PT2477603E - Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos para a sua utilização - Google Patents

Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos para a sua utilização Download PDF

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Svatos Sonja
Schwarz Hans-Peter
Weber Alfred
Bruckschwaiger Leopold
Lei Laura
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Description

DESCRIÇÃO "CO-FORMULAÇÃO ESTÁVEL DE HIALURONIDASE E IMUNOGLOBULINA E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO"
CAMPO DA INVENÇÃO São aqui proporcionadas co-formulações estáveis de imunoglobulina e hialuronidase que são estáveis durante o armazenamento na forma liquida, à temperatura ambiente, durante pelo menos 6 meses e num frigorífico convencional durante 1-2 anos. Tais co-formulações podem ser usadas em métodos de tratamento de doenças ou condições tratáveis com IG através da administração subcutânea.
ANTECEDENTES
Os produtos de imunoglobulina (IG) derivados de plasma humano foram usados pela primeira vez em 1952 para tratar imunodeficiência. Inicialmente, as administrações intramusculares e subcutâneas de IG eram os métodos de eleição. Para a injecção de quantidades maiores de IG necessárias para o tratamento eficaz de várias doenças, no entanto foram desenvolvidos produtos administráveis por via intravenosa com IG de concentração mais baixa (50 mg/ml). A administração intravenosa de imunoglobulina (IVIG) é o principal tratamento de indivíduos com imunodeficiências.
Apesar das preparações iniciais de IVIG causarem efeitos secundários graves, as preparações de IVIG disponíveis actualmente são bem toleradas na maioria dos doentes imunodeficientes. No entanto, uma pequena proporção de doentes continua a ter reacções desagradáveis, mesmo incapacitantes, tais como dor de cabeça, fadiga e mialgia. A febre e suores continuam a ser um problema, especialmente quando os doentes têm infecções recorrentes. As reacções frequentemente persistem apesar de se tentar outras preparações de IVIG ou pré-medicação com acetaminofeno, difenidramina e corticosteróides. Ainda, devido à necessidade de administração IV, verificam-se dificuldades relativamente à colaboração do doente. A administração subcutânea (SQ) de imunoglobulina é uma alternativa à administração intravenosa. Comparativamente com as infusões IV, a administração SQ de imunoglobulina apresenta várias vantagens. Por exemplo, reduz a incidência de reacções sistémicas, não requer o aceso IV por vezes difícil, melhora os níveis e dá mais independência aos doentes.
Para uso terapêutico de qualquer preparação de IG, uma outra consideração importante nos produtos IG é a sua estabilidade durante o armazenamento. A manipulação e administração seguras das formulações contendo proteínas representam desafios para os formuladores de fármacos. As proteínas possuem propriedades químicas e físicas únicas que apresentam problemas de estabilidade: existe uma variedade de vias de degradação para as proteínas, implicando instabilidade química e física. A instabilidade química inclui desaminação, agregação, corte do esqueleto peptídico e oxidação dos resíduos de metionina. A instabilidade física inclui muitos fenómenos, incluindo, por exemplo, agregação. Assim, existe a necessidade de formulações estáveis das preparações de imunoglobulinas.
SUMÁRIO São aqui proporcionadas composições, métodos e kits para a administração subcutânea de co-formulações líquidas estáveis para o tratamento de doenças e condições tratáveis com IG. São proporcionadas composições líquidas de co-formulação para administração subcutânea, contendo imunoglobulina (IG) numa concentração que é pelo menos 10% p/v, uma hialuronidase numa concentração que é pelo menos 50 U/ml e está presente numa proporção de pelo menos 100 Unidades/grama (U/g) de IG, NaCl numa concentração de pelo menos 50 mM e um pH entre 4 e 5. A co-formulação é estável a 28°C-32°C durante pelo menos 6 meses.
Ainda, pode estar presente um aminoácido estabilizador, por exemplo alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina ou prolina. Nalguns exemplos, o aminoácido está presente numa quantidade que é pelo menos 100 mM. Num exemplo, o aminoácido é glicina e está presente numa quantidade que é ou é pelo menos 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM ou mais. Num outro exemplo, a glicina está numa quantidade que é 250 mM.
As co-formulações líquidas estáveis aqui proporcionadas possuem pelo menos 10% a 22% de IG, por exemplo 10 % w/v, 11 % w/v, 12 % w/v, 13 % w/v, 14 % w/v, 15 % w/v, 16 % w/v, 17 % w/v, 18 % w/v, 19 % w/v, 20 % w/v, 21 % w/v, 22 % w/v ou mais. Nalguns exemplos, a IG é 10 % w/v ou 20 % w/v. A IG usada nas co-formulações é de plasma humano, por exemplo, pode ser purificada a partir de plasma humano, como seja por fraccionamento com álcool. Nalguns exemplos, a IG é ainda purificada através de uma ou mais modificações químicas, incubação a pH 4,0 com ou sem pepsina, precipitação com polietilenoglicol (PEG), cromato-grafia de permuta iónica, clivagem enzimática, tratamento com solventes/detergentes, diafiltração ou ultrafiltração. As co-formulações aqui proporcionadas podem empregar IG que contém IgG, IgA e IgM. Nalguns exemplos, a IG possui mais de 95% de IgG.
Ainda, as co-formulações podem conter NaCl. Nalguns exemplos, o NaCl está numa concentração de 50 mM a 220 mM, por exemplo 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 210 mM, 22 0 mM ou mais. Num exemplo, o NaCl está numa concentração de 150 mM.
As co-formulações aqui proporcionadas possuem uma hialunoridase solúvel que pode ser PH20 ou uma sua forma truncada. Por exemplo, a hialuronidase solúvel pode ser PH20 ovina, bovina ou humana truncada. Nalguns exemplos, onde PH2 0 é PH2 0 humana truncada, a PH20 humana truncada pode ser seleccionada a partir de polipéptidos tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NOS: 4-9, ou variantes alélicas ou outras variantes das mesmas. Num exemplo, a hialuronidase solúvel é rHuPH20.
Ainda, a hialuronidase solúvel pode estar numa concentração que é 50 U/mL a 500 U/mL, por exemplo 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/ mL ou mais. Por exemplo, a hialuronidase solúvel pode estar numa concentração que é 100 U/ml ou 30 U/ml. Nas co-formulações aqui proporcionadas, a hialuronidase solúvel pode estar presente numa proporção de 100 U/g a 5000 U/g de IG, por exemplo 100 U/g IG, 150 U/g IG, 200 U/g IG, 250 U/g IG, 300 U/g IG, 400 U/g IG, 500 U/g IG, 600 U/g IG, 700 U/g IG, 800 U/g IG, 900 U/g IG, 1000 U/g IG, 1200 U/g IG, 1500 U/g IG, 1800 U/g IG, 2000 U/g IG, 3000 U/g IG, 4000 U/g IG, 5000 U/g IG ou mais. Nalguns exemplos, a hialuronidase está numa proporção de 500 U/g IG, 1000 U/g IG, 1500 U/g IG ou 3000 U/g IG. O pH das co-f ormulações é 4,4 a 4,9 na forma concentrada.
As co-formulações aqui proporcionadas podem ser formuladas para administração de dosagens múltiplas ou administração de dosagem única. Ainda, nos exemplos em que a co-formulação é para administração de dosagem única, a IG está numa quantidade suficiente para tratar uma doença ou condição tratável com IG. A IG pode ser administrada diariamente, semanalmente, bissemanalmente, cada 2-3 semanas, cada 3-4 semanas ou mensalmente para tratamento de uma doença ou condição tratável com IG. A administração da co-formulação é efectuada de modo que a quantidade de IG administrada seja substancialmente a mesma quantidade numa administração de dosagem única quando administrada intravenosamente para tratamento de uma doença ou condição tratável com IG. Nalguns exemplos, a quantidade de IG na co-f ormulação pode ser cerca de 1 grama (g) a 200 g, por exemplo, 1 grama (g) , 2g, 3g, 4g, 5g, lOg, 20g, 30g, 40g, 50g, 60g, 70g, 80g, 90g, lOOg ou 200g. Ainda, a quantidade de hialuronidase na composição pode ser cerca de 500 Unidades a 100,000 Unidades, por exemplo, 500 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 5000 Unidades, 10000 Unidades, 30,000 Unidades, 40000 Unidades, 50000 Unidades, 60000 Unidades, 70000 Unidades, 80000 Unidades, 90000 Unidades, 100000 Unidades ou mais.
As co-formulações liquidas aqui proporcionadas são estáveis a 28°C-32°C durante pelo menos 6 meses a um ano, por exemplo 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou mais. As co-formulações liquidas são ainda estáveis a 0o C-10° C durante pelo menos 6 meses a 2 anos, por exemplo, 6 meses, 1 ano, 2 anos ou mais.
Também é aqui proporcionado um kit contendo quaisquer co-formulações liquidas estáveis aqui proporcionadas e, facultativamente, instruções para o seu uso. São aqui proporcionados contentores incluindo as co-formulações liquidas estáveis aqui proporcionadas. 0 contentor pode ser um tubo, garrafa, frasco ou seringa. Nos exemplos em que o contentor é uma seringa, o contentor ainda compreende uma agulha para injecção. Assim, os contentores aqui proporcionados possuem co-formulações líquidas estáveis para administração de dosagem única ou administração de dosagem múltipla. São aqui proporcionados métodos de tratamento de doenças ou condições tratáveis com IG, através da administração subcutânea a um indivíduo de uma co-formulação líquida estável contendo uma hialuronidase solúvel e IG. A co-formulação é administrada de modo que a quantidade de IG administrada é substancialmente a mesma quantidade quando administrada intravenosamente para tratamento de uma doença ou condição tratável com IG.
Ainda, os métodos aqui proporcionados são para tratamento de uma doença ou condição tratável com IG, seleccionada entre doenças de imunodeficiências primárias, doenças de imunodeficiências secundárias, doenças inflamatórias, doenças auto-imunes e infecções agudas.
Nalguns exemplos, as co-formulações podem ser administradas usando métodos aqui proporcionados para tratar uma doença de imunodeficiência primária. A doença de imunodeficiência primária pode ser imunodeficiência variável comum (CVID), deficiência selectiva de IgA, deficiência da subclasse IgG, deficiência em anticorpos específicos, distúrbios do complemento, agamaglobulinemia congénita, ataxia telangiectasia, híper-IgM, síndrome de Wiskott-Aldrich, imunodeficiência severa combinada (SCID), hipogamaglobulinemia primária, doenças de imunodeficiência primária com deficiência de anticorpos, agamaglobulinemia associada a X (XLA) ou hipogamaglobulinemia da infância.
Noutros exemplos, a doença ou condição tratável com IG é uma doença de imunodeficiência adquirida secundária a doenças malignas hematológicas. A doença maligna hematológica pode ser seleccionada entre leucemia linfocitária crónica (CLL) , mieloma múltiplo (MM) e linfoma não Hodkin (NHL).
Nos casos em que a doença ou condição tratável com IG é uma doença inflamatória ou auto-imune, a doença inflamatória ou auto-imune pode ser seleccionada entre doença de Kawasaki, polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, síndrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, polimiosite, dermatomiosite, miosite de corpos de inclusão, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, neuropatia motora multifocal, miastenia gravis e síndrome de Moersch-Woltman.
Nalguns exemplos, a co-formulação é administrada para tratar uma infecção aguda bacteriana, virai ou fúngica, como seja, por exemplo, Haemophilus influenzae tipo B; Pseudomonas aeruginosa tipos A e B; Staphylococcus aureus; estreptococos do grupo B; Streptococcus pneumoniae tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 e 23; adenovirus tipos 2 e 5; citomegalovírus; virus de Epstein-Barr VCA; vírus da hepatite A; virus da hepatite B; virus herpes simples-1; virus herpes simples-2; gripe A; sarampo; parainfluenza tipos 1, 2 e 3; polio; virus da varicela zoster; Aspergillus; e Candida albicans.
Ainda, a doença ou condição tratável com IG pode ser seleccionada entre imunodeficiência iatrogénica; encefalomielite disseminada aguda; vasculite necrotizante sistémica ANCA-positiva; anemia hemolitica auto-imune; pen-figóide bolhoso; penfigóide cicatricial; sindrome de Evans (incluindo anemia hemolitica auto-imune com trombocitopenia imune); trombocitopenia alo-imune feto-maternal/neonatal (FMAIT/NAIT); sindrome hemofagocitico; transplante de células estaminais hematopoiéticas alogeneicas de risco elevado; neuropatia paraproteinémica de IgM; transplante renal; esclerose múltipla; ataxia opsoclonus mioclonus; pênfigo foliáceo; pênfigo vulgar; púrpura pós-transfusão; necrolise epidérmica tóxica/sindrome de Steven Johnson (TEM/SJS); sindrome do choque tóxico; Doença de Alzheimer; lupus sistémico eritematoso; mieloma múltiplo; sepsis; tumores das células B; degeneração cerebelar paraneoplásica sem anticorpos; e transplante de medula óssea. DESCRIÇÃO DETALHADA índice A. Definiçõess B. Co-formulações estáveis de imunoglobulina (IG) e hialuronidase 1. Terapia com imunoglobulina 2. Administração subcutânea de formulações de Imunoglobulina e Hialuronidase 3. Co-formulações estáveis C. Imunoglobulina e Preparação de Imunoglobulina 1. Preparação e Purificação a. Método de Cohn-Oncley b. Procedimentos de Cohn-Oncley modificados c. Processamento virai d. Concentração de proteinas
e. Exemplos de Preparações de IG
1. 10% IG ii. Preparações de concentração elevada de IG (e.g. 20% IG) 2. Estabilidade ao armazenamento
1. a. Excipientes estabilizadores de proteinas b. pH D. Hialuronidase 1. PH20 2. Hialuronidase solúvel a. PH20 humana solúvel b. PH20 humana solúvel recombinante (rHuPH20) 3. Glicosilação 4. Modificação de hialuronidases para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas E. Métodos de produção de ácidos nucleicos codificadores de uma Hialuronidase solúvel e seus polipéptidos 1. Vectores e Células 2. Expressão a. Células procarióticas b. Células de levedura c. Células de insecto d. Células de mamifero e. Plantas 3. Técnicas de purificação F. Preparação, Formulação e Administração de imunoglobulinas e polipéptidos solúveis de Hialuronidase 1. Formulações e Dosagens a. Imunoglobulina b. Hialuronidase c. Cloreto de sódio d. Aminoácidos estabilizadores e. Outros agentes 2. Formas de dosagem 3. Administração G. Métodos de avaliação da actividade, estailidade, biodisponibilidade e farmacocinética 1. Tamanho molecular 2. Actividade biológica a. Imunoglobulina b. Hialuronidase 1. Farmacocinética e tolerabilidade H. Métodos de tratamento e usos terapêuticos I. Imunodeficiência primária e secundária a. Imunodeficiência primária b. Imunodeficiência secundária 2. Doenças inflamatórias e auto-imunes a. Doença de Kawasaki b. Polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica c. Sindrome de Guillain-Barre d. Púrpura trombocitopénica idiopática e. Miopatias inflamatórias i. Dermatomiosite ii. Polimiosite iii. Miosite de corpos de inclusão f. Sindrome miasténico de Lambert-Eaton g. Neuropatia motora multifocal h. Mias tenia Gravis i. Sindrome de Moersch-Woltmann 3. Infecções agudas 4. Outras doenças e condições I. Artigos de produção e kits J. Exemplos
A. DEFINIÇÕES A menos que de outra forma seja definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado normalmente atribuído pelos familiarizados com a área da invenção. Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos de patentes publicados e publicações, sequências do GenBank, bases de dados, locais da rede e outros materiais publicados referidos ao longo da totalidade desta divulgação, a menos que de outra forma ser assinalado, são incorporados por referência na sua totalidade. No caso de existir uma pluralidade de definições para os termos usados, prevalecem os desta secção. Quando é feita referência a uma URL ou a outro identificador ou endereço, é entendido que tais identificadores podem mudar e informação particular na internet pode existir e deixar de existir, mas informação equivalente pode ser encontrada pesquisando na internet. As suas referências evidenciam a disponibilidade e disseminação pública de tal informação.
Como aqui usado, "imunoglobulina", "globulina imune", "gamaglobulina" referem-se a preparações de proteínas do plasma derivadas de lotes de plasma de dadores adultos. Os anticorpos IgG são predominantes; outras subclasses de anticorpos, tais como IgA e IgM estão presentes. Imunoglobulina terapêutica pode proporcionar imunização passiva através do aumento dos níveis séricos do recipiente de anticorpos circulantes. Os anticorpos IgG podem, por exemplo, ligar-se e neutralizar toxinas bacterianas; patogénios opsonizados; activar o complemento; e suprimir citocinas patogénicas e fagócitos através da interacção co citocinas e seus receptores, como seja CD5, interleucina-la (IL-la) , interlecuina 6 (IL-6), factor de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e receptores de células T. A imunoglobulina terapêutica pode inibir a actividade de autoanticorpos. Preparações de imunoglobulina também incluem, mas não lhes estão limitadas, imunoglobulina intravenosa (IGIV), imunoglobulina IV, imunoglobulina terapêutica. São conhecidas preparações de imunoglobulina e incluem nomes de marcas comerciais, tais como BayGam®, Gamimune® N, Gammagard® S/D, Gammar®-P, Iveegam® EN, Panglobulin®, Polygam® S/D, Sandoglobulin®, Venoglobulin®-I, Venoglobulin®-S, WinRho® SDF e outras. As preparações de imunoglobulina podem derivar de plasma humano ou serem produzidas por via recombinante.
Como aqui usado, "IgG intravenosa" ou tratamento com "IVIG" refere-se de um modo geral a um método terapêuticos de administração intravenosa de uma composição de imunoglobulinas IgG a um doente para o tratamento de uma série de condições tais como deficiências imunes, doenças inflamatórias e doenças auto-imunes. As imunoglobulinas IgG são tipicamente reunidas e preparadas a partir de plasma, podem ser usados anticorpos totais ou seus fragmentos.
Como aqui usado, doenças ou condições tratáveis com IG refere-se a qualquer doença ou condição para a qual são usadas preparações de imunoglobulinas. Tais doenças e condições incluem, mas não lhes estão limitadas, qualquer doença em que um aumento nos anticorpos circulantes é melhorada, como seja, por exemplo, imunodeficiência; hipo-gamaglobulinemia adquirida subsequente a doenças malignas hematológicas; doença de Kawasaki, polineuropatia desmieli-nizante inflamatória crónica (CIDP); síndrome de Guillain-Barre; púrpura trombocitopénica idiopática; miopatias inflamatórias; sindrome miasténico de Lambert-Eaton; neuropatia motora multifocal; mistenia gravis; síndrome de Moersch-Woltman; hipogamaglobulinemia secundária (incluindo imunodeficiência iatrogénica); deficiência de anticorpos específicos; encefalomielite disseminada aguda; vasculite necrotizante sistémica ANCA-positiva; anemia hemolítica auto-imune; penfigóide bolhoso; penfigóide cicatricial; síndrome de Evans (incluindo anemia hemolítica auto-imune com trombocitopenia imune); trombocitopenia aio-imune feto-maternal/neonatal (FMAIT/NAIT); síndrome hemofagocítico; transplante de células estaminais hematopoiéticas aloge-neicas de risco elevado; neuropatia paraproteinémica de IgM; transplante renal; esclerose múltipla; ataxia opsoclonus mioclonus; pênfigo foliáceo; pênfigo vulgar; púrpura pós-transfusão; necrolise epidérmica tóxica/síndrome de Steven Johnson (TEM/SJS); síndrome do choque tóxico; Doença de Alzheimer; lupus sistémico eritematoso; mieloma múltiplo; sepsis; tumores das células B; trauma; e infecção bacteriana, virai ou fúngica.
Como aqui usado, temperatura ambiente refere-se a uma gama geralmente entre cerca de 18°C e cerca de 32°C, inclusive. Os familiarizados com a técnica saberão que a temperatura ambiente varia de acordo com a localização e condições prevalecentes. Por exemplo, as temperaturas ambientes podem ser mais elevadas nos climas mais quentes como os de Itália ou Texas.
Como aqui usado, "estável" ou "estabilidade" cm referência a uma co-formulação aqui proporcionada refere-se a uma em que as proteínas (IG e hialuronidase) retenham essencialmente a sua estabilidade física e química e inteqridade quando do armazenamento durante pelo menos seis meses a temperaturas até 32°C. Para os presentes fins, "estabilidade à temperatura ambiente" siqnifica estabilidade na qama mais alta das temperaturas ambientes típicas para os locais mais quentes (i.e. 28-32°C para Itália ou
Texas) . As formulações são estáveis ao longo da gama das temperaturas de frigoríficos e ambientes, i.e. 0 - 32 °C, ou até 32 °C durante pelo menos seis meses. IG e hialuronidase apresentam individualmente estabilidade na co-formulação quando do armazenamento durante pelo menos seis meses à temperatura ambiente, incluindo temperaturas até cerca de 32°C, inclusive. Ensaios para avaliar a estabilidade de cada um deles são conhecidos dos familiarizados com a técnica e são aqui descritos.
Como aqui usado, estabilidade de IG significa que a IG não agrega, desnatura ou fragmenta substancialmente, de modo que pelo menos 90% da IG está presente como monómeros ou oligómeros/dímeros, com uma massa molecular de IG entre 70 kDa inclusive e menos de 450 kDa. Assim, menos de aproximadamente 10%, por exemplo, menos de aproxi-madamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, menos de aproximadamente 1% da proteína IG está presente como um agregado (i.e. possui uma massa molecular superior ou igual a 450 kDa) na formulação. De forma semelhante, não mais de 5 % a 7 %, por exemplo, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % ou 0,5 % ou menos da IG na co-formulação está fragmentada (i.e. possui uma massa molecular inferior a 70 kDa).
Como aqui usado, a estabilidade da hialuronidase significa que mantém pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais da actividade da hialuronidase original antes do armazenamento. Os ensaios para avaliar a actividade de hialuronidase são conhecidos dos familiarizados com a técnica e aqui descritos.
Como aqui usado, "armazenamento" significa que uma formulação não é administrada imediatamente a um indivíduo depois de preparada, mas é mantida durante um período de tempo em condições particulares (e.g. temperatura particular; forma líquida ou liofilizada) antes de usar. Por exemplo, uma formulação líquida pode ser mantida durante dias, semanas, meses ou anos, geralmente pelo menos seis meses, antes da administração a um indivíduo a várias temperaturas tais como temperatura de refrigeração (0o a 10°C) ou temperatura ambiente (e.g. temperatura até 32°C).
Como aqui usado, o regime de dosagem refere-se à quantidade de imunoglobulina administrada e à frequência de administração. O regime de dosagem é uma função da doença ou condição a ser tratada e assim pode variar.
Como aqui usado, "substancialmente o mesmo que um regime de dosagem de IG intravenosa (IVIG)" refere-se a um regime em que a dose e/ou frequência está dentro de uma quantidade que é eficaz para o tratamento de uma doença ou condição particular, tipicamente é cerca de 10%, inclusive, da dose IV ou frequência. Quantidades de IVIG que são eficazes para o tratamento de uma doença ou condição particular são conhecidas ou podem ser determinadas empiricamente pelos familiarizados com a técnica. Por exemplo, como exemplificado abaixo, 300 mg/kg (i.e. 21 gramas assumindo os pesos médios de adultos de 70 kgs) a 600 mg(kg (i.e. 42 gramas) é a dose mensal típica de IVIG administrada a doentes tendo doenças de imunodeficiência primária. Assim, IG, quando administrada em combinação com hialuronidase, é administrada subcutaneamente em doses de aproximadamente 300 mg/kg a 600 mg/kg inclusive para o tratamento de doenças de imunodeficiência primária.
Como aqui usado, a frequência de administração refere-se ao tempo entre doses sucessivas de imunoglobu-lina. Por exemplo, a frequência pode ser uma, duas, três, quatro semanas e é uma função da doença ou condição particular a ser tratada. De um modo geral, a frequência é pelo menos cada duas ou três semanas e tipicamente não mais de uma vez por mês.
Como aqui usado, hialuronidase refere-se a uma enzima que degrada o ácido hialurónico. As hialuronidases incluem hialuronidases bacterianas (EC 4.2.99.1), hialu- ronidases de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos (EC 3.2.1.36) e hialuronidases do tipo mamífero (EC 3.2.1.35). As hialuronidases também incluem qualquer uma de outra origem não humana incluindo, mas não lhes estando limitados, murina, canina, felina, leporina, aviária, bovina, ovina, porcina, equina, piscina, ranina, bacteriana e qualquer uma de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos. Exemplos de hialuronidases não humanas incluem, hialuronidases de vacas (SEQ ID NO:10 e 11), vespas amarelas (SEQ ID NOS: 12 e 13), abelhas (SEQ ID NO: 14), vespão de cabeça branca (SEQ ID N0:15), vespa do papel (SEQ ID N0:16), murganho (SEQ ID NOS:17-19, 32), porco (SEQ ID NOS: 20-21) , rato (SEQ ID NOS:22-24, 31), coelho (SEQ ID NO:25), carneiro (SEQ ID NO:26 and 27), orangotango (SEQ ID NO:28), macaco cinomólogo (SEQ ID NO:29), cobaio (SEQ ID NO:30), Staphylococcus aureus (SEQ ID NO:33), Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 34) e Clostridium perfringens (SEQ ID NO:35). As hialuronidases também incluem as de origem humana. Exemplos de hialuronidases humanas incluem HYAL1 (SEQ ID NO:36), HYAL2 (SEQ ID NO:37), HYAL3 (SEQ ID NO:38), HYAL4 (SEQ ID NO:39), e PH20 (SEQ ID NO:l). Nas hialuronidases também estão incluídas hialuronidases solúveis, incluindo PH20 ovina e bovina, PH20 humana solúvel e rHuPH20 solúvel. A referência a hialuronidases incluem polipépti-dos precursores de hialuronidase e polipéptidos de hialuronidase madura (como seja aquelas em que uma sequência sinal foi removida) , formas truncadas das mesmas que possuem actividade e inclui variantes alélicas e variantes de espécies, variantes codificadas por variantes de "splicing" e outras variantes, incluindo polipéptidos que possuem pelo menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequências com os polipéptidos precursores descritos em SEQ ID NOS: 1 e 10-39 ou a sua forma madura. Por exemplo, a referência a hialuronidase também inclui variantes do polipéptido precursor de PH20 humana descrito em SEQ ID NOS :50-51. As hialuronidases também incluem as que possuem modificações químicas ou pós-tradução e aquelas que não possuem modificações químicas ou pós-tradução. Tais modificações incluem, mas não lhes estão limitadas, peguilação, albuminação, glicosilação, farnisi-lação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação e outras modificações de polipéptidos conhecidas na técnica.
Como aqui usado, uma hialuronidase solúvel refe-re-se a um polipéptido caracterizado pela sua solubilidade em condições fisiológicas. De um modo geral, uma hialuronidase solúvel não possui a totalidade ou uma parte de uma âncora de glicof osf atidilo (GPI) ou que de outra forma não ancora suficientemente à membrana celular. Assim, quando da expressão por uma célula, uma hialuronidase solúvel é secretada para o meio. Hialuronidases solúveis podem ser distinguidas, por exemplo, pela sua partição na fase aquosa de uma solução de Triton X-114 aquecida a 37°C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). Hialuronidases ancoradas a membranas, como sejam as ancoradas por lípidos, surgirão na fase rica em detergente, mas surgirão na fase com pouco detergente ou na fase aquosa após tratamento com Fosfolipase C. Nas hialuronidases solúveis estão incluídas hialuronidases ancoradas à membrana em que uma ou mais regiões associadas à ancoragem da hialuronidase à membrana foi removida ou modificada, onde a forma solúvel mantém actividade de hialuronidase. Hialuronidases solúveis incluem hialuronidases solúveis recombinantes e as existentes nas fontes naturais ou purificadas a partir destas, tais como, por exemplo, extractos de testículo de ovinos ou bovinos. Exemplos de tais hialuronidases solúveis são PH20 humana solúvel. Outras hialuronidases solúveis incluem PH20 ovina (SEQ ID NO:27) e bovina (SEQ ID N0:11).
Como aqui usado, PH20 humana solúvel ou sHuPH20 inclui polipéptidos maduros sem a totalidade ou uma porção do local de ligação a glicosilfosfatidilinositol (GPI) no extremo C de modo que quando da expressão, os polipéptidos ssejam solúveis. Exemplos de polipéptidos sHuPH20 incluem polipéptidos maduros tendo uma sequência de aminoácidos descrita em qualquer uma de SEQ ID NOS :4-9 e 47-48. Os polipéptidos precursores para exemplos de tais polipéptidos sHuPH20 incluem uma sequência sinal. São exemplos de precursores os descritos em SEQ ID NOS: 3 e 40-46, cada um deles possui uma sequência sinal de 35 aminoácidos nas posições de aminoácidos 1-35. Polipéptidos solúveis HuPH20 também incluem os degradados durante ou após os métodos de produção e purificação aqui descritos.
Como aqui usado, PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20) refere-se a uma forma solúvel de PH20 humana que é expresso por via recombinante expresso em células de ovários de hamster chinês (CH) . rHuPH20 solúvel é codificado por ácido nucleico que inclui a sequência sinal e está descrito em SEQ ID NO:49. São também incluídas moléculas de DNS que são variantes alélicas das mesmas e outras variantes solúveis. 0 ácido nucleico codificador de rHuPH20 solúvel é expresso em células CHO que secretam o polipéptido maduro. Tal como produzido no meio de cultura, existe heteroqeneidade no extremo C de modo que o produto inclui uma mistura de espécies que podem incluir qualquer uma ou mais de SEQ ID NOS :4-9 em abundância variável. As variantes alélicas correspondentes e outras variantes também são incluídas, incluindo as correspondentes aos polipéptidos precursores de PH20 humano descrito em SEQ ID NOS:50-51. Outras variantes podem ter 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOS :4-9 e 47-48 desde que mantenham uma actividade de hialuronidase e sejam solúveis.
Como aqui usado, a actividade refere-se a uma actividade ou actividades funcionais ou porções do mesmo associado a uma proteína de tamanho completo. Actividades funcionais incluem, mas não lhes estão limitadas, actividade biológica, actividade catalítica ou enzimática, antigenicidade (capacidade para se ligar ou competir com um polipéptido para ligação a um anticorpo anti-polipéptido) , imunogenicidade, capacidade para formar multímeros e a capacidade para se ligar especificamente a um receptor ou ligando do polipéptido.
Como aqui usado, a actividade hialuronidase refere-se à capacidade da hialuronidase para cortar o ácido hialurónico. Os ensaios in vitro para determinar a actividade de hialuronidase das hialuronidases, como sejam rHuPH20 solúvel, são conhecidos na técnica e aqui descritos. Exemplos de ensaios incluem o ensaio de microturbidez descrito abaixo (ver e.g. Exemplo 3) que mede indirecta-mente a clivagem do ácido hialurónico pela hialuronidase através da detecção do precipitado insolúvel formado quando o ácido hialurónico não cortado se liga a albumina sérica.
Como aqui usado, o termo "ultrafiltração (UF) " inclui uma variedade de métodos de filtração com membrana em que a pressão hidrostática força um liquido contra uma membrana semi-permeável. Os sólidos suspensos e solutos de peso molecular elevado são retidos, enquanto a água e os solutos de massa molecular baixa passam através da membrana. Este processo de separação é frequentemente usado para a purificar e concentrar soluções macromoleculares (ΙΟ3—106 Da), especialmente soluções de proteínas. Existe uma série de membranas de ultrafiltração dependendo do tamanho das moléculas que retêm. A ultrafiltração é tipicamente caracterizada por um tamanho do poro da membrana entre e 1000 kDa e pressões entre 0,01 e 10 bar e é particularmente útil para a separação de proteínas tipo colóides das moléculas pequenas tipo açúcares e sais.
Como aqui usado, o termo "diafiltração" é usado com as mesmas membranas da ultrafiltração e é uma filtração de fluxo tanqencial. Durante a diafiltração, o tampão é introduzido no tanque de reciclagem enquanto o filtrado é removido da unidade de operação. Nos processo em que o produto está no retentato (por exemplo IgG), a diafiltração remove componentes do produto para o filtrado, trocando assim tampões e reduzindo a concentração de espécies indesej áveis.
Como aqui usado, o termo "mistura" descreve um acto que provoca distribuição equitativa de dois ou mais compostos ou substâncias distintas, numa solução ou suspensão, através de qualquer forma de agitação. A total distribuição equitativa de todos os ingredientes numa solução ou suspensão não é necessária como resultado da "mistura" tal como o termo é usado neste pedido de patente.
Como aqui usado, o termo "solvente" inclui qualquer substância líquida capaz de dissolver ou dispersar uma ou mais substâncias. Um solvente pode ter natureza inorgânica, como seja água, ou pode ser um líquido orgânico, como seja etanol, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, hexano, éter de petróleo, etc. Como usdo no termo "tratamento com detergente solvente", solvente significa um solvente orgânico (e.g., tri-N-butilfosfato), que é parte da mistura de detergente solvente usado para inactivar vírus com invólucro lipídico em solução.
Como aqui usado, o termo "detergente" é usado neste pedido de patente indistintamente com o termo "tensioactivo" ou "agente actuante na superfície". Os tensioactivos são tipicamente compostos orgânicos que são anfifílicos, i.e., contendo grupos hidrofóbicos ("caudas") e grupos hidrofílicos ("cabeças"), que tornam os tensioactivos solúveis em solventes orgânicos e água. Um tensioactivo pode ser classificado pela presença de grupos formalmente carregados na sua cabeça. Um tensioactivo não iónico não possui grupos com carga na sua cabeça, enquanto um tensioactibo iónico possui uma carga global na sua cabeça. Um tensioactivo zuiteriónico possui uma cabeça com dois grupos com carga oposta. Alguns exemplos de tensioactivos comuns incluem: aniónicos (baseados em iões sulfato, sulfonato ou carboxilato): perfluorooctanoato (PFOA ou PFO) , perfluorooctanossulfonato (PFOS), dodecilsulfato de sódio (SDS), laurilsulfato de amónio e outros sais de alquilsulfato, lauretossulfato de sódio (também conhecido como sulfato do éter de laurilo sódico ou SLES), benzenos-sulfonato de alquilo; catiónico (baseado em catioes de amónio quaternário): brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) a.k.a. brometo de hexadeciltrimetilamónio e outros sais de alquiltrimetilamónio, cloreto de cetilpiridínio (CPC), amina de sebo polietoxilado (POEA), cloreto de benzalcónio (BAC), cloreto de benzetónio (BZT); zuiteriónico (anfo-térico): dodecilbetaína; cocamidopropilbetaína; coco-anfo- glicinato; noniónico: alquil-poli(óxido de etileno), al-quilfenol poli(óxido de etileno), copolímeros de poli(óxido de etileno) e poli(óxido de propileno) (comercialmente conhecidos como Poloxâmeros ou Poloxaminas), alquilpoliglu-cósidos, incluindo octilglucósido, decilmaltósido, álcoois gordos (e.g., álcool cetilico e álcool oleilico), cocamida MEA, cocamida DEA, polissorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes de Triton, e óxido de dodecildi-metilamina.
Como aqui usados, os resíduos de a-aminoácidos naturais são os resíduos dos 20 α-aminoácidos encntrados na natureza que são incorporados na proteína através do reconhecimento específico da molécula de tRNA carregada com o seu codão de mRNA cognato em humanos.
Como aqui usado, ácidos nucleicos incluem DNA, RNA e seus análogos, incluindo ácido péptido nucleico (PNA) e misturas dos mesmos. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou dupla. Quando da referência a sondas ou sequências iniciadoras, as quais são facultativamente marcadas, como seja com uma marca detectável, como sejam fluorescentes ou marcadas radioactivamente, são consideradas moléculas de cadeia simples. Tais moléculas são tipicamente de um comprimento tal que o seu alvo é estatisticamente único ou de baixo número de cópias (tipicamente menos de 5, geralmente menos de 3) para testar ou iniciar uma biblioteca. De um modo geral, uma sonda ou sequência iniciadora possui pelo menos 14, 16 ou 30 nucleótidos contíguos de sequência complementar do gene de interesse ou idêntica a ele. As sondas e sequências iniciadoras podem ter 10, 20, 30, 50, 100 ou mais nucleótidos de comprimento.
Como aqui usado, um péptido refere-se a um poli-péptido que tem entre 2 e 40 aminoácidos de comprimento.
Como aqui usado, os aminoácidos que ocorrem nas várias sequências de aminoácidos aqui proporcionadas são identificados de acordo com as suas abreviaturas conhecidas de três letras ou de uma letra (Tabela 1) . Os nucleótidos que ocorrem nos vários fragmentos de ácido nucleico são designados com as designações convencionais de letras simples usadas de rotina na técnica.
Como aqui usado, um "aminoácido" é um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo de ácdio carboxílico. Um polipéptido possui dois ou mais aminoácidos. Para fins desta invenção, os aminoácidos incluem os vinte aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais e análogos de aminoácidos (i.e., aminoácidos em que o carbono α possui uma cadeia lateral).
Como aqui usado, "resíduo de aminoácido" refere-se a um aminoácido formado quando da digestão química (hidrólise) de um polipéptido nas suas ligações peptídicas. Presume-se que os resíduos de aminoácidos aqui descritos estejam na forma isomérica "L". Os resíduos na forma isomérica "D", os quais são assim designados, podem substituir por qualquer resíduo de L-aminoácidos desde que a propriedade funcional pretendida seja mantida pelo polipéptido. NH2 refere-se ao qrupo amino livre presente no extremo amino de um polipéptido. COOH refere-se ao qrupo carboxilo livre presente no extremo carboxilo de um polipéptido. Ao usar-se a nomenclatura convencional de polipéptidos descrita em J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), e adoptado 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, as abreviaturas de resíduos de aminoácidos estão mostradas na
Tabela 1 - Tabela de correspondências
(continuação)
Deverá notar-se que todas as sequências de resíduos de aminoácidos aqui representadas pela fórmula possuem uma orientação da esquerda para a direita na direcção convencional do extremo amina para o extremo carboxilo. Ainda, a frase "resíduo de aminoácidos" é definida em sentido lato para incluir os aminoácidos listados na Tabela de Correspondência (Tabela 1) e aminoácidos modificados e invulqares, como os referidos em 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e aqui incluído como referência. Ainda, deverá notar-se que um hífen no início ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação peptídica a uma outra sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos, a um grupo terminal amino como seja NH2 ou a um grupo terminal carboxilo como seja COOH.
Como aqui usado, "aminoácidos naturais" refere-se aos 20 L-aminoácidos que ocorrem em polipéptidos.
Como aqui usado, "aminoácido não natural" refere-se a um composto orgânico que possui uma estrutura semelhante a um aminoácido natural mas foi modificado estruturalmente para simular a estrutura e reactividade de um aminoácido natural. Os aminoácidos não naturais incluem assim, por exemplo, aminoácidos ou análogos de aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos naturais e incluem, mas não lhes estão limitados, os D-isosterómeros de aminoácidos. Exemplos de aminoácidos não naturais estão aqui descritos e são conhecidos dos familiarizados com a técnica.
Como aqui usado, uma mistura isocinética é uma em que as proporções molares de aminoácidos foram ajustadas com base nas suas velocidades de reacção descritas (ver, e.g., Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34:1681).
Como aqui usado, modificação é como referência a modificação de uma sequência de aminoácidos de um poli-péptido ou uma sequência de nucleótidos numa molécula de ácido nucleico e inclui deleções, inserções e substituições de aminoácidos e nucleótidos, respectivamente. Métodos de modificação de um polipéptido são usados de rotina pelos familiarizados com a técnica, como seja através da utilização de metodologias de DNA recombinante.
Como aqui usado, substituições de aminoácidos conservadas adequadas são conhecidas pelos familiarizados com esta técnica e podem ser feitas, de um modo geral, sem alterar a actividade biológica da molécula resultante. Os familiarizados com esta técnica reconhecem que, em geral, substituições de aminoácidos isolados em regiões não essenciais de um polipéptido não alteram substancialmente a actividade biológica (ver, e.g., Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benja-min/Cummings Pub. co., p.224). Tais substituições podem ser feitas de acordo com o estabelecido na TABELA IA como se segue:
TABELA IA
Outras substituições são também permitidas e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com substituições conservadas conhecidas.
Como aqui usado, uma construção de DNA é uma molécula de DNA de cadeia simples ou dupla, linear ou circular, que possui segmentos de DNA combinados e justapostos de forma não encontrada na natureza. As construções de DNA existem como resultado de manipulação humana e incluem clones e outras cópias de moléculas manipuladas.
Como aqui usado, um segmento de DNA é uma orção de uma molécula de DNA maior tendo atributos especificados. Por exemplo, um segmento de DNA codificador de um polipéptido especificado é uma porção de uma molécula de DNA mais longa, como seja plasmídeo ou fragmento de plas-mídeo, que quando lida na direcção de 5' para 3', codifica a sequência de aminoácidos do polipéptido especificado.
Como aqui usado, o termo polinucleótido significa um polímero de cadeia simples ou dupla de bases de desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos lidos de 5' para 3'. Os polinucleótidos incluem RNA e DNA, e podem ser isolados a partir de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. 0 comprimento de uma molécula de polinucleótido é aqui dado em termos de nucleótidos (abreviado "nt") ou pares de bases (abreviado "pb"). 0 termo nucleótidos é usado para moléculas de cadeia simples e dupla quando o contexto o permite. Quando o termo é aplicado a moléculas de cadeia dupla é usado para significar comprimento total e será entendido como equivalente ao termo pares de bases. Será reconhecido pelos familiarizados com a técnica que as duas cadeias de um polinucleótido de cadeia dupla podem diferir ligeiramente de comprimento e cujos extremos podem ser de cadeia simples; assim todos os nucleótidos dentro de uma molécula de polinucleótido de cadeia dupla podem não estar emparelhados. Tais extremos não desemparelhados, em geral, não excederão 20 nucleótidos de comprimento.
Como aqui usado, "similaridade" entre duas proteínas ou dois ácidos nucleicos refere-se à relação entre a sequência de aminoácidos da proteína ou das sequências de nucleótidos dos ácidos nucleicos. A similaridade pode ser baseada no grau de identidade e/ou homologia das sequências de resíduos e dos resíduos contidos. Métodos para avaliação do grau de similaridade entre proteínas ou ácidos nucleicos são conhecidas dos familiarizados com a técnica. Por exemplo, num método de avaliação da similaridade de sequências, duas sequências de aminoácidos ou de nucleótidos são alinhadas de modo a dar um nível máximo de identidade entre as sequências. "Identidade" refere-se ao grau de invariância das sequências de aminoácidos ou de nucleótidos. O alinhamento das sequências de aminoácidos e, até certo ponto, das sequências nucleotídicas, também pode ter em consideração as diferenças conservadas e/ou substituições infrequentes em aminoácidos (ou nucleótidos). As diferenças conservadas são as que preservam as propriedades fisicoquimicas dos resíduos envolvidos. Os alinhamentos podem ser globais (alinhamento das sequências comparadas ao longo de todo o comprimento das sequências e incluindo todos os resíduos) ou local (o alinhamento de uma porção das sequências que inclui apenas a região ou regiões mais similares). "Identidade" per se possui um significado reconhecido na técnica e pode ser calculada usando técnicas publicadas. (Ver, e.g. : Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Ao mesmo tempo que existe uma série de métodos para medir a identidade entre dois polinucleótidos ou polipéptidos, o termo "identidade" é bem conhecido dos familiarizados com a matéria (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
Como aqui usado, homólogo (relativamente às sequências de ácido nucleico e/ou aminoácido) significa maior ou igual 25% de homologia de sequências, tipicamente superior ou igual a 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homologia de sequências; a percentagem precisa pode ser especificada se necessário. Para fins da presente invenção, os termos "homologia" e "identidade" são frequentemente usados indistintamente, a menos que de outra forma seja indicado. Em geral, para determinação da percentagem de homologia ou identidade, as sequências são alinhadas de modo que a correspondência mais elevada seja obtida (ver, e.g., Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073).Através da homologia de sequências, o número de aminoácidos conservados é determinado com programas de algoritmos de alinhamentos convencionais e pode ser usado com penalizações de intervalos por defeito estabelecidas por cada fornecedor. Moléculas de ácido nucleico substancialmente homólogas hibridarão tipicamente com restringência moderada ou com elevada restringência ao longo do comprimento do ácido nucleico de interesse. São igualmente contempladas moléculas de ácido nucleico que possuem codões degenerados no lugar de codões na molécula de ácido nucleico hibridante.
Se quaisquer duas moléculas possuem sequências de nucleótidos ou de aminoácidos que são pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% "idênticas" ou "homólogas" pode ser determinado usando algoritmos informáticos conhecidos, tais como o programa "FASTA", usando, por exemplo, os parâmetros por defeito como em Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 (outros programas incluem o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, e Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a função BLAST da base de dados do National Center for Biotechnology Information pode ser usada para determinar identidade. Outros programas comercializados ou acessíveis ao público incluem, o programa DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) e o programa "Gap" da University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison WI). A percentagem de homologia ou de indentidade de moléculas de proteína e/ou ácido nucleico pode ser determinada, por exemplo, através de comparação da informação das sequências usando um programa informático GAP (e.g., Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, conforme revisto por Smith and Waterman ((1981) Adv. Appl. Match. 2:482). Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (i.e., nucleótidos ou aminoácidos), que são semelhantes, divididos pelo número total de símbolos na mais curta das duas sequências. Os parâmetros por defeito para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e de 0 para não identidades) e a matriz de comparação pesada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, como descrito por Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) uma penalização de 3,0 para cada intervalo e mais uma penalização de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo; e (3) sem penalizações para od intervalos dos extremos.
Assim, como aqui usado, o termo "identidade" ou "homologia" representa uma comparação entre um polipéptido ou polinucleótido teste e uma referência. Como aqui usado, o termo pelo menos "90% idêntico a" refere-se a percentagens de identidade entre 90 e 99,99 relativamente à sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos de referência do polipéptido. Identidade a um nível de 90% ou superior é indicativo do facto de, assumindo para fins de exemplificação a comparação de um comprimento de polipéptido teste e referência de 100 aminoácidos, não mais de 10% (i.e., 10 em 100) dos aminoácidos no polipéptido teste difere do polipéptido de referência. Comparações semelhantes podem ser feitas entre polinucleótidos este e referência. Tais diferenças podem ser representadas como mutações pontuais aleatoriamente distribuídas ao longo de todo comprimento de um polipéptido ou podem estar agrupadas numa ou mais localizações de comprimento variável até um máximo permitido, e.g. 10/100 de diferença de aminoácidos (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças são definidas como substituições, inserções ou deleções de nucleótidos ou aminoácidos. Ao nivel de homologias ou identidades acima de 85-90%, o resultado deverá ser independente do programa e parâmetros de intervalo estabelecidos; tais níveis elevados de identidade podem ser avaliados facilmente, frequentemente através do alinhamento manual sem ser baseado no programa informático.
Como aqui usado, uma sequência alinhada refere-se ao uso de homologia (similaridade e/ou identidade) para alinhar as posições correspondentes numa sequência de nucleótidos ou aminoácidos. Tipicamente, são alinhadas duas ou mais sequências que estão relacionadas em 50% ou mais de identidade. Uma série de sequências alinhadas refere-se a 2 ou mais sequências que são alinhadas nas posições correspondentes e pode incluir alinhamento de sequências derivadas de RNAs, tais como ESTs e outros cDNAs, alinhadas com a sequência de DNA genómico.
Como aqui usado, "sequência iniciadora" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que pode actuar como um ponto de iniciação da síntese de DNA dirigida por matriz em condições adequadas (e.g., na presença de quatro trifos-fatos de nucleósido diferentes e um agente de poli-merização, como seja DNA polimerase, RNA polimerase ou transcriptase reversa) num tampão adequado e a uma temperatura adequada. Será apreciado que uma determinada molécula de ácido nucleico pode servir como uma "sonda" e como uma "sequência iniciadora". No entanto, uma sequência iniciadora, possui um grupo hidroxilo 3' para extensão. Uma sequência iniciadora pode ser usada numa variedade de métodos, incluindo, por exemplo, a reacção em cadeia da polimerase (PCR), transcriptase reversa (RT)-PCR, RNA, PCR, LCR, PCR multiplex, PCR com estruturas cabo de frigideira ("panhandle"), PCR de captura, PCR de expressão, RACE 3' e 5', PCR in situ, PCR mediado por ligação e outros protocolos de amplificação.
Como aqui usado, "par de sequências iniciadoras" refere-se a uma série de sequências iniciadoras que inclui uma sequência iniciadora 5' (a montante) que híbrida com o extremo 5' de uma sequência a ser amplificada (e.g. por PCR) e uma sequência iniciadora 3' (a jusante) que hibrida com o complemento do extremo 3' da sequência a ser amplificada .
Como aqui usado, "hibrida especificamente" refe-re-se a emparelhamento, através de emparelhamento de bases complementares, de uma molécula de ácido nucleico (e.g. um oligonucleótido) com uma molécula de ácido nucleico alvo. Os familiarizados com a técnica estão familiarizados com os parâmetros in vitro e in vivo que afectam a hibridação específica, como seja comprimento e composição da molécula particular. Os parâmetros particularmente relevantes para a hibridação in vitro incluem temperatura de emparelhamento e lavagem, composição do tempo e concentração de sal.
Exemplos de condições de lavagem para remoção de moléculas de ácido nucleico ligadas inespecificamente a elevada restringência são 0,1 x SSPE, 0,1% SDS, 65°C, e restringência média são 0,2 x SSPE, 0,1% SDS, 50°C. Condições de restringência equivalentes são conhecidas na técnica. Os familiarizados com a técnica podem facilmente justar estes parâmetros para conseguir hibridação especifica de uma molécula de ácido nucleico com uma molécula de ácido nucleico alvo adequada para uma aplicação particular. Complementar, quando se refere a duas sequências de nucleótidos, significa que as duas sequências de nucleótidos são capazes de hibridar, tipicamente com menos de 25%, 15% ou 5% de desemparelhamentos entre nucleótidos opostos. Se necessário, as duas moléculas são seleccionadas de modo a hibridarem em condições de restringência elevada.
Como aqui usado, substancialmente idêntico a um produto significa suficientemente semelhante de modo que a propriedade de interesse é suficientemente inalterada para que o produto substancialmente idêntico possa ser usado em vez do produto.
Como aqui usado, é igualmente compreendido que os termos "substancialmente idêntico" ou "similar" varia com o contexto como entendido pelos familiarizados com a técnica relevante.
Como aqui usado, uma variante alélica ou variação alélica faz referência a quaisquer duas ou mais alternativas de um gene ocupando o mesmo locus cromossómico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo fenotípico dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (sem alteração no polipéptido codificado) ou podem codificar polipéptidos tendo sequência de aminoácidos alterada. 0 termo "variante alélica" também é usado aqui para significar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. Tipicamente, a forma de referência de um gene codifica uma forma selvagem e/ou forma predominante de um polipéptido de entre uma população ou membro de referência simples de uma espécie. Tipicamente, as variantes alélicas, que incluem variantes entre espécies e dentro de uma espécie, tipicamente possuem pelo menos 80%, 90% ou mais de identidade de aminoácidos com uma forma selvagem e/ou predominante da mesma espécie; o grau de identidade depende do gene e se a comparação é entre espécies ou intraspécie. De um modo geral, as variantes alélicas intraspécies possuem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ou superior com uma forma selvagem e/ou predominante, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com uma forma selvagem e/ou predominante de um polipéptido. Referência a uma variante alélica aqui refere-se genericamente a variações nas proteínas entre os membros da mesma espécie.
Como aqui usado, "alelo" que aqui é usado indistintamente com "variante alélica" refere-se a formas alternativas de um gene ou porções do mesmo. Quando um indivíduo possui dois alelos idênticos de um gene, o indivíduo é referido como homozigótico para esse gebe ou alelo. Quando um indivíduo possui dois alelos diferentes de um gene, o indivíduo é referido como sendo heterozigótico para o gene. Os alelos de um gene específico podem diferir um do outro num único nucleótido ou em vários nucleótidos e podem incluir substituições, deleções e inserções de nucleótidos. Um alelo de um gene ode também ser uma forma de um gene contendo uma mutação.
Como aqui usado, variantes de espécies refere-se a variantes em polipéptidos entre diferentes espécies, incluindo espécies de mamíferos diferentes, tais como murganho e humano.
Como aqui usado, uma variante de "splicing" refere-se a uma variante produzida através de processamento diferencial de um transcrito primário de DNA genómico que resulta em mais de um tipo de mRNA.
Como aqui usado, o termo promotor significa uma porção de um gene contendo sequências de DNA que proporcionam a ligação da RNA polimerase e iniciação da transcrição. As sequências de promotor são cnormalmente, mas nem sempre, encontradas na região não codificadora 5' dos genes.
Como aqui usado, polipéptido ou proteína ou porção biologicamente active da mesma isolada ou purificada está substancialmente livre de material celular ou de outras proteínas contaminantes da célula ou tecido de onde a proteína deriva, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros compostos químicos quando quimicamente sintetizados. Pode-se determinar que as preparações estão substancialmente livres de impurezas se surgirem livres de impurezas facilmente detectáveis conforme determinado por métodos convencionais de análise, tais como cromatografia em camada fina (TLC), electroforese em gel e cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), usado pelos familiarizados com a técnica para avaliar tal pureza, ou suficientemente puras de modo que purificação subsequente não vai alterar de forma detectável as propriedades físicas e químicas, tais como actividades enzimáticas e biológicas, da substância. Métodos de purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente quimicamente puros são conhecidos dos familiarizados com a técnica. Um composto substancialmente quimicamente puro, no entanto, pode ser uma mistura de estereoisómeros. Nesses casos, purificação posterior deverá aumentar a actividade específica do composto. 0 termo substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas em que a proteína é separada dos componentes celulares das células de onde são isoladas ou produzidas via recombinante. Numa realização, o termo substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas enzimáticas tendo menos que cerca de 30% (por peso seco) de proteínas não enzimáticas (também referido aqui como uma proteína contaminante) , de um modo geral inferior a 20% de proteínas não enzimáticas ou 10% de proteínas não enzimáticas ou menos de cerca de 5% de proteínas não enzimáticas. Quando a proteína enzimática é produzida por via recombinante, está também substancialmente livre de meio de cultura, í.e. o meio de cultura representa menos de aproximadamente 20%, 10% ou 5%, inclusive, do volume da preparação de proteína enzimática.
Como aqui usado, o termo substancialmente livre de precursores químicos ou de outros compostos químicos inclui preparações de proteínas enzimáticas em que a proteína é separada dos precursores químicos ou de outros compostos químicos que estejam envolvidos na síntese da proteína. O termo inclui preparações das proteínas enzimáticas tendo menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% ou menos (por peso seco) de precursores químicos ou compostos químicos ou componentes não enzimáticos.
Como aqui usado, sintético, referindo-se, por exemplo, a uma molécula de ácido nucleico sintético ou um gene sintético ou um péptido sintético significa uma molécula de ácido nucleico ou uma molécula de péptido que é produzida por métodos recombinantes e/ou por métodos de síntese química.
Como aqui usado, a produção por meios recombinantes através da utilização de métodos de DNA recombinante significa o uso de métodos bem conhecidos de biologia molecular para a expressão de proteínas codificadas pelo DNA clonado.
Como aqui usado, vector (ou plasmídeo) refere-se a elementos discretos que são usados para introduzir um ácido nucleico heterólogo nas células para a sua expressão ou replicação. Os vectores tipicamente permanecem como epissomas, mas podem ser desenhados para efectuar a integração de um gene ou porção do mesmo num cromossoma do genoma. São igualmente contemplados vectores que sejam cromossomas artificiais, tais como cromossomas artificiais de levedura e cromossomas artificiais de mamífero. A selecção e uso de tais veículos são bem conhecidos dos familiarizados com a técnica.
Como aqui usado, um vector de expressão inclui vectores capazes de expressar DNNA que está operacionalmente ligado a sequências reguladoras, tais como regiões de promotor, que são capazes de efectuar a expressão de tais fragmentos de DNA. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências de promotor e terminador, e facultativamente pode incluir uma ou mais origens de replicação, uma ou mais marcas de selecção, um estimulador, um sinal de poliadenlação e similares. Os vectores de expressão são, de um modo geral, derivados de plasmídeo ou DNA virai, ou podem conter ambos os elementos. Assim, o vector de expressão refere-se a uma construção de DNA ou RNA recombinante, como seja um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vector que, quando da introdução numa célula hospedeira adequada, resulta na expressão do DNA clonado. Vectores de expressão adequados são conhecidos dos familiarizados com a técnica e incluem os que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e os que são mantidos como epissoma ou os que se inteqram no genoma da célula hospedeira.
Como aqui usado, vector inclui "vectores de virus" ou "vectores virais". Os vectores virais são virus manipulados que são operacionalmente ligados a genes exógenos para transferir (como veículos ou vaivéns) os genes exógenos para células.
Como aqui usado, operacionalmente ou operativamente ligado quando se referindo a segmentos de DNA significa que os segmentos estão arranjados de modo que funcionam concertadamente para os fins pretendidos, e.g., a transcrição inicia-se no promotor e prossegue através do segmento codificador até ao terminador.
Como aqui usado, o termo avaliação destina-se a incluir a determinação quantitativa e qualitativa no sentido de obter um valor absoluto para a actividade de uma proteína, como seja uma enzima ou protease, ou um seu domínio, presente na amostra, e também obtenção de um índice, proporção, percentagem, visualização ou outro valor indicativo do nível da actividade. A avaliação pode ser directa ou indirecta e a espécie química detectadas não necessitam de ser o produto final de uma reacção, como seja o próprio produto de proteólise, mas pode, por exemplo, ser um derivado do mesmo ou outra substância. Por exemplo, a avaliação pode ser a detecção de um produto de clivagem de uma proteína, como seja por SDS-PAGE e coloração das proteínas com azul Coomassie.
Como aqui usado, actividade biológica refere-se às actividades in vivo de um composto ou resposta fisiológicas que resultam quando da administração in vivo de um composto, composição ou outra mistura. A actividade biológica, inclui assim efeitos terapêuticos e actividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. As actividades biológicas podem ser observadas nos sistemas in vitro destinados a testar ou usar tais actividades. Assim, para os fins da presente invenção uma actividade biológica de uma protease é a sua actividade catalítica em que um polipéptido é hidrolisado.
Como aqui usado, equivalente quando se referindo a duas sequências de ácidos nucleicos significa que as duas sequências em questão codificam a mesma sequência de aminoácidos ou proteínas equivalentes. Quando equivalente é usado referindo-se a duas proteínas ou péptidos, significa que as duas proteínas ou péptidos possuem substancialmente a mesma sequência de aminoácidos com apenas substituições de aminoácidos que não alteram substancialmente a actividade ou função da proteína ou péptido. Quando equivalente se refere a uma propriedade, a propriedade não necessita de estar presente no mesmo nível (e.g., dois péptidos podem apresentar diferentes proporções do mesmo tipo de actividade enzimática) , mas as actividades são geralmente substancialmente as mesmas.
Como aqui usado, "modular" e "modulação" ou "alterar" refere-se a uma alteração de uma actividade de uma molécula, como seja uma proteína. Exemplos de actividades incluem, mas não lhes estão limitados, actividades biológicas, tais como transdução de sinal. A modulação pode incluir um aumento da actividade (í.e. regulação positiva ou actividade agonista), um decréscimo de actividade (í.e., regulação negativa ou inibição) ou qualquer outra alteração numa actividade (como seja uma alteração na periodicidade, frequência, duração, cinética ou outro parâmetro). A modulação pode ser dependente do contexto e tipicamente a modulação é comparada com um determinado estado, por exemplo, a proteína selvagem, a proteína num estado constitutivo ou a proteína como expressa num determinado tipo celular ou condição.
