RU2520817C2 - Очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран - Google Patents
Очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран Download PDFInfo
- Publication number
- RU2520817C2 RU2520817C2 RU2008134479/10A RU2008134479A RU2520817C2 RU 2520817 C2 RU2520817 C2 RU 2520817C2 RU 2008134479/10 A RU2008134479/10 A RU 2008134479/10A RU 2008134479 A RU2008134479 A RU 2008134479A RU 2520817 C2 RU2520817 C2 RU 2520817C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- factor
- wound healing
- iii
- hrgp
- affinity chromatography
- Prior art date
Links
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 claims abstract description 84
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 claims abstract description 84
- 102100027619 Histidine-rich glycoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 80
- 108010044853 histidine-rich proteins Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 64
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 38
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 38
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 43
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 18
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 14
- 230000035876 healing Effects 0.000 claims description 14
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 13
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 10
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 9
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 claims description 8
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 8
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 8
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 6
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 4
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 4
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 4
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 4
- -1 C 1 -C 4 alcohol Chemical compound 0.000 claims description 3
- 108010035369 Cohn fraction I Proteins 0.000 claims description 3
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 3
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 claims description 3
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 2
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 claims 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 claims 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 abstract description 2
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 57
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 10
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 8
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 8
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 8
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 8
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 8
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 8
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 8
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 8
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 7
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 7
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 4
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 2
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 2
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091007643 Phosphate carriers Proteins 0.000 description 2
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 201000005657 Antithrombin III deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000033666 hereditary antithrombin deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229940066429 octoxynol Drugs 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000020964 regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006076 specific stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ очистки фактора, способствующего заживлению ран, представляющего собой фактор роста гепатоцитов (HGF). Все стадии способа очистки осуществляют в присутствии антитромбина III (AT-III). Согласно предложенному способу осуществляют размораживание замороженного источника, содержащего HGF, и удаление осадка из размороженного источника. Далее полученный раствор, содержащий супернатант и AT-III, приводят в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина. Затем отделяют раствор от носителя для аффинной хроматографии. Приводят носитель в контакт с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции HGF. Собирают десорбционный буфер, содержащий HGF, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP). Также предложены композиции для заживления ран, содержащие очищенный указанным способом HGF, AT-III и/или HRGP. Изобретения позволяют повысить постадийный выход фактора роста гепатоцитов, при этом в присутствии АТ-III фактор роста гепатоцитов сконцентрирован в элюате. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 табл., 6 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способам очистки и применения белкового фактора, получаемого из плазмы крови, для облегчения заживления ран. Отдельные аспекты изобретения включают способы очистки и защиты молекулы от деградации in vivo и in vitro.
Уровень техники
HGF является одним из факторов, способствующих заживлению ран, и представляет собой белок, который экспрессируется в мезенхимальных клетках, таких как легочные макрофаги и фибробласты, купферовских клетках в печени и лейкоцитах. HGF является цитокином, секретируемым при повреждении клеток, который, по-видимому, играет важную роль в регенерации определенных органов и заживлении ран. С точки зрения химического строения HGF представляет собой гликопротеин, который изначально синтезируется в клетке в виде нативного (неактивного) предшественника. Впоследствии молекула предшественника расщепляется в поврежденном органе с получением активного HGF с помощью специального активатора. HGF и другие факторы связываются с гепарином; это связывание, по-видимому, необходимо для активации HGF и связывании его со своим рецептором. Рецептором, связывающимся с HGF, является c-MET. Поскольку экспрессия c-MET понижена только в поврежденных органах, только клетки этих органов реагируют на взаимодействие HGF с рецептором. Примерами факторов роста, связывающихся с гепарином и воздействующих на процесс заживления ран, могут служить: тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста эпидермиса (EGF), трансформирующий фактор роста α (TGF-α), трансформирующий фактор роста β (TGF-β), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I) и фактор роста фибробластов (FGF).
Антитромбин III (AT-III) представляет собой гликопротеин плазмы, который ингибирует сериновые протеазы в каскаде коагуляции и, таким образом, играет важнейшую роль в регуляции свертывания крови. АТ-III является ингибитором факторов свертывания крови IXa, Xa, XI, Xlla и тромбина. Таким образом, АТ-III регулирует образование сгустка на разных ступенях каскада коагуляции. Даже небольшое понижение концентрации АТ-III в крови приводит к повышению риска тромбоэмболии. Концентрированные препараты AT-III используют для профилактики и лечения тромбоэмболических заболеваний у пациентов с врожденным или приобретенным дефицитом AT-III. Кроме того, было показано, что AT-III участвует во многих других биологических процессах, включая ангиогенез и реакции воспаления. Механизм действия AT-III в этих процессах еще не раскрыт полностью.
Из уровня техники известен способ очистки AT-III с помощью аффинной хроматографии, использующей гепарин в качестве лиганда, связанного с твердофазным носителем. В работе Миллер-Андерссона и соавт. описывается использование гепарин-сефарозы для очистки человеческого АТ-III (Miller-Andersson et al., Thrombosis Research 5, 439-452, 1974). Описанная методика, включающая ионообменную и гель-фильтрационную хроматографию, обеспечивает выход продукта 34%.
Богатый гистидином гликопротеин (HRGP) представляет собой одноцепочечный протеин плазмы крови, впервые выделенный в 1972 г. Физиологическая функция HRGP до сих пор точно не известна. Поскольку HRGP взаимодействует с гепарином, фибриногеном и фибрином, плазминогеном и активированными тромбоцитами, предполагается, что HRGP является модулятором коагуляции и фибринолизиса (Koide, T. In: Fibrinolysis: current prospects. Gaffney, PJ (Ed.), John Libbey & Co., London 1988, p. 55-63). Полипептидная цепь HRGP содержит 507 полипептидных остатков и содержит участки гомологии с другими белками плазмы, например, AT-III (Koide, T. Et al., (1986) Biochemistry 25, 2220-2225).
Сущность изобретения
Активная форма фактора, способствующего заживлению ран, быстро разрушается в организме, особенно в области ран, где активируется коагуляция и система протеолиза, включающая протеазы. В процессе очистки in vitro также важно предотвратить деградацию как нативной, так и активной форм фактора, способствующего заживлению ран. Про один из факторов, HGF, известно, что он переносится в крови в форме неактивного предшественника и активируется во время процесса заживления ран особыми активаторами. Например, неактивная (денатурированная) форма HGF может быть выделена в небольших количествах с помощью практически всех протестированных методов очистки, в то время как активированная и/или неактивированная форма может быть выделена только с помощью метода, описанного в настоящем изобретении. Неожиданно было обнаружено, что удаление протеаз и/или предшественников протеаз в сочетании с совместной очисткой двух стабилизаторов HGF (АТ-III и/или HRGP) приводило к увеличению выхода активированной или неактивированной формы HGF, которая легко переводится в активную форму. Поскольку обычно HGF in vivo циркулирует в крови в форме неактивного предшественника, очевидно, что медицинский препарат, представляющий собой нативную и/или активную форму HGF, может быть полезным при лечении многих заболеваний и нарушений в организме, в особенности там, где возможно местное нанесение препарата, например, при заживлении ран. Подобное может оказаться справедливым и для других факторов роста, связывающихся с гепарином, как-то: тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста эпидермиса (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGF-α), трансформирующего фактора роста β (TGF-β), инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) и фактора роста фибробластов (FGF). Ожидается, что присутствие АТ-III и HRGP улучшит результаты очистки и применения этих факторов роста.
