JPS60243019A - 肝細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、肝細胞増殖因子に関する。

（従来の技術） 本発明者は、先に肝細胞の増殖因子を見出した（日本組
織培養学会第５２回研究会で発表）が、さらに比活性を
向上させた増殖因子を得るべく種々検討を行ない、本発
明に到達した。

（発明の要旨） すなわち、本発明の要旨は、温血動物の腸粘膜のホモジ
ネートニジ分画され１、分子量が約２万である肝細胞増
殖因子にある。

（発明の構成） 以下、本発明の詳細な説明する。

まず、本発明における瀉血動物としては、ラット、マウ
ス、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ、ウマ等が挙
げられる。

これらの動物の腸粘膜の種類としては、小腸、盲腸、−
二脂腸、空腸、回腸、大腸が挙げられるが、通常、ウシ
、ブタ、ニワトリ等の小腸、盲腸が好適に使用される。

本発明に係る増殖因子は、たとえば、次のような方法に
よって得られる。

まず、上記動物の腸粘膜を採取する。採取は、通常、擦
過法によシ行い、腸上皮粘膜組織を得る。これをカルシ
ウム、好ましくはさらにマグネシウムを実質的に含有し
ない塩類溶液で処理してホモジネートを得る。これらの
工程は通常Ｏ−２℃程度の温度で行なわれる。

上記塩類溶液としては、たとえばタイロード溶液（Ｔｙ
ｒｏｄｅｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　（以下、ｒＣＭＦ
Ｊという）が使用される。この溶液の組成は次のとおシ
である。

ＮｈＣＩＬＯＯＮａ２ＨＰＯ４／、　／！Ｋｅｌ　θ、
２θ　ＫＨ２ＰＯ４０，２θ（り／Ｉｔ） 次いでホモジネートから、遠心分都等によυ上清を得る
。遠心分＠によるときは、通常ζ０００−　／、２，０
００　Ｘ　ｔで数分以上で行なわれる。

得られた上清は加熱され、変性した高分子タンパクは沈
殿除去される。加熱はｔＯ−７ｏｏ℃程度で１分以上行
なわれる。次いで上清を上記塩類溶液で透析処理し、低
分子量成分が除去される。

次いで、得られた両分（あるいは、上記加熱お工び／ま
たは透析を行なわない遠心分離画分でもよい）をパセフ
ァデツクス”Ｇ−７！ｒ、ｉｏ。

ろ ｉたはコθθ等によるグル４過に付し、得られる３つの
ピークのうちの第１のピークを有する両分を分画する。

ついで、ＤＥＡＥセルロースを用いて、イオン交換クロ
マトグラフィー処理すると、６〜７の両分に分画される
。２番目の両分が目的とする本発明の増殖因子は、次の
ような性質を有する。

ａ）ＣｏｎＡ　（コンカナバリンＡ）−セファロースク
ロマトグラフィーによシ溶出される。すなわち、多糖類
または糖タンパク質の性状を示さない。

ｂ）　ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動図
は、分子量約２万にひとつのバンドを有する。

Ｃ）動物による種特異性を示さない。

ｄ）良好な熱安定性を有する。

θ）肝細胞の増殖促進作用を有し、かつ、他の組繊細胞
の培養においてもウシ由来の胎児血清、準胎児血清また
は子牛血清と同様の培養効果を示す。

（発明の効果〕 以上のように、本発明に係る肝細胞増殖因子は、肝機能
促進剤等としての用途が期待され、また、無血清培地へ
の培養促進剤と゛しても有用である。

（実施例） 以下、実施例によシ本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明は、その要旨を超えない限多。

以下の実施例に限定されない。

実施例１ （実験−７）加熱、透析したラット小腸粘膜抽出物のゲ
ル濾過法による分画 ｌ）実験動物と飼育条件 グル濾過にはＳｐｒａｇｕｅ　−Ｄａｗｌｅ系（以後ｒ
ｓＤ系」という）の生後２〜３ヶ月齢、体重λθθ〜３
００９の雄から得た試料を使用した。ラットは飼料、飲
料水ともに自由摂取とし、飼料としては固型飼料（日本
配合飼料に、に製）を給与し、２３℃前後に保温された
環境下で飼育した。