Como aqui usado, uma composição refere-se a qualquer mistura. Pode ser uma solução, suspensão, líquido, pó, pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação da mesma.
Como aqui usado, uma combinação refere-se a qualquer associação entre ou no seio de dois ou mais itens. A combinação pode ser de dois ou mais itens separados, tais como duas composições ou duas colecções, pode ser uma mistura dos mesmos, como seja uma mistura simples dos dois ou mais itens, ou qualquer variação dos mesmos. Os elementos de uma combinação estão, de um modo geral, funcionalmente associados ou relacionados.
Como aqui usado, um kit é uma combinação embalada que facultativamente inclui outros elementos, tais como reagentes adicionais e instruções para uso da combinação ou seus elementos.
Como aqui usado, "doença ou distúrbio" refere-se a uma condição patológica num organismo resultante de uma causa ou condição incluindo mas não lhes estando limitados, infecções, condições adquiridas, condições genéticas e caracterizadas por sintomas não identificáveis. Doenças ou distúrbios de interesse são aqui os que são tratáveis por imunoglobulina.
Como aqui usado, "tratamento" de um indivíduo com uma doença ou condição significa que os sintomas do indivíduo são parcialmente ou totalmente aliviados ou permanecem estabilizados após tratamento. Assim, o tratamento inclui profilaxia, terapia e/ou cura.
Profilaxia refere-se à prevenção de uma potencial doença e/ou prevenção do aumento dos sintomas ou progressão de uma doença. Tratamento também inclui qualquer uso farmacêutico de uma preparação de imunoglobulina e composições aqui proporcionadas.
Como aqui usado, um agente eficaz em termos farmacêuticos, inclui qualquer agente terapêutico ou agentes bioactivos, incluindo, mas não lhes estando limitados, por exemplo, anestésicos, vasoconstritores, agentes de dispersão, fármacos terapêuticos convencionais, incluindo pequenas moléculas fármacos e proteinas terapêuticas.
Como aqui usado, tratamento significa quaisquer meios através dos quais os sintomas de uma condição, distúrbio ou doença ou outra indicação, sejam melhorados ou de outra forma beneficamente alterados.
Como aqui usado, efeito terapêutico significa um efeito que resulta do tratamento de um indivíduo ou que altera, tipicamente melhora ou reduz os sintomas de uma doença ou condição ou que cura uma doença ou condição. Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade de uma composição, molécula ou composto que resulta num efeito terapêutico após administração a um indivíduo.
Como aqui usado, o termo "indivíduo" refere-se a um animal, incluindo um mamífero, como seja um ser humano.
Como aqui usado, um doente refere-se a um indivíduo humano.
Como aqui usado, melhoria dos sintomas de uma doença ou distúrbio particular, como seja através da administração de uma composição farmacêutica ou de outro fármaco, refere-se a qualquer redução, permanente ou temporária, duradoira ou transitória, dos sintomas que podem ser atribuídos ou associados com a administração da composição ou fármaco.
Como aqui usado, prevenção ou profilaxia refere-se a métodos em que o risco de desenvolvimento de doença ou condição é reduzido.
Como aqui usado, uma "quantidade eficaz em termos terapêuticos" ou uma "dose eficaz em termos terapêuticos" refere-se à quantidade de um agente, composto, material ou composição contendo um composto que é pelo menos suficiente para produzir um efeito terapêutico. Assim, é a quantidade necessária para a prevenção, cura, melhoria, paragem ou paragem parcial de um sintoma de uma doença ou distúrbio.
Como aqui usado, forma unitária de dosagem refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas para indivíduos humanos e animais e embalados individualmente como é conhecido na técnica.
Como aqui usado, uma formulação de dosagem simples refere-se à formulação para administração directa.
Como aqui usado, um "artigo de manufactura" é um produto que é feito e vendido. Como usado ao longo deste pedido, o termo destina-se a incluir composições de IG e hialuronidase contidas em embalagens.
Como aqui usado, fluido refere-se a qualquer composição que pode fluir. Os fluidos incluem assim composições que estão na forma de semi-sólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras composições análogas.
Como aqui usado, "kit" refere-se a uma combinação de composições aqui proporcionadas e um outro item com uma finalidade que inclui, mas não lhes está limitado, activação, administração, diagnóstico e avaliação de uma actividade biológica ou propriedade. Os kits facultativamente incluem instruções de uso.
Como aqui usado, um extracto ou lisado celular refere-se a uma preparação ou fracção que é preparada a partir de uma célula lisada ou destruída.
Como aqui usado, animal inclui qualquer animal, como, mas não lhes estando limitados, primatas, incluindo seres humanos, gorilas e macacos; roedores, tais como murganhos e ratos; aves de capoeira, tais como galinhas; ruminantes tais como cabras, vacas, veados, ovinos; suínos, tais como porcos e outros animais. Animais não humanos excluem os seres humanos como animal contemplado. As enzimas aqui proporcionadas são de qualquer fonte, animal, planta, procariótica e fúngica. A maioria das enzimas é de origem animal, incluindo com origem em mamíferos.
Como aqui usado, um controlo refere-se a uma amostra que é substancialmente idêntica à amostra a testar, excepto não ser tratada com um parâmetro a testar ou se for amostra de plasma pode ser de um voluntário normal não afectado com a condição de interesse. Um controlo também pode ser um controlo interno.
Como aqui usado, as formas singlares "um", "uma", "o" e "a" incluem plurais a menos que que o contexto claramente indique de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a um composto, compreendendo "um domínio extra-celular" inclui compostos com um ou uma pluralidade de domínios extracelulares.
Como aqui usado, gamas e quantidades podem ser expressas como "aproximadamente" um valor ou gama particular. Aproximadamente também inclui a quantidade exacta. Assim, "aproximadamente 5 bases" significa "aproximadamente 5 bases" e também "5 bases".
Como aqui usado, "facultativo" ou "facultativamente" significa que o evento ou circunstâncias subsequentemente descritas ocorrem ou não e que a descrição inclui casos em que o referido evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre. Por exemplo, um grupo facultativamente substituído significa que o grupo é substituído ou não.
Como aqui usado, as abreviaturas para quaisquer grupos protectores, aminoácidos e outros compostos, são, a menos que outra forma indicado, de acordo com a sua utilização comum, abreviaturas reconhecidas, ou a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (ver, (1972) Biochem. 11:1726).
B. CO-FORMULAÇÕES ESTÁVEIS DE IMUNOGLOBULINA (IG) E HIALURONIDASE São aqui proporcionadas co-formulações estáveis contendo imunoglobulina (IG) e hialuronidase. As co- formulações mantêm a distribuição da massa molecular de IG e a actividade da hialuronidase após armazenamento prolongado na forma líquida à temperatura ambiente (e.g. 28 a 32°C) durante pelo menos seis meses. De um modo geral, as co-formulações também mantêm a distribuição da massa molecular de IG e a actividade da hialuronidase às temperaturas convencionais do frigorifico durante pelo menos 1-2 anos. As co-formulações podem ser usadas para o tratamento de doenças ou condições tratáveis com IG. Em particular, as co-formulações estáveis aqui proporcionadas são formuladas para administração subcutânea. 1. Terapia com imunoglobulina A imunoglobulina é um fármaco que é dado principalmente para tratar indivíduos com imunodeficiê-ncias. Os distúrbios de deficiência em imunoglobulina são uma subsérie de doenças de imunodeficiência caracterizadas através da falta ou níveis reduzidos de imunoglobulinas séricas, conduzindo a aumento da susceptibilidade a infecções bacterianas, especialmente do trato sinopulmonar. As doenças de imunodeficiência são primárias (genéticas) ou secundárias (adquiridas). As doenças de imunodeficiência primária são raras e incluem agamaglobulinemia associada a X; deleção da cadeia pesada das imunoglobulinas; deficiência numa subclasse de imunoglobulina G (IgG) selectiva, imunodeficiência variável comum ou síndrome da hipermimu-noglobulina M associada a X. Níveis reduzidos de imunoglobulina também são encontrados em indivíduos tendo imunodeficiências combinadas devido a defeitos nas células T e B, tais como, mas não lhes estando limitados, imuno-deficiência severa combinada ou síndrome de Wiskott Aldrich (IUIS Scientific Committee, 1999). Mais frequentemente são imunodeficiências secundárias, induzidas por factores que incluem, mas não lhes estão limitados, malnutrição, vírus, idade e leucemia. Os indivíduos com estas doenças requerem terapia de substituição com produtos de imunoglobulina para prevenir ou reduzir a gravidade das infecções. A terapia de substituição com imunoglobulina foi primeiro usada em 1952 e foi administrada intramuscularmente e subcutaneamente. No entanto, para tratar eficazmente a doença, são necessárias quantidades maiores de IG, as quais levam ao desenvolvimento de produtos administráveis com concentrações de IG mais baixas (50-100 mg/ml). Desde 1981, a maioria dos produtos de imunoglobulina disponíveis nos Estados Unidos são administrados intraveno samente. Geralmente, as preparações de IG são produtos purificados estéreis que possuem imunoglobulina G (IgG, IgM, IgA ou uma combinação dos mesmos) . Tipicamente, os produtos de IG possuem 95-99% de IgG e apenas quantidades vestigiais de imunoglobulinas A (IgA), M (IgM), D (IgD) e E (IgE) . As preparações de IG para administração IV são geralmente formuladas entre 3 e 12% de IG.
Mais recentemente, têm sido desenvolvidas preparações de imunoglobulina para administração subcutânea (Gardulf et al. (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 6: 434-42; Gardulf et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26: 177-85; Ochs et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26:265-73), e pelo menos um produto, Vivaglobin®, está aprovado para administração subcutânea nos Estados Unidos. Uma via subcutânea de administração de IG possui várias vantagens comparativamente com a via IV, como seja melhor tolerabilidade e a possibilidade do tratamento em casa.
A biodisponibilidade da imunoglobulina administrada subcutaneamente geralmente é inferior à conseguida por infusão intravenosa. Após administração IV, a imunoglobulina fica imediatamente disponível no sangue e lentamente equilibra-se com o compartimento extravascular durante 3 a 5 dias Schiff et al. (1986) J. Clin. Immunol. 6:256-64). A imunoglobulina administrada subscutaneamente é lentamente absorvida a partir do espaço subcutâneo para o sangue e ao mesmo tempo equilibra-se com o compartimento extravascular; não existe um pico elevado IV. A biodisponibilidade não foi estudada de forma extensa, mas num ensaio clinico recente a preparação ZLB-Boehring (i.e., Vivaglobin®) , foi determinada através da medição da área sob a curva (AUC) que apenas 67% da imunoglobulina foi absorvida e assim a dose recomendada foi de 137% da dose IV (Ochs et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26:265-73). Apesar das dificuldades técnicas de comparação da AUC para as duas vias diferentes e frequência de administração, os estudos de imunoglobulina administrada intradermicamente em coelhos sugerem que existe biodisponibilidade reduzida através da via subcutânea. Isto pode ser devido ao modo de absorção de moléculas de proteína grandes, as quais não se podem facilmente difundir através das paredes capilares e devem ser absorvidas através dos vasos linfáticos (Supersaxo et al. (1990) Pharm. Res. 7:167-9).
Todas as preparações de imunoglobulina presentemente usadas para administração subcutânea são formuladas a 16% IG, comparativamente com as preparações IVIG formuladas entre 5 e 12% IG. A concentração mais elevada de IG nas preparações subcutâneas relativamente às preparações IV permite volumes de infusão menores; tais preparações não podem ser infundidas intravenosamente. Tais métodos subcutâneos de terapia de substituição com imunoglobulina são considerados eficazes, seguros e também altamente apreciados pelos doentes, uma vez que possui menor risco de reacções sistémicas adversas e conduz a concentrações de IgG séricas mais elevadas comparativamente com as infusões IV mensais (Gardulf et al. (1995) J. Adv. Nurs., 21:917-27;
Gardulf et al. (1993) Clin. Exp. Immunol., 92:200-4; Gardulf et al. (1991) Lancet, 338:162-6).
Para além da biodisponibilidade reduzida associada à administração subcutânea de IG, uma outra distinção entre administração SC e IV é que apenas volumes pequenos podem ser infundidos subcutaneamente em cada local, necessitando do uso de múltiplos locais numa base semanal ou bissemanal (semana sim semana não) . Em geral, no entanto, os adultos podem apenas ser infundidos com 20-40 ml num único local subcutâneo, com volumes mais reduzidos por local para as crianças. Presentemente, a prática aceita para administração de IG é 300-600 mg/kg intravenosamente cada 3-4 semanas ou 100-200 mg/kg/semana subcutaneamente (Berger (2008) Immunol. Allergy Clin. North Am. 28(2):413-438) . Assim, até 15 g de IG é administrada por semana subcutaneamente. Isto significa que é necessária a administração de uma preparação de 16-20% IG em pelo menos 3 locais por semana. Ainda assim, a administração semanal ou bissemanal tem a vantagem adicional de manter melhores níveis que as infusões mensais IV, a necessidade de múltiplas inserções da agulha tem sido dissuasor para muitos doentes.
No entanto, os métodos subcutâneos de terapia de substituição com imunoglobulina estão a tornar-se uma alternativa cada vez mais popular à terapia IVIG. Os doentes com reacções graves às reacções IVIG podem frequentemente tolerar IG administrada subcutaneamente. A administração subcutânea é considerada eficaz, segura e também muito apreciada pelos doentes, uma vez que possui baixo risco de reacções sistémicas adversas e pode ser administrada em casa ou no hospital (Gardulf et al. (1995) J. Adv. Nurs., 21:917-27; Gardulf et al. (1993) Clin. Exp. Immunol., 92:200-4; Gardulf et al. (1991) Lancet, 338:162-6). 2. Administração subcutânea de formulações de imunoglobulina e formulações de hialuronidase A biodisponibilidade de IG administrada sub-cutaneamente é aumentada na combinação com administração de hialuronidase, permitindo assim a administração subcutânea de imunoglobulina em dosagens e frequências semelhantes ao tratamento IVIG (ver, e.g., Pedido de Patente U.S. U No. 2010-0074885 e PCT Internacional No. WO 2009-117085 ambas aqui incluídas como referência) . O espaço subcutâneo (SC) , formado por uma rede de colagénio cheia com ácido hialurónico, uma substância tipo gel, é largamente responsável pela resistência ao fluxo de fluidos através dos tecidos. Hialuronidase é uma família deenzimas naturais que cortam o ácido hialurónico, que é uma substância tipo "gel" de preenchimento de espaços encontrada na matriz extracelular e em tecidos do corpo, tais como pele e olho. A hialuronidase actua ao cortar a ligação glucosamínidica no ácido hialurónico entre fracção Ci da fracção N-acetilglucosamina e C4 da fracção glucurónica. Esta reduz temporariamente a viscosidade do cimento celular e promove a difusão dos fluidos injectados, facilitando assim a sua absorção. Em seguida, o ácido hialurónico é regenerado naturalmente dentro de 24 horas. Assim, as características de biodisponibilidade, farmacocinética e/ou farmacodinâmica das co-formulações contendo hialurodinase são melhoradas. Com base nas experiências em animais, o aumento da dispersão de fluidos permite a administração de até 1 1 por hora através da via subcutânea, que é um fluxo do tipo IV.
Na presença de hialuronidase, a biodisponibilidade de IG administrada subcutaneamente é aumentada, tipicamente para mais de 90% da biodisponibilidade de IG após tratamento por IVIG. Ainda, a co-administração com uma hialuronidase solúvel permite a infusão de grandes volumes num único local subcutâneo. Por exemplo, volumes até 600 ml ou superiores de IG podem ser administrados num único local numa única sessão, por exemplo 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml ou mais pode ser administrado um único local numa única administração, por exemplo, uma preparação de IG formulada entre 15 e 12%, por exemplo a 10% de proteína, que tipicamente são usados apenas para terapia IVIG possam ser co-administrados subcutaneamente com uma hialuronidase solúvel em dosagens equivalentes a doses IVIG mensais, por exemplo, a cerca de 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg ou mais. As preparações de IG com concentrações superiores de proteína, por exemplo, 12-25 % IG tal como 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% ou mais podem também ser administrados subcutaneamente na presença de hialuronidase. As dosagens podem ser administradas como uma dose única ou podem ser divididas em múltiplas doses dadas diariamente ou semanalmente, como seja uma vez por semana ou cada duas semanas, três ou quatro semanas ou combinações das mesmas. Assim, IG, quando administrada subcutaneamente na presença de hialuronidase, pode ser administrada uma vez por mês nas doses IVIG prevalecentes. Ainda, devido à hialuronidase actuar na abertura de canais de fluxo na pele, pode aumentar a velocidade de infusão. Assim, a administração subcutânea de IG administrada com hialuronidase aumenta as velocidades de infusão e assim reduz o tempo de entrega da terapia com IG.
Através da administração de IG subcutaneamente na presença de uma hialuronidase, uma ou todas as considerações e problemas associados à administração subcutânea de IG são abordadas. Assim, devido às propriedades de dispersão da hialuronidase, a administração subcutânea de IG na presença de uma hialuronidase solúvel permite a administração de doses IVIG com frequências mensais de IVIG, enquanto mantendo a biodisponibilidade de IVIG. 3. Co-formulações estáveis
Uma vez que as preparações de imunoglobulina administráveis subcutaneamente possuem a vantagem de uma preparação de IG para tratamento em casa, estável, prontra a usar e a hialuronidase está considerada. As proteínas usadas para terapia são tipicamente sujeitas a uma gama de condições durante o processamento e armazenamento, incluindo pH baixo, flutuações na temperatura, vários componentes de tampão e forças iónicas e, frequentemente, concentração proteica elevada na preparação final, para ser eficaz, no entanto, a co-formulação deverá manter actividade suficiente da IG e da hialuronidase. Assim, a co-formulação de IG e hialuronidase deve ser fornecida como uma solução estável para armazenamento de uma solução aquosa sem deterioração durante períodos de tempo prolongados. Assim, é aqui proporcionada uma co-formulação líquida, estável, de IG e hialuronidase. A co-formulação é tal que é proporcionada como uma forma de dosagem que pode ser usada para injecção directa, i.e. não diluída antes de usar.
Encontrou-se que o produto co-formulado preparado pela adição de uma hialuronidase designada rHuPH20 a uma preparação de IG antes da administração não era estável à temperatura ambiente. A adição de sal melhora a estabilidade da formulação, em particular, através da manutenção da actividade de hialuronidase na formulação. Assim, para além de conter uma quantidade eficaz de IG e hialuronidase, as co-formulações estáveis aqui proporcionadas também possuem pelo menos 50 mM de um sal cloreto de metal alcalino, por exemplo, NaCl ou KC1. Tipicamente, as co-formulações estáveis também possuem um aminoácido, por exemplo glicina, como estabilizador e são proporcionadas a um pH de aproximadamente 4 a 5, inclusive. Em geral, a proporção de hialuronidase para IG num produto co-formulado é superior à proporção quando os mesmos produtos (IG e hialuronidase) e a mesma quantidade de IG são subcutaneamente administrados em separado, por exemplo, numa administração com tecnologia de ponta.
De um modo geral, a co-formulação estável é uma formulação liquida. 0 armazenamento da co-formulação direc-tamente numa forma liquida tira partido da conveniência de ter estabilidade de armazenamento na forma liquida, facilidade de administração sem reconstituição e capacidade de fornecer a formulação em seringas pré-cheias prontas a usar ou como preparações de múltiplas doses. Assim, as co-formulações liquidas proporcionam uma preparação protnta a usar de IG e hialuronidase para administração subcutânea a um indivíduo sem ter de reconstituir a preparação com precisão e assepticamente e esperar durante um período de tempo até a solução clarificar antes da administração da formulação ao indivíduo. Simplifica o procedimento de administração da formulação a um indivíduo pelo profissional de saúde. Ainda, o processo de fabrico das formulações líquidas é simplificado e mais eficiente que o processo de fabrico para a versão liofilizada devido a todas as fases do fabrico das formulações líquidas serem realizadas numa solução aquosa, não envolvendo processo de secagem, como seja liofilização. Assim, é igualmente mais eficaz em termos de custos. A co-formulação estável pode ser proporcionada como uma formulação líquida num contentor ou seringa. Tal co-formulação pode ser convenientemente administrada a humanos ou a outras espécies de mamíferos como um fármaco sem reconstituição adicional pelo médico ou doente.
Ainda, devido à sua elevada estabilidade durante o armazenamento, as co-formulações podem conter concentrações proteicas elevadas na gama de aproximadamente 10% a 22% IG, como seja 10% a 20% IG sem causar um efeito adverso nas actividades biológicas de IG devido à agregação e/ou fragmentação da proteína edurante um armazenamento prolongado. Tal estabilidade não só assegura a eficácia da co-formulação de IG, como também reduz possíveis riscos de causar efeitos adversos num indivíduo. Assim, as co-formulações estáveis aqui proporcionadas mantêm a actividade enzimática da hialuronidase e a actividade de IG, minimizando ao mesmo tempo a auto-associação e agregação de IG. De um modo geral, a actividade é mantida a uma temperatura até 32°C, por exemplo a aproximadamente 0°C até 32°C, geralmente a aproximadamente 28°C a 32°C. A estabilidade da co-formulação é mantida durante períodos de tempo prolongados, por exemplo diariamente, semanalmente, mensalmente, anualmente ou mais. As co-formulações possuem vantagem de serem estáveis na forma líquida durante o armazenamento durante períodos de tempo prolongados de pelo menos 6 meses. Num exemplo, as co-formulações estáveis são estáveis em líquido durante pelo menos 1 ano ou mais, por exemplo, 1 ano a 2 anos, como seja 1 ano, 2 anos ou mais nas temperaturas do frigorífico (aproximadamente 4±2°C, ou cerca de 2-8°C ou, mais geralmente, variando entre cerca de 0-10°C). Num outro exemplo, as co-formulações são estáveis na forma líquida durante armazenamento à temperatura ambiente (na gama de 18-32°C, por exemplo, 28°C a 32°C) durante pelo menos seis meses. Por exemplo, as co-for-mulações estáveis geralmente possuem uma vida de prateleira de pelo menos 6 meses a 18 meses, inclusive, por exemplo 6 meses, 12 meses, 18 meses ou mais quando guardadas à temperatura ambiente.
As secções que se seguem descrevem as formulações aqui proporcionadas, incluindo exemplos de formulações de imunoglobulinas e hialuronidases, métodos para a sua preparação, e métodos de utilização das co-formulações estáveis para tratar doenças e condições tratáveis com IG.
C. IMUNOGLOBULINA E PREPARAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA São aqui proporcionadas imunoglobulinas (IG, também referidas como imunoglobulina, gamaglobulina ou IgG) que podem ser formuladas em composições estáveis com hialuronidase. As co-formulações estáveis podem ser usadas para uso no tratamento de doenças ou condições tratáveis com IG. AS imunoglobulinas são proteínas gama globulinas produzidas pelo sistema imunitário humoral e encontradas no plasma de anmais superiores. IG actua de modo a fortalecer o sistema imunitário através da modulação da actividade do complemento, supressão da produção de auto-anticorpos, saturação ou bloqueio de receptores Fc nos macrófagos e linfócitos B e supressão da produção de mediadores inflamatórios tais como citocinas, quimocinas e mataloprotei- nases. IG é composta por cinco classes, ou isotipos, de anticorpos (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE) e várias subclasses, cada uma com especificidades variáveis. IgG é a classe mais predominante de IG encontrada no sangue e é importante nas respostas imunes secundárias e tecidos protectores contra a infecção. A Tabela 2 ilustra quantidades típicas de imunoglobulinas encontradas no soro, se bem que preparações de IG para tratamento possam empregar passos de purificação que alterem as proporções de uma classe ou classes de imunoglobulinas particulares, por exemplo, a cromatografia com proteína A-, proteína G- ou proteína H-sefarose, pode ser usada para enriquecer uma mistura de imunoglobulinas relativamente a IgG ou subtipos específicos de IgG (ver, e.g., Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Patente U.S. No. 5,180,810 ).
Tabela 2. Imunoglobulina do soro
1. Preparação e purificação
As preparações de imunoglobulina aqui proporcionadas podem ser preparadas a partir de quaisquer materiais de partida adequados. Por exemplo, as imunoglobulinas podem ser isoladas a partir de sangue humano ou animal, por exemplo, a partir de soro de dadores humanos, ou produzida por outros meios, por exemplo através de tecnologia de DNA recombinante ou da tecnologia de hibridomas. Asssim, as preparações de imunoglobulina podem incluir imunoglobulinas monoclonais ou imunoglobulinas recombinantes. Por exemplo, a globulina imune pode ser obtida a partir de tecidos, culturas de hibridomas de linfócitos, plasma ou soro humano, ou culturas de células recombinantes usando qualquer procedimento adequado, como seja, por exemplo, precipitação (fraccionamento com álcool de Cohn ou fraccionamento com polietilenoglicol); métodos cromatográficos (cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, cromato-grafia de imunoafinidade); ultracentrifugação; ou preparação electroforética (ver, e.g., Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-75; Oncley et ai. (1949) J. Am. Chem. Soc., 71:541-50; Barandern et ai. (1962) Vox Sang., 7:157-74; Koblet et al. (1967) Vox Sang., 13:93-102; Patentes U.S. Nos. 5,122,373 e 5,177,194 ). Tipicamente, a imunoglobulina é preparada a partir de produtos contendo gama globulina produzidos por métodos de fraccionamento com álcool e/ou cromatografia de permuta iónica e de afinidade bem conhecidos dos familiarizados com a técnica.
Podem ser usados passos preparativos para enriquecer um isotipo ou subtipo particular de imunoglobulina. Por exemplo a cromatografia com proteína A-, proteína G- ou proteína H-sefarose, pode ser usada para enriquecer uma mistura de imunoglobulinas relativamente a IgG ou subtipos específicos de IgG (ver, genericamente, e.g., Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Patente U.S. No. 5,180,810 ). a. Método de Cohn-Oncley
Os métodos industriais convencionais de purificação de imunoglobulinas a partir do plasma sanguíneo são baseados no fraccionamento com etanol frio, o qual co-precipita grupos de proteínas, com base no seu ponto isoeléctrico, em determinadas concentrações de álcool a temperaturas abaixo de zero, originalmente empregues por Cohn e modificados por Oncley (ver, e.g. Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-75; Oncley et al. (1949) J. Am. Chem. Soc. 71:541-50) . O uso de álcool no processo de purificação pode inactivar potenciais vírus contaminantes, no entanto, aumentando a temperatura e a concentração de álcool, o método de Cohn-Oncley pode resultar em proteínas desnaturadas e agregadas. Estas formas de massa molecular elevada podem actuar como complexos de antigénio-anticorpo tendo a capacidade de fixar livremente o complemento. b. Procedimentos de Cohn-Oncley modificados
Para prevenir os efeitos indesejáveis do método de Cohn-Oncley, métodos de Cohn-Oncley modificados foram desenvolvidos para a preparação e purificação de IG. Vários desses procedimentos são conhecidos e podem ser adaptados e modificados para a produção de preparações de IG. Está ao alcance dos familiarizados com a técnica preparar preparações de IG face aos métodos detalhados conhecidos e disponíveis na técnica.
Tipicamente, IG é produzida usando uma fracciona-mento primário com etanol frio e um fraccionamento secundário que pode incluir, por exemplo, qualquer um ou mais dos passos que se seguem para obter um produto tendo uma actividade de anti-complemento baixa (ACA): separação de agregados de IG através de técnicas convencionais, tais como ultracentrifugação ou cromatografia por exclusão de tamanho modificação química das moléculas de IG através de alcoolização, alquilação, sulfonação e tratamento com agentes redutores (ver, e.g., Patente U.S. 6,875,848); incubação a um pH moderadamente acídico (pH 4,0) com ou sem pepsina, plasmina e tripsina imobilizada; fraccionamento de plasma humano através de polímeros de etilenoglicol (Poison et al. (1964) Biochim. Biophys. Acta. 82: 463-475), incorporação de polietilenoglicol (PEG) como um agente de purificação para material separado a partir do fracciona-mento de Cohn (fracção II ou II + III, ver e.g., Patentes U.S. Nos. 4,093,606 e 4,165,370), métodos de fraccionamento que usam polietilenoglicol como agente de precipitação, e outras técnicas descritas nas patentes U.S. Nos. 4,093,606, 4,126,605, 3,966,906, e 4,124,576, e outros métodos semelhantes de purificação com polietilenoglicol (EP 0246579); tratamento com B-propiolactona; cromatografia de permuta iónica para eliminar contaminantes indesejáveis a partir dos materiais de partida usados para obter as preparações de IG (ver e.g., Patentes U.S. No. 3,869,436, EP 91300790 e WO 94/29334). EP 0440483 descreve uma combinação de técnicas úteis para facilitar a preparação intravenosa do produto baseado em cromatografia de permuta iónica e diafiltração a um pH ligeiramente acídico; clivagem enzimática; tratamento com solvente/detergente; e diafiltração e ultrafiltração. Outros métodos estão igualmente descritos na técnica e são conhecidos dos familiarizados com a matéria (ver, e.g., Patentes U.S. 5,177,194 e 6, 875, 848) . A fracção de Cohn II purificada é normalmente usada. A pasta fracção de Cohn II de partida é tipicamente cerca de 95 por cento de IgG e também possui os quatro subtipos de IG. Os diferentes subtipos estão presentes na Fracção II aproximadamente na mesma proporção encontrada nos lotes de plasma humano de onde são obtidos. A Fracção II é ainda purificada antes da formulação num produto administrável. por exemplo, a Fracção II pode ser dissolvida em solução aquosa fria de álcool purificada e as impurezas removidas através de precipitação e filtração. Após a filtração final, a suspensão de imunoglobulinas pode ser dialisada ou diafiltrada (e.g. usando membranas de ultrafiltração tendo um limite de massa molecular nominal inferior ou igual a 100000 daltons) para remover o álcool. A solução pode ser concentrada ou diluída para se obter a concentração proteica pretendida e pode ainda ser purificada por técnicas bem conhecidas dos familiarizados com a técnica. c. Processamento virai
As preparações de IG deverão ser tratadas para remover carga virai. Existem dois métodos de processamento virai: inactivação virai e remoção dos vírus. A inactivação virai torna os vírus inactivos através, por exemplo, de alteração química do invólucro lipídico ou da cápside virai ou através de desnaturação completa dos vírus. Exemplos de métodos de inactivação virai incluem, mas não lhes estão limitados, aquecimento (pasteurização) , tratamento com solvente/detergente (S/D) e exposição a ambiente acídico (pH baixo). O processo S/D é o método de inactivação virai mais largamente usado na indústria de plasma sanguíneo, usado para inactivar vírus contendo um invólucro lipídico. Por exemplo, demonstrou-se que o processo S/D possui acção virucida contra VSV (vírus da estomatite vesicular) , vírus Sindbis, HIV, HBV (vírus da hepatite B) e HCV (vírus da hepatite C). A remoção de vírus é um processo que remove totalmente todos os vírus da amostra. Exemplos de separação ou remoção virai incluem, mas não lhes estão limitados, fraccionamento com etanol frio, separação de fases ou precipitação com PEG, cromatografia de afinidade, cro-matografia de permuta iónica ou de exclusão em gel e nanofiltração. d. Concentração proteica
As imunoglobulinas podem ser preparadas em diversas concentrações. Por exemplo, IG pode ser preparado em concentrações proteicas que variam entre cerca de 3-25% IG, tipicamente cerca de 10% a 22%, tais como 10%-20% p/v. Por exemplo, as preparações de IG podem ser aproximadamente 18% a 22% IG p/v. As preparações de IG aqui proporcionadas são preparadas em concentrações de IG de aproximadamente 10%, 11%, 12%, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 % ou mais. A concentração proteica final depende largamente do método de geração e purificação. É aqui considerado que qualquer imunoglobulina pode ser usada para co-formulações estáveis com hialuronidase. Está dentro da capacidade dos familiarizados com a técnica determinar a concentração adequada de IG para inclusão nas co-formu-lações estáveis da invenção. A escolha da preparação de IG dependerá de uma variedade de factores tais como via de administração, doente a ser tratado e tipo de condição a ser tratada.
Por exemplo, pode ser usada qualquer preparação conhecida ou existente de IG. Estas incluem preparações de IG tipicamente usadas para administração IV (IVIG). Em geral, as preparações finais de IG para administração intravenosa possuem uma concentração proteica de aproximadamente 3 a 12% p/v ou tipicamente 10% p/v. Por exemplo, IVIG está disponível no comércio como Carimune® NF, Flebogamma® 5 %, Gammagard® Liquid, Gammagard® S/D, Gamunex®, Iveegam® EN, Octagam® w Polygam® S/D. tipicamente, tais preparações usam um método de fraccionamento com álcool frio, mas diferem nos métodos usados para isolar e purificar a imunoglobulina e métodos para reduzir potencial contaminação com vírus.
Ainda, outras preparações presentemente formuladas para administração intramuscular ou subcutânea podem ser usadas nas composições e métodos aqui proporcionados. Por exemplo, as preparações de IG para administração intramuscular e administração subcutânea estão disponíveis comercialmente como GamaSTAN® S/D e Vivaglobin®, respec-tivamente. Tipicamente, tais preparações usam fracciona-mento com etanol frio a partir de plasma humano e possuem uma concentração de IgG de aproximadamente 15 a 18% ou 10 a 22%, respectivamente. O Pedido de Patente U.S. provisório N° 61/181,606 descreve a geração de uma composição de imunoglobulina altamente purificada e concentrada a partir de lotes de plasma para administração subcutânea.
e. Exemplos de preparações de IG i. 10% IG
Exemplos de uma preparação de IG é imunoglobulina intravenosa (humana), 10% (IVIG, 10%, comercializada como liquido Gammagard®, Baxter Healthcare Corporation), que é uma preparação liquida de IgG não modificada, com uma distribuição de subclasses de IgG semelhante à do plasma normal. A preparação possui regiões do fragmento cristalizável intacto (Fc) e do fragmento de ligação a antigénio (Fab). As preparações possuem 100 mg/ml de proteína, com pelo menos 98% sendo IgG; IgA está presente numa concentração de 37 yg/ml e IgM está presente apenas em quantidades vestigiais. Possui uma osmolalidade que é semelhante à osmolalidade fisiológica e não possui açúcares, sódio ou conservantes adicionados. É formulada com glicina para estabilização a um pH de 4,6 a 5,1. o processo de produção emprega um procedimento de fracionamento com álcool a frio de Cohn-Oncley modificado e ainda purificações através de um processo contínuo através do uso de cromatografia de permuta catiónica fraca e cromatografia de permuta aniónica fraca. 0 processo de produção também inclui 3 passos independentes de inactivação ou remoção virai: tratamento com solvente/detergente (S/D) , nanofil- tração e incubação a um pH baixo e temperatura elevada. A preparação de uma preparação de 10% IVIG está descrita no Exemplo 1. ii. Concentração elevada de preparações de IG (e.g. 20% IG) A geração de preparações de imunoglobulina de concentração proteica elevada está descrita no Pedido de Patente U.S. provisório N° 61/181,606. Exemplos de preparações contendo 18-22% IG são formulações liguidas isotónicas altamente purificadas de imunoglobulina (pelo menos 95% IG) formuladas em glicina 0,25 mM a pH 4,4 a 4,9, representado nos Exemplos abaixo.
Os produtos de IgG de concentração elevada aqui descritos são produzidos através de um processo tendo muitos passos iguais ou semelhantes aos do processo de produção das preparações IVIG tradicional (e.g. 10% IG). Os passos adicionais, ultrafiltração/diafiltração usando membranas de canais abertos com uma pós-lavagem e formulação especificamente desenhada quase perto do final do processo de produção, tornam as composições de IG resultantes cerca de duas vezes mais altas em concentração proteica (200 mg/ml) comparativamente com as IVIGs do estado da técnica (e.g., Gammardd Liquid), sem afectar o rendimento e a estabilidade no armazenamento. Com a maioria das membranas de ultrafiltração comerciais, uma concentração de 200 mg/ml de IgG não pode ser atingida sem perdas importantes de proteína. Estas membranas ficam bloqueadas muito cedo, consequentemente é difícil de atingir pós-lavagem adequada. Assim, as configurações de membrana de canal aberto têm de ser usadas. Ainda, um procedimento pós- lavagem especificamente desenhado é empregue para obter a concentração de IG necessária sem perda significativa de proteína (menos de 2% de perda); a concentração proteica mais elevada de 200 mg/ml não afecta a capacidade de inactivação virai do passo de armazenamento a pH baixo. O processo geral de produção da composição de elevada concentração de IG inclui os passos que se seguem que são descritos mais detalhadamente no Exemplo 2. Primeiro, os crioprecipitados são separados a partir de plasma previamente congelado para dar um "plasma fraco de congelação" liquido, o qual é processado no passo seguinte para obter o sobrenadante (ou Fraccionamento I) . O ajustamento do pH e a concentração com etanol, tipicamente para 7 e 20 a 25% v/v, respectivamente, seguido de centrifugação subsequente ao mesmo tempo que reduzindo a temperatura, separa os líquidos dos sólidos. O precipitado deste passo é então extraído, misturado com sílica fumada e filtrado, todos os passos realizados a temperaturas baixas, tipicamente 2 a 8°C. O filtrado foi então misturado com polissorbato-80 e citrato de sódio desidratado com agitação simultânea entre 2 e 8°C. Obtém-se então o precipitado G, numa forma semelhante ao passo de precipitação de Cohn II, em que o pH e a concentração de álcool são ajustados, o precipitado G é dissolvido e filtrado com um filtro de profundidade de um tamanho de poro nominal de 0,2 ym (e.g., filtro Cuno VR06 ou equivalente) para obter um filtrado límpido. Tratamento subsequente com solvente/detergente, tipicamente usando 1,0% (v/v) Triton X-100, 0,3 % (v/v)
Tween-80 e 0,3 % (v/v) TNBP, a 18 a 25 °C durante pelo menos 60 minutos, seguido de cromatografia de permuta catiónica, cromatografia de permuta aniónica e nanofil-tração usando, e.g., um filtro Asahi Planova 35N ou equivalente. Após a nanofiltração, o filtrado é concentrado para uma concentração proteica de 5 ± 1 % p/v por ultra-filtração. Nalguns exemplos, a ultrafiltração é realizada numa cassete com um crivo de canal aberto e a membrana de ultrafiltração possui uma massa molecular de exclusão nominal (NMWCO) de 50 kDa ou menos. Quando completado o passo de ultrafiltração, o concentrado é diafiltrado contra uma solução de glicina 0,25M com um pH baixo. Tipicamente, o volume minimo de permuta é 6 vezes o volume de concentrado original e a solução é concentrada para uma concentração proteica de mais de 20% p/v. No final do processo de diafiltração e de concentração, o pH da solução é tipicamente entre 4,4 e 4,9. Para formulação, a concentração proteica da solução é então ajustada lacima de 20% p/v, e.g. 20,4 ± 04 % p/v, com o tampão de diafiltração. A solução formulada em bloco é ainda esterilizada, primeiro por filtração através de uma membrana com um tamanho de poro absoluto de 0,2 micon ou menos. Em seguida, a solução é distribuída assepticamente nos recipientes finais para fecho adequado, com colheita de amostras para testar. O passo final é o armazenamento em recipientes selados entre 30 e 32 °C durante um período de tempo prolongado, e.g. 21 a 22 dias. A inclusão dos passos de ultrafiltração e formulação no processo de fabrico é uma melhoria relativamente aos métodos de purificação e concentração de IG anteriormente usados, resultando em preparações com concentrações de IG mais elevadas sem perda significativa da actividade de IG, mantendo ao mesmo tempo um pH baixo na formulação final. Tipicamente, os produtos possuem uma concentração proteica de pelo menos 18% peso/volume (p/v), da qual a grande maioria (tipicamente não menos de 95%) é IG e um pH na gama de pH 3-6, o que facilita a inactivação de agentes patogénicos tais como vírus que possam estar presentes no plasma. Devido à concentração elevada de IG e portanto volume reduzido na administração, as preparações de concentração elevada são adequadas para administração subcutânea. Nalgumas realizações, os produtos de IG possuem uma viscosidade não superior a 18 mPascal.segundo e podem portanto ser igualmente adequados para administração intravenosa. A simples diluição pode também permitir a administração intravenosa. 2. Estabilidade no armazenamento
Formulações finais de IG purificada devem ser preparadas para reterem actividade da IG e evitar agregação excessiva. Quando do armazenamento das preparações de IG, a agregação pode ser minimizada e a estabilidade melhorada através, por exemplo, da adição de excipientes estabilizadores de proteína ou do ajustamento do pH da solução. a. Excipientes estabilizadores de proteina
Uma forma de aumentar a estabilidade das preparações de IG bem conhecida na técnica é adicionar excipientes estabilizadores de proteina à preparação de IG. Excipientes conhecidos incluem, mas não lhes estão limitados, açúcares, polióis, aminoácidos, aminas, sais, polímeros e tensioactivos. Por exemplo, a Patente U.S.4,499,073 descreve a estabilização como resultado da força iónica e pH da solução de armazenamento; a Patente JP 54020124 descreve a adição de um aminoácido a uma preparação intramuscular para tornar a preparação estável e segura no armazenamento; JP 57031623 e JP 57128635 divulgam o uso de arginina e/ou lisina com NaCl em preparações de 5 a 15% IG para conseguir estabilidade a longo prazo numa preparação intramuscular; JP 4346934 divulga o uso de condutividade baixa (inferior a 1 mmho), pH 5,3 a 5,7 e facultativamente um ou mais estabilizadores, incluindo PEG, albumina sérica humana e manitol; US 4,439,421 descreve a adição de uma macromolécula hidrofílica, um poliol e uma outra proteína para estabilizar contra a geração de anti-complemento; US 5,945,098 divulga a estabilização de soluções isotónicas pela adição de aminoácidos (glicina 0,1 a 0,3 M) e detergentes não iónicos (polissorbato e PEG); US 4,186,192 divulga vários aditivos, incluindo aminoácidos; WO 2005/049078 divulga a estabilização com maltose, e adicionalmente, glicina para 0,1 M; US 4,362,661 divulga o uso de aminoácidos neutros e básicos para conferir estabilidade numa preparação de 5 % IG. As formulações liquidas estáveis podem também ser preparadas usando açúcares num meio aquoso força iónica muito baixa e um pH de 4,25 (Patente U.S. No. 4,396, 608) ou um pH fracamente ácido de 5-6 (EP 0278422) . A formação de dimeros de preparações de IG pode também ser controlada. Por exemplo, a Patente U.S. N° 5,871, 736 divulga preparações de IG, particularmente reparações liquidas, contendo um ou mais estabilizadores anfifilicos contra a formação de dimeros. Os estabilizadores anfifilicos incluem ácido nicotinico e seus derivados, em particular nicotinamida e, principalmente, conjuntamente com aminoácidos tendo cadeias laterais lipofilicas não carregadas, e.g. fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, prolina e valina.
b. pH
As preparações de IG podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica, como sejam quaisquer uns aqui descritos. De um modo geral, no entanto o pH da preparação final é ajustado a um pH relativamente elevado, nomeadamente na gama de aproximadamente pH 4,0 a 7,4. Encontrou-se que o pH da preparação de imunoglobulina é um factor importante relativo ao teor em monómero de IgG do produto final. De um modo geral, uma preparação de 5 por cento de imunoglobulina possui um pH de 4,2 ± 0,5. As preparações dez por cento são mais estáveis a um pH de 5,2 ± 0,2. O pH óptimo é obtido através de técnicas de formulação bem conhecidas dos familiarizados com a técnica. Por exemplo, o pH óptimo pode ser determinado a partir das determinações de cromatografia de exclusão por tamanho, assim como dos dados de estabilidade ao calor e dos títulos anti-complemento das várias preparações em diferentes condições de pH. D. Hialuronidase São aqui proporcionadas co-formulações estáveis contendo imunoglobulina e uma hialuronidase, tipicamente uma hialuronidase solúvel. As hialuronidases são membros de uma grande família de enzimas que degradam o ácido hialurónico, o qual é um componente essencial da matriz extracelular e uma constituinte importante da barreira intersticial. Ao catalisar a hidrólise de ácido hialurónico, um constituinte importante da barreira intersticial, a hialuronidase baixa a viscosidade do ácido hialurónico, aumentando assim a permeabilidade dos tecidos. Como tal, as hialuronidases têm sido usadas, por exemplo, como um agente de difusão ou dispersão conjuntamente com outros agentes, fármacos e proteínas para aumentar a sua dispersão e entrega. Exemplos de hialuronidases nas co-formulações aqui proporcionadas são hialuronidases solúveis.
Existem três classes gerais de hialuronidases; hialuronidases de mamíferos, hialuronidases bacterianas e hialuronidases de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos.
As hialuronidases tipo mamífero (EC 3.2.1.35) são endo-p-N-acetil-hexosaminidases que hidrolisam a ligação glicosidica β1^4 de hialuronano em oligossacáridos de comprimento variável como sejam tetrassacáridos e hexassacáridos. Possuem também actividades hidrolítica e de transglicosidase e podem degradar hialuronano e sulfatos de condroitina (CS), geralmente C4-S e C6-S. As hialuronidases deste tipo incluem, mas não lhes estão limitadas, hialuronidases de vaca (bovina) (SEQ ID NOS:10 e 11), murganho (SEQ ID NOS:17-19, 32), porco (SEQ ID NOS:20-21), rato (SEQ ID NOS :22-24, 31), coelho (SEQ ID NO:25), carneiro (ovino) (SEQ ID NOS:26 e 27), orangotango (SEQ ID NO:28), macaco cinomólogo (SEQ ID NO:29), cobaio (SEQ ID NO:30), e hialuronidases humanas.
As hialuronidases de mamífero podem ainda ser subdivididas nas que são activas a pH neutro, predominantemente encontradas em extractos de testículos, e nas que são activas a pH ácido, predominantemente encontrado em órgãos tais como o fígado. Exemplos de hialuronidases activas a pH neutro incluem PH20, incluindo mas não lhes estando limitados, PH20 derivada de diferentes espécies tais como ovinos (SEQ ID NO:27), bovinos (SEQ ID N0:11) e humana (SEQ ID N0:1). PH20 humana (também conhecida como SPAM1 ou proteína da superfície do espermatozóide PH20), está geralmente ligada à membrana plasmática através de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Está naturalmente envolvida na adesão do espermatozóide ao ovo e ajuda na penetração pelo espermatozóide da camada das células do cumulus através da digestão do ácido hialurónico.
Para além de PH20 humana (também designada SPAMl), cinco genes tipo hialuronidase foram identificadas no genoma humano, HYALl, HYAL2, HYAL3, HYAL4 e HYALPl. HYALPl é um pseudogene, e HYAL3 (SEQ ID NO :38) não se demonstrou possuir actividade enzimática relativamente a qualquer substrato conhecido. HYAL4 (polipéptido precursor descrito em SEQ ID NO:39) é uma condroitinase e apresenta pouca actividade contra o hialuronano. HYALl (polipéptido precursor descrito em SEQ ID NO:36) é a enzima protótipo activa a pH ácido e PH20 (polipéptido precursor descrito em SEQ ID N0:1) é a enzima protótipo activa a pH neutro. As hialuronidases activas a pH ácido, tais como HYAL e HYAL2 (polipéptido precursor descrito em SEQ ID NO:37) geralmente não possuem actividade catalítica a pH neutro (í.e. pH 7). Por exemplo, HYALl possui pouca actividade catalítica in vitro a pH 4,5 (Frost et al. (1997) Anal. Biochemistry, 251:263-269) . HYAL2 é uma enzima activa a pH ácido com muito pouca actividade específica in vitro. As enzimas tipo hialuronidase podem ser igualmente caracterizadas pelas que estão geralmente ligadas à membrana pasmática através de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol, como seja HYAL2 humana e PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100(8):4580-5), e as que são geralmente solúveis tais como HYALl (Frost et ai., (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5). 1. PH20 PH20, tal como outras hialuronidases de mamífero, é uma endo-β-N-acetil-hexosaminidases que hidrolisam a ligação glicosídica β1^4 de hialuronano em oligossacáridos de comprimento variável como sejam tetra-sacáridos e hexa-sacáridos. Possuem também actividades hidrolítica e de transglicosidase e podem degradar hialuronano e sulfatos de condroitina, geralmente C4-S e C6-S. PH20 está naturalmente envolvida na adesão do espermatozóide ao ovo e ajuda na penetração pelo espermatozóide da camada das células do cumulus através da digestão do ácido hialurónico. PH20 está localizada na superfície do espermatozóide e no acrossoma derivado do lisossoma, onde está ligado à membrana acrossómica interna. PH20 da membrana plasmática possui actividade de hialuornidase apenas a pH neutro, enquanto PH20 da membrana acrossómica interna possui actividade a pH neutro e a pH ácido. Para além de ser uma hialuronidase, PH20 também parece ser um receptor da sinalização celular induzida por HA e um receptor para a zona pelúcida que rodeia o oócito.
Exemplos de proteína PH20 incluem, mas não lhes estão limitados a polipéptidos de PH20 humana (polipéptido precursor descrito em SEQ ID N0:1; polipéptido maduro descrito em SEQ ID N0:2), bovina (SEQ ID N0S:11), de coelho (SEQ ID NO:25), PH20 ovina (SEQ ID NOS:27), macaco cinomólogo (SEQ ID NO:29), cobaio (SEQ ID NO:30), rato (SEQ ID NO:31) e murganho (SEQ ID NO:32). PH20 bovina é um polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEQ ID NO: 11) . Um alinhamento de PH20 bovina com PH20 humana mostra apenas homologia fraca, com múltiplos intervalos existindo entre o aminoácido 470 até ao extremo carboxilo respectivo devido à ausência de uma âncora GPI no polipéptido bovino (ver e.g., Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440). De facto, em muitas espécies, para além da humana, não se consegue prever claramente âncoras GPI em HP20. Assim, polipéptidos HP20 produzidos a partir de ovinos e de bovinos existem naturalmente como formas solúveis. Apesar de PH20 bovino existir ligada muito frouxamente à membrana plasmática, não está ancorada através de uma âncora sensível à fosfolipase (Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36). Esta característica única da hialuronidase bovina tem permitido o uso da enzima hialuronidase solúvel de testículo bovino como um extracto para uso clínico (Wydase®, Hyalase®). O transcrito mRNA de HP20 humana é normalmente traduzido para gerar um polipéptido precursor de 509 aminoácidos (SEQ ID NO:l) contendo uma sequência sinal de 35 aminoácidos no extremo N (posições de resíduos de aminoácidos 1-35) e uma sequência sinal de ligação à âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de 19 aminoácidos no extremo C (posições de resíduos de aminoácidos 491-509). A PH20 madura é, portanto, um polipéptido de 474 aminoácidos descrito em SEQ ID NO:2. Após transporte do polipéptido precursor para o ER e remoção do péptido sinal, o péptido sinal de ligação a GPI C-terminal é cortado para facilitar a ligação covalente de uma âncora GPI ao aminoácido C-terminal acabado de formar na posição de aminoácidos correspondente à posição 490 do polipéptido precursor descrito em SEQ ID NO:l. Assim, é produzido um polipéptido maduro de 474 aminoácidos ancorado a GPI com uma sequência de aminoácidos como descrita em SEQ ID NO:2.
Comparativamente com outras hialuronidases, incluindo hialuronidase de abelhas e de murganho, PH20 de macaco e cobaio, PH20 humana possui uma região comum de 340 aminoácidos com 57 aminoácidos conservados (ver, e.g., Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814). Os aminoácidos conservados incluem quatro resíduos de cisteína que formam pontes dissulfeto nos resíduos de aminoácidos 25, 189, 203 e 316 na sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 2. (correspondendo aos resíduos 60, 224, 238 e 351 na sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO:l). As ligações dissulfeto formam-se entre os resíduos de cisteína C60 e C351 e entre C224 e C238 para formar o domínio nuclear da hialuronidase. No entanto, são necessárias outras cisteínas no extremo carboxilo para actividade catalítica da enzima a pH neutro, de modo que os aminoácidos 3 6 a 4 64 de SEQ ID NO:l possuam o domínio minimamente activo da hialuronidase PH20 humana. Quatro ligações dissulfeto adicionais são formadas entre os resíduos de cisteína C376 e C387; entre C381 e C435; entre C437 e C443; e entre C458 e C464 do polipéptido exemplificado em SEQ ID NO: 1 (correspondendo aos resíduos C341 e C352; entre C346 e C400; entre C402 e C408; e entre C423 e C429 do polipéptido maduro descrito em SEQ ID N0:2, respectivamente).
Ainda, outros resíduos conservados estrão provavelmente envolvidos na ligação ao substrato e na catálise, os resíduos de aminoácidos nas posições 111, 113, 176, 249 e 252 correspondendo aos resíduos em SEQ ID N0:2 parecem estar envolvidos na actividade de PH20, uma vez que a mutação destas posições torna a enzima inactiva ou deixa apenas actividade residual comparativamente com PH20 selvagem sem as mutações (ver, e.g., Arming et al. (1997)
Eur. J. Biochem., 247:810-814).
Existem sete potenciais locais de glicosilação ligada em N em 82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana exemplificada em SEQ ID NO: 1. as ligações dissulfeto formam-se entre os resíduos de cisteína C60 e C351 e entre C224 e C238 para formar o domínio nuclear da hialuronidase. Uma vez que os aminoácidos 36 a 4 64 de SEQ ID NO:l possuem o domínio minimamente activo da hialuronidase PH20 humana, o local de glicosilação ligada em N N-490 não é necessário para a actividade correcta da hialuronidase. 2. Hialuronidase solúvel
De um modo geral, a hialuronidase nas co-formulações estáveis aqui proporcionadas são hialuronidases solúveis. As hialuronidases solúveis, quando expressas nas células, são secretadas para o meio. A solubilidade pode ser demonstrada através da particção da proteína na fase aquosa da solução de Triton X-114. Assim, é entendido que uma hialuronidase solúvel não inclui qualquer hialuronidase que possua uma âncora GPI, tornando o polipéptido liqado à membrana celular.Por exemplo, PH20 humana de tamanho completo (descrita na forma madura como SEQ ID N0:2) possui uma âncora GPI e não é solúvel. Pelo contrário os polipéptidos de PH20 bovina e ovina não possuem uma âncroa GPI que seja suficiente para a ligação à âncora GPI e assim são considerados como proteínas solúveis. Ainda, a hialuronidase solúvel incluída nas co-formulações aqui proporcionadas, de um modo geral, são proteínas substancialmente purificadas. Igualmente, as hialuronidases solúveis mantêm a actividade de hialuronidase. por exemplo, PH20 humana solúvel retém actividade neutra. A hialuronidase solúvel inclui hialuronidases que não incluem naturalmente uma âncora GPI ou uma âncora suficiente para a ligação à membrana, incluindo, mas não lhes estando limitadas, Hyall, PH20 bovina e PH20 ovina, suas variantes alélicas e outras variantes. Também estão incluídas na hialuronidase solúvel qualquer hialuronidase que tenha sido modificada para ser solúvel. Por exemplo, PH20 humana, que normalmente está ancorada à membrana através de uma âncora GPI, pode ser tornada solúvel quando truncada e removida a totalidade ou uma parte da âncora GPI no extremo C. As hialuronidases solúveis também incluem hialuronidases activas a pH neutro e activas a pH ácido, no entanto, as hialuronidases activas a pH neutro estão contempladas para usar para fins de administração cutânea.
Assim, são exemplos de hialuronidase solúvel PH20 de qualquer espécie, como sejam as descritas em qualquer uma de SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31 e 32, ou formas truncadas das mesmas sem a totalidade ou parte da âncora GPI C-terminal, desde que a hialuronidase seja solúvel e mantenha a actividade de hialuronidase. Também incluídas nas hialuronidases solúveis estão as variantes alélicas ou outras variantes conhecidas dos familiarizados com a técnica e incluem polipéptidos tendo 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % ou mais de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30 e 31, ou suas formas truncadas.
Tipicamente, as co-formulações aqui descritas possuem uma PH20 humana solúvel. Apesar de PH20 de outros animais puderem ser usadas, tais preparações são potencialmente imunoqénicas, uma vez que são proteínas animais. Por exemplo, uma proporção siqnificativa de doentes demonstra sensibilização anterior secundária a alimentos ingeridos e uma vez que existem proteínas animais, todos os doentes possuem um risco de subsequente sensibilização. Assim, as preparações não humanas podem não ser adequadas para uso crónico. Caso sejam pretendidas preparações não humanas, é aqui considerado que tais polipéptidos possam ser preparadas para terem imunoge- nicidade reduzida. Tais modificações estão dentro do nivel dos familiarizados com a técnica. a. PH20 humana solúvel
Um exemplo de uma hialuronidase solúvel é a PH20 solúvel. As formas solúveis de PH20 recombinante foram produzidas e podem ser incluídas nas co-formulações aqui descritas. A produção de tais formas solúveis de PH20 está descrita no Pedido de Patente U.S. NosU.S. Patent Application Nos. 2005-0260186 e 2006-0104968 . As formas
solúveis incluem, mas não lhes estão limitados, quaisquer truncagens C-terminais para gerar polipéptidos contendo o aminoácido 1 ao aminoácido 4 64 ou da sequência de aminoácidos descritos em SEQ ID NO: 1. Por exemplo, as formas solúveis incluem, mas não lhes estão limitadas, quaisquer truncagens C-terminais para gerar polipéptidos contendo o aminoácido 1 ao aminoácido 467 até 483, por exemplo, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 e 483. Quando expressa em células de mamífero, a sequência sinal N-terminal de 35 aminoácidos é cortada durante o processamento e a forma madura da proteína é secretada. Assim, os polipéptidos maduros solúveis possuem pelo menos os aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO:l. Por exemplo, os polipéptidos maduros solúveis possuem os aminoácidos 36 a 467 e 36 a 483 de SEQ ID NO:l, por exemplo 36 to 467, 477, 478, 479, 480,481, 482 e 483 de SEQ ID NO:l. Os mutantes de deleção terminando na posição de aminoácidos 477 a 483 (correspondendo ao polipéptido precursor descrito em SEQ ID N0:1) apresentam maior actividade hialuronidase secretada que a forma ancorada a GPI de tamanho completo. Assim, exemplos de hialuronidases solúveis são as que possuem 442, 443, 444, 445, 446 ou 447 aminoácidos de comprimento, como estabelecido em qualquer uma de SEQ ID NOS :4-9 ou variantes alélicas ou de espécie ou outras variantes das mesmas. b. PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20)
As formas recombinantes solúveis de HP20 humana designada como rHuPH20 foram geradas e podem ser produzidas e purificadas usando os métodos aqui descrito. A geração de tais formas solúveis de rHuPH20 está descrita nos Pedidos de Patente U.S. Nos de Série U Nos. 11/065,716 e 11/238,171 (publicado como Pedidos de Patente U.S. publicados Nos. US20050260186 e US 20060104968 ) e nos Exemplos 3 abaixo. Exemplos de tais polipéptidos são os gerados a partir de uma molécula de ácido nucleico codificadora dos aminoácidos 1-482 descrito em SEQ ID NO:3. O processamento pós-tradução remove a sequência sinal de 35 aminoácidos, resultando na secreção de uma rHuPH20 solúvel de 447 aminoácidos (SEQ ID NO:4). rHuPH20 resultante purificado pode ser heterogéneo devido às peptidases presentes no meio de cultura quando da produção e purificação. Tipicamente, rHuPH20 é produzida em células que facilitam a N-glicosilação correcta para reter a actividade, como sejam as células CHO (e.g. células CHO DG44) . 3. Glicosilação A glicosilação, incluindo a glicosilação ligada em N e em 0, de algumas hialuronidases pode ser muito importante pela sua actividade catalítica e estabilidade. Apesar da alteração do tipo de glicano de uma glicoproteína poder ter efeitos dramáticos na anteginicidade, enrolamento estrutural, solubilidade e estabilidade da proteína, a maioria das enzimas não necessita de glicosilação para actividade enzimática óptima. Tais hialuronidases são únicas neste aspecto, pelo facto da remoção da glicosilação ligada em N poder resultar na inactivação quase completa da actividade de hialuronidase. Para tais hialuronidases, a presença de glicanos ligados em N é crítica para a geração de uma enzima activa.