В зависимости от способа применения, активированная и/или неактивированная форма фактора, способствующего заживлению ран, может поставляться в присутствии или в отсутствие двух специфических стабилизаторов, AT-III и HRGP, которые являются ингибиторами протеолитической деградации нативной и активированной формы фактора, способствующего заживлению ран, таким образом, их использование повышает эффективность и время полужизни продукта. В зависимости от способа нанесения в некоторых случаях предпочтительно вводить пациенту только активированную или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, в других случаях предпочтительно вводить смесь этих форм с добавлением выбранных стабилизаторов AT-III и HRGP. Это зависит от того, насколько быстро должен действовать фактор, способствующий заживлению ран. Очевидно, что сходный принцип подходит и для других факторов роста, связывающихся с гепарином и обладающих сходными с HGF свойствами, например, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста эпидермиса (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGF-α), трансформирующего фактора роста β (TGF-β), инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) и фактора роста фибробластов (FGF).
Изобретение относится к способу получения композиции, содержащей очищенный фактор, способствующий заживлению ран, из источников, содержащих фактор, способствующий заживлению ран, в частности, крови, причем стадии очистки фактора осуществляют в присутствии антитромбина III (АТ-III), богатого гистидином гликопротеина (HRGP), или их комбинации. Факторы, способствующие заживлению ран, выбирают из группы, включающей фактор роста гепатоцитов (HGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста эпидермиса (EGF), трансформирующий фактор роста α (TGF-α), трансформирующий фактор роста β (TGF-β), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) и фактор роста фибробластов (FGF), полученные из различных источников, в частности, крови, содержащих фактор, способствующий заживлению ран, причем способ получения включает стадии очистки, которые проводят в присутствии антитромбина III (АТ-III).
Способ согласно изобретению можно осуществлять с помощью следующих стадий:
- (i) размораживания замороженной крови, удаления осадка и дальнейшей обработки супернатанта;
- (ii) приведения супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соль в концентрации, сравнимой с физиологической, и имеет значение pH, близкое к нейтральному, при этом основная часть белков находится в несвязанном состоянии (включая факторы, способствующие заживлению ран, АТ-III, HRGP, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и др.), а специфические белки и протеазы связываются анионной смолой (например, протромбином, фактором X, фактором IX и др.);
- (iii) отделение носителя для анионообменной хроматографии с получением раствора (содержащего факторы, способствующие заживлению ран, AT-III, HRGP, альбумин, IgG, транферрин, гаптоглобин и др.);
- (iv) приведение раствора в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, причем основная часть белков остается несвязанной (альбумин, IgG, транферин, гаптоглобин и др.);
- (v) отделение раствора и обработка носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина десорбционным буфером с ионном силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина (необязательно, промывание гепарин-сефарозного носителя промывочным буфером до десорбции фракции, содержащей факторы, способствующие заживлению ран, причем промывочный раствор имеет повышенную ионную силу, достаточную для десорбции примесных белков (например, кофактора гепарина II), но недостаточную для десорбции факторов, способствующих заживлению ран;
- (vi) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и HRGP.
Во втором варианте осуществления способ согласно изобретению может включать следующие стадии:
(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта;
(ii) добавление неорганического адсорбирующего вещества, такого как диатомовая земля, силикагель или глинозем, и инкубация в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей, например, фактора XII, активатора прекалликреина и т.д.;
(iii) добавление низшего алифатического спирта, например, С1-С4 спирта с получением фракции Кона I;
(iv) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;
(v) пропускание супернатанта фракции Кона I через носитель для аффинной хроматографии, при котором нативная и активная форма фактора, способствующего заживлению ран, AT-III и HRGP (нативная и активная форма фактора, способствующего заживлению ран, AT-III и HRGP далее в тексте обозначены HAH) связываются с носителем колонки, тогда как основная часть других белков плазмы (например, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и т.д.) остается несвязанной и удаляется;
(vi) элюирование и сбор фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии, необязательно, обработка аффинной смолы промывочным буфером перед десорбцией факторов, способствующих заживлению ран, причем промывочный раствор имеет повышенную ионную силу, достаточную для десорбции примесных белков (например, кофактора гепарина II и др.), но недостаточную для десорбции факторов, способствующих заживлению ран.
В третьем варианте способа согласно изобретению могут осуществляться следующие стадии:
(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта;
(ii) приведение супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе для анионообменной хроматографии, при этом буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение pH, близкое к нейтральному, причем основная часть белков является несвязанной (включая фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III, HRGP, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и др.), и специфические белки и протеазы связываются анионной смолой (например, протромбин, FX, FIX и др.);
(iii) отделение носителя для анионообменной хроматографии с получением раствора (содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III, HRGP, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и др.);
(iv) добавление неорганического адсорбирующего вещества, такого как диатомовая земля, силикагель или глинозем, и инкубация в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей, например, фактора XII, активатора прекалликреина и т.д.;
(v) добавление низшего алифатического спирта, например, С1-С4 спирта с получением фракции Кона I;
(vi) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;
(vii) пропускание супернатанта фракции Кона I через носитель для аффинной хроматографии, при котором активные факторы, способствующие заживлению ран, AT-III и HRGP (HAH) связываются с носителем, тогда как основная часть других белков плазмы (например, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и т.д.) остается несвязанной и удаляется;
(viii) элюирование и сбор факторов, способствующих заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии (необязательно, промывка аффинной смолы промывочным буфером перед десорбцией факторов, способствующих заживлению ран, причем промывочный раствор имеет повышенную ионную силу, достаточную для десорбции примесных белков, но недостаточную для десорбции факторов, способствующих заживлению ран.
Четвертый вариант способа согласно изобретению осуществляют при помощи следующих стадий:
(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта;
(ii) пропускание супернатанта через носитель для аффинной хроматографии, при котором активный фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III и HRGP (HAH) связываются носителем, тогда как основная часть других белков плазмы (например, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и т.д.) остается несвязанной и удаляется;
(iii) элюирование и сбор фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии (необязательно, промывка аффинной смолы промывочным буфером перед десорбцией фактора, способствующего заживлению ран, причем промывочный раствор имеет повышенную ионную силу, достаточную для десорбции примесных белков (например, кофактора гепарина II), но недостаточную для десорбции факторов, способствующих заживлению ран).