λ〕　小腸粘膜抽出物の調製 ラットを軽くエーテルで麻酔し、頚静脈を切断、放血し
、開腹後、全小腸を摘出し、内容物を除去した後、眼科
用ノ・サミでｗＫ切開衝塩類溶液）Ｆで洗い、粘膜をビ
ンセットによシ擦過採取し、約２倍容のＣＭＦ−ＰＢＳ
液でホモジネート後、ｌツｏｏｏｘ、ｙ、３０分間遠心
分離した上清を小腸粘膜抽出物とした。

３）小腸粘膜抽出物の加熱、透析性 上述の小腸粘膜抽出物を１００℃、２分間加熱後、１．
２，０００Ｘｔ５．２０分間遠心分離し、上清を約３θ
倍容のＯＭＦ−ＰＢＳ液で２μ時間透析した。

弘〕　ゲル濾過法による分画 加熱、透析した小腸粘膜抽出物をコロジオンバッグによ
り約ｓ　ｍｅ　Ｋ　ｍ縮し、分画用試料とした。

グル濾過に使用したゲルは’　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　
−カラムは内径／、Ｊｍ、ゲル高１２θσとした。

０、／ＭＮａＣ！１−−〇ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝
液（ｐＨ７，５）によりゲルを洗い、試料を２ゴはど添
加し、同一の緩衝液で下降法にて、２Ｗｔｌ／ｈｒの流
速で溶出した。

溶出さノまた緩衝液をフラクションコレクターによって
、２ｒｎ１分取し、２１０　ｎｍの吸光度を計測するこ
とによシ溶出曲醇を得た（図−ｌ）。

これに１９３つの画分を得たので次の実験−λの試料と
した。

（実験−２）成熟ラット肝細胞培養による肝細胞増殖活
性因子の検索 ／〕　培養に用いた動物はｇ週齢、体重約１ｓｏｔＯ８
Ｄ系雄ラツトを用い、飼育は実験−７と同様の条件で行
なった。なお、肝細胞の分離操作及び培養は全て無菌条
件で行なうため、滅菌には特に注意を払った。

２）成熟ラット肝細胞分離法 肝細胞の分離はすべて次のような方法で行なった。

ラットに０．２ｔｔｔｌのネンプタールを腹腔内に注射
して麻酔する。次に腹部を刺毛し、１０チ塩化ベンザル
コニウム液で身体全体を消毒する（以後肝細胞分離操作
は振とうと遠心分離以外は全て無菌箱中で行ない無菌的
に操作する。）。

ラットを手術用固定台に仰臥位に固定し、手術用ハサミ
で腹部の皮膚、腹筋の＄に開腹する。ＯＭＦ−ＰＢＳ液
をしみ込ませた脱脂綿で腸を術者の右側にかきょけ門脈
を十分露出させる。門脈に縫合糸のループをかけ、眼科
用ハサミの先端を使って門脈に切れ目を入れる。切開部
にあらかじめ設置しでおいた潅流装置に前油流緩衝液を
流しながら溢れ出る血液をめがけ゛Ｃカニユーレを挿入
し、すばやく縫合糸で結紮する。同時に肝臓下の工大静
脈を切断し洗浄液を流出させる。そのまま３０ｒｒｒＪ
／　ｈｒの流速で前油流緩衝液を約、２　ｏ　ｏ　ｍｌ
流した後、ポンプを止める。潅流液をｃＭｙ−ＰＢＳ液
に変え、同一の流速で約１ｏｏ−流し洗浄した後、ポン
プを止め、潅流液をコラゲナーゼ溶液に変え、同一の流
速で約３０ｔｕｌ流す。コラゲナーゼが肝臓全体に浸透
したところでポンプを止め、全肝臓を慎重に摘出し、１
２０ｔｔｒａガラスシヤーレに移ス。約２０ｄのコラゲ
ナーゼ溶液を加え、カミソリの刃を鉗子で交叉させ肝臓
を２四角の大きさに細切する。細切した組織をコラゲナ
ーゼ溶液ごと１ｏｏｔｔｔｌ容三角コルベンに移し、ブ
チル栓にて密栓し、３７℃の恒温振とう機で７分間に１
００振とうの割合でｉｓ分間振とうする。

振とう後、未消化の組織を細胞濾過器によって取り除き
、上から約ｉｏ−〇〇ＭＦ−ＰＢＳ液で未消化の組織を
洗い、全てのＦ液を３０−容の遠沈管に集め、密栓後ｊ
Ｏ×？、１分間遠心分離する。上清を捨て、新たに、２
０ｄのＯＭＦ−ＰＢＳ液を加えて洗浄し、ゆるやかにピ
ペッティングし密栓後、遠沈管を氷冷し、ｊθ×２．１
分間遠心分離し上清を捨てる。