Os oligossacáridos ligados em N são classifiçados em vários tipos principais (oligomanose, complexos, híbridos, sulfatados) todos eles possuindo núcleos de (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc ligados através do azoto da amida dos resíduos Asn que estão dentro das sequências -Asn-Xaa-Thr/Ser- (onde Xaa não é Pro) . A glicosilação num local -Asn-Xaa-Cys- foi descrita para a coagulação da proteína C. Nalguns casos, a hialuronidase pode conter ligações N-glicosídicas e 0-glicosídicas. Por exemplo, PH20 possui oligossacáridos ligados em 0 assim como oligossacáridos ligados em N. Existem sete potenciais locais de glicosilação ligada em N em N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana exemplificada em SEQ ID NO: 1. Como refrido atrás, a glicosilação ligada em N em N490 não é necessároa para a actividade de hialuronidase. 4. Modificações de hialuronidase para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas
As hialuronidases proporcionadas nas co-formu-lações podem ser modificadas para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas, como seja o aumento da sua semivida in vivo e/ou actividades. A modificação de hialuronidases para usar nas co-formulações aqui proporcionadas pode incluir ligação, directamente ou indirec-tamente através de um elemento de ligação, como seja covalentemente ou outra ligação estável, de um polímero, como seja uma fracção de dextrano, polietilenoglicol (pequilação (P) ou sialilo, ou outros polímeros, tais como polímeros naturais ou de açúcares. A peguilação de fármacos é conhecida por aumentar a resistência à proteólise, aumentar a resistência à proteólise, aumentar a semivida no plasma e reduzir a antigenicidade e imunogenicidade. A ligação covalente ou outra ligação estável (conjugação) de moléculas poliméricas, tais como a fracção de polietilenoglicol (PEG) à hialuronidase pode assim conferir propriedades benéficas à composição de enzima-polímero resultante. Tais propriedades incluem melhor biocompatibilidade, extensão da semivida da proteína (e da actividade enzimática) no sangue, células e/ou noutros tecidos do indivíduo, protecção eficaz da proteína relativamente a protéases e hidrólise, melhor biodistribuição, melhor farmacocinética e/ou farmacodinâmica e maior solubilidade em água.
Exemplos de polímeros que podem ser conjugados com a hialuronidase incluem homopolímeros naturais e sintéticos, tais como polióis (i.e. poli-OH), poliaminas (í.e. poli-NH2) e ácidos policarboxílicos (i.e. poli-COOH) e ainda heteropolímeros, i.e. polímeros contendo um ou mais grupos de acoplagem e.g. um grupo hidroxilo e grupos amina. Exemplos de moléculas poliméricas adequadas incluem moléculas poliméricas seleccionadas entre óxidos de polialquileno (PAO) , tais como polialquilenoglicóis (PAG), incluindo polipropilenoglicóis (PEG), metoxipropileno-glicóis (mPEG) e polipropilenoglicóis, éteres de PEG-glicidilo (Epox-PEG), polietilenoglicóis (PEGs) ramificados com PEG-oxicarbonilimidazole (CDI-PEG), álcool polivinílico (PVA), policarboxilatos, polivilpirrolidona, poli-D,L-aminoácidos, polietileno-co-ácido maleico anidrido polistireno-co-ácido maleico anidrido, dextranos incluindo carboximetil-dextranos, heparina, albumina homóloga, celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, carboxietilcelulose e hidroxipropilcelulose, hidrolisados de quitosano, amidos tais como hidroxietil-amidos e hidroxipropil-amidos, glicogénio, agaroses e derivados das mesmas, goma de guar, pululano, inulina, goma xantano, carragenano, pectina, hidrolisados de ácido algínico e biopolímeros.
Tipicamente, os polímeros são óxidos de poli-alquileno (PAO), tais como óxidos de polietileno, tais como PEG, tipicamente mPEG, que comparativamente com polissa-cáridos tais como dextrano, pululano e similares, possuem poucos grupos reactivos capazes de ligação cruzada. Ti+icamente, as poli,erases são moléculas poliméricas não tóxicas tais como (m)polietilenoglicol (mPEG) que podem ser conjugadas covalentemente à enzima que degrada hialuronano (e.g. a grupos de ligação na superfície da proteína) usandp uma química relativamente simples.
Moléculas poliméricas adequadas para a ligação à enzima que degrada hialuronano incluem, mas não lhes estão limitados, polietilenoglicol (PEG) e derivados de PEG tais como metoxi-plietilenoglicóis (mPEG), éteres de PEG-glicidilo (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazole (CDI-PEG), PEGs ramificados e óxido de polietileno (PEO) (ver, e.g., Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 19 97; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003); and Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004). a molécula polimérica pode ter uma massa molecular tipicamente variando entre cerca de 3kDa e cerca de 60 kDa. Nalgumas realizações, a molécula polimérica que é conjugada com uma proteína, como seja rHuPH20, possui uma massa molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais de 60 kDa. Vários métodos de modificação de polipéptidos através da ligação covalente (conjugação) de um PEG ou derivado de PEG (i.e. "PEGuilação") são conhecidos na técnica (ver, e.g., U.S. 2006/0104968; U.S. 5,672,662; U.S. 6,737,505; e U.S. 2004/0235734). Técnicas de PEGuilação incluem, mas não lhes estão limitadas, elementos de ligação especializados e química de acoplagem (ver, e.g., Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), ligação de múltiplas fracções de PEG a um único local de ligação (como seja através do uso de PEGs ramificados; ver e.g., Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGuilação dirigida e/ou mono-PEGuilação (ver e.g., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), e PEGuilação enzimática dirigida (ver e.g., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002) (ver, também, por exemplo, Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and
Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95; ver também, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77, e Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). Métodos e técnicas descritas na técnica podem produzir proteínas tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais de 10 PEG ou derivados de PEG ligados a uma única molécula proteica (ver e.g., U.S. 2006/0104968).
Numerosos reagentes para PEGuilação foram des- critos na técnica. Tais reagentes incluem, mas não lhes estão limitados, PEG activado com N-hidroxi-succinimidilo (NHS), succinimidil-mPEG, mPEG2-Nhidroxisuccinimida, mPEG succinimidil-alfa-metilbutanoato, mPEG succinimidilpropio-nato, mPEG succinimidilbutanoato, mPEG carboximetil 3-ácido hidroxibutanóico éster succinimidilo, PEG-succinimidilpro-pionato homobifuncional, PEG propionaldeido homobifuncio-nal, PEG butiraldeido homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrzida, p-nitrofenil-carbonato PEG, mPEG-benzotriazole carbonato, propionaldeido PEG, mPEG butiraldeido, mPEG2 butiraldeido ramificado, mPEG acetilo, mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG (sem elemento de ligação" maleimida, mPEG vinilsulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, mPEG ortopiridil dissulfeto, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona PEG-NHS, acriylato PEG-NHS, fluoresceina PEG-NHS, e biotina PEG-NHS (ver e.g., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; U.S. 5,672,662; U.S. 5,932,462; U.S. 6,495,659; U.S. 6,737,505; U.S. 4,002,531; U.S. 4,179,337; U.S. 5,122,614; U.S. 5, 183, 550; U.S. 5, 324 , 844; U.S. 5, 446, 090; U.S. 5,612,460; U.S. 5,643,575; U.S. 5,766,581; U.S. 5,795,569; U.S. 5,808,096; U.S. 5,900,461; U.S. 5,919,455; U.S. 5,985,263; U.S. 5,990,237; U.S. 6,113,906; U.S. 6,214,966; U.S. 6,258,351; U.S. 6,340,742; U.S. 6,413,507; U.S. 6,420,339; U.S. 6,437,025; U.S. 6,448,369; U.S. 6,461,802; U.S. 6,828,401; U.S. 6,858,736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; U.S. 2005/000360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; e WO 0187925). E. Métodos de produção de ácidos nucleicos codificadores de uma hialuronidase solúvel e seus polipéptidos
Os polipéptidos de uma hialuronidase solúvel aqui descrita podem ser obtidos através de métodos bem conhecidos na técnica da purificação de proteínas e expressão de proteína recombinante. Pode ser usados qualquer método conhecido na técnica para identificação de ácidos nucleicos que codificam os qenes pretendidos. Qualquer método disponível na técnica pode ser usado para obter um cDNA de tamanho completo (i.e., incluindo toda a reqião codificadora) ou clone de DNA qenómico codificador de uma hialuronidase, como seja a derivada de uma célula ou tecido. Hialuronidases modificadas ou variantes, podem ser manipuladas a partir de um polipéptido selvaqem, como seja por mutaqénese dirigida. Tipicamente, as hialuronidases, incluindo hialuronidases solúveis tais como rHuPH20, usadas nas co-formulações aqui proporcionadas podem ser produzidas por via recombinante ou podem ser purificadas ou parcialmente purificadas a partir de fontes naturais, tais como, por exemplo, a partir de extractos de testículo.
Os polipéptidos podem ser clonados ou isolados usando qualquer um dos métodos disponíveis conhecidos na técnica para clonagem e isolamento de moléculas de ácido nucleico. Tais métodos incluem amplificação por PCR de ácidos nucleicos e rastreio de bibliotecas, incluindo rastreio por hibridação de ácidos nucleicos, rastreio baseado em anticorpos e rastreio baseado na actividade.
Os métodos para amplificação de ácidos nucleicos podem ser usados para isolar moléculas de ácido nucleico codificadoras de um polipéptido pretendido, incluindo por exemplo, métodos de reacção em cadeia da polimerase. Um material contendo ácido nucleico pode ser usado como material de partida a partir do qual pode ser isolada uma molécula de ácido nucleico codificadora do polipéptido pretendido. Por exemplo, preparações de DNA e mRNA, extractos celulares, extractos de tecidos, amostras de fluidos (e.g., sangue, soro, saliva), amostras de indivíduos saudáveis e/ou doentes podem ser usados nos métodos de amplificação. As bibliotecas de ácidos nucleicos também podem ser usadas como fonte de material de partida. Podem ser desenhadas sequências iniciadoras para amplificar um polipéptido pretendido. Por exemplo, as sequências iniciadoras podem ser desenhadas com base nas sequências expressas a partir das quais é gerado um polipéptido pretendido. As sequências iniciadoras podem ser desenhadas com base na sequência de aminoácidos de um polipéptido. As moléculas de ácido nucleico geradas através da amplificação podem ser sequenciadas e confirmadas como codificadoras do polipéptido pretendido.
Sequências nucleotídicas adicionais podem ser ligadas a uma molécula de ácido nucleico codificadora de um polipéptido, incluindo sequências de elementos de ligação contendo locais para endonucleases de restrição para fins de clonagem do gene sintético num vector, por exemplo, um vector de expressão de proteínas ou um vector destinado à amplificação de sequências de DNA codificadoras da proteína nuclear. Ainda, sequências nucleotídicas adicionais especificando elementos de DNA funcionais podem ser ligadas operacionalmente a uma molécula de ácido nucleico codificsdora de polipéptidos. Exemplos de tais sequências incluem, mas não lhes estão limitadas, sequências de promotor destinadas a facilitar a expressão de proteína intracelular e sequências de secreção. Por exemplo sequências sinal heterólogas, destinadas a facilitar a secreção de proteínas, tais sequências são conhecidas dos familiarizados com a técnica. Outras sequências de resíduos de nucleotídicos tais como sequências de bases especificadoras de regiões de ligação também podem ser ligadas a moléculas de ácido nucleico codificadoras de enzimas. Tais regiões incluem, mas não lhes estão limitadas, sequências de resíduos que facilitam ou codificam proteínas que facilitam a internalização de uma enzima em células alvo específicas ou de outra forma alteram a farmacocinética de um produto de um gene sintético. Por exemplo, as enzimas podem ser ligadas a fracções de PEG.
Ainda, etiquetas ou outras fracções podem ser adicionadas, por exemplo, para ajudar na detecção ou purificação por afinidade do polipéptido. Por exemplo, sequências de resíduos nucleotídicos adicionais tais como sequência de bases que especificam um epitopo etiqueta ou outra marca detectável podem ser igualmente ligados a molécula de ácido nucleico codificadoras de enzimas. Exemplos de tais sequências incluem sequências de ácido nucleico codificadoras de uma etiqueta de His (e.g., 6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO :54) ou etiqueta Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO:55).
Os ácidos nucleicos identificados e isolados podem então ser inseridos num vector de clonagem adequado. Pode ser usado um grande número de sistemas vector-hospedeiro conhecidos na técnica. Vectores possíveis incluem, mas não lhes estão limitados, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema vector deve ser compatível com a célula hospedeira usada. Tais vectores incluem, mas não lhes estão limitados, bacteriófagos tais como derivados de lambda, ou plasmídeos tais como pVMV4, pBR322 ou derivados do plasmídeo pUC ou vector Bluescript (Stratagene, la Jolla, CA) . Outros vectores de expressão incluem o vector de expressão HZ24 aqui exemplificado. A inserção num vector de clonagem pode, por exemplo, ser conseguida através da ligação do fragmento de DNA num vector de clonagem que é complementar de extremos coesivos. A inserção pode ser efectuada usando vectores de clonagem TOPO (INVITROGEN, Carlsbad, CA) . Se os locais de restrição complementares usados para fragmentar o DNA não estiverem presentes no vector de clonagem, os extremos das moléculas de DNA podem ser modificadas enzimaticamente. Como alternativa, qualquer local pretendido pode ser produzido através da ligação de sequências nucleotídicas (adaptadores) nos extremos do DNA; estes adaptadores ligados podem conter oligonucleótidos específicos sintetizados quimicamente codificadores de sequências de reconhecimento por endonucleases de restrição. Num método alternativo, o vector cortado e o gene da proteína podem ser modificados por adição de caudas homopoliméricas. As moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras através, por exemplo, de transformação, transfecção, infecção, electroporação e sonoporação, de modo que muitas cópias da sequência do gene sejam geradas.
Em realizações específicas, a transformação de células hospedeiras com moléculas de DNA recombinante que incorporam a sequência do gene da proteína isolada, cDNA ou DNA sintetizado permite a geração de múltiplas cópias do gene. Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades através do crescimento de transformantes, isolamento das moléculas de DNA recombinante a partir dos transformantes e, quando necessário, recuperação do gene inserido a partir do DNA recombinante isolado. De um modo geral, as hialuronidases, incluindo as formas solúveis de PH20, são produzidas usando sistemas de expressão proteica que facilitam a correcta N-glicosilação para assegurar que o polipéptido mantém a actividade, uma vez que a glicosilação é importante para a actividade catalítica e estabilidade das hialuronidases. Tais célulaS incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) (e.g. células CHO DG44). 1. Vectores e células
Para a expressão recombinante de uma ou mais proteínas pretendidas, tais como qualquer uma aqui descrita, o ácido nucleico contendo a totalidade ou uma porção da sequência nucleotídica codificadora da proteína pode ser inserida num vector de expressão adequado, i.e., um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência inserida codificadora da proteína. Os sinais necessários à transcrição e tradução também podem ser fornecidos pelo promotor nativo dos genes das enzimas e/ou regiões flanqueantes das mesmas. São igualmente proporcionados vectores que possuem um ácido nucleico codificador da enzima. Células contendo os vectores são igualmente proporcionadas. As células incluem células eucarióticas e procarióticas e os vectores são qualquer um adequado para usar aqui. São proporcionadas células procarióticas e eucarióticas, incluindo células endoteliais, contendo os vectores. Tais células incluem células bacterianas, células de levedura, células de fungos, Archea, células vegetais, células de insecto e células animais. As células são usadas para produzir uma sua proteína através do crescimento das células atrás descritas em condições que permitem a expressão da proteína codificada e recuperação da proteína expressa. Pra esse fim, por exemplo, a enzima pode sr secretada para o meio. São proporcionados vectores que possuem uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido hialuronidase solúvel acoplado à sequência sinal nativa ou heteróloga, assim como mútiplas cópias dos mesmos. Os vectores podem ser seleccionados relativamente à expressão da proteína enzima na célula ou de modo que a proteína enzima seja expressa como proteína secretada.
Uma variedade de sistemas hospedeiro-vector pode ser usada para expressar a sequência codificadora da proteína. Estas incluem, mas não lhes estão limitadas, sistemas de células de mamífero infectadas com vírus (e.g. vírus da vacina, adenovirus e outros vírus); sistemas de células de insecto infectadas com vírus (e.g. baculovírus); microrganismos tais como leveduras contendo vectores de leveduras; ou bactérias transformadas com bacteriófago, DNA, DNA plasmídico ou DNA de cosmídeo. Os elementos de expressão de vectores variam nas suas forças e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro-vector usado, pode ser usados qualquer um de uma série de elementos de transcrição e tradução adequado.
Quaisquer métodos conhecidos dos familiarizados com a técnica para a inserção de fragmentos de DNA num vector pode ser usado para construir vectores de expressão contendo um gene quimérico contendo sinais adequados de controlo da transcrição/tradução e sequências codificadoras de proteínas. Estes métodos podem incluir técnicas in vitro de DNA recombinante e técnicas de síntese química e recombinantes in vivo (recombinação genética). A expressão de sequências de ácido nucleico codificadoras da proteína, ou domínios, derivados, fragmentos ou homólogos dos mesmos, podem ser reguladas através de uma segunda sequência de ácido nucleico de modo que os genes ou seus fragmentos sejam expressos num hospedeiro transformado com as moléculas de DNA recombinante. Por exemplo, a expressão de proteínas pode ser controlada através de qualquer promotor/estimulador conhecido na técnica. Numa realização específica, o promotor não é nativo dos genes de uma proteína pretendida. Os promotores que podem ser usados incluem, mas não lhes estão limitados, promotor precoce do SV40 (Bemoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), o promotor contido na repetição terminal longa 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), o promotor da timidina cinase de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1441-1445 (1981)), as sequências reguladoras do gene da metalotioneina (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expressão procarió-ticos tais como o promotor da β-lactamase (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5543) ou o promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:21-25 (1983) ) ; ver também "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980)); vectors de expressão em plantas contend o promotor da nopaline sintetase 3 (1984) ) ou o promotor do RNA 35S do virus do mosaic da couve-flor (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), e o promotor da enzima fotossintética ribulose bisfosfato carboxilase (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); elementos do promotor de levedura e de outros fungos tais como o promotor Gal4, o promotor da álcool desidrogenase, o promotor da fosfoglicerol cinase, o promotor da fosfatase alcalina e as seguintes regiões de controlo da transcrição animal que apresentam especificidade de tecido e que foram usados em animais transgénicos: região de controlo do gene da elastase I que é activa nas células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986);
MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); região de controlo do gene da insulina que está active nas células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), região de controlo do gene da imunoglobulina que está activo nas células linfoides (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), região de controlo do virus do tumor mamário de murganho que é activo em células testiculares, da mama, células linfoides e mastócitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (198 6) ) , região de controlo do gene da albumina que está activo no fígado (Pinckert et al., Genes and Devei. 1:268-276 (1987)), região de controlo do gene da alfa- fetoproteína que está activo no fígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), região de controlo do gene da alfa-1 antitripsina que está activo no fígado (Kelsey et al., Genes and Devei. 1:161-171 (1987)), região de controlo do gene da beta globina que está active em células mielóides (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), região de controlo do gene da proteína mielina básica que está activo nas células de oligodendrócitos do cérebro (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), região de controlo do gene do gene da cadeia leve 2 de miosina que está activo no músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), e região de controlo do gene da hormona de libertação da hormona gonadotrófica que está activo glândulas gonado tróficas do hipotálamo (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)).
Numa realização específica, usa-se um vector que contém um promotor ligado operacionalmente a ácidos nucleicos codificadores de uma proteína pretendida, ou domínio, fragmento, derivado ou homólogo da mesma, uma ou mais origens de replicação e, facultativamente, uma ou mais marcas de selecçõ (e.g., um genes de resistência a antibióticos). Exemplos de vectores plasmídicos para transformação de células de E. coli, incluem, por exemplo, os vectores de expressão pQE (disponíveis na Qiagen, Valencia, CA; ver também literatura publicada pela Qiagen descrevendo o sistema). Os vectores pQE possuem um promotor do fago T5 (reconhecido pela RNA polimerase de E. coli) e um duplo módulo de repressão do operador lac para proporcionar elevados níveis de expressão estreitamente regulada de proteínas recombinantes em E. coli, um local de ligação aos ribossomas sintético (RBS II) para tradução eficiente, uma sequência codificadora da etiqueta de 6XHis, terminadores de transcrição to e Tl, origem de replicação ColEl e um gene da beta-lactamase para conferir resistência à ampicilina. Os vectores pQE permitem a colocação de uma etiqueta de 6XHis no extremo N ou C da proteína recombinante. Tais plasmídeos incluem pQE 32, pQE 30 e pQE 31 que proporcionam múltiplos locais de clonagem para as três grelhas de leitura e proporcionam a expressão de proteínas com cauda de 6XHis n-terminal. Outros exemplos de vectores plasmídicos para transformação de células E. coli, incluem, por exemplo, os vectores de expressão pET (ver, patente U.S. U 4,952,496; disponível na NOVAGEN, Madison, WI; ver também literatura publicada pela Novagen descrevendo o sistema). Tais plasmídeos incluem pET 11a, que contém o promotor T71ac, terminador T7, o operador lac induzível de E. coli e o gene do repressor lac; pET 12a-c, que contém o promotor T7, o terminador T7 e o sinal de secreção ompT de E. coli; e pET 15b e pETl9b (NOVAGEN, Madison, WI), que possui uma sequência líder His-Tag™ para usar na purificação com uma coluna de His e um local de corte pela trombina que permite a clivagem após purificação na coluna, a região do promotor T7-lac e o terminador T7.
Exemplos de um vector para a expressão de células de mamífero é o vector de expressão HZ24. O vector de expressão HZ24 deriva do esqueleto do vector pCI (Promega). Possui DNA codificador do gene de resistência à beta- lactamase (AmpR), uma origem de replicação Fl, uma região de estimulador/promotor precoce imediato de citomegalovirus (CMV) e um sinal de poliadenilação tardio de SV40 (SV40). 0 vector de expressão também possui um local interno de entrada no ribossoma (IRES) do virus ECMV (Clontech) e o gene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murganho. 2. Expressão
Os polipéptidos de hialuronidase solúvel podem ser produzidos por qualquer método conhecido dos familiarizados com a técnica incluindo métodos in vivo e in vitro. As proteínas pretendidas podem ser expressas em qualquer organismo adequado para produzir as quantidades e as formas necessárias das proteínas, tais como por exemplo, necessárias para administração e tratamento. Os hospedeiros de expressão incluem organismos procarióticos e eucarióticos tais como E. coli, leveduras, plantas células de insecto, células de mamífero, incluindo linhas celulares humanas e animais transgénicos. Os hospedeiros de expressão podem diferir nos seus níveis de produção de proteína assim como nos tipos de modificações pós-tradução que estão presentes nas proteínas expressas. A escolha do hospedeiro de expressão pode ser feita com base nestes e noutros factores, tais como considerações reguladoras e de segurança, custos de produção e necessidade e métodos para purificação.
Muitos vectores de expressão estão disponíveis e são conhecidos na técnica e podem ser usados para a expressão de proteínas. A escolha do vector de expressão será influenciada pela escolha do sistema de expressão do hospedeiro. Em geral, os vectores de expressão podem incluir promotores da transcrição e facultativamente estimuladores, sinais da tradução e sinais de terminação da transcrição e da tradução. Os vectores de expressão que são usados para a transformação estável tipicamente possuem uma marca seleccionável que permite a selecção e manutenção das células transformadas. Nalguns casos, uma origem de replicação pode ser usada para amplificar o número de cópias do vector.
Polipéptidos de hialuronidase solúvel também podem ser utilizados ou expressos como proteínas de fusão. Por exemplo, uma fusão de enzimas pode ser gerada para adicionar mais funcionalidade a uma enzima. Exemplos de proteínas de fusão de enzimas incluem, mas não lhes estão limitados, fusões de uma sequência sinal, uma etiqueta como seja para localização, e.g. uma etiqueta de his6 ou uma etiqueta myc ou uma etiqueta para purificação, por exemplo, uma fusão com GST e uma sequência para dirigir a secreção da proteína e/ou associação a membranas. a. Células procariótlcas
Procariotas, especialmente E. coli, proporcionam um sistema para a produção de grandes quantidades de proteínas. A transformação de E. coli é uma técnica simples e rápida bem conhecida dos familiarizados com a técnica. Os vectores de expressão para E. coli podem conter promotores induzíveis, tais promotores são fúteis para indução de níveis elevados de expressão proteica e para a expressão de proteínas que apresentam alguma toxicidade para as células do hospedeiro. Exemplos de promotores induzíveis incluem o promotor lac, o promotor trp, o promotor híbrido tac, os promotores de T7 e SP6 e o promotor regulável pela temperatura ÀPL.
Proteínas, tais como quaisquer umas aqui proporcionadas, podem ser expressas no ambiente citoplasmático de E. coli. 0 citoplasma é um ambiente redutor e para algumas moléculas, isto pode resultar na formação de corpos de inclusão insolúveis. Agentes redutores tais como ditiotreitol e β-mercaptoetanol e desnaturantes, tais como guanidina-HCl e ureia podem ser usados para voltar a solubilizar as proteínas. Uma abordagem alternativa é a expressão de proteínas no espaço periplásmico de bactérias que proporciona um ambiente oxidante e do tipo chaperonina e isomerases dissulfeto e pode conduzir à produção de proteína solúvel. Tipicamente, uma sequência líder é fundida com a proteína a ser expressa que dirige a proteína para o periplasma. 0 líder é então removido por peptidases sinal dentro do periplasma. Exemplos de sequências líder de direccionamento para o periplásmico incluem o líder pelB do gene da pectato liase e o líder derivado do gene da fosfatase alcalina. Nalguns casos, a expressão periplas-mática permite a saída da proteína expressa para o meio de cultura. A secreção de proteínas permite purificação rápida e simples a partir do sobrenadante de cultura. As proteínas que não são secretadas podem ser obtidas a partir do periplasma por lise osmótica. À semelhança da expressão citoplasmática, nalguns casos as proteínas podem tornar-se insolúveis e podem ser usados desnaturantes e agentes redutores para facilitar a solubilização e re-enrolamento. A temperatura de indução e crescimento também pode influenciar os níveis de expressão e solubilidade, tipicamente temperaturas entre 25°C e 37°C são usadas. Tipicamente, as bactérias produzem proteínas aglicosiladas. Assim, se as proteínas necessitarem de glicosilação para funcionarem, a glicosilação pode ser adicionada in vitro após purificação a partir das células hospedeiras. b. Células de levedura
As leveduras tais como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyve-romyces lactis e Pichia pastoris são hospedeiros de expressão em levedura bem conhecidos que podem ser usados para a produção de proteínas, como sejam qualquer uma aqui descrita. As leveduras podem ser transformadas com vectores replicativos epissómicos ou através de integração estável no cromossoma por recombinação homóloga. Tipicamente, os promotores induzíveis são usados para regular a expressão génica. Exemplos de tais promotores incluem GAL1, GAL7 e GAL5 e os promotores da metalotioneína, tais como CUP1, AOXl ou outro promotor de Pichia ou de outra levedura. Os vectores de expressão frequentemente incluem uma marca seleccionável como seja LEU2, TRPl, HIS3 e URA3 para selecção e manutenção do DNA transformado. As proteínas expressas em levedura são frequentemente solúveis. A co-expressão com chaperoninas tais como Bip e proteína dissulfeto isomerase podem melhorar os níveis de expressão e solubilidade. Ainda, as proteínas expressas em levedura podem ser dirigidas para secreção usando fusões de péptidos sinal para secreção como seja o sinal de secreção do factor alfa de conjugação de levedura de Saccharomyces cerevisiae e fusões com proteínas da superfície celular de levedura tais como o receptor de adesão da conjugação de Aga2p ou a glucoamilase de Arxula adeninivorans. Um local de corte por protéases, como seja a protease Kex-2, pode ser introduzido para remover as sequências fundidas dos polipéptidos expressos à medida que saem da via de secreção. A levedura também é capz de fazer glicosilação nos motivos Asn-X-Ser/Tre. c. Células de insecto
As células de insecto, particularmente usando a expressão em baculovírus, são úteis para a expressão de polipéptidos tais como polipéptidos hialuronidase. As células de insecto expressam níveis elevados de proteína e são capazes de fazer a maioria das modificações pós-tradução usadas pelos eucariotas superiores. Os baculovírus possuem uma gama restrita de hospedeiros que melhora a segurança e reduz as preocupações sobre regulação no que respeita às expressão eucariótica. Vectores de expressão típicos usam um promotor para níveis de expressão elevados tais como os do promotor da poliedrina. Os sistemas de baculovírus normalmente usados incluem os baculovírus tais como o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) e o vírus da poliedrose nuclear de Bombyx mori (BmNPV) e uma linha celular de insecto como seja Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl). Para expressão em níveis elevados, a sequência nucleotídica da molécula a ser expressa é fundida imediatamente a jusante do codões de iniciação da poliedrina do vírus. Os sinais de secreção de mamífero são processos correctamente em células de insecto e podem ser usados para secretar a proteína expressa para o meio de cultura. Ainda, as linhas celulares de Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danausplexippus (DpNl) produzem proteínas com padrões de glicosilação semelhantes aos sistemas de células de mamífero.
Um sistema de expressão alternativo em células de insecto é o uso de células estavelmente transformadas. Linhas celulares tais como células Schneider 2 (S2) e Kc (Drosophila melanogaster) e células C7 (Aedes albopictus) podem ser usadas para a expressão. 0 promotor da metalotioneina de Drosophila pode ser usado para induzir níveis elevados de expressão na presença da indução com metais pesados com cádmio ou cobre. Os vectores de expressão são tipicamente mantidos através do uso de marcas seleccionáveis tais como neomicina e higromicina. d. Células de mamífero
Os sistemas de expressão de mamíferos podem ser usados para expressar proteínas incluindo plipéptidos hialuronidase solúvel. As construções de expressão podem ser transferidas para células de mamífero através da infecção virai, como seja com adenovirus, ou através de transferência directa de DNA, como seja através de lipossomas, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano e por meios físicos tais como electroporação e microinjecção. Os vectores de expressão para células de mamífero tipicamente incluem um local de "capping" do mRNA, uma caixa TATA, uma sequência de iniciação da tradução (sequência de consenso Kozak) e elementos de poliadenilação. Os elementos IRES também podem ser adicionados para permitir a expressão bicistrónica com um outro gene, como seja uma marca seleccionável. Tais vectores frequentemente incluem promotores-estimuladores da transcrição para expressão com níveis elevados, por exemplo o promotor-estimulador do SV40, o promotor de citomegalovírus (CMV) humano e a repetição terminal longa do írus do sarcoma de Rous (RSV). Estes promotores-estimuladores são activos em muitos tipos de células. Os promotores e as regiões estimuladoras específicas de tecidos e de células podem também ser usados para a expressão. Exemplos de regiões de promoto-res/estimuladores incluem, mas não lhes estão limitadas, as de genes tais como elastase I, insulina, imunoglobulina, vírus do tumor mamário murino, albumina, alfafetoproteína, alfa 1-antitripsina, betaglobina, proteína básica da mielina, cadeia leve da miosina 2 e do controlo do gene da hormona libertadora da gonadotropina. Marcas seleccionáveis podem ser usadas para seleccionar e manter células com a construção de expressão. Exemplos de genes de marcas seleccionáveis incluem, mas não lhes estão limitadas, fosfotransferase da higromicina B, adenosina desaminase xantina-guanina fosforrribosil transferase, aminoglicósido fosfotransferase, di-hidrofolato redutase (DHFR) e timidina cinase. Por exemplo, a expressão pode ser efectuada na presença de metotrexato para seleccionar apenas as células que expressam o gene DHFR. A fusão com moléculas de sinalização da superfície celular tais como TCR-ζ e FcsRI-γ podem dirigir a expressão das proteínas num estado activo na superfície celular.
Muitas linhas celulares estão disponíveis para a expressão em mamífero incluindo murganho, rato, humano, macaco, galinha e cobaio. Exemplos de linhas celulares incluem, mas não lhes estão limitadas, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NSO de murganho (não secretora) e outras linhas celulares de mieloma, linhas celulares de hibridoma e hetero-hibridoma, limfócitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, e HKB. Também existem linhas celulares adaptadas a meio sem soro que facilita a purificação das proteínas secretadas a partir do meio de cultura celular. Exemplos incluem células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012) e a linha celular EBNA-1 não dependente de soro (Pham et ai., (2003)
Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.)· Também existem linhas celulares adaptadas a crescimento em meios especiais optimizados para expressão máxima. Por exemplo, as células CHO DG44 estão adaptadas a crescimento em cultura em suspensão num meio quimicamente definido, meio sem produtos de origem animal. e. Plantas
Plantas e células de plantas transgénicas podem ser usadas para expressar proteínas como as aqui descritas. As construções de expressão são tipicamente transferidas para plantas usando transferência directa de DNA, como seja por bombardeamento com microprojécteis e transferência mediada por PEG para protoplastos e com transformação mediada por agrobactérias. Os vectores de expressão podem incluir sequências de promotor e de estimulador, elementos de terminação da transcrição e elementos de controlo da tradução. Os vectores de expressão e as técnicas de transformação são geralmente divididas em hospedeiros dicotiledóneas, tais como Arabidopsis e tabaco, e hospedeiros monocotiledóneas, tais como milho e arroz. Exemplos de promotores vegetais usados para a expressão incluem o promotor do virus do mosaico da couve-flor, o promotor da nopalina sintetase, o promotor da ribose bisfosfato carboxilase e os promotores da ubiquitina e UBQ3. Marcas seleccionáveis tais como higromicina, fosfo-manose isomerase e neomicina fosfotransferase são frequentemente usados para facilitar a selecção e manutenção das células transformadas. As células vegetais transformadas podem ser mantidas em cultura como células, agregados (tecido de calo) ou regeneradas em plantas completas. As células vegetais transgénicas podem incluir algas manipuladas para produzir polipéptidos de hialuronidase. Devido as plantas terem padrões de glicosilação diferentes das células de mamífero, isto pode influenciar a escolha de proteínas produzidas nestes hospedeiros. 3. Técnicas de purificação
Os métodos de purificação de polipéptidos, incluindo polipéptidos hialuronidase solúveis ou outras proteínas, a partir de células hospedeiras dependerão das células hospedeiras e sistemas de expressão escolhidos. Para as moléculas secretadas, as proteínas são geralmente purificadas a partir do meio de cultura após remoção das células. Para a expressão intracelular, as células podem ser lisadas e as proteínas purificadas a partir do extracto. Quando os organismos transgénicos, tais como plantas e animais transgénicos são usados para expressão, tecidos ou órgão podem ser usados como material de partida para preparar um extracto de lisado celular. Ainda, a produção de animais transgénicos pode incluir a produção de polipéptidos em leite ou ovos, os quais podem ser colhidos e, se necessário, as proteínas podem ser extraídas e ainda purificadas usando métodos convencionais da técnica.
Proteínas, tais como polipéptidos hialuronidase solúveis, podem ser purificados usando técnicas de purificação de proteína convencionais conhecidas na técnica incluindo, mas não lhes estando limitados, SDS-PAGE, fraccionamento por tamanho e cromatografia de exclusão por tamanho, precipitação com sulfato de amónio e cromatografia de permuta iónica, como seja cromatografia de permuta aniónica. As técnicas de purificação por afinidade também podem ser utilizadas para melhorar a eficiência e pureza das preparações, por exemplo, anticorpos receptores e outras moléculas que se ligam às enzimas hialuronidases podem ser usadas em purificação de afinidade. As construções de expressão também podem ser manipuladas para adicionar uma etiqueta de afinidade a uma proteína como seja fusão com epitopo myc, GST ou His6 e purificada com anticorpo contra myc, resina com glutationa e Ni-resina, respectivamente. A pureza pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica incluindo electroforese em gel e coloração e técnicas espectrofotométricas. F. Preparação, formulação e administração de Imunoglobullnas e pollpéptldos de hlaluronldase solúveis São aqui proporcionadas co-formulações de IG e hialuronidase que são estáveis como uma formulação liquida para períodos prolongados de tempo de pelo menos 6 meses a temperaturas até 32°C, por exemplo, variando entre cerca de 0°C e 32°C. 0 aumento da estabilidade caracteriza-se por melhoria do tempo de armazenamento, redução da fragmentação, decréscimo da formação de agregados, decréscimo da formação de dímeros ou/e decréscimo da descoloração, mantendo a actividade da IG e hialuronidase. Tais formulações podem ser proporcionadas como formulação liquida "pronta a usar" sem subsequente reconstituição e/ou sem necessidade de diluição adicional. As co-formulações estáveis resultantes podem ser convenientemente distribuídas pelos médicos ou doentes nas formas de dosagem para injecção directa ou administração. Por exemplo, as co-formulações podem ser infundidas ou injectadas em casa ou noutro local.
As hialuronidases solúveis que são co-formuladas com imunoglobulina permitem aumento da entrega de imuno-globulina nos locais pretendidos dentro do corpo através do auemnto da biodisponibilidade da imunoglobulina. Assim, as co-formulações atingem concentrações elevadas e/ou são mais rapidamente atingidas da imunoglobulina após administração subcutânea comparativamente com métodos convencionais de administração subcutânea, para proporcionar, por exemplo, uma resposta mais potente e/ou mais rápida para uma determinada dose. Ainda, co-formulações de IG contendo hialuronidase solúvel também permitem que doses mais baixas de IG sejam administradas atingindo uma determinada resposta com uma dose mais baixa de IG administrada. Finalmente, a capacidade de uma hialuronidase solúvel para estimular o fluxo global de fluidos no local da injecção ou infusão ou perto dele, pode também melhorar outros aspectos da entrega farmacológica associada. Por exemplo, o aumento no fluxo global de fluidos pode ajudar ao permitir que o volume de fluido injectado seja mais facilmente dispersos a partir do local de injecção (reduzindo potencialmente dor ou outras consequências adversas da injecção). Isto é particularmente importante para as infusões subcutâneas para permitir que doses mais elevadas sejam administradas. Para além do aumento da biodisponibilidade, a co-formulação de IG com hialuronidase proporciona uma via mais segura ou mais conveniente de administração comparativamente com vias de administração intravenosas convencionais.
As co-formulações aqui proporcionadas são estáveis durante períodos de tempo prolongados, incluindo a temperaturas variáveis. Por exemplo, as co-formulações aqui proporcionadas são estáveis e mantêm actividade da IG e hialuronidase a temperaturas até 32°C durante pelo menos 6 meses. Por exemplo, as co-formulações são estáveis às temperaturas do "frigorífico", por exemplo entre 2°C e 8°C, como seja a cerca de 4°C inclusive, durante pelo menos 6 meses a 4 anos, como seja 1 ano a 2 anos, por exemplo 6 meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 3 anos ou pelo menos 4 anos ou mais. Num outro exemplo, as co-formulações são estáveis e mantêm a actividade à temperatura ambiente, por exemplo entre 18°C e 32°C, de um modo geral entre 20°C e 32°C, como seja 28°C a 32°C, durante pelo menos 6 meses a 1 ano, por exemplo 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses ou pelo menos 1 ano ou mais.
Em particular, as co-formulações estáveis apresentam níveis baixos ou indetectáveis de agregação e/ou fragmentação de IG após armazenamento durante períodos de tempo definidos. Métodos para avaliar agregação e fragmentação são conhecidos dos familiarizados com a técnica e são exemplificados na secção G abaixo. De um modo geral, não mais de 0,5% a 5% de IG, por exemplo, não mais de 5%, não mais de 4%, não mais de 3%, não mais de 2%, não mais de 1% e, de um modo geral não mais de 0,5% de IG na co-formulação forma um agregado, como medido por HPSEC ou outros métodos, após armazenamento durante períodos de tempo definidos atrás.
Ainda, a IG e a hialuronidase nas co-formulações estáveis aqui proporcionadas mantêm uma ou mais actividades da actividade inicial da IG e hialuronidase antes do aramazenamento. Os familiarizados com a técnica conhecem as actividades de IG e hialuronidase e podem avaliar tais actividades. A secção G proporciona exemplos de actividades e ensaios para avaliar a actividade. Tipicamente, as co-formulações liquidas estáveis aqui proporcionadas mantêm após armazenamento pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais da actividade inicial da proteína antes do armazenamento, geralmente pelo menos 70% a 95% da actividade inicial. Por exemplo as co-formulações liquidas estáveis mantêm após armazenamento mais de 70 %, mais de 80 %, mais de 85 %, mais de90 %, mais de 95 %, mais de 98 %, mais de 99 % ou mais de 99,5 % da actividade inicial da respectiva proteína antes do armazenamento. 1. Formulações e dosagens
As co-formulações aqui proporcionadas são formuladas como líquidos. As co-formulações incluem imuno-globulina, hialuronidase, pelo menos 0,05M de um sal cloreto de metal alcalino, por exemplo, pelo menos 0,05M de cloreto de sódio (NaCl ou sal) ou 0,05 M de cloreto de de potássio (KCl). As co-formulações também são ajustadas no pH para limitar a agregação e manter a actividade da IG e hialuronidase. Nalguns exemplos, as co-formulações não incluem outros ingredientes excepto água ou outros solventes. Noutros exemplos, as co-formulações ainda incluem diluentes, veículos ou outros excipientes.
Tipicamente, os compostos são formulados em composições farmacêuticas usando técnicas e procedimentos bem conhecidos na técnica (ver e.g., Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fouth Edition, 1985, 126). Composições aceitáveis em termos farmacêuticos são preparadas atendendo às aprovações de uma agência reguladora ou outra agência de acordo com farmacopeia reconhecida para uso em animais e seres humanos. A formulação deverá ser adequada ao modo de administração.
As co-formulações podem ser proporcionadas como uma preparação farmacêutica na forma líquida como soluções, xaropes ou suspensões. Na forma líquida, as preparações farmacêuticas podem ser proporcionadas como uma preparação coentrada a ser diluída para uma cocnetração terapeuti- camente eficaz antes de ser usada. De um modo geral, as preparações são proporcionadas numa forma de dosagem que não requer diluição para ser usada. Tais preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos aceitáveis em termos farmacêuticos como agentes de suspensão (e.g., xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis) ; agentes emulsionantes (e.g. lecitina ou acácia); veículos não aquosos (e.g. óleo de amêndoas, ésteres oleosos ou óleos vegetais fraccionados); e conservantes (e.g., metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). Num outro exemplo, preparações farmacêuticas podem ser apresentadas na forma liofilizada para reconstituição com água ou com outro veículo adequado antes de serem usadas. 0 pH das co-formulações estáveis aqui proporcionadas é tal que a IG nas co-f ormulações não se agrega e/ou a IG e hialuronidase mantêm a actividade como descrito na Secção G. 0 pH óptimo pode ser obtido através de técnicas de formulação conhecidos com os familiarizados com a técnica. Por exemplo, o pH óptimo pode ser determinado através da avaliação da agregação e actividade em diferentes condições de pH usando vérios métodos conhecidos dos familiarizados com a técnica, por exemplo,como descrito na secção G. Tais ensaios ou avaliação incluem, mas não lhes estão limitados, cromatografia de exclusão por tamanho, determinações de HSPEC, dados de estabilidade ao calor, títulos anticomplemento das várias preparações e/ou ensaios de actividade de hialuronidase. Tipicamente, nas co-formulações aqui proporcionadas, o pH pode variar entre 4.0 e 8,0 como medido na solução concentrada da co-formulação livre. De um modo geral, dentro desta gama, pretende-se um pH mais baixo, no entanto, para assegurar um teor máximo de monómero. Assim, as co-formulações aqui proporcionadas tipicamente possuem um pH que é pelo menos 4.0 a 7,4 inclusive, geralmente pelo menos 4,0 a 6,0 inclusive e tipicamente 4,4 a 4,9. Conforme notado, o pH indicado é medido na solução coentrada da formulação. O pH pode ser ajustado usando agentes acidificantes para baixar o pH ou agentes alcalinizantes para aumentar o pH. Exemplos de agentes acidificantes incluem, mas não lhes estão limitados, ácido acético, ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, solução de fosfato de sódio monobásico e ácido fosfórico. Exemplos de agentes alcalinizantes incluem, mas não lhes estão limitados, solução de fosfato de sódio dibásico, carbonato de sódio ou hidróxido de sódio.
Qualquer tampão pode ser usado na preparação da formulação líquida aqui proporcionada desde que não afecte adversamente a estabilidade da co-formulação e suporte a gama de pH necessária. Exemplos de tampões particularmente adequados incluem tampões sucinato, acetato, fosfato, citrato, aconitato, malato e carbonato. Os familiarizados com a técnica, no entanto, reconhecerão que as formulações aqui proporcionadas não estão limitadas a um tampão particular, desde que o tampão proporcione um grau aceitável de estabilidade do pH ou "capacidade tamponante" na gama indicada. De um modo geral, um tampão possui uma capacidade tamponante adequada dentro de aproximadamente 1 unidade de pH do seu pK (Lachman et al. 1986). A adequação do tampão pode ser estimada com base nas tabelas de pK publicadas ou pode ser determinada empiricamente por métodos conhecidos na técnica. 0 pH da solução pode ser ajustado ao ponto pretendido dentro da gama descrita atrás, por exemplo usando qualquer ácido ou base aceitável. a. Imunoglobuliba A IG nas co-formulações é proporcionada numa concentração de é aproximadamente 5% a 22% p/v, por exemplo cerca de 50 mg/ml, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 120 mg/mL, 150 mg/mL, 180 mg/mL, 200 mg/mL, 220 mg/mL, 250 mg/mL ou mais. De um modo geral, a IG na co-formulação é proporcionada numa quantidade que é pelo menos 10 % (100 mg/mL) a 20 % (200 mg/mL), por exemplo, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19%, 20 % ou mais.
As preparações de imunoglobulina aqui proporcionadas podem ser formuladas como composições farmacêuticas para uso de dosagens simples ou múltiplas. Tipicamente, como aqui descrito algures, a IG na co-formulação é formulada numa quantidade tal que está pronta a usar e não sendo necessária diluição adicional. Dependendo da co-formulação ser proporcionada como formulação de dosagem simples ou múltipla, os familiarizados com a técnica podem determinar empiricamente a quantidade exacta de IG na co-formulação.
De um modo geral, a imunoglobulina é proporcionada numa quantidade eficaz em termos terapêuticos para o o regime de dosagem particular. A concentração eficaz em termos terapêuticos pode ser determinada empiricamente testando os compostos em sistemas on vitro e in vivo conhecidos, como sejam os ensaios aqui proporcionados. A concentração de uma imunoglobulina seleccionada na composição depende das taxas de absorção, inactivação e excreção do complexo, caracteristicas fisicoquimicas do complexo, esquema de dosagem e quantidade administrada, assim como outros factores conhecidos dos familiarizados com a técnica. Por exemplo, é entendido que a dosagem precisa e duração do tratamento é uma função do tecido a ser tratado e pode ser determinada empiricamente usando protocolos de ensaio conhecidos ou através de extrapolação a partir de dados de testes in vivo ou in vitro. Deve-se notar que os valores das concentrações e dosagens podem também variar com a idade do indivíduo a ser tratado. É ainda entendido que para qualquer indivíduo particular os regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e da avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das formulações e que as gamas de concentrações aqui estabelecidas são exemplificativas apenas e não pretendem limitar o âmbito da invenção. A quantidade de uma preparação de imunoglobulina seleccionada a ser administrada para o tratamento de uma doença ou condição, por exemplo uma doença ou condição tratável com IG, pode sr determinada através de técnicas clinicas convencionais. Ainda, ensaios in vitro e modelos animais podem ser empregues para ajudar a identificar as gamas de dosagem óptimas. Assim, a dosagem precisa, que pode ser determinada empiricamente, pode depender da preparação de imunoglo-bulina particular, do regime e esquema de dosagem com a hialuronidase solúvel, do tipo de doença a ser tratada e da gravidade da doença.
Por exemplo, as preparações de IG podem ser formuladas em composições farmacêuticas para conseguir regimes de dosagem (doses e frequências) para as quais as preparações intravenosas actuais (IVIG) são preparadas e administradas para doenças ou condições particulares tratáveis com IG. Os familiarizados com a técnica conhecem os regimes de dosagem para administração IVIG de doenças ou condições particulares. Por exemplo, a Secção H abaixo proporciona regimes de dosagem exemplificativos (doses e frequências) de IG para doenças e condições particulares. Outros regimes de dosagem são bem conhecidos dos familiarizados com a técnica. Se necessário, uma dosagem e duração e protocolo de tratamento particulares podem ser empiricamente determinados ou extrapolados.
Por exemplo, exemplos de doses de imunoglobulina administrada intravenosamente podem ser usados como ponto de partida para determinar as dosagens adequadas. Os niveis de dosagem podem ser determinados com base numa variedade de factores, tais como peso do corpo do indivíduo, saúde geral, idade, actividade do composto específico empregues, sexo, dieta, tempo de administração, velocidade de excreção, combinação de fármacos, gravidade e curso da doença e disposição do doente relativamente à doença e avaliação do médico assistente. De um modo geral, as dosagens de imunoglobulina são entre 100 mg/kg de peso do corpo (í.e. 100 mg/kg PC) a 2 g/kg PC. É entendido que a quantidade a ser administrada será uma função da indicação tratada e possivelmente efeitos secundários que serão tolerados. As dosagens podem ser empiricamente determinadas usando modelos reconhecidos para cada distúrbio.
Num exemplo, IG é proporcionada numa quantidade que permite a administração subcutânea de uma dose equivalente a uma dose mensal IV para a indicação particular a ser tratada.Em tal exemplo, as reparações de imunoglobulina podem ser formuladas para administração de dose simples numa quantidade suficiente para proporcionar uma dose mensal, mas pode ser proporcionada em quantidades inferiores para administração de dosagens múltiplas. Por exemplo, as preparações de IG nas doses mensais podem ser administradas diariamente, semanalmente, bissemanalmente ou uma vez por mês. Os regimes de dosagem podem ser continuados durante meses ou anos. A dose IV mensal particular é uma função da doença a ser tratada e assim pode variar.
Exemplos de dosagens simples, em particular para administração subcutânea de IG, são entre 1 grama (g) e 200 g, por exemplo, 1 grama (g) , 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g ou 200 g. A dosagem particular e formulação da mesma dependem da indicação e do indivíduo. Por exemplo, as dosagens podem ser administradas a 50 mg/kg peso do corpo (PC) to 600 mg/kg, PC, por exemplo 50 mg/kg peso do corpo (PC) , 100 mg/kg PC, 200 mg/kg BW, 300 mg/kg PC, 400 mg/kg PC, 500 mg/kg PC, 600 mg/kg PC ou mais. Se necessário, a dosagem pode ser determinada empiricamente. Para atingir tais dosagens, os volumes de co-formulações contendo IG administradas subcutaneamente podem ser de aproximadamente 10 ml a 700 ml, por exemplo, 100 ml a 500 ml, como seja 200 ml a 400 ml. Por exemplo, os volumes de co-formulações contendo IG administrados subcutaneamente podem ser de aproximadamente 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 60 0 ml, 700 ml ou mais para administração de dosagem simples. Por exemplo, uma co-formulação de 10% de IG líquida (100 mg/ml) para indicações aqui descritas pode ser administrada num volume de 200 ml a 700 ml para se atingir uma dosagem simples de 2 0 g a 7 0 g de IG. Num outro exemplo, uma co-formulação líquida de 20% de IG (200 mg/ml) para indicações aqui descritas pode ser administradas num volume de 100 ml a 350 ml para se conseguir uma dosagem simples semelhante de 20 g a 70 g de IG. Como notado, IG pode ser proporcionada em quantidades inferiores na co-formulação para administrações de dosagem múltipla. b. Hialuronidase A hialuronidase seleccionada, em particular uma hialuronidase solúvel, por exemplo rHuPH20, é incluída na co-formulação numa concentração que é cerca de 50 U/ml to 300 U/ml, por exemplo 50 U/ml, 75 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml ou 500 U/ml, tipicamente pelo menos 100 U/ml a 300 U/ml, geralmente numa concentração que é 75 U/ml a 350 U/ml. Caso se pretenda, a hialuronidase pode ser proporcionada numa forma mais concentrada, por exemplo a cerca de 1000 U/ml a 5000 U/ml, como seja 1000 U/ml, 1500 Units/ml, 2000 U/ml, 4000 U/ml ou 5000 U/ml. A hialuronidase na co-formulação pode ser formulada como uma composição farmacêutica para administração de dosagem simples ou múltipla. Como notado atrás para IG, a hialuronidase na co-formulação tipicamente é formulada numa quantidade pronta a usar de modo a não ser necessária diluição adicional. Dependendo da formulação ser proporcionada como forma de dosagem simples ou múltipla, os familiarizados com a técnica podem determinar empiricamente a quantidade exacta de hialuronidase para incluir a co-formulação.
Geralmente, a hialuronidase seleccionada, em particular uma hialuronidase solúvel, por exemplo, rHuPH20, é incluída na co-formulação numa quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil da IG na ausência de efeitos secundários indesejáveis no doente tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente testando os polipéptidos em sistemas in vitro e in vivo conhecidos, como seja usando ensaios aqui proporcionados ou conhecidos na técnica (ver, e.g., Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996)
Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza et al. (1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem. 247:242-246; ver também e.g., Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207 e depois extrapolados para dosagens humanas.
Por exemplo, uma dose eficaz em termos terapêuticos de hialuronidase para administração de dosagem simples é aproximadamente 500 Unidades a 500,000 Unidades, por exemplo, 1000 Unidades a 100000 Unidades de hialuronidase. Por exemplo, a hialuronidase pode ser administrada, em particular para administração subcutânea, a aproximadamente 500 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 5000 Unidades, 10,000 Unidades, 30,000 Units, 40,000 Unidades, 50,000 Unidades, 60,000 Unidades, 70,000 Unidades, 80,000 Unidades, 90,000 Unidades, 100,000 Unidades ou mais. Conforme notado, a hialuronidase pode ser proporcionada em quantidades inferiores na co-formulação para administrações de dosagem múltiplas.
Nalguns exemplos, podem ser proporcionadas dosagens como uma proporção de IG administrada. Por exemplo, a hialuronidase pode ser administrada a 10U/grama (g) a 2000 U/g ou mais de IG, por exemplo, a aproximadamente 10 U/g, 20 U/g, 30U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 250 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g, 1000 U/g, 1500 U/g, 2000 U/g, 3000 U/g IG ou mais. Em geral, a proporção de hialuronidase para IG num produto co-formulado é superior à proporção quando os mesmos produtos (IG e hialuronidase) e a mesma quantidade de IG são administrados subcutaneamente separadamente, por exemplo, numa administração de vanguarda. Assim, de um modo geral a proporção é pelo menos 100 U/g e geralmente 250 U/g ou mais, por exemplo 100 U/g a 3000 U/g IG, como seja 250 U/g a 1000 U/g, e em particular 250U/g a 750 U/g, como seja 500 U/g IG. Por exemplo, uma co-formulação contendo 100 U/ml de hialuronidase, quando co-formulada com 20% IG (200 mg/ml), é proporcionada numa proporção que é aproximadamente 500 U/g de IG. Tipicamente, os volumes administrados subcutaneamente pode ser aproximadamente 10 ml a 700 ml, como seja 50 ml a 500 ml, por exemplo 100 ml a 400 ml para administração de uma dosagem simples. Por exemplo, os volumes administrados subcutaneamente podem ser cerca de 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml ou mais para administração de dosagem simples. c. Sal cloreto de metal alcalino A co-formulação aqui proporcionada inclui um sal cloreto de metal alcalino que é pelo menos 0,05M. 0 sal cloreto de metais alcalinos inclui, mas não lhes está limitado, cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de potássio (KCl) . Tipicamente, o sal cloreto de metal alcalino, por exemplo NaCl ou KCl, é proporcionado para reter a estabilidade e actividade da hialuronidase. A quantidade exacta de sal pode ser empiricamente determinada pelos familiarizados com a técnica. Por exemplo, a quantidade de sal nas formulações pode ser determinada através da avaliação da agregação e actividade em diferentes condições de sal usando vários métodos conhecidos dos familiarizados com a técnica, por exemplo, como descrito na Secção G. Tipicamente, nas co-formulações aqui proporcionadas, o cloreto de sódio é proporcionado numa quantidade que é aproximadamente 0,05M a 0,3M, por exemplo, a cerca de 0, 05M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M ou mais. Tipicamente, a quantidade de sal é entre 0,05 M a 0,25 M, por exemplo 0,15 M. d. Aminoácido estabilizador A co-formulação aqui proporcionada inclui um aminoácido estabilizador, o qual contribui para a estabilidade da preparação. O estabilizador pode ser um aminoácido não polar e básico. Exemplos de aminoácidos não polares e básicos incluem, mas não estão limitados a alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina e prolina. Por exemplo, o aminoácido estabilizador é glicina ou prolina, tipicamente glicina. 0 estabilizador pode ser um único aminoácido ou pode ser uma combinação de 2 ou mais desses aminoácidos. Os aminoácidos estabilizadores podem ser aminoácidos naturais, análogos de aminoácidos, aminoácidos modificados ou eguivalentes de aminoácidos. De um modo geral, o aminoácido é um L-amino-ácido. Por exemplo, quando se usa prolina como estabilizador, é geralmente L-prolina. É igualmente possível usar equivalentes de aminoácidos, por exemplo, análogos de prolina.
De um modo geral, uma quantidade de um ou mais aminoácidos eficaz para manter a imunoglobulina na forma monomérica é adicionada à solução. A concentração do estabilizador aminoácido, por exemplo glicina, incluída na co-formulação líquida varia entre 0,1 M e 1 M de aminoácido, tipicamente 0,1 M a 0,75 M, geralmente 0,2M a 0,5M, por exemplo, pelo menos cerca de 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,75 M ou mais. O aminoácido, por exemplo glicina, pode ser usado na forma de um sal aceitável em termos farmacêuticos, como seja cloreto, brometo, sulfato, acetato, etc. A pureza do aminoácido, por exemplo glicina, deverá ser pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,5% ou mais. e. Outros agentes
Facultativamente, as co-formulações podem incluir veículos tais como um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com os quais uma hialuronidase ou IG é administrada. Exemplos de tais veículos aceitáveis em termos farmacêuticos estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Tais composições incluirão uma quantidade eficaz em termos farmacêuticos do composto, de um modo geral na forma purificada ou na forma parcialmente purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veiculo de modo a fornecer a forma adequada para administração ao doente. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, como seja óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e óleo de sésamo. A água é um veículo típico quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções salinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol podem ser empregues como veículos líquidos, particularmente para soluções injectáveis.