В особом воплощении настоящего изобретения способ включает инактивацию вирусов, в частности, после стадии (vi). Инактивацию вируса на данной стадии способа осуществляют предпочтительно с помощью химических веществ, способных инактивировать вирусы. Подобный процесс инактивации, так называемый процесс сольвент/детергентной инактивации, подробно рассмотрен в патентной заявке № EP-A-131740. Содержание патентной заявки № EP-A-131740 включено в виде ссылки в настоящую заявку. После стадии инактивации вируса возможно проведение анионообменной хроматографии. Также возможно проведение катионообменной хроматографии, в частности, после анионообменной хроматографии. В дальнейшем воплощении изобретения проводят хроматографию на фосфате целлюлозы. Хроматография на фосфате целлюлозы может быть предпочтительной, поскольку такая хроматография является достаточной. Однако может быть предпочтительным проведение хроматографии на фосфате целлюлозы в комбинации с анионообменной и/или катионообменной хроматографией.
Как правило, фракцию, содержащую HGF, наносят на целлюлозофосфатный носитель в буфере, позволяющем HGF адсорбироваться на целлюлозофосфатном носителе. Элюирование HGF обычно проводится буферами с ионной силой ≥0,05 М хлорида натрия или его эквивалента.
В соответствии с настоящим изобретением фракции, полученные при выполнении альтернативных вариантов способа, могут быть сконцентрированы или подвергнуты диафильтрации для получения концентрата. Этот концентрат может быть подвергнут дальнейшей обработке, в частности, путем контакта с катионообменным носителем. Катионообменный носитель обрабатывают буфером с ионной силой, необходимой для элюции фракции А1, содержащей в основном (>90%) АТ-III, и далее обрабатывают буфером с большей ионной силой, необходимой для преимущественной элюции фактора, способствующего заживлению ран, и HRGP, которые затем собирают. Фактор, способствующий заживлению ран, и HRGP концентрируют или подвергают диафильтрации с получением фракции А2.
Во втором альтернативном варианте способа, согласно настоящему изобретению, включающем добавление к концентрату осаждающего буфера, проводят фильтрацию, и к осадку добавляют буфер для выделения фактора, способствующего заживлению ран, и HRGP.
Дальнейшая очистка полученного концентрата нативных факторов, способствующих заживлению ран, с использованием катионообменной смолы, при которой нативный фактор, способствующий заживлению ран, и HRGP связываются со смолой, может быть осуществлена с помощью по меньшей мере одним из следующих факторов:
(i) фракцию факторов, способствующих заживлению ран, и HRGP элюируют с катионообменной смолы буфером, обладающим проводимостью 10-450 мСм/см при комнатной температуре, более предпочтительно 20-200 мСм/см, наиболее предпочтительно 30-100 мСм/см;
(ii) при проведении хроматографии pH поддерживают на уровне 6-9, в частности, 6,5-8 или 6,75-7,25;
(iii) заряженные группы катионообменной смолы присоединяют к смоле с помощью слабогидрофобных полимерных углеродных цепей, состоящих из 10-100 мономерных звеньев.
Более подробно, условия для проведения второго альтернативного варианта способа очистки полученного концентрата фактора, способствующего заживлению ран, с использованием стадии высаливания, на которой HRGP осаждается, включают:
(i) использование соли в соответствии с рядом Гофмейстера, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из сульфата натрия, фосфата натрия, цитрата натрия, сульфата аммония и их комбинаций;
(ii) концентрацию соли выбирают в интервале 0,3-3 М, в частности 0,5-2 М или 0,75-1,5 М;
(iii) рН раствора выбирают в интервале 4-10, в частности 6-9 или 7-8;
(iv) полученный осадок удаляют фильтрованием или центрифугированием.
Для получения пригодного к коммерческому употреблению фактора, способствующего заживлению ран, полученный концентрат нативного фактора, способствующего заживлению ран, обрабатывают с целью очистки от патогенов с помощью по меньшей мере одного из следующих методов:
(i) инактивация вирусов с помощью раствора детергента в растворителе;
(ii) инактивация вирусов с помощью облучения светом, например, UVC, или радиоактивного облучения;
(iii) инактивация вирусов путем тепловой обработки;
(iv) удаление вирусных частиц с помощью вирусных фильтров.
Объектом настоящего изобретения является также композиция, полученная способом согласно настоящему изобретению, содержащая активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, активную форму фактора, способствующего заживлению ран или их комбинацию.
В одном воплощении изобретения, композиция содержит активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, а также АТ-III для повышения стабильности фактора, способствующего заживлению ран, in vivo и in vitro. В другом воплощении изобретения композиция содержит активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, к которому добавляют HRGP для повышения стабильности нативного фактора, способствующего заживлению ран, in vivo и in vitro. В частности, фактор, способствующий заживлению ран, полностью находится в активированной форме, или фактор, способствующий заживлению ран, находится в неактивной форме.
Предпочтительно добавление стабилизаторов, выбранных из группы, содержащей сахариды и аминокислоты, к фракциям, содержащим фактор, способствующий заживлению ран, и HRGP. Как правило, в роли стабилизаторов могут выступать полиол, аргинин, трегалоза, лизин, маннит или их комбинации.
Объектом настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция, содержащая композицию согласно настоящему изобретению.
В фармацевтической композиции фактор, способствующий заживлению ран, может присутствовать в активированной и/или неактивированной форме. Предпочтительно, чтобы фактор, способствующий заживлению ран, содержался в композиции в жидкой или лиофилизированной форме в составе для местного применения, такого как гель, спрей или аналогичной формы, в концентрации, обеспечивающей приблизительную дозировку 1-10 нг фактора, способствующего заживлению ран на см2 раны в день. В зависимости от способа применения композиция также может вводиться с использованием одного или более следующих путей введения: внутривенно, внутримышечно, подкожно, интратекально, ректально или путем ингаляции.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Количественное определение АТ-III
Для измерения биологической активности (МЕ/мл) АТ-III измеряли его активность в качестве кофактора гепарина в реакции ферментативного расщепления хромогенного субстрата H-D-Phe-Pip-Arg-pNA • 2 HCl (Chromogenix, Sweden) тромбином в присутствии гепарина и AT-III. Более полное описание методики см. Frantzen Handeland et al. (Scand. J. Haematol. 31, 427-436, 1983) и van Voorhuizen et al. (Thromb. Haemostas. 52(3), 350-353, 1984).
Общий белок
Концентрацию общего белка определяли путем измерения поглощения света с длиной волны 280 нм (A280). Концентрацию (мг/мл) для растворов AT-III рассчитывали с использованием коэффициента 6,4 МЕ/мг.
Удельную активность (SA) AT-III определяли как отношение между активностью кофактора гепарина, исчисляемой в МЕ/мл, и А280.
Количественное определение богатого гистидином гликопротеина
Количественное определение HRGP проводили с использованием метода ракетного электрофореза, в котором высота «ракеты» пропорциональна концентрации антигена (Laurell, C-B, (1966) Analyt. Biochem. Vol. 15, p. 45; and Laurell, C-B (1972) J. Clin. Lab. Invest. Vol. 29, suppl. 124, p. 21). Кроличьи антитела против HRGP (Behringwerke) добавляли в 1% гель из агарозы А (Amersham Pharmacia Biotech). Образец HRGP объемом 5 мкл наносили на гель, электрофорез проводили в течение ночи при 150В и 1В/см. Полученный комплекс антиген-антитело окрашивали и сравнивали со стандартом (сыворотка крови человека).
