KR20080088610A

KR20080088610A - 상처 치유 지지 인자의 정제와 용도

Info

Publication number: KR20080088610A
Application number: KR1020087018153A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 나이서-스배; 스테팬 윈지; 안나 엠자르데스탐
Original assignee: 옥타파르마 아게
Priority date: 2006-01-25
Filing date: 2007-01-25
Publication date: 2008-10-02
Also published as: UA94442C2; NO20082787L; AU2007209363A1; US20090221491A1; CN101374855A; BRPI0707268A2; US20100261651A9; AU2007209363B2; ZA200806382B; JP2009524622A; EP1987054A1; WO2007085626A1; CA2640010A1; RU2008134479A; RU2520817C2; IL192320A0; US8962813B2

Abstract

혈액과 같은, 상처 치유 지지 인자를 함유하는 근원으로부터의 간세포 성장인자 (HGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 인슐린유사 성장 인자(IGF-I) 및 섬유모세포 성장 인자(FGF)로 이루어진 군에서 선택된, 정제된 상처 치유 지지 인자를 함유하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 제조 방법은 항트롬빈Ⅲ (AT-Ⅲ)의 존재 하에서 수행되는 정제 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

상처 치유 지지 인자의 정제와 용도{Purification and use of a factor for supporting wound healing}

본 발명은 상처 치유 지지를 위한 혈소판 유래 인자의 정제 방법 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 구체적 양태는 상기 인자의 정제 및 분자를 생체 내 (in vivo) 및 시험관 내(in vitro)에서의 분해로부터 보호하기 위한 방법을 포함한다.

HGF는 상처 치유를 지지하는 인자 중 하나이며, 폐 대식세포 및 섬유모세포와 같은 중간엽세포, 간 내의 쿠퍼(Kupffer) 세포, 및 백혈구에서 발현되는 단백질이다. HGF는, 세포 손상시 분비되며 특정 기관의 재생 및 상처 치유에 중요한 것으로 보이는 사이토카인이다. 화학적으로 HGF는, 먼저 원형(navitve)(비활성) 전구체로 합성되는 당단백질이다. 상기 전구체는 특정 활성제를 통해 손상된 기관에서 활성 HGF로 분할된다. HGF와 다른 인자들이 헤파린에 결합하고, 이는 HGF의 활성 및 그의 수용체로의 결합에 중요한 것으로 보인다. HGF에 결합하는 수용체는 c-MET이다. c-MET 수용체만이 손상된 기관에서 하향조절(down-regulated)되기 때문에, HGF-수용체의 상호작용에 반응하는 것으로 보이는 것은 손상된 기관에서 세포들뿐이다. 이러한 상처 치유 과정에 영향을 미치는 헤파린 결합 친화성이 있는 성장 인 자 패밀리의 인자들의 예는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 인슐린유사 성장 인자(IGF-I) 및 섬유모세포 성장 인자(FGF)를 포함한다.

항트롬빈 Ⅲ (AT-Ⅲ)는 응고 캐스캐이드(coagulation cascade)에서 세린 프로테아제를 억제하고, 따라서 혈액 응고의 조절에서 주요한 역할을 수행하는 혈장 당단백질이다. AT-Ⅲ 는 인자 IXa, Xa, XI, XⅡa 및 트롬빈의 억제제이다. 따라서, AT-Ⅲ는 응고 캐스캐이드의 다른 단계에서 혈병 형성을 조절한다. 혈액 중의 AT-Ⅲ 농도의 작은 감소도 혈전색전증의 위험률 상승과 연관된다. 농축된 AT-Ⅲ는 후천성 또는 유전적 AT-Ⅲ 결핍증이 있는 환자들에서의 혈전색전성 질환의 예방 및 치료에 사용된다. 또한, AT-Ⅲ는 다른 많은 생물학적 반응, 예를 들어 혈관형성 및 염증 반응에 관여하는 것으로 알려져 왔다. 이러한 기전에서의 AT-Ⅲ의 기능은 아직 완전히 이해되지 않았다.

헤파린을 고체상 결합 리간드로 사용하는 친화 크로마토그래피를 통한 AT-Ⅲ의 정제는 당해 기술분야에 알려져 있다. 밀러-안데르손 등(Thrombosis Research 5, 439-452, 1974)은 헤파린-세파로즈를 사용한 인간 AT-Ⅲ의 정제를 개시한다. 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함한 전체의 절차는 34%의 수율을 제공하였다.

HRGP(Histidine-rich Glycoprotein)은 1972년에 최초로 단리된 단사슬 혈장 단백질이다. HRGP의 정확한 생리적 기능은 아직도 미상이다. 헤파린, 피브리노겐 및 피브린, 플라스미노겐 및 활성화된 혈소판과의 상호작용으로 인해, HRGP는 응고 및 섬유소용해(fibrinolysis)의 조절자로 여겨진다(Koide, T. In: Fibrinolysis: Current Prospects. Gaffney, PJ (Ed.), John Libbey & Co., London 1988, p.55-63). HRGP 폴리펩티드 사슬은 507개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고 다른 혈장 단백질, 예를 들어 AT-Ⅲ와 상동성을 공유하는 영역을 함유한다 (Koide, T. et al. (1986) Biochemistry 25, 2220-2225).