Por exemplo, veículos aceitáveis em termos farmacêuticos usados em preparações parentéricas incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimi-crobianos, agentes isotónicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e de dispersão, agentes emulsionantes, agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias aceitáveis em termos farmacêuticos.
Exemplos de veículos aquosos incluem cloreto de sódio para injecção, solução de Ringer, desxtrose isotónica para injecção, água estéril para injecção, dextrose e solução de Ringer lactada para injecção. Veículos parentéricos não aquosos incluem óleos fixados de origem vegetal, óleo de algodoeiro, óleo de milho, óleo de sésamo e óleo de amendoim. Os agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas podem ser adicionados a preparações parentéricas embaladas em contentores de múltiplas doses, as quais incluem fenóis ou cresóis, mercúrios, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres do ácido metil e propil p-hidroxibenzóico, timerosal, cloreto de benzalcónio e cloreto de benzetónio. Os agentes isotónicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Os tampões incluem fosfato e citrato. Os antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais incluem hidrocloreto de procaina. Os agentes de suspensão e dispersão incluem carboximetilcelulose sódica, hidroxipropilmetilcelulose e polivinilpirrolidona. Os agentes emulsionantes incluem Polysorbate 80 (TWEENs 80) . Um agente de sequestração ou quelante de iões metálicos inclui EDTA. Os veículos farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietile-noglicol e propilenoglicol para veículos miscíveis em água e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido láctico para ajuste do pH.
As composições podem conter juntamente com um ingrediente activo: um diluente como seja lactose, sucrose, fosfato dicálcico ou carboximetilcelulose; um lubrificante, como seja estearato de magnésio, estearato de cálcio e talco; e um agente de ligação como seja amido, gomas naturais, como seja goma de acácia-gelatina, glucose, melaço, polivinilpirrolidona, celuloses e seus derivados, povidona, crospovidonas e outros agentes de ligação conhecidos dos familiarizados com a técnica.
Por exemplo, uma proteína excipiente pode ser adicionada à co-formulação que pode ser qualquer uma de uma várias proteínas ou péptidos aceitáveis em termos terapêuticos. De um modo geral, a proteína excipiente é seleccionada pela sua capacidade para ser administrada a um mamífero sem provocar uma resposta imune. Por exemplo, albumina sérica humana é adequada para usar em formulações farmacêuticas. Outros excipientes proteicos farmacêuticos conhecidos incluem, mas não lhes estão limitados, amido, glucose, lactose, sucrose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, glicerol monostearato, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propilenoglicol, água e etanol. 0 excipiente é incluído na formulação numa concentração suficiente para evitar a adsorção da proteína ao recipiente ou frasco. A concentração do excipiente variará de acordo com a natureza do excipiente e com a concentração da proteína na co-formulação.
Caso se pretenda, uma composição também pode conter quantidades pequenas de agentes molhantes ou emulsionantes ou agentes tamponantes do pH, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrinas, monolaurato de sorbitano, trietanolamina acetato de sódio, oleato de trietanolamina e outros desses agentes. 2. Formas de dosagem
As co-formulações aqui proporcionadas podem ser formuladas como formas de dosagem simples ou múltiplas. Por exemplo, uma vez que a co-formulação aqui proporcionada é estável ao longo de periodos de tempo prolongados, a co-formulação pode ser proporcionada na forma de dosagem múltipla para administração ao longo de um intervalo de dias, semanas, meses ou anos. Assim, a co-formulação líquida pode ser preparada como formas unitárias de dosagem. A concentração do composto activo em termos farmacêuticos é ajustada de modo a que a injecçãp proporcione uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico pretendido. Por exemplo, cada dose unitária contém uma quantidade pré-determinada de composto activo em termos farmacêuticos para produzir o efeito terapêutico pretendido, em associação com o veiculo ou diluente farmacêutico necessário. A dose exacta depende da idade, peso e condição do doente ou animal como conhecido na técnica.
Formas de dose unitária podem ser administradas em fracções ou múltiplos das mesmas. Uma forma de doses múltipla é uma pluralidade de formas de doses unitárias idênticas embaladas num único contentor para serem administradas na forma de dose unitária segregada. Assim, a forma de doses múltiplas é um múltiplo de doses unitárias que não estão segregadas na embalagem.
As preparações parentéricas de dose unitária são embaladas numa ampola, frasco ou seringa com uma agulha. 0 volume de solução líquida contendo o composto activo em termos farmacêuticos é uma função da doença a ser tratada e do artigo particular escolhido pelo fabricante para embalagem. Todas as preparações para administração parentérica devem ser estéreis, como é conhecido na prática da técnica. Quando proporcionadas como uma preparação de múltiplas doses, a formulação pode conter um agente bacteriostático. 3. Administração
As composições co-formuladas aqui proporcionadas tipicamente são formuladas para administração parentérica, por exemplo, através de via subcutânea. Devido à crescente biodisponibilidade de IG nas co-formulações com hialuroni-dase, as imunoglobulinas podem ser administradas subcuta-neamente em dosagens e frequências para as quais as preparações intravenosas actuais (IVIG) são preparadas e administradas. As vantagens de IG relativamente às formulações subcutâneas actuais são que a hialuronidase/IG co-formuladas pode resultar em regimes de dosagem mais favoráveis, por exemplo dosagem menos frequente. Por dosagem menos frequente ou inferior, os efeitos secundários associados com toxicidade podem ser reduzidos. De um modo geral, a farmacocinética e/ou farmacodinâmica da terapia IG subcutânea é melhorada. Ainda, as administrações subcutâneas de IG também possuem vantagens relativamente a infusões intravenosas. Por exemplo, a infusão subcutânea permite a infusão pelo doente ou familia em oposição a uma enfermeira experiente; a infusão pode ser conseguida a velocidades mais elevadas de modo que IG seja infundida em 1-3 horas comparativamente com 5-10 horas para as terapias IVIG convencionais; não existe necessidades de veias funcionais; não existem efeitos secundários relacionados com a infusão tais como trombose, dor de cabeça, tromboflebite e náusea e menos probabilidade de eventos adversos; e a infusão pode ser realizada em casa ou noutro local. A administração subcutânea também é pretendida para assegurar que as hialuronidases sejam administradas de modo a atingirem o interstício da pele ou tecidos, degradando assim o espaço intersticial para subsequente entrega de imunoglobulina. Assim, é considerada a administração directa sob a pele, como seja por métodos de administração subcutânea. A administração pode ser local, tópica ou sistémica dependendo do locus do tratamento. A administração local numa área necessitada de tratamento pode ser conseguida por exemplo através de infusão local, aplicação tópica, e.g., conjuntamente com um penso numa ferida após cirurgia, por injecção, através de um cateter, por meio de um supositório ou por meio de um implante, mas não lhes estando limitados. De um modo geral, a administração local é conseguida por injecção, como seja com uma seringa ou outro item do fabricante contendo um sistema de injecção, como seja uma agulha. Num outro exemplo, a administração local pode ser conseguida por infusão, a qual pode ser facilitada pelo uso de uma bomba ou de outro dispositivo semelhante.
Outros modos de administração são igualmente contemplados. A composição farmacêutica pode ser formulada em formas de dosagem adequadas a cada via de administração. A via mais adequada em qualquer caso depende de uma variedade de factores, tais como a natureza da doença, o progresso da doença, a gravidade da doença, a composição particular que é usada. Outras vias de administração, como seja qualquer via conhecida dos familiarizados com a técnica, incluem, mas não lhes estão limitadas, injecção intramuscular, intravenosa, intradérmica, intralesional, intraperitoneal, epidural, nasal, oral, vaginal, rectal, tópica, local, ótica, inalação, bucal (e.g., sublingual), e administração transdérmica ou qualquer via. As formulações adequadas para tais vias são conhecidas dos familiarizados com a técnica.
As composições também podem ser administradas com outros agentes biologicamente activos, sequencialmente, intermitentemente ou na mesma composição. A administração também pode incluir sistemas de libertação controlada incluindo formulações de libertação controlada e libertação controlada por dispositivo, como seja através de uma bomba. A administração subcutânea, de um modo geral caracterizada através da injecção ou da infusão, é igualmente considerada. Os injectáveis podem ser preparados de formas convencionais, soluções liquidas ou suspensões, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em liquido antes da injecção ou como emulsões. De um modo geral, as co-formulações aqui proporcionadas são preparadas como líquidos, os injectáveis destinam-se a administração local ou sistémica. Para os fins da presente invenção, a administração local é desejável para administração directa do interstício afectado. As preparações para administração parentérica incluem as soluções estéreis prontas para injecção, produtos solúveis secos estéreis, tais como pós liofilizados, prontos a serem combinados com um solvente imediatamente antes de usar, incluindo comprimidos hipo-dérmicos, suspensões estéreis prontos para injecção, produtos insolúveis secos estéreis prontos a ser combinados com um veículo imediatamente antes de usar e emulsões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não aquosas. Se administradas intravenosamente, os veículos adequados incluem soro fisiológico ou soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS) e soluções contendo agentes espessantes e solubilizantes, tais como glucose, polietilenoglicol e polipropilenoglicol e misturas dos mesmos. Métodos de administração podem ser empregues para reduzir a exposição de compostos seleccionados para processos de degradação, tais como degradação proteolítica e intervenção imunológica via respostas antigénicas e imunogénicas. Exemplos de tais métodos incluem administração local no local do tratamento. A peguilação de fármacos tem sido descrita como aumentando a resistência a proteólise, aumento da semivida no plasma e redução da antigenicidade e imunogenicidade. Exemplos de metodologias de pequilação são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Felix et; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154:3088-95, 1995; ver também, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 and Molineux (2003) Pharmacotherapy 23(8 Pt 2):3S-8S). A peguilação pode também ser usada na entrega de moléculas de ácido nucleico in vivo. Por exemplo, peguilação de adenovirus pode aumentar a estabilidade e transferência de genes (ver, e.g., Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51).
Quando grandes volumes são administrados, a administração é tipicamente através de infusão. Os individuos podem ser doseados a velocidades de infusão de aproximadamente 0,5 ml/kg/PC/h a 5 ml/kg/PC/h, por exemplo a cerca de 0,5 ml/kg/PC/h, 1 ml/kg/PC/h, 2 ml/kg/PC/h, 3 ml/kg/PC/h, 4 ml/kg/PC/h, ou 5 ml/kg/PC/h. A velocidade de infusão pode ser determinada empiricamente e, tipicamente, é uma função da tolerabilidade do indivíduo. Caso ocorra uma reacção adversa durante a infusão, a velocidade de infusão pode ser retardada para a velocidade imediatamente baixo daquela em que ocorreu o efeito adverso. Se o evento adverso se resolver em resposta à redução da velocidade, a velocidade de infusão pode ser elentamente aumentada de acordo com a vontade do médico. A infusão subcutânea das co-formulações de IG pode ser facilitada pela gravidade, infusão com bomba ou injecção de uma dose pretendida, por exemplo, uma dose de 20-30 gramas. De um modo geral, para as infusões podem ser empregues bombas de infusão intravenosa. As co-formulações de IG/hialuronidase podem ser infundidas a velocidades de aproximadamente 5 ml/h, 10 ml/h, 30 ml/h, 60 ml/h, 120 ml/h, 240 ml/h ou 300 ml/h. As velocidades de infusão podem ser aumentadas no decurso do tratamento desde que a infusão seja tolerada pelo doente. De um modo geral, o tempo de administração da infusão +e cerca de 0,5h, 1 h, l,5h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h ou mais. Devido à elevada velocidade de infusão conseguida por administração subcutânea de IG co-formulada com hialuro-nidase, o tempo de infusão +e significativamente inferior ao das terapias IVIG convencionais. Quando o tempo de infusão excede o limite pretendido, um segundo local de infusão pode ser iniciado pelo médico e de acordo com o indivíduo, O segundo local tipicamente é iniciado a pelo menos 10 cm do local inicial.
As técnicas para infusão são conhecidas dos familiarizados com a técnica e estão dentro das capacidades do médico assistente. De um modo geral, a dose adequada da co-formulação IG/hialuronidase pode ser reunida num saco IV convencional. Por exemplo, pode-se usar um sistema de infusão não ventilado que é uma porta Y perto do seu extremo. Uma agulha de infusão subcutânea de 24 gauge pode ser inserida num local de preferência do indivíduo, mas o abdómen e depois a coxa são recomendados devido ao volume de solução a ser infundida. A hialuronidase e IG podem ser proporcionadas no mesmo sistema porta Y. Outros artigos do fabricante podem também ser usados para fins de infusão por gravidade ou uma bomba, e incluem, mas não lhes estão limitadas, tubos, frascos, seringas ou outros contentores.
No caso de uma infusão não ser tolerada (e.g., causa reacções locais moderadas a graves), um segundo local de infusão pode ser iniciado de modo que o indivíduo receba a dosagem completa.
Ainda, é entendido que as co-formulações estáveis aqui proporcionadas são adequadas a regimes de dosagem envolvendo uma frequência periódica de administração. Por exemplo, a frequência de dosagem pode ser diária ao longo de um intervalo de tempo dada em dias consecutivos ou alternativos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias. Noutros exemplos, o regime de dosagem é semanal, por exemplo, uma vez por semana, cada duas semanas, cada três semanas, cada quatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas ou mais. Assim, uma preparação de IG/hialu-ronidase pode ser administrada de uma só vez ou pode ser dividida numa série de pequenas doses a serem administradas em intervalos de tempo. Preparações de IG/hialuronidase seleccionadas podem ser administradas numa ou mais doses no decurso de um tempo de tratamento, por exemplo durante várias horas, dias, semanas ou meses. Nalguns casos, a administração contínua é útil. Deve-se compreender que a dosagem precisa e curso de administração dependem da indicação e tolerabilidade do doente.
Igualmente, deve-se entender que a dosagem precisa e duração do tratamento é uma função da doença a ser tratada e pode ser determinada empiricamente usando protocolos conhecidos ou através de extrapolação dos dados de testes in vivo ou in vitro. Deve-se notar que os valores de concentrações e dosagem podem também variar com a gravidade da condição ser aliviada. Deve-se entender que para qualquer indiv+iduo particular, os regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo coma necessidade individual e avaliação profissional de quem administra ou supervisiona a administração das composições e que as gamas de concentrações aqui estabelecidas são exemplificativas apenas e não pretendem limitar o âmbito ou uso de composições e combinações que os incluem. As composições podem ser administradas hora a hora, diariamente, semanalmente, mensalmente, anualmente ou uma vez. De um modo geral, os regimes de dosagem são escolhidos para limitar a toxicidade. Deve-se notar que o médico assistente saberá como e quando terminar, interromper ou ajustar a terapia a dosagem mais baixa devido à toxicidade ou disfunções da medula óssea, fígado ou rim ou de outros tecidos. Pelo contrário, o médico assistente também saberá como e quando ajustar o tratamento a níveis mais altos se a resposta clínica não for adequada (evitando efeitos secundários tóxicos). G. Métodos de avaliação da estabilidade, actividade, biodisponibilidade e farmacocinética A estabilidade e actividade de IG e hialuronidase nas formulações podem ser avaliadas usando vários ensaios in vitro e in vivo que são conhecidos dos familiarizados com a técnica. Várias técnicas analíticas para medição da estabilidade proteica estão disponíveis na técnica e revistas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993). A estabilidade pode ser medida a uma temperatura seleccionada durante um período de tempo seleccionado.
Os ensaios para avaliar o tamanho molecular (e.g. causado pela agregação, desnaturação e/ou fragmentação) da IG é uma consideração importante para avaliação da estabilidade da co-formulação. Ainda, a estabilidade das formulações líquidas também pode ser avaliada através de quaisquer ensaios para medir a actividade biológica de IG e hialuronidase na formulação. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Para além de avaliar a estabilidade da co-formulação, tais ensaios podem ser usados, por exemplo, para determinar as dosagens adequadas de imunoglobulina e hialuronidase e a frequência de dosagem, para tratamento. Ainda, ensaios conhecidos dos familiarizados com a técnica podem ser realizadas para avaliar as propriedades farmac-ocinéticas da imunoglobulina administrada subcutaneamente, incluindo biodisponibilidade e tolerabilidade. 1. Massa molecular 0 principal parâmetro indicador da estabilidade é a massa molecular e uma alteração no tamanho pode ser o resultado da degradação através de desnaturação, agregação ou fragmentação. A agregação de IG é um problema comum durante o armazenamento de produtos IG. Os agregados são problemáticos devido a poderem combinar com o complemento no sangue do doente e produzir uma reacção anticomplemento. A capacidade de IG se ligar ao complemento é grandemente aumentada como resultado da desnaturação, em particular através da agregação com espécies de massa molecular elevada. 0 mecanismo de ligação ao complemento destes agregados parece ser idêntico ao dos complexos antigénio-anticorpo. Marcus, D. M., (1960) J. Immunol. 84:273-284. No caso de IgG, sabe-se que o local de ligação ao complemento requere duas moléculas juntas. É portanto possível que seja necessária a associação crítica das moléculas e não qualquer alteração conformacional. Métodos para a monitorização da estabilidade de IG estão disponíveis na técnica, incluindo os métodos aqui descritos e nos exemplos aqui divulgados. Existem vários métodos disponíveis para avaliar a estabilidade das formulações de proteínas, incluindo as formulações de anticorpos ou de imunoglobulinas, baseado nas estruturas f+isicas e químicas das proteínas assim como nas suas actividades biológicas. Por exemplo, para estudar a agregação, fragmentação e desnaturação das proteínas, estão disponíveis métodos tais como absorção de transferência de carga, análise térmica, espectroscopia de fluorescência, dicroísmo circular, NMR, electroforese capilar em gel em condições redutoras (rCGE) e cromatografia de exclusão por tamamnho de alta resolução (HPSEC) . Ver, por exemplo, Wang et al., 1988, J. of Parenteral Science & Technology 42 (supp) :S4-S26. A rCGE e HPSEC são os métodos mais comuns e simples para avaliar o tamanho molecular devido à formação de agregados proteicos, degradação de proteína e fragmentação de proteína. Ainda, a actividade anticomple-mento (ACA) pode ser determinada directamente.
Por exemplo, a estabilidade das formulações químicas pode ser avaliada através de HPSEC ou rCGE, onde a percentagem de área dos picos representa a proteína não degradada. Num exemplo, a proteína é injectada numa coluna TosoH Biosep TSK G3000 SW 600 x 7,5 mm. A proteína é eluída. A proteína eluída é detectada usando absorvância de UV a 280 nm. Um padrão de referência é corrido no ensaio como controlo e os resultados estão descritos como percentagem de área do pico do produto monómero comparativamente com todos os outros picos excluindo o pico do volume incluído. Os picos que eluem mais precocemente que o pico do monómero são registados como percentagem de agregado. 0 título ACA também pode ser determinado como descrito na Farmacopeia Europeia (European Pharmacopeia, 1997, 2nd ed. Part II. Maisonneuve, S.A.,). de um modo geral, o título ACA é um indicador especifico para a administração intravenosa (IV) e não é relevante para aa co-formulações de administração subcutânea. Assim, para os fins da presente invenção, o título ACA não é de um modo geral um indicador determinante das co-formulações que são formuladas para administração subcutânea.
De um modo geral, o ensaio ACA mede a quantidade de complemento que é ligado pela mistura de quantidades padronizadas de complemento e proteína (ver, e.g., Palmer, D. F. and Whaley, S. D., Complement Fixation Test, in Manual of Clinical Laboratory Immunology (Ed. N. R. Rose, et al., American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1986) pp. 57-66.; Mayer, Μ. M., Quantitative C Fixation Analysis, Complement and Complement Fixation, in Experimental Immunochemistry (Ed. E. A. Rabat and Μ. M. Meyer, Thomas, Springfield, III., 1961), pp. 214-216, 227-228.) Resumidamente, eritrócitos que foram sensibilizados pela pré-incubação com anticorpos contra eritrócitos são adicionados â mistura de complemento/proteína. Na presença de complemento livre (não ligado ainda pela proteína) estas células sensibilizadas lisarão, libertando hemoglobina que pode ser quantificada como uma medida do grau de lise. Paralelamente, os eritrócitos sensibilizados são igualmente adicionados a uma mistura de controlo tampão-complemento, cujo grau de lise é definido como 100%. A diferença entre a quantidade real de complemento necessária para dar 100% de lise e a quantidade de complemento que permanece ligada na presença de proteína iguala a quantidade de complemento ligado de facto pela proteína, ou actividade anticomple-mento. Uma unidade de actividade ACA (uma unidade CH50) é a quantidade de proteína capaz de activar 50% do complemento num sistema de complemento titulado em condições óptimas e eritrócitos/hemolisina. De um modo geral, um título ACA aceitável é inferior a 50% unidades CH50 consumidas por mg de proteína.
Num outro exemplo, a distribuição de massas moleculares, por exemplo devido à formação de agregados, durante o armazenamento de uma co-formulação líquida pode ser facilmente determinada através da medição da alteração da proteína solúvel em solução ao longo do tempo. A quantidade de polipéptido solúvel em solução pode ser quantificada através de uma série de ensaios analíticos. Tais ensaios incluem, por exemplo, HPLC de fase reversa (RP) e espectroscopia de absorção de UV. A determinação de agregados solúveis e insolúveis durante o armazenamento em formulações líquidas pode ser conseguida, por exemplo, usando ultracentrifugação analítica para distinguir entre a porção do polipéptido solúvel que está presente como agregados solúveis e a porção que está presente na forma molecular biologicamente activa não agregada.
Num outro exemplo, a estabilidade das co- formulações pode ser avaliada através do aquecimento do produto acabado a uma temperatura de 57°C e mantendo-o a essa temperatura durante quatro horas, ao mesmo tempo que se examina o produto relativamente a precipitados visuais. (Ver, e.g., Code of Federal Regulations 21, Food and Drugs, 640. 101a (revisto em Abril 1978)). Numa modificação do método (ver e.g., Fernandes and Lundblad, Vox Sang 39:101— 112 (1980)), aproximadamente 2 mililitros do produto a testar é aquecido a 57°C durante quatro horas e depois é avaliada a percentagem alteração do grau de opalescência medido através do registo da transmitância a 580 nm com um espectrofotómetro de laboratório (ver também a Patente U.S. N° 4,597,966). SDS-PAGE pode igualmente ser usado para avaliar a agregação e/ou fragmentação. A densidade ou a radioacti-vidade de cada banda corada ou marcada com isótopo radioactivo pode ser medida e a % de identidade ou a % de radioactividade da banda representando proteína não degradada pode ser obtida.
De um modo egral, as co-formulações apresentam níveis baixos a indetectáveis de agregação como medido através de qualquer um dos ensaioa acima, por exemplo HPSEC ou rCGE. Por exemplo, a agregação é, não mais de 5%, não mais de 4%, não mais de 53%, não mais de 2%, não mais de 1%, e geralmente não mais de 0,5% de agregados por peso de proteína e níveis baixos a indetectáveis de fragmentação, ou seja 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais ou 99,5% ou mais da área total do pico representando anticorpos intactos ou fragmentos dos mesmos. Por exemplo, tipicamente, uma agregação aceitável inclui ^ 90% de monómeros e oligo/dímeros; ^5% agregados, e ^ 5% fragmentos. 2. Actividade biológica a. imunoglobulina A capacidade da imunoglobulina actuar como um agente terapêutico pode ser avaliada in vitro ou in vivo. Por exemplo, os ensaios in vitro podem ser realizados para avaliar a capacidade de imunoglobulina para neutralizar a infecciosidade virai ou bacteriana (Hiemstra et al., (1994) J Lab Clin Med 123:241-6) . Outros ensaios in vitro podem ser utilizados para avaliar outras actividades biológicas da imunoglobulina. Por exemplo, a capacidade das preparações de imunoglobulina para interagiram com os produtos de activação do complemento e modulá-los, ligar anticorpo anti-idiotipico, ligar receptores Fc nos macrófagos e suprimir vários mediadores inflamatórios incluindo citoci-nas, quimiocinas e metaloproteinases, pode ser avaliado usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não lhes estando limitados, ELISA, transferência Western, transferência Northern e citometria de fluxo para avaliar a expressão de marcadores. Por exemplo, o efeito da imunoglobulina na expressão dos receptores de quimiocinas nas células mononucleadas do sangue periférico pode ser avaliado usando citometria de fluxo (Trebst et al., (2006) Eur J Neurology 13(12) :1359-63) . Num outro exemplo, o efeito da imunoglobulina na expressão de metaloproteinases em macrófagos pode ser avaliado usando análise de transferências Northern (Shapiro et al.r (2002) Cancer 95:2032-2037).
Estudos in vivo usando modelos animais podem ser igualmente realizados para avaliar a actividade terapêutica da imunoglobulina. A imunoglobulina pode ser administrada a modelos animais infectados com um ou mais microrganismos e o efeito na progressão da infecção pode ser avaliado, como seja através da medição do número de microrganismos ou medindo o peso como um marcador da morbilidade. O efeito terapêutico da imunoglobulina também pode ser avaliado usando modelos animais das doenças e condições para os quais a terapia usando imunoglobulina é considerada. Tais modelos animais são conhecidos na técnica e incluem, mas não lhes estão limitados, modelos de pequenos animais para agamaglobulinemia associada a X (XLA), SCID, sindrome de Wiskott-Aldrich, doença de Kawasaki, sindrome de Guillain-Barré, ITP, polimiosite, sindrome miasténico de Lambert-Eaton, miastenia gravis e sindrome de Moersch-Woltmann (Czitrom et al. (1985) J Immunol 134:2276-2280, Ellmeier et al., (2000) J Exp Med. 192: 1611-1624, Ohno (2006) Drug Discovery Today: Disease Models 3:83-89, Oyaizu et al. (1988) J Exp Med 2017-2022, Hansen et al.r (2002) Blood 100:2087-2093, Strongwater et al., (1984) Arthritis Rheum. 27:433-42, Kim et al. (1998) Annals NY Acad Sci 841:670-676, Christadoss et al. (2000) Clin. Immunol. 94:75-87,
Sommer et al., (2005) Lancet 365:1406-1411 e Patente U.S. No.7,309,810). b. Hialuronidase A actividade de hialuronidase pode ser avaliada usando métodos bem conhecidos na técnica. Num exemplo, a actividade é medida usando um ensaio de microturbidez. Este baseia-se na formação de um precipitado insolúvel quando o ácido hialurónico se liga a albumina sérica. A actividade é medida através da incubação de hialuronidase com hialu-ronato de sódio (ácido hialurónico) durante um período de tempo estabelecido (e.g., 10 minutos) e depois precipitação do hialuronato de sódio não digerido com a adição de albumina sérica acidificada. A turbidez da aostra resultante é medida a 640 nm após um período de revelação adicional. A redução da turbidez resultante da actividade de hialuronidase no substrato hialuronato de sódio é uma medida da actividade enzimática da hialuronidase, Num outro exemplo, a actividade de hialuronidase é medida usando um ensaio de micortiulação em que o ácido hialurónico residual é medido após incubação comhialuronidase (ver, e.g., Frost and Stem (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicação de Patente U.S. No. 20050260186). Os grupos carboxilo livres nos resíduos de ácido glucurónico do ácido hialurónico são biotinilados e o substrato ácido hialurónico biotinilado é acoplado covalentemente a uma placa de microtitulação. Após incubação com hilauronidase, o substrato residual de ácido hialurónico biotinilado é detectado usando uma reacção avidina-peroxidase e comparado com o obtido após reacção com os padrões de hialuronidase de actividade conhecida. Outros ensaios para medir a actividade de hialuronidase são igualmente conhecidos na técnica e podem ser usados nos métodos aqui descritos (ver, e.g., Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263). A capacidade da hialuronidase para actuar como um agente dispersor ou difusor também pode ser avaliada. Por exemplo, o corante azul tripano pode ser injectado subcutaneamente com ou sem hialuronidase na pele lateral de cada lado de murganhos labros. A área do corante é então medida, como seja com uma microcraveira, para determinar a capacidade da hialuronidase actuar como um agente dispersor (Patente U.S. N° 20060104968). 3. Farmacocinética e tolerabilidade
Os estudos de farmacocinética e tolerabilidade podem ser realizados usando modelos animais ou podem ser realizados durante estudos clínicos com doentes. Os modelos animais, incluem, mas não lhes estão limitados, murganhos, ratos, coelhos, cães, cobaios e modelos de primatas não humanos, como sejam macacos cinomólogos ou macacos rhesus. Nalguns casos, os estudos de farmacocinética e de tolerabilidade são realizados usando animais sudáveis. Noutros exemplos, os estudos são realizados usando modelos animais de uma doença para a qual a terapia com imuno- globulina é considerada, como sejam modelos animais de qualquer uma das doenças ou condições descritas abaixo. A farmacocinética da imunoglobulina administrada subcutaneamente pode ser avaliada medindo parâmetros tais como concentração máxima (pico) de imunoglobulina no plasma (Cmax) , tempo do pico (i.e. quando ocorre a concentração máxima de imunoglobulina no plasma; T max) concentração minima de imunoglobulina no plasma (i.e. a concentração minima no plasma entre doses de imunglobulina; Cmin) , a semivida de eliminação (T1/2) e a área sob a curva (i.e. a área sob a curva gerada pela representação do tempo versus concentração da imunoglobulina no plasma; AUC) após administração. A biodisponibilidade absoluta da imunoglobulina administrada subcutaneamente é determinada comparando a área sob a curva da imunoglobulina após entrega subcutânea (AUCsc) com a AUC da imunoglobulina após entrega intravenosa (AUCiv) . A biodisponibilidade absoluta (F) pode ser calculada usando a fórmula: F=([AUC]Sc * dosesc) / ([AUCJiv x doseiv) . A concentração de imunoglobulina no plasma após administração subcutânea pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica adequado para avaliar concentrações de imunoglobulina nas amostras de sangue. Exemplos de métodos incluem, mas não lhes estão limitados, ELISA e nefelometria.
Uma gama de doses e diferentes frequências de dosagem da dosagem podem ser administradas nos estdos de farmacocinética para avaliar o efeito do aumento ou redução das concentrações de imunoglobulina e/ou hialuronidase na dose. As propriedades farmacocinéticas da imunoglobulina administrada subcutaneamente, como sejam a biodisponibi-lidade, podem ser igualmente avaliadas com ou sem co-administração de hialuronidase. Por exemplo, cães, tais como beagles, podem receber imunoglobulina subcutaneamente em combinação com hialuronidase ou sozinhos. As doses intravenosas de imunoglobulina são igualmente administradas a um outro grupo de beagles. As amostras de sangue são colhidas a vários tempos e a quantidade de imunoglobulina no plasma determinada, como seja por nefelometria. A AUC pode então ser medida e a biodisponibilidade da imunoglobulina administrada subcutaneamente com ou sem hialuronidase pode ser determinada, tais estudos podem ser realizados para avaliar o efeito da co-administração com hialuronidase nas propriedades farmacocinéticas, tais como biodis-ponibilidadem da imunoglobulina administrada subcutaneamente .
Estudos para avaliar a segurança e tolerabilidade são igualmente conhecidos na técnica e podem ser aqui usados. Após administração subcutânea da imunoglobulina, com ou sem co-administração de hialuronidase, o desenvolvimento de quaisquer reacções adversas pode ser monitorizado. As reacções adversas podem incluir, mas não lhes estão limitadas, reacções em locais de injecção, tais como edema ou inchaço, dor de cabeça, febre, fadiga, arrepios, ruborização, vertigens, urticária, pieira ou aperto no peito, náusea, vómitos, calafrios, dor nas costas, dor no peito, câimbras musculares, tremores ou convulsões, alterações na pressão sanguínea e respostas anafilácticas ou de hipersensibilidade grave. Tipicamente, uma gama de doses e diferentes frequências de dosagem são administradas em estudos de segurança e tolerabilidade para avaliar o efeito do aumento e redução das concentrações de imunoglobulina e/ou hialuronidase na dose.
H. MÉTODOS DE TRATAMENTO E USOS TERAPÊUTICOS
As co-formulações de IG/hialuronidase aqui descritos podem ser usados para o tratamento de qualquer condição para a qual seja empregue imunoglobulina. A imunoglobulina (IG) pode ser administrada subcutaneamente em co-formulações com hialuronidase, para tratar qualquer condição que seja susceptível de tratamento com imunoglobulina. Esta secção proporciona exemplos de usos terapêuticos de co-formulações de IG/hialuronidase. Deve-se entender que as co-formulações de IG/hialuronidase aqui proporcionadas podem ser usadas em métodos, processos ou usos para tratar qualquer uma das doenças e condições descritas abaixo e outras doenças e condições conhecidas dos familiarizados com a técnica que sejam tratáveis por IG. Em particular, é contemplada a administração subcutânea das co-formulações. A dosagem de IG administrada é a mesma ou semelhante à dosagem administrada intravenosamente e conhecida dos familiarizados com a técnica. 0 regime e a frequência de dosagem podem variar dos regimes intravenosos como aqui descrito. Os usos terapêuticos descritos abaixo são exemplificativos e não limitam as aplicações dos métodos aqui descritos.
Por exemplo, as co-formulações aqui proporcionadas podem ser usadas para tratar imunodeficiências tais como imunodeficiências prim+arias tais como agamablo-bulinemia associada a X, hipogamaglobulinemia e e condições de imunidade comprometida adquirida (imunodeficências secundárias), tais como as que incluem niveis baixos de anticorpos; doenças inflamatórias e auto-imunes; e infec-ções agudas. Os usos terapêuticos incluem, mas não lhes estão limitados, terapia de substituição com imunoglobu-linas para várias doenças e condições imunológicas, hematológicas, neurológicas, inflamatórias, dermatológicas e/ou infecciosas. Nalguns exemplos, a imunoglobulina é administrada para aumentar a resposta imune em doentes saudáveis, tais como após possível exposição a doenças infecciosas (e.g. picada acidental por agulhas). As co-formulações de IG aqi proporcionadas também podem ser usadas no tratamento de esclerose múltipla (especialmenteesclerose múltipla recidivante-remitente ou RRMS), doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Está dentro da capacidade do médico assistente identificar tais doenças ou condições.
As co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas em combinação com outros agentes usados no tratamento destas doenças e condições. Por exemplo, outros agentes que podem ser administrados incluem, mas não lhes estão limitados, antibióticos, agentes quimiooterapêuticos, anti-inflamatórios esteróides, anti-inflamatórios não esteróides e outros agentes imunomodula-dores tais como citocinas, quimocinas e factores de crescimento .
Se necessário, uma dosagem e duração e protocolo de tratamento particulares podem ser determinados empiricamente ou extrapolados. Por exemplo, exemplos de doses de imunoglobulina administrada intravenosamente podem ser usados como ponto de partida para determinar dosagens adequadas. Os níveis de dosagem podem ser determinados com base numa variedade de factores, tais como peso do corpo do indivíduo, estado de saúde geral, idade, actividade do composto específico empregue, sexo, dieta, tempo de administração, velocidade de excreção, combinação de fármacos, gravidade e curso da doença e disposição do doente relativamente à doença e avaliação do médico assitente. Exemplos de dosagens de imunoglobulina e hialuronidase são aqui proporcionados. É entendido que a quantidade a ser administrada será uma função da indicação tratada e possivelmente dos efeitos secundários que serão tolerados. As dosagens podem ser empiricamente determinadas usando modelos reconhecidos para cada distúrbio.
Quando da melhoria de uma condição do doente, uma dose de manutenção da imunoglobulina pode ser administrada subcutaneamente em combinação com hialuronidase, se necessário, e a dosagem, forma de dosagem ou frequência de administração ou uma combinação das mesmas podem ser modificadas. Nalguns casos, um indivíduo pode requerer tratamento intermitente numa base a longo prazo quando da recorrência dos sintomas da doença. 1. Imunodeficiência primária e secundária a. Imunodeficiência primária
Mais de 80 doenças de imunodeficiência primária são reconhecidas pela Organização Mundial de Saúde e ocorrem em cerca de 1 em cada 10000 indivíduos. Estas doenças caracterizam-se por um defeito intrínseco no sistema imunitário em que, nalguns casos, o corpo é incapaz de produzir quaisquer anticorpos ou anticorpos suficientes contra a infecção. Noutros casos, as defesas celulares para lutar contra a infecção não funcionam adequadamente. A imunoglobulina pode ser usada para tratar imunodeficiência primária com deficiência em anticorpos. Assim, a imunoglobulina pode ser administrada como terapia de substituição com imunoglobulinas a doentes que apresentem tais doenças .
Tipicamente, as imunodeficiências primárias são distúrbios hereditários. Exemplos de imunodeficiências primárias incluem, mas não lhes estão limitadas, imunodeficiência variável comum (CVID), deficiência em IgA selectiva, deficiência na subclasse de IgG, agamaglobuli-nemia associada a X (XLA), imunodeficiência grave combinada (SCID), distúrbios do complemento, ataxia telangiectasia, híper-IgM e sindrome de Wiskott-Aldridge. As co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas subcutaneamente a doentes com doenças de imunodeficiência primária com deficiência de anticorpos em doses semelhantes às doses usadas para administração intravenosa de imunoglo-bulina. Exemplos de doses incluem, por exemplo, entre 100 mg/kg PC e 800 mg/kg PC de imunoglobulina, em intervalos de quatro semanas. A dose pode ser aumentada ou reduzida, tal como pode a frequência das doses, dependendo da resposta clinica. b. Imunodeficiência secundária A imunodeficiência secundária ou adquirida não é o resultado de anormalidades genéticas hereditárias mas antes ocorre em indivíduos em que o sistema imunitário é comprometido pos factores foram do sistema imune. Exemplos incluem, mas não lhes estão limitados, trauma, vírus, quimioterapia, toxinas e poluição. A sindrome de imuno-deficiência adquirida (AIDS) é um exemplo de um distúrbio de imunodeficiência secundária causada por um vírus (VIH), em que a depleção de linfócitos T torna o corpo incapaz de lutar contra a infecção.
Um outro exemplo, hipogamaglobulinemia, é causado por falta de linfócitos B, caracteriza-se por níveis baixos de anticorpos no sangue e pode ocorrer em doentes com leucemia linfocítica crónica (CLL), mieloma múltiplo (MM), linfoma não Hokin (NHL) e outras doenças malignas relevantes como resultado de disfunção imune relacionada com leucemia e imuno-supressão relacionada com terapia. Os doentes com hipogamaglobulinemia adquirida subsequente a tais doenças hematológicas e os doentes que receberam transplante de células estaminais hematopoiéticas são susceptiveis a infecções bacterianas. A deficiência em imunidade humoral é largamente responsável pelo risco acrescido de morbilidade e mortalidade relacionada com infecção nestes doentes, especialmente por microrganismos encapsulados. Por exemplo, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae aned Staphylococcus aureus, assim como Legionella e Nocardia spp. são agentes patogénicos bacterianos frequentes que causam pneumonia em doentes com CLL. As infecções oportunistas, tais como Pneumocystis carinii, fungos, virus e micobactérias também foram observadas. 0 número e gravidade das infecções nestes doentes podem ser significativamente reduzidos através da administração de imunoglobulina (Griffiths et al. (1989) Blood 73:366-368; Chapei et al. (1994) Lancet 343:1059-1063).
Assim, as co-formulações de imunoglobulina/hialu-ronidase podem ser administradas subcutaneamente em tais doentes para prevenir infecções recorrentes. Exemplos de dosagens incluem as usadas para administração intravenos de imunoglobulina a doentes com hipogamaglobulinemia adquirida subsequente às doenças malignas hematológicas. Por exemplo, co-formulações contendo 400 mg/kg PC de imunoglobulina podem ser administradas subcutanemanete cada 3 a 4 semanas.
Num outro exemplo, uma dose adicional de 400 mg/kg PC pode ser administrada no primeiro mês de terapia em casos onde a IgG do soro do doenteseja inferior a 4 g/1. A quantidade de imunoglobulina administrada e a frequência das doses, podem ser aumentadas ou reduzidas conforme adequado. 2. Doenças inflamatórias e auto-imunes a. Doença de Kawasaki A doença de Kawasaki é uma doença aguda, febril, multi-sistemas das crianças e bebés jovens, frequentemente envolvendo as artérias coronárias. É igualmente conhecida como sindrome dos nódulos linfáticos, doença dos nódulos mucocutâneos, poliartrite infantil e sindrome de Kawasaki. A doença de Kawasaki é uma vasculite auto-limitada mal compreendida que afecta muitos órgãos,incluindo a pele, membranas mucosas, nódulos linfáticos, paredes dos vasos sanguíneos e coração. Os aneurismas das artérias coronárias podem ocorrer a partir da segunda semana de doença durante a fase de convalescença. Apesar da cusa da condição ser desconhecida, existe evidência que a vasculite caracte-rística resulta de uma reacção imune caracterizada por activação de células T e macrófagos a um antigénio desconhecido, secreção de citocinas, hiperactividade de células B policlonais e formação de autoanticorpos contra as células endoteliais e células do músculo liso. Em indivíduos geneticamente susceptíveis, um ou mais agentes infecciosos comuns não caracterizados, possivelmente com actividade de super-antigénio, podem desencadear a doença. A imunoglobulina administrada na fase inicial da doença de Kawasaki pode prevenir a patologia das artérias coronárias. A administração subcutânea de co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase a doentes com inflamação associada a doença deKawasaki pode melhorar os sintomas. Exemplos de dosagems incluem as usadas na administração intravenosa de imunoglobulina a doentes com doença de Kawasaki. Por exemplo, um doente com doença de Kawasaki pode receber cerca de 1-2 g/kg de peso do corpo do doente de imunoglobulina. Esta pode ser administrada, por exemplo, em quatro doses de 400 mg/kg PC durante quatro dias consecutivos. Num outro exemplo, 1 g/kg de PC de imunoglobulina é administrada como uma dose única durante um período de 10 horas. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou reduzida conforme adequado. b. Polineuropatia inflamatória crónica desmieli- nizante A polineuropatia inflamatória crónica desmielini-zante (CIDP) é um distúrbio neurológico caracterizado por fraqueza progressiva e função sensorial debilitada nas pernas e braços. O distúrbio, que é por vezes designado polineuropatia crónica recidente, é causada pela lesão da bainha de mielina dos nervos periféricos, Apesar de poder ocorrer em qualquer idade em ambos os sexos, CIDP é mais comum nos adultos jovens, e mais nos homens que nas mulheres. Frequentemente apresenta sintomas que incluem formigueiro ou dormência (começando nos dedos dos pés e das mãos), frqueza dos braços e pernas, derda dos reflexos dos tendões profundos (areflexia), fadiga e sensações anormais. CIDP está estreitamente relacionado com a sindrome de Guillain-Barré e é considerada a contrapartida crónica daquela doença aguda. Não existe teste diagnóstico especifico, mas os dados clínicos e laboratoriais carac-terísiticos ajudam a distinguir este distúrbio de outras síndromes neuropáticos mediados por imunidade.
Estudos indicam que o tratamento com imunoglobu-lina reduz os sintomas (van Schaik et al. (2002) Lancet Neurol. 1:497-498). Assim, as co-formulações de imunoglobu-lina/hialuronidase podem ser administradas subcutaneamente a doentes que apresentem CIDP uando os métodos aqui descritos. Exemplos de dosagens incluem as usadas para administração intravenosa de imunoglobulina a doentes com CIDP. Num exemplo, um doente com CIDP recebe cerca de 2 g/kg de PC de imunoglobulina subcutaneamente, em combinação com hialuronidase. Esta pode ser administrada, por exemplo, em cinco doses de 400 mg/kg PC durante cinco dias consecutivos. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou reduzida conforme adequado. c. Sindrome de Guillain-Barré A sindrome de Guillain-Barré é um distúrbio neurológico auto-imune envolvendo desmilinizaçâo inflamatória dos nervos periféricos, os primeiros sintomas incluem graus variáveis de fraqueza ou sensação de formigueiro nas pernas, que se pode dispersar para os braços e parte superior do corpo. Estes sintomas podem aumentar de intensidade até os músculos não poderem ser usados definitivamente e o doente ficar quase totalmente paralisado, resultando numa condição de perigo de vida. Apesar da recuperação ser de um modo geral boa ou completa na maioria dos doentes, a incapacidade persistente foi descrita em cerca de 20% de todos os doentes e morte em 4 a 15% dos doentes. A sindrome de Guillain-Barré pode ocorrer alguns dias ou semanas após os sintomas de uma infecção virai respiratória ou gastrointestinal. Nalguns casos, a cirugia ou vacinações podem desencadear esta sindrome. O distúrbio pode desenvolver-se no decurso de horas ou dias ou pode levar até 3 a 4 semanas. Um teste de velociadade de condução nervosa (NCV) pode dar uma pista para ajudar o diagnóstico. Nalguns casos, uma punção lombar pode ser usada no diagnóstico, uma vez que o fluido cerebrospinal nos doentes com sindrome de Guillain-Barré tipicamente possui mais proteína que nos indivíduos normais.
Apesar de não haver cura conhecida para a sindrome de Guillain-Barré, o tratamento com imunoglobulina pode minorar a gravidade da doença e acelerar a recuperação. As co-formulações de imunoglobulina/hialu-ronidase podem ser administradas subcutaneamente a doentes numa dose adequada de IG, como seja por exemplo, uma dose semelhante à dose usada para administrar imunoglobulina intravenosamente a doentes com sindrome de Guillain-Barré.
Por exemplo, um doente com síndrome de Guillain-Barré pode receber cerca de 2 g/kg PC de imunoglobulina, em combinação com hialuronidase, subcutaneamene. Esta pode ser administrada, por exemplo, em cinco doses de 400 mg/kg PC durante cinco dias consecutivos. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou reduzida dependendo, por exemplo, da gravidade da doença e da resposta clinica à terapia, a qual pode ser facilmente avaliada pelos familiarizados com a técnica. d. Púrpura trombocitopéinca idiopática A púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), também conhecida como púrpura trombocitopénica imune primária e púrpura trombocitopénica auto-imune, é uma redução na contagem de plaquetas (trombocitopenia) resultante da sobrevivência encurtada das plaquetas devido a anticorpos anti-plaquetas. Quando as contagens de plaquetas são muito baixas (e.g., <30 x 109/1), pode ocorrer hemorregias na pele (púrpura) e membranas mucosas. A produção de plaquetas peloa medula óssea (megacariopoiese) em doentes com ITP é morfologicamente normal. Nalguns casos, existe a incapacidade adicional da função das plaquetas relacionada com a ligação de anticorpos às glicoproteínas na superfície das plaquetas. ITP pode estar presente como formas crónicas ou agudas. Aproximadamente 80% dos adultos com ITP possuem a forma crónica da doença. A incidência mais elevada de ITP crónica é nas mulheres entre os 15 e 50 nos, ainda que algumas descrições sugiram incidência creescente com a idade. ITP é relativamente comum em doentes com HIV. Se bem que ITP possa ser encontrada em qualquer fase da infecção, a sua prevalência aumenta com os avanços da doença por HIV.
Estudos demonstraram que a imunoglobulina pode ser usada para tratar doentes com ITP (Godeau et al. (1993)
Blood 82(5):1415-21,- Godeau et al. (1999) Br. J. Haematol. 107(4):716-9). As co-formulações de imunoglobulina/hialuro-nidase podem ser administradas a doentes numa dose de IG semelhante à dose usada para administrar imunoglobulina intravenosamente para tratar doentes com ITP. Por exemplo, um doente com ITP podem ser receber cerca de 1 a 2 g/kg de PC de imunoglobulina, em combinação com hialurodinase, subcutaneamente. Esta pode ser administrada ao longo de vários dias ou pode ser administrada numa dose. Nalguns exemplos, são administradas cinco doses de 400 mg/kg/ PC de imunoglobulina em dias consecutivos. Num outro exemplo, 1 g/kg PC é administrado durante 1-2 dias consecutivos, dependendo da contagem de plaquetas e da resposta clínica. A quantidade de imunoglobulina administrada e a frequência das doses podem ser aumentadas ou reduzidas dependendo, por exemplo, da contagem de plaquetas e da resposta clínica às terapias, que podem ser facilmente avaliadas pelos familiarizados com a técnica. e. Miopatias inflamatórias
As miopatias inflamatórias são um grupo de doenças musculares envolvendo a inflamação e degeneração dos tecidos dos músculos esqueléticos. Estes distúrbios adquiridos apresentam todos frqueza muscular significativa ea presença de uma resposta inflamatória no músculo. i. Dermatomiosite A dermatomiosite (DM) é a miopatia inflamatória mais facilmente reconhecida devido ao eritema caracterís-tico, o qual ocorre como manchas irregulares, sóbrias, avermelhadas ou violeta nas pálpebras, face e ponte do nariz e nas costas e parte superior do torax, cotovelos, joelhos e falanges. Nalguns doentes, desenvolvem-se sob a pele nódulos calcificados ou inchaços duros. 0 eritema frequentemente precede a fraqueza muscular, que tipicamente se desenvolve ao longo de um período de semanas, mas pode desenvolver-se ao longo de meses ou mesmo dias. A dermatomiosite pode ocorrer em qualquer idade desde a infância até à idade adulta e é mais comum em mulheres que em homens. Mais de 50% das crianças com DM queixam-se dor e desconforto muscular, enquanto isto geralmente ocorre em menos de 25% dos adultos com DM. ii. Polimiosite
Polimiosite (PM) não possui o eritema caracte-rístico da dermatomiosite, e a fraqueza muscular geralmente progride mais lentamente que em DM. Muitos doentes com DMA apresentam dificuldade em engolir. Nalguns casos, os doentes também têm dificuldade em respirar devido à falência muscular. Até um terço dos doentes com PM tem dores musculares. A doença afecta mais as mulheres que os homens e raramente afecta indivíduos com menos de 20 anos, apesar de serem reportados casos de polimiosite na infância. iii. Miosite dos corpos de inclusão A miosite dos corpos de inclusão (IBM) é muito semelhante à polimiosite. O aparecimento da fraqueza muscular em IBM é qeralmente muito gradual, ocorrendo ao longo de meses ou anos. Difere de PM no facto de serem afectados os músculos proximais e distais, enquanto geralmente apenas os músculos proximais são afectdados em PM. Daos típios incluem fraqueza dos flexores do pulso e dos flexores dos dedos. A atrofia dos músculos dos antebraços e dos quadricepes é característico da doença, com graus variáveis de fraueza nos outros músculos. Aproximadamente metade dos doentes atingidos por IBM tem dificuldade em engolir. Os sintomas de IBM geralmente começam após os 50 anos, apesar de nenhum grupo etário ser excluído. IBM ocorre mais frequentemente nos homens que nas mulheres. Cerca de um em dez casos de IBM pode ser hereditário.
Os estudos indicam que a administração de imu-noglobulina pode beneficiar os doentes com estas miopatias inflamatórias. A imunoglobulina pode melhorar a força muscular, reduzir a inflamação e reduzir a progressão e gravidade da doença (Dalakas et al. (1993) N. Engl. J. Med. 329 (27) : 1993-2000; Dalakas et al. (2001) Neurology 56(3):323-7,- Dalakas (2004) Pharmacol. Ther. 102 (3) : 177-93; Walter et al. (2000) J. Neurol. 247(1):22-8). As co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas subcutaneamente a doentes com DM, PM ou IBM numa dose de IG semelhante à dose usada para administrar a imunoglobulina intravenosamente. Por exemplo, 2 g/kg PC de imunoglobulina pode ser administrada, tipicamente ao longo de vários dias, tais como, por exemplo, cinco doses de 400 mg/kg PV em dias consecutivos. f. Sindrome miasténico de Lambert-Eaton A sindrome miasténica de Lambert-Eaton (LEMS) é um distúrbio auto-imune raro da transmissão neuromuscular primeiro reconhecido clinicamente em associação com cancro do pulmão e, subsequentemente, e casos em que não foi de-tectado neoplasma. Os doentes com LEMS possuem uma junção neuromuscular pré-sináptica defeituosa. A doença carac-teriza-se clinicamente por fraqueza dos músculos proximais, com aumento da força após exercício, sinais oculomotores ligeiros, reflexos dos tendões profundos deprimidos e disfunção autonômica (boca seca, obstipação, disfunção eréctil). A administração subcutânea das co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase a doentes com LEMS pode melhorar os sintomas. Exemplos de dosagens de IG das co-formulações incluem as usadas para administração intravenosa de imunoglobulina a doentes com LEMS. Por exemplo, um doente com LEMS pode receber 2 g/kg PC de imunoglobulina em várias doses. Por exemplo, cinco doses de 400 mg/kg PC de imunoglobulina podem ser administradas em cinco dias consecutivos. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou reduzida conforme adequado. g. Neuropatia motora multifocal A neuropatia motora multifocal (MMN) com bloqueio da condução é uma neuropatia adquirida desmileinizante mediada por imunidade com fraqueza lentamente progressiva, fasciulações e cólicas, sem envolvimento sensorial significativo. A duração da doença antes do diagnóstico varia entre váriso meses a mais de 15 anos. A natureza precisa de MMN é desconhecida. Estudos histopatológicos e de electro-diagnóstico demonstram a presença de lesão desmielinizante e axonal. Os nervos motores são os orincipalmente afectados, se bem que desmielinização suave tenha sido demonstrada igualmente em nervos sensoriais. A eficácia do tratamento imunomodulador e imunossupressor suporta mais a natureza imune da MMN. Os títulos de anticorpos anti-GMl são elevados em mais de metade dos doentes com MMN. Apesar do papel dos anticorpos anti-GMl na doença ser desconhecido, a sua presença pode ser usada como marcador de diagnóstico para MMN. A administração subcutânea das co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase a doentes com MMN pode melhorar os sintomas. Exemplos de dosagens de IG nas co-formu- lações incluem as usadas para administração intravenosa de imunoglobulina a doentes com MMN. Por exemplo, um doente com MMN pode receber 2 g/kg de PC de imunoglobulina em várias doses. Por exemplo, cinco doses de 400 mg/kg PC de imunoglobulina podem ser administradas em cinco dias consecutivos. Num outro exemplo, 1 g/kg PC pode ser administrado em 2 dias consecutivos. Alguns doentes podem receber terapia de manutenção, a qual pode incluir, por exemplo, doses de 400 mg/kg PC a 2 g/kg PC dadas cada 2-6 semanas. A quantidade de imunoglobulina administrada pde ser aumentada ou reduzida conforme adequado, tendo em consideração a resposta do doente. h. Miastenia grave A miastenia grave (MG) é uma doença nurosmuscular auto-imune crónica caracterizada por graus vairáveis de fraqueza dos músculos esqueléticos do corpo. Está associada à presença de anticorpos contra os receptores de ace-tilcolina (AChR) ou cobtra a tisorina cinase especifica dos músculos (MuSK) na junção neuromuscular, se bem que alguns doentes sejam negativos para os anticorpos. As carac-terísticas clónicas de MG incluem fraqueza flutuante e fatigabilidade dos músculos voluntários, particularmente dos músculos levantador da pálpebra, extraocular, bulbar, membros e respiratórios. Os doentes geralmente apresentam pálpebras pendentes (ptose), visão dupla (diplopia), dificuldade em engolir (disfagia) e fraqueza dos músculos proximais. A fraqueza dos músculos respiratórios pode resultar em falência respiratória em casos graves ou em exacerbações agudas graves (crise miasténica). A miastenia grave ocorre em todos os grupos étnicos e ambos os sexos. Mais frequentemente afecta a mulher jovem com menos de 40 e homens mais velhos com mais de 60, mas pode ocorrer em qualquer idade. Nalguns casos, é realizada timectomia para reduzir os sintomas. A imunogloboluina pode ser usada, por exemplo, como terapia de manutenção para doentes com MG moderada a grave, tipicamente quando outros tratamentos foram ineficazes ou causaram efeitos secundários graves e também pode ser administrada antes da tirectomia ou durante uma exacerbação aguda da doença (crise miasténica). As co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas subcutaneamente a doentes com MG usando os métodos aqui descritos. Exemplos de dosagens de IG nas co-formulações incluem as usadas para administração intravenosa de imunoglobulina a doentes com MG. Por exemplo, um doente com MG pode receber doses de 400 mg/kg PC a 2 g/kg de PC cada 4-6 semanas durante a terapia de manutenção. Antes da timectomia ou durante crise miasténica, 1-2 g/kg PC pode ser administrado em várias doses, tais como, por exemplo, cinco doses de 400 mg/kg PC em cinco dias consecutivos. Num outro exemplo, 1 g/kg PC pode ser administrado em 2 dias consecutivos. i. Sindrome de Moersch-Woltmann A sindrome de Moersch-Woltmann, também conhecida como sindrome da pessoa rígida (SPS) ou sindrome do homem rígido, é um distúrbio neurológico raro com características de uma doença auto-imune. Os doentes apresentam sintomas relacionados com rigidez muscular e sobrepostos com espasmos episódicos. A rigidez dos músculos dissemina-se para envolver os músculos axiais, principalmente abdominais e toracolombares, assim como os músculos proximais dos membros. Tipicamente, a co-contração de músculos agonistas e antagonistas do tronco conduz a um aspecto tipo tábua com hiperlordose. Menos frequentemente, o envolvimento dos músculos respiratórios conduz a dificuldades respiratórias e envolvimento dos músculos faciais resultando numa face tipo máscara. 0 tratamento com imunoglobulina pode originar redução da rigidez e maior sensibilidade em doentes com síndrome de Moersch-Woltmann (Dalakas et al. (2001) N. Engl. J. Med. 345(26):1870-6). As co-formulações de imuno-globulina/hialuronidase podem ser administradas subcutanea-mente a doentes com síndrome de Moersch-Woltmann usando os métodos aqui descritos. Exemplos de dosagens de IG nas co-formulações incluem as usadas para administração intravenosa de imunoglobulina a doentes com síndrome de Moersch-Woltmann. Por exemplo, um doente com síndrome de Moersch-Woltmann pode receber doses de 400 mg/kg PC durante cinco dias consecutivos. Alguns doentes podem receber terapia de manutenção, a qual pode incluir, por exemplo, doses de 1-2 g/kg PC dadas cada 4-6 semanas. A quantidade de imunoglobulina administrada pde ser aumentada ou reduzida conforme adequado, tendo em consideração a resposta do doente. 3. Infecções agudas
Também se demonstrou que a imunoglobulija possui actividade antimicrobiana contra uma série de infecções bacterianas, virais e fúngicas incluindo, mas não lhes estando limitados, Haemophilus influenzae tipo B; Pseudomonas aeruginosa tipos A e B; Staphylococcus aureus; Streptococcus do grupo B; Streptococcus pneumoniae tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, e 23; adenovirus tipos 2 e 5; citomegalovirus; virus de Epstein-Barr VCA; virus da hepatite A; virus da hepatite B; virus herpes simples-1; virus herpes simples-2; virus da gripe A; virus do sarampo; parainfluenza tipos 1, 2 e 3; polio; varicela zoster virus; Aspergillus; e Candida albicans. Assim, as co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas subcutaneamente a doentes com infecções bacterianas, virais e fúngicas para aumentar o sistema imune do doente e tratar a doença. Nalguns exemplos, os antibióticos ou outros antimicrobianos são igualmente administrados. 4. Outras doenças e condições
Exemplos de outras doenças e condições tratáveis por terapia com IG e não descritas atrás incluem, mas não lhes estão limitadas, imunodeficiência iatrogénica; deficiência em anticorpos específicos; encefalomielite agida disseminada; vasculite necrotizante sistémica positiva para ANCA; anemia hemolítica auto-imune; penfigóide bolhoso; penfigóide cicatricial; sindrome de Evans (incluindo anemia hemolitca auto-imune com trombocitopenia imune); trombocitopenia alolimune feto-amterna/neonatal (FMAIT/NAIT); sindrome hemafagocitico; transplante de células hematopoiéticas estaminais alogeneicas de risco elevado; neuropatia paraproteinémica por IgM; transplante renal; esclerose múltipla; ataxia opsoclonus mioclonus; pênfigo foliáceo; pêmfigo vulgar; purpura pós-transfusão; necrólise epidérmica tóxica/sindrome de Steven Johnson (TEM/SJS); sindrome do choque tóxico; lupus sistémico eritematoso; mieloma múltiplo; sépsis; transplante de medula óssea; tumores das células B; e doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer, por exemplo, inclui tratamento com imunoglobulina intravenosa (ver, e.g., Dodel et al. (2004) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 75:1472-4; Solomon et al. (2007) Curr. Opin. Mol. Ther. 9:79-85; Relkin et al. (2008) Neurobiol Aging). IG possui anticorpos que se ligam a beta-amilóide (AB) , que é um componente central da placa nos cérebros dos doentes com Alzheimer. Assim, IG pode ajudar a promover a eliminação de AB do cérebro e a bloquear os efeitos tóxicos de AB nas células do cérebro. Assim, as co-formulações de imunoglobu-lina/hialuronidase podem ser administradas subcutaneamente a doentes com doença de Alzheimer usando os métodos aqui descritos. Os indivíduos a serem tratados incluem doentes com doença de Alzheimer ligeira, moderada ou avançada. Esta dentro do conhecimento do médico assistente identificar doentes para tratamento. As co-formulações de imunoglobu- lina/hialuronidase podem ser administradas semanalmente, cada duas semanas ou uma vez por mês. 0 tratamento pode continuar ao longo de vários meses ou anos. As co-formulações podem ser administradas em doses de IG entre 200 mg/kg PC a 2 g/kg PC semanalmente ou cada duas semanas e, geralmente, pelo menos 200 mg/kg PC a 2 g/kg PC pelo menos uma vez por mês. O tratamento com imunoglobulina pode originar um aumento dos níveis de anticorpos anti-beta amilóide comparativamente com os níveis antes do tratamento. I. Artigos de fabrico e kits
As composições farmacêuticas das co-formulações de imunoglobulina e hialuronidase podem ser embaladas como artigos de fabrico contendo material de embalagem, uma composição farmacêutica que é eficaz para o tratamento de uma doença ou condição tratável com IG e um rótulo que indica que a composição é oara ser usada no tratamento de doenças e condições tratáveis com IG. Exemplos de artigos de manufactura são os recipientes que incluem recipientes de câmara simples e de câmara dupla. Os recipientes incluem, mas não lhes estão limitados, tubos, frascos e seringas. Os recipientes podem ainda incluir uma agulha para administração subcutânea.