再度ＣＭＦ−ＰＢＳ液を加え懸濁し、２重ナイロン布の
小片で濾過し、ろ液を新しい遠沈管に集めて密栓後、氷
冷し、ＩＯＸ？、１分間遠心分離する。上清を捨てた後
、Ｃ！ＭＦ−ＰＢＳ液による洗浄を２回繰り返すことに
よシ、肝実質細胞よシ比重の軽い非実質細胞が取り除か
れ、肝実質細胞が分離される。

３）前培養と前培養培地 酵素などによシ損傷を受けた肝細胞は本来の肝機能を失
っているため、それを開腹させるため、前培養を行々つ
た。

低速遠心法で精製した肝実質細胞をｓ％ラット血清（５
６℃、３０分間の加熱で補体な無毒化したもの）と１０
″Ｍのデキサメサゾンを含む、ウィリアムのＩ培地（Ｗ
Ｅ培地）Ｊに懸濁し、滅菌済のプラスティクシャーレ（
３３×１ＯＩＩＩＩ１１）に八ｊ１の割合で播く。培養
液にはペニシリン（／　００　Ｕ／ｍ／）　、ストレプ
トマイシン（７００ｐ２／１１ｔｌ）、アンホテリシン
Ｂ　（０，２にμｔ／ｒｒｔｊ　）などが添加しである
。培養はｊ％ｃｏ２−タよ％空気を気相として、３７℃
の００２インキユベーター中で２≠時間行なう。２≠時
間後には多くの肝細胞がシャーレ底面に接着している。

リ　培養方法 前培養培地で２を時間培養した後、目的の培地に交換し
た。

培地には、前述のＷＥ培地を基本培地とし、対照区（ｃ
ｏｎｔｒｏｌ　）として７０％ラット血清添加培地、実
験区として実験−！で得た画分ｌ（０，Ｏコキ蛋白／　
ｙｔ４　）、両分２（０，０２■蛋白／罰〕、画分３（
θ、０１ダ蛋白／ｒｒｔｌ）をそれぞれ１０％添加した
。

なお、画分／　（ｔｕ’ｂｅ　Ｎ［１３３〜４２　）、
画分λ（ｔｕｂｅ　Ｎｎ　６０−ざｊ）、画分３　（ｔ
ｕｂｅ　Ｉｔｉ　９１１〜）、！θ）、ハソれそれコロ
ジオンバッグによシ適当量（ｊｍＪ前後）に濃縮し、３
０倍容のＯＭＦ−ＰＢＳ液で、２≠時間透析し、ＬＯＷ
ｌＦ法で蛋白質製置を測定した。

培地の交換は≠ｇ時間毎に行なった。

力　細胞数の測定日と測定法 前培養終了時を０日目として１日目、３日目、６日目、
２日目の細胞数を測足した。

測定法は、シーヤーレを取シ出し、培地を取シ除きトリ
プシン−ＲＤＴＡ混液（０，１％トリプシン、θ、０．
２％ＥＤＴＡ−ＣＭＦ−ＰＢｓ液）で３７℃、ｌｊ分間
インキュベートし、細胞がシャーレに残らなくなるまで
繰り返しはがした。その細胞浮遊液をｓｏ、ｏ×ｙ、ｌ
！分間遠心分離し、細胞を集めそれを既知量のＯＭＦ−
ＰＢＳ液に懸濁し、トリバンプルーで染色後、核の染ま
らないものを生細胞としてヘマトメーターによシ算定し
た。なお、各突鹸区毎に３個のシャーレを測定しその平
均値を細胞数とした。

６）実験結果 潅流法と低速遠心処理によって得られた肝細胞では１．
１’１７％前後の生細胞が得られ、血球、非実質細胞の
混入もほとんどなかった。

培養後の細胞数の変化および形態的変化をみたところ、
培地に画分／を添加したものは顕著な増殖が見られた。

画分コ及び３も３日目までは増殖の傾向が見られたが６
日目、り日日と日数が経つにつれ細胞数が減ってゆき、
画分３は乙日日以後は培養不能となった。対照区の１０
チラツト血清添加培地では増殖が見られず６日目で培養
不能となった。