상처 치유 지지 인자의 활성 형태는 신체 내(in vivo), 특히 개시된 혈액 응고 및 프로테아제를 포함하는 단백질 가수분해 시스템을 갖는 상처 부위에서 빨리 분해된다. 정제 공정 중에도, 시험관 내(in vitro)에서 상처 치유 지지 인자의 원형 및 활성 형태 모두의 분해를 억제할 수 있는 것이 중요하다. 상기 인자 중 하나인 HGF는 혈액에서 비활성 전구체로서 운반되고, 특정 활성제에 의해 부상 시에 활성화되는 것으로 알려져 있다. 예로서, HGF의 불활성(변성) 형태는 시험한 거의 모든 정제 방법에서 소량으로 검출될 수 있는 한편, 활성 및/또는 비활성 (non-activated)형태는 본 발명의 방법을 이용해서만 발견되었다. 놀랍게도, HGF의 두 안정제(AT-Ⅲ 및/또는 HRGP)의 공동정제와 함께 프로테아제 및/또는 프로테아제의 건구체의 제거는, 강화되고(enriched) 활성화된, 및/또는 쉽게 작용하거나 활성 형태로 전환될 수 있는 HGF의 비활성 형태를 가져왔다. HGF가 일반적으로 신체 내에서 불활성(inactive) 전구체의 형태로 순환되기 때문에, 원형 및/또는 활성 HGF 의약품이 신체의 다수의 기능장애, 특히 예를 들어 상처 치유시와 같은 국소 적용이 가능한 부위의 치료를 유의적으로 향상시킬 수 있는 것으로 보인다. 이것은 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 인슐린유사 성장 인자(IGF-I) 및 섬유모세포 성장 인자(FGF)와 같은, 헤파린 결합 특성을 갖는 다른 성장 인자에 대해서도 예상될 수 있으며, 이러한 성장 인자들의 정제 및 용도도 AT-Ⅲ 및 HRGP의 존재 하에 향상될 것으로 예상된다.

용도에 따라서는, 상처 치유 지지 인자의 활성 및/또는 비활성 형태는, 상처 치유 지지 인자의 원형 및 활성 형태의 프로테아제에 의한 분해의 억제제로 작용하여, 이에 따라 제품의 효과 및 반감기를 증가시키는, 두 개의 특정한 안정제 AT-Ⅲ와 HRGP와 함께 또는 이들 안정제 없이 제공될 수 있다. 적용에 따라서는, 일부 경우에 상처 치유 지지 인자의 활성 또는 비활성 형태만을 환자에게 제공하는 것이 유익하고, 다른 경우에는 선택된 안정제 AT-Ⅲ 및 HRGP의 부가를 포함하여 그의 혼합물을 제공하는 것이 유익할 수 있다. 이것은 상처 치유 지지 인자가 얼마나 빨리 작용해야하는 지에서 기인한다. 이 원리는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 인슐린유사 성장 인자(IGF-I) 및 섬유모세포 성장 인자(FGF)와 같은, HGF와 유사점을 갖는 헤파린 결합 특성을 갖는 다른 성장 인자에 대해서도 유효하다는 것은 자명하다.

본 발명은, 정제 단계가 항트롬빈 Ⅲ(AT-Ⅲ), 히스티딘-풍부 당단백질(HRGP) 또는 그의 조합의 존재하에서 수행되는 것인, 혈액과 같은 상처 치유 지지 인자를 함유하는 근원(source)으로부터 정제된 상처 치유 지지 인자 함유 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 상처 치유 지지 인자는 상처 치유 지지 인자를 함유하는 혈액과 같은 근원으로부터의 간세포 성장 인자 (HGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 인슐린유사 성장 인자(IGF-I) 및 섬유모세포 성장 인자(FGF)로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 제조 방법은 항트롬빈 Ⅲ(AT-Ⅲ)의 존재하에서 수행되는 정제 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 하기 단계를 통해 수행될 수 있다:

- (i) 냉동 혈액을 해동한 후, 침전물을 제거하고 상층액을 더 가공하는 단계,

- (ⅱ) 상기 상층액을 음이온 교환 크로마토그래피에 필요한 완충액 중에서 음이온 교환 크로마토그래피 재료와 접촉시키는 단계로서, 상기 완충액은 생리적 조건과 유사한 염 농도와 중성 정도의 pH 값을 갖고, (상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ, HRGP, 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등을 포함한) 단백질의 대부분은 결합되지 않고, 특정 단백질 및 프로테아제(예: 프로트롬빈, FX, FIX 등)가 음이온 수지에 결합하는 것인 단계,

- (ⅲ) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 분리시켜 (상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ, HRGP, 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등을 포함한) 용액을 얻는 단계,

- (iv) 상기 용액을 단백질의 대부분(알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린)은 결합하지 않는, 헤파린-친화 크로마토그래피 재료와 접촉시키는 단계,

- (v) 상기 용액을 분리시키고 상기 상처 치유 지지 인자를 상기 헤파린-친화 크로마토그래피 재료로부터 탈착시키기에 충분한 이온 강도를 갖는 탈착 완충액으로 상기 헤파린-친화 크로마토그래피 재료를 처리하는 단계 (선택적으로 상기 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착하기 전에 헤파린 세파로즈 재료를 불순물 단백질(예: 헤파린 보조인자 Ⅱ)을 탈착시키나, 상기 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키지 않는 증가된 이온 강도를 갖는 세척 완충액으로 처리함),

- (vi) 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP를 함유하는 상기 탈착 완충액을 수집하는 단계.

제2의 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 이용하여 수행될 수 있다:

- (i) 냉동된 혈장을 해동시키고, 선택적으로는 침전물을 제거하고 상층액을 더 가공하는 단계;

- (ii) 규조토, 실리카 겔, 알루미나와 같은 무기 흡착 재료를 첨가하고, 불필요한 물질, 예를 들면, FXⅡ 및 프리칼리크레인 활성제 등을 결합시키기에 충분한 시간동안 인큐베이션하는 단계;

- (ⅲ) C₁-C₄ 알코올과 같은 저급 지방족 알코올을 첨가하여 콘 (Cohn) 분획 I을 형성하는 단계;

- (iv) 존재하는 침전물 및 무기 흡착 재료를 제거하는 단계;

- (v) 콘 분획 I 상층액을 친화 크로마토그래피 재료를 통해 처리하여, 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP (원형/활성 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP는 이하 HAH로 기재됨)를 결합시키고 다른 혈장 단백질의 대부분(예: 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등)은 결합되지 않고 제거되는 단계.

- (vi) 상기 상처 치유 지지 인자 함유 물질을 상기 친화 크로마토그래피 재료로부터 용출시키고 수집하는 단계 (선택적으로 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키기 전에 상기 친화 수지를, 불순물 단백질(예: 헤파린 보조인자Ⅱ)을 탈착시키나, 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키지 않는 증가된 이온 강도를 갖는 세척 완충액으로 처리함).