Os artigos de fabrico aqui proporcionados incluem materiais de embalagem. Os materiais de embalagem para usar no embalamento dos produtos farmacêuticos são conhecidos dos familiarizados com a técnica. Ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5,323,907, 5,033,252 e 5,052,558, cada um dos quais é aqui incluído na sua totalidade. Exemplos de materiais de embalagem de fármacos incluem, mas não lhes estão limitados, embalagens de blisters, frascos, tubos, inaladores, bombas, sacos, ampolas, contentores, seringas, garrafas e qualquer material de embalagem adequado ara a formulação seleccionada e modo pretendido de administração e tratamento. Um largo arranjo de formulações dos copostos e composições aqui proporcionadas estão contemplados tal como uma variedade de tratamentos para qualquer doença ou condição tratável com IG.
Composições de co-formulações de imunoglobulina e uma hialuronidase solúvel podem também ser proporcionadas como kits. os kits podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para administração. Por exemplo, as composições podem ser fornecidas com um dispositivo para administração, como seja uma seringa, um inalador, um copo doseador, um conta-gotas ou um aplicador. 0 kit pode, facultativamente, incluir instruções para aplicação incluindo dosagens, regimes de dosagens e instruções para modos de administração. Os kits também incluem uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para diagnóstico. Por exemplo, tais kits podem incluir um item para medição da concentração, quantidade ou actividade de IG.
J. EXEMPLOS
Os exemplos que se seguem são incluídos para fins ilustrativos apenas e não pretendem limitar o âmbito da invenção.
Exemplo 1
Preparação de liquido Gammagard (formulações de 10% de imunoglobulina (IG)) Líquido Gammagard (10% IG) foi produzido a partir de grandes lotes de plasma humano, testado exaustivamente relativamente a agentes infecciosos. As imunoglobulinas foram purificadas a partir de lotes de plasma usando um processo de fraccionamento de Cohn-Oncley modificado com etanol frio (Cohn et al. (1946) J Am. Chem. Soc. 68:459-467), assim como cromatografia de permute catiónica e aniónica (Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55) . A proteína purificada foi ainda sujeita a três passos de independents de inactivação/remoção virai: tratamento solvente/detergente (S/D) (Horowitz et al. (1994) Blood Coagul. Fibrin. 5(3) :S21-528; Kreil et al. (2003)
Transfusion 43:1023-1038), 35 nm nanofiltration (Hamamoto et al. (1989) Vox Sang. 56:230-236; Yuasa et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:2021-2024), e uma incubação a pH baixo a temperaturas elevadas (Kempf et al. (1991) Transfusion 31:423-427; Louie et al. (1994) Biologicals 22:13-19). O procedimento S/D incluiu tratamento com uma mistura orgânica de tri-n-butilfosfato, octoxinol-9 e polissorbato-80 a 18 a 25°C durante um mínimo de 60 minutos (Põlsler et al., (2008) Vox Sang. 94:184-192).
As preparações finais usadas nos estudos foram preparações liquidas a 10% de anticorpos de imunoglobulina G (IG) concentrada e altamente purificada formulada em glicina 0,25 mM pH 4,6 a 5,1 (como medido na solução concentrada). A glicina serve como agente estabilizador e tamponante e não houve açúcares, sódio ou conservantes adicionados. Todos os lotes de 10% IG (e.g. lotes LE12H020, LE12H062, LE12H173, LE12F047) foram substancialmente similares. A osmolalidade foi 240 a 300 mOsmol/kg, o que é semelhante à osmolalidade fisiológica. A distribuição das subclasses de IG fo produto produzido de acordo com o processo atrás descrito foi semelhante ao do plasma normal: pelo menos 98% da preparação de proteína sendo IgG, a concentração média de IgA foi de 37 yg/ml (nenhum destes lotes tinha uma concentração de IgA >140 yg/ml) e IgM estava presente apenas em quantidades vestigiais. As funções Fc e Fab foram mantidas. Não foi detectada actividade do activador pré-calicreína.
Exemplo 2
Preparação de SUBQ NG 20% (20% IG) A. Produção de uma composição de IG purificada concentrada a. Resumo
Plasma de lotes congelados de dadores de sangue foi separado numa amostra de plasma com pouca crioglobulina para isolamento de vários factores de coagulação e inibidores brutos antes de subsequente fraccionamento com álcool frio usando uma procedimento de fraccionamento de Cohn como descrito por Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55. O processo de fraccionamento com álcool deu um fracção IG intermédia principal, referida como Precipitado G, que foi ainda processada para dar o produto final usando purificação cromatográfica. A produção a jusante envolveu permuta catiónica (CM-Sepharose fluxo rápido) e cromato-grafia de permuta aniónica (ANX-Sephaorese fluxo rápido). Para proporcionar uma elevada margem de segurança relativamente à potencial transmissão de vírus, três passos dedicado à inactivação/remoção de virus, que se complementam no modo de actuação, foram integrados no processo de produção, nomeadamente: tratamento com solvente/detergente (mistura de 1% Triton X-100, 0,3 % tri-n-butilfosfato e 0,3 % polissorbato-80), nanofiltração (Asahi Planova 35 nm) , e pH baixo (4,7) armazenamento durante 3 semanas a temperatura elevada. b. Separação de crioprecipitados
Plasma de lotes congelados de dadores de sangue, já testados relativamente à segurança e qualidade, foi descongelado a uma temperatura não superior a 6°C. A centrifugação no frio foi realizada para separar sólidos e líquidos, que se formaram quando da descongelação do plasma. A porção líquida (também referida como "plasma pobre em crioglobulinas", após as proteínas insolúveis no frio serem removidas por centrifugação a partir de plasma descongelado de fresco) foi então arrefecida até 0±1°C e o seu pH ajustado a 7. 0 plasma sem criglobulinas foi usado para isolamento de vários factores de coagulação e inibidores brutos para subsequente fraccionamento com álcool frio. Sete vias foram escolhidas para adsorção em bloco dos factores de coagulação e inibidores brutos a partir do plasma pobre em crioglobulinas antes da purificação de SUBQ NG20% e são referidas como as vias 1 a 7 na Tabela 3.
Tabela 3. Vias para adsorção em bloco dos factores de coagulação e inibidores a partir de plasma pobre em crioglobulinas
Para a produção de SUBQ NG20% pré-clínica, os materiais de partida de Cohn derivados das vias 1 (plasma de fonte US sem passos de adsorção) , 3 (plasma de fonte US após FEIBA, adsorção AT-III) e 6 (plasma de fonte US após adsorção de F-IX, F-VII, AT-III) foram escolhidos para cobrir uma larga variedade de diferentes passos de adsorção antes do fraccionamento com álcool. Os vários processos de adsorção estão descritos em Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55; Polsler et al. (2008) Vox Sang. 94:184 — 192; Patentes U.S. Nos. 6,395,880 e 5,409,990; e Prothrombin complex: Brummelhuis in Methods of Plasma Protein Fractionation (J.M. Curling Editor, Academic Press, 1980).). c. Fraccionamento
i. Obtenção do sobrandanete da Fracção I
Enquanto o plasma estava em agitação, adicionou-se etanol pré-arreecido, para uma concentração alvo de 8% v/v de etanol e a temperatura foi ainda baixada para -2 a 0°C para permitir a precipitação. O sobrenadante (ou fracção I) foi colhido após centrifugação.
ii. Precipitado das fracções II e III A fracção I foi ajustada a pH 7 e a uma concentração de etanol de 20 a 25% v/v, enquanto a temperatura foi ainda mais baixada. Subsequentemente, realizou-se uma centrifugação para separar líquidos (Fracção II + sobrenadante III) e sólidos. iii. Extracção do precipitado das fracções II e
III
Um tampão de extracção frio (fosfato de sódio monobásico 5 mM, acetato 5 mM pH 4,510,2, condutividade de 0,7 a 0,9 mS/cm9 foi usado para ressuspender as as Fracções II + III numa proporção de 1:15 de precipitado: tampão de extracção. o processo de extracção foi realizado entre 2 e 8 °C. iv. Tratamento com silica fumada e filtração
Silica fumada (e.g. Aerosil 380 ou equivalente) foi adicionada à suspensão para uma concentração de aproximadamente 40 g/kg de suspensão (ou equivalente para 1,8 g/1 de plasma pobre em crioglobulinas) e foi misturado entre 2 e 8°C durante 50 a 70 minutos, os liquidos e sólidos foram separados por filtração entre 2 e 8°C usando um auxiliar de filtração (Hyflo Super-Cel, World Minerais Inc., 0,5 kg/kg de suspensão), seguido de pós-lavagem do prensa do filtro com tampão de extracção.
v. Fracção do precipitado G O filtrado foi misturado com polissorbato-80 numa concentração de aproximadamente 0,2% p/v com agitação durante pelo menos 30 minutos entre 2 e 8°C. Citrato de sódio desidratado foi então misturado na solução a 8 g/1 durante mais 30 minutos de agitação entre 2 e 8°C. o pH foi então ajustado a 7,0±0,1 com hidróxido de sódio 1M ou ácido acético 1M. Adicionou-se então álcool frio à solução para uma concentração de aproximadamente 25% v/v e realizado um passo de precipitação semelhante a Cohn II (Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-467). vi. Suspensão do precipitado G e tratamento com solvente/detergente 0 precipitado foi dissolvido e filtrado com um filtro profundo de um tamanho de poro nominal de 0,2 ym (e.g., filtro Cuno VR06 ou equivalente) para obter um filtrado límpido que foi usado para o tratamento com solvente/detergente (S/D). 0 primeiro dos passos da inactivação virai é o tratamento S/D do Precipitado G ressuspenso. A mistura de tratamento S/D continha 1,0 % (v/v) Triton X-100, 0,3 % (v/v) Tween-80, e 0,3 % (v/v) tri-n-butilfosfato, e a mistura foi mantida entre 18 e 25 °C durante pelo menos 60 minutos. d. Cromatografia de permuta catiónica A solução de proteína contendo S/D foi então passada através de uma coluna de permuta catiónica (Carboximetil(CM)-Sepharose fluxo rápido) para remover o solvente e detergente. Após lavagem para remoção dos reagentes S/D, as proteínas adsorvidas foram então eluídas com tampão de eluição de pH elevadp (pH 8,510,1). e. Cromatografia de permuta aniónica O eluato foi então ajustado a pH 6 e diluído para a condutividade adequada antes da solução ser passada através da coluna de permuta aniónica equilibrada (ANX-Sepharose fluxo rápido). 0 material não retido na coluna durante a aplicação e lavagem foi colhido para posterior processamento. f. Nanofiltração
No segundo dos três passos de inactivação, o efluente da coluna do último passo foi nanofiltrado (filtro Asahi Planova 35 nm) para gerar um nanofiltrado. g. Ultrafiltração e diafiltração A concentração de glicina do nanofiltrado foi ajustada a 0,25 M e o nanofiltrado foi ainda concentrado para uma concentração proteica de 5 ±1% p/v através de ultrafiltração e o pH ajustado a 5,210,2. De modo a atingir uma concentração proteica mais elevada para aplicação subcutânea, a ultrafiltração foi realização numa cassete com um écran de canal aberto e membrana de ultrafiltração (Millipore Pellicon Biomax) com uma massa molecular nominal de exclusão (NMWCO) de 50 kDa ou menos que foi especialmente desenhado para produtos de elevada viscosidade. O concentrado foi diafiltrado contra uma solução de glicina 0,25M com um pH de 4,210,2. O volume de permuta mínimo foi de 10X do volume de concentrado original. Durante a operação de ultrafiltração/diafiltração, a solução foi mantida entre 4 e 20°C. Após a diafiltração, a solução foi concentrada para uma concentração proteica mínima de 22% p/v e ajustada a 2 a 8°C.
Para recuperar a proteína residual total no sistema, aumentando assim a concentração proteica, a lavagem do primeiro grande sistema de ultrafiltração foi feita com pelo menos 2x o volume morto em modo de recirculação para assegurar que toda a proteína foi removida por lavagem. Depois a lavagem do primeiro sistema de ultrafiltração foi concentrada para uma concentração proteica de pelo menos 22% p/v com um segundo sistema de ultra-/diafiltração equipado com o mesmo tipo de membrana que foi dimensionada para um décimo ou menos que a primeira. 0 concentrado pós-lavagem foi adicionado à solução global. 0 segundo sistema de ultrafiltração foi então lavado e a temperatura da solução foi ajustada a 2 a 8°C. h. Formulação
Para a formulação, a concentração proteica da solução foi ajustada a 20,410,4% p/v com pós-lavagem do segundo sistema de ultrafiltração mais pequeno e/ou com tampão de diafiltração. o pH foi ajustado entre 4,4 e 4,9, se necessário. 1. Nova esterilização A solução em bloco formulada foi ainda esteri- lizada através de uma primeira filtração através de um filtro de membrana com um tamanho absoluto de proo de 0,2 micron ou menos, depois foi distribuída assepticamente em recipientes finais para selagem adequada, sendo tiradas amostras para testar. O passo de inactivação/remoção de vírus foi realizado através do armazenamento dos recipientes entre 30 e 32°C durante 21 a 22 dias.
Assim, as formulações de 20% de IG resultantes eram formulações líquidas isotónicas de imunoglobulina altamente purificada (pelo menos 95% de gama globulina) formulada em 0,25 mM glicina a pH 4,4 a 4,9. As preparações finais usadas nos estudos foram os lotes SC00107NG, SC00207NG e SC00307NG. B. Caracterização de lotes pré-clinicos
Os lotes pré-clínicos SC00107NG, SC00207NG e SC00307NG foram produzidos numa escala de 200 1 e caracterizados de acordo com a Tabela 4. Ao nível de produto final, a pureza da preparação foi ilustrada pelos níveis baixos das principais impurezas, as quais estavam bem abaixo de 0,1% da IG total. A distribuição da massa molecular (MSD) no produto 20% IG na fase final do processo era semelhante à MSD de um contentor final de 10% IG (Gammagard Liquid). Isto indicou que o aumento da concentração para 20% de proteína não teve um impacto negativo na integridade da molécula de IgG.
Tabela 4. Caracterização dos lotes de SUBQ NG20%
Os critérios preliminares de libertação do contentor final foram definidos com base nos requisitos das autoridades dos EUA e Europeias (FDA e EMEA) para as imunoglobulinas humanas subcutâneas, as especificações do contentor final do produto actual para administração subcutânea (SUBCUVIA, autorizado para administração subcutânea na Europa) e as especificações do Gammagard Liquid. A caracterização do espectro de anticorpos relevantes dos três contentores finais foi completada e comparada com os resultados dos lotes pré-clinicos 10% IG Triple Virally Reduced (TVR). A Tabela 5 compara os resultados dos títulos de anticorpos e dos factores de enriquecimento dos três contentores finais pré-clínicos SUBQ NG20% e dos lotes pré-clínicos de Gammagard Liquid. Os resultados são da mesma ordem de grandeza para ambos os lotes.
Tabela 5. Comparação dos dados de libertação de SUBQ NG20% e 10% IG TVR
Testes de controlo de qualidade adicionais foram realizados para avaliar o nivel de impurezas relacionadas com o produto e/ou processo. A Tabela 6 mostra os dados de controlo de qualidade dos três contentores finais de SUBQ NG20%. A remoção das impurezas relacionadas com o produto e o processo é satisfatória e todas as especificações preliminares relacionadas com o produto são satisfeitas para os três lotes.
Tabela 6. Testes de controlo de qualidade do contentor final de SUBQ NG20%
(continuação)
Os parâmetros do processo monitorizados durante a produção pré-clinica e a caracterização dos intermediários e do produto final mostraram não haver diferenças óbvias detectáveis entre os três lotes. Todos os contentores finais satisfaziam as especificações preliminares relacionadas com o produto independentemente do tipo de material de partida escolhido (Precipitado G VNELG171, VNELG173 ou LB0790301).
C. Estudo de armazenamento das formulações de 20% IG
Para avaliar a estabilidade ao armazenamento dos contentores finais de 20% IG, os três lotes pré-clínicos atrás descritos (SC00107NG, SC00207NG, SC00307NG) e um lote de praticabilidade (IgGSC 62/1) foram guardados entre 2 e 8 °C e entre 28 e 30 °C (lote de praticabilidade apenas) até 18 meses. A cromatografia por exclusão de tamanho de alta resolução foi usada para determinar a distribuição da massa molecular (MSD) e a estabilidade das amostras. O principal parâmetro indicador da estabilidade é a massa molecular e uma alteração na massa pode ser resultado da degradação por desnaturação, agregação ou fragmentação. A MSD dos contentores finais pré-clínicos após armazenamento entre 2 e 8°C até 12 meses está mostrada na Tabela 7. A Tabela 8 dá a MSD do lote de praticabilidade, IgGSC 62/1, entre 2 e 8 °C e entre 28 e 30 °C, após armazenamento até 18 meses. Os dados confirmaram que o produto satisfaz as especificações pré-definidas para os parâmetros investigados até 18 meses de armazenamento entre 2 e 8°C e entre 28 e 30°C.
Tabela 7. MSD dos lotes pré-clínicos de 20%IG entre 2 e 8°C
(continuação)
Tabela 8. MSD do lote de aplicabilidade IgGSC 62/1 entre 2 e 8°C e entre 28 e 30°C
D. Estudo da estabilidade das várias concentrações e formulações de IG A estabilidade ao armazenamento de formulações com elevada concentração proteica (14-20%) com pH baixo (glicina 0,25M pH 4,4-4,9) foi comparada com formulações de elevada concentração proteica com pH neutro (22,5 g/1 de glicina, 3 g/1 NaCl, pH 7,0), que estão actualmente a ser usados para imunoglobulinas injectáveis intramuscularmente e subcutaneamente.
Todas as corridas começaram com concentrações do nanofiltrado para 5% de proteina. Realizou-se uma troca de tampão 10X contra glicina 0,15M (concentração de glicina mais baixa investigada), seguido da concentração final para um valor alvo acima de 20% de proteina usando uma membrana Millipore de polietersulf ona 0,5 m2 com uma massa de exclusão de 30K (écran padrão). Os contentores finais foram formulados e guardados a pH baixo (4,7) ou o armazenamento a pH baixo foi feito bloco e depois foram formulados a pH neutro (7,0) antes do armazenamento entre 2 e 8°C ou entre 28 e 30°C durante 3 meses. Após 3 meses, a distribuição da massa molecular foi determinada por cromatografia de exclusão por tamanho de alta resolução de modo a determinar o teor dos agregados e fragmentos. Os critérios de aceitação foram definidos como: monómeros e oligómeros/di-meros, > 90 %; agregados, ^ 5 %; fragmentos, ^ 5 %. O titulo ACA foi testado como descrito na Farmacopeia Europeia. O titulo ACA aceitável foi definido como inferior a 50% de unidades CH50 consumidas por mg de proteina.
As Tabelas 9 e 10 mostram o teor em agregados e fragmentos assim como o título ACA após 3 meses de armazenamento entre 28 e 30°C e entre 2 e 8°C, respectivamente, para as formulações padrão (pH 4,7, glicina 0,25 M; ou pH 7,0, 22,5 g/1 glicina, 3 g/1 NaCl) a diferentes concenteações proteicas. Os dados mostram claramente que a formulação a pH baixo possuía menos agregados e o título ACA mais baixo após 3 meses de armazenamento entre 28 e 30°C. Todos os títulos ACA das formulações a pH 7,0 estavam acima do critério de aceitação definido para este teste.
Os resultados entre 2 e 8°C confirmam a tendência observada entre 28 e 30°C. Os títulos ACA estavam todos abaixo do limite definido como critério de aceitação, se bem que as formulações de pH 7,0 pareçam possuir valores mais elevados. O valor da proteína não influencia os resultados dos parâmetros testados.
Tabela 9. Valores dos fragmentos, agregados e ACA após 3 meses de armazenamento entre 28 e 30°C a pH 4,7 e a pH 7,0 em diferentes concentrações de proteína
Tabela 10. Valores dos fragmentos, agregados e ACA após 3 meses de armazenamento entre 2 e 8°C a pH 4,7 e a pH 7,0 em diferentes concentrações de proteína
Estudou-se a influência dos diferentes procedimentos de concentração na MSD e titulo ACA. 0 primeiro procedimento usou uma membrana Millipore de polietersulfona de 0,5 m2 com uma exclusão molecular de 30K (écran padrão), como atrás descrito, e o segundo procedimento usou uma membrana Millipore de polietersulfona de 0,5 m2 com écran aberto, adequada para soluções de viscosidade mais elevada. As fracções pós-lavagem foram concentradas através de um segundo sistema de ultra-/diafiltração com uma superfície de membrana inferior (0,lm2, écran aberto) de modo a reduzir as perdas de rendimento.
As Tabelas 11 e 12 mostram MSD e o título ACA após 3 meses de armazenamento entre 28 e 30°C ou entre 2 e 8°C, respectivamente, para as formulações de pH baixo (4,7) a várias concentrações proteicas. Os dados mostraram resultados semelhantes após 3 meses de armazenamento para ambos os modos de concentração. Os valores obtidos entre 2 e 8°C confirmaram os resultados obtidos entre 28 e 30°C. o método de concentração não influencia a estabilidade do produto, apesar de pós-lavagem adequada poder apenas ser conseguida com membranas de écran aberto.
Tabela 11. Valores dos fragmentos, agregados e ACA após 3 meses de armazenamento entre 28 e 30°C a pH 4,7 com diferentes métodos de de concentração de proteína
Tabela 12. Valores dos fragmentos, agregados e ACA após 3 meses de armazenamento entre 2 e 8°C a pH 4,7 com diferentes métodos de de concentração de proteína
Exemplo 3
Preparação de PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20) A. Geração de uma linha celular que expressa rHuPH20 solúvel 0 plasmídeo HZ24 (descrito em SEQ ID NO:52) foi usado para transfectar células de ovário de hamster chinês (CHO) (ver, e.g., pedidos de patente Nos. 10,795,095, 11/065,716 e 11/238,171). O vector plasmídeo HZ24 para expressão de rHuPH20 solúvel contem um esqueleto de vector pCI (Promega), DNA codificador dos aminoácidos 1-482 da hialuronidase humana PH20 (SEQ ID NO:49), um local interno de entrada do ribossoma (IRES) do virus ECMBV (Clontech) e o gene da diidrofolato redutase (DHFR) de murganho. O esqueleto de vector pCI também inclui DNA codificador do gene de resistência à beta-lactamase (AmpR), uma origem de replicação fl, uma região de estimulador/promotor precoce imediato de citomegalovirus (CMV), um intrão quimérico e um sinal de poliadenilação tardio de SV40 (SV40). O DNA codificador da construção de rHuPH20 solúvel possui um local Nhel e uma sequência de consenso Kozak antes do DNA codificador da metionina na posição de aminoácido 1 da sequência sinal de 35 aminoácidos nativa de PH20 humana e um codão de paragem após o DNA codificador da tirosina correspondente ao aminoácido na posição 482 da hialuronidase PH20 humana (descrito em SEQ ID NO:l), seguido de um local de restrição BamHI. A construção pCI- PH20-IRES- DHFR-SV4 Opa (HZ24), resulta assim numa única espécie de mRNA regulada pelo promotor CMV que codifica os aminoácidos 1-482 de PH20 humana (descrita em SEQ ID NO: 3) e os aminoácidos 1-186 da diidrofolato redutase de murganho (descrita em SEQ ID NO:53), separadas pelo local interno de entrada do ribossoma (IRES). Células CHO DG44 não transfectadas a crescer em meio GIBCO CD-CHO modificado para células DHFR(-), suplementado com glutamina 4 mM e 18 ml/1 de Pluronic F68/1 (GIBCO) foram semeadas a 0,5 x 106 células/ml num frasco de agitação na preparação para transfecção. As células foram crescidas a 37 °C em 5% CO2 numa incubadora humidificada, com agitação a 120 rpm. As células CHO DG44 em crescimento exponencial não transfectadas foram testadas relativamente à viabilidade antes da transfecção.
Sessenta milhões de células viáveis da cultura de células CHO DG44 não transfectadas foram sedimentadas e ressuspensas para uma densidade de 2 x 107 células em 0,7 ml de tampão de transfecção 2X (2x HeBS: 40 mM Hepes, pH 7, 0, 274 mM NaCl, 10 mM KC1, 1,4 mM Na2HP04 12 mM dextrose). A cada aliquota de células ressuspensas, adicionou-se 0,09 ml (250 yg) do plasmídeo HZ24 (linearizado por digestão durante a noite com Cia I (New England Biolabs) ) , e as soluções de células/DNA foram transferidas para cuvetes de electroporação com um intervalo de 0,4 cm BTX (Gentronics) à temperatura ambiente. Um controlo negativo de electroporação foi realizado sem DNA plasmídico misturado as células. As misturas de células/plasmídeo foram electroporadas com uma descarga do condensador de 330 V e 960 pF ou a 350 V e 960 pF.
As células foram removidas das cuvetes após electroporação e transferidas para 5 ml de meio CD-CHO modificado para células DHFR(-), suplementado com glutamina 4 mM e 18 ml/1 de Pluronic F68/1 (Gibco) e deixadas a crescer num alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 6 alvéolos sem selecção durante 2 dias a 37°C em 5% CO2 numa incubadora humidificada.
Dois dias após electroporação, 0,5 ml de meio de cultura de tecidos foi removido de cada alvéolo e testado relativamente à presença de actividade de hualuronidase, usando o ensaio de microtubidez descrito no Exemplo 4.
Tabela 13. Actividade inicial de hialuronidase de células CHO DG44 transfectadas com HZ24 às 40 horas pós-transfecção
As células da transfecção 2 (350V) foram colhidas do alvéolo de cultura de tecidos, contadas e diluídas para 1 xlO4 a 2 x 104 células viáveis por ml. Uma alíquota de 0,1 ml da suspensão celular foi transferida para cada alvéolo de cinco placas de cultura de tecidos 96 alvéoloc de fundo redondo. Cem microlitros de meio CD-CHO (GIBCO) contendo suplemento de GlutaMAX™-l (GIBCO™, Invitrogen Corporation) e sem os suplementos de hipoxantina e timidina foram adicionados aos alvéolos contendo células (volume final 0,2 ml).
Dez clones foram identificados a partir de 5 placas crescidos sem metotrexato.
Tabela 14. Actividade de hialuronidase dos clones identificados
Seis clones HZ24 foram expandidos em cultura e transferidos para frascos de agitação como suspensões de células isoladas. Os clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11, e 4D10 foram colocados em placas de cultura de tecidos de 96 alvéolos de fundo redondo usando uma estratégia de diluição infinita bidimensional em que as células foram diluídas a 1:2 verticalmente e a 1:3 horizontalmente, começando com 5000 células no alvéolo do topo esquerdo. Os clones diluídos foram crescidos num fundo de 500 células CHO DG44 não transfectadas por alvéolo, para proporcionar os factores de crescimento necessários para os dias iniciais de cultura. Foram feitas dez placas por suclone, com 5 placas contendo metotrexato 50 nM e 5 placas sem metotrexato. O clone 3D3 produziu 24 subclones visuais (13 sem tratamento com metotrexato e 11 do tratamento com metotrexato). Actividade de hialuronidase significativa foi medida nos sobrenadantes de 8 dos 24 subclones (>50 Unidades/ml) e estes 8 subclones foram expandiso para frascos de cultura de tecidos T-25. Os clones isolados a partir do protocolo de tratamento com metotrexato foram expandiso na presença de metotrexato 50 nM. O clone 3D35M foi ainda expandido em metotrexato 500 nM dando origem a clones produtores de 1000 Unidades/ml em excesso em frasocs de agitação (clone 3D35M; ou Genl 3D35M). Um banco de células mãe ("master cell bank", MCB) das células 3D35M foi então preparado. B. Produção e purificação de PH20 humana Genl a. Processo do biorreator de 5 1
Uma ampola de 3D35M foi descongelada e expandida a partir de frascos de agitação para frascos com agitação magnética de 1 1 em meio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad Calif.) suplementado com metotrexato 100 nM e GlutaMAX™-l (Invitrogen). As células foram transferidas dos frascos de agitação magnética para um biorreactor de 5 1 (Braun) numa densidade de inoculação de 4 x 105 células viáveis/ml. Os parâmetros foram: ponto definido para a temperatura: 37°C; pH 7,2 (ponto de partida definido); ponto definido para o oxigénio dissolvido: 25%; e camada de ar: 0-100 cc/min. Às 168 hrs, 250 ml de Meio de alimentação #1 (CD CHO com 50 g/1 de glucose) foi adicionado. Às 216 horas, adicionou-se 250 ml de Meio de alimentação #2 (CD CHO com 50 g/1 de glucose e butirato de sódio 10 mM) e às 264 horas adicionou-se 250 ml de Meio de alimentação #2. Este processo resultou numa produtividade final de 1600 Unidades/ml com uma densidade celular máxima de 6 x 106 células/ml. A adição de butirato de sódio foi para aumentar dramaticamente a produção de rHuPH20 solúvel nas fases finais de produção. O meio condicionado do clone 3D35M foi clarificado por filtração profunda e diafiltração de fluxo tangencial em Hepes lOmM pH 7,0. rHuPH20 solúvel foi então purificada por cromarografia sequencial em permuta iónica Q Sepharose (Pharmacia) , Phenyl Sepharose (Pharmacia) croma-tografia de interacção hidrofóbica, fenilboronato (Prome-tics) e cromatografia em hidroxiapatite (Bio-Rad, Richmond, CA) . rHuPH20 solúvel ligou-se a Q Sepharose e foi eluida com NaCl 400 mM no mesmo tampão. O eluato foi diluído com sulfato de amónio 2M para uma concentração final de sulfato de amónio de 500 mM e passada através de uma coluna de Phenyl Sepharose (baixo sub), seguido de ligação ns mesmas condições a uma resina de fenilboronato. A rHuPH20 solúvel foi eluida a partir da resina de Phenyl Sepharose em Hepes pH 6,9 após lavagem e pH 9,0 em bicina 50 mM sem sulfato de amónio. O eluato foi aplicado numa resina de hidroxiapatite cerâmica a pH 6,9 em fosfato de potássio 5 mM e CaCl2 1 mM e eluida com fosfatod e potássio 80 mM, pH 7,4 com CaCl2 0,1 mM. A rHuPH20 solúvel purificada resultante possuía uma actividade específica em excesso de 65000 Unidades USP/mg de proteína pelo ensaio de microturbidez (Exemplo 4) usando o padrão de referência USP. rHuPH20 eluiu como um único pico entre os 24 e os 26 minutos de uma coluna de estirenodivinilbenzeno Pharmacia 5RPC com um gradiente entre 0,1% TFA/H2O e 0,1% TFA/90% acetonitrilo/10% H2O e resolvida como umabanda única larga de 61 kDa por electroforese com SDS que reduziu para uma banda estreita de 51 kDa quando do tratamento com PNGASE-F. A sequenciação dos aminoácidos N-terminal revelou qua o péptido líder tinha sido eficientemente removido. b. Processo de expansão da cultura celular a montante para a cultura celular em biorreactor de 100 1
Usou-se um processo de aumento de escala para separadamente purificar rHuPH20 solúvel a partir de quatro ampolas diferentes de células 3D35M para produzir 4 lotes separados de rHuPH20; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C e HUA0420C. Cada ampola foi expandida separadamente e cultivada num biorreactor de 125 1, depois purificada usando cromatografia em coluna. Retiraram-se amostras ao longo do processo para avaliar parâmetros tais como rendimento da enzima. A descrição do processo proporcionado abaixo descreve especificações representativas de coisas tais como volumes de meio de partida e de alimentação do biorreactor, densidades celulares das transferências e volumes de lavagem e eluição. Os números exactos variam ligeiramente para cada lote e estão detalhados nas Tabelas 15 a 22.
Quatro ampolas de células 3D35m foram descongeladas num banho-maria a 37°C, adicionou-se meio CD CHO contendo metotrexato 100 nM e 40 ml/1 de GlutaMAXT™-l e as células foram centrifugadas. As células foram ressuspensas num frasco de agitação de 125 ml com 20 ml de meio fresco e colocadas numa incubadora a 37°C com 7% de CO2. As células foram expandidas para 40 ml num frasco de agitação de 125 ml. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para um frasco de agitação magnética de 125 ml num volume de meio de cultura de 100 ml. O frasco foi incubado a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para um frasco de agitação magnética de 250 ml num volume de 200 ml de cultura e o frasco foi incubado a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para um frasco com agitação magnética de 11 num volume de cultura de 800 ml e incubada a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para um frasco com agitação magnética de 6 1 num volume de cultura de 5 1 e incubada a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para um frasco com agitação magnética de 36 1 num volume de cultura de 20 1 e incubada a 37°C, 7% C02.
Um reactor de 125 1 foi esterilizado com vapor a 121°C, 20 psi e adicionados 65L de meio CD CHO. Antes de usar, o reactor foi verificado relativamente a contaminação. Quando a densidade celular atingiu 1,8-2,5 x 106 células/ml, 20 1 da cultura celular foram transferidos dos frascos de agitação magnética de 36 1 para o biorreactor de 125 1 (Braun), resultando num volume final de 85 1 e numa densidade de sementeira de aproximadamente 4 x 105 células/ml. Os parâmetros foram: ponto definido para a temperatura: 37°C; pH 7,2; oxigénio dissolvido: 25% ± 10%; velocidade do impulsor: 50 rpm; pressão do vaso: 3 psi; ar aspergido: 1 L/ min.; camada de ar: 1 L/min. Foram retiradas amostras do reactor diariamente para contagem das células, verificação do pH, análise do meio, produção de proteína e retenção. Adições de nutrientes foram efectuadas durante as corridas. No Dia 6, adicionaram-se 3,4 1 de Meio de Alimentação #1 (CD CHO + 50 g/1 glucose + 40 ml/1
GlutaMAX™-l) e a temperature da cultura foi alterada para 36,5°C. No Dia 9, foram adicionados 3,5 1 de Meio de
Alimentação #2 (CD CHO + 50 g/1 glucose + 40 ml/1
GlutaMAX™-l + 1,1 g/1 piruvato de sódio), e a temperature da cultura foi alterada para 36°C. No dia 11, foram adicionados 3,7 1 Meio de Alimentação #3 (CD CHO + 50 g/1 glucose + 40 ml/1 GlutaMAX™-l + 1,1 g/1 de piruvato de sódio), e a temperature da cultura foi alterada para 35,5°C. O material do reactor foi colhido aos 14 dias, ou quando a viabilidade das células desceu abaixo de 50%. O processo resultou na produção de rHuPH20 solúvel com with uma actividade enzimática de 1600 Units/ml com uma densidade celular máxima de 8 milhões de células/ml. Quando da colheita, retirou-se uma amostra da cultura para testar micoplasmas, carga microbiana, endotoxinas e vírus in vitro e in vivo, microscopia electrónica de transmissão (TEM) para as partículas virais e actividade enzimática.
Uma cultura celular de biorreactor de 100 1 foi filtrada através de uma série de filtros de cápsulas descartáveis tendo um meio de polietersulfona (Sartorius): primeiro através de uma cápsula de profundidade 8,0 ym, a uma cápsula de profundidade 0,65 ym, uma cápsula de profundidade 0,22 ym, and finalmente através de um filtro de 0,22 ym Sartopore 2000 cm2 e para um saco de armazenamento estéril de 100 1. A cultura foi concentrada 10x usando dois filtros TFF com Spiral Polyethersulfone 30 kDa MWCO (Millipore), seguido de uma troca de tampão 6X com 10 mM HEPES, 25 mM NazSCú, pH 7,0, através de um filtro final de 0,22 μπι para um saco de armazenamento estéril de 20 L. A Tabela 15 proporciona dados demonitorização relacionados com os passos de cultura celular, colheita, concentração e troca de tampão.
Tabela 15. Dados da monitorização dos passos de cultura celular, colheita, concentração e troca de tampão
Preparou-se uma coluna de permuta iónica Q Sepahrose (Pharmacia) (3 1 de resina, altura = 20 cm;
diâmetro = 14 cm). As amostras das lavagens foram colhidas para determinação do pH, condutividade e ensaio de endotoxinas (LAL). A coluna foi equilibrada com 5 volumes da coluna de 10 mM Tris, 20 mM Na2S04, pH 7,5 e 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7,0. A proteína foi eluída com 10 mM
Hepes, 400 mM NaCl, pH 7,0, e filtrada através de um filtro final de 0,22 ym para um saco estéril.
Em seguida realizou-se cromatografia de interac-ção hidrofóbica em Phenyl Sepharose (Pharmacia). Preparou-se uma coluna de Phenyl Sepharose (PS) (9,1 1 de resina, altura = 29 cm, diâmetro = 20 cm). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. O eluato da proteína atrás foi suplementado com soluções stock de sulfato de amónio 2 M, fosfato de potássio 1 M e Cacl2 1M para concentrações finais de 5 mM, 0,5 M e 0,1 mM, respectivamente. A proteína foi aplicada na coluna PS num fluxo de 100 cm/hr. Adicionou-se fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0, a 100 cm/hr. 0 material não retido foi passado através de um filtro final de 0,22 ym para um saco estéril.
A proteína purificada por PS foi então aplicada numa coluna de aminofenilboronato (ProMedics) (6,3 1 de resina, altura = 20 cm, diâmetro = 20 cm) que foi equilibrada com 5 volumes de coluna de fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio. A proteína foi passada através da coluna num fluxo de 100 cm/hr e a coluna foi lavada com fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5M, pH 7,0. A coluna foi então lavada com bicina 20 mM, NaCl 100 mM, pH 9,0 e a proteína eluída com hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9, através de um filtro estéril e para um saco estéril de 20 1. 0 eluato foi testado relativamente à carga microbiana, concentração de proteína e actividade enzimática.
Uma coluna de hidroxiapatite (HAP) (Bio-Rad) (1,6 1 de resina, altura = 10 cm, diâmetro = 14 cm) foi equilibrada com fosfato de potássio 5 mM, NaCl 100 mM, NaCl2 0,1 mM, pH 7,0. As amostras das lavagens foram colhidas e testadas relativamente ao pH, condutividade e endotoxinas (ensaio LAL). A proteína purificada por amino-fenilboronato foi suplementada com fosfato de potássio e CaCl2 para dar concentrações finais de fosfato de potássio 5 mM e CaCÍ2 0,1 mM, foi então aplicada numa coluna HAP num fluxo de 100 cm/hr. A coluna foi lavada com fosfato de potássio 5 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM, depois fosfato de potássio 10 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. A proteína foi eluída com fosfato de potássio 70 mM, pH 7,0, e filtrada através de um filtro de 0,22 ym para um saco de armazenamento estéril. 0 eluato foi testado relativamente à carga microbiana, concentração proteica e acti-vidade enzimática. A proteína purificada por HAP foi então bombeada através de um filtro de remoção de vírus 20 nM através de um tanque de pressão. A proteína foi adicionada ao tanque de pressão DV20 e filtro (Pali Corporation), passando através de um filtro Ultipor DV20 com poros de 20 nm (Pali Corporation) para um saco de armazenamento estéril de 20 1. O filtrado foi testado relativamente à concentração proteica, actividade enzimática, perfil de oligossacáridos, monossacáridos e ácido siálico, e impurezas relacionadas com o processo. A proteína no filtrado foi então concentrada para 1 mg/ml usando sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) com exclusão de massa molecular (MWCO) de 10 kDa (Sartorius). O filtro foi primeiro preparado através de lavagem com solução de Hepes/soro fisiológico (Hepes 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,0) e colhida uma amostra do permeato para pH e condutividade. Após concentração, foi retirada uma amostra da proteína concentrada e testada para concentração proteica e actividade enzimática. Uma permuta de tampão 6X foi realizada na proteína concentrada para o tampão final: 10 mM Hepes, 130 mM NaCl, pH 7,0. A proteína concentrada foi passada através de um filtro de 0,22 ym para um saco de armazenamento estéril de 20 L. Retirou-se uma amostra de proteína e testou-se relativamente à concentração proteica, actividade enzimática, grupos sulfidrilo livres, perfil de oligossa-cáridos e osmolaridade.
As Tabelas 16 a 22 proporcionam dados de monitorização relacionados com cada um dos passos de purificação atrás descritos, para cada lete de células 3D35M.
Tabela 16. Dados da coluna de Q Sepharose
Tabela 17. Dados da coluna de Phenyl Sepharose
Tabela 18. Dados da coluna de fenllboronato
Tabela 19. Dados da coluna de hldroxiapatite
(continuação)
Tabela 20. Dados da filtração em DV20
Tabela 21. Dados da concentração final
Tabela 22. Dados da permuta de tampão para formulação final
A proteína rHuPH20 solúvel purificada e concentrada foi usada para encher assepticamente frascos estéreis com volumes de 5 ml e 1 ml. A proteína foi passada através de um filtro de 0,22 ym para uma bomba controlada pelo operador que foi usada para encher os frascos usando uma leitura gravimétrica. Os frascos foram fechados com rolhas fixadas com tampas cravadas. Os frascos fechados foram inspeccionados visualmente relativamente a partículas estranhas e depois rotulados. Após rotulagem, os frascos foram congelados rapidamente por submersão em azoto líquido durante não mais de 1 minuto e guardados a ^-15 °C (-20 ± 5 °C) . C. Produção de células Gen2 contendo PH20 humana solúvel (rHuPH20) A linha celular 335M Gen 1 atrás descrita foi adaptada a níveis mais elevados de metotrexato para produzir clones da geração 2 (Gen2). Células 3D35M foram semeadas a partir de culturas estabelecidas contendo metotrexato em meio CD CHO contendo GlutaMAX™-l 4 mM e metotrexato 1,0 μΜ. As células foram adaptadas a um nível mais elevado de metotrexato através do crescimento e passagem 9 vezes durante um período de 46 dias numa incubadora humidificada, a 37°C, 7% CO2. A população amplificada foi clonada por diluição limite em placas de cultura de 96 alvéolos contendo meio com metotrexato 2,0 μΜ. Após aproximadamente 4 semanas, os clones foram identificados e o clone 3Ε10Β foi seleccionado para expansão. As células 3E10B foram crescidas em meio CD CHO contendo GlutaMAX™-l 4 mM e metotrexato 2,0 μΜ durante 20 passagens. Um banco de células mãe (MCB) da linha celular 3E10B foi criado e congelado e usado para estudos subsequentes. A amplificação da linha celular continuou através da cultura de células 3E10B em meio CD CHO contendo GlutaMAX™-l 4 mM e metotrexato 4,0 μΜ. Após a décima segunda passagem, as células foram congeladas em ampolas como banco de células para pesquisa (RCB) . Uma ampola do RCB foi descongelada e cultivada em meio contendo metotrexato 8,0 μΜ. Após 5 dias, a concentração de metotrexato no meio foi aumentada para 16,0 μΜ, depois para 20,0 μΜ 18 dias mais tarde. As células da oitava passagem em meio contendo metotrexato 20,0 μΜ foram clonadas por diluição limite em placas de cultura de tecidos de 96 alvéolos contendo meio CD CHO contendo GlutaMAX™-l 4 mM e metotrexato 20,0 μΜ. Os clones foram identificados 5-6 semanas mais tarde e o clone 2B2 foi seleccionado para expansão em meio contendo metotrexato 20,0 μΜ. Após a décima primeira passagem, as células 2B2 foram congeladas em ampolas como banco de células para pesquisa (RCB).
As células 2B2 resultantes são células CHO DG44 deficientes diidrofolato redutase (dhfr-) que expressam PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20). A rHuPH20 solúvel está presente nas células 2B2 num número de cópias de aproximadamente 206 cópias/célula. A análise de transferências Southern do DNA genómico de células 2B2 digerido com Spe I-, Xba I- e BamH I/Hind III usando uma sonda especifica de rHuPH20 revelou o seguinte perfil de restrição: uma banda principal com hibridação de ~7,7 kb e quatro bandas com hibridação mais fraca (—13,9, ~6,6, ~5,7 e ~4,6 kb) com DNA digerido com Spe I; uma banda com hibridação forte de ~5,0 kb e duas bandas de hibridação mais fracas (~13,9 e ~6,5 kb) com DNA digerido com Xbal; e uma só banda de hibridação de ~1,4 kb observada usando DNA de 2B2 digerido com BamHI/HindiII. A análise da sequência do transcrito de mRNA indicou que o cDNA derivado (SEQ ID NO: 56) era idêntico ao da sequência de referência (SEQ ID NO:49) excepto uma diferença num par de bases na posição 1131, que foi observado ser uma timidina (T) em vez da citosina (C) esperada. Esta é uma mutação silenciosa, sem efeito na sequência de aminoácidos. D. Produção de rHuPH20 solúvel Gen2 por culturas celulares de biorreactores de 300 1
Uma ampola de HZ24-2B2 foi descongelada e expandida dos frascos de agitação para frascos de agitação magética de 36 1 em meio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com metotrexato 20 μΜ e GlutaMAX™-l (Invitrogen). Resumidamente, a ampola de células foi descongelada num banho-maria a 37°C, o meio foi mudado e as células forma centrifugadas. As células foram ressuspensaa num frasco de agitação de 125 ml com 20 ml de meio fresco e colocadas numa incubadora a 37°C, 7% CO2. As células foram expandidas até 40 ml no frasco de agitação de 125 ml. Quando a densidade celular foi superior a 1,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para um frasco de agitação magnética de 125 ml num volume de cultura de 100 ml. O frasco foi incubado a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu mais de 1,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para expandida para um frasco de agitação magnética de 250 ml num volume de cultura de 200 ml e o frasco foi incubado a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu mais de 1,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para expandida para um frasco de agitação magnética de 1 1 num volume de cultura de 800 ml e 0 frasco foi incubado a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu mais de 1,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para expandida para um frasco de agitação magnética de 6 1 num volume de cultura de 50 0 0 ml e o frasco foi incubado a 37°C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu mais de 1,5 x 106 células/ml, a cultura foi expandida para expandida para um frasco de agitação magnética de 36 1 num volume de cultura de 32 1 e incubado a 37°C, 7% C02.
Um reactor de 400 1 foi esterilizado e 230 ml de meio CD CHO foi adicionado. Antes de usar, o reactor foi verificado relativamente a contaminação. Aproximadamente 30 1 de células foram transferidos dos frascos de agitação magnética de 36 1 para o biorreactor de 400 1 (Braun) , a uma densidade de inoculação de aproximadamente 4 x 105 células viáveis/ml e um volume total de 260 1. Os parâmetros foram: ponto definido para a temperatura: 37°C; pH 7,2; velocidade do impulsor: 40-55 rpm; pressão do vaso: 3 psi; ar aspergido: 0,5-1,5 Ι/min.; camada de ar: 3 1/min. Foram retiradas amostras do reactor diariamente para contagem das células, verificação do pH, análise do meio, produção de proteína e retenção. Igualmente, durante as corridas foram feitas adições de nutrientes. Às 120 hrs (dia 5), adicionaram-se 10,4 1 de Meio de Alimentação #1 (CD CHO 4x + 33 g/1 glucose + 160 ml/1 GlutaMAX™-l + 83 ml/1 de extracto de levedura + 33 mg/1 de rHuInsulin) . Às 168 hrs (dia 7), foram adicionados 10,8 1 de Meio de
Alimentação #2 (CD CHO + 33 g/1 glucose + 180 ml/1
GlutaMAX™-l + 167 ml/1 de extracto de levedura + 0,92 g/1 butirato de sódio) , e a temperature da cultura foi alterada para 36,5°C. Às 216 hrs (dia 9), foram adicionados 10,8 1 de Meio de Alimentação #3 (CD CHO lx + 50 g/1 glucose + 50 ml/1 GlutaMAX™-l + 250 ml/1 de extracto de levedura + 1,80 g/1 de butirato de sódio) , e a temperature da cultura foi alterada para 36°C. Às 264 hrs (dia 11), foram adicionados 10,8 1 de Meio de Alimentação #43 (CD CHO lx + 50 g/1 glucose + 50 ml/1 GlutaMAX™-l + 250 ml/1 de extracto de levedura + 0,92 g/1 de butirato de sódio), e a temperature da cultura foi alterada para 35,5°C. Observou-se que a adição do meio de alimentação aumentou dramaticamente a produção de rHuPH20 solúvel nas fases finais da produção. 0 material do reactor foi colhido aos 14 ou 15 dias, ou quando a viabilidade das células desceu abaixo de 40%. O processo resultou numa produtividade final de 17000 Unidades/ml com uma densidade celular máxima de 12 milhões de células/ml. Quando da colheita, retirou-se uma amostra da cultura para testar micoplasmas, carga microbiana, endotoxinas e virus in vitro e in vivo, microscopia electrónica de transmissão (TEM) para as partículas virais e actividade enzimática. A cultura foi bombeada por uma bomba peristáltica através de quatro módulos do sistema de filtração Millistak (Millipore) em paralelo, cada um contendo uma camada de terra de diatomáceas de 4-8 ym e uma camada de terra de diatomáceas de 1,4-1,1 ym, seguido de uma membrana de celulose, depois através de um segundo sistema de filtração Millistak (Millipore) contendo uma camada de terra de diatomáceas de 0,4-0,11 ym e uma camada de terra de diatomáceas <0,1 ym, seguido de uma membrana de celulose, e depois através de um filtro final de 0,22 ym para um saco flexível, estéril, descartável, com uma capacidade de 350 1. O fluido da cultura celular colhida foi suplementado com EDTA 10 mM e tris 10 mM para um pH de 7,5. A cultura foi concentrada 10χ usando um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) com quatro filtros de polietersulfona (PES) com massa molecular de exclusão de 30 kDa MWCO Sartoslice TF (Sartorius), seguido de uma troca de tampão 10X com Tris, 20 mM Na2S04, pH 7,5, através de um filtro final de 0,22 ym para um saco de armazenamento estéril de 50 L. O material diafiltrado concentrado colhido foi inactivado para vírus. Antes da inactivação virai, uma solução de 10% Triton X-100, 3% tri-n-butilfosfato (TNBP) foi preparada. O material diafiltrado concentrado colhido foi exposto a 1% Triton X-100, 0,3% TNBP durante 1 hora num vaso de reacção de 36 1 imediatamente antes da purificação em coluna Q. E. Purificação de rHuPH20 solúvel Gen2
Preparou-se uma coluna de permuta iónica Q Sepahrose (Pharmacia) (9 1 de resina, altura = 29 cm; diâmetro = 20 cm). As amostras das lavagens foram colhidas para determinação do pH, condutividade e ensaio de endotoxinas (LAL). A coluna foi equilibrada com 5 volumes da coluna de 10 mM Tris, 20 mM Na2S04, pH 7,5. Após inactivação virai, o material diafiltrado concentrado colhido foi aplicado na coluna Q a um fluxo de 100 cm/hr. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de Tris 10 mM, Na2S04 20 mM, pH 7,5 e 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7,0. A proteína foi eluída com 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7,0, e filtrada através de um filtro final de 0,22 ym para um saco estéril. A amostra de eluato foi testada relativamente à carga microbiana, concentração proteica e actividade de hialuronidase. Foram feitas leituras de absorvância a 280 nm no começo e no fim da permuta.
Em seguida realizou-se cromatografia de interacção hidrofóbica em Phenyl Sepharose (Pharmacia). Preparou-se uma coluna de Phenyl Sepharose (PS) (19-21 1 de resina, altura = 29 cm, diâmetro = 30 cm) . A lavagem foi colhida e uma amostra testada para pH, condutividade e endotoxinas (ensaio LAL) . A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. O eluato da proteína da coluna de Q Sepharose foi suplementado com soluções stock de sulfato de amónio 2 M, fosfato de potássio 1 M e Cacl2 1M para concentrações finais de 5 mM, 0,5 M e 0,1 mM, respectivamente. A proteína foi aplicada na coluna PS num fluxo de 100 cm/hr e colhido o material não ligado. A coluna foi lavada com fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0, a 100 cm/hr e a lavagem foi adicionada ao material não retido colhido. A combinação da lavagem e do material não retido foi passada através de um filtro final de 0,22 ym para um saco estéril. 0 material não retido foi testado relativamente à carga microbiana, concentração proteica e actividade enimática.
Preparou-se uma coluna de aminofenilboronato (ProMetic). A lavagem foi colhida e testada para pH, condutividade e endotoxinas (ensaio LAL) . A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5 mM. O material não retido de PS contendo proteína proteína purificada foi aplicado na coluna de aminofenilboronato a um fluxo de 100 cm/hr. A coluna foi lavada com fosfato de potássio 5 mM, sulfato de amónio 0,5M, pH 7,0. A coluna foi lavada com bicina 20 mM, sulfato de amónio 0,5M, pH 9,0. A coluna foi lavada com bicina 20 mM, NaCl 100 mM, pH 9,0. A proteína foi eluída com Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6, 9, e passada através de um filtro estéril para um saco estéril. A amostra eluída foi testada relativamente à carga microbiana, concentração de proteína e actividade enzimática.
Preparou-se uma coluna de hidroxiapatite (HAP) (Bio-Rad).A lavagem foi colhida e testada para pH, condutividade e endotoxinas (ensaio LAL). A coluna foi equilibrada com fosfato de potássio 5 mM, NaCl 100 mM, NaCl2 0,1 mM, pH 7,0. A proteína purificada por aminofenilboronato foi suplementada para concentrações finais de fosfato de potássio 5 mM e CaCl2 0,1 mM e aplicada na coluna de HAP aum fluxo 100 cm/hr. A coluna foi lavada com fosfato de potássio 5 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. A coluna foi em seguida lavada com fosfato de potássio 10 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. A proteína foi eluída com fosfato de potássio 70 mM, pH 7,0, e filtrada através de um filtro de 0,22 ym para um saco estéril. A amostra eluída foi testada relativamente à carga microbiana, concentração proteica e actividade enzimática. A proteína purificada por HAP foi então passada através de um filtro de remoção de vírus. Primeiro preparou-se o filtro Viosart (Sartorius) esterilizado através da lavagem com 2 1 de fosfato de potássio 70 mM, pH 7,0. Antes de usar, o tampão filtrado foi testado quanto ao pH e condutividade. A proteína purificada por HAP foi bombeada com uma bomba peristáltica através de um filtro de remoção de vírus 20 nM. A proteína filtrada em fosfato de potássio 70 mM, pH 7,0, foi passada através de um filtro final de 0,22 ym para um saco estéril. A amostra filtrada foi testada relativamente à concentração proteica, acti-vidade enzimática, perfil de oligossacáridos, monossacári-dos e ácido siálico. A amostra também foi testada relativamente e impurezas relacionadas com o processo. A proteína no filtrado foi então concentrada para 10 mg/ml usando um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) com exclusão de massa molecular (MWCO) de 10 kDa (Sartorius). O filtro foi primeiro preparado através de lavagem com solução de histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0 e o permeato foi testado para pH e condutividade. Após concentração, foi retirada uma amostra da proteína concentrada e testada para concentração proteica e actividade enzimática. Uma permuta de tampão 6X foi realizada na proteína concentrada para o tampão final: histidina 10 mM, 130 mM NaCl, pH 67,0. Após permuta de tampão, a proteína concentrada foi passada através de um filtro de 0,22 ym para um saco de armazenamento estéril de 20 L. Retirou-se uma amostra de proteína e testou-se relativamente à concentração proteica, actividade enzimática, grupos sulfi-drilo livres, perfil de oligossacáridos e osmolaridade. A proteína em bloco, esterilizada por filtração, foi então distribuída assepticamente em volumes de 20 ml por ampolas de Teflon estéreis de 30 ml (Nalgene) . As ampolas foram então congeladas rapidamente e guardadas a -20 ± 5°C. F. Comparação da produção e purificação de rHuPH20 solúvel Genl e rHuPH20 solúvel Gen2 A produção e purificação de rHuPH20 solúvel Gen2 numa cultura celular em biorreactor de 300 1 continha algumas alterações nos protocolos comparativamente com a produção e purificação de rHuPH20 solúvel Genl numa cultura celular em biorreactor de 100 1. A Tabela 23 descreve exemplos de diferenças, para além das simples alterações de aumento de escala, entre os métodos.
Tabela 23. Comparação dos métodos Genl e Gen2
(continuação)
(continuação)
(continuação)
Exemplo 4
Determinação da actlvldade de hlaluronldase de rHuPH20 solúvel usando um ensaio de mlcroturbldez A actividade de hialuronidase de PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20) em amostras, tais como culturas celulares fracções de purificação e soluções purificadas foi determinada usando um ensaio turbidométrico, o qual se baseia na formação de um precipitado insolúvel quando o ácido hialurónico se liga a albumina sérica. A actividade é medida através da incubação de rHuPH20 solúvel com hialuronato de sódio (ácido hialurónico) durante um período de tempo estabelecido (10 minutos) e depois precipitando o hialuronato de sódio não digerido com a adição de albumina sérica acidificada. A turbidez da amostra resultante é medida a 640 nm após um período de revelação de 30 minutos. A redução da turbidez resultante da actividade enzimática no substrato hialuronato de sódio é uma medida da actividade de rHuPH20 solúvel. O método é realizado usando uma curva de calibração gerada com diluições de um padrão de referência de trabalho do ensaio de rHuPH20 solúvel e medições da actividade da amostra são feitas relativamente a esta curva de calibração.
