I, precipitado de la fracción II+III, precipitado del Precipitado B, etc.) se enriquece adicionalmente separando por precipitado el factor H de la solución usando PEG a una concentración final de entre aproximadamente un 9 % y aproximadamente un 15 %. En otro modo de realización, se usa PEG a una concentración final de entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 14 %. En otro modo de realización, se usa PEG a una concentración final de entre aproximadamente un 11 % y aproximadamente un 13 %. Aún en otro
65 modo de realización, se usa PEG a una concentración final de aproximadamente un 12 %.
imagen51
En otro modo de realización específico, una composición de factor H extraída de una fracción de plasma (por ejemplo, precipitado de la fracción I, precipitado de la fracción II+III, precipitado del Precipitado B, etc.) se enriquece adicionalmente (a) separando por precipitado al menos una impureza de la solución; (b) separando por precipitado el 5 factor H de la solución; y (c) recuperando el precipitado que contiene el factor H. En determinados modos de realización, las etapas de precipitación se realizan con alcohol (por ejemplo, metanol o etanol), PEG, o una combinación de los mismos. En un modo de realización particular, las etapas de precipitación se realizan con PEG. En determinados modos de realización, la concentración de PEG de la primera etapa de precipitación está entre aproximadamente un 2,5 % y aproximadamente un 7,5 % y la concentración de PEG de la segunda etapa de 10 precipitación está entre aproximadamente un 9 % y aproximadamente un 15 %. En un modo de realización específico, la concentración de PEG de la primera etapa está entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 6 % y la concentración de PEG de la segunda etapa está entre aproximadamente un 11 % y aproximadamente un 13 %. En un modo de realización más específico, la concentración de PEG de la primera etapa de precipitación es de aproximadamente un 5 % y la concentración de PEG de la segunda etapa de precipitación es de aproximadamente 15 un 12 %. Aún en otros modos de realización, la concentración de PEG de las etapas de precipitación primera y
segunda se selecciona de las variaciones Var. 1101 y Var. 1221 enumeradas en la tabla 16.
imagen52
Concentración de PEG -Primera precipitación
2,5 %
3,0 % 3,5 % 4,0 % 4,5 % 5,0 % 5,5 % 6,0 % 6,5 % 7,0 % 7,5 %
Concentración de PEG -Segunda precipitación
2,5 % Var. 1101 Var. 1112 Var. 1123 Var. 1134 Var. 1145 Var. 1156 Var. 1167 Var. 1178 Var. 1189 Var. 1200 Var. 1211
3,0 %
Var. 1102 Var. 1113 Var. 1124 Var. 1135 Var. 1146 Var. 1157 Var. 1168 Var. 1179 Var. 1190 Var. 1201 Var. 1212
3,5 %
Var. 1103 Var. 1114 Var. 1125 Var. 1136 Var. 1147 Var. 1158 Var. 1169 Var. 1180 Var. 1191 Var. 1202 Var. 1213
4,0 %
Var. 1104 Var. 1115 Var. 1126 Var. 1137 Var. 1148 Var. 1159 Var. 1170 Var. 1181 Var. 1192 Var. 1203 Var. 1214
4,5 %
Var. 1105 Var. 1116 Var. 1127 Var. 1138 Var. 1149 Var. 1160 Var. 1171 Var. 1182 Var. 1193 Var. 1204 Var. 1215
5,0 %
Var. 1106 Var. 1117 Var. 1128 Var. 1139 Var. 1150 Var. 1161 Var. 1172 Var. 1183 Var. 1194 Var. 1205 Var. 1216
5,5 %
Var. 1107 Var. 1118 Var. 1129 Var. 1140 Var. 1151 Var. 1162 Var. 1173 Var. 1184 Var. 1195 Var. 1206 Var. 1217
6,0 %
Var. 1108 Var. 1119 Var. 1130 Var. 1141 Var. 1152 Var. 1163 Var. 1174 Var. 1185 Var. 1196 Var. 1207 Var. 1218
6,5 %
Var. 1109 Var. 1120 Var. 1131 Var. 1142 Var. 1153 Var. 1164 Var. 1175 Var. 1186 Var. 1197 Var. 1208 Var. 1219
7,0 %
Var. 1110 Var. 1121 Var. 1132 Var. 1143 Var. 1154 Var. 1165 Var. 1176 Var. 1187 Var. 1198 Var. 1209 Var. 1220
7,5 %
Var. 1111 Var. 1122 Var. 1133 Var. 1144 Var. 1155 Var. 1166 Var. 1177 Var. 1188 Var. 1199 Var. 1210 Var. 1221
En determinados modos de realización, el procedimiento para preparar una composición de factor H enriquecida
5 comprende además al menos una, preferentemente dos etapas cromatográficas para enriquecer adicionalmente la pureza de la composición. En general, se puede emplear cualquier procedimiento cromatográfico adecuado para enriquecer adicionalmente la composición de factor H, por ejemplo, extraído de un precipitado de la fracción I o torta de filtro de la fracción II+III. En determinados modos de realización, antes del enriquecimiento cromatográfico, la composición de factor H extraída se someterá a una o más etapas de precipitación adicionales, como se describe
10 anteriormente, para reducir las impurezas presentes en la composición, reducir el volumen de carga para la etapa cromatográfica, y/o intercambiar el tampón de la composición.
En determinados modos de realización, una composición de factor H se puede enriquecer adicionalmente por una etapa cromatográfica que comprende cromatografía de intercambio aniónico (AEC), cromatografía de intercambio
15 catiónico (CEC), cromatografía de afinidad por heparina, cromatografía de intercambio hidrófobo (HIC), cromatografía de hidroxiapatita (HAP), cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de exclusión por tamaño (es decir, filtración de gel), u otra etapa cromatográfica adecuada. Las etapas cromatográficas se pueden realizar en modo de lote o de columna.
20 En un modo de realización preferente, el procedimiento comprende el uso de cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de afinidad por heparina.
En determinados modos de realización, los procedimientos proporcionados en el presente documento para la preparación de una composición de factor H enriquecida incluirán adicionalmente al menos una, preferentemente al 25 menos dos, lo más preferentemente al menos tres, etapas de inactivación o retirada vírica. Ejemplos no limitantes de etapas de inactivación o retirada vírica que se pueden emplear con los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen, tratamiento con disolvente-detergente (Horowitz etal, Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Supl 3):S21-S28 y Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, de los que ambos se incorporan en el presente documento expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), nanofiltración (Hamamoto et at., 30 Vox Sang 1989 (56)230-236 y Yuasa et at., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):202I-2024, de los que ambos se incorporan en el presente documento expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), incubación a pH
imagen53
bajo a temperaturas altas (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 y Louie et al., Biologicals 1994 (22): 13-19), y tratamiento térmico de composiciones de factor H liofilizadas (Piszkiewicz etat, Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235-41; Piszkiewicz et al, Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein y Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;l 14(3):335-40).
5 En un modo de realización preferente, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una composición de factor H enriquecida víricamente segura que tiene una reducción en el contenido de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa que comprende (i) extraer el factor H de una torta de filtro de la fracción II+III usando SiO2, (ii) realizar una primera etapa de precipitación para precipitar al menos una impureza de la composición de factor H, (iii) realizar una segunda etapa de precipitación para precipitar el factor H de la composición, y (iv) realizar al menos una etapa de inactivación o retirada vírica, preparando de este modo una composición de factor H enriquecida víricamente segura. En un modo de realización, las etapas de precipitación comprenden precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la concentración de PEG de las etapas de precipitación primera y segunda se selecciona de las variaciones Var. 1101 y Var. 1221 enumeradas en la tabla 16.
15
2. Unión conjunta y elución diferencial
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento extraer conjuntamente el factor H y una serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa de una composición derivada de mezcla de plasmas uniendo las proteínas a dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido, eluir la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa del SiO2 bajo una primera condición de solución, y posteriormente eluir el factor H del SiO2 bajo una segunda condición de solución. En un modo de realización preferente, la composición de partida es un precipitado de la fracción II+III resuspendida o precipitado
25 equivalente del mismo.
En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; (c) eluir la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa del SiO2 bajo una condición de solución en la que el factor H permanece unido; y (d) eluir el factor H del SiO2.
En determinados modos de realización, una condición de solución en la que el factor H permanece unido se refiere a
35 una condición que eluye preferencialmente la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa, mientras que una fracción sustancial de factor H permanece unida al SiO2. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % del factor H unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 25 % del factor H unido al the SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % del factor H unido al the SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % del factor H unido al the SiO2. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % del factor H unido al SiO2, o al menos un 15, 20,25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o más del factor H unido al SiO2.
En determinados modos de realización, la elución diferencial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa y
45 factor H se logra poniendo en contacto secuencialmente (es decir, elución en etapas) el SiO2 con una primera condición de solución (por ejemplo, un primer tampón de elución) adecuada para eluir la mayoría de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa pero no la fracción sustancial del factor H unido, y una segunda condición de solución (por ejemplo, un segundo tampón de elución) adecuada para eluir la fracción sustancial de factor H unido del SiO2.
En otros modos de realización, la elución diferencial e la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa y factor H se logra cambiando gradualmente las condiciones de solución (es decir, con un gradiente de elución) desde una primera condición de solución adecuada para eluir la mayoría de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa pero no una fracción sustancial del factor H unido hasta una segunda condición de solución adecuada para eluir la fracción
55 sustancial del factor H unido del SiO2. De esta forma, el contenido de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa y factor H separado por elución del SiO2 se pueden solapar parcialmente. Al fraccionar la elución y caracterizar las fracciones individuales, se puede crear una reserva de factor H a partir de fracciones que tienen contenido en factor H alto y un contenido en serina proteasa o zimógeno de serina proteasa bajo.
Las condiciones de solución que se pueden variar para lograr un resultado deseado de un procedimiento descrito anteriormente incluyen, sin limitación, el pH de la solución, la conductividad de la solución, la temperatura de la solución, la concentración de factor H en la composición, y la concentración de SiO2 usada en el procedimiento. En general, los intervalos de pH adecuados para procedimientos de reducción del contenido en serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa en una composición enriquecida de factor H varían de aproximadamente 3 a 65 aproximadamente 11. Las conductividades adecuadas para los procedimientos descritos anteriormente varían de
imagen54
aproximadamente 0,1 mS/cm a aproximadamente 100 mS/cm. Las temperaturas adecuadas para realizar los procedimientos descritos anteriormente varían de aproximadamente -10 ºC a aproximadamente 90 ºC. Se puede usar dióxido de silicio finamente dividido a una concentración final que varía de aproximadamente 0,01 g/g proteína a aproximadamente 10 g/g proteína. Finalmente, las composiciones de factor H pueden variar en un concentración de
5 aproximadamente 0,001 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción significativa del factor H permanece unida comprende un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 11,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 1,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,5. Aún en otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0.
En un modo de realización particular, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina
15 proteasa se eluye del SiO2 y una fracción significativa del factor H permanece unida comprende un pH de aproximadamente 7,0. En otro modo de realización específico, el pH es aproximadamente 7,5. En otro modo de realización, el pH es aproximadamente 8,0. Aún en otros modos de realización, el pH es aproximadamente 3,0 o aproximadamente 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, u 11,0.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción significativa del factor H permanece unida comprende un pH de al menos 6,0. En otro
25 modo de realización, el pH es al menos 6,5. En otro modo de realización, el pH es al menos 7,0. Aún en otro modo de realización, el pH es al menos 7,5. Aún en otros modos de realización, el pH de la solución es al menos 3,0 o al menos 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, o mayor.
En otro modo de realización, de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2  
En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 10,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 9,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 8,0. Aún en
35 otros modos de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 11,0, o 10,5, 10,0, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, o menor.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción significativa del factor H permanece unida comprende una conductividad de al menos 10 mS/cm. En otro modo de realización, the conductividad es al menos 20 mS/cm. Aún en otros modos de realización, la conductividad de la condición de solución es al menos 2 mS/cm, o al menos 3 mS/cm, 4 mS/cm, 5 mS/cm, 6 mS/cm, 7 mS/cm, 8 mS/cm, 9 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17 mS/cm, 18 mS/cm, 19 mS/cm, 20 mS/cm, 21 mS/cm, 22 mS/cm, 23 mS/cm, 24 mS/cm, 25 mS/cm, 26 mS/cm, 27 mS/cm, 28 mS/cm, 29 mS/cm, 30 mS/cm, 31 mS/cm, 32 mS/cm, 33 mS/cm, 34 mS/cm, 35 mS/cm, 36 mS/cm, 37
45 mS/cm, 38 mS/cm, 39 mS/cm, 40 mS/cm, 41 mS/cm, 42 mS/cm, 43 mS/cm, 44 mS/cm, 45 mS/cm, 46 mS/cm, 47 mS/cm, 48 mS/cm, 49 mS/cm, 50 mS/cm, 55 mS/cm, 60 mS/cm, 65 mS/cm, 70 mS/cm, 75 mS/cm, 80 mS/cm, 85 mS/cm, 90 mS/cm, 95 mS/cm, 100 mS/cm, o mayor.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción significativa del factor H permanece unida comprende una conductividad entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 100 mS/cm. En otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 50 mS/cm. En otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 20 mS/cm y aproximadamente 100 mS/cm. Aún en otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 20 mS/cm y aproximadamente 50 mS/cm.
55 Como se muestra en el ejemplo 5 y se ilustra en la figura 3, se descubrió que el uso de condiciones de solución que tienen un pH mayor de 6,0 (por ejemplo, 7,5) y un incremento en la conductividad (por ejemplo, mayor de 6,0 mS/cm), da como resultado un incremento en la elución de serina proteasas y/o zimógenos de serina proteasas de SiO2, y una disminución en la elución del factor H de SiO2. De forma ventajosa, estos hallazgos se pueden usar para proporcionar procedimientos para reducir los niveles de serina proteasa y zimógeno de serina proteasa presentes en las composiciones de factor H. En un modo de realización particular de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2 y una fracción significativa del factor H permanece unida comprende una conductividad de al menos aproximadamente 10 mS/cm y un pH de al menos 7,0. En otro modo de realización particular, la condición de solución comprende un conductividad
65 de al menos 10 mS/cm y un pH de al menos 7,5. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un conductividad de al menos 20 mS/cm y un pH de al menos 7,0. Aún en otro modo de realización, la condición de solución comprende un conductividad de al menos 20 mS/cm y un pH de al menos 7,5.
imagen55
3. Unión conjunta y elución del factor H preferencial
5 En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento extraer conjuntamente el factor H y una serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa de una composición derivada de mezcla de plasmas uniendo las proteínas a dióxido de silicio (SiO2)
10 finamente dividido, y eluir el factor H del SiO2 bajo condiciones en las que una fracción sustancial de la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa unido permanece unida al SiO2. En un modo de realización preferente, la composición de partida es un precipitado de la fracción II+III resuspendido o precipitado equivalente del mismo.
En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto una
15 composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el factor H del SiO2 bajo una condición de solución en la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido.
20 En determinados modos de realización, una condición de solución en la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido se refiere a una condición que eluye preferencialmente el factor H, mientras que una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida al SiO2. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 25 % de la
25 serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2, o al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,
30 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o más de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2.
Las condiciones de solución que se pueden variar para lograr un resultado deseado de un procedimiento descrito anteriormente incluyen, sin limitación, el pH de la solución, la conductividad de la solución, la temperatura de la solución, la concentración de factor H en la composición, y la concentración de SiO2 usada en el procedimiento. En 35 general, los intervalos de pH adecuados para procedimientos de reducción del contenido en serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa en una composición enriquecida de factor H varían de aproximadamente 3 a aproximadamente 11. Las conductividades adecuadas para los procedimientos descritos anteriormente varían de aproximadamente 0,1 mS/cm a aproximadamente 100 mS/cm. Las temperaturas adecuadas para realizar los procedimientos descritos anteriormente varían de aproximadamente -10 ºC a aproximadamente 90 ºC. Se puede usar
40 dióxido de silicio finamente dividido a una concentración final que varía de aproximadamente 0,01 g/g proteína a aproximadamente 10 g/g proteína. Finalmente, las composiciones de factor H pueden variar en un concentración de aproximadamente 0,001 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y una fracción
45 significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida comprende un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 11,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 1,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,5. Aún en otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0.
50 En un modo de realización particular, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida comprende un pH de aproximadamente 7,0. En otro modo de realización específico, el pH es aproximadamente 7,5. In otro modo de realización, el pH es aproximadamente 8,0. Aún en otros modos de realización, el pH es aproximadamente 3,0 o
55 aproximadamente 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 64, 6,5, 6,6, 6,1, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 u 11,0.
60 En un modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida comprende un pH de al menos 6,0. En otro modo de realización, el pH es al menos 6,5. En otro modo de realización, el pH es al menos 7,0. Aún en otro modo de realización, el pH es al menos 7,5. Aún en otros modos de realización, el pH de la solución es al menos 3,0 o al menos 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, o mayor.
65 En otro modo de realización, de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida comprende un pH de no mayor de aproximadamente 11,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 10,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 9,0.
imagen56
5 En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 8,0. Aún en otros modos de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 11,0, o 10,5, 10,0, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, o menor.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida comprende una conductividad de no más de aproximadamente 20 mS/cm. En otro modo de realización, the conductividad es no más de aproximadamente 10 mS/cm. Aún en otros modos de realización, la conductividad de la condición de solución es no más de aproximadamente 20 mS/cm, o no más de aproximadamente 19 mS/cm, 18 mS/cm, 17 mS/cm, 16 mS/cm, 15 mS/cm, 14 mS/cm, 13 mS/cm, 12 mS/cm, 11 mS/cm, 10 mS/cm, 9 mS/cm, 8 mS/cm, 7 mS/cm, 6 mS/cm, 5 mS/cm, 4
15 mS/cm, 3 mS/cm, 2 mS/cm, o menor.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se eluye del SiO2  
Como se muestra en el ejemplo 5 y se ilustra en la figura 3, se descubrió que el uso de condiciones de solución que
25 tienen un pH mayor de 6,0 (por ejemplo, 7,5) y una disminución en la conductividad (por ejemplo, menor de 20 mS/cm), da como resultado un incremento en la elución del factor H de SiO2, y una disminución en la elución de serina proteasas y/o zimógenos de serina proteasas de SiO2. De forma ventajosa, estos hallazgos se pueden usar para proporcionar procedimientos para reducir los niveles de serina proteasa y zimógeno de serina proteasa presentes en las composiciones de factor H. En un modo de realización particular de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se eluye del SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida comprende una conductividad de no más de aproximadamente 20 mS/cm y un pH de al menos 7,0. En otro modo de realización particular, la condición de solución comprende un conductividad de no más de aproximadamente 10 mS/cm y un pH de al menos 7,5. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un conductividad entre aproximadamente 10 mS/cm y
35 aproximadamente 2 mS/cm y un pH de al menos 7,0. Aún en otro modo de realización, la condición de solución comprende un conductividad entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 2 mS/cm y un pH de al menos 7,5.