제3의 양태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 이용하여 수행될 수 있다:

(i) 냉동된 혈장을 해동시키고, 선택적으로 침전물을 제거하고 상층액을 더 가공하는 단계;

(ⅱ) 생리적 조건과 유사한 염 농도와 중성 정도의 pH 값을 가지며 음이온 교환 크로마토그래피에 필요한 완충액에 담긴 음이온 교환 크로마토그래피 재료와 상기 상층액을 접촉시켜, (상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ, HRGP, 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등을 포함한) 단백질의 대부분은 결합되지 않고, 특정 단백질 및 프로테아제(예: 프로트롬빈, FX, FIX 등)는 음이온 수지에 결합되는 것인 단계;

(ⅲ) 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 분리하고 (상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ, HRGP, 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등을 포함한) 용액을 얻는 단계;

(iv) 규조토, 실리카 겔, 알루미나와 같은 무기 흡착 재료를 첨가하고, 예를 들어 FXII 및 프리칼리크레인 활성제 등의 불필요한 물질을 결합시키기에 충분한 시간동안 인큐베이션하는 단계;

(v) C₁-C₄ 알코올과 같은 저급 지방족 알코올을 첨가하여 콘 분획 I을 형성하는 단계;

(vi) 존재하는 침전물 및 무기 흡착 재료를 제거하는 단계;

(vⅱ) 콘 분획 I 상층액을 친화 크로마토그래피 재료로 처리하여 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP (HAH)를 결합시키고 다른 혈장 단백질의 대부분은 결합되지 않고(예: 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등) 제거되는 단계.

(vⅲ) 상기 상처 치유 지지 인자 함유 물질을 친화 크로마토그래피 재료로부터 용출시키고 수집하는 단계 (선택적으로 상기 친화 수지를 상처 치유 지지 인자를 탈착시키기 전에 불순물 단백질을 탈착시키나, 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키지 않는 증가된 이온 강도를 갖는 세척 완충액으로 처리함).

제4의 양태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 이용하여 수행될 수 있다:

(ⅱ) 상층액을 친화 크로마토그래피 재료로 처리하여 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP (HAH)를 결합시키고 다른 혈장 단백질의 대부분(예: 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등)은 결합되지 않고 제거되는 단계;

(ⅲ) 상기 상처 치유 지지 인자 함유 물질을 상기 친화 크로마토그래피 재료로부터 용출시키고 수집하는 단계 (선택적으로 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키기 전에 친화 수지를 불순물 단백질(예: 헤파린 보조인자Ⅱ 등)을 탈착시키나 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키지 않는 증가된 이온 강도를 갖는 세척 완충액으로 처리함).

본 발명의 특정한 구현예에서, 본 발명의 방법은 특히 (vi)단계 이후의 바이러스 불활성화를 포함한다. 이 공정 단계에서의 바이러스 불활성화는 바람직하게 바이러스를 불활성화할 수 있는 화학물질로 처리하는 것이다. 이러한 바이러스 불활성화는 소위 용매/세제(solvent/detergent) 공정으로, EP-A-131740에 더 상세하게 기재돼 있다. EP-A-131740의 개시는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 상기 바이러스 불활성화 단계 이후에 음이온 교환 크로마토그래피가 수행될 수 있다. 또한 양이온 교환 크로마토그래피도, 특히 음이온 교환 크로마토그래피 이후에 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 셀룰로스 포스페이트 상의 크로마토그래피가 수행된다. 셀룰로스 포스페이트 상의 크로마토그래피는 이 크로마토그래피만 수행하는 것으로 충분하기 때문에 이점이 있다. 그러나, 음이온 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피와 함께 셀룰로스 포스페이트 상의 크로마토그래피를 이용하는 것이 또한 유리할 수 있다.

일반적으로, HGF를 함유하는 분획은 셀룰로스 포스페이트에 HGF가 흡착될 수 있게 하는 완충액에 담긴 셀룰로스 포스페이트 매트릭스 상에 적용된다. HGF의 용출은 일반적으로 0.05M 이상의 염화나트륨 또는 그와 동등한 이온 강도를 갖는 완충액으로 수행된다.

본 발명에 따르면, 상기 양태에서 얻은 수집된 분획을 농축 및/또는 정용여과하여 농축액을 얻을 수 있다. 상기 농축액은 선택적으로 양이온 교환 재료에 상기 농축액을 접촉시킴으로써 더 가공될 수 있다. 상기 양이온 교환 재료는 AT-Ⅲ를 지배적으로 함유하는 (>90%) A1 분획을 용출하기 위한 이온 강도를 갖는 완충액으로 처리되고, 뒤이어 상처 치유 지지 인자 및 HRGP를 지배적으로 용출하기 위해 더 높은 이온 강도를 갖는 완충액으로 처리한다. 상처 치유 지지 인자 및 HRGP 함유 분획은 농축 또는 정용여과되어 분획 A2를 생성한다.

침전 완충액이 농축액에 부가되는 본 발명의 방법의 제2의 양태에서, 여과가 수행되고 침전물은 상처 치유 지지 인자 및 AT-Ⅲ 회수용 완충액으로 처리된다.