Изоэлектрическое фокусирование
Изоэлектрическое фокусирование проводили с использованием системы PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech) на готовых гелях; изоэлектрическая точка pI 3-9 согласно инструкции по методике разделения белков Phast файл № 100 (см. приложенное изображение).
Характеризация HGF
Чтобы подтвердить присутствие интактного HGF, обладающего полным спектром свойств, присущих этому цитокину, проводили анализ по методике Вестерн-блот. Для этого вначале проводили электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), как в присутствии, так и в отсутствие восстанавливающих агентов. После переноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану мембрану инкубировали в растворе антител, специфичных к человеческому HGF (имеющиеся в продаже антитела производства R&D Systems, Inc.), а затем в растворе конъюгированных вторых антител, специфичных к первым антителам (имеющиеся в продаже антитела производства R&D Inc.). Визуализацию антигена (белка) проводили с помощью цветной реакции.
Количественное определение HGF
Для определения относительных массовых долей HGF естественного происхождения использовали имеющуюся в продаже систему для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (solid phase ELISA, производство R&D Systems, Inc.), разработанную для определения уровня HGF в культуральной среде, сыворотке и плазме крови.
Планшет для иммуноферментного анализа предварительно покрывали антителами к HGF. Образцы и контроли наносили в лунки планшета, в результате чего весь HGF, присутствующий в растворах, связывался с иммобилизированными антителами. После отмывки несвязанных веществ в лунки добавляли поликлональные антитела, специфичные к HGF, ковалентно связанные с ферментом. После отмывки лунок с целью удаления несвязанных антител в комплексе с ферментом в лунки добавляли раствор субстрата. Субстрат расщепляли ферментом с образованием окрашенного продукта, таким образом, интенсивность цвета пропорциональна количеству HGF, связавшегося с антителами в ходе первого этапа методики. После остановки цветной ферментативной реакции определяли оптическую плотность раствора в каждой лунке при длине волны 450 нм с помощью ридера для микропланшетов.
Биологическая активность HGF
Биологическую активность определяли с помощью имеющихся в продаже тестов на заживление экспериментальной раны, миграцию и пролиферацию клеток. См. B. Rafferty et al. (J. Immunol. Methods 258 (2001) 1-11).
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Очистка нативного (активного) HGF, стабилизированного AT-III и HRGP согласно изобретению.
Стадия 1
Объединенную свежезамороженную плазму крови здоровых доноров в количестве 1 200 кг размораживали при 0°С. Полученный криопреципитат, содержащий, в частности, фактор VIII и фибронектин, удаляли с помощью центрифугирования. Преципитат обычно используют для выделения и очистки фактора VIII.
Стадия 2
Криосупернатант, полученный в результате выполнения стадии 1, пропускали через анионообменную колонку (70 литров DEAE-сефароза FF, производство Amersham Pharmacia Biotech) для связывания витамин К-зависимых белков (фактор IX, фактор X, фактор II, протеин C, протеин S и др.). Колонку промывали буфером, содержащим 0,14 М хлорида натрия и 5 мМ фосфата натрия, рН 7,0. Фракцию несвязанных белков (приблизительный вес 1270 кг) подвергали дальнейшей обработке на стадии 3, в то время как белки, связавшиеся с носителем колонки, подвергались дальнейшей очистке с целью получения фактора IX, тромбина и пр.
Стадия 3
Фракцию несвязанных белков, полученную в результате этапа 2, подвергали дальнейшей обработке путем добавления этилового спирта до достижения массовой доли 8% с получением осадка фракции Кона I, содержащей, в частности, фибриноген и липопротеиды (Cohn et al. (1946) Am. Chem. Soc. 68, 459-475). Перед добавлением этилового спирта к раствору белков было добавлено 5,5 кг диатомовой земли (Hyflow Super cel). Осадок и диатомовую землю удаляли с помощью центрифугирования.
Стадия 4
pH супернатанта фракции Кона I (приблизительный вес около 1400 кг) доводили до 7,8; после этого супернатант пропускали через носитель для аффинной хроматографии (120 литров, гепарин-сефароза FF, Amersham Pharmacia Biotech), где нативный (активный) HGF, AT-III и HRGP (HAH) связывались с носителем колонки, в то время как основная часть других белков плазмы (альбумин, IgG и др.) проходили через колонку. Колонку промывали 600 кг буфера (0,4 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, pH 7,8) для удаления неактивных форм белков и после этого фракцию НАН элюировали 500 кг буфера (2,3 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, pH 7,8). Полученный элюат НАН сконцентрировали и подвергали диафильтрации против раствора 0,05 М фосфата натрия, pH 7,5 через мембрану для ультрафильтрации (Biomax-10, Millipore). Полученный концентрат HAH, подвергнутый диафильтрации, обозначался UF1.
ПРИМЕР 2
Очистка нативного (активированного и/или неактивированного) HGF, стабилизированного АТ-III и HRGP, согласно изобретению
Стадия 1
Объединенную свежезамороженную плазму крови здоровых доноров в количестве 1 200 кг размораживали при 0°С. Полученный криопреципитат, содержащий, в частности, фактор VIII и фибронектин, удаляли с помощью центрифугирования. Преципитат обычно используют для выделения и очистки фактора VIII.
Стадия 2
Криосупернатант, полученный в результате выполнения стадии 1, подвергали дальнейшей обработке путем добавления этилового спирта до достижения массовой доли 8% с получением осадка фракции Кона I, содержащей, в частности, фибриноген и липопротеиды (Cohn et al. (1946) Am. Chem. Soc. 68, 459-475). Перед добавлением этилового спирта к раствору белков добавляли 5,5 кг диатомовой земли (Hyflow Super cel), и раствор перемешивали в течение 1-2 ч. Преципитат и диатомовую землю удаляли с помощью центрифугирования.
Стадия 3
pH супернатанта фракции Кона I (приблизительный вес около 1400 кг) доводили до 7,8; после этого супернатант пропускали через носитель для аффинной хроматографии (120 литров, гепарин-сефароза FF, Amersham Pharmacia Biotech). Нативный (активный) HGF, AT-III и HRGP (HAH) связывали с носителем колонки, в то время как основная часть других белков плазмы (альбумин, IgG и др.) проходила через колонку. Колонку промывали 600 кг буфера (0,4 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, pH 7,8) для удаления неактивных форм белков и после этого фракцию НАН элюировали 500 кг буфера (2,3 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, pH 7,8). Полученный элюат НАН сконцентрировали и подвергали диафильтрации против раствора 0,05 М фосфата натрия, pH 7,5 через мембрану для ультрафильтрации (Biomax-10, Millipore). Полученный концентрат HAH, подвергнутый диафильтрации, обозначался UF1.