As diluições da amostra foram preparadas em Soluções de Diluente da Enzima. A solução de diluente da enzima (EDS) foi preparada dissolvendo 33,0 ± 0,05 mg de gelatin hidrolisada em 25,0 mL do Tampão de Reacção 50 mM PIPES (140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5,5) e 25,0 ml de Água Estéril para Irrigação (SWFI), e diluindo 0,2 ml de solução a 25% de albumina sérica humana na mistura e agitando com vortex durante 30 segundos. Isto foi realizado dentro de 2 horas de uso e guardado em gelo até ser necessário. As amostras foram diluídas com EDS para 1-2 U/ml estimadas. De um modo geral, a diluição máxima por passo não excedeu 1:100 e o tamanho da amostra inicial para a primeira diluição não foi inferior a 20 μΐ. Os volumes mínimos de amostra necessários para a realização do ensaio foram: Amostras do processo, Fracções FPLC: 80 μΐ; sobrenadantes da cultura de tecidos; 1 ml; material concentrado: 80 μΐ; material purificado ou de passo final: 80 μΐ. Fizeram-se diluições em triplicado numa placa de 96 alvéolos de Ligação Baixa de Proteína e 30 μΐ de cada diluição foram transferidos para placas de fundo preto/transparente Optilux (BD BioSciences).
Diluições de rHuPH20 solúvel conhecidas com uma concentração de 2,5 U/ml foram preparadas em Solução de Diluente da Enzima para gerar uma curva padrão e adicionada à placa Optilux em triplicado. As diluições incluíram 0 U/ml, 0,25 U/ml, 0,5 U/ml, 1,0 U/ml, 1,5 U/ml, 2,0 U/ml, e 2,5 U/ml. Os alvéolos com "Branco de Reagentes" que continham 60 μΐ de Solução Diluente da Enzima foram incluídos na placa como um controlo negativo. A placa foi então coberta e aquecida num bloco térmico durante 5 minutos a 37°C. A tampa foi removida e a placa foi agitada durante 10 segundos. Após agitação, a placa voltou para o bloco térmico e o Sistema de Manipulação de Líquidos MULTIDROP 384 foi cheio com solução de hialuronato de sódio a 0,25 mg/ml aquecida (preparada por dissolução de 100 mg de hialuronato de sódio (LifeCore Biomedical) em 20,0 ml de SWFI. Isto foi misturado através de rotação e/ou agitação suave a 2-8°C durante 2-4 hrs ou até estar totalmente dissolvido. A solução de substrato foi preparada misturando 9 ml de SWFI, 10 ml PIPES e 1 ml de 5 mg/ml de hialuronato). A placa de reacção foi transferida para o MULTIDROP 384 e a reacção foi iniciada pressionando o botão de iniciar para distribuir 30 μΐ da solução do substrato hialuronato de sódio em cada alvéolo. A placa foi então removida do MULTIDROP 384 e agitado durante 10 segundos antes de ser transferido para um bloco térmico com a tampa da placa substituída. A placa foi incubada a 37°C durante 10 minutos. O MULTIDROP 384 foi preparado para parar a reacção através da introdução na máquina da solução de trabalho de soro (25 ml de solução stock de soro [1 volumede soro de cavalo (Sigma) foi diluído com 9 volumes de solução tampão acetato 500 mM, pH 4,3 e o pH foi ajustado a 3,1 com ácido clorídrico] em 75 ml de solução tampão acetato 500 mM, pH 4,3) e mudando o volume definido para 240 μΐ. A placa foi removida do bloco térmico e colocada no MULTIDROP 384 e 240 μΐ da solução de trabalho de soro foram distrubídos pelos alvéolos. A placa fi removida e agitada num eitor de placas durante 10 segundos. Após mais 15 minutos, a turbidez das amosras foi medida a 640 nm e a actividade de hialuronidase (em U/ml) de cada amostra foi determinada por extrapolação para a curva padrão. A actividade específica (Unidades/mg) foi calculada dividindo a actividade da hialuronidase (U/ml) pela concentração proteica (mg/ml).
Exemplo 5
Efeito do cloreto de sódio na estabilidade de rHuPH20 A rHuPH20 estava numa solução a pH 6,5 contendo 10 mg/ml em histidina/HCl e cloreto de sódio 130 mM (NaCl). Como se mostra na Tabela 24, preparou-se um total de 6 formulações diferentes contendo os componentes que se seguem: 25 mM Tris, pH 7,3, 100 pg/ml rHuPH20, 0,01 % Tween 80 e NaCl (0, 50, 100, 150, 200 ou 250 mM) . As soluções foram distribuídas por frascos de vidro de 2 ml tipo I com rolhas de borracha e seladas com tampas de alumínio. Uma série de frascos foi guardada a 40 °C durante 4 dias, e a outra série foi mantida no frigorífico entre 2 e 8 °C.
Tabela 24. Formulação de rHuPH20 com NaCl
Após 4 dias de armazenamento, cada uma das formulações mencionada na Tabela 24 foi testada relativamente à actividade de hialuronidase usando o ensaio de micro-turbidez descrito no Exemplo 4. A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) foi realizada para avaliar o nível de agregação usando as seguintes condições: IX PBS, coluna Toso BioScience G2000 SWXL, velocidado do fluxo = 1 ml/min. A tabela 25 mostra os resultados do estudo, incluindo a actividade de hialuronidase (U/ml), % da área do pico principal (percentagem da rHuPH20 gue estava contida na área do pico princial) e % da área do pico de agregados (percentagem de rHuPH20 gue estava contida na área do pico atribuída aos agregados) para cada formulação. Os resultados indicam que a estabilidade de rHuPH20, quando incubada a 40°C, estava dependente da concentração de NaCl: um aumento na concentração de NaCl conduziu a um aumento da actividade enzimática de rHuPH20. As amostras guardadas entre 2 e 8°C mantiveram níveis semelhantes de actividade enzimática de rHuPH20 no decurso do estudo, indepen- dentemente da formulação. Na ausência de NaCl a temperaturas elevadas (40°C), toda a actividade enzimática de rHuPH20 se perdeu.
Os resultados na Tabela 25 também mostram o efeito da concentração de NaCl nos níveis de agregados de rHuPH20. Os níveis de agregadps aumentaram com a redução da concentração de NaCl nas amostras guardadas a 40°C. Não houve essencialmente alterações nas amostras guardadas entre 2 e 8°C.
Assim, os resultados mostram que dentro da gama de concentrações de NaCl testadas (0-250 nM) houve uma relação directa entre a concentração de NaCl e o aumento da estabilidade de rHuPH20, sugerindo que a concentração de NaCl seja mantida tão elevada elevada quanto possível dentro dos limites de solubilidade e tonicidade de modo a aumentar a estabilidade de rHuPH20 a temperatura elevada.
Tabela 25. Actlvidades enzimáticas e resultados SEC das amostras guardadas 4 dias a 40°C e a 28°C.
Exemplo 6
Estabilidade de 10%IG ou 20%IG co-formulada com rHuPH20 A. Estabilidade de 10%IG ou de 20%IG co-formulada com rHuPH20 rHuPH2 0 foi formulada como se segue: 1 ml con tinha 1048071 unidads de hialuronidase humana recombinante do lote HUB0702CA (gerado usando a produção Gen2 descrita no Exemplo 3) em histidina 10 mM e cloreto de sódio (NaCl) 130 mM a pH 6,0. rHuPH20 foi diluída para 100000 U/l usando histidina 10 mM + NaCl 130 mM, pH 6,0, antes da mistura com imunoglobulina. Para este fim, 200 μΐ de solução stock de rHuPH20 foi diluída com 1896 μΐ de tampão histidina/NaCl, pH 6,0. A rHuPH20 pré-diluída foi adicionada a diferentes formulações de IG formuladas em glicina 0,25 M a pH 4,4 a 4,9 para dar concentrações finais de 100 U/ml ou 300 U/ml na solução. Um de três lotes diferentes de 10%IG da produção em larga escala (LE12H020, LE12H062, e LE12H173) ou um dos três lotes pré-clínicos de 20%IG (SC00107NG, SC00207NG, e SC00307NG) foi utilizado de acordo com a tabela 26. As soluções foram filtradas através de um filtro de 0,2 pm e transferidas em porções de 1 ml para frascos de vidro de 5 ml estéreis. As frascos de vidro foram guardados entre 2 e 8°C ou entre 28 e 32°C. Assim, as co-formulações resultantes de rHuPH20 e IG foram formuladas em glicina 0,25 M a entre pH 4,4 e 4,9.
Tabela 26. Co-formulações de rHuPH20 e 10%IG e 20%IG#
Após 0 (início), 1, 3, 6, 12, 24 e 36 semanas (2 a 8 °C apenas) de armazenamento, uma amostra de cada uma das 6 formulações mencionadas na Tabela 26 e de cada uma dascâmaras de armazenamento (2 a 8°C e 28 a 32°C) foi retirada da incubação e analisada relativamente à actividade de hialuronidase usando o ensaio de micro-turbidez descrito no Exemplo 4. Para avaliar os efeitos em IG, a distribuição de massas moleculares da IG nas formulações contendo 20% IG foi determinada aos 0 (início) e 6 meses por cromatografia de exclusão por tamanho de alta resolução (ΗΡ-SEC) usando uma coluna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm (Tosoh Bioscience) e um sistema de tampão contendo DMSO (Kolarich et al. (2006) Transfusion, 46:1959-1977). A Tabela 27 mostra a actividade de hialuronidas (U/ml) nos 7 pontos de tempo (0, 1, 3, 6, 12, 24 e 36 semanas) para cada co-formulação guardada entre 2 e 8°C. A Tabela 28 mostra a actividade de hialuronidas (U/ml) nos 6 pontos de tempo (0, 1, 3, 6, 12 e 24 semanas) para as co- formulações guardadas entre 28 e 328°C. Uma perda significativa constante da actividade de hialuronidase foi observada nas co-formulações na presença de 10% e 20%IG guardadas entre 2 8 e 32 °C durante 24 semanas, indicando instabilidade de rHuPH20. As co-formulações de 10%IG permaneceram estáveis após 9 meses de armazenamento entre 2 e 8°C, enquanto a actividade de rHuPH20 diminuiu ligeiramente nas co-formulações de 20%IG. A distribuição das massas moleculares da IG nas formulações contendo 20%IG ficou inalterada a ambas as temperaturas após 6 meses de armazenamento (Tabelas 29 e 30).
Tabela 27. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulações após armazenamento a 2-8°C
Tabela 28. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulações após armazenamento a 28-32°C
Tabela 29. Distribuição da massa molecular de IG em 20%IG co-formulada com rHuPH20 após armazenamento a 2-8°C
Tabela 30. Distribuição da massa molecular de IG em 20%IG co-formulada com rHuPH20 após armazenamento a 28-32°C
B. Estabilidade de 10%IG co-formulada com rHuPH20 e cloreto de sódio (0-150 mM)
Para melhorar a estabilidade de rHuPH20 nas co-formulações, estudou-se o efeito da adição de cloreto de sódio (NaCl) . As co-formulações de 300 U/mL rHuPH20 (lote HUB0702CA; geradas usando a produção Gen2 descrita no Exemplo 3) em 10 % IG (lot LE12F047) foram preparadas como descrito no Exemplo 7A acima, com a adição de NaCl em 4 concentrações diferentes (0, 50, 100 e 150 mM) . As co-formulações foram guardadas entre 2 e 8°C ou entre 28 e 32°C. Assim, as co-formulações resultantes de rHuPH20 e IG foram formuladas em glicina 0,25 mM entre pH 4,6 e 5,1 (medido na solução diluída) na presença de quantidades variáveis de NaCl.
Após 0 (início), 1, 3, 6, 12, 18 e 24 semanas de armazenamento, uma amostra de cada uma das co-formulações (com concentrações de NaCl de 0, 50, 100 e 150 mM) e de cada uma das câmaras de armazenamento (2 a 8°C e 28 a 32°C) foi retirada da incubação e analisada relativamente à actividade de hialuronidase usando o ensaio de micro-turbidez descrito no Exemplo 4. A agregação de IG foi determinada por distribuição da massa molecular (MSD) através de cromatografia de exclusão por tamanho de alta resolução (ΗΡ-SEC) usando uma coluna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm (Tosoh Bioscience) e um sistema de tampão contendo DMSO (Kolarich et al. (2006) Transfusion, 46:1959-1977).
As Tabelas 31 e 32 mostram a actividade de hialuronidase (U/ml) em 7 pontos de tempo (0, 1, 3, 6, 12, 18 e 24 semanas) para cada co-formulação. Os resultados mostram que a estabilidade de rHuPH20 co-formulada com 10%IG na presença de NaCl 50, 100 ou 150 mM permanecia inalterada até 24 semanas de armazenamento entre 2 e 8°C, enquanto a estabilidade de rHuPH20 melhorou para as amostras guardadas entre 28 e 32°C. No entanto, a actividade de hialuronidase decresceu rapidamente nas co-formulações tendo uma concentração de NaCl de 0 mM quando guardadas entre 28 e 32°C.
As Tabelas 33 e 34 mostram que NaCl aumentou ligeiramente a dimerização de IG (~350 kDa) a ambas as temperaturas de armazenamento e a agregação de IG (>450 kDa) entre 28 e 32°C, e todos os valores permaneceram dentro dos limites de especificação MSD (>90% monóme-ro/dímeros, ^5% agregados, ^5% fragmentos) após 6 meses.
Apesar da adição de NaCl ter um impacto negativo (aumento) no titulo da actividade de anticomplemento (ACA) das formulações de IG guardadas entre 28 e 32°C, o titulo ACA é um indicador especifico para administração intravenosa (IV) e não é relevante para a administração subcutânea das co-formulações.
Tabela 31. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulações de 10%IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento a
2-8°C
Tabela 32. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulações de 10%IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento a 28-32 °C
Tabela 33. Distribuição da massa molecular de IG nas co-formulações de 10%10%IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento a 2-8°C
Tabela 34. Distribuição da massa molecular de IG nas co-formulações de 10%10%IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento a 28-32°C
C. Estabilidade de 10%IG ou 20%IG co-formulada com rHuPH20 e cloreto de sódio (0-50 mM)
Estudou-se o efeito da adição de cloreto de sódio às co-formulações de 10%IG ou 20%IG com rHuPH20 guardadas entre 28 e 32°C. As co-formulações de 300 U/mL rHuPH20 (lote HUB0702CA; gerado usando a produção Gen2 descrita no Exemplo 1) em 10 % IG (lot LE12F047) e 300 U/ml de rHuPH20 (lote HUB0702CA; gerado usando a produção Gen2 descrita no Exemplo 1) em 20%IG (lote SC00108NG) foram preparadas como descrito no Exemplo 6B acima, usando NaCl nas concentrações de 0, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mM) . Assim as co-formulações resultantes de rHUPH20 e IG foram formuladas em glicina 0,25 mM entre pH 4,6 e 5,1 (medido na solução diluída) na presença de quantidades variáveis de NaCl.
Após 0 (início), 1, 3, 6, 12 e 24 semanas de armazenamento, uma amostra de cada uma das co-formulações (com concentrações de NaCl de 00, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mM) foi retirada da incubação e analisada relativamente à actividade de hialuronidase usando o ensaio de microturbidez descrito no Exemplo 4. A agregação de IG foi determinada por distribuição da massa molecular (MSD) através de cromatografia de exclusão por tamanho de alta resolução (ΗΡ-SEC) usando uma coluna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm (Tosoh Bioscience) e um sistema de tampão contendo DMSO.
As Tabelas 35 e 36 mostram a actividade de hialuronidase (U/ml) em vários pontos de tempo (0, 1, 3, 6, e 12 e 24 semanas) para cada co-formulação. Os resultados mostram que a estabilidade de rHuPH20 co-formulada com 10%IG na presença de concentrações de NaCl mais elevadas (20, 30, 40 e 50 mM) permanecia inalterada até 24 semanas de armazenamento entre 28 e 32°C. A actividade de hialuronidase decresceu rapidamente nas co-formulações com uma concentração de NaCl inferior a 20 mM quando guardada entre 28 e 32°C. A estabilidade de rHuPH20 co-formulada com 20%IG permaneceu relativamente inalterada ao longo de 24 semanas de armazenamento entre 28 e 32°C em todas as concentrações de NaCl. O cloreto de sódio aumentou ligeiramente a dime-rização de IG (~350 kDa) e a agregação em ambas as co-formulações d 10% e 20%IG entre 28 e 32°C. O efeito foi menos pronunciado em 20%IG (i.e, concentração de IG mais elevada) na agregação de IG (Tabelas 37 e 38).
Tabela 35. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulaçõs de 10%IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento a 28-32 °C
Tabela 36. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulaçõs de 20%IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento a 28-32°C
Tabela 37. Distribuição da massa molecular de IG nas co-formulaçõs de 10%IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento a 28-32°C
Tabela 38. Distribuição da massa molecular de IG nas co-formulaçõs de 20%IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento a 28-32 °C
D. estabilidade de rHuPH20 nas co-formulações com 10%IG ou 20% IG na presença de cloreto de sódio (100-250 nM) ou aminoácidos (500 mM)
Estudou-se o efeito na estabilidade de rHuPH20 das co-formulações contendo 10%IG ou 20%IG com rHuPH20 e cloreto de sódio ou aminoácidos estabilizadores. As co-formulações de 100 Ul/ml ou 300 Ul/ml de rHuPH20 (lote HUB07 02CA; gerado usando a produção de Gen2 descrita no Exemplo 3) em 10%IG (com glicina 0,25M a pH 4,4) (lote LE12F047) oru 20 % IG (lote SC00108NG) foram preparadas como descrito no Exemplo 6A atrás. As amostras continham NaCl (concentrações de 100, 150 ou 250 mM) , glicina (500 mM) ou prolina (500 mM). As co-formulações foram guardadas entre 2 e 8°C ou entre 28 e 32 °C. Assim, as co-formulações resultantes de rHuPH20 e IG foram formuladas em glicina 0,25 M a pH 4, 6 a 5,1 na presença de quantidades variáveis de NaCl, glicina ou prolina.
Após 0 (inicio), 1, 3, 6 e 12 (300 U/ml apenas) semanas de armazenamento, uma amostra de cada uma das co-formulações (com concentrações de NaCl de 100, 150 ou 250 mM, glicina concentração de 500 mM ou prolina concentração de 500 mM) foi retirada da incubação e analisada relativamente à actividade de hialuronidase usando o ensaio de microturbidez descrito no Exemplo 4. A agregação de IG foi determinada por distribuição da massa molecular (MSD) através de cromatografia de exclusão por tamanho de alta resolução (ΗΡ-SEC) usando uma coluna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm (Tosoh Bioscience) e um sistema de tampão contendo DMSO (Kolarich et ai. (2006) Transfusion, 46:1959-1977).
As Tabelas 39 e 41 mostram a actividade de hialuronidase (U/ml) em 5 pontos de tempo (0, 2, 1, 3, e 6 semanas) para co-formulações contendo 100 U/ml de rHuPH20 e 10% ou 20%IG, respectivamente. As Tabelas 40 e 42 mostram a actividade de hialuronidase (U/ml) em 6 pontos de tempo (0, 1, 2, 3, 6 e 12 semanas) para co-formulações contendo 300 U/ml de rHuPH20 e 10% ou 20%IG, respectivamente. Os resultados mostram que as concentrações mais elevadas de aminoácidos (glicina 500 mM ou prolina 500 mM) foram menos eficazes que NaCl na estabilização de rHuPH20 em co-formulações de 10%IG ou 20%IG com rHuPH20.
Cloreto de sódio, em todas concentrações estudadas, estimularam a agregação de IG (>450 kDa) após armazenamento entre 28 e 32°C em todas as co-formulações, Todas as co-formulações contendo prolina 500 mM tinham um teor reduzido de dimeros de IG (-350 kDa) e um teor de monómero aumentado (-160 kDa) após 6 semanas de armazenamento entre 28 e 32°C. O teor em dimeros de IG foi igualmente reduzido em co-formulações com glicina, apesar de não tão pronunciada quanto as co-formulações de prolina (Tabelas 43 e 44). Demonstrou-se que concentrações elevadas de prolina são eficazes na inibição da aqreqação de proteina durante o enrolamento através do bloqueio das interacções hidrofóbicas não especificas entre proteínas (Kumar et al. (1998) Biochem. Mol. Biol. Int. 4:59-517).
Tabela 39. Actividade de hlaluronidase (U/ml) das co-formulações de 10%IG e 100 U/ml de rHuPH20 com estabilizadores após armazenamento entre 28 e 32°C
Tabela 40. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulações de 10%IG e 300 U/ml de rHuPH20 com estabilizadores após armazenamento entre 28 e 32°C
Tabela 41. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulações de 20%IG e 100 U/ml de rHuPH20 com estabilizadores após armazenamento entre 28 e 32°C
Tabela 42. Actividade de hialuronidase (U/ml) das co-formulações de 20%IG e 300 U/ml de rHuPH20 com estabilizadores após armazenamento entre 28 e 32°C
Tabela 43. Distribuição de massa molecular de IG em co-formulações de 10%/rHuPH20 com NaCl, glicina ou prolina após armazenamento a 28-32°C
Tabela 44. Distribuição de massa molecular de IG em co-formulações de 20%/rHuPH20 com NaCl, glicina ou prolina após armazenamento a 28-32°C
Exemplo 7
Efeitos de rHuPH20 co-formulada com 10%IG ou 20%IG em mini porcos Yucatan A. Projecto experimental A exequibilidade da dosagem de rHuPH20 corformulada com uma solução de 10% ou 20% de imunogloblina (IG) (NaCl 130 mM, histidina 10 mM, pH 6,6) subcutaneamente em mini-porcos Yucatan foi determinada e comparada com dosagem Leading Edge (dosagem sucessiva de rHuPH20 seguida de solução de IG) . Uma dose-resposta usando várias concentrações de rHuPH20 foi igualmente avaliada para cada solução de IG.
Dezoito mini-porcos Yucatan machos pesando 18,4-23,2 kg (SNS Farms) foram distribuídos por um ou dois dos onze grupos de tratamento como se mostra na Tabela 45, de modo que cada grupo utilizou três porcos. Todas as formulações foram administradas subcutaneamente com agulhas tipo Huber de 10 gauge, curvatura suave de 90 graus, nas costas de porcos machos anestesiados. Para a dosagem Leading Edge, rHuPH20 seguido de IG foi injectado consecutivamente usando a mesma agulha na localização exacta, empregando uma mudança de seringa simples. Não foi necessário ou usado intervalo entre as dosagens de rHuPH20 e IgG. Até duas formulações diferentes, cada uma de um grupo de tratamento diferente, foram testadas em cada porco num volume máximo e 110 ml por local de injecção. As infusões duraram aproximadamente 20 minutos para co-formulações e 22-28 minutos para as formulações Leading Edge.
Tabela 45. Sumário do desenho experimental
As observações do local da injecção foram realizadas após a dosagem. Utilizaram-se transdutores para medir a pressão contínua (mm Hg) exercida para administrar cada formulação e o sangue foi colhido para contagem completa do sangue (CBC) e análise da imunoglobulina gama (IgG) . No final do estudo, 3 dias após a dosagem, todos os animais foram eutanizados e duas secções amostras (A e B) foram colhidas de cada local de injecção 1. Local de injecção 2 e Controlo (colhido de um lugar distante dos dois locais de injecção) e preservadas em formalina tamponada neutra a 10% e avaliadas por microscopia óptica (Nova Pathology, PC, San Diego, CA) . 0 local A era uma secção de 2-3 mm de espessura até ao centro do local de injecção e o local B era uma secção de 2-3 mm de espessura retirada do extremo do local de injecção colhido. B. Observações do local da injecção
Após 5 minutos da administração de apenas 10%IG (~25 ml de infusão; Grupo I), era visível uma "bolha" distinta nos três porcos. Aproximadamente 10 minutos após a administração de apenas 20%IG (~25 ml de infusão; Grupo 5) era visível uma bolha distinta. A área de formação da bolha observada aumentou com todas as formulações contendo rHuPH20 (incluindo Leading Edge) comparativamente com a dosagem de IG sozinha, significando maior dispersão dos fluidos utilizando rHuPH20 (Tabela 46).
As co-f ormulações de rHuPH20 com 10% e 20%IG resultaram na redução significativa do endurecimento da pele em todas as concentrações de rHuPH20 (os locais permeneceram moles) e reduziu a vermelhidão da pele em todas as concentrações de rHuPH20. A comparação com a administração de Leading Edge revelou observações de vermelhidão semelhante às das co-formulações. A ocorrência de vermelhidão nos locais de injecção observadas pós-dosagem mostraram recuperação completa dentro dee 24 horas para todos os grupos (Tabela 46).
Tabela 46. Aspecto do local de injecção e análise
C. Observações da medição da pressão A Tabela 47 resume as medições da pressão média. Aos 2,5 minutos, ou mais cedo, após a dosagem de apenas 20%IG (Grupo 5) , as pressões estavam foram da gama mensurável (>460 mmHg) para todos os porcos. Dois dos três porcos estavam fora da gama de pressões mensuráveis no Grupo 6 e um porco estava fora da gama para cada um dos Grupos 7 e 8. Cada um dos Grupos 1 e 2 tinha um porco fora da gama. Os resultados mostram que a pressão necessária para realizar as injecções diminuiu com todas as co-formulações contendo rHuPH20.
Tabela 47. Análise da medição da pressão média
D. Contagem completa do sangue e análise de IgG no plasma
Colheu-se sangue para tubos com K3EDTA na pré-dose (~2,0 ml) e aos 30 minutos pós-dosagem (~2,0 nl) para análise da contagem completa do sangue (CBC). As amostras foram guardadas a 4°C até análise (Bioquant, Inc., San Diego, CA). Os resultados CBC não deram origem a quaisquer preocupações de segurança relacionadas especificamente com o produto. A maioria dos porcos permaneceu com níveis normais de CBC (gama de CBC normal referenciada pelas quintas SNS). Cinco dos dezoito porcos não tinham coágulos visíveis nas amostras e não puderam ser avaliados. O sangue para análise de imunoglobulina gama (IgG) foi colhido para tubos com citrato de sódio na pré- dose (-2,0 ml) e no final do estudo (-4,0 ml) para confirmar a disponibilidade sistémica após administração subcutânea da IG humana. As amostras foram centrifugadas a 4°C durante 10 minutos a 3000 rpm, o plasma dividido em amostras e estas foram guardadas a -20°C até serem analisadas. Um aumento geral de IgG foi observado para todos os animais 3 dias após administração, como se mostra na Tabela 48. Os níveis de IgG do plasma para cada porco reflectiam a média dos dois tratamentos diferentes administrados a cada porco (com excepção dos porcos 7-9 que receberam apenas um único tratamento).
Tabela 48. Análise de IgG
E. Resultados de histopatologia
Os resultados histológicos estavam presentes na epiderme, derme e tecido subcutâneo e continham uma mistura de inflamação de leucócitos, edema e hemorragia. A cada dado histológico foi atribuído um grau de gravidade com base no seguinte esquema: Não presente: 0; Presente, Não classificado: 0; Mínimo: 1;
Suave: 2; Moderado: 3; Marcado: 4.
Os resultados histológicos estão resumidos por incidência e a pontuação média da gravidade do grupo nas Tabelas 49-51.
Tabela 49. Sumário dos resultados histológicos: 10%IG + rHuPH20
Tabela 50. Sumário dos resultados histológicos: 20%IG + rHuPH20
Tabela 51. Sumário dos resultados histológicos: Dosagem de Leading Edge
A resposta à administração de IG e rHuPH20 foi qualitativamente semelhante em cada grupo de dose neste estudo. Ests respostas foram caracterizadas por inflamação mista de leucócitos, edema e hemorragia no tecido subcutâneo nos locais de injecção. A Tabela 52 compara a pontuação média da gravidade do grupo para os três grupos de dose.
Tabela 52. Sumário das pontuações de gravidade média do grupo
Com base nas pontuações de gravidade média, as respostas mais graves no local de injecção foram associadas com a administração de 100 ml de 10%IG apenas (Grupo 1) e com a administração de 50 ml de 20%IG co-formulada com 300 U/ml de rHuPH20 (Grupo 8). A resposta à administração de 100 ml de 10%IG co-formulada com rHuPH20 a 50, 100 e 300U/ml de 10%IG (Grupos 2-4) foi semelhante à resposta à administração de 50 ml de 20%IG apenas (Grupo 5) , co-formulada com rHuPH20 a 50 e 100 U/ml de 20%IG (Grupos 6 e 7) e dosagem de Leading Edfge com 10 ml de rHuPH2 0 (150 U/ml) seguido de 100 ml de 10%IG (Grupo 9) . No entanto, a dosagem de Leading Edge com 10 ou 20 ml de rHuPH20 (150 U/ml) seguido de 50 ml de 20%IG (Grupos 10 e 11) resultou numa resposta mais grave que co-formulações semelhantes (Grupos 6 e 7) . Secções de pele controlo continham poucas alterações histológicas, o que pode ser atribuído à difusão das formulações injectadas a partir dos locais de injecção do artigo a testar e alterações incidentais não rela cionadas com as formulações. F. Sumário
Os resultados confirmaram a exequibilidade da administração de rHuPH20 co-formulada com 10% e 20%IG subcutaneamente em mini-porcos Yucatan. IG (10% ou 20%) administrada sozinha é exequível, ainda que um grau moderado a grave de endurecimento e vermelhidão da ppele tenha resultado. As co-formulações com rHuPH20 resultaram numa redução da pressão necessária para dar as injecções, reduziram significativamente o endurecimento da pele e reduzirama vermelhidão da pele. A área de formação de bolha observada foi semelhante ou aumentou com todas as formulações que continham rHuPH20 comparativamente com a dosagem de IG sozinha, confirmando a maior dispersão dos fluidos quando rHuPH20 foi utilizada. A dosagem de Leading Edge foi exequível e a pressão, vermelhidão e área da bolha foram semelhantes as observadas com as co-formulações. Os resultados histopatológicos presentes no tecido subcutâneo profundo incluíram inflamação de leucócitos mistos, edema e hemorragia, com as respostas mais graves associadas com a administração de 10%IG sozinha e de 20%IG co-formulada com rHuPH20 (300 U/ml) .
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Baxter International, Inc.
Baxter Healthcare, S.A.
Teschner, Wolfgang Svatos, Sonja Bruckschwaiger, Leopold Weber, Alfred Schwarz, Hans-Peter Lei, Laura
<120> CO-FORMULAÇÃO ESTÁVEL DE HIALURONIDASE E IMUNOGLOBULINA E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO
<130> 3800020-00137/3088PC <140> Ainda não atribuído <141> Aqui <150> US 61/277,045 <151> 2009-09-17 <160> 56 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1
<211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor de PH20 humana <4 0 0> 1
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 · 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly lie 'Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Vai Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Vai Glu Thr Ile Lys Leu' Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Vai Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro vai 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Vai Arg Asn Arg Vai Arg Glu Ala Ile Arg Vai 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Vai Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg Ile Vai Phe Thr Asp Gin Vai Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Vai Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Vai Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335
Vai Ile Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365
Vai Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Vai Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Vai Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Vai Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys· 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Vai Lys Asp Thr Asp Ala vai Asp Vai Cys Ile Ala Asp Gly Vai Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin Ile 465 470 475 480
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Vai 485 490 495
Ser lie Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Vai Ãla Ser Leu 500 505
<210> 2 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PH20 madura <400> 2
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Vai lie Pro Asn vai Pro Phe Leu Trp 15 10 15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 . 60
Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80
Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys He 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350
He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe Tyr Asn 435 440 445
Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe He Val Ser lie Leu 450 455 460
Phe Leu lie He Ser Ser val Ala Ser Leu 465 470
<210> 3 <211> 482 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor solúvel de rHuPH20 <400> 3
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr val Asn Gly 100 105 no
Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140
He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys . 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335
Val He Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480
Phe Tyr
<210> 4 <211> 447 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> rHuPH20 1-447 solúvel <400> 4
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60
Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80
Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr*Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 . 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350
He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415'
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr 435 440 445
<210> 5 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 1-446 solúvel <400> 5
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60
Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80
Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp 100 105 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Atg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr .Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu He 195 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He Phe 435 440 445
<210> 6 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 1-445 solúvel <400> 6
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60
Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80
Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp 100 105 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Léu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Vai Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr lie Ile Asn Val Thr Leu 325 ' 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350
Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala Ile Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430
Phe Leu Lys Pró Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin Ile 435 440 445
<210> 7 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 1-444 solúvel <400> 7
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Ârg Ile Asn Ala 35 40 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr Ile Phe Tyr val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60
Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80
Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn val Glu lie 195 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie Val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu-Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val lie Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 , 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp val Lys Asp 405 410 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin 435 440
<210> 8 <211> 443 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> rHuPH20 1-443 solúvel <400> 8
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 . 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60
Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly He Pro 65 70 75 80
Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp He 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val He Asp Trp
100 105 HO
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val <31n Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu. Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie IPS 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val Ser Lys lie 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He Val He Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He He Asn Val Thr Leu 325 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys He Asp Ala 420 425 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 435 440
<210> 9 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> rHuPH20 1-442 solúvel <400> 9
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly‘Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60
Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80
Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys He 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg lie val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val lie Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie He Asn Val Thr Leu 325 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350
He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 435 440 <210> 10 <211> 450 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> hialuronidase <4 0 0> 10
Met Arg Pro Phe Ser Leu Glu Val Ser Leu His Leu Pro Trp Ala Met 15 10 15
Ala Ala His Leu Leu Pro Val Cys Thr Leu Phe Leu Asn Leu Leu Ser 20 25 30
Met Thr Gin Gly Ser Arg Asp Pro Val’ Val Pro Asn Gin Pro Phe Thr 35 40 45
Thr lie Trp Asn Ala Asn Thr Glu Trp Cys Met Lys Lys His Gly Val 50 55 60
Asp Val Asp He Ser lie Phe Asp Val Val Thr Asn Pro Gly Gin Thr 65 70 75 80
Phe Arg Gly Pro Asn Met Thr He Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly Thr 85 90 95
Tyr Pro Tyr Tyr Thr Ser Ala Gly Glu Pro Val Phè Gly Gly Leu Pro 100 105 110
Gin Asn Ala Ser Leu Asn Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gin Asp He 115 120 125
Leu Ala Ala Met Pro Glu Pro Arg Phe Ser Gly Leu Ala Val He Asp 130 135 140
Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys Asp 145 150 155 160 lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Lys Gin His Pro Asp 165 170 175
Trp Leu Ala Pro Arg Val Glu Ala Ala Ala Gin Asp Gin Phe Glu Gly 180 185 190
Ala Ala Glu Glu Trp Met Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly Gin Ala Leu 195 200 205
Arg Pro Gin Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Asn Phe Pro Glu Cys Tyr Asn 210 215 220
Tyr Asp Phe Lys Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Cys Pro Leu Asn He 225 230 235 240
Cys Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg Ala 245 250 255
Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Glu Gly Thr Lys Lys 260 265 270
Thr Gin Met Phe Val Gin His Arg Val Ala Glu Ala Phe Arg Val Ala 275 280 285
Ala Gly Ala Gly Asp Pro Lys Leu Pro Val Leu Pro Tyr Met Gin Leu 290 295 300
Phe Tyr Asp Met Thr Asn His Phe Leu Pro Ala Glu Glu Leu Glu His 305 310 315 320
Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Vai Vai Leu Trp 325 330 335
Vai Ser Trp Leu Ser Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala Ile Lys 340 345 350
Glu Tyr Vai Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ser Ile Leu Asn Vai Thr Ser 355 360 365
Gly Ala Arg Leu Cys Ser GÍn Vai Leu Cys Ser Gly His Gly Arg Cys 370 375 380
Ala Arg Arg Pro Ser Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ile Leu Asn Ser Thr 385 390 395 400
Ser Phe Ser lie Lys Pro Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Thr Leu Gin 405 410 415
Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp Arg Leu Arg Met Ala Vai Glu Phe Glu 420 425 430
Cys Arg Cys Tyr Arg Gly Trp Arg Gly Thr Arg Cys Glu Gin Trp Gly 435 440 445
Met Trp 450 <210> 11 <211> 553 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> PH20 <4 0 0> 11
Met Arg Met Leu Arg Arg His His Ile Ser Phe Arg Ser Phe Ala Gly 1 5 10 15
Ser Ser Gly Thr Pro Gin Ala Vai Phe Thr Phe Leu Leu Leu Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Ala Leu Asp Phe Arg Ala Pro Pro Leu lie Ser Asn Thr Ser 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Tip Asn Ala Pro Vai Glu Arg Cys Vai Asn Arg Arg 50 55 60
Phe Gin Leu Pro Pro Asp Leu Arg Leu Phe Ser Vai Lys Gly Ser Pro 65 70 75 80
Gin Lys Ser Ala Thr Gly Gin Phe lie Thr Leu Phe Tyr Ala Asp Arg 85 90 95
Leu Gly Tyr Tyr Pro His lie Asp Glu Lys Thr Gly Lys Thr vai Phe 100 105 110
Gly Gly lie Pro Gin Leu Gly Asn Leu Lys Ser His Met Glu Lys Ala 115 120 125
Lys Asn Asp lie Ala Tyr Tyr lie Pro Asn Asp Ser Vai Gly Leu Ala 130 135 140 val lie Asp Trp Glu Asn Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys 145 150 155 160
Pro Lys Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ser Val Glu Leu Val Leu Gin Lys 165 170 175
Asn Pro Gin Leu Ser Phe Pro Glu Ala Ser Lys Ile Ala Lys Val Asp 180 185 190
Phe Glu Thr Ala Gly Lys Ser Phe Met Gin Glu Thr Leu Lys Leu Gly 195 200 205
Lys Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp 210 215 220
Cys Tyr Asn His Asn His Asn Gin Pro Thr Tyr Asn Gly Asn Cys Pro 225 230 235 240
Asp Vai Glu Lys Arg Arg Asn Asp Asp Leu Glu Trp Leu Trp Lys Glu 245 250 255
Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Vai Tyr Leu Asn Ile Arg Leu Lys Ser 260 265 270
Thr Gin Asn Ala Ala Leu Tyr Vai Arg Asn Arg Vai Gin Glu Ala Ile 275 280* 285
Arg Leu Ser Lys Ile Ala Ser Vai Glu Ser Pro Leu Pro Vai Phe Vai 290 ' 295 300
Tyr Ala Arg Pro Vai Phe Thr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin 305 310 315 320
Gly Asp Leu Vai Asn Ser Vai Gly Glu Ile Vai Ser Leu Gly Ala Ser 325 330 335
Gly lie lie Met Trp Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Ser Met Gin Ser 340 345 350
Cys Met Asn Leu Gly Thr Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile 355 360 365 lie Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Vai Leu Cys His 370 375 380
Asn Glu Gly Val Cys Thr Arg Lys His Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu 385 390 395 400
His Leu Asn Pro Met Asn Phe Ala Ile Gin Thr Gly Glu Gly Gly Lys 405 410 415
Tyr Thr Val Pro Gly Thr Val Thr Leu Glu Asp Leu Gin Lys Phe Ser 420 425 430
Asp Thr Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ala Asn Ile His Cys Lys Lys Arg 435 440 445
Val Asp Ile Lys Asn Val His Ser Val Asn Val Cys Met Ala Glu Asp 450 455 460
Ile Cys Ile Asp Ser Pro Val Lys Leu Gin Pro Ser Asp His Ser Ser 465 470 475 480
Ser Gin Glu Ala Ser Thr Thr Thr Phe Ser Ser Ile Ser Pro Ser Thr 485 490 495
Thr Thr Ala Thr Val Ser Pro Cys Thr Pro Glu Lys His Ser Pro Glu 500 505 510
Cys Leu Lys Val Arg Cys Ser Glu Val lie Pro Asn Val Thr Gin Lys 515 520 525
Ala Cys Gin Ser Val Lys Leu Lys Asn Ile Ser Tyr Gin Ser Pro lie 530 535 540
Gin Asn ile Lys Asn Gin Thr Thr Tyr 545 550
<210> 12 <211> 331 <212> PRT <213> Vespula vulgaris <220> <223> hialuronidase A <400> 12
Ser Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn lie Tyr Trp Asn Val Pro Thr 1 5 10 15
Phe Met Cys His Gin Tyr Asp Leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30
Asn Ile Lys Arg Asn Ser Lys Asp Asp Phe Gin Gly Asp Lys Ile Ala 35 40 45 lie Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Ser Leu Lys Asp 50 55 60
Gly Lys Tyr Lys Lys Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Glu Gly Asn He 65 70 75 80
Thr lie His Leu Gin Lys Phe He Glu Asn Leu Asp Lys He Tyr Pro 85 90 95
Asn Arg Asn Phe Ser Gly lie Gly Val lie Asp Phe Glu Arg Trp Arg 100 105 110
Pro He Phe Arg Gin Asn Trp Gly Asn Met Lys He His Lys Asn Phe 115 120 125
Ser He Asp Leu Val Arg Asn Glu His Pro Thr Trp Asn Lys Lys Met 130 135 140
He Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Phe Phe 145 150 155 160
Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Gin Ala Asp 165 170 175
Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr· Pro Tyr Cys Phe Asn Met Ser Pro Asn Asn 180 185 190
Leu Val Pro Glu Cys Asp Val Thr Ala Met His Glu Asn Asp Lys Met 195 200 205
Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gin Asn Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr Val 210 21S 220
Arg Gin Glu Leu Thr Pro Asp Gin Arg He Gly Leu Val Gin Gly Arg 225 230 235 240
Val Lys Glu Ala Val Arg He Ser Asn Asn Leu Lys His Ser Pro Lys 245 250 255
Val Leu Ser Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Glu Thr Asn Thr Phe 260 265 270
Leu Thr Glu Thr Asp Val Lys Lys Thr Phe Gin Glu He Val He Asn 275 280 285
Gly Gly Asp Gly He He He Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser 290 295 300
Leu Ser Lys Cys Lys Arg Leu Gin Asp Tyr Leu Leu Thr Val Leu Gly 305 310 315 320
Pro He Ala He Asn Val Thr Glu Ala Val Asn 325 330
<210> 13 <211> 340 <212> PRT <213> Vespula vulgaris <22 0>
<223> hialuronidase B <4 0 0> 13
Asp Arg Thr He Trp Pro Lys Lys Gly Phe Ser He Tyr Trp Asn lie 1 5 10 15
Pro Thr His Phe Cys His Asn Phe Gly Val Tyr Phe Lys Glu Leu Lys 20 25 30
Gin Phe Asn He Lys Tyr Asn Ser Met Asn Asn Phe Arg Gly Glu Thr 35 40 45
He Ser Leu Phe Tyr Asp Pro Gly Asn Phe Pro Ser Met Val Leu Leu 50 55 . 60
Lys Asn Gly Thr Tyr Glu lie Arg Asn Glu Gly Val Pro Gin Lys Gly 65 70 75 80
Asn Leu Thr He His Leu Glu Gin Phe Thr Lys Glu Leu Asp Glu lie 85 90 95
Tyr Pro Lys Lys He Ala Gly Gly lie Gly Val He His Phe His Asn 100 105 110
Trp Arg Pro lie Phe Arg Arg Asn Val Asp Asn Leu Lys lie Asn Lys 115 120 125
Asp He Ser lie Asp Leu Val Arg Lys Glu His Pro Lys Trp Asp Lys 130 135 140
Ser Met He Glu Lys Glu Ala Ser Asn Arg Phe Glu Thr Ser Ala Lys
145 150 155 ISO lie Phe Met Glu Lys Thr Leu Lys Leu Ala Lys Glu He Arg Lys Lys 165 170 175
Thr Glu Trp Gly Tyr His Gly Tyr Pro His Cys Leu Ser Gly Ser Thr 180 185 190
Asp Lys Pro Ser Phe Asp Cys Asp Ala Leu Ser Met Ser Glu Asn Asp 195 200 205
Lys Met Ser Trp Leu Phe ASn Asn Gin Asn Val Leu Leu Pro Ser lie 210 215 220
Tyr Leu Lys Asn Val Leu Lys Pro Asp Glu Lys He His Leu Val Gin 225 230 235 240
Glu Arg Leu Lys Glu Ala He Arg He Ser Lys Asn Phe Lys His Leu 245 250 255
Pro Lys Val Leu Pro Tyr Trp Trp Tyr Thr Tyr Gin Asp Lys Glu Ser 260 265 270 lie Phe Leu Thr Glu Ala Asp Val Lys Asn Thr Phe Lys Glu lie Leu 275 280 285
Thr Asn Gly Ala Asp Gly He lie He Trp Gly Val Ser Tyr Glu Leu 290 295 300
Thr Asp Arg Lys Arg Cys Glu Lys Leu Lys Glu Tyr Leu Met Lys He 305 310 315 320
Leu Gly Pro lie Ala Phe Lys Val Thr Lys Ala Val Lys Glu Asn Thr 325 330 335
Pro Leu Asn Phe 340
<210> 14 <211> 382 <212> PRT <213> Apis mellifera <220> <223> hialuronidase <400> 14
Met Ser Arg Pro Leu Val He Thr Glu Gly Met Met lie Gly Val Leu IS 10 15
Leu Met Leu Ala Pro He Asn Ala Leu Leu Leu Gly Phe Val Gin Ser 20 25 30
Thr Pro Asp Asn Asn Lys Thr Val Arg Glu Phe Asn Val Tyr Trp Asn 35 40 45
Val Pro Thr Phe Met Cys His Lys Tyr Gly Leu Arg Phe Glu Glu Val 50 55 60
Ser Glu Lys Tyr Gly He Leu Gin Asn Trp Met Asp Lys Phe Arg Gly 65 70 75 80
Glu Glu He Ala He Leu Tyr Asp Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu 85 90 95
Lys Asp Pro Asn Gly Asn Val Val Ala Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin 100 105 110
Leu Gly Asn Leu Thr Lys His Leu Gin Val' Phe Arg Asp His Leu lie US 120 125
Asn Gin lie Pro Asp Lys Ser Phe Pro Gly Val Gly Val lie Asp Phe 130 135 140
Glu Ser Trp Arg Pro lie Phe Arg Gin Asn Trp Ala Ser Leu Gin Pro 145 150 155 160
Tyr Lys Lys Leu Ser Val Glu Val Val Arg Arg Glu His Pro Phe Trp 165 170 175
Asp Asp Gin Arg Val Glu Gin Glu Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Tyr 180 185 190
Gly Gin Leu Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Ala Ala Lys Arg Met Arg 195 200 205
Pro Ala Ala Asn Trp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Pro Tyr Cys Tyr Asn Leu 210 215 220
Thr Pro Asn Gin Pro Ser Ala Gin Cys Glu Ala Thr Thr Met Gin Glu 225 230 235 240
Asn Asp Lys Met Ser Trp Leu Phe Glu Ser Glu Asp Val Leu Leu Pro 245 250 255
Ser Val Tyr Leu Arg Trp Asn Leu Thr Ser Gly Glu Arg Val Gly Leu 260 265 270
Val Gly Gly Arg Val Lys Glu Ala Leu Arg lie Ala Arg Gin Met Thr 275 280 285
Thr Ser Arg Lys Lys Val Leu Pro Tyr Tyr Trp Tyr Lys Tyr Gin Asp 290 295 300
Arg Arg Asp Thr Asp Leu Ser Arg Ala Asp Leu Glu Ala Thr Leu Arg 305 310 315 320
Lys lie Thr Asp Leu Gly Ala Asp Gly Phe lie lie Trp Gly Ser Ser 325 330 335
Asp Asp lie Asn Thr Lys Ala Lys Cys Leu Gin Phe Arg Glu Tyr Leu 340 345 350
Asn Asn Glu Leu Gly Pro Ala Val Lys Arg lie Ala Leu Asn Asn Asn 355 360 365
Ala Asn Asp Arg Leu Thr Val Asp Val Ser Val Asp Gin Val 370 375 380
<210> 15 <211> 331 <212> PRT <213> Dolichovespula maculata <220> <223> hialuronidase <400> 15
Ser Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn lie Tyr Trp Asn Val Pro Thr 1 5 10 15
Phe Met Cys His Gin Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30
Asn lie Lys His Asn Ser Lys Asp Asp Phe Gin Gly Asp Lys lie Ser 35 40 45
He Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Pro Leu Lys Glu 50 55 60
Gly Asn Tyr Lys lie Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Glu Gly Asn lie 65 70 75 80
Thr lie His Leu Gin Arg Phe lie Glu Asn Leu Asp Lys Thr Tyr Pro 85 90 95
Asn Arg Asn Phe Asn Gly lie Gly Val He Asp Phe Glu Arg Trp Arg 100 105 110
Pro lie Phe Arg Gin Asn Trp Gly Asn Met Met lie His Lys Lys Phe US 120 125
Ser lie Asp Leu Val Arg Asn Glu His Pro Phe Trp Asp Lys Lys Met 130 135 140
He Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Phe 145 150 155 160
Met Glu Glu Thr Leu Lys Lèu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Gin Ala Asp 165 170 175
Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Cys Phe Asn Met Ser Pro Asn Asn 180 185 190
Leu Val Pro Asp Cys Asp Ala Thr Ala Met Leu Glu Asn Asp Lys Met 195 200 205
Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gin Asn Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr lie 210 21S 220
Arg His Glu Leu Thr Pro Asp Gin Arg Val Gly Leu Val Gin Gly Arg 225 230 235 240
Val Lys Glu Ala Val Arg lie Ser Asn Asn Leu Lys His Ser Pro Lys 245 250 255
Val Leu Ser Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Asp Thr Asn Thr Phe 260 265 270
Leu Thr Glu Thr Asp Val Lys Lys Thr Phe Gin Glu lie Ala He Asn 275 280 285
Gly Gly Asp Gly lie lie He Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser 290 295 300
Leu Ser Lys Cys Lys Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Thr Val Leu Gly 305 310 315 320
Pro lie Thr Val Asn Val Thr Glu Thr Val Asn 325 330
<210> 16 <211> 367 <212> PRT <213> Polistes annularis <22 0> <223> hialuronidase <4 0 0> 16
Tyr Val Ser Leu Ser Pro Asp Ser Val Phe Asn He He Thr Asp Asp 15 10 15 lie Ser His Gin He Leu Ser Arg Ser Asn Cys Glu Arg Ser Lys Arg 20 25 30
Pro Lys Arg Val Phe Ser He Tyr Trp Asn Val Pro Thr Phe Met Cys 35 40 45
His Gin Tyr Gly Met Asn Phe Asp Glu Val Thr Asp Phe Asn He Lys 50 55 60
His Asn Ser Lys Asp Asn Phe Arg Gly Glu Thr lie Ser He Tyr Tyr 65 70 75 80
Asp Pro Gly Lys Phe Pro Ala Leu Met Pro Leu Lys Asn Gly Asn Tyr 85 90 95
Glu Glu Arg Asn Gly Gly Val Pro Gin Arg Gly Asn He Thr He His .100 105 110
Leu Gin Gin Phe Asn Glu Asp Leu Asp Lys Met Thr Pro Asp Lys Asn 11S 120 125
Phe Gly Gly He Gly Val lie Asp Phe Glu Arg Trp Lys Pro lie Phe 130 135 140
Arg Gin Asn Trp Gly Asn Thr Glu lie His Lys Lys Tyr Ser He Glu 145 150 155 160
Leu Val Arg Lys Glu His Pro Lys Trp Ser Glu Ser Met lie Glu Ala 165 170 175
Glu Ala Thr Lys Lys Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Tyr Phe Met Glu Glu 180 185 190
Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Arg Ala Lys Trp Gly Tyr 195 200 205
Tyr Gly Phe Pro Tyr Cys Tyr Asn Val Thr Pro Asn Asn Pro Gly Pro 210 215 220
Asp Cys Asp Ala Lys Ala Thr lie Glu Asn Asp Arg Leu Ser Trp Met 225 230 235 240
Tyr Asn Asn Gin Glu lie Leu Phe Pro Ser Val Tyr Val Arg His Glu 245 250 255
Gin Lys Pro Glu Glu Arg Val Tyr Leu Val Gin Gly Arg lie Lys Glu 260 265 270
Ala Val Arg He Ser Asn Asn Leu Glu His Ser Pro Ser Val Leu Ala 275 280 285
Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gin Asp Lys Met Asp He Tyr Leu Ser Glu 290 295 300
Thr Asp Val Glu Lys Thr Phe Gin Glu He Val Thr Asn Gly Gly Asp 305 310 315 320
Gly He lie lie Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser Leu Ser Lys 325 330 335
Cys Lys Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Asn Thr Leu Gly Pro Phe Ala 340 345 350
Val Asn Val Thr Glu Thr Val Asn Gly Arg Ser Ser Leu Asn Phe 355 360 365
<210> 17 <211> 462 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> hialuronidase <400> 17
Met Leu Gly Leu Thr Gin His Ala Gin Lys Val Trp Arg Met Lys Pro 1 5 10 15
Phe Ser Pro Glu Val Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ala Thr Ala Gly His 20 25 30
Leu Leu Arg lie Ser Thr Leu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ala Gin 35 40 45
Val Cys Arg Gly Ser Val Val Ser Asn Arg Pro Phe He Thr Val Trp 50 55 60
Asn Gly Asp Thr His Trp Cys Leu Thr Glu Tyr Gly Val Asp Val Asp 65 70 75 80
Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Lys Glu Gin Ser Phe Gin Gly 85 90 95
Ser Asn Met Thr He Phe Tyr Arg Glu Glu Leu Gly Thr Tyr Pro Tyr 100 105 HO
Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro Gin Asn Ala 115 120 125
Ser Leu Val Thr His Leu Ala His Thr Phe Gin Asp He Lys Ala Ala 130 135 140
Met .Pro Glu Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val He Asp Trp Glu Ala 145 150 1SS 160
Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp ser Lys Asp lie Tyr Arg 165 170 175
Gin Arg Ser Met Glu Leu Val Gin Ala Glu His Pro Asp Trp Pro Glu 180 185 190
Thr Leu Val Glu Ala Ala Ala Lys Asn Gin Phe Gin Glu Ala Ala Glu 195 200 205
Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Leu Gly Gin Val Leu Arg Pro Arg 210 215 220
Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr Asn Asn Asp Phe 225 230 235 240
Leu Ser Leu Asn Tyr Thr Gly Gin Cys.Pro Val Phe Val Arg Asp Gin 245 250 255
Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Asn Gin Ser Tyr Ala Leu Tyr Pro 260 265 270 ser lie Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Met Gly Thr Gly Lys ser Gin Met 275 280 285
Tyr Val Arg His Arg Val Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala lie Val Ser 290 295 300
Arg Asp Pro His Val Pro Val Met Pro Tyr Val Gin lie Phe Tyr Glu 305 310 315 320
Met Thr Asp Tyr Leu Leu Pro Leu Glu Glu Leu Glu His Ser Leu Gly 325 330 335
Glu Ser Ala Ala Gin Gly Val Ala Gly Ala Val Leu Trp Leu Ser Ser 340 345 350
Asp Lys Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala lie Lys Ala Tyr Met 355 360 365
Asp Ser Thr Leu Gly Pro Phe lie Val Asn Val Thr Ser Ala Ala Leu 370 375 380
Leu Cys Ser Glu Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg Cys Val Arg His 385 390 ' 395 400
Pro Ser Tyr Pro Glu Ala Leu Leu Thr Leu Asn Pro Ala Ser Phe Ser 405 410 415
He Glu Leu Thr His Asp Gly Arg Pro Pro Ser Leu Lys Gly Thr Leu 420 425 430
Ser Leu Lys Asp Arg Ala Gin Met Ala Met Lys Phe Arg Cys Arg Cys 435 440 445
Tyr Arg Gly Trp Arg Gly Lys Trp Cys Asp Lys Arg Gly Met 450 455 460
<210> 18 <211> 473 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> Hialuronidase 2 <400> 18
Met Arg Ala Gly Leu Gly Pro lie lie Thr Leu Ala Leu Val Leu Glu 15 10 15
Val Ala Trp Ala Gly Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro He Phe Thr 20 25 30
Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asn Val Pro Thr Gin Glu Cys Ala 35 40 45
Pro Arg His Lys Val Pro Leu Asp Leu Arg Ala Phe Asp Val Lys Ala 50 55 60
Thr Pro Asn Glu Gly Phe Phe Aan Gin Asn lie Thr Thr Phe Tyr Tyr GS 70 75 80
Asp Arg Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ala Ala Gly Thr Ser Val 85 90 95
His Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Cys Ala His Leu Pro Met 100 105 110
Leu Lys Glu Ser Val Glu Arg Tyr lie Gin Thr Gin Glu Pro Gly Gly 115 120 125
Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 140
Trp. Gin Glu Lys Asp Val Tyr Arg Gin Ser Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 150 155 160
Ser Arg His Pro Asp Trp Pro Ser Asp Arg Val Met Lys Gin Ala Gin 165 170 175
Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin Phe Met Leu Asn Thr Leu Arg 180 185 190
Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Gin His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe 195 200 205
Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr val Gin Asn Trp Glu Ser Tyr Thr 210 215 220
Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Arg Asn Asp Gin Leu Ala Trp 225 230 235 240
Leu Trp Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asp Glu 245 250 255
Thr Leu Ala Ser Ser Val His Ser Arg Asn Phe Val Ser Phe Arg Val 260 265 270
Arg Glu Ala Leu Arg Val Ala His Thr His His Ala Asn His Ala Leu 275 280 285
Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Thr Arg Gly Leu Thr Gly 290 295 300
Leu Ser Gin Val Asp Leu lie Ser Thr He Gly Glu Ser Ala Ala Leu 305 310 315 320
Gly Ser Ala Gly Val lie Phe Trp Gly Asp Ser Glu Asp Ala Ser Ser 325 330 335
Met Glu Thr Cys Gin Tyr Leu Lys Asn Tyr Leu Thr Gin Leu Leu Val 340 345 350
Pro Tyr lie Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Trp Thr 355 360 365
Gin Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Asn Pro Ser Ala Asn 370 375 380
Thr Phe Leu His Leu Asn Ala Ser Ser Phe Arg Leu Val Pro Gly His 385 390 395 400
Thr Pro Ser Glu Pro Gin Leu Arg Pro Glu Gly Gin Leu Ser Glu Ala 405 410 415
Asp Leu Asn Tyr Leu Gin Lys His Phe Arg Cys Gin Cys Tyr Leu Gly 420 425 430
Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Arg Asn Tyr Lys Gly Ala Ala Gly Asn 435 440 445
Ala Ser Arg Ala Trp Ala Gly Ser His Leu Thr Ser Leu Leu Gly Leu 450 455 460
Val Ala Val Ala Leu Thr Trp Thr Leu 465 470
<210> 19 <211> 412 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> hialurinidase 3 <400> 19
Met lie Met His Leu Gly Leu Met Met Val Val Gly Leu Thr Leu Cys 1 5 10 15
Leu Met His Gly Gin Ala Leu Leu Gin Val Pro Glu His Pro Phe Ser 20 25 30
Val Val Trp Asn Val Pro Ser Ala Arg Cys Lys Ala His Phe Gly Val 35 40 45
His Leu Pro Leu Asp Ala Leu Gly lie Val Ala Asn His Gly Gin His SO 55 60
Phe His Gly Gin Asn lie Ser lie Phe Tyr Lys Asn Gin Phe Gly Leu 65 70 75 80
Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95
Gin Ala Val Ser Leu Asp His His Leu Ala Arg Ala Ala His Gin lie 100 105 110
Leu His Ser Leu Gly Ser Ser Phe Ala Gly Leu Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125
Glu Glu Trp Tyr Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Pro His Arg Gin 130 135 140
Val Tyr Leu Ala Ala Ser Trp Val Trp Thr Gin Gin Met Phe Pro Gly 145 150 155 160
Leu Asp Pro Gin Glu Gin Leu His Lys Ala His Thr ser Phe Glu Gin 165 170 175
Ala Ala Arg Ala Leu Met Glu Tyr Thr Leu Gin Leu Gly Arg Thr Leu 180 185 190
Arg Pro Ser Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Arg Tyr Pro Ala Cys Gly Asn 195 200 20S g
Gly Trp His Lys Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly His Cys His Ala Ala 210 215 220 lie Thr Thr Gin Asn Thr Gin Leu Arg Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser 225 230 235 240
Ala Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Leu Ala Tyr 245 250 255
Arg Gin Ala Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala 260 265 270
Leu Leu Glu His. Ser His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Ser Arg Leu 275 280 285
Thr His Arg Ser Ser Gly Arg Phe Leu Ser Leu Asp Asp Leu Met Gin 290 295 300
Thr He Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Thr Ala Gly Val Val Leu Trp 305 310 315 320
Gly Asp Leu Ser Phe Ser Ser Ser Glu Glu Lys Cys Trp Arg Leu His 325 330 335
Asp Tyr Leu Val Gly Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Lys 340 345 350
Ala Asp Met Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys 355 360 365
Ala Arg Lys Asp Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Gin Pro 370 375 380
Asp Asp Ser Leu Gly Ala Trp Asn Ser Phe Arg Cys His Cys Tyr Ser 385 390 395 400
Gly Trp Ala Gly Pro Thr Cys Leu Glu Pro Lys Pro 405 410 <210> 20 <211> 435 <212> PRT <213> Sus scrofa <22 0> <223> hialauronidase <400> 20
Met Ala Ala His Leu Leu Pro lie Cys Thr Leu Phe Leu Asn Leu Leu 15 10 15
Ser Val Ala Gin Gly Ser Arg Asp Pro Val Val Leu Asn Arg Pro Phe 20 25 30
Thr Thr lie Trp Asn Ala Asn Thr Gin Trp Cys Leu Lys Arg His Gly 35 40 45
Val Asp Val Asp Val Ser Val Phe Glu Val Val Val Asn Pro Gly Gin 50 55 60
Thr Phe Arg Gly Pro Asn Met Thr He Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly 65 70 75 80
Thr Tyr Pro Tyr Tyr Thr Ser Ala Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu 85 90 95
Pro Gin Asn Ala Ser Leu Asp Val His Leu Asn Arg Thr Phe Lys Asp 100 105 110 lie Leu Ala Ala Met Pro Glu Ser Asn Phe Ser Gly Leu Ala Val He 115 120 125
Asp Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Ala Lys 130 135 140
Asp lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Lys Gin His Pro 145 150 155 160
Asp Trp Pro Ala Pro Trp Val Glu Ala Ala Ala Gin Asp Gin Phe Gin 165 170 175
Glu Ala Ala Gin Thr Trp Met Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly Gin Thr 180 185 190
Leu Arg Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr 195 200 205
Asn Tyr Asp Phe Gin Ser Ser Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Pro Pro Gly 210 215 220
Val Ser Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg 225 230 235 240
Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Pro Ser Ala Leu Glu Gly Thr Asn 245 250 255
Lys Thr Gin Leu Tyr Vál Gin His Arg Val Asn Glu Ala Phe Arg Val 260 265 270
Ala Ala Ala Ala Gly Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Ala Gin 275 280 285
He Phe His Asp Met Thr Asn Arg Leu Leu Ser Arg Glu Glu Leu Glu 290 295 300
His Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Val Val Leu 305 310 315 320
Trp Val Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ser lie 325 330 335
Lys Glu Tyr Val Asp Thr Thr Leu Gly Pro Phe He Leu Asn Val Thr 340 345 350
Ser Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gin Ala Val Cys Ser Gly His Gly Arg 355 360 365
Cys Val Arg Arg Pro Ser His Thr Glu Ala Leu Pro He Leu Asn Pro 370 375 380
Ser Ser Phe Ser lie Lys Pro Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Thr Leu 385 390 395 400
Gin Gly Ala Leu Ser Leu Lys Asp Arg Vai Gin Met Ala Glu Glu Phe 405 410 415
Gin Cys Arg Cys Tyr Pro Gly Trp Arg Gly Thr Trp Cys Glu Gin Gin 420 425 430
Gly Thr Arg 435 <210> 21 <211> 419 <212> PRT <213> Sus scrofa <22 0> <223> hialuronidase 3 <400> 21
Met Thr Met Gin Leu Gly Leu Ala Leu Vai Leu Gly Vai Ala Met Cys 15 10 15
Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Leu Arg Ala Pro Glu Arg Pro Phe Cys 20 25 30
Vai Leu Trp Asn Vai Pro Ser Ala Arg Cys Lys Ala Arg Phe Gly Vai 35 40 45
His Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gly Ile Thr Ala Asn His Gly Gin Arg 50 55 60
Phe His Gly Gin Asn Ile Thr Ile Phe Tyr Lys Ser Gin Leu Gly Leu 65 70 75 80
Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95
Gin Ala Vai Ser Leu Asp His His Leu Ala Arg Ala Ala Tyr Gin Ile 100 105 110
His Arg Ser Leu Arg Pro Gly Phe Thr Gly Leu Ala Vai Leu Asp Trp 115 120 125
Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Gin Ala 130 135 140
Tyr Gin Ala Ala' Ser Cys Ala Trp Ala Gin Arg Vai Tyr Pro Asn Leu 145 150 155 160
Asp Pro Gin Glu Gin Leu Cys Lys Ala Arg Ala Gly Phe Glu Glu Ala 165 170 175
Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Leu Gly Arg Met Leu Arg 180 185 190
Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205
Trp His Gly Thr Ala Ser Asn Tyr Thr Gly His Cys His Ala Ala Ala 210 215 220
Leu Ala Arg Asn Thr Gin Leu Tyr Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240
Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Gly Leu Pro Pro Ala Tyr His 245 250 255
Gin Ala Phe Vai Arg Tyr Arg Leu Glu Glu Ala Phe Árg Vai Ala Leu 260 265 270
Vai Gly His Pro His Pro Leu Pro Vai Leu Ala Tyr Ala Arg Leu Thr 275 280 285
His Arg Asn ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Vai Gin Thr 290 295 300
Ile Gly Vai Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ser Gly Vai Vai Leu Trp Gly 305 310 315 320
Asp Leu Ser Phe Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu Arg Gly 325 330 335
Tyr Leu Vai Gly Thr Leu Gly Pro Tyr Vai Ile Asn Vai Thr Arg Ala 340 345 350
Ala Met Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala 355 360 365
Trp Gin Asp Pro Gly Gin Leu Lys Vai Phe Leu His Leu His Pro Gly 370 375 380
Gly Ser Pro Gly Ala Trp Glu Ser Phe Ser Cys Arg Cys Tyr Trp Gly 385 390 395 400
Trp Ala Gly Pro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Pro Glu Leu Gly Pro Glu 405 410 415
Glu Ala Thr
<210> 22 <211> 449 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <223> hialuronidase 1 <400> 22
Met Lys Pro Phe Ser Pro Glu Vai Ser Pro Asp Pro Cys Pro Ala Thr IS 10 15
Ala Ala His Leu Leu Arg' Thr Tyr Thr Leu Phe Leu Thr Leu Leu Glu 20 25 30
Leu Ala Gin Gly Cys Arg Gly Ser Met Val Ser Asn Arg Pro Phe Ile 35 40 45
Thr Val Trp Asn Ala Asp Thr His Trp Cys Leu Lys Asp His Gly Val 50 55 60
Asp Val Asp Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Lys Glu Gin Asn 65 70 75 80
Phe Gin Gly Pro Asn Met Thr Ile Phe Tyr Arg Glu Glu Leu Gly Thr. 85 90 95
Tyr Pro Tyr Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro 100 105 110
Gin Asn Ala Ser Leu Val Thr His Leu Ala His Ala Phe Gin Asp Ile 115 120 125
Lys Ala Ala Met Pro Glu Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val Ile Asp 130 135 140
Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Ser Lys Asp 145 150 155 160
Ile Tyr Gin Gin Arg Ser Met Glu Leu Val Arg Ala Glu His Pro Asp 165 170 175
Trp Pro Glu Thr Leu Val Glu Ala Glu Ala Gin Gly Gin Phe Gin Glu 180 1Θ5 190
Ala Ala Glu Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Leu Gly Gin Val Leu 195 200 205
Arg pro Arg Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr Asn 210 215 220
Tyr Asp Phe Leu Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Ser Leu Ser Ile 225 230 235 240
His Asp Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Asn Gin Ser Tyr Ala 24S 250 255
Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Pro Ala Ala Leu Met Gly Thr Gly Lys 260 265 270
Ser Gin Met Tyr Val Arg Tyr Arg Val Gin Glu Ala Phe Arg Leu Ala 275 280 . 285
Leu Val Ser Arg Asp Pro His Val Pro lie Met Pro Tyr Val Gin lie 290 295 300
Phe Tyr Glu Lys Thr Asp Tyr Leu Leu Pro Leu Glu Glu Leu Glu His 305 310 315 320
Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Ala Val Leu Trp 325 330 335 lie Ser Ser Glu Lys Thr Ser Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala He Lys 340 345 350
Ala Tyr Met Asp Ser Thr Leu Gly Pro Phe lie Leu Asn Val Thr Ser 355 360 365
Ala Ala Leu Leu Cys Ser Glu Ala Leu Cys Ser Gly Arg Gly Arg Cys 370 375 380
Val Arg His Pro Ser Tyr Pro Glu Ala Leu Leu Thr Leu Ser Pro Ala 385 390 395 400