원형(native) 상처 치유 지지 인자 및 HRGP가 수지에 결합하는 것인 양이온 교환 수지를 이용한, 결과적으로 수득된 원형의 상처 치유 지지 인자 농축액의 추가 정제는 하기 단계 중 하나 이상을 적용함으로써 수행될 수 있다:

(i) 상기 상처 치유 지지 인자/HRGP 분획을 실온에서 10 내지 450 mS/cm, 보다 바람직하게는 20-200 mS/cm, 가장 바람직하게는 30-100mS/cm 의 전도도를 갖는 완충액으로 양이온 교환 수지로부터 용출하는 단계;

(ⅱ) 6-9, 특히 6.5-8 또는 6.75-7.25로 유지되는 pH에서 크로마토그래피를 수행하는 단계;

(ⅲ) 상기 수지의 전하를 띤 기를 약 10 내지 100개의 단량체로 이루어진 약한 소수성의 고분자 탄소 사슬(slightly hydrophobic polymeric carbon chain)을 이용하여 상기 수지에 부착시키는 단계;

더 상세하게는, HRGP를 침전시키는 염석 단계를 이용한, 수득된 상처 치유 지지 인자 농축액의 상기 제2양태의 정제법의 조건은 다음을 포함한다:

(i) 호프마이스터 계열(Hofmeister series)에 따른 염, 바람직하게는 황산 나트륨, 인산 나트륨, 구연산 나트륨, 황산 암모늄 및 그의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 염이 사용되고;

(ⅱ) 상기 염의 농도는 0.3-3M, 특히 0.5-2M 또는 0.75-1.5M의 범위에서 선택되고;

(ⅲ) 상기 용액의 pH는 4-10, 특히 6-9 또는 7-8의 범위에서 선택되고;

(iv) 수득된 침전물은 여과 또는 원심분리를 통해 제거된다.

상업적으로 적용될 수 있는 상처 치유 지지 인자 분획을 제공하기 위해, 수득된 원형 상처 치유 지지 인자 농축액은 하기 중 하나 이상의 방법으로 처리하여 병원체를 감소시킨다:

(i) 용매 세제 (solvent detergent:SD)용액을 이용한 바이러스 불활성화

(ⅱ) 광 (예: UVC) 또는 방사능 처리(radioactive treatment)를 이용한 바이러스 불활성화

(ⅲ) 열처리를 이용한 바이러스 불활성화;

(iv) 바이러스 필터를 이용한 바이러스 제거.

본 발명의 대상은 또한 상처 치유 지지 인자의 활성화(activated) 및/또는 비활성화(non-activated) 형태, 상처 치유 지지 인자의 활성(active) 형태 또는 그의 조합을 포함하는, 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 조성물(composition of matter)에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 신체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro)에서 상처 치유 지지 인자의 안정성을 증가시키기 위해 상처 치유 지지 인자의 활성화 및/또는 비활성화 형태 및 AT-Ⅲ을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 상처 치유 지지 인자의 활성화 및/또는 비활성화 형태를 함유하고, HRGP가 포함되어 체내 및 시험관 내 원형의 상처 치유 지지 인자의 안정성을 증가시킨다. 특히, 상처 치유 지지 인자는 완전히 활성화되거나, 비활성화되어 있다(non-activated).

당류 및 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 안정제를 상처 치유 지지 인자 및 HRGP를 함유하는 분획에 첨가하는 것이 유익할 수 있다. 일반적으로, 상기 안정제는 폴리올, 아르기닌, 트레할로스, 라이신, 만니톨, 또는 그의 조합물일 수 있다.

본 발명의 대상은 또한 본 발명의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 활성화 및/또는 비활성화 형태의 상처 치유 지지 인자 또는 그의 조합으로, 바람직하게는 액체 또는 동결건조된 형태로 존재하고 겔, 스프레이, 또는 동종에 혼합되어 약 1 내지 10ng 상처 치유 지지 인자/㎠ 상처/일의 투여량으로 일반적으로 국소적으로 적용된다. 상기 조성물은 또한 잠재적으로 (적용에 따라) 하기 방식 중 하나 이상을 이용하여 투여될 수 있다: 정맥내, 근육내, 피하, 흡입, 경막내, 또는 경직장(per rectally) 투여.

실험 방법

AT -Ⅲ의 정량

AT-Ⅲ의 생물학적 활성(IU/ml)은 헤파린 보조인자 활성으로, 헤파린 및 AT-Ⅲ의 존재 하에서 트롬빈에 의한 발색 기질 H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl (크로모제닉스, 스웨덴)의 절단을 모니터링하여 결정하였다. Frantzen Handeland 등 (Scand. J. Haematol. 31,427-436, 1983) 및 Van Voorhuizen 등 (Thromb. Haemostas. 52(3), 350-353, 1984) 참조.

총 단백질

총 단백질 농도는 280nm (A₂₈₀) 에서의 흡광 측정을 통해 결정하였다. AT-Ⅲ용액의 농도 (mg/ml)는 6.4IU/mg의 계수를 사용하여 계산하였다.

AT-Ⅲ의 비활성(specific activity:SA)은 IU/ml로 계산된 헤파린 보조인자 활성도와 A280 간의 비율로 정의하였다.

히스티딘-풍부 당단백질( HRGP )의 정량

HRGP는 "로켓"의 높이가 항원 농도와 정비례하는 로켓(rocket) 전기영동법을 이용하여 정량하였다 (Laurell, C-B, (1966) Analyt. Biochem. vol. 15, p. 45; and Laurell, C-B (1972) J. Clin. Lab. Invest. vol. 29, suppl. 124, p. 21). HRGP 토끼 항체 (베링베르크)를 1% 한천 A 겔 (아머샴 파마시아 바이오텍)에 포함시켰다. HRGP 샘플(5㎕)을 겔에 적용하고, 밤새 전개시켰다 (150V, 1V/cm). 수득된 항체-항원 복합체를 염색하여 표준(인간 혈청)과 비교하였다.

등전압 포커싱

등전압 포커싱을 PhastSystem (아머샴 파마시아 바이오텍)을 이용하여 사전 제조된 겔로, pI 3-9에서, Phast 매뉴얼 분리 기법 파일 No.100에 따라 수행하였다(사진 첨부).

HGF 의 특성규명

이 사이토카인의 특징적인 다수의 기능을 갖는 완전한(intact) HGF의 양을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석을 수행하였다. 따라서, SDS-PAGE를 환원 및 비환원 조건 하에서 수행하였다. 단백질을 니트로-셀룰로스 쉬트 위로 전기영동에 의해 옮기고, 상업적으로 이용가능한 항-인간 HGF IgG (R&D 시스템스 사)와 함께 인큐베이션한 후, 상기 항체에 특이적인 상업적으로 이용가능한 접합 2차 항원(R&D 시스템스 사)과 함께 인큐베이션하였다. 항원 (단백질)의 가시화는 발색 반응을 통해 수행하였다.