ПРИМЕР 3
Дальнейшая очистка нативного HGF с целью удаления AT-III
Способ осуществляли при комнатной температуре (+22°С). Концентрат UF1, полученный в Примере 1 или 2 (А280=23,6; фиг. 1, дорожка 1), разбавляли тройным объемом дистиллированной воды. Разбавленный раствор (масса 2050 г; проводимость 2,6 мСм/см) пропускали через колонку (Pharmacia Biotech Bioprocess Column, диаметр 15 см), заполненную катионообменным носителем Fractogel® EMD SO3-650 (M) (1,7 л). Предварительно колонку уравновешивали раствором 10 мМ цитрата натрия, pH 7,5, проводимость 2,6 мСм/см. Скорость потока составляла 9 л/ч. После того, как колонку нагружали белковым раствором, колонку промывали семикратным объемом уравновешивающего буфера. Вещества, не адсорбировавшиеся на колонке, смешивали с промывочным буфером (14,6 кг, обозначенный «Фракция А1», фиг. 1, дорожка 2). Белки, более сильно связанные с носителем колонки, элюировали с колонки 1,9 кг буфера (1 М NaCl, 10 мМ цитрата натрия, pH 7,5, проводимость 106 мСм/см). Элюат (массой 1,9 кг) концентрировали и подвергали диафильтрации против раствора, содержащего 0,1 М цитрата натрия/1% сахарозы, pH 7,0. Полученная фракция, обозначенная «А2», содержала активный HGF и HRGP (табл. 1 и фиг. 1, дорожка 3).
| Таблица 1 | ||||
| Разделение фракций АТ-III и HGF/HRGP согласно изобретению | ||||
| А280 | Содержание АТ-III (%) | Присутствие нативного HGF | HRGP (мг/мл) | |
| UF1 (HAH) | 33 | >80 | + | не определено |
| Фракция А1 (АТ-III) | 4,5 | >95 | - | <0,01 |
| Фракция А2 (HGF+HRGP) | 16 | <1 | + | 4,2 |
ПРИМЕР 4
Дальнейшая очистка нативного HGF с целью удаления HRGP
К 490 г фракции UF1 (полученной способом, описанным в Примере 2) добавляли осаждающий буфер, состоящий из 532 г 0,05 М натрий-фосфатного буфера, pH 7,5, 327 г цитрата натрия и 237 г сахарозы. Осаждающий буфер добавляли к раствору фракции UF1 в течение 30 минут. После перемешивания в течение 15 минут осадок удаляли с помощью фильтра с диаметром пор 0,2-0,45 мкм; для сбора HGF и АТ-III фильтрат промывали буфером следующего состава: 1,617 г цитрата натрия и 1,012 г сахарозы, растворенных в 4400 г 0,05 М раствора фосфата натрия pH 7,5. Получившийся фильтрат далее обозначается как «фильтрат».
| Таблица 2 | |||||
| Отделение АТ-III и HGF от фракций HRGP согласно изобретению | |||||
| Масса (г) | А280 | Содержание АТ-III (%) | Присутствие нативного HGF | HRGP (мг/мл) | |
| UF1 | 490 | 18,6 | >80 | + | + |
| Фильтрат | 3,620 | 2,2 | >95 | + | - |
ПРИМЕР 5
Чтобы выяснить, насколько важно присутствие АТ-III и HRGP для наилучшего выхода HGF, был предпринят следующий эксперимент:
А. Фракцию не связанных с гепарин-сефарозой продуктов, полученную в ходе примера 2 (этапы 1-3), подвергали дальнейшей обработке. В эту фракцию, не содержащую HGF, активного АТ-III, вносили HGF, но не АТ-III или HRGP. После обработки сольвентом/детергентом (Octoxynol, TnBP) раствор пропускали через фильтр с размером пор 0,45 мкм и наносили на колонку с Q-сефарозой XL (анионообменная смола). Колонку промывали раствором Tris/HCl (концентрация 20 мМ, pH 7,0), который также удалял следы сольвента/детергента. После промывки связавшиеся с колонкой белки элюировали буфером Tris/HCl pH 7,0, содержащим 0,2 М NaCl. Элюат наносили на колонку с носителем Fractogel EMD SO3. После промывки материал элюировали с колонки 10 мМ раствором цитрата натрия pH 5,5 и 1 М NaCl.
B. Процедуру очистки проводили аналогично описанной в части А, но одновременно с HGF в раствор вносили очищенный АТ-III.
Результаты
Оценка различных фракций, полученных в ходе вариантов методики А и В, показала, что постадийный выход обоих хроматографических процессов был значительно выше в присутствии АТ-III, чем в его отсутствие, особенно в случае хроматографии на Fractogel EMD SO3. В присутствии AT-III пошаговый выход HGF превышал постадийный выход HGF в отсутствие АТ-III в два раза.
Следует также отметить, что в отсутствие АТ-III HGF обнаруживался также в других фракциях, помимо элюата, в то время как в присутствии АТ-III в случае В HGF был сконцентрирован в элюате, а в проточной и промывочной фракции присутствие HGF не обнаруживалось.
Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что присутствие АТ-III значительно повышает постадийный выход HGF. В особенности это справедливо для процессов анионообменной и катионообменной хроматографии, описанных выше.
ПРИМЕР 6
Элюат, полученный с колонки с гепарин-сефарозой, а также фракция UF1, полученные согласно способу, описанному в примере 2, то есть содержащие HGF, АТ-III и HRGP, обрабатывали сольвентом/детергентом способом, описанным в примере 5, пропускали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и наносили на колонку с фосфатом целлюлозы. Колонку промывали фосфатным буфером с концентрацией 1 мМ, pH 6,0. Элюирование HGF проводилось 1М NaCl в фосфатном буфере.
При использовании такого хроматографического процесса для удаления сольвента/детергента и дальнейшей очистки HGF постадийный выход HGF достигал более 50% от содержания HGF в исходном материале.
Claims (26)
1. Способ очистки фактора, способствующего заживлению ран, выбранного из фактора роста гепатоцитов (HGF), из источника, содержащего указанный фактор, где все стадии способа очистки осуществляют в присутствии антитромбина III (AT-III), при этом способ включает:
(i) размораживание замороженного источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и удаление осадка из размороженного источника;
(ii) приведение раствора, полученного на стадии (i), содержащего супернатант и антитромбин III, в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и приведение носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина в контакт с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).
(i) размораживание замороженного источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и удаление осадка из размороженного источника;
(ii) приведение раствора, полученного на стадии (i), содержащего супернатант и антитромбин III, в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и приведение носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина в контакт с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).
2. Способ по п.1, включающий стадии:
(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную кровь, удаление осадка из размороженного источника с получением супернатанта;
(ia) приведение супернатанта стадии (i) в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе, необходимом для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение рН, близкое к нейтральному;
(ib) отделение носителя для анионообменной хроматографии от раствора, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и AT-III;
(ii) приведение раствора, полученного на стадии (ib), в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).