4. Unión preferencial del factor H
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas
45 para unir el factor H pero no la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el factor H del SiO2.
En determinados modos de realización, una condición de solución en la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une al SiO2 se refiere a una condición que permite preferencialmente la unión del factor H al SiO2, mientras que una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece no unida en la solución. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 25 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % de la serina proteasa o zimógeno de
55 serina proteasa en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida, o al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o más de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida.
Las condiciones de solución que se pueden variar para lograr un resultado deseado de un procedimiento descrito anteriormente incluyen, sin limitación, el pH de la solución, la conductividad de la solución, la temperatura de la solución, la concentración de factor H en la composición, y la concentración de SiO2 usada en el procedimiento. En general, los intervalos de pH adecuados para procedimientos de reducción del contenido en serina proteasa y/o 65 zimógeno de serina proteasa en una composición enriquecida de factor H varían de aproximadamente 3 a
imagen57
5 aproximadamente 10 g/g proteína. Finalmente, las composiciones de factor H pueden variar en un concentración de aproximadamente 0,001 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se une a SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une comprende un pH entre aproximadamente 5,0 y
10 aproximadamente 11,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 1,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,5. Aún en otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0.
15 En un modo de realización particular, la condición de solución bajo la que factor H se une a SiO y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une comprende un pH de aproximadamente 7,0. En otro modo de realización específico, el pH es aproximadamente 7,5. En otro modo de realización, el pH es aproximadamente 8,0. Aún en otros modos de realización, el pH es aproximadamente 3,0 o aproximadamente 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8,
20 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 u 11,0.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se une a SiO2 y una fracción significativa
25 de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une comprende un pH de al menos 6,0. En otro modo de realización, el pH es al menos 6,5. En otro modo de realización, el pH es al menos 7,0. Aún en otro modo de realización, el pH es al menos 7,5. Aún en otros modos de realización, el pH de la solución es al menos 3,0 o al menos 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, o mayor.
30 En otro modo de realización, de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que factor H se une a SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une comprende un pH de no mayor de aproximadamente 11,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 10,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 9,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 8,0. Aún en otros modos de realización, el pH es no mayor de
35 aproximadamente 11,0, o 10,5, 10,0, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, o menor.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se une SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une comprende una conductividad de al menos 10 mS/cm. En otro modo de realización, the conductividad es al menos 20 mS/cm. Aún en otros modos de realización, la 40 conductividad de la condición de solución es al menos 2 mS/cm, o al menos 3 mS/cm, 4 mS/cm, 5 mS/cm, 6 mS/cm, 7 mS/cm, 8 mS/cm, 9 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17 mS/cm, 18 mS/cm, 19 mS/cm, 20 mS/cm, 21 mS/cm, 22 mS/cm, 23 mS/cm, 24 mS/cm, 25 mS/cm, 26 mS/cm, 27 mS/cm, 28 mS/cm, 29 mS/cm, 30 mS/cm, 31 mS/cm, 32 mS/cm, 33 mS/cm, 34 mS/cm, 35 mS/cm, 36 mS/cm, 37 mS/cm, 38 mS/cm, 39 mS/cm, 40 mS/cm, 41 mS/cm, 42 mS/cm, 43 mS/cm, 44 mS/cm, 45 mS/cm, 46 mS/cm, 47
45 mS/cm, 48 mS/cm, 49 mS/cm, 50 mS/cm, 55 mS/cm, 60 mS/cm, 65 mS/cm, 70 mS/cm, 75 mS/cm, 80 mS/cm, 85 mS/cm, 90 mS/cm, 95 mS/cm, 100 mS/cm, o mayor.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que el factor H se une a SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une comprende una conductividad entre
50 aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 100 mS/cm. En otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 50 mS/cm. En otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 20 mS/cm y aproximadamente 100 mS/cm. Aún en otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 20 mS/cm y aproximadamente 50 mS/cm.
55 Como se muestra en el ejemplo 5 y se ilustra en la figura 3, se descubrió que el uso de condiciones de solución que tienen un pH mayor de 6,0 (por ejemplo, 7,5) y un incremento en la conductividad (por ejemplo, mayor de 6,0 mS/cm), da como resultado una disminución en la afinidad de serina proteasas y/o zimógenos de serina proteasas por SiO2, y un incremento en la afinidad del factor H por SiO2. De forma ventajosa, estos hallazgos se pueden usar para proporcionar procedimientos para reducir los niveles de serina proteasa y zimógeno de serina proteasa presentes en
60 las composiciones de factor H. En un modo de realización particular de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que el factor H se une a SiO2 y una fracción significativa de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une comprende una conductividad de al menos aproximadamente 10 mS/cm y un pH de al menos 7,0. En otro modo de realización particular, la condición de solución comprende un conductividad de al menos 10 mS/cm y un pH de al menos 7,5. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un conductividad de al menos 20 mS/cm y un pH de al menos 7,0. Aún en otro modo de realización, la condición de solución comprende un conductividad de al menos 20 mS/cm y un pH de al menos 7,5.
imagen58
5. Unión preferencial de serina proteasa o zimógeno de serina proteasa
5 En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, el procedimiento que comprende (a) poner en contacto una composición que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas
10 para unir la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa pero no el factor H; y (b) separar el SiO2 de la composición.
En determinados modos de realización, una condición de solución en la que el factor H no se une al SiO2  una condición que permite preferencialmente la unión de serina proteasa o zimógeno de serina proteasa al SiO2, 15 mientras que una fracción sustancial del factor H permanece no unida en la solución. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % del factor H en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 25 % del factor H en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % del factor H en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % del factor H en la composición de 20 partida. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % del factor H en la composición de partida, o al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99,
o más del factor H en la composición de partida.
Las condiciones de solución que se pueden variar para lograr un resultado deseado de un procedimiento descrito
25 anteriormente incluyen, sin limitación, el pH de la solución, la conductividad de la solución, la temperatura de la solución, la concentración de factor H en la composición, y la concentración de SiO2 usada en el procedimiento. En general, los intervalos de pH adecuados para procedimientos de reducción del contenido en serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa en una composición enriquecida de factor H varían de aproximadamente 3 a aproximadamente 11. Las conductividades adecuadas para los procedimientos descritos anteriormente varían de
30 aproximadamente 0,1 mS/cm a aproximadamente 100 mS/cm. Las temperaturas adecuadas para realizar los procedimientos descritos anteriormente varían de aproximadamente -10 ºC a aproximadamente 90 ºC. Se puede usar dióxido de silicio finamente dividido a una concentración final que varía de aproximadamente 0,01 g/g proteína a aproximadamente 10 g/g proteína. Finalmente, las composiciones de factor H pueden variar en un concentración de aproximadamente 0,001 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml.
35 En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une a SiO2 y una fracción significativa del factor H no se une comprende un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 11,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 1,0. En otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0. En otro modo de
40 realización, el pH está entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,5. Aún en otro modo de realización, el pH está entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0.
En un modo de realización particular, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une a SiO2 y una fracción significativa del factor H no se une comprende un pH de aproximadamente 7,0. 45 En otro modo de realización específico, el pH es aproximadamente 7,5. En otro modo de realización, el pH es aproximadamente 8,0. Aún en otros modos de realización, el pH es aproximadamente 3,0 o aproximadamente 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 u
50 11,0.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une a SiO2 y una fracción significativa del factor H no se une comprende un pH de al menos 6,0. En otro modo de realización, el pH es al menos 6,5. En otro modo de realización, el pH es al menos 7,0. Aún en otro modo de
55 realización, el pH es al menos 7,5. Aún en otros modos de realización, el pH de la solución es al menos 3,0 o al menos 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, o mayor.
En otro modo de realización, de cualquier de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une SiO2 y una fracción significativa del factor H no
60 se une comprende un pH de no mayor de aproximadamente 11,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 10,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 9,0. En otro modo de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 8,0. Aún en otros modos de realización, el pH es no mayor de aproximadamente 11,0, o 10,5, 10,0, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, o menor.
imagen59
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une a SiO2 y una fracción significativa del factor H no se une comprende una conductividad de no más de aproximadamente 20 mS/cm. En otro modo de realización, the conductividad es no más de aproximadamente 10 mS/cm. Aún en otros modos de realización, la conductividad de la condición de solución es no más de
5 aproximadamente 20 mS/cm, o no más de aproximadamente 19 mS/cm, 18 mS/cm, 17 mS/cm, 16 mS/cm, 15 mS/cm, 14 mS/cm, 13 mS/cm, 12 mS/cm, 11 mS/cm, 10 mS/cm, 9 mS/cm, 8 mS/cm, 7 mS/cm, 6 mS/cm, 5 mS/cm, 4 mS/cm, 3 mS/cm, 2 mS/cm, o menor.
En un modo de realización, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une a SiO2 y una fracción significativa del factor H no se une comprende una conductividad entre aproximadamente 2 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm. En otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 2 mS/cm y aproximadamente 10 mS/cm. En otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 20 mS/cm y aproximadamente 6 mS/cm. Aún en otro modo de realización, la conductividad es entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 6 mS/cm.
15 Como se muestra en el ejemplo 5 y se ilustra en la figura 3, se descubrió que el uso de condiciones de solución que tienen un pH mayor de 6,0 (por ejemplo, 7,5) y una disminución en la conductividad (por ejemplo, menor de 20 mS/cm), da como resultado un incremento en la afinidad del factor H por SiO2, y una disminución en la afinidad de serina proteasas y/o zimógenos de serina proteasas por SiO2. De forma ventajosa, estos hallazgos se pueden usar para proporcionar procedimientos para reducir los niveles de serina proteasa y zimógeno de serina proteasa presentes en las composiciones de factor H. En un modo de realización particular de los procedimientos descritos anteriormente, la condición de solución bajo la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se une a SiO2 y una fracción significativa del factor H no se une comprende una conductividad de no más de aproximadamente 20 mS/cm y un pH de al menos 7,0. En otro modo de realización particular, la condición de solución comprende un
25 conductividad de no más de aproximadamente 10 mS/cm y un pH de al menos 7,5. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un conductividad entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 2 mS/cm y un pH de al menos 7,0. Aún en otro modo de realización, la condición de solución comprende un conductividad entre aproximadamente 10 mS/cm y aproximadamente 2 mS/cm y un pH de al menos 7,5.
6. Procedimiento para la extracción del factor H de un precipitado de plasma
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de factor H, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto una composición de precipitado de plasma suspendido que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de 35 silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H, (b) lavar el SiO con una solución que comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad menor de 4 mS/cm, y (c) eluir el factor H del SiO2 con una solución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad mayor de 10 mS/cm, proporcionando de este modo una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es una o más de FXI, FXIa, FXII, y FXIIa. En determinados modos de realización, el precipitado de plasma es un precipitado de la fracción I de Cohn, un precipitado de la fracción II+III de Cohn, un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn, un Precipitado A de Kistler/Nitschmann, un Precipitado B de Kistler/Nitschmann, o una fracción equivalente de los mismos. En un modo de realización, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH entre 5,5 y 6,5. En un modo de realización específico, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH de 6,0±0,2. En un modo de realización, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de al
45 menos 20 mS/cm. En un modo de realización específico, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de entre 25 mS/cm y 40 mS/cm.
En determinados modos de realización, el procedimiento descrito anteriormente comprende además una etapa de enriquecimiento que comprende precipitar al menos una impureza de la composición de factor H enriquecida, en la que el factor H no coprecipita. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de (a) poner en contacto una composición de precipitado de plasma suspendido que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H, (b) lavar el SiO2 con una solución que comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad menor de 4 mS/cm, (c) eluir el factor H del SiO2 con una solución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una 55 conductividad mayor de 10 mS/cm, y (d) precipitar al menos una impureza de la elución del factor H, en la que el factor H no precipita, proporcionando de este modo una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es una o más de FXI, FXIa, FXII, y FXIIa. En determinados modos de realización, el precipitado de plasma es un precipitado de la fracción I de Cohn, un precipitado de la fracción II+III de Cohn, un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn, un Precipitado A de Kistler/Nitschmann, un Precipitado B de Kistler/Nitschmann, o una fracción equivalente de los mismos. En un modo de realización, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH entre 5,5 y 6,5. En un modo de realización específico, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH de 6,0±0,2. En un modo de realización, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En un modo de realización específico, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de entre 25 mS/cm y 40 mS/cm. En 65 un modo de realización, la etapa de precipitación de impurezas es una precipitación con PEG. En un modo de
imagen60
realización específico, la precipitación con PEG de impurezas comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 3 % y un 7 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 en la etapa de precipitación de impurezas es de un 5±0,5 %.
5 En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además una etapa de enriquecimiento que comprende precipitar el factor H de una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de (a) poner en contacto una composición de precipitado de plasma suspendido que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H, (b) lavar el SiO2 con una solución que comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad menor de 4 mS/cm, (c) eluir el factor H del SiO2 con una solución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad mayor de 10 mS/cm, (d) precipitar al menos una impureza de la elución del factor H, para formar un sobrenadante que comprende factor H, y
(e) precipitar el factor H del sobrenadante, proporcionando de este modo una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es una o más de FXI, FXIa, 15 FXII, y FXIIa. En determinados modos de realización, el precipitado de plasma es un precipitado de la fracción I de Cohn, un precipitado de la fracción II+III de Cohn, un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn, un Precipitado A de Kistler/Nitschmann, un Precipitado B de Kistler/Nitschmann, o una fracción equivalente de los mismos. En un modo de realización, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH entre 5,5 y 6,5. En un modo de realización específico, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH de 6,0±0,2. En un modo de realización, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En un modo de realización específico, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de entre 25 mS/cm y 40 mS/cm. En un modo de realización, la etapa de precipitación de impurezas es una precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG de impurezas comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 3 % y un 7 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG
25 4000 en la etapa de precipitación de impurezas es de un 5±0,5 %. En un modo de realización, la etapa de precipitación del factor H es precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG del factor H comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 10 % y un 15 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 es de un 12±0,5 % en la etapa de precipitación del factor H.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además una etapa de enriquecimiento que comprende realizar una cromatografía de intercambio aniónico con una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de (a) poner en contacto una composición de precipitado de plasma suspendido que contiene factor H y al menos una serina proteasa 35 o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H, (b) lavar el SiO2 con una solución que comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad menor de 4 mS/cm, (c) eluir el factor H del SiO2 con una solución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad mayor de 10 mS/cm, (d) precipitar al menos una impureza de la elución del factor H, para formar un sobrenadante que comprende factor H, (e) precipitar el factor H del sobrenadante, (f) resuspender el precipitado que comprende factor H, (g) unir el factor H presente en el precipitado resuspendido a una resina de intercambio aniónico, y (h) eluir el factor H de la resina de intercambio aniónico, proporcionando de este modo una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es una o más de FXI, FXIa, FXII, y FXIIa. En determinados modos de realización, el precipitado de plasma es un precipitado de la fracción I de Cohn, un precipitado de la fracción II+III de Cohn, un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn, un Precipitado A de 45 Kistler/Nitschmann, un Precipitado B de Kistler/Nitschmann, o una fracción equivalente de los mismos. En un modo de realización, la solución usada para lavar el SiO comprende un pH entre 5,5 y 6,5. En un modo de realización específico, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH de 6,0±0,2. En un modo de realización, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En un modo de realización específico, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de entre 25 mS/cm y 40 mS/cm. En un modo de realización, la etapa de precipitación de impurezas es una precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG de impurezas comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 3 % y un 7 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 en la etapa de precipitación de impurezas es de un 5±0,5 %. En un modo de realización, la etapa de precipitación del factor H es precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG
55 del factor H comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 10 % y un 15 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 es de un 12±0,5 % en la etapa de precipitación del factor H.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además una etapa de enriquecimiento que comprende realizar una cromatografía de afinidad por heparina con una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de (a) poner en contacto una composición de precipitado de plasma suspendido que contiene factor H y al menos una serina proteasa
o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir
el factor H, (b) lavar el SiO2 con una solución que comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad menor de 4 65 mS/cm, (c) eluir el factor H del SiO2 con una solución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad mayor de 10 mS/cm, (d) precipitar al menos una impureza de la elución del factor H, para formar un sobrenadante que comprende factor H, (e) precipitar el factor H del sobrenadante, (f) resuspender el precipitado que comprende factor H, (g) unir el factor H presente en el precipitado resuspendido a una resina de intercambio aniónico, (h) eluir el factor H de la resina de intercambio aniónico, (i) unir el factor H presente en el eluato de intercambio aniónico a una resina de afinidad por heparina, y (j) eluir el factor H de la resina de afinidad por heparina, proporcionando de este modo una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es una o más de FXI, FXIa, FXII, y FXIIa. En determinados modos de realización, el precipitado de plasma es un precipitado de la fracción I de Cohn, un precipitado de la fracción II+III de Cohn, un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn, un Precipitado A de Kistler/Nitschmann, un Precipitado B de Kistler/Nitschmann, o una fracción equivalente de los mismos. En un modo de realización, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH entre 5,5 y 6,5. En un modo de realización específico, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH de 6,0±0,2. En un modo de realización, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En un modo de realización específico, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de entre 25 mS/cm y 40 mS/cm. En un modo de realización, la etapa de precipitación de impurezas es una precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG de impurezas comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 3 % y un 7 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 en la etapa de precipitación de impurezas es de un 5±0,5 %. En un modo de realización, la etapa de precipitación del factor H es precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG del factor H comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 10 % y un 15 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 es de un 12±0,5 % en la etapa de precipitación del factor H.