HGF 의 정량

세포 배양물 상층액, 혈청, 및 혈장 내의 HGF 수준을 측정하기 위해 고안된 상업적으로 이용가능한 고체상 ELISA (R&D 시스템즈 사)를 사용하여 천연 HGF의 상대적 질량 값을 결정하였다.

HGF에 특이적인 단일클론항체를 마이크로플레이트에 사전 도포하였다. 표준 과 샘플들을 피펫으로 웰에 적용하여, 존재하는 HGF 모두를 고정된 항체에 결합시켰다. 결합되지 않은 물질들을 세척에 의해 제거한 후, HGF에 특이적인 효소-결합 다클론항체(enzyme-linked polyclonal antibody)를 웰에 첨가하였다. 결합되지 않은 항체-효소 시약을 모두 제거하기 위한 세척 후, 상기 웰에 기질 용액을 첨가하면, 초기 단계에서 결합된 HGF의 양에 비례하여 발색 현상되었다. 발색을 중단시킨 후, 각 웰의 광학 밀도를 450nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다.

HGF 의 생물학적 활성

생물학적 활성도는 상업적으로 이용가능한 상처 치유, 이동, 및 증식 분석을 이용하여 측정하였다. B. Rafferty 등 (J. Immunol. Methods 258 (2001) 1-11) 참조.

실시예

실시예 1:

AT-Ⅲ 및 HRGP 로 안정화된 본 발명에 따른 원형의 (활성) HGF의 정제.

단계 1

건강한 기증자로부터 혼주된(pooled), 신선 냉동(fresh-frozen) 인간 혈장(1,200kg)을 0℃에서 해동시키고, (예를 들면, 인자VⅢ (FVⅢ) 및 피브로넥틴을 포함하는) 수득된 동결침전물을 원심분리를 통해 제거하였다. 상기 침전물은 일반적으로 FVⅢ의 추가적인 정제를 위해 사용했다.

단계 2

(단계 1에서) 수득된 동결상층물(cryosupernatant)을 음이온 교환 칼럼 (70 리터 DEAE-세파로즈 FF, 아머샴 파마시아 바이오텍)을 통해 처리하여 비타민 K-의존 단백질 (인자IX, 인자X, 인자Ⅱ, 단백질 C, 단백질 S 등)을 결합시켰다. 상기 칼럼을 0.14M 염화 나트륨 및 5mM 인산 나트륨을 함유하는 pH 7.0의 완충액으로 세척하였다. 결합되지 않은 단백질 분획 (약 1,270kg)은 단계 3으로 더 처리하고, 칼럼에 결합된 단백질은 FIX, 트롬빈 등을 정제하기 위해 더 처리하였다.

단계 3

단계 2에서의 결합되지 않은 단백질 분획에 최종 농도 8% (v/v)까지 에탄올을 첨가함으로써 더 가공하여, 예컨대 피브리노겐 및 지질단백 (Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475)을 포함하는 콘 분획 (Cohn Fraction) I 침전물을 얻었다. 에탄올의 첨가 전에, 5.5kg의 규조토 물질 (하이플로우 슈퍼 셀)을 상기 용액에 첨가하였다. 상기 침전물과 규조토 물질을 원심분리를 통해 제거하였다.

단계 4

상기 콘 분획 I 상층액 (약 1,400kg)을 pH 7.8로 pH를 조절하고, 친화 크로마토그래피 칼럼 (120리터 헤파린-세파로즈 FF, 아머샴 파마시아 바이오텍)을 통해 처리하여, 원형의 (활성) HGF, AT-Ⅲ, 및 HRGP (HAH)를 결합시키고, 다른 혈장 단백질의 대부분 (알부민, IgG 등)은 칼럼을 통과시켰다. 상기 칼럼을 600kg의 완충액 (0.4M 염화나트륨 및 0.01M 인산나트륨, pH 7.8)으로 세척하여 비활성 형태의 단백질을 제거하고, HAH 분획을 500kg 완충액 (2.3M NaCl 및 0.01M 인산 나트륨 pH 7.8)으로 용출시켰다. 수득된 HAH 용출액을 초여과막 (바이오맥스-10, 밀리포어)을 이용하여 농축하고 0.05M 인산 나트륨 pH 7.5에 대해 정용여과하였다. 정용여과로 수득된 HAH 농축액을 UF1으로 지정하였다.

실시예 2:

본 발명에 따른, AT-Ⅲ 및 HRGP로 안정화된 원형의 (활성화 및/또는 비활성화) HGF의 정제

단계 1

건강한 기증자로부터 혼주된, 신선 냉동 인간 혈장(1,200kg)을 0℃에서 해동시키고, (예: 인자VⅢ 및 피브로넥틴을 포함하는) 수득된 동결침전물을 원심분리를 통해 제거하였다. 상기 침전물은 일반적으로 인자VⅢ의 추가적인 정제를 위해 사용한다.

단계 2

단계 1에서 수득된 동결상층물에 최종 농도 8% (v/v)까지 에탄올을 첨가함으로써 더 가공하여, 예컨대 피브리노겐 및 지질단백질 (Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475)을 포함하는 콘 분획 (Cohn Fraction) I 침전물을 얻었다. 에탄올의 첨가 전에, 5.5kg의 규조토 물질 (하이플로우 슈퍼 셀)를 상기 용액에 첨가하고, 상기 용액을 1-2시간동안 교반하였다. 상기 침전물과 규조토 물질를 원심분리를 통해 제거하였다.