(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную кровь, удаление осадка из размороженного источника с получением супернатанта;
(ia) приведение супернатанта стадии (i) в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе, необходимом для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение рН, близкое к нейтральному;
(ib) отделение носителя для анионообменной хроматографии от раствора, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и AT-III;
(ii) приведение раствора, полученного на стадии (ib), в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).
3. Способ по п.1, включающий стадии:
(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, содержащую фактор, способствующий заживлению ран, удаление осадка из размороженной плазмы крови с получением супернатанта;
(ia) добавление к супернатанту неорганического адсорбирующего вещества, выбранного из группы, состоящей из диатомовой земли, силикагеля или глинозема, и инкубацию в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей;
(ib) добавление низшего алифатического спирта, такого как C1-C4 спирт, к смеси этапа (ia) с получением фракции Кона I и супернатанта;
(ic) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;
(ii) контактирование супернатанта фракции Кона I, полученного на этапе (ic), который представляет собой раствор, содержащий фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP), с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и контактирование носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).
(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, содержащую фактор, способствующий заживлению ран, удаление осадка из размороженной плазмы крови с получением супернатанта;
(ia) добавление к супернатанту неорганического адсорбирующего вещества, выбранного из группы, состоящей из диатомовой земли, силикагеля или глинозема, и инкубацию в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей;
(ib) добавление низшего алифатического спирта, такого как C1-C4 спирт, к смеси этапа (ia) с получением фракции Кона I и супернатанта;
(ic) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;
(ii) контактирование супернатанта фракции Кона I, полученного на этапе (ic), который представляет собой раствор, содержащий фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP), с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и контактирование носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).
4. Способ по п.1, включающий стадии:
(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, удаление осадка из размороженной плазмы крови;
(ia) приведение супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе, необходимом для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение рН, близкое к нейтральному, при этом фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP) остаются несвязанными, а другие белки, содержащие один или несколько белков из протромбина, фактора Х и фактора IX, связываются с носителем для анионообменной хроматографии;
(ib) отделение носителя для анионообменной хроматографии от раствора, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и HRGP;
(ic) добавление неорганического адсорбирующего вещества, выбранного из группы, состоящей из диатомовой земли, силикагеля и глинозема, к раствору этапа (ib) и инкубацию в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей, содержащих фактор XII и/или активатор прекалликреина;
(id) добавление низшего алифатического спирта, такого как C1-C4 спирт, к смеси этапа (ic) с получением фракции Кона I и супернатанта;
(ie) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;
(ii) контактирование супернатанта фракции Кона I, полученной на этапе (ie), который представляет собой раствор, содержащий фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP), с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и контактирование носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).
(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, удаление осадка из размороженной плазмы крови;
(ia) приведение супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе, необходимом для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение рН, близкое к нейтральному, при этом фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP) остаются несвязанными, а другие белки, содержащие один или несколько белков из протромбина, фактора Х и фактора IX, связываются с носителем для анионообменной хроматографии;
(ib) отделение носителя для анионообменной хроматографии от раствора, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и HRGP;
(ic) добавление неорганического адсорбирующего вещества, выбранного из группы, состоящей из диатомовой земли, силикагеля и глинозема, к раствору этапа (ib) и инкубацию в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей, содержащих фактор XII и/или активатор прекалликреина;
(id) добавление низшего алифатического спирта, такого как C1-C4 спирт, к смеси этапа (ic) с получением фракции Кона I и супернатанта;
(ie) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;
(ii) контактирование супернатанта фракции Кона I, полученной на этапе (ie), который представляет собой раствор, содержащий фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP), с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и контактирование носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).
5. Способ по п.1, включающий стадии:
(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, удаление осадка;
(ii) приведение полученного раствора, содержащего супернатант и антитромбин III, в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и приведение носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина в контакт с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор фактора, способствующего заживлению ран, антитромбина III (AT-III) и богатого гистидином гликопротеина (HRGP).
(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, удаление осадка;
(ii) приведение полученного раствора, содержащего супернатант и антитромбин III, в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;
(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и приведение носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина в контакт с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и
(iv) сбор фактора, способствующего заживлению ран, антитромбина III (AT-III) и богатого гистидином гликопротеина (HRGP).
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором собранный фактор, способствующий заживлению ран, концентрируют или подвергают диафильтрации с получением концентрированного раствора.
7. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий стадию инактивации вирусов после сбора фактора, способствующего заживлению ран, AT-III и богатого гистидином гликопротеина (HRGP).
8. Способ по п.7, в котором стадия инактивации вирусов включает применение химического вещества, инактивирующего вирусы.
9. Способ по п.8, в котором фракцию, обработанную химическими веществами, инактивирующими вирусы, дополнительно подвергают хроматографии на фосфате целлюлозы.
10. Способ по п.8, в котором фракцию, обработанную химическими веществами, инактивирующими вирусы, подвергают анионообменной хроматографии с последующей катионообменной хроматографией.
11. Способ по любому из пп.1-5, в котором к элюированному и собранному фактору, способствующему заживлению ран, добавляют осаждающий буфер для получения осадка, который затем фильтруют и обрабатывают буфером для выделения фактора, способствующего заживлению ран, и антитромбина III (AT-III).
12. Способ по любому из пп.1-5, в котором фактор, способствующий заживлению ран, обрабатывают с целью снижения содержания патогенов с помощью по меньшей мере одного из следующих методов:
(i) инактивация вирусов с помощью раствора детергента в растворителе;
(ii) инактивация вирусов с помощью облучения ультрафиолетовым светом или радиоактивного облучения;
(iii) инактивация вирусов путем тепловой обработки;
(iv) удаление вирусов с помощью вирусных фильтров.
(i) инактивация вирусов с помощью раствора детергента в растворителе;
(ii) инактивация вирусов с помощью облучения ультрафиолетовым светом или радиоактивного облучения;
(iii) инактивация вирусов путем тепловой обработки;
(iv) удаление вирусов с помощью вирусных фильтров.
13. Способ по любому из пп.1-5, в котором фактор, способствующий заживлению ран, подвергают дальнейшей очистке с использованием катионообменной смолы, при которой фактор, способствующий заживлению ран, и богатый гистидином гликопротеин (HRGP) связываются со смолой, и которая включает одну из следующих стадий:
(i) фракцию фактора, способствующего заживлению ран, и HRGP элюируют с катионообменной смолы буфером, обладающим проводимостью при комнатной температуре, выбранной из группы, состоящей из 10-450 мСм/см, 20-200 мСм/см и 30-100 мСм/см;
(ii) при проведении хроматографии рН поддерживают на уровне, выбранном из группы, состоящей из рН 6-9, рН 6,5-8 и рН 6,75-7,25; и
(iii) заряженные группы катионообменной смолы присоединяют к смоле с помощью слабогидрофобных полимерных углеродных цепей, состоящих примерно из 10-100 мономерных звеньев.