本実験によシ肝細胞増殖活性を持つ因子が画分／にある
ことがわかり、少なくとも９日以上増殖を維持すること
が明らかにされた。

（なお、画分２及び３の一時的な増殖は画分ｌの分画が
画分λ及び３に少量混入したことによるものであった。

） （実験−Ｊ）イオン交換セルロースカラムクロマトグラ
フィーによる分画 カラムに使用したセルロースイオン交換体はを用いた。

カラムは内径３ｃＩｎ、高さ３０ｃｍを使用し、実験−
／と同様の緩衝液にて、セルロースイオン交換体を平衡
化して使用し虎。

上記実験−１で得た画分ｌをコロジオンバッグ（よシ約
ｒｍＫ濃縮し分画用試料とした。

試料をカラムに５ｍｌ添加した後、０．１Ｍ。

０．２　Ｍ％０．３　Ｍ、　０．１／−Ｍ、　０．６　
Ｍ、　０．Ｉ　ＭのＮａ１ｌ　によフイオン強度を段階
的に高め、吸着された物質を溶出した。なお、７種類の
緩衝液はそれぞれ流す量をλｒＯｒｎＪとし、／　Ｏｒ
ｕｇ／　ｈｒの流速にて溶出し、溶出された緩衝液をフ
ラクションコレクターによって、ｊ　ｙｔ１分取し、２
１０ｎｍ　の吸光度を測足し、溶出曲線を得た（図−２
）。

これによシロつの両分を得たので、次の実験−グの試料
とした。

（実験−μ）成熟ラット肝細胞培養による肝細胞増殖活
性因子の検索 上記実験−２と同様の方法によった。

なお、培養方法は、実験−ノと同様Ｋ、前培養を２≠時
間行なった後、実験区とし、画分／（０，０２ｑ蛋白／
、ｉ：　；　ｔｕｂｅ　ＮｃＬ／　０〜−２　ｊ　）、
画分λ（０，０２Ｗ蛋白／　ｍｌ　；　ｔｕｂｅ　ｔＪ
ｎ　Ａ　６〜７３　）、画分３（ｏ、ｏ、ｙｔ　ｑ蛋白
／　Ｍｌ　ｅ　ｔｕｂｅ　％　１３０〜／　ｊ　Ｏ）、
画分グ（０，００２１ｑ蛋白／ＷＬｌ；　ｔｕ’ｂｅ１
４　／３７〜１６１　）、画分ｊ　（０，００２１Ｌｑ
蛋白／１ｌＩ７！；　ｔｕ’ｂｅ　Ｎｎ　／　６り〜１
ｒ７）、画分６（０，００２１ｎ９蛋白／　ｗｌ　：　
ｔ＋ｉｂｅ　Ｎｎ　／りＡ−２０２）を基本培地にｉｏ
％添加して行ない、細胞数の測定は、７日目と３日目と
に行なった。

各両分の物性は分子量の測定とＰＡＳ染色による糖の存
在を調べ、細胞増殖活性を有する区分については、ポリ
アクリルアミド電気泳動法によって蛋白組成を調べた。

なお、分子量は、８Ｄ８ポリアクリルアミド電気泳動法
によって測定した。

（笑験結果〕 培養後の細胞数の変化を表−ｌに示す。

すなわち、画分λを添加した培地のみが増殖を示した。

分子量の測定では、ＳＤＳポリアクリルアミドによ名測
定において蛋白質の染色反応（クーマシーブリリアント
ブルー染色）が画分３、弘、ｊ及び６に出ないことが明
らかにされた。

ポリアクリルアミド電気泳動法による分画は、細胞増殖
活性の見られた両分２（すなわち、目的とする増殖因子
）について行なった。その結果３つのバンド（分子量約
２万）が、アミドブラック染色によシ検出された。

表　ｌ （Ｘ　／　０’　ｃｅｌｌｓ　／ａｉｅｈ＋：ＳＫ）

【図面の簡単な説明】

図−７はラット小腸粘膜抽出物のゲルろ適法による溶出
曲線を示す図でお９、図−λは一図−ｌにおける両分ｌ
のイオシ交換セルロースクロマトグラフィーによる溶出
曲線を示す図である。 出　願　人　三菱化成工業株式会社 代　理　人　弁理士　長谷用　− ほか１名 図−１ チーーブんＶ。 Ｆ：函分

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　温血動物の腸粘膜のホモジネートより分画され
   、分子量が約２万である肝細胞増殖因子。