imagen61
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además someter una composición de factor H a una etapa de retirada y/o inactivación vírica dedicada. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de (a) poner en contacto una composición de precipitado de plasma suspendido que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H, (b) lavar el SiO2 con una solución que comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad menor de 4 mS/cm, (c) eluir el factor H del SiO2 con una solución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad mayor de 10 mS/cm, (d) precipitar al menos una impureza de la elución del factor H, para formar un sobrenadante que comprende factor H, (e) precipitar el factor H del sobrenadante, (f) resuspender el precipitado que comprende factor H, (g) unir el factor H presente en el precipitado resuspendido a una resina de intercambio aniónico, (h) eluir el factor H de la resina de intercambio aniónico, (i) unir el factor H presente en el eluato del intercambio aniónico a una resina de afinidad por heparina, (j) eluir el factor H de la resina de afinidad por heparina, y (k) realizar una etapa de retirada y/o inactivación vírica dedicada seleccionada de nanofiltración, tratamiento con disolvente/detergente (S/D), tratamiento térmico, e incubación a pH bajo, proporcionando de este modo una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es una o más de FXI, FXIa, FXII, y FXIIa. En determinados modos de realización, el precipitado de plasma es un precipitado de la fracción I de Cohn, un precipitado de la fracción II+III de Cohn, un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn, un Precipitado A de Kistler/Nitschmann, un Precipitado B de Kistler/Nitschmann, o una fracción equivalente de los mismos. En un modo de realización, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH entre 5,5 y 6,5. En un modo de realización específico, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH de 6,0±0,2. En un modo de realización, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En un modo de realización específico, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de entre 25 mS/cm y 40 mS/cm. En un modo de realización, la etapa de precipitación de impurezas es una precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG de impurezas comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 3 % y un 7 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 en la etapa de precipitación de impurezas es de un 5±0,5 %. En un modo de realización, la etapa de precipitación del factor H es precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG del factor H comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 10 % y un 15 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 es de un 12±0,5 % en la etapa de precipitación del factor H.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además una etapa de concentrar una composición de factor H enriquecida por ultrafiltración/diafiltración. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de (a) poner en contacto una composición de precipitado de plasma suspendido que contiene factor H y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el factor H, (b) lavar el SiO2 con una solución que comprende un pH entre 5,0 y 7,0 y una conductividad menor de 4 mS/cm, (c) eluir el factor H del SiO2 con una solución que comprende un pH entre 7,0 y 8,0 y una conductividad mayor de 10 mS/cm, (d) precipitar al menos una impureza de la elución del factor H, para formar un sobrenadante que comprende factor H, (e) precipitar el factor H del sobrenadante, (f) resuspender el precipitado que comprende factor H, (g) unir el factor H presente en el precipitado resuspendido a una resina de intercambio aniónico, (h) eluir el factor H de la resina de intercambio aniónico, (i) unir el factor H presente en el eluato del intercambio aniónico a una resina de afinidad por heparina, (j) eluir el factor H de la resina de afinidad por heparina, (k) realizar una etapa de retirada y/o inactivación vírica dedicada seleccionada de nanofiltración, tratamiento con disolvente/detergente (S/D), tratamiento térmico, e incubación a pH bajo, y ( j) concentrar el factor H por ultrafiltración/diafiltración, proporcionando de este modo una composición de factor H enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es una o más de FXI, FXIa, FXII, y FXIIa. En determinados modos de realización, el precipitado de plasma es un precipitado de la fracción I de Cohn, un precipitado de la fracción II+III de Cohn, un precipitado de la fracción I+II+III de Cohn, un Precipitado A de Kistler/Nitschmann, un Precipitado B de Kistler/Nitschmann, o una fracción equivalente de los mismos. En un modo de realización, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH entre 5,5 y 6,5. En un modo de realización específico, la solución usada para lavar el SiO2 comprende un pH de 6,0±0,2. En un modo de realización, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En un modo de realización específico, la solución usada para eluir el factor H comprende una conductividad de entre 25 mS/cm y 40 mS/cm. En un modo de realización, la etapa de precipitación de impurezas es una precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG de impurezas comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 3 % y un 7 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 en la etapa de precipitación de impurezas es de un 5±0,5 %. En un modo de realización, la etapa de precipitación del factor H es precipitación con PEG. En un modo de realización específico, la precipitación con PEG del factor H comprende precipitación con PEG 4000 a una concentración final entre un 10 % y un 15 %. En un modo de realización más específico, la concentración final de PEG 4000 es de un 12±0,5 % en la etapa de precipitación del factor H.
imagen62
C. Inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI)
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de IαI derivado de plasma. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto la composición de IαI con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (b) separar el SiO2 de la composición de IαI para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII).
En un modo de realización, el procedimiento comprende además la etapa de realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína de IαI para formar una primera composición de IαI enriquecida, antes de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína de IαI se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína IαI para formar una segunda composición de IαI enriquecida, antes de poner en contacto la composición con el dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína de IαI se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de IαI derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de IαI para formar una primera composición de IαI derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de IαI para formar una segunda composición de IαI derivada de plasma; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una etapa de enriquecimiento de IαI después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la etapa de enriquecimiento de IαI se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de IαI derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de IαI para formar una primera composición de IαI derivada de plasma enriquecida; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (d) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de IαI para formar una segunda composición de IαI derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
imagen63
Asimismo, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de IαI derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de IαI para formar una primera composición de IαI derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de IαI para formar una segunda composición de IαI derivada de plasma enriquecida; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (e) realizar una tercera etapa de enriquecimiento de IαI para formar una tercera composición de IαI derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 101 a Var. 1100, encontradas en la tabla 2, tabla 3, tabla 4, tabla 5, tabla 6, tabla 7, tabla 8, tabla 9, tabla 10 o tabla 11.
1. Unión conjunta y elución diferencial
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de IαI derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento extraer conjuntamente el IαI y una serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa de una composición derivada de mezcla de plasmas uniendo las proteínas a dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido, eluir la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa del SiO2 bajo una primera condición de solución, y posteriormente eluir el IαI del SiO2 bajo una segunda condición de solución. En un modo de realización preferente, la composición de partida es un precipitado de la fracción II+III resuspendida o precipitado equivalente del mismo.
En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene IαI y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el IαI y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2  SiO2 bajo una condición de solución en la que el IαI permanece unido; y (d) eluir el IαI del SiO2.
En determinados modos de realización, una condición de solución en la que el IαI permanece unido se refiere a una condición que eluye preferencialmente la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa, mientras que una fracción sustancial de IαI permanece unida al SiO2. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % del IαI unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 25 % del IαI unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % del IαI unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % del IαI unido al SiO2. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % del IαI unido al SiO2, o al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o más del IαI unido al SiO2.
En determinados modos de realización, la elución diferencial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa y IαI se logra poniendo en contacto secuencialmente (es decir, elución en etapas) el SiO2 con una primera condición de solución (por ejemplo, un primer tampón de elución) adecuada para eluir la mayoría de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa pero no la fracción sustancial del IαI unido, y una segunda condición de solución (por ejemplo, un segundo tampón de elución) adecuada para eluir la fracción sustancial de IαI unido del SiO2.
En otros modos de realización, la elución diferencial e la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa y IαI se logra cambiando gradualmente las condiciones de solución (es decir, con un gradiente de elución) desde una primera condición de solución adecuada para eluir la mayoría de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa pero no una fracción sustancial del IαI unido hasta una segunda condición de solución adecuada para eluir la fracción sustancial del IαI unido del SiO2. De esta forma, el contenido de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa e IαI separado por elución del SiO2 se pueden solapar parcialmente. Al fraccionar la elución y caracterizar las fracciones individuales, se puede crear una reserva de IαI a partir de fracciones que tienen contenido en IαI alto y un contenido en serina proteasa o zimógeno de serina proteasa bajo.
2. Unión conjunta y elución del IαI preferencial
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de IαI derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento extraer conjuntamente el IαI y una serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa de una composición derivada de mezcla de plasmas uniendo las proteínas a dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido, y eluir el IαI del SiO2 bajo condiciones en las que una fracción sustancial de la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa unido permanece unida al SiO2. En un modo de realización preferente, la composición de partida es un precipitado de la fracción II+III resuspendida o precipitado equivalente del mismo.
imagen64
En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composición que contiene IαI y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el IαI y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el IαI del SiO2  
En determinados modos de realización, una condición de solución en la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unido se refiere a una condición que eluye preferencialmente el IαI, mientras que una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece unida al SiO2. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 25 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2, o al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 91, 98, 98, 99, o más de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido al SiO2.
3. Unión preferencial de IαI
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de IαI derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, comprendiendo el procedimiento (a) poner en contacto una composición que contiene IαI y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir el IαI pero no la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (b) separar el SiO2 de la composición; y (c) eluir el del SiO2.
En determinados modos de realización, una condición de solución en la que la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa no se une al SiO2 se refiere a una condición que permite preferencialmente la unión del IαI al SiO2, mientras que una fracción sustancial de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa permanece no unida en la solución. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 25 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida, o al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o más de la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa en la composición de partida.
4. Unión preferencial de serina proteasa o zimógeno de serina proteasa
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de IαI derivada de plasma que tiene una cantidad reducida de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa, el procedimiento que comprende (a) poner en contacto una composición que contiene IαI y al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa pero no el IαI; y (b) separar el SiO2 de la composición.
En determinados modos de realización, una condición de solución en la que el IαI no se une al SiO2 se refiere a una condición que permite preferencialmente la unión de serina proteasa o zimógeno de serina proteasa al SiO2, mientras que una fracción sustancial del IαI permanece no unida en la solución. En un modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % del IαI en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 25 % del IαI en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 50 % del IαI en la composición de partida. En otro modo de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 75 % del IαI en la composición de partida. Aún en otros modos de realización, una fracción sustancial se refiere al menos a un 10 % del IαI en la composición de partida, o al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o más del IαI en la composición de partida.
imagen65
D. Alfa-1-antitripsina (A1PI)
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de alfa-1-antitripsina (A1PI) derivada de plasma. En un modo de realización específico, el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composición de A1PI con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (b) separar el SiO2 de la composición de A1PI para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII).
En un modo de realización, el procedimiento comprende además la etapa de realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína de A1PI para formar una primera composición de A1PI enriquecida, antes de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína A1PI se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína A1PI para formar una segunda composición de A1PI enriquecida, antes de poner en contacto la composición con el dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína A1PI se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de A1PI derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de A1PI para formar una primera composición de A1PI derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de A1PI para formar una segunda composición de A1PI derivada de plasma; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
En determinados modos de realización, los procedimientos descritos anteriormente comprenden además la etapa de realizar una etapa de enriquecimiento de A1PI después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la etapa de enriquecimiento de A1PI se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de A1PI derivada de plasma, el procedimiento comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de A1PI para formar una primera composición de A1PI derivada de plasma enriquecida; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (d) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de A1PI para formar una segunda composición de A1PI derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1.
Asimismo, en un modo de realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de A1PI derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de A1PI para formar una primera composición de A1PI derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de A1PI para formar una segunda composición de A1PI derivada de plasma enriquecida; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (e) realizar una tercera etapa de enriquecimiento de A1PI para formar una tercera composición de A1PI derivada de plasma enriquecida. En un modo de realización preferente, la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es factor XIa (FXIa), factor XIIa (FXIIa), factor XI (FXI), y/o factor XII (FXII). En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 101 a Var. 1100, encontradas en la tabla 2, tabla 3, tabla 4, tabla 5, tabla 6, tabla 7, tabla 8, tabla 9, tabla 10 o tabla 11.
imagen66
En un modo de realización particular, la composición de A1PI es un intermedio de fabricación. Por ejemplo, en determinados modos de realización, la composición de A1PI es un intermedio de fabricación de un procedimiento de fraccionamiento de Cohn (J. Am. Chem. Soc, 1946, 68(3): 459-475; J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950)), un procedimiento de fraccionamiento de Oncley (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550), un procedimiento de fraccionamiento de Kistler/Nitschmann (Vox Sang. 7:434-424 (1962)), un procedimiento de purificación divulgado en las patentes de EE. UU. n.º 6.974.792 o 7.807.435, procedimientos modificados del mismo, y procedimientos de purificación similares o equivalentes conocidos en la técnica. Las referencias mencionadas anteriormente se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
Por ejemplo, son conocidos varios procedimientos de producción para A1 PI que comprenden la precipitación fraccionada de plasma con polietilenglicol 4000, pero también el procesamiento de diversas fracciones de plasma (precipitado de la fracción IV-1 de Cohn o sobrenadante A o A+1 de Kistler y Nitschmann) (Feldman y Winkelman, Blood Separation and Plasma Fractionation (1991), Wiley-Liss, Inc., p. 341-383). En purificaciones más elaboradas, se han purificado las respectivas fracciones sanguíneas por medio de DEAE-celulosa, por ejemplo (Basis et al. (Vopr. Med. Khim. 33 (1) (1987), 54-59)), tratadas con materiales cromatográficos de afinidad o con materiales cromatográficos de intercambio catiónico (documento EP 0 698 615 A1). La patente de EE. UU. N.º 6.974.792 describe un procedimiento de purificación que proporciona A1PI con una actividad específica alta utilizando un precipitado de la fracción V de Cohn. La patente de EE. UU. N.º 7.807.435 describe un procedimiento de purificación que proporciona mayores rendimientos de A1PI, utilizando un precipitado de la fracción IV-1 y/o fracción IV-4 de Cohn.
En un modo de realización particular, la composición de A1PI es una reserva de Cohn desprovista de crioprecipitado. En otro modo de realización particular, la composición de A1PI es un precipitado de la fracción V de Cohn resuspendida, o fracción equivalente del mismo. En otro modo de realización particular, la composición de A1PI es un precipitado de la fracción IV-1 de Cohn resuspendida, o fracción equivalente del mismo. En otro modo de realización particular, la composición de A1PI es un precipitado de la fracción IV-4 de Cohn resuspendida, o fracción equivalente del mismo. En otro modo de realización particular, la composición de A1PI es un sobrenadante A de Kistler/Nitschmann, o fracción equivalente del mismo.
En general, la retirada de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa de las composiciones de A1PI se puede lograr tratando la composición que contiene A1PI con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones de solución de pH y conductividad en las que la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa se unen al SiO2.
En un modo de realización, las mejoras del procedimiento se producen por la inclusión de un tratamiento de sílice de combustión anterior a la filtración o aclarado por centrífuga de un precipitado de plasma que comprende A1PI. En un modo de realización, la etapa de tratamiento con SiO2 comprende la adición de partículas de dióxido de sílice finamente dividido (por ejemplo, sílice de combustión, Aerosil®) seguido de un periodo de incubación de 40 minutos a 16 horas durante el que se mezcla de forma constante la suspensión. En determinados modos de realización, el periodo de incubación estará entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más minutos. En otros modos de realización, el periodo de incubación será de al menos 1 hora, o al menos 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, o más horas. En un modo de realización particular, el periodo de incubación será de al menos 15 horas. En general, el tratamiento se realizará a entre aproximadamente 0 ºC y aproximadamente 25 ºC, o entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC. En determinados modos de realización, el tratamiento se puede realizar aproximadamente a 0 ºC, 1 ºC, 2 ºC, 3 ºC, 4 ºC, 5 ºC, 6ºC, 7ºC, 8 ºC, 9ºC, 10ºC, 11ºC, 12 ºC, 13ºC, 14ºC, 15ºC, 16ºC, 17ºC, 18ºC, 19ºC, 20ºC, 21ºC, 22 ºC, 23 ºC, 24 ºC, o 25 ºC. En un modo de realización particular, el tratamiento se realiza a entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 25 ºC. En un modo de realización específico, las mejoras del procedimiento se producen por inclusión de un tratamiento con sílice de combustión, que reduce los niveles de FXI, FXIa, FXII, y FXIIa en la preparación de inmunoglobulina.
En determinados modos de realización, se añade sílice de combustión a una concentración de entre aproximadamente 20 g/kg precipitado y aproximadamente 100 g/kg precipitado. En determinados modos de realización, se puede añadir sílice de combustión a una concentración de aproximadamente 20 g/kg precipitado, o aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 g/kg precipitado. En un modo de realización específico, se añade sílice de combustión (por ejemplo, Aerosil 380 o equivalente) a la resuspensión de precipitado hasta una concentración final de aproximadamente 40 g/kg precipitado.
En determinados modos de realización, se añade SiO2 a una composición de A1PI a una concentración de entre aproximadamente 0,01 g/g proteína y aproximadamente 10 g/g proteína. En otro modo de realización, se añade SiO2 a una composición de A1PI a una concentración de entre aproximadamente 0,01 g/g proteína y aproximadamente 5 g/g proteína. En otro modo de realización, se añade SiO2 a una composición de A1PI a una concentración de entre aproximadamente 0,02 g/g proteína y aproximadamente 4 g/g proteína. En un modo de realización, se añade SiO2 a una composición de A1PI a una concentración final de al menos 0,1 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 0,2 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 0,25 g por gramo de proteína total. En otros modos de realización específicos, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 1 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 2 g por gramo de proteína total. En otro modo de realización específico, se añade sílice de combustión a una concentración de al menos 2,5 g por gramo de proteína total. Aún en otros modos de realización específicos, se añade dióxido de silicio finamente dividido a una concentración de al menos 0,01 g/g proteína total o al menos 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, o más g/g proteína total.
imagen67
En determinados modos de realización, se añadirá coadyuvante de filtro, por ejemplo Celpure C300 (Celpure) o Hyflo-Supper-Cel (World Minerals), después del tratamiento con dióxido de sílice, para facilitar la filtración en profundidad. Se puede añadir un coadyuvante de filtro a una concentración final de desde aproximadamente 0,01 kg/kg precipitado a aproximadamente 1,0 kg/kg precipitado, o desde aproximadamente 0,02 kg/kg precipitado a aproximadamente 0,8 kg/kg precipitado, o desde aproximadamente 0,03 kg/kg precipitado a aproximadamente 0,7 kg/kg precipitado. En determinados modos de realización, se añadirá el coadyuvante de filtro a una concentración final de al menos 0,01 kg/kg precipitado, o al menos 0,02 kg/kg, 0,03 kg/kg, 0,04 kg/kg, 0,05 kg/kg, 0,06 kg/kg, 0,07 kg/kg, 0,08 kg/kg, 0,09 kg/kg, 0,1 kg/kg, 0,2 kg/kg, 0,3 kg/kg, 0,4 kg/kg, 0,5 kg/kg, 0,6 kg/kg, 0,7 kg/kg, 0,8 kg/kg, 0,9 kg/kg, o 1,0 kg/kg precipitado. En determinados modos de realización, se añadirá el coadyuvante de filtro a una concentración final de aproximadamente 0,01 kg/kg precipitado, o aproximadamente 0,02 kg/kg, 0,03 kg/kg, 0,04 kg/kg, 0,05 kg/kg, 0,06 kg/kg, 0,07 kg/kg, 0,08 kg/kg, 0,09 kg/kg, 0,1 kg/kg, 0,2 kg/kg, 0,3 kg/kg, 0,4 kg/kg, 0,5 kg/kg, 0,6 kg/kg, 0,7 kg/kg, 0,8 kg/kg, 0,9 kg/kg, o 1,0 kg/kg precipitado.
En consecuencia, en un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de A1PI derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 7,0 para unir una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2  realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 7,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 5,5. Aún en otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,6 y aproximadamente 5,6. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,7 y aproximadamente 5,5. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,8 y aproximadamente 5,4. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,9 y aproximadamente 5,3. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 5,2. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH de aproximadamente 5,1. En otros modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH de aproximadamente 4,0 o aproximadamente 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, o no más de 7,0. Aún en otros modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH de no más de 4,0 o no más de 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, o no más de 7,0.