(i) фракцию фактора, способствующего заживлению ран, и HRGP элюируют с катионообменной смолы буфером, обладающим проводимостью при комнатной температуре, выбранной из группы, состоящей из 10-450 мСм/см, 20-200 мСм/см и 30-100 мСм/см;
(ii) при проведении хроматографии рН поддерживают на уровне, выбранном из группы, состоящей из рН 6-9, рН 6,5-8 и рН 6,75-7,25; и
(iii) заряженные группы катионообменной смолы присоединяют к смоле с помощью слабогидрофобных полимерных углеродных цепей, состоящих примерно из 10-100 мономерных звеньев.
14. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий стадию катионообменной хроматографии после сбора фактора, способствующего заживлению ран, AT-III и богатого гистидином гликопротеина (HRGP).
15. Способ по п.14, в котором катионообменную смолу обрабатывают буфером с ионной силой, достаточной для элюции фракции, содержащей AT III, и далее обрабатывают катионообменный материал буфером с ионной силой, достаточной для элюции фактора, способствующего заживлению ран, и HGRP, которые собирают.
16. Способ по п.15, в котором фракцию, содержащую фактор, способствующий заживлению ран, и HGRP, концентрируют или подвергают диафильтрации.
17. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий стадию нанофильтрации.
18. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что полученный фактор, способствующий заживлению ран, подвергают дальнейшей очистке путем высаливания, при котором богатый гистидином гликопротеин (HRGP) осаждается, следующим образом: используют соль в соответствии с рядом Гофмейстера, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из сульфата натрия, фосфата натрия, цитрата натрия, сульфата аммония и их комбинаций; концентрацию соли выбирают в интервале, выбранном из группы, состоящей из 0,3-3 М, 0,5-2 М и 0,75-1,5 М; рН раствора выбирают в интервале, выбранном из группы, состоящей из 4-10, 6-9 и 7-8; полученный осадок удаляют путем фильтрации или центрифугирования.
19. Композиция для заживления раны, содержащая фактор, способствующий заживлению ран, который представляет собой фактор роста гепатоцитов (HGF), полученная способом по любому из пп.1-18, где композиция также содержит один или два стабилизатора, выбранных из антитромбина III (AT-III) или богатого гистидином гликопротеина.
20. Композиция для заживления раны по п.19, в которой указанный фактор представляет собой активированную или неактивированную форму, или их комбинацию.
21. Композиция для заживления раны по п.19, дополнительно содержащая химические стабилизаторы, выбранные из группы, состоящей из полиолов, сахаридов и аминокислот.
22. Фармацевтическая композиция для заживления раны, содержащая композицию по п.19 и фармацевтически приемлемый носитель.
23. Фармацевтическая композиция для заживления раны по п.22, в которой фактор, способствующий заживлению ран, находится в жидкой или лиофизированной форме.
24. Лекарственная форма для заживления раны, содержащая композицию по п.19, при этом лекарственная форма находится в виде геля, мази или спрея.
25. Композиция для заживления раны, содержащая очищенный фактор, способствующий заживлению ран, обогащенная фракцией богатого гистидином гликопротеина (HRGP), полученная способом по любому из пп.1-18.
26. Композиция для заживления раны, содержащая очищенный фактор, способствующий заживлению ран, обогащенная фракцией богатого гистидином гликопротеина (HRGP), полученная способом по любому из пп.1-18, где способ включает после проведения аффинной хроматографии на гепариновом носителе и инактивации вирусов, обработку смеси, полученной на стадии инактивации вирусов, фосфатом целлюлозы.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06100819.9 | 2006-01-25 | ||
| EP06100819 | 2006-01-25 | ||
| PCT/EP2007/050714 WO2007085626A1 (en) | 2006-01-25 | 2007-01-25 | Purification and use of a factor for supporting wound healing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008134479A RU2008134479A (ru) | 2010-02-27 |
| RU2520817C2 true RU2520817C2 (ru) | 2014-06-27 |
Family
ID=36607451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008134479/10A RU2520817C2 (ru) | 2006-01-25 | 2007-01-25 | Очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8962813B2 (ru) |
| EP (1) | EP1987054A1 (ru) |
| JP (1) | JP2009524622A (ru) |
| KR (1) | KR20080088610A (ru) |
| CN (1) | CN101374855A (ru) |
| AU (1) | AU2007209363B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0707268A2 (ru) |
| CA (1) | CA2640010A1 (ru) |
| IL (1) | IL192320A0 (ru) |
| NO (1) | NO20082787L (ru) |
| RU (1) | RU2520817C2 (ru) |
| UA (1) | UA94442C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007085626A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200806382B (ru) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7935364B2 (en) * | 2008-03-04 | 2011-05-03 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Patterned gradient wound dressing and methods of using same to promote wound healing |
| DE102009029194A1 (de) * | 2009-09-04 | 2011-04-07 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc., Neenah | Abtrennung gefärbter Stoffe aus wasserhaltigen Flüssigkeiten |
| WO2011028173A1 (en) * | 2009-09-05 | 2011-03-10 | Fariba Nayeri | Method of treatment of a patient suffering from an infection or injuries caused or complicated by infection |
| US8796430B2 (en) | 2010-05-26 | 2014-08-05 | Baxter International Inc. | Method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield |
| US8772462B2 (en) | 2010-05-26 | 2014-07-08 | Baxter International Inc. | Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide |
| AU2010202125B1 (en) * | 2010-05-26 | 2010-09-02 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield |
| IL210162A0 (en) * | 2010-12-21 | 2011-03-31 | Omrix Biopharmaceuticals | Viral inactivated platelet extract, use and preparation thereof |
| TR201807926T4 (tr) | 2011-02-04 | 2018-06-21 | Octapharma Ag | Koagülasyon faktörlerinin çökeltme yoluyla etkisizleştirilmesine/çıkarılmasına yönelik usul. |
| WO2013077641A1 (ko) * | 2011-11-22 | 2013-05-30 | (주)아모레퍼시픽 | 성장 인자를 포함하는 피부 재생 촉진제 |
| US9161869B2 (en) | 2012-03-30 | 2015-10-20 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Absorbent articles with decolorizing agents |
| US9237975B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-01-19 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Absorbent article with side barriers and decolorizing agents |
| US10239926B2 (en) | 2015-02-27 | 2019-03-26 | The University Of Vermont And State Agriculture College | Compositions and methods for vascular protection against reperfusion injury after myocardial ischemia |