단계 3

상기 콘 분획 I 상층물 (약 1,400kg)을 pH 7.8로 pH를 조절한 다음, 친화 크 로마토그래피 칼럼(120리터 헤파린-세파로즈 FF, 아머샴 파마시아 바이오텍)을 통해 처리하여 원형의 (활성) HGF, AT-Ⅲ, 및 HRGP (HAH)를 결합시키고, 다른 혈장 단백질의 대부분 (알부민, IgG 등)은 칼럼을 통과시켰다. 상기 칼럼을 600kg의 완충액 (0.4M 염화나트륨 및 0.01M 인산나트륨, pH 7.8)으로 세척하여 비활성 형태의 단백질을 제거하고, HAH 분획을 500kg 완충액 (2.3M NaCl 및 0.01M 인산 나트륨 pH 7.8)으로 용출시켰다. 수득된 HAH 용출액을 초여과막 (바이오맥스-10, 밀리포어)을 이용하여 농축하고 0.05M 인산 나트륨 pH 7.5에 대해 정용여과하였다. 정용여과로 수득된 HAH 농축액을 UF1으로 지정하였다.

실시예 3:

AT-Ⅲ의 제거를 위한 원형의 HGF의 추가 정제

본 공정은 실온 (+22℃)에서 수행하였다. 실시예 1 및 2에서의 농축액 UF1 (A₂₈₀= 23.6; 도 1, 래인 1)을 증류수로 1+3으로 희석하였다. 희석된 용액 (2,050g, 전도도 2.6mS/cm)을 10 mM 구연산 나트륨, pH 7.5, 2.6mS/cm으로 평형화한 프락토겔® EMD SO₃-650(M) 양이온-교환 크로마토그래피 매질(1.7L)로 충전된 칼럼(파마시아 바이오텍 바이오공정 칼럼, 직경 15 cm)을 통해 처리하였다. 유속은 9L/시간이었다. 단백질 용액을 칼럼에 적재하였을 때 상기 칼럼을 7배부피(7 volumes)의 평형화 완충액으로 세척하였다. 칼럼에 흡착되지 않은 물질은 상기 세척액과 혼합되었다 (14.6 kg, "분획 A1"으로 지정; 도 1, 래인 2). 보다 강력히 흡착된 단백질은 1.9kg 완충액 (1M NaCl/10mM 구연산 나트륨, pH 7.5, 전도도 106 mS/cm)으로 상기 칼럼으로부터 용출하였다. 용출액 (1.9kg)을 농축하고 0.1M 구연산 나트륨/1% 사카로즈, pH 7.0에 대해 정용여과하였다. 수득된 "A2"는 활성 HGF 및 HRGP를 함유하였다 (표 1 및 도 1, 래인 3).

표 1

본 발명에 따른 AT-Ⅲ 및 HGF/HRGP 분획의 분리

	A₂₈₀	AT-III 함 량(%)	원형의 HGF 존재유무	HRGP (mg/ml)
UF1 (HAH)	33	>80	⁺	미검출
분획 AI (AT-III)	4.5	>95	-	<0.01
분획 A2 (HGF+HRGP)	16	<1	⁺	4.2

실시예 4:

HRGP를 제거하기 위한 원형의 HGF의 추가 정제

490g 의 UF1 (실시예 2에 따라 제조)에 532g 0.05M 인산 나트륨 완충액 pH 7.5, 372g 의 구연산 나트륨 및 237g 수크로즈를 함유하는 침전 완충액을 첨가하였다. 상기 침전 완충액을 30분간 UF1 용액에 첨가하였다. 15분동안 교반한 후 0.45-0.2㎛ 필터를 사용하여 침전물을 제거하고, 상기 필터를 하기 완충액으로 세척하여 HGF와 AT-Ⅲ를 회수하였다: 1,617g 구연산 나트륨 및 1,012g 수크로즈를 4,400g 의 0.05M 인산 나트륨 pH 7.5에 용해시켰다. 수득된 여과액을 여과액으로 표시하였다 (표 Ⅱ 참조)

표 Ⅱ

	중량 (그램)	A₂₈₀	AT-III 함량 (%)	원형 HGF 존재유무	HRGP (mg/ml)
UF1	490	18.6	>80	+	+
여과액	3,620	2.2	>95	+	-

실시예 5:

최적의 HGF 회수를 위한 AT-Ⅲ 및/또는 HRGP의 중요성을 조사하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다:

A. 실시예 2 (단계 1-3)에 따라 수행된 헤파린-세파로즈의 유통(flow-through) 분획을 추가 제조를 위해 사용하였다. HGF, 활성 AT-Ⅲ 및 HRGP를 포함하지 않는 이 분획에 그 후 HGF를 스파이크(spike)하였으나, AT-Ⅲ 또는 HRGP는 스파이크하지 않았다. 용매 세제(solvent detergent:SD) (옥톡시놀, TnBP)로 처리한 후, 이 용액을 여과(0.45㎛의 세공 크기를 갖는 필터)하고 Q-세파로즈 XL 칼럼 (음이온 교환 수지)에 적용하였다. 칼럼을 SD 시약을 제거하는 작용도 하는 20mM Tris/HCl, pH 7.0 용액으로 세척한 후, 결합된 단백질을 0.2M NaCl을 함유하는 Tris/HCl 완충액, pH 7.0으로 용출시켰다. 이 용출액을 프락토겔 EMD SO₃ 칼럼에 적용시켰다. 세척 단계 후, 10mM 구연산 나트륨 용액, pH 5.5와 1M NaCl로 용출을 수행하였다.

B. 정제 절차는 상기 A에 기술한 것과 동일하게 수행하고, 정제된 AT-Ⅲ를 HGF 스파이크된 용액에 첨가하였다.

결과:

A 와 B의 절차에서 수득된 상이한 분획의 평가는 B 절차에서의 용출액에서 두 크로마토그래피 모두의 단계 수율이 AT-Ⅲ의 부재 하에서 수행된 크로마토그래피, 특히 프락토겔 EMD SO₃ 크로마토그래피의 수율과 비교하여 훨씬 더 높았음을 보여주었다. AT-Ⅲ의 부재하에서 얻은 것의 두배 이상의 HGF 단계 수율을 얻었다.