Ser Phe Ser lie Glu Pro Thr His Asp Gly Arg Pro Leu Ser Leu Lys 405 410 415
Gly Thr Leu Ser Leu Lys Asp Arg Ala Gin Met Ala Met Lys Phe Lys 420 425 430
Cys Arg Cys Tyr Arg Gly Trp Ser Gly Glu Trp Cys Lys Lys Gin Asp 435 440 445
Met <210> 23 <211> 473'
<212> PRT <213> Rattus norvegicus <22 0> <223> hialuronidase 2 <400> 23
Met Arg Ala Gly Leu Gly Pro He lie Thr Leu Ala LeU Val Leu Glu 15 10 15
Val Ala Trp Ala Ser Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro He Phe Thr 20 25 30
Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asn Val Pro Thr Gin Glu Cys Ala 35 40 45
Pro Arg His Lys Val Pro Leu Asp Leu Arg Ala Phe Asp Val Glu Ala 50 55 60
Thr Pro Asn Glu Gly Phe Phe Asn Gin Asn He Thr Thr Phe Tyr Tyr 65 70 75 80
Asp Arg Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ala Ala Gly Met Ser Val 85 90 95
His Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Cys Ala His Leu Pro Met 100 105 110
Leu Lys Glu Ala Val Glu Arg Tyr lie Gin Thr Gin Glu Pro Ala Gly 115 120 125
Leu Ala Val He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 140
Trp Gin Glu Lys Asp Val Tyr Arg Gin Ser Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 150 155 160
Ser Arg His Pro Asp Trp Pro Ser Asp Arg He Val Lys Gin Ala Gin 165 170 175
Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin Phe Met Leu Asn Thr Leu Arg 180 185 190
Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Gin His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe 195 200 205
Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Asp Ser Tyr Thr 210 215 220
Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Gin Asn Asp Gin Leu Ala Trp 225 230 235 240
Leu Trp Ala Glu Asn Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asp Lys 245 250 255
Thr Leu Ala Ser Ser Lys His Ser Arg Asn Phe Val Ser Phe Arg Val 260 265 270
Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala His Thr His His Ala Asn His Ala Leu 275 280 285
Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Thr Arg Arg Leu Thr Glu 290 295 300
Leu Asn Gin Met Asp Leu lie Ser Thr He Gly Glu Ser Ala Ala Leu 305 310 315 320
Gly Ser Ala Gly Val lie Phe Trp Gly Asp Ser Val Tyr Ala Ser Ser 325 330 335
Met Glu Asn Cys Gin Asn Leu Lys Lys Tyr Leu Thr Gin Thr Leu Val 340 345 350
Pro Tyr lie Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Trp Thr 355 360 365
Gin Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Asn Pro Ser Ala Ser 370 375 380
Thr Phe Leu His Leu Ser Pro Ser Ser Phe Arg Leu Val Pro Gly Arg 385 390 395 400
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Asp Leu Ser Tyr Leu Gin Met His Phe Arg Cys His Cys Tyr Leu Gly 420 425 430
Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asn His Lys Arg Ala Ala Gly Asp 435 440 445
Ala Ser Arg Ala Trp Ala Gly Ala His Leu Ala Ser Leu Leu Gly Leu 450 455 460
Val Ala Met Thr Leu Thr Trp Thr Leu 465 470
<210> 24 <211> 412 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <22 0> <223> hialuronidase 3 <400> 24
Met He Thr Gin Leu Gly Leu Thr Leu Val Val Gly Leu Thr Leu Cys 15 10 15
Leu Val His Val Gin Ala Leu Leu Gin Val Pro Glu Phe Pro Phe Ser 20 25 30
Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala Arg Cys Lys Thr Arg Phe Gly Val 35 40 45
His Leu Pro Leu Asp Ala Leu Gly lie He Ala Asn His Gly Gin Arg 50 55 60
Phe His Gly Gin Asn lie Thr He Phe Tyr Lys Asn Gin Phe Gly Leu 65 70 75 80
Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95
Gin Ala Val Ser Leu Asp His His Leu Ala Gin Ala Ala His Gin lie 100 105 HO
Leu His Asn Leu Gly Ser Ser Phe Ala Gly Leu Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125
Glu Glu Trp Tyr Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Thr His Arg Gin 130 135 140
Val Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Met Phe Pro Asp 145 150 155 160
Leu Asn Pro Gin Glu Gin Leu His Lys Ala Gin Thr Gly Phe Glu Gin 165 170 175
Ala Ala Arg Ala Leu Met Glu His Thr Leu Arg Leu Gly Gin Met Leu 180 185 190
Arg Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Arg Tyr Pro Val Cys Gly Asn 195 200 205
Gly Trp His Asn Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly His Cys His Pro Ala 210 215 220 lie lie Thr Arg Asn Thr Gin Leu Arg Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser 225 230 235 240
Ala Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Ala Tyr 245 250 255
His Gin Thr Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala 260 265 270
Leu Thr Gly His Ala His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu 275 280 285
Thr His Arg Ser Ser Gly Arg Phe Leu Ser Leu Asp Asp Leu Met Gin 290 295 300
Thr lie Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp 305 310 315 320
Gly Asp Leu Ser Val Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp Arg Leu His 325 330 335
Asp Tyr Leu Val Gly Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Lys 340 345 350
Ala Ala Thr Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys 355 360 365
Ser Trp Lys Asp Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Gin Pro 370 375 380
Asp Asp Asn Leu Gly Ala Trp Lys Ser Phe Arg Cys Arg Cys Tyr Leu 385 390 395 400
Gly Trp Ser Gly Pro Thr Cys Leu Glu Pro Lys Pro 405 410
<210> 25 <211> 545 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <22 0> <223> PH20 <400> 25
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Gly Ser Ala Val Glu 15 10 15
Leu Ser Gly Val phe Gin lie Val Phe lie Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Ala Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Thr Glu Phe Cys Leu Gly Lys Ser 50 5S 60
Gly Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Leu Phe Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80
Lys Asn Lys Thr Gly Gin Gly Ilé Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Pro His Thr Gly Ala lie Val His Gly 100 105 110
Arg He Pro Gin Leu Gly Pro Leu Gin Gin His Leu Thr Lys Leu Arg 115 120 125
Gin Glu lie Leu Tyr Tyr Met Pro Lys Asp Asn Val Gly Leu Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Leu Pro Thr Trp Leu Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp lie Tyr Arg He Lys Ser lie Glu Leu Val Lys Ser Gin His 165 170 175
Pro Gin Tyr Asn His Ser Tyr Ala Thr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Gly Arg 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Asp Lys Pro Asn Leu Tyr Lys Gly Ser Cys Phe 225 230 235 240
Asp He Glu Lys Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Lys Glu 245 250 255
Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Ala Arg Ser 260 265 270
Ala Thr Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Val Val Arg Asn Arg Val His Glu 275 280 285
Ala lie Arg Val Ser Lys lie Pro Asp Asp Lys Ser Pro Leu Pro Asn 290 295 300
Phe Val Tyr Thr Arg Leu Val Phe Thr Asp Gin lie Phe Gin Phe Leu 305 310 315 320
Ser His His Asp Leu Val Tyr Thr He Gly Glu lie Val Ala Leu Gly 325 330 335
Ala Ser Gly He Val Val Trp Gly Ser Gin Ser Leu Ala Arg Ser Met 340 34S 350
Lys Ser Cys Leu His Leu Asp Asn Tyr Met Lys Thr lie Leu Asn Pro 355 360 365
Tyr Leu He Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Asn Gin Val Leu 370 375 380
Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys Thr Arg Lys Asn Trp Asn Pro Asn Asp 385 390 395 400
Tyr Leu His Leu Asn Pro Gly Asn Phe Ala He Gin Leu Gly Ser Asn 40S 410 415
Gly Thr Tyr Lys . Val Asp Gly Lys Pro Thr Leu Thr Asp Leu Glu Gin 420 425 430
Phe Ser Lys Asn Phe Gin Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Asn Cys Lys 435 440 445
Glu Arg Thr Asp Met Asn Asn Val Arg Thr Val Asn Val Cys Ala Val 450 455 460
Glu Asn Val Cys He Asp Thr Asn Val Gly Pro Gin Ala Val Thr Tyr 465 470 475 480
Ala Pro Lys Glu Lys Lys Asp Val Ala His He Leu Ser Asn Thr Thr 485 490 495
Ser He Asn Ser Ser Thr Thr Met Ser Leu Pro Phe Pro Arg Lys His 500 505 510
Vai Ser Gly Cys Leu Leu Vai Leu Cys Met Tyr Ser Gin Tyr Leu Asn 515 520 525 lie Cys Tyr Arg Leu Vai Ala lie Gly Ile Gin His Gly Tyr Tyr Leu 530 535 540
Lys 545 <210> 26 <211> 476 <212> PRT <213> Ovis aries <22 0> <223> hialuronidase 2 <40J)> 2 6
Met Trp Thr Gly Leu Gly Pro Ala Vai Thr Leu Ala Leu Vai Leu Vai 15 10 15
Vai Ala Trp Ala Thr Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Phe Thr 20 25 30
Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asp Val Pro Thr Gin Asp Cys Gly 35 40 45
Pro Arg His Lys Met Pro Leu Asp Pro Lys Asp Met Lys Ala Phe Asp 50 55 60
Val Gin Ala Ser Pro Asn Glu Gly Phe Val Asn Gin Asn Ile Thr Ile 65 70 75 80
Phe Tyr Arg Asp Arg Leu Gly Met Tyr Pro His Phe Asn Ser Val Gly 85 90 95
Arg Ser Val His Gly Gly Val Pro Gin Asn Gly Ser Leu Trp Val His 100 105 110
Leu Glu Met Leu Lys Gly His Val Glu His Tyr Ile Arg Thr Gin Glu 115 120 125
Pro Ala Gly Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Asp Trp. Arg Pro Val Trp 130 135 140
Val Arg Asn Trp Gin Asp Lys Asp Val Tyr Arg Arg Leu Ser Arg Gin 145 150 155 160
Leu Val Ala Ser His His Pro Asp Trp Pro Pro Glu Arg Ile val Lys 165 170 175
Glu Ala Gin Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Arg Gin Phe Met Leu Glu 180 185 190
Thr Leu Arg Phe Val Lys Ala Phe Arg Pro Arg His Leu Trp Gly Phe 195 200 205
Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Glu 210 215 220
Thr Tyr Thr Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ser Arg Asn Asp Gin 225 230 235 240
Leu Ser Trp Leu Trp Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr 245 250 255
Leu Glu Glu Thr Leu Ala Ser Ser Thr His Gly Arg Asn Phe val Ser 260 265 270
Phe Arg Val Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala Asp Val His His Ala Asn 275 280 285
His Ala Leu Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Ser Arg Gly 290 295 300
Leu Thr Gly Leu Ser Glu Met Asp Leu Ile Ser Thr lie Gly Glu Ser 305 310 315 320
Alá Ala Leu Gly Ala Ala Gly Vai lie Leu Trp Gly Asp Ala Gly Phe 325 330 335
Thr Thr Ser Asn Glu Thr Cys Arg Arg Leu Lys Asp Tyr Leu Thr Arg 340 345 350
Ser Leu Vai Pro Tyr Vai Vai Asn Vai Ser Trp Ala Ala Gin Tyr Cys 355 360 365
Ser Trp Ala Gin Cys His Gly His Gly Arg .Cys Vai Arg Arg Asp Pro 370 375 380
Asn Ala His Thr Phe Leu His Leu Ser Ala Ser Ser Phe Arg Leu Vai 385 390 395 400
Pro Ser His Ala Pro Asp Glu Pro Arg Leu Arg Pro Glu Gly Glu Leu 405 410 415
Ser Trp Ala Asp Arg Asn His Leu Gin Thr His Phe Arg Cys Gin Cys 420 425 430
Tyr Leu Gly Trp Gly Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asp Arg Arg Arg Ala 435 440 445
Ala Gly Gly Ala Ser Gly Ala Trp Ala Gly Ser His Leu Thr Gly Leu 450 455 460
Leu Ala Vai Ala Vai Leu Ala Phe Thr Trp Thr Ser 465 470 475 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213> Ovis aries <22 0> <223> PH20 sequência parcial <400> 27
Leu Tyr Vai Arg Asn Arg Vai Arg Glu Ala Ile Arg Leu Ser Lys Ile 15 10 15
Ala Ser Vai Glu Ser Pro Leu Pro Vai Phe Vai Tyr His Arg Pro Vai 20 25 30
Phe Thr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gin Gly Asp Leu vai Asn 35 40 45
Ser Vai Gly Glu Ile Vai Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie lie Met Trp 50 55 60
Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr Met Gin Ser Cys Met Asn Leu Gly 65 70 75 80
Asn Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Vai Thr Leu 8S 90 95
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Vai Leu Cys Gin Glu Gin Gly Vai Cys 100 105 110
Ile Arg
<210> 28 <211> 414 <212> PRT <213> Pongo pygmaeus <220> <223> hialuronidase 3 <400> 28
Met Thr Thr Arg Leu Gly Pro Ala Leu Vai Leu Gly Vai Ala Leu Cys 15 10 15
Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Pro Gin Val Pro Glu Arg Pro Phe Ser 20 25 30
Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala His Cys Lys Ser Arg Phe Gly Val 35 40 45
His Leu Pro Leu Asn Ala Leu Gly lie lie Ala Asn Arg Gly Gin His 50 55 60
Phe His Gly Gin Asn Met Thr lie Phe Tyr Lys Asn Gin Leu Gly Leu 65 70 75 80
Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Lys Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95
Gin Ala Leu Pro Leu Asp Arg His Leu Ala Leu Ala Ala Tyr Gin lie 100 105 110
His His Ser Leu Arg Pro Gly Phe Ala Gly Pro Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125
Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Arg Ala 130 135 140
Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Val Phe Pro Asp Leu 145 150 155 160
Asp Pro Gin Glu Gin Leu Tyr Lys Ala Tyr Thr Gly Phe Glu Gin Ala 165 170 175
Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Val Ala Gin Ala Leu Arg 180 185 190
Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205
Trp His Ser Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Arg Cys His Ala Alá Thr 210 215 220
Leu Ala Arg Asn Thr Gin Leu His Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240
Leu Phe Pro Ser lie Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Ala His His 245 250 255
Gin Ala Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg val Ala Leu 260 265 270
Val Gly His Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu Thr His Arg Arg 275 280 285
Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Asp Leu Val Gin Thr lie Gly Val 290 295 300
Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp Gly Asp Leu Ser 305 310 315 320
Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His Asp Tyr Leu Val 325 330 335
Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Gly lie Asn Val Thr Arg Ala Ala Met Ala 340. 345 350
Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala Arg Arg Asp 355 360 365
Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Trp Pro Asp Gly Ser Leu 370 375 380
Gly Asp Trp Lys Ser Phe Ser Cys His Cys Tyr Trp Gly Trp Ala Gly 385 390 395 400
Pro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Leu Gly Pro Lys Glu Ala Val 405 410
<210> 29 <211> 510 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> PH20 <400> 29
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn phe Arg Ala Pro Pro lie lie Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asn Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Thr Leu Met Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Val Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Leu Thr Thr Gly Val Thr Val His Gly 100 105 110
Gly I.le Pro Gin Lys Val Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ser Lys 115 120 125
Gin Asp lie Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Pro Gin Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Leu Glu Thr lie Lys Leu Gly Arg 195 200 205
Ser Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Arg Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asp 225 230 235 240
Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Val Val 260 265 270
Val Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Asn Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Ala 290 29S 300
Arg Leu Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Arg Glu Glu 305 310 315 320
Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335
Val He Trp Gly Ser Leu Ser lie Thr Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Thr Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys He Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Asp He Arg Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val His Gly Lys Pro Thr Val Glu Asp Leu Glu Glu Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro 465 470 475 480 lie Phe Tyr Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Thr Thr Met Phe lie 485 490 495
Val Asn He Leu Phe Leu lie lie Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 510
<210> 30 <211> 529 <212> PRT <213> Cavia porcellus <22 0> <223> PH20 <400> 30
Met Gly Ala Phe Thr Phe Lys His Ser Phe Phe Gly Ser Phe Val Glu 15 10 15
Cys Ser Gly Val Leu Gin Thr Val Phe He Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Ala Asp Lys Arg Ala Pro Pro Leu He Pro Asn Val Pro Leu 35 40 45
Leu Trp Val Trp Asn Ala Pro Thr Glu Phe Cys lie Gly Gly Thr Ash 50 55 60
Gin Pro Leu Asp Met Ser Phe Phe Ser lie Val Gly Thr Pro Arg Lys 65 70 75 80
Asn He Thr Gly Gin Ser lie Thr Leu Tyr Tyr Val Asp Arg Leu Gly 85 90 95
Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Pro His Thr Gly Ala He Val His Gly Gly 100 105 110
Leu Pro Gin Leu Met Asn Leu Gin Gin His Leu Arg Lys Ser Arg Gin 115 120 125
Asp He Leu Phe Tyr Met Pro Thr Asp Ser Val Gly Leu Ala val He 130 135 140
Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Thr Arg Asn Trp Arg Pro Lys 145 150 155 160
Asp He Tyr Arg Asn Lys Ser He Glu Leu Val Lys Ser Gin His Pro 165 170 175
Gin Tyr Asn His Ser Tyr Ala Val Ala Val Ala Lys Arg Asp Phe Glu 180 185 190
Arg Thr Gly Lys Ala Phe Met Leu Glu Thr Leu Lys Leu Gly Lys Ser 195 200 205
Leu Arg Pro Ser Ser Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220
Asn Thr His Phe Thr Lys Pro Asn Tyr Asp Gly His Cys Pro Pro He 225 230 235 240
Glu Leu Gin Arg Asn Asn Asp Leu Gin Trp Leu Trp Asn Asp Ser Thr 245 250 255
Ala Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Val Arg Ser Ser Gin 260 265 270
Asn Gly Ala Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val His Glu Ser lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys Leu Met Asp Asp Lys Asn Pro Leu Pro lie Tyr Val Tyr lie 290 295 300
Arg Leu Val Phe Thr Asp Gin Thr Thr Thr Phe Leu Glu Leu Asp Asp 305 310 315 320
Leu Val His Ser Val Gly Glu lie Val Pro Leu Gly Val Ser Gly He 325 330 335 lie lie Trp Gly Ser Leu Ser Leu Thr Arg Ser Leu Val Ser Cys He 340 345 350
Gly Leu Glu Asn Tyr Met Lys Gly Thr Leu Leu Pro Tyr Leu lie Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Gly Gin Val Leu Cys Lys Asn Gin 370 375 380
Gly lie Cys Thr Arg Lys Asp Trp Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Ala Thr Asn Phe Asp He Glu Leu Gin Gin Asn Gly Lys Phe Val 405 410 415
Val His Gly Lys Pro Ser Leu Glu Asp Leu Gin Glu Phe Ser Lys Asn 420 425 430
Phe His Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Val Ala Cys Lys Asp Arg Leu Asp 435 440 445
Val His Asn Val Arg Ser Val Asn Val Cys Thr Ala Asn Asn He Cys 450 455 460
He Asp Ala Val Leu Asn Phe Pro Ser Leu Asp Asp Asp Asp Glu Pro 465 470 475 480
Pro He Thr Asp Asp Thr Ser Gin Asn Gin Asp Ser lie Ser Asp He 485 490 495
Thr Ser Ser Ala Pro Pro Ser Ser His lie Leu Pro Lys Asp Leu Ser 500 505 510
Trp Cys Leu Phe Leu Leu Ser He Phe Ser Gin His Trp Lys Tyr Leu 515 520 525
Leu
<210> 31 <211> 512 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <223> PH20 <400> 31
Met Gly Glu Leu Gin Phe Lys Trp Leu Phe Trp Arg Ser Phe Ala Glu IS 10 15
Ser Gly Gly Thr Phe Gin Thr Val Leu lie Phe Leu Phe lie Pro Tyr 20 25 30
Ser Leu. Thr Val Asp Tyr Arg Ala Thr Pro Val Leu Ser Asp Thr Thr 35 40 45
Phe Val Trp Val Trp Asn Val Pro Thr Glu Ala Cys Val Glu Asn Val 50 55 60
Thr Glu Pro lie Asp Leu Ser Phe Phe Ser Leu lie Gly Ser Pro Arg 65 70 . 75 80
Lys Thr Ala lie Gly Gin Pro Val Thr Leu Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Asn Tyr Pro His lie Asp Ala Gin Gin Thr Glu His His Gly Gly 100 105 110
He Pro Gin Lys Gly Asp Leu Thr Thr His Leu Val Lys Ala Lys Glu 115 120 125
Asp Val Glu Arg Tyr He Pro Thr Asp Lys Leu Gly Leu Ala lie lie 130 135 140
Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Met Arg Asn Trp Thr Pro Lys 145 150 155 160
Asp lie Tyr Arg Asn Lys Ser lie Glu Leu Val Gin Ala Ala Asp Pro 165 170 175
Ala lie Asn lie Thr Glu Ala Thr Val Arg Ala Lys Ala Gin Phe Glu 180 185 190
Gly Ala Ala Lys Glu Phe Met Glu Gly Thr Leu Lys Leu Gly Lys His 195 200 205 lie Arg Pro Lys His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220
Asn Asn Lys Phe Gin Val Asp Asn Tyr Asp Gly Gin Cys Pro Asp Val 225 230 235 240
Glu Lys Lys Arg Asn Asp Asp Leu Asp Trp Leu Trp Lys Glu Ser Thr 245 250 255
Gly Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser Ser Arg 260 265 270
Lys Ala Thr Leu Tyr Val Arg Tyr Arg Val Leu Glu Ser He Arg Val 275 280 285
Ser Lys Val Ser Asp Glu Ser Asn Pro Val Pro lie Phe Val Tyr He 290 295 300
Arg Leu Val Phe Thr Asp His Val Ser Glu Tyr Leu Leu Glu Asp Asp 305 310 315 320
Leu Val Asn Thr lie Gly Glu He Val Ala Gin Gly Thr Ser Gly lie 325 * 330 335 lie . lie Trp Asp Ala Met Ser Leu Ala Gin Arg Ser Ala Gly Cys Pro 340 345 350
He Leu Arg Gin Tyr Met Lys Thr Thr Leu Asn Pro Tyr He Val Asn 355 360 '365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Thr Leu Cys Lys Glu Lys 370 375 380
Gly Met Cys Ser Arg Lys Thr Glu Ser Ser Asp Ala Tyr Leu His Leu 38S 390 395 400
Asp Pro Ser Ser Phe Ser He Asn Val Thr Glu Ala Gly Lys Tyr Glu 405 410 415
Val Leu Gly Lys Pro Glu Val Lys Asp Leu Glu Tyr Phe Ser Glu His 420 425 430
Phe Lys Cys Ser Cys Phe Ser Lys Met Thr Cys Glu Glu Thr Ser Asp
435 440 44S
Met Arg Ser lie Gin Asp Val Asn Val Cys Met Gly Asp Asn Val Cys 450 45S 460
He Lys Ala Thr Leu Gly Pro Asn Ser Ala Phe His Leu Leu Pro Gly 465 470 475 480
Lys Gly Leu Leu Leu Met Thr Thr Leu Ala His He Leu His His Leu 485 490 495
Pro His Asp lie Phe Val Phe Pro Trp Lys Met Leu Val Ser Thr Pro 500 505 510
<210> 32 <211> 512 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <223> PH20 <400> 32
Met Gly Glu lieu Arg Phe Lys His Leu Phe Trp Gly Ser Phe Val Glu 15 10 is
Ser Gly Gly Thr Phe Gin Thr Val Leu lie Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Ser Leu Thr Val Asp Tyr Arg Ala Ala Pro lie Leu Ser Asn Thr Thr 35 40 45
Phe Leu Trp lie Trp Asn Val Pro Thr Glu Arg Cys Val Gly Asn Val 50 55 60
Asn Asp Pro lie Asp Leu Ser Phe Phe Ser Leu lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80
Lys Thr Ala Thr Gly Gin Pro Val Thr Leu Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Leu Tyr Pro His lie Asp Ala Asn Gin Ala Glu His Tyr Gly Gly 100 105 110 lie Pro Gin Arg Gly Asp Tyr Gin Ala His Leu Arg Lys Ala Lys Thr 115 120 125
Asp lie Glu His Tyr lie Pro Asp Asp. Lys Leu Gly Leu Ala lie lie 130 135 140
Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Leu Arg Asn Trp Lys Pro Lys 145 150 155 160
Asp Asn Tyr Arg Asn Lys Ser lie Glu Leu Val Gin Ser Thr Asn Pro 165 170 175
Gly Leu Ser lie Thr Glu Ala Thr Gin Lys Ala lie Gin Gin Phe Glu 180 185 190
Glu Ala Gly Arg Lys Phe Met Glu Gly Thr Leu His Leu Gly Lys Phe 195 200 205
Leu Arg Pro Asn Gin Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr 210 215 220
Asn Asn Lys Phe Gin Asp Pro Lys Tyr Asp Gly Gin Cys Pro Ala Val 225 230 235 240
Glu Lys Lys Arg Asn Asp Asn Leu Lys Trp Leu Trp Lys Ala Ser Thr 245 250 255
Gly Leu Tyr Pro Ser Val Tyr Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser Asn Arg 260 265 270
Gin Ala Thr Leu Tyr Val Arg Tyr Arg Val Val Glu Ala lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys Val Gly Asn Ala Ser Asp Pro Val Pro lie Phe Val Tyr lie 290 295 300
Arg Leu Val Phe Thr Asp Arg Thr Ser Glu Tyr Leu Leu Glu Asp Asp 305 310 315 320
Leu Val Asn Thr lie Gly Glu lie Val Ala Leu Gly Thr Ser Gly He 325 330 335 lie lie Trp Asp Ala Met Ser Leu Ala Gin Arg Ala Ala Gly Cys Pro 340 345 350
He Leu His Lys Tyr Met Gin Thr Thr Leu Asn Pro Tyr lie val Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Thr Leu Cys Asn Glu Lys 370 375 380
Gly Met Cys Ser Arg Arg Lys Glu Ser Ser Asp Val Tyr Leu His Leu 38S 390 395 400
Asn Pro Ser His Phe Asp lie Met Leu Thr Glu Thr Gly Lys Tyr Glu 405 410 415
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Phe Lys Cys Ser Cys Phe Ser Arg Met Thr Cys Lys Glu Thr Ser Asp 435 440 445
Val Lys Asn Val Gin Asp Val Asn Val Cys Val Gly Asp Asn Val Cys 450 455 460 lie Lys Ala Lys Val Glu Pro Asn Pro Ala Phe Tyr Leu Leu Pro Gly 465 470 475 480
Lys Ser Leu Leu Phe Met Thr Thr Leu Gly His Val Leu Tyr His Leu 485 490 495
Pro Gin Asp lie Phe Val Phe Pro Arg Lys Thr Leu Val Ser Thr Pro 500 505 510
<210> 33 <211> 807 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <22 0> <223> hialuronidase <400> 33
Met Thr Tyr Arg lie Lys Lys Trp Gin Lys Leu Ser Thr lie Thr Leu 1 .5 10 15
Leu Met- Ala Gly val lie Thr Leu Asn Gly Gly Glu Phe Arg Ser Val 20 25 30
Asp Lys His Gin lie Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gin Thr Pro Asp 35 40 45
Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60
Lys Tyr Asp Glu Asn Asn Pro Asp Met Lys Lys Lys Phe Asp Ala Thr 65 70 75 80
Glu Lys Glu Ala Thr Asn Leu Leu Lys Glu Met Lys Thr Glu Ser Gly 85 90 95
Arg Lys Tyr Leu Trp Ser Gly Ala Glu Thr Leu Glu Thr Asn Ser Ser 100 105 110
His Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn lie Glu Lys lie Ala Glu Ala Met 115 120 125
Arg Asn Pro Lys Thr Thr Leu Asn Thr Asp Glu Asn Lys Lys Lys Val 130 135 140
Lys Asp Ala Leu Glu Trp Leu His Lys Asn Ala Tyr Gly Lys Glu Pro 145 ISO 155 160
Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Ser Glu Asn Phe Thr Lys Thr Thr Gly 165 170 175
Lys Asn Thr Asn Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu He Gly Thr Pro Lys 180 185 190
Ser Leu Thr Asn Thr Leu lie Leu Leu Asn Asp Gin Phe Ser Asn Glu 195 200 205
Glu Lys Lys Lys Phe Thr Ala Pro lie Lys Thr Phe Ala Pro Asp Ser 210 215 220
Asp Lys lie Leu Ser Ser Val Gly Lys Ala Glu Leu Ala Lys Gly Gly 225 230 235 240
Asn Leu Val Asp lie Ser Lys Val Lys Leu Leu Glu Cys He lie Glu 245 250 255
Glu Asp Lys Asp Met Met Lys Lys Ser lie Asp Ser Phe Asn Lys Val 260 265 270
Phe Thr Tyr Val Gin Asp Ser Ala Thr Gly Lys Glu Arg Asn Gly Phe 275 280 285
Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Gin Asp Val Pro Tyr Thr Gly 290 295 300
Ala Tyr Gly Val val Leu Leu Glu Gly He ser Gin Met Met Pro Met 305 310 315 320 lie Lys Glu Thr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Gin Asn Asp Thr Thr Leu 325 330 335
Lys Ser Trp lie Asp Asp Gly Phe Met Pro Leu He Tyr Lys Gly Glu 340 345 350
Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala lie Ser Arg Glu Asn Glu Thr 355 360 365
Ser His Ser Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu Ser 370 375 380
Asp Ala Met Asp Asp Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Lys He Val Lys 385 390 395 400
Ser Ser Val Glu Ser Asp Ser Ser Tyr Lys Gin Asn Asp Tyr Leu Asn 405 410 415
Ser Tyr Ser Asp lie Asp Lys Met Lys Ser Leu Met Thr Asp Asn Ser 420 425 430 lie Ser Lys Asn Gly Leu Thr Gin Gin Leu Lys lie Tyr Asn Asp Met 435 440 445
Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly Leu 450- 455 460
Ser Met Thr Ser Lys Asn Val Ala Arg Tyr Glu Ser He Asn Gly Glu 465 470 475 480
Asn Leu Lys Gly Trp His Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr Asn 485 490 495
Ser Asp Val Lys His Tyr His Asp Asn Phe Trp Val Thr Ala Asp Met 500 505 510
Lys Arg Leu Ser Gly Thr Thr Thr Leu Asp Asn Glu lie Leu Lys Asp 515 520 525
Thr Asp Asp Lys Lys Ser Ser Lys Thr Phe Val Gly Gly Thr Lys Val 530 . 535 540
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Thr Leu Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe lie Leu Asn Asp Lys lie Val 565 570 575
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Val His Phe Glu Leu Thr Lys 805
<210> 34 <211> 371 <212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes bacteriófago H4489A <22 0> <223> hialuronidase <400> 34
Met Thr Glu Asn He Pro Leu Arg Val Gin Phe Lys Arg Met Ser Ala 1 5 10 15
Asp Glu Trp Ala Arg Ser Asp Val lie Leu Leu Glu Gly Glu lie Gly 20 25 30
Phe Glu Thr Asp Thr Gly Phe Ala Lys Phe Gly Asp Gly Gin Asn Thr 35 40 45
Phe Ser Lys Leu Lys Tyr Leu Thr Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Asp 50 55 60
Thr Gly Leu Gin Gly Lys Thr Gly Gly Thr Gly Pro Arg Gly Pro Ala 65 70 75 80
Gly Lys Pro Gly Thr Thr Asp Tyr Asp Gin Leu Gin Asn Lys Pro Asp 85 90 95
Leu Gly Ala Phe Ala Gin Lys Glu Glu Thr Asn Ser Lys lie Thr Lys 100 105 HO
Leu Glu Ser Ser Lys Ala Asp Lys Ser Ala Val Tyr Ser Lys Ala Glu 115 120 125
Ser Lys He Glu Leu Asp Lys Lys Leu Ser Leu Thr Gly Gly He Val 130 135 140
Thr Gly Gin Leu Gin Phe Lys Pro Asn Lys Ser Gly lie Lys Pro Ser 145 ISO 155 160
Ser Ser Val Gly Gly Ala He Asn lie Asp Met Ser Lys Ser Glu Gly 165 170 175
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Gly Lys Gly Thr Ala Ala Gin Gly lie Tyr lie Asn Ser Thr Ser Gly 290 295 300
Thr Ala Gly Lys Met Leu Arg He Arg Asn Lys Asn Glu Asp Lys Phe 305 310 315 320
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Thr Lys Asp Tyr Val Asp Glu Lys lie Ala Glu Leu Lys Lys Leu He 355 360 365
Leu Lys Lys 370
<210> 35 <211> 1628 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <220> <223> hialuronidase <400> 35
Met Asn Lys Asn lie Arg Lys He He Thr Ser Thr Val Leu Ala Ala 15 10 15
Met Thr He Ser Val Leu Pro Ser Asn Leu Val Val Phe Ala Thr Asp 20 25 30
Gly lie Thr Glu Asn Phe Tyr Glu He Tyr Pro Lys Pro Gin Glu He 35 40 45
Ser Tyr Ser Gly Gly Glu Phe Gin He Ser Asp Glu lie Asn He Val 50 55 60
Tyr Asp Asp Gly lie Asp Thr Tyr Thr Lys Lys Arg Val Asp Glu Val 65 70 75 80
Leu Glu Ala Ser Asn Leu Glu Ala Thr Val Ser Asn Glu lie Val Pro 85 90 95
Gly Lys Thr Asn Phe Leu Val Gly He Asn Glu Ser Gly Gly Val Val 100 105 110
Asp Asn Tyr Phe Asn Lys Asn He Pro His Asp Glu Ser Phe Phe Asp 115 120 125
Glu Lys Met Asp Ala Asn He Val Ser Val Lys Asp Gly Val He Gly 130 135 140
Val lie Gly Glu Asp Thr Asp Ser Ala Phe Tyr Gly Val Thr Thr Leu 145 150 155 160
Lys His Val Phe Asn Gin Leu Glu Glu Gly Asn Lys He Gin Ser Phe 165 170 175
Arg Ala Asp Asp Tyr Ala Glu Val Ala His Arg Gly Phe He Glu Gly 180 185 190
Tyr Tyr Gly Asn Pro Trp Ser Asn Glu Asp Arg Ala Glu Leu Met Lys 195 200 205
Phe Gly Gly Asp Tyr Lys Leu Asn Gin Tyr Val Phe Ala Pro Lys Asp 210 215 220
Asp Pro Tyr His Asn Ser Lys Trp Arg Asp Leu Tyr Pro Glu Glu Lys 225 230 235 240
Leu Ser Glu He Lys Lys Leu Ala Gin Val Gly Asn Glu Thr Lys Asn 245 250 255
Arg Tyr Val Tyr Ala Leu His Pro Phe Met Asn Asn Pro Val Arg Phe 260 265 270
Asp Thr Glu Glu Asn Tyr Gin Asn Asp Leu Gly Val He Lys Ala Lys 275 280 285
Phe Thr Gin Leu Leu Glu Asn Asp Val Arg Gin Phe Ala lie Leu Ala 290 295 300
Asp Asp Ala Ser Ala Pro Ala Gin Gly Ala Ser Met Tyr Val Lys Leu 305 310 315 320
Leu Thr Asp Leu Thr Arg Trp Leu Glu Glu Gin Gin Ser Thr Tyr Pro 325 330 335
Asp Leu Lys Thr Asp Leu Met Phe Cys Pro Ser Asp Tyr Tyr Gly Asn 340 345 350
Gly Ser Ser Ala Gin Leu Lys Glu Leu Asn Lys Ala Glu Asp Asn Val 355 360 365
Ser He Val Met Thr Gly Gly Arg ile Trp Gly Glu Val Asp Glu Asn 370 375 380
Phe Ala Asn Asn Phe Met Asn Asn Ile Ser Thr Glu Gly His Pro Gly 385 390 395 400
Arg Ala Pro Phe Phe Trp lie Asn Trp Pro Cys Ser Asp Asn Ser Lys 405 410 415
Gin His Leu Ile Met Gly Gly Asn Asp Thr Phe Leu His Pro Gly Val 420 425 430
Asp Pro Ser Lys Ile Asp Gly Ile Val Leu Asn pro Met Gin Gin Ala 435 440 445
Glu Ala Asn Lys Ser Ala Leu Phe Ala Ile Ala ASp Tyr Ala Trp Asn 450 455 460 lie Trp Asp Asn Lys Glu Glu Ala Asp Glu Asn Trp Asn Asp Ser Phe 465 470 475 480
Lys Tyr Met Asp His Gly Thr Ala Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Ala ' 485 490 495
Leu Arg Glu Ile Ser Lys His Met Ile Asn Gin Asn Met Asp Gly Arg 500 505 510 val Arg pro Leu Gin Glu Ser Val Glu Leu Ala Pro Lys Leu Glu Ala 515 520 525
Phe Lys Gin Lys Tyr Asp Ser Gly Ala Ser Ile Lys Glu Asp Ala Leu 530 535 540
Glu Leu Ile Ala Glu Phe Thr Asn Leu Gin Lys Ala Ala Asp Tyr Tyr 545 550 555 560
Lys Asn Asn Pro Gly Asn Glu Arg Thr Arg Asp Gin Ile lie Tyr Trp 565 570 575
Leu Asn Cys Trp Glu Asp Thr Met Asp Ala Ala Ile Gly Tyr Leu Lys 580 585 590
Ser Ala Ile Ala Ile Glu Glu Gly Asp Asp Glu Ala Ala Trp Ala Asn 595 600 605
Tyr Ser Glu Ala Gin Gly Ala Phe Glu Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Phe 610 615 620
His Tyr Val Asp His Thr Glu Tyr Ala Glu Val Gly Val Gin His Ile 625 630 635 640
Val Pro Phe Ile Lys Ser Met Gly Gin Asn Leu Ser Val Val Ile Gly 645 650 655
Ser Ile Val Asp Pro Asn Arg Ile Ile Ala Thr Tyr Ile Ser Asn Arg 660 665 670
Gin Asp Ala Pro Thr Gly Asn Pro Asp Asn Ile Phe Asp Asn Asn Ala 675 680 685
Ser Thr Glu Leu Val Tyr Lys Asn Pro Asn Arg Ile Asp Val Gly Thr 690 695 700
Tyr Val Gly Val Lys Tyr Ser Asn Pro Ile Thr Leu Asn Asn Val Glu 705 710 715 720
Phe Leu Met Gly Ala Asn Ser Asn Pro Asn Asp Thr Met Gin Lys Ala 725 730 735
Lys Ile Gin Tyr Thr Val Asp Gly Arg Glu Trp lie Asp Leu Glu Glu 740 745 750
Gly Val Glu Tyr Thr Met Pro Gly Ala Ile Lys Val Glu Asn Leu Asp 755 760 765
Leu Lys Val Arg Gly Val Arg Leu Ile Alá Thr Glu Ala Arg Glu Asn 770 775 780
Thr Trp Leu Gly Val Arg Asp Ile Asn Val Asn Lys Lys Glu Asp Ser 785 790 795 800
Asn Ser Gly Val Glu Phe Asn Pro Ser Leu Ile Arg Ser Glu Ser Trp 805 810 815
Gin Vai Tyr Glu Gly Asn Glu Ala Asn Leu Leu Asp Gly Asp Asp Asn 820 825 830
Thr Gly Vai Trp Tyr Lys Thr Leu Asn Gly Asp Thr Ser Leu Ala Gly 835 840 845
Glu Phe lie Gly Leu Asp Leu Gly Lys Glu Ile Lys Leu Asp Gly Ile 850 855 860
Arg Phe Vai Ile Gly Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ser Asp Lys Trp Asn 865 870 875 880
Lys Phe Lys Leu Glu Tyr Ser Leu Asp Asn Glu Ser Trp Thr Thr Ile 885 890 895
Lys Glu Tyr Asp Lys Thr Gly Ala Pro Ala Gly Lys Asp Vai Ile Glu 900 905 910
Glu Ser Phe Glu Thr Pro lie Ser Ala Lys Tyr Ile Arg Leu Thr Asn 915 920 925
Met Glu Asn Ile Asn Lys Trp Leu Thr Phe Ser Glu Phe Ala He lie 930 935 940
Ser Asp Glu Leu Glu Asn Ala Gly Asn Lys Glu Asn Vai Tyr Thr Asn 945 950 955 960
Thr Glu Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ala Lys Glu Asp Vai Thr Lys Leu 965 970 975 lie Pro Thr Asp Asp Ile Ser Leu Asn His Gly Glu Tyr Ile Gly Vai 980 985 990
Lys Leu Asn Arg Ile Lys Asp Leu Ser Asn Ile Asn Leu Glu Ile Ser 995 1000 1005
Asn Asp Thr Gly- Leu Lys Leu Gin Ser Ser Met Asn Gly Vai Glu Trp 1010 1015 1020
Thr Glu Ile Thr Asp Lys Asn Thr Leu Glu Asp Gly Arg Tyr Vai Arg 1025 1030 1035 1040
Leu Ile Asn Thr Ser Asn Glu Ala Vai Asn Phe Asn Leu Thr Lys Phe 1045 1050. 1055
Glu Vai Asn Ser Asn Glu Vai Tyr Glu Pro Ser Leu Vai Asp Ala Tyr 1060 1065 1070
Vai Gly Asp Asp Gly Ala Lys Lys Ala Vai Asp Gly Asp Leu Lys Thr 1075 1080 1085
Arg Vai Lys Phe Leu Gly Ala Pro Ser Thr Gly Asp Thr Ile Vai Tyr 1090 1095 1100
Asp Leu Gly Gin Glu Ile Leu Vai Asp Asn Leu Lys Tyr Vai Vai Leu 1105 1110 1115 1120
Asp Thr Glu Vai Asp His Vai Arg Asp Gly Lys Ile Gin Leu Ser Leu 1125 1130 1135
Asp Gly Glu Thr Trp Thr Asp Ala Ile Thr Ile Gly Asp Gly Vai Glu 1140 1145 1150
Asn Gly Vai Asp Asp Met Phe Ser Thr Pro Leu Lys Asn Gly Tyr Lys 11SS 1160 1165
His Gly Asn Gin Ser Gly Gly lie Vai Pro lie Asp Ser Ala Tyr Vai 1170 1175 1180
Glu Gly Asp Asn Leu Asn Gin Lys Ala Arg Tyr Vai Arg Ile Leu Phe 1185 1190 1195 1200
Thr Ala Pro Tyr Arg His Arg Trp Thr Vai lie Asn Glu Leu Met lie 1205 1210 1215
Asn Asn Gly Glu Tyr Ile Ser Thr Vai Asn Asp Pro Thr Tyr Ile Ser 1220 1225 1230
Asn Pro lie Glu Glu Arg Gly Phe Ala Pro Ser Asn Leu Arg Asp Gly 1235 1240 1245
Asn Leu Thr Thr Ser Tyr Lys Pro Asn Thr Asn Asn Gly Glu Ile Ser 1250 1255 1260
Glu Gly Ser Ile Thr Tyr Arg Leu Ser Glu Lys Thr Asp Vai Arg Lys 1265 1270 1275 1280
Vai Thr lie Vai Gin Ser Gly Ser Ser lie Ser Asn Ala Lys Vai Met 1285 1290 1295
Ala Arg Vai Gly Asp Gly Ser Glu Asn Vai Thr Asp Gin Trp Vai Gin 1300 1305 1310
Leu Gly Thr Leu Ser Asn Ser Leu Asn Glu phe Ile Asn Arg Asp Tyr 1315 1320 1325
Asn Asn lie Tyr Glu lie Lys lie Glu Trp Thr Asp Vai Ala Pro Asn 1330 1335 1340 lie Tyr Glu lie lie Thr Leu Asn Gin Glu Phe Glu Phe Pro Vai Asn 1345 1350 1355 1360
Asp Ser Leu Lys Ala Lys Tyr Asp Glu Leu ile Asn Leu ser Gly Asp 1365 1370 1375
Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Phe Glu Thr Leu Lys Glu Ala Leu Asn Glu 1380 1385 1390
Ala Lys Ser lie Leu Asp Asp Ser Asn Ser Ser Gin Lys Lys Ile Asp 1395 1400 1405
Lys Ala Leu Glu Lys Leu Asn Lys Ala Glu Glu Arg Leu Asp Leu Arg 1410 1415 1420
Ala Thr Asp Phe Glu Asp Phe Asn Lys Vai Leu Thr Leu. Gly Asn Ser 1425 1430 1435 1440
Leu Vai Glu Glu Glu Tyr Thr Ala Glu Ser Trp Ala Leu Phe Ser Glu 1445 1450 1455
Vai Leu Glu Ala Ala Asn Glu Ala Asn Lys Asn Lys Ala Asp Tyr Thr 1460 1465 1470
Gin Asp Gin Ile Asn Gin Ile Vai Ile Asp Leu Asp Ala Ser Ile Lys 1475 1480 1485
Ala Leu Vai Lys Glu Thr Pro Glu vai Asp Lys Thr Asn Leu Gly Glu 1490 1495 1500
Leu Ile Asn Gin Gly Lys Ser Leu Leu Asp Glu Ser Vai Glu Gly Phe 1505 1510 1515 1520
Asn Vai Gly Glu Tyr His Lys Gly Ala Lys Asp Gly Leu Thr Vai Glu 1525 1530 1535
Ile Asn Lys Ala Glu Glu Vai Phe Asn Lys Glu Asp Ala Thr Glu Glu 1540 1545 1550
Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Ser Leu Glu Gly Ala lie Ala Arg Phe 1555 1560. 1565
Asn Ser Leu Leu Ile Glu Glu Ser Thr Gly Asp Phe Asn Gly Asn Gly 1570 1575 1580
Lys lie Asp lie Gly Asp Leu Ala Met Vai Ser Lys Asn Ile Gly Ser 1585 1590 1595 1600
Thr Thr Asn Thr Ser Leu Asp Leu Asn Lys Asp Gly Ser Ile Asp Glu 1605 1610 1615
Tyr Glu lie Ser phe Ile Asn His Arg Ile Leu Asn 1620 1625
<210> 36 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hialuronidase-1 [Precursor] <400> 36
Met Ala Ala His Leu Leu Pro lie Cys Ala Leu Phe Leu Thr Leu Leu 15 10 15
Asp Met Ala Gin Gly Phe Arg Gly Pro Leu Leu Pro Asn Arg Pro Phe 20 25 30
Thr Thr Val Trp Asn Ala Asn Thr Gin Trp Cys Leu Glu Arg His Gly 35 40 45
Val Asp Val Asp Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Pro Gly Gin 50 55 60
Thr Phe Arg Gly Pro Asp Met Thr He Phe Tyr Ser Ser Gin Leu Gly 65 70 75 80
Thr Tyr Pro Tyr Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu 85 90 95
Pro Gin Asn Ala Ser Leu lie Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gin Asp 100 105 110 lie Leu Ala Ala He Pro Ala Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val He 115 120 125
Asp Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys 130 135 140
Asp lie Tyr Arg Gin Arg Ser Arg Ala Leu Val Gin Ala Gin His Pro 145 150 155 160
Asp Trp Pro Ala Pro Gin Val Glu Ala Val Ala Gin Asp Gin Phe Gin
165 170 17S
Gly Ala Ala Arg Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gin Leu Gly Arg Ala 180 185 190
Leu Arg Pro Arg Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr 195 200 205
Asn Tyr Asp Phe Leu Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Gin Cys Pro Ser Gly 210 215 220 lie Arg Ala Gin Asn Asp Gin Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gin Ser Arg 225 230 235 240
Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Met Pro Ala Val Leu Glu Gly Thr Gly 245 250 255
Lys Ser Gin Met Tyr Val Gin His Arg Val Ala Glu Ala Phe Arg Val 260 265 270
Ala val Ala Ala Gly Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Val Gin 275 280 285 lie Phe Tyr Asp Thr Thr Asn His Phe Leu Pro Leu Asp Glu Leu Glu 290 295 300
His Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gin Gly Ala Ala Gly Val Val Leu 305 310 315 320
Trp Val Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gin Ala He 325 330 335
Lys Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Gly Pro Phe He Leu Asn Val Thr 340 345 350
Ser Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gin Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg 355 360 365
Cys Val Arg Arg Thr Ser His Pro Lys Ala Leu Leu Leu Leu Asn Pro 370 375 380
Ala Ser Phe Ser lie Gin Leu Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Leu 385 390 395 400
Arg Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gin Ala Gin Met Ala Val Glu Phe 405 410 415
Lys Cys Arg Cys Tyr Pro Gly Trp Gin Ala Pro Trp Cys Glu Arg Lys 420 425 430
Ser Met Trp 435
<210> 37 <211> 473 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hialuronidase-2 [Precursor] <400> 37
Met Arg Ala Gly Pro Gly Pro Thr Val Thr Leu Ala Leu Val Leu Ala 15 10 15
Val Ala Trp Ala Met Glu Leu Lys Pro Thr Ala Pro Pro lie Phe Thr 20 25 30
Gly Arg Pro Phe Val Val Ala Trp Asp Val Pro Thr Gin Asp Cys Gly 35 40 45
Pro Arg Leu Lys Val Pro Leu Asp Leu Asn Ala Phe Asp Val Gin Ala 50 55 60
Ser Pro Asn Glu Gly Phe Val Asn Gin Asn lie Thr lie Phe Tyr Arg 65 70 75 Θ0
Asp Arg Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Phe Asp Ser Ala Gly Arg Ser Val 85 90 95
His . Gly Gly Val Pro Gin Asn Val Ser Leu Trp Ala His Arg Lys Met 100 105 HO
Leu Gin Lys Arg Val Glu His Tyr lie Arg Thr Gin Glu Ser Ala Gly 115 120 125
Leu Ala Val lie Asp Trp Glu Asp Trp Arg Pro Val Trp Val Arg Asn 130 135 140
Trp Gin Asp Lys Asp Val Tyr Arg Arg Leu Ser Arg Gin Leu Val Ala 145 150 155 160
Ser Arg His Pro Asp Trp Pro Pro Asp Arg lie Val Lys Gin Ala Gin 165 170 175
Tyr Glu Phe Glu Phe Ala Ala Gin Gin Phe Met Leu Glu Thr Leu Arg 180 185 190
Tyr Val Lys Ala Val Arg Pro Arg His Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Phe 195 200 205
Pro Asp Cys Tyr Asn His Asp Tyr Val Gin Asn Trp Glu Ser Tyr Thr 210 215 220
Gly Arg Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Arg Asn Asp Gin Leu Ala Trp 225 230 235 240
Leu Trp Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Asp Glu 245 250 255
Thr Leu Ala Ser Ser Arg His Gly Arg Asn Phe Val Ser Phe Arg Val 260 265 270
Gin Glu Ala Leu Arg Val Ala Arg Thr His His Ala Asn His Ala Leu 275 280 285
Pro Val Tyr Val Phe Thr Arg Pro Thr Tyr Ser Arg Arg Leu Thr Gly 290 295 300
Leu Ser Glu Met Asp Leu lie Ser Thr lie Gly Glu Ser Ala Ala Leu 305 310 315 320
Gly Ala Ala Gly Val He Leu Trp Gly Asp Ala Gly Tyr Thr Thr Ser 325 330 335
Thr Glu Thr Cys Gin Tyr Leu Lys Asp Tyr Leu Thr Arg Leu Leu Val 340 345 350
Pro Tyr Val Val Asn Val Ser Trp Ala Thr Gin Tyr Cys Ser Arg Ala 355 360 365
Gin Cys His Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Asn Pro Ser Ala Ser 370 375 380
Thr Phe Leu His Leu Ser Thr Asn Ser Phe Arg Leu Val Pro Gly His 385 390 395 400
Ala Pro Gly Glu Pro Gin Leu Arg Pro Val Gly Glu Leu Ser Trp Ala 405 410 415
Asp lie Asp His Leu Gl.n Thr His Phe Arg Cys Gin Cys Tyr Leu Gly 420 425 430
Trp Ser Gly Glu Gin Cys Gin Trp Asp His Arg Gin Ala Ala Gly Gly 435 440 445
Ala Ser Glu Ala Trp Ala Gly Ser His Leu Thr Ser Leu Leu Ala Leu' 450 455 460
Ala Ala Leu Ala Phe Thr Trp Thr Leu 465 470
<210> 38 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hialuronidase-3 [Precursor] <400> 38
Met Thr Thr Gin Leu Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Val Ala Leu Cys 1 5 10 15
Leu Gly Cys Gly Gin Pro Leu Pro Gin Val Pro Glu Arg Pro Phe Ser 20 25 30
Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala His Cys Glu Ala Arg Phe Gly Val 35 40 45
His Leu Pro Leu Asn Ala Leu Gly lie He Ala Asn Arg Gly Gin His 50 55 60
Phe His Gly Gin Asn Met Thr lie Phe Tyr Lys Asn Gin Leu Gly Leu 65 70 75 80
Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly lie Pro 85 90 95
Gin Ala Leu Pro Leu Asp Arg His Leu Ala Leu Ala Ala Tyr Gin lie 100 * 105 110
His His Ser Leu Arg Pro Gly Phe Ala Gly Pro Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125
Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Arg Ala 130 135 140
Tyr Gin Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gin Gin Val Phe Pro Asp Leu 145 - ISO 155 160
Asp Pro Gin Glu Gin Leu Tyr Lys Ala Tyr Thr Gly Phe Glu Gin Ala 165 170 175
Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Val Ala Gin Ala Leu Arg 180 185 190
Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205
Trp His Ser Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Arg Cys His Ala Ala Thr 210 215 220
Leu Ala Arg Asn Thr Gin Leu His Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240
Leu PÍie Pro Sér Ilè Tyr Leu Pro Pro Arg Léu Pro Pro Ala His' His 245 250 255
Gin Ala Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala Leu 260 265 270
Val Gly His Arg His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu Thr 275 280 285
His Arg Arg Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gin Asp Asp Leu val Gin Ser 290 295 300
He Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp Gly 305 310 315 320
Asp Leu Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His Asp 325 330 335
Tyr Leu Val Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Val lie Asn Val Thr Arg Ala 340 345 350
Ala Met Ala Cys Ser His Gin Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala 355 360 365
Arg Arg Asp Pro Gly Gin Met Glu Ala Phe Leu His Leu Trp Pro Asp 370 375 380
Gly Ser Leu Gly Asp Trp Lys Ser Phe Ser Cys His Cys Tyr Trp Gly 385 390 395 400
Trp Ala Gly Pro Thr Cys Gin Glu Pro Arg Pro Gly Pro Lys Glu Ala 405 410 415
Val
<210> 39 <211> 481 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Hialuronidase-4 <400> 39
Met Lys Val Leu Ser Glu Gly Gin Leu Lys Leu Cys Val Val Gin Pro 1 5 10 15
Val His Leu Thr Ser Trp' Leu Leu lie Phe Phe lie Leu Lys Ser lie 20 25 30
Ser Cys Leu Lys Pro Ala Arg Leu Pro lie Tyr Gin Arg Lys Pro Phe 35 40 45
He Ala Ala Trp Asn Ala Pro Thr Asp Gin Cys Leu He Lys Tyr Asn 50 55 60
Leu Arg Leu Asn Leu Lys Met Phe Pro Val He Gly Ser Pro Leu Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg Gly Gin Asn val Thr He Phe Tyr Val Asn Arg Leu Gly 85 90 95
Tyr Tyr Pro Trp Tyr Thr Ser Gin Gly Val Pro He Asn Gly Gly Leu 100 105 110
Pro Gin Asn He Ser Leu Gin _Val His Leu Glu Lys Ala Asp Gin Asp 115 120 125
He Asn Tyr Tyr He Pro Ala Glu Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val He 130 135 140
Asp Trp Glu Tyr Trp Arg Pro Gin Trp Ala Arg Asn Trp Asn Ser Lys 145 150 155 160
Asp val Tyr Arg Gin Lys Ser Arg Lys Leu He Ser Asp Met Gly Lys 165 170 175
Asn val Ser Ala Thr Asp He Glu Tyr Leu Ala Lys Val Thr Phe Glu 180 185 190
Glu ser Ala Lys Ala Phe Met Lys Glu Thr He Lys Leu Gly He Lys 195 200 205
Ser Arg Pro Lys Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Tyr Pro Asp Cys His 210 215 220
Asn Tyr Asn Val Tyr Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Ser Cys Pro Glu Asp 225 230 235 240
Glu Val Leu Arg Asn Asn Glu Leu Ser Trp Leu Trp Asn Ser Ser Ala 245 250 255
Ala Leu Tyr Pro Ser lie Gly Val Trp Lys Ser Leu Gly Asp Ser Glu 260 265 270
Asn lie Leu Arg Phe Ser Lys Phe Arg Val His Glu Ser Met Arg lie 275 280 285
Ser Thr Met Thr Ser His Asp Tyr Ala Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr 290 295 300
Arg Leu Gly Tyr Arg Asp Glu Pro Leu Phe Phe Leu Ser Lys Gin Asp 305 310 315 320
Leu Val Ser Thr lie Gly Glu Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly lie 325 330 335
Val He Trp Gly Asp Met Asn Leu Thr Ala Ser Lys Ala Asn Cys Thr 340 345 350
Lys Val Lys Gin Phe Val Ser Ser Asp Leu Gly Ser Tyr lie Ala Asn 355 360 365
Val Thr Arg Ala Ala Glu Val Cys Ser Leu His Leu Cys Arg Asn Asn 370 375 380
Gly Arg Cys lie Arg Lys Met Trp Asn Ala Pro Ser Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Ala Ser Tyr His lie Glu Ala Ser Glu Asp Gly Glu Phe Thr 405 410 415
Val Lys Gly Lys Ala Ser Asp Thr Asp Leu Ala Val Met Ala Asp Thr 420 425 430
Phe Ser Cys His Cys Tyr Gin Gly Tyr Glu Gly Ala Asp Cys Arg Glu 435 440 445 lie Lys Thr Ala Asp Gly Cys Ser Gly Val Ser Pro Ser Pro Gly Ser 450 455 460
Leu Met Thr Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ala Ser Tyr Arg Ser He Gin 465 470 475 480
Leu
<210> 40 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sHuPH20 precursor 1-467 <400> 40
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly He.Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140
He Asp Trp Glu Glu.Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 19S 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 · 235 240
Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 285
Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 30S 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335
Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He He Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp· Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala 465
<210> 41 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sHuPH20 precursor 1-477 <400> 41
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15
Ser ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 1.00 105 110
Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg lie Vál Phè Thr Asp Gl'n Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320 Léu Vál Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335
Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 45(0 455 460
He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 465 470 475 <210> 42 <211> 478
<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sHuPH20 precursor 1-478 <400> 42
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15' 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335
Val lie Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin val Leu Cys Gin Giu Gin 370 375 380
Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 465 470 475
<210> 43 <211> 479 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> sHuPH20 precursor 1-479 <400> 43
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr. Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 15S 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Val Glu lie Lys Arg A9n Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335
Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395. 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin 465 470 475
<210> 44 <211> 480 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> sHuPH20 precursor 1-480 <400> 44
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 is
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80
He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He phe Tyr val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly He Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140
He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335
Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Alá lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460
He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 480
<210> 45 <211> 481 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sHuPH20 precursor 1-481 <400> 45
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu He Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asri Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly’ Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140
He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Val Glu He Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335
Val He Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 val Lys Asp Thr Asp Ala val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460
He Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 480
Phe
<210> 46 <211> 483 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sHuPH20 precursor 1-483 <400> 46
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg ser Phe Val Lys 1 5 <10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Àla Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80
He Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly He Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 v
He Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser He Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala He Arg Val 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg He Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu, Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly He 325 330 335
Val He Trp Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie He Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys He Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala He Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Vai Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys lie Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie 465 470 475 480
Phe Tyr Asn
<210> 47 <211> 432 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sHuPH20 madura 36-467 <400> 47
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg lie Asn Ala 35 40 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60
Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80
Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val lie Asp Trp 100 105 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 ISO -155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys lie 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie Val He Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser He Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr He Leu Asn Pro Tyr He He Asn Val Thr Leu 325 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430
<210> 48 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sHuPH20 madura 36-483 <400> 48
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 15 10 is
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser phe He Gly Ser Pro Arg He Asn Ala 35 40 45
Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55. 60
Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly lie Pro 65 70 75 80
Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp lie 85 90 95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Alá Val lie Asp Trp 100 105 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125
Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn Val Gin Leu 130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu lie 195 200 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220
Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val Ser Lys He 245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg He Val 260 265 270
Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie val lie Trp 290 295 300
Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320
Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr lie lie Asn Val Thr Leu 325 330 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin Gly Val Cys 340 345 350 lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365
Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys lie Asp Ala 420 425 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin lie Phe Tyr Asn 435 440 445 <210> 49 <211> 1446 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> DNA codificador do "precursor" de rHuPH20 solúvel <400> 49 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 · cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt.atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt eaagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctac 1446
<210> 50 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> PH20 variante P48A <400> 50
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His lie Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin lie val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val lie Pro Asn Val Ala 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe lie Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr lie Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr lie Asp Ser lie Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly lie Pro Gin Lys lie Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp lie Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser lie Glu Leu Val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr lie Lys Leu Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Val Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 2S5
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Val 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala lie Arg Val 275 280 285
Ser Lys lie Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 29S 300
Arg lie Val Phe Thr Asp Gin Val Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly lie 325 330 335
Val He Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr He lie Asn 355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Val Leu Cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Val Cys lie Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala lie Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys He Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin He 465 470 475 480
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe lie Val
485 490 49S
Ser He Leu Phe Leu lie lie Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505
<210> 51 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> precursor PH20 variante L499W <400> 51
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His He Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 15 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gin He Val Phe Thr Phe Leu Leu lie Pro Cys 20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val He Pro Asn Val Pro 35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser phe He Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 lie Asn Ala Thr Gly Gin Gly Val Thr He Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr He Asp Ser He Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110
Gly He Pro Gin Lys He Ser Leu Gin Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125
Lys Asp He Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 lie Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser He Glu Leu val Gin Gin Gin Asn 165 170 175
Val Gin Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gin Glu Phe 180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr He Lys Leu Gly Lys 195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240
Vai Glu lie Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser lie Tyr Leu Asn Thr Gin Gin Ser Pro Vai 260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Vai Arg Asn Arg Vai Arg Glu Ala Ile Arg Vai 275 280 285
Ser Lys He Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Vai Phe Ala Tyr Thr 290 295 300
Arg lie Vai Phe Thr Asp Gin Vai Leu Lys Phe Leu Ser Gin Asp Glu 305 310 315 320
Leu Vai Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Vai Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335
Vai Ile Trp Gly Thr Leu Ser lie Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr lie Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365
Vai Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gin Vai Leu cys Gin Glu Gin 370 375 380
Gly Vai Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gin Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415
Vai Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gin Phe Ser Glu Lys 420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445
Vai Lys Asp Thr Asp Ala Vai Asp Vai Cys Ile Ala Asp Gly Vai Cys 450 455 460 lie Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gin Ile 465 470 475 480
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Vai 485 490 495
Ser lie Trp Phe Leu Ile Ile Ser Ser Vai Ala Ser Leu 500 505
<210> 52 <211> 6630 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> vector HZ24 <400> 52 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca 1080 catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc 1200 tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga'attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 agatatgage ctcttctctt tcataggaag cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt 1320 tacaatattt tatgttgata gacttggcta ctatccttac atagattcaa tcacaggagt 1380 aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa 1440 gaaagacatt acattttata tgccagtaga caatttggga atggctgtta ttgactggga 1S00 agaatggaga cccacttggg caagaaactg gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc 1560 tatCgaattg gttcagcaac aaaatgtaca acttagtctc acagaggcca ctgagaaagc 1620 aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga tttcctggta gagactataa aattgggaaa 1680 attacttcgg ccaaatcact tgtggggtta ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca 1740 ctataagaaa cccggttaca atggaagttg cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc tctttaccca tccatttatt tgaacactca 1860 gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca agtgctttgc caggagcaag gagtgtgtat 2220 aaggaaaaac tggaattcaa gtgactatct tcacctcâac ccagataatt ttgccattca 2280 acttgagaaa ggtggaaagt tcacagtacg tggaaaaccg acacttgaag acctggagca 2340 attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tagcaccttg agttgtaagg agaaagccga 2400 tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt 2460 tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc tcaaattttc tactgaggat ccatagctaa 2520 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 2580 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 2640 cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 2700. ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2760 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 282-0' ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 2880' cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 2940 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3000 tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3060 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acagcggccg 3120 ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3180 gcaagaacgg agacctaccc Cggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa 3240 tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta 3360 gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagttCg gatgatgcct 3420 taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag 3480 gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata 3600 aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 ataagtttga agtctacgag aagaaagact aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg 3720 gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatgcagtga aaaaaacgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 3960 cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgaccgcc cttcccaaca 4020 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctCtc cccgtcaagc tctaaatcgg 4200 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4380 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4440 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 4500 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4560 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4740 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4800 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4860 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 atcgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4980 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagca aaagatgctg 5040 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5100 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5160 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact S220 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5280 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5340 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5400 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5460 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5520 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5580 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag S640 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5700 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5760 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5820 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5880 tctttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 6120 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 tggactcaag acgatagtta ccggacaagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6360 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6420 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6480 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6540 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6600 ggccttttgc tcacatggct cgacagatct 6630
<210> 53 <211> 186 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> diidrofolato reductase <400> 53
Val Arg Pro Leu Asn Cys lie Val Ala Val Ser Gin Asn Met Gly lie 1 5 10 15
Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe Lys 20 25 30
Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gin Asn 35 40 45
Leu Val lie Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser lie Pro Glu Lys Asn 50 55 60
Arg Pro Leu Lys Asp Arg lie Asn lie Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys 65 70 75 80
Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala
85 90 9S
Leu Arg Leu lie Glu Gin Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Met Val 100 105 110
Trp lie Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gin Glu Ala Met Asn Gin Pro 115 120 125
Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg lie Met Gin Glu Phe Glu Ser 130 135 140
Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro 145 150 155 160
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gin Glu Glu Lys Gly lie Lys 165 170 175
Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185
<210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cauda de His <400> 54
His His KÍS His His His 1 5
<210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Etiqueta Flag <400> 55
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 56 <211> 1449
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sequência do mRNA de Gen2 <400> 56 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag tcaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacctgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctactga 1449
Lisboa, 8 de junho de 2016

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES
1. Uma composição estável formulada para administração subcutânea, em que: a composição estável é uma co-formulação líquida; a composição possui um pH entre 4 e 5, inclusive; e a composição compreende: imunoglobulina (IG) numa concentração que é pelo menos 10% p/v; uma hialuronidase solúvel numa concentração que é pelo menos 50 U/ml e está presente numa quantidade suficiente para permitir a administração subcutânea da composição num único local da injecção, a uma velocidade de infusão igual ou superior à velocidade de infusão intravenosa da imunoglobulina intravenosa; e um sal cloreto de metal alcalino numa concentração de pelo menos 0,05M, sendo a co-formulação estável a temperaturas até 32°C, durante pelo menos 6 meses.