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de A1PI derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 2,0 mS/cm para unir una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,9 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,8 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,7 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,6 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,5 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,4 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,3 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,2 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,1 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 0,9 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 0,8 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,2 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,3 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,1 mS/cm y aproximadamente 0,4 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,5 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,6 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,7 mS/cm y aproximadamente 0,9 mS/cm. En otro modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica de aproximadamente 0,8 mS/cm. En otros modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica de aproximadamente 0,1 mS/cm o no más de 0,2 mS/cm, 0,3 mS/cm, 0,4 mS/cm, 0,5 mS/cm, 0,6 mS/cm, 0,7 mS/cm, 0,8 mS/cm, 0,9 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,1 mS/cm, 1,2 mS/cm, 1,3 mS/cm, 1,4 mS/cm, 1,5 mS/cm, 1,6 mS/cm, 1,7 mS/cm, 1,8 mS/cm, 1,9 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,1 mS/cm, 2,2 mS/cm, 2,3 mS/cm, 2,4 mS/cm, 2,5 mS/cm, 2,6 mS/cm, 2,7 mS/cm, 2,8 mS/cm, 2,9 mS/cm, o 3,0 mS/cm. Aún en otros modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a una fuerza iónica de no más de 0,1 mS/cm o no más de 0,2 mS/cm, 0,3 mS/cm, 0,4 mS/cm, 0,5 mS/cm, 0,6 mS/cm, 0,7 mS/cm, 0,8 mS/cm, 0,9 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,1 mS/cm, 1,2 mS/cm, 1,3 mS/cm, 1,4 mS/cm, 1,5 mS/cm, 1,6 mS/cm, 1,7 mS/cm, 1,8 mS/cm, 1,9 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,1 mS/cm, 2,2 mS/cm, 2,3 mS/cm, 2,4 mS/cm, 2,5 mS/cm, 2,6 mS/cm, 2,7 mS/cm, 2,8 mS/cm, 2,9 mS/cm, o 3,0 mS/cm.
imagen68
En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de A1PI derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la composición con SiO2 a un pH bajo y fuerza iónica baja para unir una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa. En un modo de realización particular, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,8 y aproximadamente 5,4 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,6 mS/cm y aproximadamente 1,0 mS/cm. En un modo de realización más particular, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 4,9 y aproximadamente 5,3 a una fuerza iónica entre aproximadamente 0,7 mS/cm y aproximadamente 0,9 mS/cm. En un modo de realización aún más particular, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 5,2 a una fuerza iónica de aproximadamente 0,8 mS/cm. Aún en otros modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la composición con SiO2 a un pH y fuerza iónica de acuerdo con una cualquiera de las variaciones Var. 1222 a 3041, presentadas en la tabla 12, tabla 13, tabla 14, y tabla 15.
1. Unión y elución de serina proteasas o zimógenos de serina proteasas
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa en un precipitado de plasma resuspendido que comprende A1PI. En general, el precipitado puede ser cualquier precipitado durante el fraccionamiento de la mezcla de plasmas, preferentemente plasma humano. En un modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto a un precipitado de plasma resuspendido que comprende A1 PI en un estado insoluble con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo una primera condición de pH bajo de solución para unir la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa y para mantener el A1PI en un estado insoluble, separar las porciones soluble e insoluble de la suspensión, eluir la serina y/o zimógeno de serina proteasa de SiO2 bajo una segunda condición de pH bajo de solución adecuada para mantener una fracción sustancial del A1PI en un estado insoluble, separar las porciones soluble e insoluble de la suspensión, y extraer el A1PI de la porción insoluble. En un modo de realización, el SiO2 se mezcla antes de o durante la reacción de precipitación y se recupera junto con el precipitado. En un modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción IV-1 de Cohn. En otro modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción IV-4 de Cohn. En otro modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción V de Cohn. En otro modo de realización, el precipitado es un precipitado IV de Kistler/Nitschmann. Aún en otro modo de realización, el precipitado es un precipitado C de Kistler/Nitschmann.
imagen69
En un modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la primera condición de solución de pH bajo comprende un pH de entre 4,0 y 7,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 7,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En un modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 5,5±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 6,0±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm.
En otro modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la primera condición de solución de pH bajo comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 4,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 2,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 0,5 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 4,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 2,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 0,5 mS/cm. En un modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 5,5±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 6,0±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. Aún en otros modos de realización, la primera condición de solución de pH bajo comprende un pH y fuerza iónica de acuerdo con una cualquiera de las variaciones Var. 1222 a 3041, presentadas en la tabla 12, tabla 13, tabla 14, y tabla 15.
En un modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la segunda condición de solución de pH bajo comprende un pH de entre 4,0 y 7,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 7,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En un modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 5,5±0,2 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 6,0±0,2 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 5,0 mS/cm,
En otro modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la segunda condición de solución de pH bajo comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 4,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 6,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 7,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 10 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 4,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 6,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 7,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 10 mS/cm. En un modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 5,5±0,2 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 10 mS/cm. En otro modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 6,0±0,2 y una fuerza iónica mayor de aproximadamente 10 mS/cm.
imagen70
En un modo de realización específico, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa en un precipitado de plasma resuspendido que comprende A1PI, que comprende las etapas de poner en contacto un precipitado de plasma resuspendido que comprende A1PI en un estado insoluble con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo una primera condición de solución de pH bajo que comprende un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,5 y una fuerza iónica menor de 5,0 mS para unir la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa y para mantener el A1PI en un estado insoluble, separar las porciones soluble e insoluble de la suspensión, eluir la serina y/o zimógeno de serina proteasa de SiO2 bajo una segunda condición de solución de pH bajo que comprende un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,5 y una fuerza iónica mayor de 5,0 mS para mantener una fracción sustancial del A1PI en un estado insoluble, separar las porciones soluble e insoluble de la suspensión, y extraer el AlPI de la porción insoluble. En un modo de realización, el SiO2 se mezcla antes de o durante la reacción de precipitación y se recupera junto con el precipitado. En un modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción IV-1 de Cohn. En otro modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción IV-4 de Cohn. En otro modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción V de Cohn. En otro modo de realización, el precipitado es un precipitado IV de Kistler/Nitschmann. Aún en otro modo de realización, el precipitado es un precipitado C de Kistler/Nitschmann.
2. Unión de serina proteasas o zimógenos de serina proteasas y extracción de A1PI
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la cantidad de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa en un precipitado de plasma resuspendido que comprende A1PI. En general, el precipitado puede ser cualquier precipitado durante el fraccionamiento de la mezcla de plasmas, preferentemente plasma humano. En un modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto un precipitado de plasma resuspendido que comprende A1PI en un estado insoluble con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo una primera condición de solución que comprende pH bajo para unir la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa y para mantener el A1PI en un estado insoluble, separar las porciones soluble e insoluble de la suspensión, extraer el A1PI de la porción insoluble bajo una segunda condición de solución que comprende pH alto, y separar la porción soluble de la porción insoluble, en el que una fracción sustancial de la serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa permanece unida al SiO2 durante la extracción de A1PI de la porción insoluble. En un modo de realización, el SiO2 se mezcla antes de o durante la reacción de precipitación y se recupera junto con el precipitado. En un modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción IV-1 de Cohn. En otro modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción IV-4 de Cohn. En otro modo de realización específico, el precipitado es un precipitado de la fracción V de Cohn. En otro modo de realización, el precipitado es un precipitado IV de Kistler/Nitschmann. Aún en otro modo de realización, el precipitado es un precipitado C de Kistler/Nitschmann.
En un modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la primera condición de solución comprende un pH de entre 4,0 y 7,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 7,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En un modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 5,5±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm. En otro modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 6,0±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5,0 mS/cm.
En otro modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la primera condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 4,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 2,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,0 y 6,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 0,5 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 4,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 2,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 1,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 5,5 y 6,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 0,5 mS/cm. En un modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 5,5±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 6,0±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. Aún en otros modos de realización, la primera condición de solución de pH bajo comprende un pH y fuerza iónica de acuerdo con una cualquiera de las variaciones Var. 1222 a 3041, presentadas en la tabla 12, tabla 13, tabla 14, y tabla 15.
imagen71
En un modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la segunda condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 10,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 10,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 9,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 10,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 10,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 10,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 10,0 mS/cm. En un modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 7,5±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 10,0 mS/cm. En otro modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 8,0±0,2 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 10,0 mS/cm.
En otro modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la segunda condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 9,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 8,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 7,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 6,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 4,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 2 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,0 y 8,5 y una fuerza iónica de entre 2 mS/cm y 10 mS/cm.
En otro modo de realización de los procedimientos proporcionados anteriormente, la segunda condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 9,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 8,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 7,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 6,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 5 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 4,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 3,0 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,0 y una fuerza iónica menor de aproximadamente 2 mS/cm. En otro modo de realización, la condición de solución comprende un pH de entre 7,5 y 8,5 y una fuerza iónica de entre 2 mS/cm y 10 mS/cm. En un modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 7,5±0,2 y una fuerza iónica de entre 2 mS/cm y 10 mS/cm. En otro modo de realización específico, la condición de solución comprende un pH de 8,0±0,2 y una fuerza iónica de entre 2 mS/cm y 10 mS/cm.
IV. Composiciones farmacéuticas
En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones de proteínas derivadas de plasma que tienen niveles reducidos de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa, que se preparan de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En determinados modos de realización, estas composiciones se formularán para su administración farmacéutica (es decir, composiciones farmacéuticas). En general, las composiciones de proteínas sanguíneas derivadas de plasma preparadas de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento tendrán una actividad amidolítica reducida y proporcionarán mejores perfiles de seguridad que los productos biológicos derivados de plasma existentes actualmente disponibles. En un modo de realización preferente, las composiciones proporcionadas en el presente documento tendrán un contenido reducido de factor XI, factor XIa, factor XII, y/o factor XIIa.
En un modo de realización, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (b) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización, la composición se formula para su administración farmacéutica. En un modo de realización específico, la composición se formula para su administración intravenosa. En otro modo de realización específico, la composición se formula para su administración intramuscular. En otro modo de realización, la composición se formula para su administración subcutánea. Aún en otro modo de realización, la composición se formula para su administración intraocular. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
imagen72
En determinados modos de realización, las composiciones descritas anteriormente se preparan por un procedimiento que comprende además la etapa de realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición enriquecida, antes de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
En un modo de realización, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida precipitando parcialmente proteína en un material de partida derivado de mezcla de plasmas; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización, la precipitación parcial se logra usando alcohol. En un modo de realización, la composición se formula para su administración farmacéutica. En un modo de realización específico, la composición se formula para su administración intravenosa. En otro modo de realización específico, la composición se formula para su administración intramuscular. En otro modo de realización, la composición se formula para su administración subcutánea. Aún en otro modo de realización, la composición se formula para su administración intraocular. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En un modo de realización, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida ultrafiltrando y/o diafiltrando un material de partida derivado de mezcla de plasmas;
(b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización, la precipitación parcial se logra usando alcohol. En un modo de realización, la composición se formula para su administración farmacéutica. En un modo de realización específico, la composición se formula para su administración intravenosa. En otro modo de realización específico, la composición se formula para su administración intramuscular. En otro modo de realización, la composición se formula para su administración subcutánea. Aún en otro modo de realización, la composición se formula para su administración intraocular. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En un modo de realización, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida poniendo en contacto un material de partida derivado de mezcla de plasmas con una resina cromatográfica; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En un modo de realización, la precipitación parcial se logra usando alcohol. En un modo de realización, la composición se formula para su administración farmacéutica. En un modo de realización específico, la composición se formula para su administración intravenosa. En otro modo de realización específico, la composición se formula para su administración intramuscular. En otro modo de realización, la composición se formula para su administración subcutánea. Aún en otro modo de realización, la composición se formula para su administración intraocular. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En determinados modos de realización, las composiciones descritas anteriormente se preparan por un procedimiento que comprende además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una segunda composición enriquecida, antes de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración, y una etapa cromatográfica.
imagen73
En un modo de realización, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una segunda composición de proteína diana derivada de plasma; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido. En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1. En un modo de realización, la composición se formula para su administración farmacéutica. En un modo de realización específico, la composición se formula para su administración intravenosa. En otro modo de realización específico, la composición se formula para su administración intramuscular. En otro modo de realización, la composición se formula para su administración subcutánea. Aún en otro modo de realización, la composición se formula para su administración intraocular. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En determinados modos de realización, las composiciones descritas anteriormente se preparan por un procedimiento que comprende además la etapa de realizar una etapa de enriquecimiento de proteína diana después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido. En determinados modos de realización, la etapa de enriquecimiento de proteína diana se selecciona de una etapa de precipitación de proteína (por ejemplo, una etapa de fraccionamiento de alcohol), una etapa de ultrafiltración/diafiltración y una etapa cromatográfica.
En un modo de realización, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida; (b) poner en contacto la primera composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (c) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y (d) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una segunda composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida. En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 1 a Var. 100, encontradas en la tabla 1. En un modo de realización, la composición se formula para su administración farmacéutica. En un modo de realización específico, la composición se formula para su administración intravenosa. En otro modo de realización específico, la composición se formula para su administración intramuscular. En otro modo de realización, la composición se formula para su administración subcutánea. Aún en otro modo de realización, la composición se formula para su administración intraocular. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma que tiene niveles reducidos de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa para su uso en el tratamiento de una afección asociada con una deficiencia o disfunción de proteína sanguínea. En determinados modos de realización, la proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En un modo de realización, la presente invención proporciona una composición de proteína derivada de plasma preparada por un procedimiento que comprende las etapas de: (a) realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida; (b) realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una segunda composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida; (c) poner en contacto la segunda composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; (d) separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa o zimógeno de serina proteasa unido; y
(e) realizar una tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una tercera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida. En determinados modos de realización, la combinación de las etapas de enriquecimiento primera y segunda se selecciona de una cualquiera de las variaciones Var. 101 a Var. 1100, encontradas en la tabla 2, tabla 3, tabla 4, tabla 5, tabla 6, tabla 7, tabla 8, tabla 9, tabla 10 o tabla 11. En un modo de realización, la composición se formula para su administración farmacéutica. En un modo de realización específico, la composición se formula para su administración intravenosa. En otro modo de realización específico, la composición se formula para su administración intramuscular. En otro modo de realización, la composición se formula para su administración subcutánea. Aún en otro modo de realización, la composición se formula para su administración intraocular. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
imagen74
En determinados modos de realización de las composiciones descritas anteriormente, una etapa de enriquecimiento cromatográfica comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la composición de proteína diana derivada de plasma con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir la proteína diana derivada de plasma; y
(ii) eluir la proteína diana derivada de plasma de la resina cromatográfica. En un modo de realización específico, la impureza no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i). En otro modo de realización específico, la impureza se une a la resina cromatográfica en a subetapa (i), pero no se eluye de la resina cromatográfica en la subetapa (ii).
En otros modos de realización determinados de las composiciones descritas anteriormente, una etapa de enriquecimiento cromatográfica comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir al menos una impureza; y (ii) separar la resina de la composición de proteína derivada de plasma, en la que la proteína diana derivada de plasma no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i).
En determinados modos de realización de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 10 %. En otro modo de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 25 %. En otro modo de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 50 %. En otro modo de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 75 %. En otro modo de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 90 %. Aún en otros modos de realización, la cantidad de una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa particular se reduce al menos en un 5 %, o al menos en un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %. En un modo de realización, la reducción de serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se refiere a la reducción lograda dentro de la etapa de tratamiento con SiO2 individual. En otro modo de realización, la reducción de serina proteasa o zimógeno de serina proteasa se refiere al nivel del contaminante en la composición final, en comparación con una composición preparada de forma similar excluyendo una etapa de tratamiento con SiO2.
En un modo de realización, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se preparan formulando una composición de proteína derivada de plasma aislada usando un procedimiento proporcionado en el presente documento. En general, la composición formulada se habrá sometido a al menos una, preferentemente al menos dos, lo más preferentemente al menos tres, etapas de inactivación o retirada vírica. Los ejemplos no limitantes de etapas de inactivación o retirada vírica que se pueden emplear con los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen, tratamiento con disolvente-detergente (Horowitz et al,, Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Supl 3):S21-S28 y Kreil et al., Transfusion 2003 (43): 1023-1028, de los que ambos se incorporan en el presente documento expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), nanofiltración (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 y Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, de los que ambos se incorporan en el presente documento expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), incubación a pH bajo a temperaturas altas (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 y Louie et al., Biologicals 1994 (22): En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En un modo de realización, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento comprenderán uno o más agentes tamponadores o agentes estabilizantes de pH adecuados para su administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, y/o intraocular. Los ejemplos no limitantes de agentes tamponadores adecuados para formular una composición de proteína derivada de plasma proporcionada en el presente documento incluyen glicina, citrato, fosfato, acetato, glutamato, tartrato, benzoato, lactato, histidina u otros aminoácidos, gluconato, malato, succinato, formiato, propionato, carbonato, o cualquier combinación de los mismos ajustada a un pH apropiado. En general, el agente tamponador será suficiente para mantener un pH adecuado en la formulación durante un periodo de tiempo prolongado. En un modo de realización preferente, el agente tamponador es glicina. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En algunos modos de realización, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden comprender opcionalmente además un agente para ajustar la osmolaridad de la composición. Los ejemplos no limitantes de agentes de osmolaridad incluyen manitol, sorbitol, glicerol, sacarosa, glucosa, dextrosa, levulosa, fructosa, lactosa, polietilenglicoles, fosfatos, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, gluconoglucoheptonato de calcio, dimetilsulfona, y similares.
imagen75
Típicamente, las formulaciones proporcionadas en el presente documento tendrán osmolaridades que son comparables con la osmolaridad fisiológica, aproximadamente de 285 a 295 mOsmol/kg (Lacy et al., Drug Information Handbook -Lexi-Comp 1999:1254). En determinados modos de realización, la osmolaridad de la formulación estará entre aproximadamente 200 mOsmol/kg y aproximadamente 350 mOsmol/kg, preferentemente entre aproximadamente 240 y aproximadamente 300 mOsmol/kg. En modos de realización particulares, la osmolaridad de la formulación será de aproximadamente 200 mOsmol/kg, o 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, o 350 mOsmol/kg.
Las formulaciones derivadas de plasma proporcionadas en el presente documento son, en general, estables en forma líquida durante un periodo de tiempo prolongado. En determinados modos de realización, las formulaciones son estables durante al menos aproximadamente 3 meses a temperatura ambiente, o al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, o 24 meses a temperatura ambiente. En general, la formulación será estable 6 o al menos aproximadamente 18 meses bajo condiciones refrigeradas (típicamente entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC), o durante al menos aproximadamente 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, o 45 meses bajo condiciones refrigeradas.