특히, AT-Ⅲ의 부재시에 HGF는 용출액 이외의 분획에서도 검출된 반면, B 절차의 칼럼 유통(flow-through) 및 세척 분획에서는 HGF가 검출되지 않았고, 용출액에 농축되었다.

결론적으로, 이러한 결과는, 특히 본 실시예에서 수행된 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피를 고려하면, AT-Ⅲ의 존재가 HGF 단계 수율을 상당히 지지한다는 것을 보여준다.

실시예 6:

실시예 2에 따른, 즉 HGF, AT-Ⅲ 및 HRGP를 함유하는 헤파린-세파로즈 칼럼 용출액과 UF1을 실시예 5에 따라 SD 처리하고, 여과하여 (0.45㎛), 셀룰로스 포스페이트 칼럼에 적용하고, 1mM 인산염 완충액 pH 6.0으로 세척하였다. HGF의 용출은 인산염 완충액 중 1M NaCl로 수행하였다.

이 크로마토그래피를 통해, SD 시약의 제거와 HGF의 추가 정제는 원재료와 비교하여 50% 초과의 HGF의 공정 단계 수율을 달성하였다.

Claims

혈액과 같은, 상처 치유 지지 인자(factor for supporting wound healing)를 함유하는 근원(source)으로부터의 간세포 성장인자 (HGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 인슐린유사 성장 인자(IGF-I) 및 섬유모세포 성장 인자(FGF)로 이루어진 군에서 선택되는, 정제된 상처 치유 지지 인자를 함유하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 제조 방법은 항트롬빈Ⅲ (AT-Ⅲ)의 존재 하에서 수행되는 정제 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,

(i) 냉동된 혈액을 해동시키고, 침전물을 제거하고 상층액을 추가로 처리하는 단계,

(ⅱ) 상기 상층액을, 생리적 조건과 유사한 염 농도와 중성 정도의 pH 값을 갖는, 음이온 교환 크로마토그래피용 완충액 중에서 음이온 교환 크로마토그래피 재료와 접촉시키는 단계,

(ⅲ) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 분리시켜 용액을 얻는 단계,

(iv) 상기 용액을 헤파린-친화 크로마토그래피 재료와 접촉시키는 단계.

(v) 상기 용액을 분리시키고 상기 상처 치유 지지 인자를 상기 헤파린-친화 크로마토그래피 재료로부터 탈착시키기에 충분한 이온 강도를 갖는 탈착 완충액으 로 상기 헤파린-친화 크로마토그래피 재료를 처리하는 단계,

(vi) 상기 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP를 함유하는 상기 탈착 완충액을 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,

(i) 냉동된 혈장을 해동시키고, 선택적으로 침전물을 제거하고 상층액을 추가로 처리하는 단계,

(ii) 규조토, 실리카 겔, 알루미나와 같은 무기 흡착 재료를 첨가하고, 불필요한 물질을 결합시키기에 충분한 시간동안 인큐베이션하는 단계,

(ⅲ) C₁-C₄ 알코올과 같은 저급 지방족 알코올을 첨가하여 콘 (Cohn) 분획 I을 형성하는 단계,

(iv) 존재하는 침전물 및 상기 무기 흡착 재료를 제거하는 단계,

(v) 상기 콘 분획 I 상층액을 상기 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP (HAH)가 결합되며 다른 혈장 단백질은 결합되지 않고 제거되는 친화 크로마토그래피 재료를 통해 처리하는 단계.

(vi) 상기 상처 치유 지지 인자를 상기 친화 크로마토그래피 재료로부터 용출시키고 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,

(i) 냉동된 혈장을 해동시키고, 선택적으로 침전물을 제거하고 상층액을 더 처리하는 단계;

(ⅱ) 생리적 조건과 유사한 염 농도와 중성 정도의 pH 값을 갖는, 음이온 교환 크로마토그래피용 완충액에 담긴 음이온 교환 크로마토그래피 재료와 상기 상층액을 접촉시켜, (상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ, HRGP, 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등을 포함한) 단백질의 대부분은 결합되지 않고, 특정 단백질 및 프로테아제(예: 프로트롬빈, FX, FIX 등)는 상기 음이온 수지에 결합되는 것인 단계;

(ⅲ) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 분리하고 (상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ, HRGP, 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등을 포함하는) 용액을 얻는 단계;

(iv) 규조토, 실리카 겔, 알루미나와 같은 무기 흡착 재료를 첨가하고, 예를 들어 FXII 및 프리칼리크레인 활성제 등의 불필요한 물질을 결합시키기에 충분한 시간동안 인큐베이션하는 단계;

(v) C₁-C₄ 알코올과 같은 저급 지방족 알코올을 첨가하여 콘 분획 I을 형성하는 단계;

(vi) 존재하는 침전물 및 상기 무기 흡착 재료를 제거하는 단계;

(vⅱ) 콘 분획 I 상층액을 친화 크로마토그래피 재료로 처리하여 상기 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP (HAH)를 결합시키고 다른 혈장 단백질의 대부분(예: 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등)은 결합되지 않고 제거되는 단계.

(vⅲ) 상기 상처 치유 지지 인자 함유 물질을 상기 친화 크로마토그래피 재료로부터 용출시키고 수집하는 단계 (선택적으로 상기 친화 수지를 상기 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키기 전에, 불순물 단백질을 탈착시키나, 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키지 않는 증가한 이온 강도를 갖는 세척 완충액으로 처리함)를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,

(i) 냉동된 혈장을 해동시키고, 선택적으로 침전물을 제거하고 상층액을 추가로 처리하는 단계;

(ⅱ) 상기 상층액을 친화 크로마토그래피 재료로 처리하여 상기 상처 치유 지지 인자, AT-Ⅲ 및 HRGP (HAH)는 결합되나, 다른 혈장 단백질의 대부분 (예: 알부민, IgG, 트랜스페린, 합토글로불린 등)은 결합되지 않고 제거되는 단계;