| EP3334441B1 (en) | 2015-08-13 | 2021-06-16 | Kamada Ltd. | Compositions derived from cohn fraction paste and use thereof |
| CN105797205B (zh) * | 2016-04-20 | 2018-08-31 | 江苏迈健生物科技发展股份有限公司 | 干细胞培养上清凝胶及其制备方法 |
| CN107216384A (zh) * | 2017-05-11 | 2017-09-29 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 一种人血浆转铁蛋白分离纯化的方法 |
| US20210087224A1 (en) * | 2019-09-20 | 2021-03-25 | Plasma Technologies, Llc | Compositions and methods for generating modified cryo poor plasma |
| US10836790B1 (en) * | 2019-09-20 | 2020-11-17 | Plasma Technologies, Llc | Therapeutic protein compositions and methods |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4673733A (en) * | 1985-04-11 | 1987-06-16 | Sudhish Chandra | Treatment of biological and pharmaceutical products adsorbed on a solid phase with virus and pyrogen inactivating agents |
| US5004805A (en) * | 1986-07-14 | 1991-04-02 | Shuji Hashimoto | Hepatocyte growth factor |
| RU2124024C1 (ru) * | 1991-05-10 | 1998-12-27 | Фармация Энд Апджон С.П.А. | Белок, способ получения белка (варианты), фармацевтическая композиция |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045534A (ja) * | 1983-08-22 | 1985-03-12 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 肝実質細胞増殖因子 |
| JPS60243019A (ja) * | 1984-05-17 | 1985-12-03 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 肝細胞増殖因子 |
| US4839298A (en) * | 1986-02-14 | 1989-06-13 | Akzo N.V. | Virus inactivating diluents used in immunoassays |
| NZ232813A (en) * | 1989-03-10 | 1992-08-26 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Human fibroblast glycoprotein, cell differentiation, blood vessel endothelial cell growth factor, cellular immunology inforcing factor of 78 or 74 thousand daltons plus or minus two thousand daltons |
| US5348941A (en) * | 1992-04-01 | 1994-09-20 | Merck & Co., Inc. | Stabilizers for fibroblast growth factors |
| AUPN858596A0 (en) | 1996-03-08 | 1996-04-04 | Csl Limited | Filtration of plasma precipitates using cellulose filter aid |
| SE0000178D0 (sv) * | 2000-01-21 | 2000-01-21 | Pharmacia & Upjohn Ab | Protein purification I |
| US6451978B2 (en) | 2000-01-21 | 2002-09-17 | Biovitrum Ab | Purification of antithrombin-III-α and β |
| RU2008101791A (ru) * | 2005-06-17 | 2009-07-27 | Дженентек, Инк. (Us) | Заживление ран |
-
2007
- 2007-01-25 BR BRPI0707268-6A patent/BRPI0707268A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-01-25 JP JP2008551784A patent/JP2009524622A/ja active Pending
- 2007-01-25 WO PCT/EP2007/050714 patent/WO2007085626A1/en active Application Filing
- 2007-01-25 KR KR1020087018153A patent/KR20080088610A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-01-25 US US12/162,107 patent/US8962813B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-01-25 AU AU2007209363A patent/AU2007209363B2/en not_active Ceased
- 2007-01-25 EP EP07726226A patent/EP1987054A1/en not_active Withdrawn
- 2007-01-25 CN CNA2007800029120A patent/CN101374855A/zh active Pending
- 2007-01-25 UA UAA200810618A patent/UA94442C2/ru unknown
- 2007-01-25 CA CA002640010A patent/CA2640010A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-25 RU RU2008134479/10A patent/RU2520817C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-06-19 IL IL192320A patent/IL192320A0/en unknown
- 2008-06-20 NO NO20082787A patent/NO20082787L/no not_active Application Discontinuation
- 2008-07-23 ZA ZA200806382A patent/ZA200806382B/xx unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4673733A (en) * | 1985-04-11 | 1987-06-16 | Sudhish Chandra | Treatment of biological and pharmaceutical products adsorbed on a solid phase with virus and pyrogen inactivating agents |
| US5004805A (en) * | 1986-07-14 | 1991-04-02 | Shuji Hashimoto | Hepatocyte growth factor |
| RU2124024C1 (ru) * | 1991-05-10 | 1998-12-27 | Фармация Энд Апджон С.П.А. | Белок, способ получения белка (варианты), фармацевтическая композиция |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YANO K. et al. "Natural hepatocyte growth factor (HGF) from human serum and a bound form of recombinant HGF with heparan sulfate are indistinguishable in their physicochemical properties", International Journal of Biological Macromolecules, 1998, v.23, pp. 227-235. * |
| ZARNEGAR R. et al. "Purification and Biological Characterization of Human Hepatopoietin A, a Polypeptide Growth Factor for Hepatocytes", Cancer Research, June 15, 1989, v.49, pp.3314-3320. . GOHDA E. et al. "Purification and Partial Characterization of Hepatocyte Growth Factor from Plasma of a Patient with Fulminant Hepatic Failure", J. Clin. Invest., 1988, v.81, pp.414-419. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007085626A1 (en) | 2007-08-02 |
| UA94442C2 (ru) | 2011-05-10 |
| US20090221491A1 (en) | 2009-09-03 |
| KR20080088610A (ko) | 2008-10-02 |
| AU2007209363B2 (en) | 2013-08-22 |
| US20100261651A9 (en) | 2010-10-14 |
| US8962813B2 (en) | 2015-02-24 |
| AU2007209363A1 (en) | 2007-08-02 |
| NO20082787L (no) | 2008-10-13 |
| IL192320A0 (en) | 2008-12-29 |
| EP1987054A1 (en) | 2008-11-05 |
| CA2640010A1 (en) | 2007-08-02 |
| CN101374855A (zh) | 2009-02-25 |
| JP2009524622A (ja) | 2009-07-02 |
| ZA200806382B (en) | 2009-06-24 |
| BRPI0707268A2 (pt) | 2011-04-26 |
| RU2008134479A (ru) | 2010-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2520817C2 (ru) | Очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран | |
| DK2267025T3 (en) | Purification of fibrinogen | |
| AU2003244850B2 (en) | Processes for the preparation of fibrinogen | |
| KR20100051620A (ko) | 혼합형 또는 다중형 수지를 사용하는 인자 ｖⅰⅰⅰ의 정제 | |
| ES2736283T3 (es) | Procedimientos para aislar hemoderivados a partir de un material hemoderivado empobrecido en proteína interalfainhibidora | |
| KR20010049988A (ko) | 이온 교환 크로마토그래피에 의한 순수형 프로테아제활성화 혈액 응고 인자 ⅶ, 이의 전효소 또는 이들 단백질둘 다의 혼합물의 제조방법 | |
| US5777081A (en) | Process for producing an inter-alpha-trypsin inhibitor concentrate for therapeutic use and concentrate thus obtained | |
| LT3417B (en) | Blood coagulation factor xi concentrate and process for the preparing same | |
| US6034222A (en) | Method for the separation of recombinant pro-factor IX from recombinant factor IX | |
| EP2640413B1 (en) | A process for reduction and/or removal of fxi and fxia from solutions containing said coagulation factors | |
| MX2008009204A (en) | Purification and use of a factor for supporting wound healing | |
| EP0672051A1 (en) | PURIFICATION OF KRINGLE CONTAINING PROTEINS, AND ESPECIALLY t-PA | |
| JP2019511467A (ja) | 血液製剤から第ｖｉｉｉ因子を分離する方法 | |
| Morelli | Production and Clinical Use of Plasma Antithrombin III |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160126 |