V. Procedimientos de tratamiento
En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una deficiencia o disfunción de proteína sanguínea en un sujeto que lo necesita administrando una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de proteína derivada de plasma que tiene niveles reducidos de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa preparada de acuerdo con un procedimiento proporcionado en el presente documento. En determinados modos de realización, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición de proteína derivada de plasma que tiene niveles reducidos de serina proteasa y/o zimógeno de serina proteasa para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una afección asociada con una deficiencia o disfunción de proteína sanguínea. En determinados modos de realización, la proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento, y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IαI).
A. Inmunoglobulinas
Como se practica de forma rutinaria en la medicina moderna, se usan preparaciones esterilizadas de inmunoglobulinas concentradas (en especial IgG) para tratar afecciones médicas que entran dentro de estas tres clases principales: deficiencias inmunitarias, enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, e infecciones agudas. Estas preparaciones de IgG también pueden útiles para tratar esclerosis múltiple (en especial esclerosis múltiple recurrente-remitente o RKMS), enfermedad de Alzheimer, y enfermedad de Parkinson. La preparación de IgG purificada de la presente invención es adecuada para estos propósitos, así como otros usos clínicamente aceptados de preparaciones de IgG.
La FDA ha aprobado el uso de IVIG para tratar varias indicaciones, incluyendo alotrasplante de médula ósea, leucemia linfocítica crónica, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), VIH infantil, inmunodeficiencias primarias, enfermedad de Kawasaki, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), y trasplante de riñón con un receptor de anticuerpos alto o con un donante AB0 incompatible. En determinados modos de realización, las composiciones de IVIG proporcionadas en el presente documento son útiles para el tratamiento o la atención médica de estas enfermedades y afecciones.
Además, se proporcionan comúnmente a pacientes usos fuera de los indicados para IVIG para el tratamiento y la atención médica de varias indicaciones, por ejemplo, síndrome de fatiga crónica, colitis por Clostridium difficile, dermatomiositis y polimiositis, oftalmopatía de Graves, síndrome de Guillain-Barre, distrofia muscular, miositis de cuerpos de inclusión, síndrome de Lambert-Eaton, lupus eritematoso, neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple (MS), miastenia grave, trombocitopenia aloinmunitaria neonatal, infección por Parvovirus B19, pénfigo, púrpura post-transfusión, rechazo a trasplante renal, aborto espontáneo/natural, síndrome de la persona rígida, opsoclonía-mioclonía, septicemia grave y choque septicémico en enfermos críticos adultos, necrolisis epidérmica tóxica, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, e hipogammaglobulinemia. En determinados modos de realización, las composiciones de IVIG proporcionadas en el presente documento son útiles para el tratamiento o la atención médica de estas enfermedades y afecciones.
Finalmente, se ha propuesto el uso experimental de IVIG para el tratamiento y la atención médica de enfermedades que incluyen inmunodeficiencia primaria, RRMS, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson (solicitud de patente de los EE. UU. N.º U.S. 2009/0148463, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos). En determinados modos de realización, las composiciones de IVIG proporcionadas en el presente documento son útiles para el tratamiento o la atención médica de inmunodeficiencia primaria, RRMS, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson. En determinados modos de realización que comprenden una administración diaria, una cantidad eficaz que se va a administrar al sujeto se puede determinar por un médico con consideración de las diferencias individuales de edad, peso, gravedad de la enfermedad, vía de administración (por ejemplo, intravenosa frente a subcutánea) y respuesta al tratamiento. En determinados modos de realización, una preparación de inmunoglobulina de la presente invención se puede administrar a un sujeto a de aproximadamente 5 mg/kilogramo a aproximadamente 2000 mg/kilogramo cada día. En modos de realización adicionales, la preparación de inmunoglobulina se puede administrar en cantidades de al menos aproximadamente 10 mg/kilogramo, al menos 15 mg/kilogramo, al menos 20 mg/kilogramo, al menos 25 mg/kilogramo, al menos 30 mg/kilogramo, o al menos 50 mg/kilogramo. En modos de realización adicionales, la preparación de inmunoglobulina se puede administrar a un sujeto en dosis de hasta 100 mg/kilogramo, hasta aproximadamente 150 mg/kilogramo, hasta aproximadamente 200 mg/kilogramo, hasta aproximadamente 250 mg/kilogramo, hasta aproximadamente 300 mg/kilogramo, hasta aproximadamente 400 mg/kilogramo cada día. En otros modos de realización, las dosis de la preparación de inmunoglobulina pueden ser mayores o menores. Además, las preparaciones de inmunoglobulina se pueden administrar en una o más dosis por día. Los médicos familiarizados con las enfermedades tratadas por preparaciones de IgG pueden determinar la dosis apropiada para un paciente de acuerdo con criterios conocidos en la técnica.
imagen76
De acuerdo con la presente invención, el tiempo necesario para completar un ciclo de tratamiento se puede determinar por un médico y puede variar desde tan sólo un día a más de un mes. En determinados modos de realización, un ciclo de tratamiento puede ser de 1 a 6 meses.
Una cantidad eficaz de una preparación de IVIG se administra al sujeto por vía intravenosa. El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una preparación de IVIG que da como resultado una mejora o remedio de la enfermedad o afección en un sujeto. Una cantidad eficaz que se va a administrar al sujeto se puede determinar por un médico con consideración de las diferencias individuales de edad, peso, la enfermedad o afección que se está tratando, gravedad de la enfermedad y respuesta al tratamiento. En determinados modos de realización, una preparación de IVIG se puede administrar a un sujeto a una dosis de aproximadamente 5 mg/kilogramo a aproximadamente 2000 mg/kilogramo por administración. En determinados modos de realización, la dosis puede ser de al menos aproximadamente 5 mg/kg, o al menos aproximadamente 10 mg/kg, o al menos aproximadamente 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800mg/kg, 1900 mg/kg, o al menos aproximadamente 2000 mg/kg.
La dosificación y frecuencia del tratamiento de IVIG dependerá, entre otros factores, de la enfermedad o afección que se está tratando y la gravedad de la enfermedad o afección en el paciente. En general, para disfunción inmunitaria primaria, una dosis de entre aproximadamente 100 mg/kg y aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal se administrará aproximadamente cada de 3 a 4 semanas. Para enfermedades neurológicas y autoinmunitarias, se implementa hasta 2 g/kg de peso corporal durante de tres a seis meses durante un ciclo de cinco días una vez al mes. En general, esto se suplementa con un tratamiento de mantenimiento que comprende la administración de entre aproximadamente 100 mg/kg y aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal aproximadamente una vez cada de 3 a 4 semanas. En general, un paciente recibirá una dosis o tratamiento aproximadamente una vez cada de 14 a 35 días,
o aproximadamente cada de 21 a 28 días. La frecuencia del tratamiento dependerá, entre otros factores, de la enfermedad o afección que se está tratando y la gravedad de la enfermedad o afección en el paciente.
En un modo de realización preferente, se proporciona un procedimiento de tratamiento de una inmunodeficiencia, enfermedad autoinmunitaria, o infección aguda en un ser humano que lo necesita, comprendiendo el procedimiento administrar una composición de IVIG farmacéutica de la presente invención. En un modo de realización relacionado, la presente invención proporciona composiciones de IVIG fabricadas de acuerdo con un procedimiento proporcionado en el presente documento para el tratamiento de una inmunodeficiencia, enfermedad autoinmunitaria, o infección aguda en un ser humano que lo necesite.
En determinados modos de realización, la inmunodeficiencia, enfermedad autoinmunitaria, o infección aguda se selecciona de alotrasplante de médula ósea, leucemia linfocítica crónica, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), VIH infantil, inmunodeficiencias primarias, enfermedad de Kawasaki, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), trasplante de riñón con un receptor de anticuerpos alto o con donante AB0 incompatible, síndrome de fatiga crónica, colitis por Clostridium difficile, dermatomiositis y polimiositis, oftalmopatía de Graves, síndrome de Guillain-Barre, distrofia muscular, miositis de cuerpos de inclusión, síndrome de Lambert-Eaton, lupus eritematoso, neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple (MS), miastenia grave, trombocitopenia aloinmunitaria neonatal, infección por Parvovirus B19, pénfigo, púrpura post-transfusión, rechazo a trasplante renal, aborto espontáneo/natural, síndrome del hombre rígido, opsoclonía-mioclonía, septicemia grave o choque septicémico en enfermos adultos críticos, necrolisis epidérmica tóxica, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, hipogammaglobulinemia, inmunodeficiencia primaria, RRMS, enfermedad de Alzheimer, y enfermedad de Parkinson.
imagen77
B. Factor H
En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una disfunción de Factor H o actividad del complemento en la ruta alternativa anormal en un sujeto que lo necesita administrando una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de Factor H preparada de acuerdo con un procedimiento proporcionado en el presente documento. En un modo de realización, la composición de Factor H se prepara extrayendo el Factor H de un precipitado de la fracción I. En otro modo de realización, la composición de Factor H se prepara extrayendo el Factor H de una torta de filtro de la fracción II+III.
En determinados modos de realización, la enfermedad o trastorno asociado con una disfunción del Factor H se selecciona de síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), degeneración macular senil (AMD), glomulonefritis membranoproliferativa tipo II (MPGNII), infarto de miocardio, cardiopatía coronaria/arteriopatía coronaria (CAD/CHD), y enfermedad de Alzheimer. En un modo de realización particular, la enfermedad es síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS). En otro modo de realización particular, la enfermedad es degeneración macular senil (AMD). Aún en otro modo de realización particular, la enfermedad es glomulonefritis membranoproliferativa tipo II (MPGNII).
En determinados modos de realización, se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad del complemento en la ruta alternativa anormal en un sujeto que lo necesita administrando al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de Factor H proporcionada en el presente documento. En un modo de realización, la composición de Factor H se prepara extrayendo el Factor H de un precipitado de la fracción I. En otro modo de realización, la composición de Factor H se prepara extrayendo el Factor H de una torta de filtro de la fracción II+III.
En determinados modos de realización, la enfermedad o trastorno asociado con la actividad del complemento en la ruta alternativa anormal se selecciona de una enfermedad autoinmunitaria (tal como artritis reumatoide, nefropatía IgA, asma, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, síndrome antifosfolipídico, vasculitis asociada a ANCA, pénfigo, uveítis, miastenia grave, tiroiditis de Hashimoto), una enfermedad renal (tal como nefropatía IgA, síndrome urémico hemolítico, glomerulonefritis membranoproliferativa) asma, enfermedad de Alzheimer, degeneración macular adulta, hemoglobinuria próxima nocturna, aneurisma aórtico abdominal, lesión por isquemia/reperfusión y septicemia.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por la invención se pueden administrar solas o junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte del mismo producto farmacéutico.
1. Administración
De acuerdo con la presente invención, el tiempo necesario para completar un ciclo de tratamiento se puede determinar por un médico y puede variar desde tan sólo un día a más de un mes. En determinados modos de realización, un ciclo de tratamiento puede ser de 1 a 6 meses.
Una cantidad eficaz de una preparación de Factor H se administra al sujeto por cualquier medio para tratar la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, en determinados modos de realización, se puede administrar el Factor H por vía intravenosa, intraocular, subcutánea y/o intramuscular. En un modo de realización preferente, se proporciona un procedimiento para tratar la degeneración macular senil en un sujeto que lo necesita comprendiendo la administración intraocular de una composición de Factor H al paciente.
En determinados modos de realización, las composiciones de Factor H proporcionadas en el presente documento se pueden administrar por vía sistémica o bien por vía local. La administración sistémica incluye: oral, transdérmica, subdérmica, intraperitoneal, subcutánea, transnasal, sublingual o rectal. La vía de administración sistémica más preferente es la oral. La administración local para una administración ocular incluye: tópica, intravítrea, periocular, transescleral, retrobulbar, juxtaescleral, subtenoniana, o por medio de un dispositivo intraocular. Los procedimientos preferentes para una administración local incluyen administración transescleral, a la mácula por administración juxtaescleral posterior; por medio de inyección intravítrea; o por medio de cánula, tal como la que se describe en la patente de los EE. UU. N.º 6.413.245, de la que la divulgación se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad para todos los propósitos. De forma alternativa, los inhibidores se pueden administrar por medio de un dispositivo de administración sostenida implantado por vía intravítrea o transescleral, o por otros medios conocidos de administración ocular local.
En determinados modos de realización, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una preparación de Factor H que da como resultado una mejora o remedio de la enfermedad o afección en el sujeto. Una cantidad eficaz que se ca a administrar al sujeto se puede determinar por un médico con consideración de las diferencias individuales de edad, peso, la enfermedad o afección que se está tratando, gravedad de la enfermedad y respuesta al tratamiento. En determinados modos de realización, una preparación de Factor H se puede administrar a un sujeto a una dosis de o aproximadamente de entre 5 mg/kilogramo y 2000 mg/kilogramo por administración. En determinados modos de realización, la dosis puede ser al menos de o aproximadamente de 5 mg/kg, o al menos de o aproximadamente de 10 mg/kg, o al menos de o aproximadamente de 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg„ 1900 mg/kg, o 2000 mg/kg. La dosificación y frecuencia del tratamiento de Factor H dependerá, entre otros factores, de la enfermedad o afección que se está tratando y la gravedad de la enfermedad o afección en el paciente.
imagen78
2. Degeneración macular senil (AMD)
En un modo de realización preferente, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento de degeneración macular senil en un sujeto que lo necesita administrando al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de Factor H proporcionada en el presente documento.
La degeneración macular senil (AMD) es la causa principal de amaurosis en la población anciana sobre los 60 años de edad. Hoy en día, se estima que un 35-40 % de los mayores de 75 años de edad tienen algún grado de AMD. Se ha estimado que aproximadamente 50 millones de personas están afectadas en todo el mundo, 10 millones sólo en los EE. UU. Actualmente, se realizan aproximadamente 155.000 diagnósticos nuevos de AMD cada año. A medida que la población mundial envejece, se espera que el número de diagnósticos anuales se triplique para el año 2020. Es una enfermedad grave que destruye la visión central en los individuos afectados, robándoles su capacidad para realizar actividades necesarias para su vida cotidiana tales como leer o conducir.
La AMD es una enfermedad progresiva, lenta, que implica células de las capas retinianas externas (incluyendo fotorreceptores y las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) que soportan los fotorreceptores), así como células en la capa vascular adyacente el ojo conocido como el coroide. La degeneración macular se caracteriza por la ruptura de la mácula, una pequeña porción de la retina central (aproximadamente de 2 mm de diámetro) responsable de la visión de alta agudeza. La degeneración macular de inicio tardío (es decir, AMD) se define, en general, como "seca" o bien "húmeda". La forma neovascular húmeda ("exudativa") de AMD afecta aproximadamente al 10 % de los que padecen la enfermedad, y se caracteriza por vasos sanguíneos anormales que crecen de la coriocapilar a través del RPE, dando como resultado, típicamente, hemorragia, exudación, cicatrización, y/o desprendimiento de retina grave. Aproximadamente un 90 % de los pacientes con AMD tienen la forma seca, o no neovascular, de la enfermedad, que se caracteriza por atrofia del RPE y pérdida de fotorreceptores maculares.
La AMD se caracteriza por la presencia de depósitos de material similar a partículas, denominados "drusas", que se acumulan sobre la membrana de Bruch, un compuesto multicapa de componentes de matriz extracelular que separa el RPE (la capa más exterior de la retina) del coroide subyacente. Se pueden observar las drusas por examen ocular oftalmoscópico. Estos depósitos se han caracterizado ampliamente en estudios microscópicos de ojos donantes de pacientes con AMD. Los depósitos observados en el ojo vivo tras un examen clínico se clasifican como drusas blandas o bien drusas duras, de acuerdo con varios criterios incluyendo tamaño relativo, abundancia, y forma de los depósitos. Los estudios histoquímicos e inmunocitoquímicos han demostrado que las drusas contienen muchos lípidos, polisacáridos, glucosaminoglucanos y proteínas.
Actualmente, no existe cura conocida para la AMD, aunque varios tipos de tratamientos han demostrado ser eficaces en controlar la enfermedad. La fotocoagulación láser de vasos anormales en la forma húmeda de la enfermedad es el tratamiento estándar. Este tratamiento está limitado por el hecho de que sólo se pueden tratar de esta forma lesiones neovasculares bien delineadas y que un 50 % de los pacientes sufrirán recidiva de la fuga desde los vasos (Fine et al, 2000). Debido a la energía del láser requerida para este tratamiento, los fotorreceptores en el área tratada también morirán, y el paciente también sufrirá amaurosis central inmediatamente después del tratamiento. Finalmente se desarrollarán nuevas lesiones neovasculares, requiriendo la repetición de los tratamientos. Otras intervenciones incluyen el cambio del estilo de vida dejando de fumar e iniciando tratamiento con antioxidantes. También se han sugerido tratamientos antiangiogénicos que usan inhibidores VEGF, por ejemplo, inyección intravítrea de ranibizumab
o bevacizumab.
Recientemente se ha descubierto que aproximadamente un 35 % de los individuos llevan un único polimorfismo mononucleotídico comprometido (SNP) en una o ambas copias de su gen de Factor H. Los individuos homocigóticos tienen incremento de aproximadamente siete veces en la probabilidad de desarrollar degeneración macular senil, mientras que los heterocigóticos tienen un incremento de dos a tres veces en la probabilidad de desarrollar la enfermedad. Se ha demostrado que este SNP, situado en el módulo 7 de la CCP del Factor H, afecta a las interacciones entre el Factor H y ambas proteína C-reactiva y heparina lo que indica una relación causal entre el SNP y la enfermedad. El polimorfismo es un polimorfismo Y420H.
imagen79
En un modo de realización de un procedimiento para limitar la activación del complemento dando como resultado una progresión o inicio retardado del desarrollo de la degeneración macular senil (AMD) en un sujeto, el sujeto no tiene ningún síntoma de AMD.
En otro modo de realización de un procedimiento para limitar la activación del complemento dando como resultado una progresión o inicio retardado del desarrollo de la degeneración macular senil (AMD) en un sujeto, el sujeto tiene drusas.
En otro modo de realización de un procedimiento para limitar la activación del complemento dando como resultado una progresión o inicio retardado del desarrollo de la degeneración macular senil (AMD) en un sujeto, el sujeto tiene un incremento en el riesgo de desarrollar AMD.
En otro modo de realización de un procedimiento para limitar la activación del complemento dando como resultado una progresión o inicio retardado del desarrollo de la degeneración macular senil (AMD) en un sujeto, la administración es intravenosa.
En otro modo de realización de un procedimiento para limitar la activación del complemento dando como resultado una progresión o inicio retardado del desarrollo de la degeneración macular senil (AMD) en un sujeto, el procedimiento comprende además tratar a un sujeto que tiene signos y/o síntomas de AMD.
En otro modo de realización de un procedimiento para limitar la activación del complemento dando como resultado una progresión o inicio retardado del desarrollo de la degeneración macular senil (AMD) en un sujeto, al sujeto se le ha diagnosticado AMD.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano que se considera que tiene riesgo de desarrollo de degeneración macular senil, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una preparación de Factor H proporcionada en el presente documento, y repetir periódicamente dicha administración.