(ⅲ) 상기 상처 치유 지지 인자 함유 물질을 상기 친화 크로마토그래피 재료로부터 용출시키고 수집하는 단계(선택적으로 상기 친화 수지를 상기 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키기 전에, 불순물 단백질(예: 헤파린 보조인자Ⅱ 등)을 탈착시키나, 상처 치유 지지 인자 분획을 탈착시키지 않는 증가된 이온 강도를 갖는 세척 완충액으로 처리함)를 포함하는 것인 방법.
제2항 내지 제5항에 있어서, 상기 수집된 분획은 농축 및/또는 정용여과하여 농축액을 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 불활성화가 특히 (vi)단계 후에 수행되는 것인 방법.
제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계 후 음이온 교환 크로마토그래피가 수행되는 것인 방법.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피가, 특히, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 이후에 수행되는 것인 방법.
제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰로스 포스페이트 상의 크로마토그래피가 수행되는 것인 방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 나노여과가 수행되는 것인 방법.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제2항 또는 제3항의 (vi)단계, 제4항의 (vⅲ)단계, 또는 제5항의 (ⅲ)단계의 분획을 바이러스 불활성화 화학물질로 바이러스 불활성화 처리하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 화학물질로 처리된 분획을 셀룰로스 포스페이트 크로마토그래피로 처리하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 화학물질로 처리된 분획을 음이온 교환 크로마토그래피로 처리 후 양이온 교환 크로마토그래피로 처리하는 것인 방법.
제8항 또는 제14항에 있어서, 상기 양이온 교환 재료를 AT-Ⅲ를 우세적으로 (>90%) 함유하는 A1 분획을 용출시키는 이온 강도를 갖는 완충액으로 처리한 후, 상처 치유 지지 인자 및 HRGP를 우세적으로 용출시키는 보다 높은 이온 강도를 갖는 완충액으로 처리하여 상기 상처 치유 지지 인자 및 HRGP를 수집하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 상처 치유 지지 인자 및 HRGP를 함유하는 분획을 농축 또는 정용여과하여 분획 A2를 수득하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 침전 완충액을 상기 농축액에 첨가하고, 여과를 수행하고, 침전물을 상기 상처 치유 지지 인자 및 AT-Ⅲ 회수용 완충액으로 처리하는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득된 상처 치유 지지 인 자 농축액을 하기 방법 중 하나 이상에 의해 처리하여 병원체를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법:

(i) 용매 세제 용액(solvent detergent solution)을 이용한 바이러스 불활성화,

(ⅱ) 광 (예: UVC) 또는 방사능 처리(radioactive treatment)를 이용한 바이러스 불활성화,

(ⅲ) 열처리를 이용한 바이러스 불활성화,

(iv) 바이러스 필터(virus filter)를 이용한 바이러스 제거.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득된 상처 치유 지지 인자 농축액을 양이온 교환 수지를 이용하여 더 정제하고, 상기 상처 치유 지지 인자 및 HRGP는 하기 단계 중에서 하나 이상에 의해 상기 수지에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법:

(i) 상기 상처 치유 지지 인자/HRGP 분획을 실온에서 10 내지 450 mS/cm, 보다 바람직하게는 20-200 mS/cm, 가장 바람직하게는 30-100 mS/cm 의 전도도를 갖는 완충액으로 상기 양이온 교환 수지로부터 용출하거나,

(ⅱ) 크로마토그래피 동안 pH는 6-9, 보다 바람직하게는 6.5-8, 가장 바람직하게는 6.75-7.25 로 유지되거나, 또는

(ⅲ) 상기 수지의 대전된 기는 약 10 내지 약 100개의 단량체로 이루어진 약소수성 고분자 탄소 사슬(slightly hydrophobic polymeric carbon chain)을 이용하 여 상기 수지에 부착된다.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득된 상처 치유 지지 인자 농축액은 HRGP가 침전되는 염석 단계를 이용하여 더 정제되는 것을 특징으로 하며, 상기 염석 단계는:

(i) 호프마이스터 (Hofmeister series) 계열에 따른 염, 바람직하게는 황산 나트륨, 인산 나트륨, 구연산 나트륨, 황산 암모늄 및 그의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 염이 사용되고;

(ⅱ) 상기 염의 농도는 0.3-3M, 특히 0.5-2M 또는 0.75-1.5M의 범위에서 선택되고;

(ⅲ) 상기 용액의 pH는 4-10, 특히 6-9 또는 7-8의 범위에서 선택되고;

(iv) 수득된 침전물은 여과 또는 원심분리를 통해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
상처 치유 지지 인자의 활성(activated) 및/또는 비활성(non-activated) 형태 또는 그의 조합을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따라 얻을 수 있는 조성물.
제21항에 있어서, 상기 조성물은 체내 (in vivo) 및 시험관 내(in vitro)에서 상기 상처 치유 지지 인자의 안정성을 증가시키기 위해, 상기 상처 치유 지지 인자 및 AT-Ⅲ의 활성 및/또는 비활성 형태를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제21항 및/또는 제22항에 있어서, 상기 조성물은 체내 및 시험관 내에서 원형의(native) 상처 치유 지지 인자의 안정성을 증가시키기 위해, 상기 상처 치유 지지 인자의 활성 및/또는 비활성 형태를 함유하고 HRGP를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올, 당류, 및/또는 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 안정제를 부가적으로 포함하는 것인 조성물.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 약제학적 조성물
제25항에 있어서, 상기 상처 치유 지지 인자의 활성 및/또는 비활성 형태는 액체 또는 동결건조된 형태이고, 겔 또는 스프레이로 적용되는 것인 약제학적 조성물.
제26항에 따른 조성물이 겔, 연고, 또는 스프레이의 제형인 것인 약제학적 제제.
제1항 내지 제20항에 따라 얻을 수 있는 HRGP 풍부 분획 (HRGP-enriched fraction).
제 28항에 있어서, 헤파린 친화 및 바이러스 불활성화 처리 후에 결과물인 혼합물을 셀룰로스 포스페이트 물질로 처리하는 방법을 통해 얻을 수 있는 것인 분획.