2. Uma composição estável formulada para administração subcutânea, em que: a composição estável é uma co-formulação líquida; a composição possui um pH entre 4 e 5, inclusive; e a composição compreende: imunoglobulina (IG) numa concentração que é pelo menos 10% p/v; uma hialuronidase solúvel numa concentração que é pelo menos 50U/ml e está presente numa proporção de pelo menos 100 Unidades/grama (U/g) de IG; e um sal cloreto de metal alcalino numa concentração de pelo menos 0,05M, sendo a co-formulação estável a temperaturas até 32°C, durante pelo menos 6 meses.
3. A co-formulação liquida estável da reivindicação 1 ou reivindicação 2, compreendendo ainda um aminoácido estabilizador numa quantidade que é pelo menos 0,1M, sendo de preferência o aminoácido estabilizador seleccionado de entre alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina e prolina, mais de preferência, em que o aminoácido estabilizador é glicina ou prolina.
4. A co-formulação liquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o aminoácido estabilizador é pelo menos 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M ou 0,75 M, de preferência em que o aminoácido estabilizador é 0,25 M.
5. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a IG é pelo menos 10% p/v, 11% p/v, 12% p/v, 13 % p/v, 14 % p/v, 15 % p/v, 16 % p/v, 17 % p/v, 18 % p/v, 19 %, p/v, 20 %, 21 % p/v, 22 % p/v ou mais, de preferência em que a IG está entre 10% p/v e 20% p/v.
6. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a IG é de plasma humano, de preferência em que a IG é purificada a partir de plasma humano através de um método de purificação compreendendo fraccionamento com álcool, mais de preferência em que a IG é ainda purificada através de um ou mais de entre uma precipitação com polietilenoglicol (PEG), cromatografia de permuta iónica, clivagem enzimática, diafiltração ou ultrafiltração.
7. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que a IG é sujeita a um passo de redução de vírus seleccionado entre incubação a pH 4,0 com ou sem pepsina, tratamento com solvente/detergente e nanofiltração.
8. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-7, em que a IG contém IgG, IgA e IgM, de preferência em que a IG contém mais de 95% IgG.
9. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-8, em que o sal cloreto de metal alcalino é seleccionado de entre KC1 e NaCl, de preferência em que o sal cloreto de metal alcalino é NaCl e o NaCl é 0, 025 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M ou 0,25 M, mais de preferência em que o NaCl é 0,15 M.
10. A co-formulação liquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-9, em que a hialuronidase solúvel é uma PH20 ou uma sua forma truncada, de preferência em que a PH20 é seleccionada de entre PH20 ovina, bovina ou humana truncada, mais de preferência, em que PH20 é uma PH20 humana truncada e a PH20 human truncada é seleccionada de entre polipéptidos tendo uma sequência de aminoácidos descrita em qualquer uma de SEQ ID NOS :4-9, ou variantes alélicas ou outras variantes da mesma.
11. A co-formulação liquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-10, em que a hialuronidase solúvel é designada rHuPH20.
12. A co-formulação liquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-11, em que a hialuronidase solúvel está numa concentração de 50 U/ml, 100 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ml ou mais, de preferência em que a hialuronidase solúvel está numa concentração de 75 U/ml a 350 U/ml.
13. A co-formulação liquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-12, em que a hialuronidase solúvel está numa proporção de 100 U/g IG, 150 U/g IG, 200 U/g IG, 250 U/g IG, 300 U/g IG, 400 U/g IG, 500 U/g IG, 600 U/g IG, 700 U/g IG, 800 U/g IG, 900 U/g IG, 1000 U/g IG, 1200 U/g IG, 1500 U/g IG, 1800 U/g IG, 2000 U/g IG, 3000 U/g IG, 4000 U/g IG ou 5000 U/g IG, de preferência em que a hialuronidase solúvel está numa proporção de 250 U/g IG, 500 U/g IG, 1000 U/g IG, 1500 U/g IG ou 3000 U/g IG.
14. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-13, em que um pH de 4,4 a 4,9 na forma concentrada.
15. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-14, em que a co-formulação é para administração de múltiplas doses ou para administração de uma única dose.
16. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que a IG está numa quantidade suficiente para administração de uma única dose para tratar uma doença ou condição tratável com IG, de preferência em que a quantidade de IG é uma quantidade suficiente para administração de uma única dose diária, semanal, bissemanal, cada 2-3 semanas, cada 3-4 semanas ou mensalmente para tratamento de uma doença ou condição tratável com IG.
17. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-16, em que a quantidade de IG na co-formulação é substancialmente a mesma quantidade de uma única administração quando administrada intravenosamente para tratamento de uma doença ou condição ratável com IG.
18. A co-formulação liquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-17, em que a co-formulação é para administração de uma única dose e a quantidade de IG é pelo menos 1 grama (g), 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g ou 200 g ou é 1-200 g, 1-100 g, 10-100 g, 5-50 g, 6-50 g ou 5-100 g.
19. A co-formulação liquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-18, em que a co-formulação é para administração de uma única dose e a quantidade de hialuro-nidase na composição é pelo menos 500 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 5000 Unidades, 10000 Unidades, 30000 Unidades, 40000 Unidades, 50000 Unidades, 60000 Unidades, 70000 Unidades, 80000 Unidades, 90000 Unidades, 100000 Unidades ou mais.
20. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-19 que é estável entre 28°C e 32°C durante 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou mais.
21. A co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-20 que ainda é estável entre 0°C e 10°C durante 6 meses, 1 ano, 2 anos ou mais.
22. Um kit, compreendendo a co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-21, e facultativamente, instruções para utlização.
23. Um contentor, compreendendo a co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-21, de preferência em que o contentor é um tubo, frasco, ampola ou seringa.
24. 0 contentor da reivindicação 23, compreendendo ainda uma agulha para injecção.
25. 0 contentor da reivindicação 23 ou 24, em que a co-formulação líquida estável é proporcionada para administração de uma única dose ou para administração de múltiplas doses.
26. Um kit, compreendendo o contentor de qualquer uma das reivindicações 23-25 e um meio para a infusão da composição.
27. Utilização de uma co-formulação líquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-21 para a formulação de um medicamento para tratamento de uma doença ou condição tratável com IG, de preferência em que a doença ou condição tratável com IG é seleccionada entre doenças de imunodeficiência primária, doenças de imunodeficiência secundária, doenças inflamatórias, doenças auto-imunes e infecções agudas.
28. A co-formulação liquida estável de qualquer uma das reivindicações 1-21 para usar no tratamento de uma doença ou condição tratável com IG, de preferência em que a doença ou condição tratável com IG é seleccionada entre doenças de imunodeficiência primária, doenças de imunode-ficiência secundária, doenças inflamatórias, doenças auto-imunes e infecções agudas. Lisboa, 8 de junho de 2016 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição - ϋ-s A * US579SA * wosoasiiiOssA < ubsooa - USS1S0810A * * US01SS37SA * US 530041)1 A - US 5177134 A - as S3'©455 A * ys esrssis b * us $s$s?63 a * UÓ; 4003006 A - US4?é$3?£'A * USãSÍA * US 4126308 A - Uâ 6113900 A v LS SSOSSOO A * US82un>5íí&amp; < * us 521¾¾ i u * 6 F 03465? 9.* * US !xWí'43 B * US 39864¾¾ A * US 6413487 8 - EP ©1300730 Λ » USS430338B - VTOÍKSSSMA ♦ US 6433856 8: - £P«4AÔ483A ’ USE44&amp;S88B v US 6n$lSO§ A * US84fi)«KB * U«.44SS€(73A * ii&amp; 8828401 8 - 4P 54028)248 * aS 3356736 B * JP 57031023 8 * US 20O1ÍKS21783 A * 4P5?1288358 » US 2801004453« A * JP 4348)34 8 * yS208l«04866l A - US 4433421 A » US 2W2Í&amp;S2430 A * us bsusoos a * yssosmwsA - US 4166182 A * US 2002916084? A - «P0200SS48078A * US 2808811484? A * US43S2SS1A - yB20W*SS98A * 004890898* - US 28030150833 A * 8P 0378422 A ♦ US 20838220447 A * US 5871716 A - US 288831383? A * us20060280ima * ussotsoc&amp;soÈ-A » US 2068010488$ .4 * US 2005811403? A * usossmÀ * us i3Ss a * US 51338171B * US 20058209418 A * US 5672862 A * EP 01064883 A * US 0737008 8 * SP 0822199 A * US 20040235734 A - iVG 00170640 A * US 6922462 A * W 800201? A * US 646S6S9 § « W) 0348673 A - US 4902531 A ♦ WO 9428024 A * US 417932? A » AAH)1S?32SA > US -5122614 A * US 4SS24SS A * US 51S3SS6 A * US 4507866 A * US 5324 A » US 7309010 B * US $44 A * US 5331907 A * US 5446060 A « USS03S252S * US 5812460 4 * US 505255$ A * US 6543575 A * US 6395800 8 * US $?S8$S1 A * US 5409990 A * CNW» * ON 11235131 * CNJHXiKVm ; * HS» Bt2??3A5 n Literatura que não é de patentes citada na Descrição * SOROíER SÍ âi. J 8SBs. CíWít, 108- «S. 3S&amp; * SCM^Feí ai ./. C». &amp;Vtturaá tOAS, TH 8,2SS45«S - 3 RtSií Cíiéti'! 1*53 \fíí :?43, SSS7-3SS8V: - 35iFÇRSAXO *4 4. PjWfH ΪΪΑ4., 10S£J «Aí ?. Í87-S * OâTSÊStt «1 si 1984. VOt 34 i65l * SARWiF^t 4.3. Aí*-. Alms 1995. iM 21.9*7-3? * : WAT&amp;Q**«t A.tttslecsjÍta*;ât9it^«is »» Same The Pstk«198?. 234 * OARQt&amp;F «4 sí- Clfc. I?**», kmwmt. 15¾ vwí, S8. *· ΰο^ρίί^&amp;ι««8^^4ί4«^^«Β' :8ί»ΐι.^': Ôxfos¥liMV«ís8y Í.-&amp;0ÍS4 B*ss,4S$«i * 8A«DÍÍtF«taUsrwei. »88J wS 938.18M * Síf-USAft-íJRéliiíf: ί^ίίίΐΐι&amp;ϊΙί.Ά. safaj. Gamma FftsjaíâSi. Âc- iSrtsmte Pt&amp;ss, 1893 * · ·ββ%0^ι#ηβ»»8!ί< AÊwgy &amp;a<m Am, * Cemgtitot Anafoste «f ,SSQUe9fc* D-SlS, :^, .38 ^3.¾ ^1:3t43S: Fssss. 1994 :·♦ MÂSt,01^ í LÁNS:< A«:9!^íbSí ôisfeS: Sjk&amp;^j Btotogy, ftssasísrfÍKS FkísS, 1987 -* J^SíiQ1Ai;tA^>^s®í^ís9i:AtSíSis^9iíy:íiS8ífi*ó:· * 19S1 Õ4<í ^η»$Η»{η* tetrad tSÓÍi * CARÍUJ&amp; H.; URTOM. D. SiA&amp;í J Appitesi Mata. « OOHSiaHt, J. Am. âtam.-SiMt. 194¾. «sl. 88.499-7¾ 1»; «&amp; 4®. ·1«Ϊ3·: * BÍ!9X>!i^íaí)'Xt: Μ«τι;Α«δ j»4s3AAT;ypAj««ts As> » ONCLEYftt ®i. J Am. Cte»! Sm;.. 1943, voi. ??. íKísfFsfeRpsass, 1993 943-59: * CSíAfAiSAi' 4 Se^uAnca? 09)3. Rail 1 Hi)- * SARANDERNst aí. i-t-xSang., 1952. Ai ?, 157-74 ?4351§ ί%«35. 1994 * CÂRiitOs-t 4l SiA&amp;f J.4¾¾)¾ Aíaíà *998 vçí 48. * ΚΟβΙ£Τ 9t iri, Wox 1967, vol. 13. 3$-1*3? i<>?5 ........ * PÊARSON í?( aí. Οχ-; ítósi £;;aa 3ts. L<SA. {983, * ΡΟίΛΟΗ ¢1 aí. fttogfeâ» 9¾^.¾¾¾ 4*ía.. 1954, Ví*. <\« 85 2444 33, 433-473 » P£VCS4EUX, J,8ía),.yifO?e;;í.4i.1i^f?44íW4.>kí 1S¥<4. * FROST tS 95. Auaí. {93>á3SS)i&amp;'f>', 1S37. A). 3$1. yc4 13 íiX 33? 383499 * ATSCHOL 3F eiaí 7AíU8=*j5SM 1^9 vOí 21S. * 0ÃN1LKO¥rrcW-®ÍAOKO¥A«S. 41, Am.; pVsif A.^i? «Ϊ3 teu&amp;A.stm «d )>Sèe-ã * C'f! í4 14 AS&amp;áí^i; Rfs.-í' ^854 * FROSTeí-Si B-ΐΐ it1'"By ',-35X9t'39í, X0i. 238)1). -:8- 9 * N£EQt£S98R lit ai, J Afci BM.. l9Tí>. ¥0i 48. 443 » FROST Oí, 3»^? 0(m. Gn®. G*e* 200? nc-í 4 •l:>r-44fi * SNrm; WATgRtfA*. ΑΦ. Affii Mft.'1381, » UktJiNCSTTS'eiaí. Ííííi95 (2). :'è4Sg &amp;g8»3?< - GR1SSK0V «í ») yr«f. Aswfe #?es, 19S&amp; voí )4. * Ã.t554í14Sí «5 ai, 3;ff 3 Ssocfasn. 133? wí S4? ¢745 610-SU - AYí.,4.3 O? Γ'?2'3?-3?EQU???í:Q5 ANO 55 HOC- * ROB-SsRTS-at aí. Ιλι?? ílaavAíy ?34¥‘9:i¥. Tl?R5 Rít&amp;xiíá SiSs^aá-ÔSi Ressâtefí FoufKisti&amp;fi. 3ÍK12. «51. 54,459-45¾ Mí?3 St5S'35íií ♦ Í\s*tí:1hyfeí4í ^χ>ί: OSi&amp;íís!ss>· arí-i Ajj- * ÈídJCAWí). 1373, VíS. 11, J7SS ί>:>'ΐ54?·ϊ3δ..Αί?!3 Slfísp-Oi.s.ifsi S&amp;ftes3SG, 193? - A<:?A!3!f AA1f;M) S^grornçs. 50)3 SssafíSO; Cí.iíimi*· > ?4E)-íVÂR «í aí, J Ptíarx. Pb&amp;rw&amp;MiL 3·ι\ 3395 !<)«, 1839 'ν' "''ν.ϊ ,'.''"'""v"’., 3¥ssí?:3Yiy^ls-iéfe " .'.L'.',',-' " v'' * OAROOtf «ísst, Oi.aT.Stm Ategsj'OSfi ÃiííiAi?^1, * ítARRtS. fe>A 2003 xot g,xi3 3¾¾. voi. 8.43442 - TSOEERT, .? S<>f Çíiam. £004, ¥0t, 3?$ pTi, > GARP05.F aí Sí J. Cítfí .çisfsítmí. 33-¾ voi 35. 315 ι?Ή 17T-8* * HARÍtíS, Λλ 0'-.? 2(WV. 30-33, u.< $4 - oc»«s et ,/ casa vmmtá. 20ôô. wt 28.2Κ&amp;-Γί 4^47¾ * VERONESE eS »í ίΧ-.-ίλ'ΐ? 4#«í £,«.;?, 3S<32, vai 12 157-1.¾¾ PE2477603 3 t CHAPMAN et at. Nature Stofec*,, 1999, vol. 1?. :.7803588 * SATO. fid*. Drug Debt. Rev.. 2002. vol. 54, *87-504 ? LU : FELIX, int J Pep&amp;sfe Pmier: Res.. 199*. wo|. 43. 127338 * LU ; FELÍX. Peptide Res, 1393. voS 8. Í32-6 * FELIXet*1. tef. J. Pephie Res.·..) 895. vd 46.253-64 ·♦ BENHAR at ai J. Biot. Ch»m.. 1994, vol. 268. 13398-404 * BRUME ANU el ai. J tmmunoi.. 1985. vol. 15*. mmm * CA LICET I at a!. Ads. Drug De*v Rev., 2003, vol. 55 ............ * MOUNEUX. Pharmacotherapy, 2003, vol. 23 (S> 3SÍ8S:; * MONFARDINI st at Bioooajugaie Ct»w, 1985. vol. 6. 62-69 » VERONESE etabJ 3«mcf-;a C.smpN>blf>F^yrres 1387. vol. -2.. 197-207 » CHAMBON. Nature -981 v&amp;S 2m. 304-310 Í YAMAMOTO st ai. Caff. 1960. vol. 22, 787-797 * WAGNER si ai. P>'cc Neil Acad Sc< USA. 1981, vd 73. 14*1-1445 * 8RINSTER «t ai. Nstitse. 1932. vol 298, 39-12 * JAY et aI, Pp.-ç. NzK Awsci. So. USA. 1981. yd 7S,lisl# * DEBOER st si Proc. Natl Mèd. So. USA. 1983, vd. SO, 21-25 * Useid Proteins írosvi Hatúr-ibinaol Baeísna Sc«f!- ;S0AwidtípAffi:· 24¾ 79/34 * HEBRARA-ESTREILAatai. mture. 1984, vd 303, -20S-213 * GAROBRetei.Nudek.AcidsPes.AS8t vof 9,2871 * HERRERA-ESTRELLA et et. Nature. 1984, vd 31-3,: :ÍfS§p * SWIFT st at, CeS, 1984. vd. 38. 839-6*6 * QRNSTZ st aí. Cd d Spring Harfcor Synip. Quant Βίο/.. 1§S8. vol £D. 330-408 * MACDONALD, itepafdooy 1907, vo' 7 425-515 * HANAHAN st ai. Nature. >965, vol. 315. 115-122 * GROSSCHEDL et »!. Cell. 1984, v©t 38. 647-658 * ADAMS et ai. Nature 1985. vd. 318, £33-533 * ALEXANDER st ai. Mol Ceií Sb!. 1987, voí 7 1438-1444 * LEDER et ai. Ceff. 1006, vd 45, 4-35-495 - PÍNCKERT st aí. Genes snd Devei. 1937, vol. 1, 258-276 * KRUMLAUF et ai. hid C,e« S;oi -955 vol 5 1-638-1848 * HAMMER et aí. Soerias. 1587. vol. 235. 53-58 - KELSEY et ai. Genas end Devei.. 1937. vol. 1. * KAGRAM et al. Na Urre, 1986. vol 315, 338-3*0 « KOLLSAS et aí. CeS. 1936. vol *6. 89-54 * README ADsíaf. CeS. 1087, vd 43,703-752 » SHANÍ ftíoíwrs. 1S8&amp;. vol. 314. 283-286 * MASON et ai. Sconce, 9386, wy 334 1372~Í378 * PH AM et ai. Biotechnot ftoeng . 2003, vol 84. 332-42 :-*. ANSEL. Introduction ίο PhariO&amp;cetttiCsi Dosage : FofiYíS'.: 1985. 126 * TALÍANÍ et ai Arei. Bxxàerrr.. 396, vol 240.60-67 FILOCAKO at ai J Virdegy. -907. vol. 71. lAIf/T-pf > SUDOetai. Anhwei Res . 1598. vd 32. δ 18 * BUFFARD et ai. Wabgy. 198S, vol. 2QS, 52-50 * BSANCH5 et ai. And Brochem. 1896, vd 237, :.239--244: ·* HAMATAKE et aí. intewroogy. 1958 vd 38, 249-258 * STEÍNKUHLER et aí. Sicdisn1938. vol 37, 8389-8905 * D'SOUZA ei aí / Get> V'»oL 1995, vol. 7:8; 1729-5 72-6 - TAKESHiTA et aí. Anal Blomei:;.. 1397 yd 2*7. .242-248 * SKÍMiZU et aí. J 1« Í994, w!. 68, 8406-8408 ‘ MÍZUTAMf ef af J. Virei.. >998. vd. 70, 7219-7223 * MÍ2UTANÍ et ai. Biecherri. Bicphys t?ss Convatir,.. 1996, vol. 227. $22-828 * LU et al. Proc. Nasi, Aesíi. Sd (USA), 1996. vol'. 93, ................................................. » Η AHM et ei. V,-;i-fcgy 1936. vol 226,3 í δ- 32E * JTO et aí. J Get,. VsroL 1396. vol 77. 1G43-Í054 * MIZUTANÍetai. Bioct^ni Bkphys Rss Cornnum 1SS5. λ-J 212.906-311 - CHO et al. J iAreff. Z-fef?; ÍSS7. vol. 6£. 201-207 * BENHAR et ai, J. Swí Cnem. 19S4, vol. 263, :1:333S-4:04í > CHENG et aí. Pham. Res... 2003, vol. 20 «9)5, ..1:444-61- * PeptKls ãr>d Protein Dreg Delivery. Marcel DekLsr, Inc, 1&amp;31, 247-301 r JONES, A. A-A- Bing Delivery Rev 13&amp;1 voi 10 29-90 * MARCUS. D. M. J. hnnwiol. 1980. vc-l. 84.273-284 * WANG et ísI, J- efPsr&amp;fíi&amp;raíSaiscce à Technokigy, * GOOEAU ei ai, Blood. 1*393, voi 62 (5). 1415-21. t», voi, 42, S4-326 * European Phamioccpoeia. 103? - GOOEAU eí at. Sr J. Haemaia#.. 1999. voi 107 (4). * Complement Fíxaison Test PALMER, D F. ;WHA- 7'6-S LEV, S. D. ei ai iVar-jcsí of Gli'aicai Laboratory Ítrí- * DALAKAS et ai. íf Engl J Kiee , 1903.vc<t 323{27). munc-ngy American Sociesy for Micnsbicik^y, 1988. 1393-2000 ST-68 DALAKAS et at Neurology. 2001. voi 58 {3), 322-7 * Q.-snttoítte C -ο.3ΐ!,;.ο Anaiysis, CoropSsrnerct and Complemerrt Fixation MAYER, Μ. M. Experimentai » DALAKAS. Pnannac-cJ. Tier. 2004, vd. 102 ÍÔ}. I i-firn oooceeniss Sr/. Thomas, 1961,214-213.227-223 177-:33 WALTER at at .7 Neutcl 2303. v<si 24? (1$, 22-8 * Feoa and Drugs, Αρη! 1978, voi 540,101a * FERNANDES; LUNS3BLAD. Vox Smug, 198C voi. > DALAKASet ai, N Ençt J Med ,200Lvd 345:26). 39,101-112 1:878-® * HiEMSTRA et aL J Lah Cfm Afe-f 1994, voi 123 .; DODE Lesai 1 Nsojo! N&amp;tansitrg.Psyctvm ? 2004. 241-8: voi 75, 1472-4 * TRE8ST at si. Eut J N^ib'olagy. 200&amp;. vd, 13 {12} ' SOLOMON et aí. Curt Ornr; Ato*. TJjet., 2G07, voi. 13Β9·^3 δ, 7δ·^5 ;.;t SHAPIRO ei a!, Γ-a,ten? 2002 voi 05 20'2-2237 · RELKÍN et a). Asíxofcw# Agmg, 2008 ' COHN et ai. J Am. Chem Soo, 0346, yof, 68. - CZfTROM ei aí. J immanai, 1S8S, vd. 134, 459-467 2276-2280 ♦ TESCHNER et aí. Vox Sang., 2007, vet. 92, 42-55 * ELLMESER et aí. J Esp fyfsà... 2000. voi. 192. 1811-1824 * HOROWSTZ et at. SI.W Caagul Féron, 1994, voi. * ORNO £Vaç Daeaiwy Today: Dmase Mooeja, S fâsí gí^SS®: 2000. vd 3. 83-89 ' * KREIL et ai. Ttsnsk^on. 2&amp;G3. voL 43,1023-1038 - OYAIZUetaí. JExptÂed, 1S8&amp;. 2017*2022 * HANáEN et ai. Stood. 2W2, vd. -00, 2087-2093 » HAMAMOTOef ai. Vt» Sang, :9SS,voL 56.23S-23S * STRCNCWATER et »1. Rhaurp,, 1084, voi. * YUASA ei aí. J. Ge». Viroi.., 5991, voi. 72,2021-2024 27,433-42 * K!M ei ei. 4»r;a;s NY Acad Sçf, 1968, voi. 841, ·.* -KEMPFsataL Tmftshi&amp;iim,19S1, vot.31·, 423-427 6:70-878 * CHRISTADOe$ et al. Cfes. fcaMieiiXi., 209D. voi. 94, ·.? LOUSiEef ai. Síiafegjfiaíe, 1094; vd. 22; T3-1S 75-87 - PÔLSLER et ai. Vox Sang, £808. voi. 94. 184-192 * SOMMER et at. Lancei, 2305, veí. 305,1406-1411 * TESCHNER ei at- Vox 5¾¾. 2807, voi. 82, 4S-5S * FROST ; STEM. Ansi, Siocfosn?:- 1387, voi. 251. 263-269 * POLSLER et at. Vox Sang- 2808. voi. 84, 184-132 * : OELPEGH et ,ai. Anal· Bine-ham., 4385, ...vet: 229, 35-4-1 x: * TAKAMASHÍ et al: Ansi. &amp;ocham 2083, voi. 322, PÈasmaPraSsiR FfacáoRStisríL Aeadaí-íifrPrass,: 1980 257-28:1 * GRiFFTTHS ef at. Siooh, 1983. voi 73, 368-383 * COHM et ai. J Am. CEens. Soti... 1948, voi. 68, 459-467 - * CHAPEL et al. Lancet, Í9S4, voi. 343, 1QS8-1D83 · KOLARiCH et si. Tmnsftision. 2806, voi 48, 1959-1077 * VAN SCHAtK et aí. Lancet Afeaid., 2002, voi. 1, · KUMAR ei at. Bkschem. Mai. Bias, tni, 1998, voi. 4, 497.498 59-51?
PT107601403T 2009-09-17 2010-09-16 Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos para a sua utilização PT2477603E (pt)

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PT107601403T PT2477603E (pt) 2009-09-17 2010-09-16 Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos para a sua utilização

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US (1) US9084743B2 (pt)
EP (1) EP2477603B1 (pt)
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PT (1) PT2477603E (pt)
WO (1) WO2011034604A2 (pt)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0408116B1 (pt) 2003-03-05 2022-09-20 Halozyme, Inc Polipeptídeos de hialuronidase solúveis conjugados a polímero, composições farmacêuticas compreendendo polipeptídeos ph20 solúveis, seus usos e processo de preparação, e ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de hialuronidase solúveis
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
EP3960854A1 (en) 2008-03-06 2022-03-02 Halozyme, Inc. Large-scale production of soluble hyaluronidase
TWI489994B (zh) * 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
NZ588638A (en) 2008-04-14 2012-09-28 Halozyme Inc Screening method for identifying a subject for treatment with a modified hyaluronidase polypeptides
CA2736141C (en) * 2008-09-23 2018-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Purification of erythropoietin
DK2477603T3 (en) 2009-09-17 2016-06-13 Baxalta Inc STABLE CO-DEVELOPMENT OF hyaluronidase and Immunoglobulin, AND METHODS OF USE THEREOF
CA2788863C (en) 2010-02-04 2020-07-07 Reinhard Franz Bolli Immunoglobulin preparation
US10420923B1 (en) 2010-08-10 2019-09-24 Amiram Katz Method and device for intrathecal administering of immunoglobulin
MX340172B (es) 2011-06-17 2016-06-28 Halozyme Inc Formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano.
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
MX342735B (es) 2011-10-24 2016-10-07 Halozyme Inc Diagnostico acompañante para terapia con agente anti-hialuronano y metodos de uso del mismo.
US11707408B2 (en) 2011-10-25 2023-07-25 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9447401B2 (en) 2011-12-30 2016-09-20 Halozyme, Inc. PH20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
IL300460A (en) * 2012-07-24 2023-04-01 Nissan Chemical Corp A culture medium preparation, and a method for culturing cells or tissues by using the preparation
US9664671B2 (en) 2012-07-24 2017-05-30 Nissan Chemical Industries, Ltd. Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof
US10017805B2 (en) 2012-08-23 2018-07-10 Nissan Chemical Industries, Ltd. Enhancing ingredients for protein production from various cells
BE1021755B1 (fr) * 2012-09-26 2016-01-15 Bone Therapeutics S.A. Formulations comporenant du plasma traite par solvant/detergent (plasma s/d) et utilisations de celles-ci
KR101454646B1 (ko) * 2012-11-05 2014-10-27 (주)한국비엠아이 히알루로니다아제의 안정화 제제 및 이를 포함하는 액상제제
US9707154B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9707155B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9707153B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9700486B2 (en) * 2013-04-24 2017-07-11 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9717649B2 (en) 2013-04-24 2017-08-01 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9713572B2 (en) 2013-04-24 2017-07-25 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9717648B2 (en) 2013-04-24 2017-08-01 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9700485B2 (en) 2013-04-24 2017-07-11 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9839579B2 (en) 2013-04-24 2017-12-12 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9849066B2 (en) 2013-04-24 2017-12-26 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
LT2994160T (lt) 2013-05-06 2019-08-26 Baxalta Incorporated Alzheimerio ligos pogrupių gydymas su iš kelių donorų sumaišytu imunoglobulinu g
KR102435648B1 (ko) 2013-09-11 2022-08-25 이글 바이오로직스 인코퍼레이티드 점도저하제를 함유하는 액체 단백질 제형
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US11357857B2 (en) 2014-06-20 2022-06-14 Comera Life Sciences, Inc. Excipient compounds for protein processing
US10478498B2 (en) 2014-06-20 2019-11-19 Reform Biologics, Llc Excipient compounds for biopolymer formulations
WO2015196091A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Reform Biologics, Llc Viscosity-reducing excipient compounds for protein formulations
JP6629325B2 (ja) * 2014-08-22 2020-01-15 ネクタジェン，インコーポレーテッド 親和性タンパク質及びその使用
CN108064182B (zh) 2014-09-09 2021-09-03 詹森生物科技公司 采用抗cd38抗体的联合疗法
US11471479B2 (en) 2014-10-01 2022-10-18 Eagle Biologics, Inc. Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
AU2015358615B2 (en) 2014-12-04 2021-08-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
CA2986594A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Tufts Medical Center, Inc. Anti-cd38 antibodies for treatment of light chain amyloidosis and other cd38-positive hematological malignancies
EA036789B1 (ru) 2015-06-22 2020-12-22 Янссен Байотек, Инк. Комбинированная терапия гемобластозов антителами к cd38 и ингибиторами сурвивина
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
TWI724048B (zh) 2015-11-03 2021-04-11 美商健生生物科技公司 抗ｃｄ３８抗體之皮下調配物及其用途
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
AU2017257191B2 (en) * 2016-04-29 2023-08-10 Inovio Pharmaceuticals, Inc. The in vivo use of chondroitinase and/or hyaluronidase to enhance delivery of an agent
WO2018002181A1 (en) * 2016-06-28 2018-01-04 Umc Utrecht Holding B.V. TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASES WITH ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND CD38
CN110831627A (zh) * 2017-04-21 2020-02-21 瑞士杰特贝林生物制品有限公司 用于治疗慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病的免疫球蛋白产品
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma
SG11202007241WA (en) * 2018-01-31 2020-08-28 Wistar Inst Nucleic acid antibody constructs for use against respiratory syncytial virus
KR20210023798A (ko) * 2018-07-25 2021-03-04 (주)알테오젠 신규 히알루론산 가수분해 효소 변이체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
EP3905999A4 (en) * 2018-12-31 2022-09-28 Rani Therapeutics, LLC THERAPEUTIC PREPARATIONS FOR DELIVERY INTO A LUMEN OF THE INTESTINAL TRACT VIA INGESTIONABLE DELIVERY DEVICE
CN110728044B (zh) * 2019-09-30 2022-08-02 哈尔滨工程大学 一种针对于活塞环槽内气体压力状态的集成计算方法
KR102265730B1 (ko) * 2020-11-06 2021-06-17 주식회사 본에스티스 피부 주름 개선 및 미백용 화장료 조성물
TW202320849A (zh) * 2021-08-02 2023-06-01 比利時商阿根思公司 皮下用單位劑型
WO2023042096A1 (en) * 2021-09-14 2023-03-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Facilitated delivery of concentrated antibody formulations using hyaluronidase
WO2023075506A1 (ko) * 2021-10-29 2023-05-04 (주)알테오젠 인간 히알루로니다제 ph20과 약물을 포함하는 약학 조성물
WO2023170680A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Equashield Medical Ltd Fluid transfer station in a robotic pharmaceutical preparation system
CN115957332B (zh) * 2022-11-01 2023-10-10 北京华睿鼎信科技有限公司 透明质酸酶稳定的布瑞诺龙纳米晶及其制备方法与应用
KR102554775B1 (ko) * 2023-02-07 2023-07-12 한국코러스 주식회사 히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 히알루로니다제 제형

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3966906A (en) 1961-10-11 1976-06-29 Behringwerke Aktiengesellschaft Disaggregated gamma globulin and process for preparing it
US3869436A (en) 1971-06-01 1975-03-04 Statens Bakteriologiska Lab Method for fractionating plasma proteins using peg and ion-exchangers
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5420124B2 (pt) 1974-01-16 1979-07-20
CA1064396A (en) 1975-02-18 1979-10-16 Myer L. Coval Fractional precipitation of gamma globulin with polyethylene glycol
JPS5731623B2 (pt) 1975-02-19 1982-07-06
US4126605A (en) 1975-12-29 1978-11-21 Plasmesco Ag Process of improving the compatibility of gamma globulins
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4165370A (en) 1976-05-21 1979-08-21 Coval M L Injectable gamma globulin
US4124576A (en) 1976-12-03 1978-11-07 Coval M L Method of producing intravenously injectable gamma globulin
JPS5420124A (en) 1977-07-14 1979-02-15 Green Cross Corp:The Preparation of gamma-globulin intravenous injection
US4186192A (en) 1978-12-18 1980-01-29 Cutter Laboratories, Inc. Stabilized immune serum globulin
US4362661A (en) 1979-08-09 1982-12-07 Teijin Limited Immunoglobulin composition having a high monomer content, and process for production thereof
JPS5731623A (en) 1980-07-30 1982-02-20 Morishita Seiyaku Kk Production of gamma-globulin for intravenous injection
US4374763A (en) 1979-09-17 1983-02-22 Morishita Pharmaceutical Co., Ltd. Method for producing gamma-globulin for use in intravenous administration and method for producing a pharmaceutical preparation thereof
JPS57128635A (en) 1981-01-30 1982-08-10 Morishita Seiyaku Kk Pharmaceutical preparation of gamma-globulin for venoclysis
US4396608A (en) 1981-08-24 1983-08-02 Cutter Laboratories Intravenously injectable immune serum globulin
US4499073A (en) 1981-08-24 1985-02-12 Cutter Laboratories, Inc. Intravenously injectable immune serum globulin
US4439421A (en) 1982-08-30 1984-03-27 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Stabilized gamma globulin concentrate
DK166763B1 (da) 1983-03-16 1993-07-12 Immuno Ag Immunoglobulin-g-holdig fraktion
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
JPH0669961B2 (ja) 1984-09-25 1994-09-07 株式会社ミドリ十字 免疫グロブリンの加熱処理方法
US4597966A (en) 1985-01-09 1986-07-01 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Histidine stabilized immunoglobulin and method of preparation
JPH0662436B2 (ja) 1986-05-19 1994-08-17 株式会社ミドリ十字 静注用免疫グロブリン製剤の製造方法
JP2547556B2 (ja) 1987-02-06 1996-10-23 株式会社 ミドリ十字 ｒ−グロブリンの液状製剤
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
JP2871709B2 (ja) 1988-11-21 1999-03-17 住友製薬株式会社 免疫グロブリンｇ結合活性を有する新規な蛋白質プロテインｈ、該蛋白質をコードする遺伝子及び該蛋白質の製造法
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE3921528A1 (de) 1989-06-30 1991-01-10 Draegerwerk Ag Messzelle fuer den elektrochemischen gasnachweis
US5945098A (en) 1990-02-01 1999-08-31 Baxter International Inc. Stable intravenously-administrable immune globulin preparation
US5177194A (en) 1990-02-01 1993-01-05 Baxter International, Inc. Process for purifying immune serum globulins
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5721348A (en) 1990-12-14 1998-02-24 University Of Connecticut DNA encoding PH-20 proteins
AT402261B (de) 1991-01-25 1997-03-25 Immuno Ag Komplex enthaltend den gerinnungsfaktor ix
JPH04346934A (ja) 1991-05-24 1992-12-02 Green Cross Corp:The γ−グロブリンの液状製剤
CH684164A5 (de) 1992-01-10 1994-07-29 Rotkreuzstiftung Zentrallab Intravenös anwendbare Immunglobulinlösung.
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
FR2706466B1 (fr) 1993-06-14 1995-08-25 Aetsrn Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré.
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
DE4344824C1 (de) 1993-12-28 1995-08-31 Immuno Ag Hochkonzentriertes Immunglobulin-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
US5795569A (en) 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
CZ288926B6 (cs) 1994-03-31 2001-09-12 Amgen Inc. MGDF derivát, způsob jeho výroby a farmaceutický prostředek s jeho obsahem
GB9418092D0 (en) 1994-09-08 1994-10-26 Red Cross Found Cent Lab Blood Organic compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5747027A (en) 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6828431B1 (en) 1999-04-09 2004-12-07 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US5958750A (en) 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase
US5665069A (en) 1996-07-19 1997-09-09 Cumer; Patricia Lynn Pressure-directed peribulbar anesthesia delivery device
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6193963B1 (en) 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6123938A (en) 1996-10-17 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Human urinary hyaluronidase
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
JP4270590B2 (ja) 1997-03-19 2009-06-03 田辺三菱製薬株式会社 免疫グロブリン製剤
GB9705810D0 (en) * 1997-03-20 1997-05-07 Common Services Agency Intravenous immune globulin
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
AT405739B (de) 1997-09-19 1999-11-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von antithrombin iii
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
AU2903899A (en) 1998-03-12 1999-09-27 Shearwater Polymers Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
WO2000002017A2 (en) 1998-07-03 2000-01-13 Neles Field Controls Oy Method and arrangement for measuring fluid
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
ATE317868T1 (de) 1999-12-22 2006-03-15 Nektar Therapeutics Al Corp Sterisch gehinderte derivate von wasserlöslichen polymeren
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US20030212021A1 (en) * 2001-01-25 2003-11-13 Frost Gregory I. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
AU7485301A (en) 2000-05-16 2001-11-26 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
DE60144439D1 (de) 2000-12-20 2011-05-26 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
ES2184594B1 (es) 2001-01-17 2004-01-01 Probitas Pharma Sa Procedimiento para la produccion de gammaglobulina g humana inactivada de virus.
US6571605B2 (en) 2001-01-19 2003-06-03 Larry Keith Johnson Constant-head soil permeameter for determining the hydraulic conductivity of earthen materials
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
AU2002352524B2 (en) 2001-11-07 2007-10-04 Nektar Therapeutics Branched polymers and their conjugates
AU2002351197A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Neose Technologies, Inc. Glycopeptide remodeling using amidases
US7192468B2 (en) 2002-04-15 2007-03-20 Fluor Technologies Corporation Configurations and method for improved gas removal
JP2004147535A (ja) 2002-10-29 2004-05-27 Japan Science & Technology Agency ギラン・バレー症候群及び／又はフィッシャー症候群発症モデル非ヒト動物
KR20040040782A (ko) 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
AR042485A1 (es) 2002-12-16 2005-06-22 Genentech Inc Anticuerpo humanizado que se une al cd20 humano
US7544499B2 (en) 2002-12-16 2009-06-09 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (CHASEGP), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
JP2004238392A (ja) 2003-01-14 2004-08-26 Nipro Corp 安定化された蛋白質性製剤
DK3417875T3 (da) * 2003-02-10 2020-08-31 Biogen Ma Inc Immunglobulinformulering og fremgangsmåde til fremstilling deraf
DK1596887T3 (da) 2003-02-26 2022-06-20 Nektar Therapeutics Polymer-Faktor VIII-konjugat
BRPI0408116B1 (pt) * 2003-03-05 2022-09-20 Halozyme, Inc Polipeptídeos de hialuronidase solúveis conjugados a polímero, composições farmacêuticas compreendendo polipeptídeos ph20 solúveis, seus usos e processo de preparação, e ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de hialuronidase solúveis
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
JP4346934B2 (ja) 2003-03-25 2009-10-21 日本碍子株式会社 セラミックス構造体の製造方法
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
DK2644206T3 (da) 2003-05-23 2019-06-11 Nektar Therapeutics PEG-derivater indeholdende to PEG-kæder
EP1532983A1 (en) 2003-11-18 2005-05-25 ZLB Bioplasma AG Immunoglobulin preparations having increased stability
US7572613B2 (en) * 2004-06-25 2009-08-11 Klein Jeffrey A Drug delivery system for accelerated subcutaneous absorption
HUE052220T2 (hu) * 2006-09-08 2021-04-28 Abbvie Bahamas Ltd Interleukin-13 kötõfehérjék
US8288142B2 (en) * 2007-06-19 2012-10-16 Uvarkina Tamara P Hyaluronidase and method of use thereof
EP3960854A1 (en) * 2008-03-06 2022-03-02 Halozyme, Inc. Large-scale production of soluble hyaluronidase
TWI489994B (zh) 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
NZ588638A (en) 2008-04-14 2012-09-28 Halozyme Inc Screening method for identifying a subject for treatment with a modified hyaluronidase polypeptides
US20090311237A1 (en) 2008-04-14 2009-12-17 Frost Gregory I Combination therapy using a soluble hyaluronidase and a bisphosphonate
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
MX2011006110A (es) 2008-12-09 2011-06-24 Halozyme Inc Polipeptidos ph20 solubles extendidos y usos de los mismos.
EP3708581A3 (en) * 2009-05-27 2021-10-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce a highly concentrated immunoglobulin preparation for subcutaneous use
DK2477603T3 (en) 2009-09-17 2016-06-13 Baxalta Inc STABLE CO-DEVELOPMENT OF hyaluronidase and Immunoglobulin, AND METHODS OF USE THEREOF
AU2010202125B1 (en) * 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
US8796430B2 (en) * 2010-05-26 2014-08-05 Baxter International Inc. Method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
ES2661089T3 (es) * 2010-07-20 2018-03-27 Halozyme Inc. Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano
PT2616090T (pt) * 2010-09-17 2023-10-16 Takeda Pharmaceuticals Co Estabilização de imunoglobulinas através de formulação aquosa com histidina em ph fracamente ácido a neutro
ES2634669T3 (es) 2011-02-08 2017-09-28 Halozyme, Inc. Composición y formulación lipídica de una enzima de degradación de hialuronano y uso de la misma para el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
US9447401B2 (en) 2011-12-30 2016-09-20 Halozyme, Inc. PH20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
LT2833905T (lt) 2012-04-04 2018-07-10 Halozyme, Inc. Derinių terapija su hialuronidaze ir į naviką nukreiptu taksanu

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