En un modo de realización de un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano que se considera que tiene riesgo de desarrollo de degeneración macular senil, la administración se repite durante un tiempo eficaz para retrasar la progresión o aparición del desarrollo de degeneración macular en dicho sujeto.
En otro modo de realización de un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano que se considera que tiene riesgo de desarrollo de degeneración macular senil, el sujeto humano se considera que tiene riesgo de desarrollo de degeneración macular senil identificado basándose en la presencia de uno o más marcadores genéticos asociados con el desarrollo de degeneración macular senil.
En otro modo de realización de un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano que se considera que tiene riesgo de desarrollo de degeneración macular senil, el marcador genético es un polimorfismo. En otro modo de realización de un procedimiento para limitar la activación del complemento dando como resultado una progresión o inicio retardado del desarrollo de la degeneración macular senil (AMD) en un sujeto, al sujeto no se le ha diagnosticado AMD.
C. Inhibidor de inter-alfa-tripsina (IαI)
Aún en otros aspectos, es un objetivo de la invención proporcionar procedimientos para tratar trastornos y enfermedades asociadas con una reducción en la función de IaIp o disfunción de IaIp administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de IaIp proporcionada en el presente documento. En un modo de realización, la enfermedad o trastorno asociado con una reducción en la función de IaIp o disfunción de IaIp es septicemia.
En un modo de realización, la presente invención proporciona una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de IaIp preparada por un procedimiento divulgado en el presente documento para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una reducción en la función de IaIp o disfunción de IaIp en un sujeto que lo necesita. En un modo de realización, la enfermedad o trastorno asociado con una reducción en la función de IaIp o disfunción de IaIp es septicemia.
En otro aspecto, es un objetivo de la invención proporcionar procedimientos para tratar enfermedades y trastornos asociados con un incremento en la actividad de serina proteasas en plasma administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de IaIp proporcionada en el presente documento. En un modo de realización, la enfermedad o trastorno asociado con la actividad de serina proteasa en plasma se selecciona de septicemia, choque septicémico, choque endotóxico, coagulación intravascular diseminada, fibroproliferación, intoxicación por carbunco, metástasis del cáncer, lesión tisular durante intervención quirúrgica, enfermedad renal, enfermedad vasculación, diabetes, e inflamación sistémica.
imagen80
En un modo de realización, la presente invención proporciona una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de IaIp preparada por un procedimiento divulgado en el presente documento para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno asociado con un incremento en la actividad de serina proteasa en un sujeto que lo necesita. En un modo de realización, la enfermedad o trastorno asociado con la actividad de serina proteasa en plasma se selecciona de septicemia, choque septicémico, choque endotóxico, coagulación intravascular diseminada, fibroproliferación, intoxicación por carbunco, metástasis del cáncer, lesión tisular durante intervención quirúrgica, enfermedad renal, enfermedad vasculación, diabetes, e inflamación sistémica.
A. Administración
De acuerdo con la presente invención, el tiempo necesario para completar un ciclo de tratamiento se puede determinar por un médico y puede variar desde tan sólo un día a más de un mes. En determinados modos de realización, un ciclo de tratamiento puede ser de 1 a 6 meses.
Una cantidad eficaz de una preparación de IaIp se administra al sujeto por cualquier medio para tratar la enfermedad
o trastorno. Por ejemplo, en determinados modos de realización, se puede administrar IaIp por vía intravenosa, subcutánea y/o intramuscular. En un modo de realización preferente, se proporciona un procedimiento para tratar la septicemia en un sujeto que lo necesita que comprende la administración intravenosa (iv) de una composición de IaIp al paciente.
En determinados modos de realización, las composiciones de IaIp proporcionadas en el presente documento se pueden administrar de forma sistémica o bien local. La administración sistémica incluye: vías de administración oral, subdérmica, intraperitoneal, subcutánea, transnasal, sublingual o rectal. La administración local incluye: vías de administración tópica, subcutánea, intramuscular, e intraperitoneal.
En determinados modos de realización, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una preparación de IaIp que da como resultado una mejora o remedio de la enfermedad o afección en el sujeto. Una cantidad eficaz que se ca a administrar al sujeto se puede determinar por un médico con consideración de las diferencias individuales de edad, peso, la enfermedad o afección que se está tratando, gravedad de la enfermedad y respuesta al tratamiento. En determinados modos de realización, una preparación de IaIp se puede administrar a un sujeto a una dosis de aproximadamente 5 mg/kilogramo a aproximadamente 2000 mg/kilogramo por administración. En determinados modos de realización, la dosis puede ser al menos aproximadamente 5 mg/kg, o al menos aproximadamente 10 mg/kg, o al menos aproximadamente 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg„ 1900 mg/kg o al menos aproximadamente 2000 mg/kg. La dosificación y frecuencia del tratamiento de IaIp dependerá, entre otros factores, de la enfermedad o afección que se está tratando y la gravedad de la enfermedad o afección en el paciente.
VI. Ejemplos
Ejemplo 1
Para determinar el contenido y la actividad de serina proteasas residuales presentes en composiciones de proteínas derivadas de plasma, se determinó el perfil de actividad amidolítico para dos preparaciones de IgG comercialmente disponibles que se fabricaron sin el uso de tratamiento con SiO2: OCTAGAM® (inmunoglobulina intravenosa al 5 %; Octapharma) y Subcuvia (inmunoglobulina subcutánea al 16 %; Baxter); dos lotes de una preparación de IgG comercialmente disponible fabricada usando tratamiento con SiO2: Gammagard Liquid (inmunoglobulina intravenosa al 10 %; Baxter), y un procedimiento de purificación de Factor H actualmente en desarrollo. Notablemente, se purificó la composición de Factor H como se describe anteriormente, uniendo y posteriormente eluyendo el Factor H del SiO2 finamente dividido.
En resumen, se determinó el perfil de actividad amidolítica para cada una de las composiciones de proteínas derivadas de plasma sometiendo a ensayo los siguientes sustratos cromogénicos con diferentes especificidades enzimáticas: PL-1 (espectro amplio), S-2288 (espectro amplio), S-2266 (FXIa, calicreínas glandulares), S-2222 (FXa, tripsina), S-2251 (plasmina), and S-2302 (calicreína, FXIa, y FXIIa). También se determinó la cantidad del activador de Precalicreína (PKKA) y la cantidad de unidades de Factor XIa. Como se muestra en la tabla 17, las composiciones de IgG derivadas de plasma fabricadas sin el uso de una etapa de adsorción de SiO2 contenían niveles significativos de actividad amidolítica y contenido en FXIa. En contraste, ambos lotes sometidos a prueba del Gammagard Liquid contenían actividad amidolítica mínima y contenido en FXIa. Consistente con estos resultados, la composición de Factor H preparada uniendo y eluyendo de SiO2 finamente dividido, contiene niveles extremadamente altos de actividad amidolítica y contenido en FXIa.
imagen81
5
10
15
20
25
30
35
40
Factor H
Preparaciones de IGIV comercialmente disponibles IGSC
Especificidad
Sustrato cromogénico Muestra FH012 FC estéril Octagam 5 % (Octapharma) n.º B842A8432 Gammagard Liquid 10 % lote 1 (Baxter) n.º LE12G142AD Gammagard Liquid 10 % lote 2 (Baxter) n.º LE12HE7B Subcuvia 16 % (Baxler) n.º VNG1H020
Tasa de hidrólisis [nmol/ml x min]
Espectro amplio
PL-1 73,7 18,3 <10 <10 22,1
Espectro amplio
S-2288 241 29 <5 <5 46
FXIa, calicreínas glandulares
S-2266 171 27,1 <5 <5 34,2
FXa, tripsina
S-2222 8,3 <5 <5 <5 <5
Plasmina
S-2251 7,3 <5 <5 <5 <5
Calicreína, FXIa, FXIIa
S-2302 563 70,1 <5 7,0 99,6
PKKA
lE/ml 9,5 <4 <4 <4 <4
F-XIa
mU/ml 510,8 1,37 <0,04 <0,04 0,79
Ejemplo 2
Para determinar un esquema económicamente beneficioso para la fabricación de factor H a partir de una muestra de plasma, que permite la recuperación de factores sanguíneos adicionales de la mismas muestra de plasma, se sometió a fraccionamiento un lote de una mezcla de plasma humano de acuerdo con el esquema indicado en el diagrama de flujo mostrado en la figura 1. Como se muestra en la figura 2, en el precipitado de la fracción II+III se puede encontrar la mayoría del Factor H (aproximadamente un 90 %) presente en una reserva de Cohn desprovista de crioprecipitado de plasma humano. En el precipitado de la fracción I también se puede encontrar una cantidad menor, aunque significativa, de Factor H (aproximadamente un 10 %). Esto es consistente con los resultados mostrados en la publicación PCT N.º WO 2011/011753, de la que el contenido se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
Se extrajo el Factor H del subproducto de torta de filtro de SiO2 finamente dividido formado como resultado de filtrar la composición de "tratamiento con Aerosil" directamente corriente arriba de la composición 6, el "filtrado de la fracción II+III", recirculando el tampón de extracción de Factor H a través de la prensa de filtro.
A continuación, se retiraron las sales y varias impurezas del extracto de torta de filtro por una primera etapa de precipitación realizada a pH 8,0 por medio de la adición de etanol hasta una concentración final de un 15 % y una incubación a -6 ºC durante un mínimo de cuatro horas. Se reajustó el pH de la reacción de precipitación hasta 8,0 después de 1 hora de tiempo de incubación. A continuación, se retiró el precipitado del sobrenadante por centrifugación. El Factor H se enriqueció adicionalmente por una segunda etapa de precipitación realizada a pH 6,0 por medio de la adición de etanol hasta una concentración final de un 25 % e incubación a -10 ºC durante un mínimo de 8 horas. A continuación, se recuperó por centrifugación el precipitado que contenía Factor H.
Se disolvió el precipitado formado por la segunda etapa de precipitación en una proporción de 1:9 en un tampón de disolución de fuerza iónica baja y se trató con S/D para inactivar los virus con envoltura lipídica. Posteriormente se enriqueció el Factor H por cromatografía de intercambio aniónico usando una resina de DEAE-Sepharose FF. En resumen, se unió el Factor H a la resina DEAE-Sepharose bajo condiciones de fuerza iónica baja y se eluyó incrementando la fuerza iónica de la solución. A continuación, se redujo la conductividad del eluato de DEAE-Sepharose y se enriqueció adicionalmente el Factor H por cromatografía de afinidad por heparina. En resumen, se unió el Factor H a la resina heparina-Sepharose FF bajo condiciones de fuerza iónica baja y se eluyó incrementando la fuerza iónica de la solución. Como se muestra en la tabla 18, la mayoría del Factor H se unió a las resinas de DEAE y heparina.

Tabla 18. Unión del Factor H a resinas cromatográficas.
1. DEAE-Sepharose FF
2. Heparina-Sepharose FF
LOTE
FH006 FH012 FH006 FH012
Carga (proteína)
30,6 mg/ml 28,0 mg/ml 3,3 mg/ml 2,1 mg/ml
Unión de FH a la resina
87,4 % 96,3 % 100 % 99,4 %
A continuación se sometió el Factor H eluido de la resina de heparina a ultrafiltración/diafiltración de acuerdo con procedimientos estándar, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200. A
82
imagen82
continuación, se concentró el Factor H recuperado de la cromatografía de exclusión por tamaño por ultrafiltración, se filtró de forma estéril, y se formuló a una concentración de proteína final de 50 mg/ml en tampón PBS.
A continuación, se caracterizó la composición de Factor H final (FH012) para determinar su homogeneidad,
5 impurezas y actividad amidolítica. Se caracterizó la monodispersidad de la composición de Factor H por cromatografía de exclusión por tamaño. Como se muestra en la tabla 19, la mayoría de la proteína presente en la composición final de Factor H migró con un tamaño estimado de 400 kDa cuando se cargó en una columna HP-SEC.
Tabla 19. Distribución de tamaño molecular de la composición de FH012 final determinada por HP-SEC.
Pico 1 >450 kDa
Pico 2 400 kDa Pico 3 160 kDa
Muestra
% área
FC FH012
0,3 97,6 2,1
10 A continuación se determinó el nivel de endotoxinas, pH, apariencia visual, y concentración de proteína final para la composición de Factor H final. Como se muestra en la tabla 20, la composición tenía niveles de endotoxinas bajos (<0,5 EU/ml) determinados por ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL).
15 Tabla 20. LAL, pH, apariencia visual, y contenido en proteína de la composición de FH012 final.
LAL
<0,5 EU/ml (sin pirógenos)
pH
7,1
Apariencia visual
Incoloro y sin partículas visuales
Concentraciones de proteína
4,54 %
A continuación, se determinó el nivel de varias impurezas de proteínas en la composición de Factor H final. Como se muestra en la tabla 21, las proteínas del complemento y las inmunoglobulinas IgG representaron menos de un 1 % de la concentración de proteína final en la composición de Factor H.

Tabla 21. Impurezas en la composición de FH012 final.
Impureza
Concentración Porcentaje de proteína total
IgG
51 μg/ml 0,11 %
C3
321,5 μg/ml 0,71 %
C3a
17,5 μg/ml 0,04 %
C5a
3,7 μg/ml <0,01 %
C4
1,94 μg/ml <0,01 %
EDTA
72 μg/ml
Finalmente, se determinó el nivel de actividad amidolítica y el contenido en proteasas como se informa en el ejemplo
1. Como se muestra en la tabla 17, el Factor H derivado de plasma purificado de acuerdo con el esquema indicado en 25 este ejemplo contenía niveles altos de actividad amidolítica y contenido en FXIa.
Ejemplo 3
Para mostrar la capacidad de retirar la actividad amidolítica de una composición de proteína derivada de plasma, se
30 trataron precipitados de la fracción II+III de Cohn resuspendidos con dióxido de silicio finamente dividido (SiO2). En resumen, se fraccionó una mezcla de plasmas humanos desprovistos de crioprecipitado de acuerdo con el esquema de purificación de IgG descrito en el presente documento, para proporcionar un precipitado de la fracción II+III. Se resuspendió el precipitado de la fracción II+III en un tampón de extracción de conductividad baja (pH 5,1±0,2; ~0,8 mS/cm) a una temperatura mantenida entre 0 ºC y 8 ºC. Se añadió Aerosil® 380 (Evonik Industries AG) hasta una
35 concentración final de entre 40 y 60 g/kg precipitado II+III. Después de la adición de coadyuvante de filtro CELPURE® C300 (Advanced Minerals Corporation) hasta una concentración final de 0,5 kg/kg precipitado II+III, se filtró la suspensión usando un filtro de profundidad. A continuación, se sometió a prueba la composición de inmunoglobulina en el filtrado para determinar el contenido en zimógeno de FXI. Como se muestra en la tabla 22, el tratamiento de la suspensión de la fracción II+III con SiO2 finamente dividido dio como resultado una reducción de casi un 90 % en el
40 contenido en zimógeno de Factor XI de la composición.
Tabla 22. Impurezas en la composición de FH012 final.
imagen83
Resuspensión de fracción II+III
Filtrado Cuno de extracto de fracción II+III
Lote
Pasta fr. II+III, (kg) Fr. II+III, disuelta (l) Zimógeno F-XI (U/ml) Zimógeno F-XI (1000s de U) F-XI zimógeno (%) Volumen filtrado Fr. II+III, (l) Zimógeno F-XI, (U/ml) Zimógeno F-XI, (1000s de U) Zimógeno F-XI (% resuspensión II+III) % Retirada
1
117 469 5,25 2460 100 2250 0,11 247 10,1 % 89,9 %
2
118 475 5,13 2435 100 2290 0,11 251 10,3 % 89,7 %
3
119 479 4,51 2162 100 2300 0,12 276 12,8 % 87,2 %
Ejemplo 4
Para evaluar la elución de serina proteasas de una torta de filtro de SiO2 finamente dividido, preparado como en el
5 ejemplo 3, se usaron tampones de elución que contenían concentraciones variables de tampón fosfato (100, 50, 25 y 5 mM) para eluir las proteínas de SiO2 a dos pH diferentes (6,0, 7,5). En resumen, se disolvió la torta de filtro en una proporción de 1:5 en un sistema de tampón apropiado y se filtró a través de filtros de profundidad (Cuno 50 SA). A continuación, se determinó la actividad amidolítica y la composición de Factor H de cada eluato (tabla 23 y tabla 24). Como se muestra en la tabla 23, a menor conductividad y pH (es decir, 6,0), se redujo la elución de la actividad
10 amidolítica medida con el sustrato CS2166 (FXIa, proteína C activada).
Bajo condiciones de elución a pH 7,5 (tabla 24), la elución de Factor H disminuyó con el incremento de la conductividad, mientras que la elución de serina proteasa se incrementó con el incremento de la conductividad. De forma sorprendente, a una conductividad extremadamente baja (fosfato 5 mM; 0,882 mS/cm), la elución de serina
15 proteasa se incrementó sustancialmente, mientras que la elución de Factor H disminuyó. Los datos obtenidos para la elución a pH 7,5 se muestran gráficamente en la figura 3.

Tabla 23. Actividad de la elución de Factor H y serina proteasa de SiO2 finamente dividido a pH 6,0.
Sustrato: CS2166
Factor H Proteína
Sistema de tampón: pH = 6,0
Muestra total nmol*min [g/l plasma] [nmol/g]
Tampón fosfato 100 mM; Cond. 11,88 mS/cm
Filtrado 72745 0,27 61944
Tampón fosfato 50 mM; Cond. 6,55 mS/cm
Filtrado 65055 0,19 64600
Tampón fosfato 25 mM; Cond. 3,48 mS/cm
Filtrado 28591 0,05 63694
Tampón fosfato 5 mM; Cond. 0,882 mS/cm
Filtrado 4816 0,0003 57331
imagen84
Sustrato: CS2166
Factor H Proteína
Sistema de tampón: pH = 7,5
Muestra total nmol*min [g/l plasma] [nmol/g]
Tampón fosfato 100 mM; Cond. 18,81 mS/cm
Filtrado 236456 0,21 156718
Tampón fosfato 50 mM; Cond. 10,91 mS/cm
Filtrado 147829 0,29 109228
Tampón fosfato 25 mM; Cond. 6,08 mS/cm
Filtrado 84622 0,39 57892
Tampón fosfato 5 mM: Cond. 1,524 mS/cm
Filtrado 176685 0,33 134051
Ejemplo 5
5 Para demostrar la capacidad para eluir diferencialmente serina proteasas y Factor H unidos conjuntamente a SiO2, se desarrolló un procedimiento de elución de dos etapas. En resumen, se preparó como antes una torta de filtro de la fracción II+III formada después del tratamiento con SiO2. A continuación se sometió la torta de filtro a una primera elución bajo condiciones de solución que comprendían una fuerza iónica de entre 0,882 mS/cm y 11,88 mS/cm a pH
10 6,0. Como se demuestra en el ejemplo 4, el tratamiento de SiO2 unido a pH bajo (pH 6,0) y fuerza iónica baja (menos de 6,5 mS/cm) da como resultado la elución de serina proteasas (por ejemplo, FXIa), mientras que una fracción sustancial de Factor H permanece unida. El tratamiento posterior a pH alto (pH 7,5) y fuerza iónica alta da como resultado la elución de Factor H del SiO2 (tabla 25). Además, consistente con los resultados proporcionados en el ejemplo 4, el tratamiento inicial de SiO2 a pH alto (7,5) da como resultado la elución de Factor H (tabla 26). Como se
15 muestra, se pudo usar una elución inicial a menor conductividad y pH 6,0 para reducir parcialmente la actividad amidolítica de la torta de filtro y después se puede eluir el Factor H a concentración de fosfato 100 mM, NaCI 150 mM, pH 7,6. Este procedimiento dio como resultado un filtrado, rendimiento de Factor H de 0,31 g/l plasma, con una reducción en la actividad amidolítica (CS2166) para un procesamiento adicional.
20 Tabla 25. Elución diferencial de dos etapas de serina proteasa y Factor H de SiO2 a pH 6,0/7,6.
Primer sistema de tampón de elución pH 6,0
Segundo tampón de elución Muestra Factor H [g/l plasma]
Tampón fosfato 100 mM; Cond. 11,88 mS/cm
Tampón fosfato 100 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6 Segunda elución de filtrado 0,06
Tampón fosfato 50 mM; Cond. 6,55 mS/cm
Tampón fosfato 100 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6 Segunda elución de filtrado 0,11
Tampón fosfato 25 mM; Cond. 3,48 mS/cm
Tampón fosfato 100 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6 Segunda elución de filtrado 0,25
Tampón fosfato 5 mM; Cond. 0,882 mS/cm
Tampón fosfato 100 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6 Segunda elución de filtrado 0,31

Tabla 26. Elución diferencial de dos etapas de serina proteasa y Factor H de SiO2 a pH 7,5/7,6.
Primer sistema de tampón de elución pH 7,5
Segundo tampón de elución Muestra Factor H [g/l plasma]
Tampón fosfato 100 mM; Cond. 11,88 mS/cm
Tampón fosfato 100 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6 Segunda elución de filtrado 0,05
Tampón fosfato 50 mM; Cond. 6,55 mS/cm
Tampón fosfato 100 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6 Segunda elución de filtrado 0,06
Tampón fosfato 25 mM; Cond. 3,48 mS/cm
Tampón fosfato 100 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6 Segunda elución de filtrado 0,06
Tampón fosfato 5 mM; Cond. 0,882 mS/cm
Tampón fosfato 100 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6 Segunda elución de filtrado 0,07
25
Ejemplo 6
Para determinar la cantidad de SiO2 finamente dividido requerido para una retirada eficaz de serina proteasas y zimógeno de serina proteasas de una composición de proteína derivada de plasma, se disolvió un precipitado de la 30 fracción II+III (es decir, torta de filtro II+III), se filtró, se trató con SiO2, se filtró con coadyuvante de filtro, y se sometió a una segunda filtración. En resumen, se disolvió en primer lugar la torta de filtro de la fracción II+III en tampón fosfato 0,1 M que contenía cloruro de sodio 150 mM (pH 7,5; 30 mS/cm). A continuación se filtró esta suspensión a través de un filtro Cuno 50 SA y se recogió el filtrado. Se mezcló Aerosil 380 con el filtrado a una concentración final de 1,0 o
imagen85
bien 2,5 g/g proteína y después se incubó durante al menos 50 minutos. Se añadió coadyuvante de filtro CELPURE y se realizó la filtración usando un filtro Cuno 50 SA. A continuación, se caracterizó el filtrado resultante para determinar la actividad amidolítica, como se informa en la tabla 27. Significativamente, los resultados muestran que la adición de Aerosil a una concentración final de 2,5 g/g proteína redujo la actividad amidolítica de calicreína, FXIa, y FXIIa en la
5 composición en más de un 90 %, en comparación con la muestra tratada con Aerosil a una concentración final de 1,0 g/g proteína.
10

Tabla 27. Actividad amidolítica presente en el precipitado de la fracción II+III resuspendido después del tratamiento con dióxido de silicio finamente dividido.
Calicreína, FXIa, FXIIa
Sustrato: S-2302 Reducción por incremento en adición de Aerosil
Muestra
total: nmol*min [%]
FH027 filtrado Cuno, después de adición de 1 g Aerosil por g proteína
83347 -
FH027 filtrado Cuno, después de adición de 2,5 g Aerosil por g proteína
6227 92,5
Ejemplo 7
Para evaluar la eficacia del tratamiento con SiO2 para la retirada de zimógeno de Factor XI durante la fabricación a
15 escala industrial de composiciones de proteína derivada de plasma, se caracterizó el contenido en zimógeno de FXI de seis lotes de fabricación a escala industrial. La tabla 28 y la tabla 29 muestran el promedio de contenido en zimógeno de FXI de cada etapa de procedimiento corriente arriba de las tres purificaciones realizadas en el mismo sitio de fabricación. Los datos en la tabla 28 y la tabla 29 demuestran que el tratamiento con SiO2 de purificaciones a escala de fabricación puede reducir el contenido en zimógeno de FXI de la composición al menos en un 90 %.
20 Notablemente, los sitios de fabricación 1 mezclaron Aerosil a una concentración final de 50 g/kg precipitado II+III, mientras que el sitio 2 usó Aerosil a una concentración final de 40 g/kg precipitado II+III. Sorprendentemente, esta pequeña diferencia en la cantidad de aerosil usado dio como resultado una diferencia significativa en el contenido en zimógeno de Factor XI del filtrado después del tratamiento con aerosil (un 8,1 % de la reserva de partida de Cohn para el sitio 2 frente a un 2,8 % de la reserva de partida de Cohn para el sitio 1).
25 Tabla 28. Valor medio del contenido en zimógeno de Factor XI en cada fracción de tres lotes de fabricación a gran escala en el sitio 1.
Muestra
Volumen Zimógeno F-XI
(U/ml)
(U) (% de reserva de Cohn)
Reserva de Cohn
3379 1,25 4233923 100,0
Sobrenadante I
3632 1,01 3669081 87,2
Sobrenadante II+III
3927 0,21 812077 19,1
pasta II+III*
2302 1,31 3026201 71,6
Filtrado después de Aerosil
2993 0,04 119107 2,8
Ppt G disuelto
248 0,31 77300 1,8
30 Tabla 29. Valor medio del contenido en zimógeno de Factor XI en cada fracción de tres lotes de fabricación a gran escala en el sitio 2.
Muestra
Volumen Zimógeno F-XI
(U/ml)
(U) (% de reserva de Cohn)
Reserva de Cohn
2885 1,11 3191460 100,0
Sobrenadante I
3076 1,04 3208517 100,5
Sobrenadante II+III
3376 0,29 968120 30,5
pasta II+III*
474,3 4,96 2352714 74,0
Filtrado después de Aerosil
2280 0,11 258466,7 8,1
Ppt G disuelto
238,1 1,07 253912,33 8,0

Claims (15)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para reducir la cantidad de una serina proteasa o un zimógeno de serina proteasa en una composición de proteína diana derivada de plasma, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    (a)
    realizar una primera etapa de enriquecimiento de proteína diana para formar una primera composición enriquecida;
    (b)
    poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido bajo condiciones adecuadas para unir al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa; y
    (c)
    separar el SiO2 de la composición para retirar la serina proteasa unida,
    en el que la al menos una serina proteasa o zimógeno de serina proteasa es Factor XIa (FXIa), Factor XIIa (FXIIa), Factor XI (FXI), o Factor XII (FXII); en el que la primera etapa de enriquecimiento de proteína diana es una etapa de precipitación de proteína; en el que la etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol; y en el que la proteína diana derivada de plasma se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina,
    alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, una proteína del sistema del complemento, y un inhibidor inter-alfa-tripsina (IαI).
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende además la etapa de realizar una segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana antes de poner en contacto la composición enriquecida con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la segunda etapa de enriquecimiento de proteína diana es:
    (i)
    una etapa de precipitación de proteína;
    (ii)
    una etapa de ultrafiltración/diafiltración; o
    (iii) una etapa de enriquecimiento cromatográfico.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol.
  5. 5.
    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el procedimiento comprende además la etapa de realizar una tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana después de poner en contacto la composición con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la tercera etapa de enriquecimiento de proteína diana es:
    (i)
    una etapa de precipitación de proteína;
    (ii)
    una etapa de ultrafiltración/diafiltración; o
    (iii) una etapa de enriquecimiento cromatográfico.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la etapa de precipitación de proteína es una etapa de fraccionamiento de alcohol.
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 3 o 6, en el que la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende las subetapas de:
    (i)
    poner en contacto la composición de proteína diana derivada de plasma con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir la proteína diana derivada de plasma; y
    (ii)
    eluir la proteína diana derivada de plasma de la resina cromatográfica.
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 3 o 6, en el que la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende las subetapas de:
    (i)
    poner en contacto la primera composición de proteína diana derivada de plasma enriquecida con una resina cromatográfica bajo condiciones adecuadas para unir al menos una impureza; y
    (ii)
    separar la resina de la composición de proteína derivada de plasma, en el que la proteína diana derivada de plasma no se une a la resina cromatográfica en la subetapa (i).
  10. 10.
    El procedimiento de la reivindicación 8 o 9, en el que la resina cromatográfica se selecciona del grupo que consiste en una resina de intercambio aniónico, una resina de intercambio catiónico, una resina de interacción hidrófoba, una resina de modo mezclado, una resina de hidroxiapatita, una resina de afinidad por ligando, una resina de inmunoafinidad y una resina de exclusión por tamaño.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 3 o 6, en el que la etapa de enriquecimiento cromatográfico comprende separar al menos una impureza de la proteína diana por tamaño y/o forma usando cromatografía de exclusión por tamaño.
  12. 12.
    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la proteína derivada de plasma es una proteína del sistema del complemento, y en el que la proteína del sistema del complemento se selecciona del grupo que consiste en Factor H (FH), Factor D, proteína del complemento C3, proteína de unión C4.
  13. 13.
    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la composición de proteína diana derivada de plasma es un intermedio de fabricación.
  14. 14.
    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición se pone en contacto con SiO2 a una concentración final de:
    (i)
    al menos 1 g SiO2/g proteína;
    (ii)
    al menos 2 g SiO2/g proteína; o
    (iii) al menos 2,5 g SiO2/g proteína.
  15. 15.
    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la serina proteasa
    o zimógeno de serina proteasa es:
    (i)
    Factor XI;
    (ii)
    Factor XII;
    87
    imagen2
    (iii) Factor XIa; o
    (iv) Factor XIIa.
    88
ES11729200.3T 2010-05-26 2011-05-26 Retirada de serina proteasas por tratamiento con dióxido de silicio finamente dividido Active ES2505465T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US842944 1986-03-24
US789365 1997-01-24
AU2010202125A AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-05-26 A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
AU2010202125 2010-05-26
US12/789,365 US8993734B2 (en) 2010-05-26 2010-05-27 Method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
US12/842,944 US8304524B2 (en) 2009-07-23 2010-07-23 Manufacture of factor H (FH) and FH-derivatives from plasma
PCT/US2011/038247 WO2011150284A2 (en) 2010-05-26 2011-05-26 Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2505465T3 true ES2505465T3 (es) 2014-10-10

Family

ID=42727304

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10727539.8T Active ES2525492T3 (es) 2010-05-26 2010-05-27 Procedimiento para preparar una composiciónde IgG enriquecida a partir de plasma
ES14176511T Active ES2959234T3 (es) 2010-05-26 2010-05-27 Procedimiento para preparar una composición de IgG enriquecida a partir de plasma
ES12190138.3T Active ES2536093T3 (es) 2010-05-26 2010-05-27 Procedimiento para preparar una composición de IgG enriquecida a partir de plasma
ES11729200.3T Active ES2505465T3 (es) 2010-05-26 2011-05-26 Retirada de serina proteasas por tratamiento con dióxido de silicio finamente dividido

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10727539.8T Active ES2525492T3 (es) 2010-05-26 2010-05-27 Procedimiento para preparar una composiciónde IgG enriquecida a partir de plasma
ES14176511T Active ES2959234T3 (es) 2010-05-26 2010-05-27 Procedimiento para preparar una composición de IgG enriquecida a partir de plasma
ES12190138.3T Active ES2536093T3 (es) 2010-05-26 2010-05-27 Procedimiento para preparar una composición de IgG enriquecida a partir de plasma

Country Status (25)

Country Link
US (6) US8993734B2 (es)
EP (6) EP2803349B1 (es)
JP (6) JP5876474B2 (es)
KR (3) KR101593265B1 (es)
CN (5) CN104958761B (es)
AR (4) AR076800A1 (es)
AU (7) AU2010202125B1 (es)
BR (2) BR112012029893B1 (es)
CA (2) CA2800155A1 (es)
CL (3) CL2012003291A1 (es)
CO (2) CO6660439A2 (es)
DK (3) DK2445482T3 (es)
EA (4) EA034602B1 (es)
ES (4) ES2525492T3 (es)
HK (6) HK1170168A1 (es)
HR (3) HRP20140944T1 (es)
HU (1) HUE064400T2 (es)
IL (2) IL223149A (es)
MX (4) MX349815B (es)
MY (3) MY173299A (es)
PL (4) PL2554160T3 (es)
PT (3) PT2554160E (es)
SG (3) SG185724A1 (es)
TW (3) TWI531577B (es)
WO (1) WO2011149472A1 (es)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI489994B (zh) 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
PT2477603E (pt) * 2009-09-17 2016-06-16 Baxalta Inc Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos para a sua utilização
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
US8772462B2 (en) 2010-05-26 2014-07-08 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
JP5830096B2 (ja) * 2010-07-23 2015-12-09 バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド 血漿由来インターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）の製造方法
AU2011364724B2 (en) * 2011-04-08 2016-11-17 Universidad De Costa Rica Method for producing injectable formulations of blood-derived protein materials, and materials obtained using said method
KR20140104479A (ko) 2011-12-13 2014-08-28 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 민감도가 증가된 저전도율 조건에서의 자가항체의 측정
TWI629283B (zh) * 2012-02-23 2018-07-11 巴克斯歐塔公司 來自血漿中的免疫球蛋白之ｉ-ｉｖ-１部分沉澱
RU2487725C1 (ru) * 2012-03-15 2013-07-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГУП "НПО "Микроген" Минздрава России) Способ получения концентрированного иммуноглобулинового препарата для подкожного введения
CN103197053B (zh) * 2013-03-15 2015-02-18 上海市血液中心 一种抗IgA抗体检测试剂盒
AU2013203043B2 (en) 2013-03-15 2016-10-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods to produce a human plasma-derived igg preparation enriched in brain disease-related natural iggs
CN104086642A (zh) * 2014-07-03 2014-10-08 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fi+iii上清的制备方法
CN104086646B (zh) * 2014-07-03 2018-10-09 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fv沉淀的制备方法
CN104072601A (zh) * 2014-07-03 2014-10-01 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fii沉淀的制备方法
GB201413227D0 (en) * 2014-07-25 2014-09-10 Bioproducts Lab Ltd Process
US20170313767A1 (en) 2014-10-21 2017-11-02 The General Hospital Corporation Methods of diagnosis and treatment of tuberculosis and infection
CN204424090U (zh) 2014-11-28 2015-06-24 比亚迪股份有限公司 薄膜电容器
CN107921079A (zh) * 2015-04-02 2018-04-17 K·黄 由组分iii制造静脉注射免疫球蛋白的方法
WO2016161422A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Kieu Hoang A method of manufacturing and purifiying prothrombin complex concentrate from fraction iii for intraveneous injection and a method of curing and preventing hemophilia a with inhibitors or hempophilia b patients infected with hiv-1 and hiv-2
US20160289301A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Kieu Hoang Process of cloning and further purification to make a recombinant intravenous immunoglobulin
WO2017058879A1 (en) * 2015-09-29 2017-04-06 Kieu Hoang A method of manufacturing intravenous immunoglobulin from fraction iii
US20170232079A1 (en) * 2015-10-06 2017-08-17 Kieu Hoang Method of manufacturing prothrombin complex concentrate from fraction iii and non-prothrombin complex concentrate from fraction iv
CN106800583A (zh) * 2015-11-26 2017-06-06 上海洲跃生物科技有限公司 一种速溶无析出的冻干人纤维蛋白原制备工艺
EP3275897A1 (en) * 2016-07-27 2018-01-31 Biotest AG Process for preparing immunoglobulin compositions
KR20190053908A (ko) * 2016-09-16 2019-05-20 로이코케어 아게 가공 동안 바이오 의약품의 안정화를 위한 신규한 방법
WO2018050873A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Leukocare Ag A novel method for producing low viscous and highly concentrated biopharmaceutical drug products in liquid formulation
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
US20200055922A1 (en) * 2017-04-21 2020-02-20 Csl Behring Ag Immunoglobulin products for use in the treatment of chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
DK3728287T3 (da) * 2017-12-19 2024-06-10 CSL Behring Lengnau AG Proteinoprensning og virusinaktivering med alkylglycosider
EP3774894A1 (en) * 2018-04-12 2021-02-17 Amgen Inc. Methods for making stable protein compositions
CN108733099B (zh) * 2018-05-31 2020-08-11 上海药明生物技术有限公司 低pH孵育和中和的自动调节系统及方法
JP2022551566A (ja) * 2019-10-11 2022-12-12 武田薬品工業株式会社 第ＸＩａ因子のヘパリン非感受性アッセイ
AU2020378245A1 (en) * 2019-11-04 2022-04-07 Alkahest, Inc. Blood plasma fractions for use in muscle regeneration
US11732004B2 (en) 2020-04-10 2023-08-22 Plasma Technologies, Llc Compositions and methods for simplified high efficiency isolation of proteins
CN111961130B (zh) * 2020-08-31 2021-09-10 华兰生物工程重庆有限公司 一种从血浆中提取并分离IgM和IgG的方法
AU2021354979A1 (en) * 2020-10-01 2023-02-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma fractionation process utilizing spray-dried human plasma
EP4271706A1 (en) * 2020-12-28 2023-11-08 Plasma Technologies LLC Systems and methods for process scale isolation of immunoglobulin g
CN112574296B (zh) * 2020-12-30 2023-05-19 中国医学科学院输血研究所 一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法
EP4377361A1 (en) 2021-07-29 2024-06-05 CSL Behring AG Method of purifying immunoglobulin g and uses thereof
KR20230121373A (ko) * 2022-02-11 2023-08-18 주식회사 녹십자 인자 xiii의 정제방법
WO2023170553A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Affinity chromatographic production of clinical human igg products
WO2023170680A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Equashield Medical Ltd Fluid transfer station in a robotic pharmaceutical preparation system
WO2023215722A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of preparing cohn pool concentrate from blood plasma through ultrafiltration
WO2023247736A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Ageronix SA Alpha1-antitrypsin for use in the treatment of diseases or disorders of the nervous system such as chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2390074A (en) * 1942-02-09 1945-12-04 Research Corp Protein product and process
SE348942B (es) 1970-06-02 1972-09-18 Statens Bakteriologiska Labor
US4056614A (en) 1972-09-22 1977-11-01 Marc Bonneau Immunity depressant medicine
US3998946A (en) * 1975-04-23 1976-12-21 The Regents Of The University Of Minnesota Fibrinogen-free plasminogen-plasmin-free plasma and method of preparing and using same
DE2801123C2 (de) * 1977-01-26 1986-01-02 Armour Pharma GmbH & Co KG, 3440 Eschwege Verfahren zur Herstellung eines intravenös applizierbaren Serumeiweiß-Präparates
US4136094A (en) 1977-08-31 1979-01-23 The Regents Of The University Of Minnesota Preparation of intravenous human and animal gamma globulins and isolation of albumin
US4296027A (en) 1977-08-31 1981-10-20 The Regents Of The University Of Minnesota Pure intravenous human and animal gamma globulins
US4550019A (en) * 1978-03-22 1985-10-29 South Africa Inventions Development Corporation Manufacture and use of fowl egg antibodies
US4357272A (en) * 1978-03-22 1982-11-02 The South African Inventions Development Corporation Recovering purified antibodies from egg yolk
DE2901822A1 (de) * 1979-01-18 1980-07-31 Biotest Serum Institut Gmbh Verfahren zur herstellung einer fuer die intravenoese applikation geeigneten immunglobulinloesung, die igm in ankonzentrierter form enthaelt
DE2902158A1 (de) 1979-01-20 1980-07-31 Biotest Serum Institut Gmbh Verfahren zur herstellung von fibrinogen, einem die gerinnungsfaktoren ii, vii, ix und x enthaltenden prothrombinkomplex, antithrombin iii und einer loesung von lagerstabilen serumproteinen
US4228154A (en) 1979-02-26 1980-10-14 Armour Pharmaceutical Company Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography
US4378346A (en) * 1979-08-15 1983-03-29 Tankersley Donald L Intravenously injectable solution of plasma protein fraction free from bradykinin, kininogen and prekallikrein activators and processes for its production
US4499073A (en) * 1981-08-24 1985-02-12 Cutter Laboratories, Inc. Intravenously injectable immune serum globulin
JPS5855432A (ja) 1981-09-29 1983-04-01 Fujirebio Inc 静脈注射用免疫グロブリンの製法
US4439358A (en) 1982-06-17 1984-03-27 Miles Laboratories, Inc. Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor
US4624780A (en) 1982-06-28 1986-11-25 Alpha Therapeutic Corporation Fractionation of blood plasma
DE3247150A1 (de) 1982-12-21 1984-06-28 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Gerinnungsaktive plasmaproteinloesung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur behandlung von stoerungen des haemostasesystems
DK166763C (da) 1983-03-16 1993-07-12 Immuno Ag Immunoglobulin-g-holdig fraktion
US5061237A (en) 1985-07-02 1991-10-29 Cytomed Medizintechnik Gmbh Method of purifying whole blood
DE3523615A1 (de) 1985-07-02 1987-01-15 Cytomed Medizintechnik Medizinisches geraet, insbesondere kanuele, katheter oder implantat
JPH0742235B2 (ja) 1985-11-08 1995-05-10 三共株式会社 自己免疫性疾病の予防・治療剤
US5136094A (en) 1988-03-10 1992-08-04 Air Products And Chemicals, Inc. Process for the synthesis of secondary formamides
US5055447A (en) 1988-07-28 1991-10-08 Genentech, Inc. Method and compositions for the treatment and prevention of septic shock
JP2871709B2 (ja) 1988-11-21 1999-03-17 住友製薬株式会社 免疫グロブリンｇ結合活性を有する新規な蛋白質プロテインｈ、該蛋白質をコードする遺伝子及び該蛋白質の製造法
US5177194A (en) 1990-02-01 1993-01-05 Baxter International, Inc. Process for purifying immune serum globulins
EP0440509A3 (en) * 1990-02-02 1991-12-18 Common Services Agency Novel cell growth medium components and process for producing same
DE59009020D1 (de) * 1990-03-22 1995-06-08 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung eines intravenös verträglichen Immunglobulin-G-Präparates.
US5130451A (en) * 1991-03-28 1992-07-14 Amoco Corporation Process for preparing carboxyaryl phosphates
US5324425A (en) * 1992-08-26 1994-06-28 Ellison Billy L Method and apparatus for removing solids from aqueous wash solutions
FR2706466B1 (fr) 1993-06-14 1995-08-25 Aetsrn Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré.
FR2711371B1 (fr) 1993-10-18 1995-12-29 Aetsrn Procédé de préparation d'un concentré d'inter-alpha-trypsine inhibiteur à usage thérapeutique et concentré obtenu.
US5610285A (en) 1994-08-24 1997-03-11 Bayer Corporation Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions
DE4435485C1 (de) 1994-10-04 1996-03-21 Immuno Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor
AUPN858596A0 (en) 1996-03-08 1996-04-04 Csl Limited Filtration of plasma precipitates using cellulose filter aid
TW491855B (en) * 1996-08-07 2002-06-21 Csl Ltd Purification of immunoglobulins
US5783640A (en) * 1997-03-04 1998-07-21 The Goodyear Tire & Rubber Company Rubber compositions containing a disodium salt of 2, 2'-dithiosalicyclic acid
US6124437A (en) 1997-03-19 2000-09-26 Welfide Corporation Immunoglobulin preparation and preparation process thereof
GB9705810D0 (en) 1997-03-20 1997-05-07 Common Services Agency Intravenous immune globulin
AT407114B (de) 1997-06-10 2000-12-27 Immuno Ag Alpha 1-antitrypsin-präparation sowie verfahren zu deren herstellung
US5886154A (en) 1997-06-20 1999-03-23 Lebing; Wytold R. Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
CN1149100C (zh) 1997-10-23 2004-05-12 三菱制药株式会社 可室温贮存的免疫球蛋白静脉注射制剂
US20020114802A1 (en) 1998-02-10 2002-08-22 Tjellstrom Bo Arthur Einar Oral immunoglobulin treatment for inflammatory bowel disease
AT406873B (de) 1998-02-25 2000-10-25 Immuno Ag Verfahren zur abreicherung von pathogenen aus proteinhaltigen lösungen
DE19932782A1 (de) * 1999-07-14 2001-01-18 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung von Plasma oder Serum, so erhaltene Präparate und deren Verwendung
EP1522289A3 (en) 1999-10-21 2008-01-23 Alcon, Inc Sub-tenon drug delivery
DE10008519C1 (de) 2000-02-21 2001-07-12 Dica Technologies Ag Verfahren und Kommunikationseinrichtungen zum Aufbau von gesicherten E-Mail-Verkehr zwischen Mail-Domains des Internet
DE10008619A1 (de) * 2000-02-24 2001-09-06 Immuno Vet As Lynge Mikroorganismenfreies IgG-Präparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung in der Tieraufzucht und in der Tiermast
SE0001128D0 (sv) 2000-03-30 2000-03-30 Amersham Pharm Biotech Ab A method of producing IgG
US20020098182A1 (en) 2000-09-28 2002-07-25 Richard Weisbart Treatment of immune-mediated diseases by oral administration of plasma fractions enriched in immunoglobulin G
WO2002030983A2 (de) 2000-10-13 2002-04-18 Octapharma Ag Bikunin enthaltende plasmafraktion, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer verwendung
FR2824568B1 (fr) 2001-05-11 2004-04-09 Lab Francais Du Fractionnement Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique
EP1463527A4 (en) 2001-10-04 2005-05-11 Protein Therapeutics Inc USE OF GAMMAGLOBULIN FOR THE TREATMENT OF IMMUNE-MEDIATED DISEASES
US6893639B2 (en) 2001-10-19 2005-05-17 Hemacare Corporation Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates
US7777006B2 (en) 2002-12-31 2010-08-17 Csl Behring L.L.C. Method for purification of alpha-1-antitrypsin
MXPA05012476A (es) * 2003-05-23 2006-02-22 Novo Nordisk Healthcare Ag Estabilizacion de proteina en solucion.
WO2005012354A1 (en) 2003-07-31 2005-02-10 Zlb Behring Gmbh Method for extending the half-life of fviii
US20050054003A1 (en) 2003-09-10 2005-03-10 Stenland Christopher J. Prion clearance using particulate metal oxides
US7932365B2 (en) 2003-11-08 2011-04-26 Pro Thera Biologics, Llc Preparation and composition of inter-alpha inhibitor proteins from human plasma for therapeutic use
BRPI0507298A (pt) 2004-01-30 2007-07-03 Suomen Punainen Risti Veripalv processo para a produção de imunoglobulina segura a vìrus
CN1922207B (zh) 2004-02-27 2012-06-06 奥克特珐玛股份有限公司 提供纯化的、病毒安全的抗体制剂的方法
US7745389B2 (en) 2005-02-14 2010-06-29 University Of Iowa Research Foundation Methods for treatment of age-related macular degeneration
US8715649B2 (en) 2005-06-07 2014-05-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods of use for alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity
US7807435B2 (en) 2005-08-11 2010-10-05 Baxter International Inc. Method for the purification of alpha-1 proteinase inhibitor (a1PI)
US20090118163A1 (en) 2005-09-19 2009-05-07 Peter Gronski Factor H for the Treatment of Chronic Nephropathies and Production thereof
FR2894145B1 (fr) 2005-12-07 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation de facteur h du complement a titre de medicament
AU2007209363B2 (en) * 2006-01-25 2013-08-22 Octapharma Ag Purification and use of a factor for supporting wound healing
US8476234B2 (en) 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
EP1852443A1 (en) * 2006-05-05 2007-11-07 Leukocare AG Biocompatible three dimensional matrix for the immobilization of biological substances
DE102007001521A1 (de) * 2007-01-10 2008-07-17 Matthias, Torsten, Dr. Verwendung von Cohn-Oncley-Fraktionen II und II/III zur Behandlung des systemischen Lupus erythematodes
EP2129686B1 (en) * 2007-03-20 2016-07-13 CSL Behring GmbH Methods for industrial scale production of therapeutic complement factor h preparations from human plasma
DE202007004346U1 (de) 2007-03-21 2007-10-31 Rehau Ag + Co Rohranordnung
CA2722015A1 (en) * 2007-04-20 2009-01-08 Regents Of The University Of Colorado Compositions and methods of use for alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity
WO2008151817A1 (en) 2007-06-13 2008-12-18 Csl Behring Gmbh Use of vwf stabilized fviii preparations and of vwf preparations without fviii for extravascular administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
EP2522755B1 (en) 2007-08-13 2014-04-02 Baxter International Inc. IVIG modulation of chemokines for treatment of Multiple Sclerosis, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease
US8466265B2 (en) * 2007-10-02 2013-06-18 Csl Limited Therapeutic antibody purification method and method of use
CN101952016A (zh) 2007-12-28 2011-01-19 巴克斯特国际公司 重组vwf配方
CN101249265B (zh) * 2008-04-11 2010-10-27 三九集团湛江开发区双林药业有限公司 静脉注射用人乙肝免疫球蛋白及其制备方法
KR101714008B1 (ko) 2008-05-28 2017-03-09 프로테라 바이오로직스, 인크. 혈액으로부터 인터-알파 저해 단백질의 제조 및 조성물
CN103739712B (zh) 2008-06-24 2016-10-05 德国杰特贝林生物制品有限公司 具有延长的体内半衰期的因子viii、冯·维勒布兰德因子或它们的复合物
CN201169579Y (zh) * 2008-06-30 2008-12-24 山东泰邦生物制品有限公司 一种人血白蛋白分离用乙醇雾化扩散装置
AU2009307648C1 (en) 2008-10-21 2016-12-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited Lyophilized recombinant VWF formulations
JP2012508580A (ja) 2008-11-12 2012-04-12 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 膜吸着を用いるブチリルコリンエステラーゼの精製
EP2435474A2 (en) 2009-05-27 2012-04-04 Baxter International Inc A method to produce a highly concentrated immunoglobulin preparation for subcutaneous use
US8304524B2 (en) 2009-07-23 2012-11-06 Baxter International Inc. Manufacture of factor H (FH) and FH-derivatives from plasma
AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
US8772462B2 (en) 2010-05-26 2014-07-08 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
EP2591094B1 (en) 2010-07-08 2018-09-05 Baxalta GmbH Method of producing recombinant adamts13 in cell culture
JP5830096B2 (ja) 2010-07-23 2015-12-09 バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド 血漿由来インターα阻害タンパク質（ＩａＩｐ）の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CO6660438A2 (es) 2013-04-30
EP2554160B1 (en) 2015-02-25
JP2018080207A (ja) 2018-05-24
HK1203838A1 (en) 2015-11-06
EP2803349C0 (en) 2023-09-27
AU2010224461A1 (en) 2010-10-21
HRP20150484T1 (hr) 2015-08-14
AU2016202973B2 (en) 2017-12-07
AR076800A1 (es) 2011-07-06
AU2020200373A1 (en) 2020-02-13
JP2013528183A (ja) 2013-07-08
ES2959234T3 (es) 2024-02-22
SG185725A1 (en) 2012-12-28
HRP20141109T1 (hr) 2014-12-19
AU2010202125B1 (en) 2010-09-02
HK1181682A1 (en) 2013-11-15
CN104840946A (zh) 2015-08-19
PT2575762E (pt) 2014-07-28
AU2011258111B2 (en) 2016-02-11
PL2803349T3 (pl) 2024-02-26
CA2800155A1 (en) 2011-12-01
CN104958761A (zh) 2015-10-07
US20110293638A1 (en) 2011-12-01
US20210403504A1 (en) 2021-12-30
AR114228A2 (es) 2020-08-05
US8993734B2 (en) 2015-03-31
DK2445482T3 (da) 2014-09-22
AU2018201371B2 (en) 2019-10-31
BR112012029893A2 (pt) 2019-05-28
IL223150A0 (en) 2013-02-03
CN104958761B (zh) 2021-01-01
MY161617A (en) 2017-04-28
SG185724A1 (en) 2013-01-30
US11136350B2 (en) 2021-10-05
US20150133644A1 (en) 2015-05-14
EP2796128A1 (en) 2014-10-29
JP2017014297A (ja) 2017-01-19
PT2445482E (pt) 2014-11-03
MX2012013682A (es) 2013-01-28
US20240117009A1 (en) 2024-04-11
PL2554160T3 (pl) 2015-07-31
EP2445482B1 (en) 2014-08-27
HK1183449A1 (en) 2013-12-27
JP6363676B2 (ja) 2018-07-25
HK1215931A1 (zh) 2016-09-30
DK2554160T3 (da) 2015-04-27
ES2525492T3 (es) 2014-12-23
TW201542584A (zh) 2015-11-16
TWI543989B (zh) 2016-08-01
PT2554160E (pt) 2015-06-11
AU2010224461B2 (en) 2011-08-04
JP2016155798A (ja) 2016-09-01
AR082093A1 (es) 2012-11-14
AU2011258111A1 (en) 2012-12-13
CL2014003430A1 (es) 2015-05-04
CL2012003290A1 (es) 2013-10-18
CA2800272A1 (en) 2011-12-01
US20130101579A1 (en) 2013-04-25
EP2575762A2 (en) 2013-04-10
AU2021286395B2 (en) 2024-04-11
TWI531577B (zh) 2016-05-01
KR20130080450A (ko) 2013-07-12
KR20130109016A (ko) 2013-10-07
BR112012029893B1 (pt) 2022-09-06
TW201202263A (en) 2012-01-16
JP5866345B2 (ja) 2016-02-17
MX364252B (es) 2019-04-17
HUE064400T2 (hu) 2024-03-28
MX349815B (es) 2017-08-09
PL2575762T3 (pl) 2015-01-30
HK1170168A1 (en) 2013-02-22
CL2012003291A1 (es) 2013-10-04
KR101647617B1 (ko) 2016-08-10
US20180118782A1 (en) 2018-05-03
EP2803349A1 (en) 2014-11-19
HK1213790A1 (zh) 2016-07-15
WO2011149472A1 (en) 2011-12-01
MX337028B (es) 2016-02-09
AU2021286395A1 (en) 2022-01-20
PL2445482T3 (pl) 2015-01-30
EP2803349B1 (en) 2023-09-27
CN103068365B (zh) 2015-07-08
IL223149A (en) 2017-02-28
EA034530B1 (ru) 2020-02-18
AU2020200373B2 (en) 2022-01-13
BR112012029897A2 (pt) 2016-08-16
EA025826B1 (ru) 2017-02-28
JP2013527201A (ja) 2013-06-27
JP6592120B2 (ja) 2019-10-16
CN103068365A (zh) 2013-04-24
EA201500848A1 (ru) 2016-06-30
EA034602B1 (ru) 2020-02-25
KR20160014119A (ko) 2016-02-05
EP2445482A1 (en) 2012-05-02
DK2575762T3 (da) 2014-10-13
CN109180776B (zh) 2022-12-13
AR121861A2 (es) 2022-07-20
TWI504607B (zh) 2015-10-21
CO6660439A2 (es) 2013-04-30
EP2575762B1 (en) 2014-07-09
CN109180776A (zh) 2019-01-11
ES2536093T3 (es) 2015-05-20
EP4039249A1 (en) 2022-08-10
SG10201505161SA (en) 2015-08-28
AU2016202973A1 (en) 2016-05-26
JP5876474B2 (ja) 2016-03-02
JP2016053016A (ja) 2016-04-14
CN102970975B (zh) 2015-05-06
MX2012013689A (es) 2013-01-28
MY160551A (en) 2017-03-15
AU2018201371A1 (en) 2018-03-22
HRP20140944T1 (hr) 2014-12-05
EA023446B1 (ru) 2016-06-30
MX2019004482A (es) 2019-08-30
TW201141879A (en) 2011-12-01
EA201291367A1 (ru) 2013-09-30
EA201691558A1 (ru) 2017-05-31
KR101716534B1 (ko) 2017-03-14
MY173299A (en) 2020-01-14
EP2554160A1 (en) 2013-02-06
US8940877B2 (en) 2015-01-27
KR101593265B1 (ko) 2016-02-11
EA201291355A1 (ru) 2013-04-30
IL223149A0 (en) 2013-02-03
CN102970975A (zh) 2013-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021286395B2 (en) Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
US11891431B2 (en) Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide