JPS58500273A - 組織培養媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　組織培養媒体 発明の背景 本願は１９８４年２月２７日に出願された出願番号第２３８，６８６　号の一部 継続出願である。

発明の分野 本発明は細胞の生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）成育に有用な組織培養様体（関する 。

背景技術の記述 動物及び植物細胞が液体培養媒体、即ち組織培養液中において生体外で生育する ことが６米ることは公知である。例えば、Ｋｒｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、Ａｃａｄｅ ｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、、１９７３年、及びｉａｍ、Ｒ ，Ｇ、及びＭｃｋｅｅｈａｎ、Ｗ、Ｌ、、Ｍｅｔｈ−ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ、４３：４４−９３　（１９７９）参照、その様な媒体は通常培養細 胞の最大生育を促進する各株栄養素及び塩類を含む広範囲の異種成分を含有する 。

組織培養液中で生育された細胞は多（の異った目的に使用される。例えば、酵素 、ａ胞生成物、抗体の製造成いは薬品１発ガン件試薬の試験などである。動物細 胞系の生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）生育は最近（おいて細胞融合の発展及び＾イ ブリドーマのＩＩ製及びそれらに関連したモノクロナール抗体との新らたな関連 性を獲得している。

組織培養媒体の必須成分の一つがウシ血清であり、最も好ましくは、クシ胎児或 いは新生の仔ウシ血清であることは当該技術分野において長く確立されている事 実である。これらの二ｓｔ１の血清は細胞生育を阻害する成分を高濃度で含まず 、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で細胞生育を支持する不特定の因子を含有する。

しかしながら、ウシ胎児血清の使用は十分な供給に欠けること、及びその成分の 貧弱な特性決定による問題がある。更ＫＣの種の血清のコストはその様な血清を 含有する細胞の経済的成長を妨げてきた。

多（のウシ胎児血清代用物が提案されている。例えば、米国特ｌＦＦ３１１２８ ．２２８号明細書は血清蛋白質画分、並びに栄養塩分、蛋白質分解生成物及び特 別の酸更に糖類及びビタミン類或いは助酵Ｘ類を含有する栄養素溶液に基づいて 細胞培養液の調製用の培養媒体を開示している。この血清代用物は仔ウシの血液 より＃ｌ！固、血清の率離後一連の沈澱工程を行って得られている。

米国Ｆ＃ＦＦ３，４２９，８６７号明１１１１書は仔ウシ血清明１１１１書酸性 化により調製された組織培養液に適したＰｆｒｎ　ｒｙカンマ（Ａｇａｍｍａ） Ｊ仔つシ血清を記載している。

米国特ｌＦＦ４，０３８，１３９号明ＩＩＢ沓はツタ血清及び約０．１　％の蛋 白質の沈澱な防止する界面活性剤を含有する培養媒体を記載している。同Ｉ＃肝 のブタ血清はウシ胎児血清を用いて祷られるよりも優れたべ率を与えるリンＡｗ Ｕ胞の生育を支持すると述べられている。ブタ血清は又相当罠費用が安く従って 同時にコストの減少ももたらす。

米国特許３，１２２，４７６号明細書は、未成熟の仔ウシの血液から分別、血清 の単離及びそれからのエチルアルコール沈澱（よるガンマ−グロブリン及びその 他の毒性物質の分離により調製された生体外（ｉｎマ１ｔｒｏ）での正常なヒト 細胞その他の動物細胞の生育（有用な代用ウシ胎児血清を記載している。これら の従来技術の血清の一つ或いはそれ以上ＫｐＡしての問題点は塩、＠或いは有機 ＠媒による長い及び非選択的な沈殿が必須生育因子の除去を起こし、これにより 得られる代用血清な相対的に短時間にのみ有効とすること、即ちこれらの血清の 幾つかは、細胞生育を多くの世代に亘って支えることが小米ないことである。史 に、仔ウシ血清は仔ウシ胎児血清には存在しない多くの毒素な含有することが知 られており、それらの毒素は絶胞成長な阻害する傾向を有する。更に、仁れらの 血清の幾つかにおいて見られる欠点・とじて、ｆ１織培養において細胞生育の調 製可能な条件を与える完全な成分の＊単化が欠けていることである。

従って、活性生育成分を含有し、１ｌｌｌ胞生育阻害毒素を含まないｍｓ化され た十分に％性決定された仔つシ崩清に由来する仔ウシ胎児血清代用物に対する需 要は依然として継続して存在していると云うことができる従って本発明の目的は 、ウシ血清に由来する高効率の組織培養媒体を提供することである・本発明の他 の目的は、十分に特性決定され、生体外の動物及び植物細胞の制御された生育を 可能にする組繊培１に媒体を提供することである。

更に、本発明の他の目的は組織培養媒体の製造方法を提供することである。

更に又、本発明の目的は、本発明の培ＩＰ媒体を利用することにより生体外（ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ）の動物及び植物細胞の生育方法を提供することである。

これら及び以下の蔽明により容易に明らかとなる本発明のその他の目的は、天然 のウシ血清に由来する脂質分濃度が低（、更にウシ胎児血清と同様なグロブリン 及びアルブミン組成並びに制御されたヘモグロビン、膜包囲ウィルス、ステロイ ドホルモン、マイコプラズマ、コレステロール、トリグリセリド及び農薬を含有 する血清′４！：′！Ｍ供することにより達成される。本発明の血清は、３０ｍ ｇ／ｄ１未満の全脂質分、θ〜１０ｍｇ／ｄ１以内のコレステロール分、ＯＮ２ ０ｍｇ／ｄｉ以内のトリグリセリド分、　２０　ｍｇ／ｄ　１未満のヘモグロビ ン分、！ｊ！質的に検知不能であるマイコプラズマ分及び膜包囲ウィルス分を含 んでなることを特徴とする天然ウシ血清から由来す；二面を含んでなるものであ る。

これらの目的は又、天然ウシ血清な３０ｍｇ／ｄ１未満の脂質分濃度まで脱脂質 することを特徴とする血清の製造方法を提供することにより達成された。この方 法は又、ヘモグロビン、マイコプラズマ及び内因性ウシウィルスも減少させる。

これらの目的は又動物及び植物細胞の生体外の生育方法において該細胞を上記血 清の存在下において培養することを特徴とする方法を提供することにより達成さ れた。

図面の簡単な説明 重付図面を参照しつつ以下の詳細な記述を読むこと罠より、本発明をより完全に 理解し、また付随的効果をより完全に理解することができるであろう。象付図面 において： 第１図はクシ胎児血清（Ｆｅ２−Ｒｅｈｅｊｓ■）及び本発明の血清（「Ｚｅｔ ａＪ血清）Ｋ適応化されたマウス細胞内におけるｖＳｖの生育を比較するもので ある。

例８参照。

第２図はｙｃｓ、ウシ血清（ＣＳ）及び本発明のＺｅｔａ血清２ｏット中におけ るニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）の成長を比較するものである０例１１参照第 ３図はＦＣ８％Ｃ８及びｚｅｔａ血清２０ット中におけるＲＥＶ−Ｔで感染され たＣＥＦの生育を比較するものである。例１１参照。

第４図は１０％ＦＣＢ及び１０％ｚｅｔａ血清を補給したＲＰＭ１１６４０培地 において生育されたＣＥＦの培養液中のＲＥＶ−ムウイルスの生育を比較するも のである。例２３参照。

第５図はＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡによって刺戟されたＩジクロナール活性化 ９７２球中のＤＮＡ合成をＦｅ２及びＺｅｔａ血清中において比較するものであ る。

例２５参照。

第６図は？ジクロナール活性化９７７球中のコレステロール合成ｆｔｙｃｓ及び ｚｅｔａ血清中において比較するものである。例２６参照。

第７図はポリクロナール活性化リンΔ球中の細胞毒力価をＦｅ２及びＺｅｔ＃血 清中において比較するものである。＠１２７参照。

第８図は２５−０Ｒ−コレステロールｔｔｆｊｉ加或いは添加せずに本発明血清 中における細胞毒力価な比較するものである。例２７参照。

ｖ、９図はぼりクロナール活性化リンＡ球中における細砲毒力価をＦｅ２及びＺ ｅｔａ血清中において比較するものである６例２７参照。

８１０図及び第１１図はＺｅｔａ血清中におけるヘキナメチレンーピスーアセタ ミド（ＨＭＢＡ）ＫよるＤ８１９赤白血病細胞における分化の誘発なＨＭＢＡを 用いて及び用いずに比較するものである。例３０参照。

好ましい実施態様の説明 本発明者等は、天然のウシ血清を処理して脂質分の除去を行い、内毒素並びにそ の他の毒素、ステロイド類、ガンマ−グロブリン類、感染試薬及び低分子量の化 合物を除去すれば得られる低脂質分血清は生体外での動物及び植物細胞の培養の 際にウシ胎児血清代用物として極めて有用であることを発見した。本発明の低脂 質分、低ステロイド、低ガンマーグロブリン血清はその様な細胞に対して毒性が 低（、その様な細胞の制御された培養を負期間行うことを可能にする。

本発明において使用される「脂質」という用語は。

一般的に、血清中の水には不溶性で、アルコール及びエーテルに可溶性の構成成 分を包含する。それらには脂肪、脂肪酸、脂肪油、必須油、ワックス、ステロイ ド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質、アミノ脂質、及び色素類脂質（リイクロム ）などが含まれる。この用語は又すＩ蛋白、トリｌｖセリド並びにマイコプラズ マの脂質を含有する包皮及び膜も包含する。

本発明において用いられる「内毒素」という用語は、又「バクテリア性発熱因子 」としても知られており、バクテリアの細胞中和存在するがしかし健全なバクテ リアの増殖培養液中には存在せず、通常該バクテリアからバクテリア細胞の死に 際して自動分解くより放出される熱安定性の毒素を云う、内毒素は主として腸の 桿菌に見られるが、成る覆のグラム陰性の球菌にも見られる０円毒素は発熱性で あり毛細管浸透性を増大させ、細胞生育％にリンノ細胞に多大の影響を及ぼす、 その活性は、それらの得られるバクテリアの種類の如何を問わず実質的に同一で ある。

「殺虫剤」とは通常の各種の塩素化殺虫剤及び有機リン殺虫剤を含み、例えば１ ，２，３，４，５．６　−ヘキサクロロシクロヘキサンのα及びβ異性体、アル ドリン或いはＴＤＫ（テトラクロロジフェニルエタン）すどが挙げられる。

本発明の血清は３０ｍｇ／ｄ１未満の全脂質分、好ましくは１０ｍｇ／ｄｉ未満 、最も好ましくは全脂質分がなるべくＯｍｇ／ｄｌＫ近い程よい、高脂質水準が 望ましくないことは一般的に公知である。しかしながら、本発明においては脂質 分水準はウシ胎児血清のそれよりも減少されており、得られた物質はウシ胎児血 清代用物として思いがけず、極めて有用であることが判明した。

一般的に低脂質分である特性の他に本発明の血清は次の生化学的特徴を有する。

ａ）　コレステロールは０〜１０ｍｇ／ｄｉ、好ましくは０〜２ｍｇ／ｄｌの範 囲にある。

ｂ）　）リグリセリド類は０〜２０ｍｇ／ｄｉ、好ましくは０〜５ｍｇ／ｄｉの 範囲にある。

Ｃ）　Ｊｉ！包囲されたウシウィルス例えばＰＩ−３゜ＩＢＲ及びＢｖＤなどは 実質的に検知不可能な量で存在する［Ｍｏ１ａｎｄｅｒ、Ｃ，Ｗ、等のＩｎ　Ｖ ｉｔｒ。

７：１６８〜１７３　（１９７２年）Ｋ１載された方法ｅＣよりＩＩＩ定〕。

ｄ）　−ｒイコプラズマは実質的に検知不可能な量で存在する［Ｂａｒｉｌｅ、 Ｍ−Ｆ、等のｐｒｏｃ、Ｓｅｃ。

Ｂｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、１３８：４３２〜４３７　（１９７１年）に１載の 方法により測定］。

ｅ）　本発明の血清内のヘモグロビン含量は２０ｍｇ／ｄ１未満、好ましくは５ ｍｇ／ｄ１未満である。

これらの特性の他に本発明の血清は又次の特徴な有するＯ ｆ）　本発明の血清の蛋白質含量の好ましい電気泳動分析表は、ウシ胎児血清と 実質的に同様なアルゾミン、アルファグロブリン及びペーターグロゾリン含＊１ １！：示すがアルファーグロブリン含量は幾分より少ない量である。成牛或いは 殆んどの新生ウシの血清忙はガンマ−グロブリンが含まれるが、ウシ胎児血清に は殆んど含まれない６本発明のウシ胎児血清代用物は製造方法の際に出発物質か ら除去することにより極めて低水準のガンマ−グロブリンを含むにすぎない０本 発明の血清中の全蛋白質は３〜７ｇ／ｄｌの範囲にあればよい。アルブミンは２ −４ｇ／ｄｌの範囲で変わり得る。アルファグロブリンは２．０〜０．４ｇ７ｄ ｌの範囲にあればよい。ベータグロブリンは２．０〜０．４ｇ／ｄｌ　の範囲に あればよい、ガン！−グロブリ／は０．１〜１．０ｇ／ｄｉ、好ましくは０．０ 〜０．５ｇ／ｄｌの範囲にあればよい。

ｇ）　本発明の血清内の内毒素の範囲は２．Ｏｎｇ／ｍ１未満、好ましくはＱ、 ３ｎｇ／ｍ１　未満、最も好ましくは０．Ｉｎｇ／ｍｌ　未満である。

ｈ）　本発明の血清中の薄紫水準は通常ウシ胎児血清の正常の範囲内のものであ る。即ちアルカリホスファターゼは１００〜３００ｍｕ／ｍｌの範囲でよく、Ｇ ＧＴ　（ｒ−グルタミルトランスペプチダーぜ）は１０１０５３（ｊ／ｍｌ、８ ＧＯＴ（血清グルタミンオギザロ酢酸トランスアミナーゼ）はｌＯ〜８０ｍｕ／ ｍｌであればよい。ＬＤＨ（乳酸デヒドロギナーゼ）の含量は仔ウシの年に応じ て異り、好ましくはウシ胎児血清の正常範囲（２００〜６００ｍｕ／ｍｌ）がよ い。しかしながらＬＤＨのこれよりも高い含ｔ　２５００　ｍｕ／ｍｌまでは本 発明の血清の生育促進特性な害するものではない。

ｉ）　殺虫剤分、例えば１，２，３．４，５．６−へキサクロロシクロヘキサン のα異性体（α−ＢＨＣ）はｏ、ｘｓｐｐｍ未満であり、β−ＢＨＣは０．Ｏ５ ｐｐｍ未満であり、ｒ−ＢＨＣは０．１５ｐｐｍ未満であり、アルドリンは１． ５ｐｐｍであり、ＴＤＫは０．６ｐｐｍ未満である。

ｊ）　重金［並びに電解質は製造過程において容易に制御することができ、それ らの値は下記の表ＩＫ与えられている。

ｋ）　尿酸含量は２　ｍｇ／ｄ　１　、好ましくは０　、５　ｍｇ／ｄ！である 。

１）　コルチゾール含量は５μｇ／ｄｉ、好ましくは１βｇ／ｄ１である。フル チゾールはステロイドホルモンの代表的なものである。

表１は好ましい血清を含む本発明の血清の生化学的成分の範囲’ｋ（ａ）１才未 満の供与ウシからの天然産ｖｒｒｃ存在する同様の成分、（ｂ）新生ウシ（２棟 類の源泉）からの天然血清、及び（Ｃ）ウシ胎児血清からの天然血清と比較して 示すものである。同表は、本発明の血清においては、コレステロール及びトリグ リセリドＷＪ′ｌｔ含む全脂質分含量が％に低く、対応する天然製品と本発明の 血清とが区別されることを示している、その他の生化学的成分によっても又本発 明の血清は区別される。成る場合（即ち薄葉）において１通常の値は本発明の血 清において意図的に変化させなかったノラメーターを反映するものである。

本発明の一つ或いはそれ以上のｍ遣方法は、天然ウシ血清を脱脂質を行うと共に 又該梅漬からマイコプラズマ、ヘモグロビン並びにステロイドウィルス、ガンマ −ダロプリン及び低分子量化合物を１１１１”濃度水準まで除去することを特徴 とする。

ウシ血液からのウシ血清の調製は一般的に公知であり、従つ℃余り詳細には説明 は行わない０本発明の血清をｇＩ製するためには任意のウシの血液からの血清の 調製方法が有用である。

ウシ、好ましくは任意の性、穀物飼育成いは牧草飼育、好ましくは穀物飼育の、 好ましくは１才未満の飼育ウシを標準的な方法に従つ工採血する。飼育ウシから の血清は、その様なウシにおける通常の高脂質血症の状態により組織培養媒体と しては使用不可能と従米考えられていた。この高脂質血症は血液中の脂質水準を 通常上昇させる。本発明はしかしながら、驚くべきことに従来使用不可能と云わ れていた血清源な利用したものである。

赤血球を、例えば遠心分離によって分離する。上澄液の血漿を例えばウシのトロ ンビン及びカルシウムを添加して凝固させる。或いは又、血液を単純に凝固させ る。血清は凝固血液から濾過及び遠心分離により分離され、脱脂質並びＫその他 の製品のＮ製に役立つ工程の準備が整う。

血清の脱脂質は任意の公知の脱脂質方法或いは試薬例えばシリカ、疎水性相互作 用、硫酸デキストラ／のよ５な４リアニオン化合物、ａ［結−融解後の濾過など を用いて行うことができる。

好ましい方法は血清の発煙シリカを用いる処理であり（ｆ＋！えば米国特軒３， ６８６，３９５号明細書参照）。

回分式形態或いは固定化発煙シリカを用いて行われる。発煙シリカの締維状媒体 中の固定化は一緒に譲渡された同時継続中の１９８２年−一一−−工Ｌ９出願の ５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　「ミリミク１２ｙ径の粒子を含有する＃Ｉ維状状媒体中 に十分に説明されている、この出願は本川ＩＩ＠において十分に準用されるもの であるが、シートに発煙シリカ、線維並びに発煙シリカを凝集させるに十分な量 のＩリカチオン注及び？リアニオン性樹脂を真空フェルト化させることにより発 煙シリカ１に：Ｉａ維状マトリックス円に固定化する方法を記載するものである 。その様な固定化発煙シリカを用いることにより、率に血清を発煙シリカ含有シ ートと接触させて本発明の結果な達成することが可能となる。例えばシート状形 態のｆＩＩ維状煤状媒体盤状に切断することができる。これらの円盤な円筒状カ ラムに積重ねることが出来、非処理面ｆＩを次いでカラムを通して流す。カラム 内の円盤が少なくとも脱脂質量の発煙シリカ（或いは過剰量の発煙シリカ）を含 有するならばカラムは効率のよい迅速かつ経済的な脱脂質相装置を構成する。そ の様な方法は現在では１分式処理よりも遊離の粉末を使用することに伴５はこり １分離、生成血清の清澄化などの問題を避けることができるので好ましい。

シリカ処理を１分式形態で行う場合には１発煙シリカを血清に直接に添加するこ とが可能である０本発明において有用なシリカは市販の任意のものでよ（、特に Ａｅｒｏｓｉｌ■或いはＣａｂ−０−ａｉｌ■　として販売されているものであ る。シリカの表面積及び粒径は広範囲に変わり得るものであり１〜５０ｍの寸法 及び０．０４〜０．１２５　ｇ／ｃｃ　（２，５〜７．ｇｌｂｓ／ｆｔ”）まで の密度な有するものである。特に有効なものは表面積の高いシリカであり、好ま しくは３００ｍ／ｇを越える表面積を有するものであるが、５ＯＮ４００ｍ　” 　／　Ｈの範囲の値を有する任意の製品を使用することができる。シリカは１０ 〜１００ｇ／ｌ−血清、最も好ましくは２０〜３０ｇ／ｌ−血清の割合で添加さ れる。回分式処理においては１発煙シリカは０℃〜呈温の温度で１時間〜４８時 間、好ましくは４〜８ｑ間攪拌リカで処理する直前にカルシウム、マグネシウム 、或いはマンガンのような二価金属イオンを０．Ｏ１〜０．５Ｍの渡度範囲、好 ましくは０．０５Ｍの値Ｋｍ加することが有益である。二価金属イオンの添加は 恐らくシリカを用いた脱脂質方法を補助する機能な果すもΦ　＋！ のである。シリカ処理工程かＣａ　の存在下における凝固の直後に行われるなら ば二価金属イオンは既に存在する。回分式方＠により行う場合には、脂葭含有発 煙シリカの残存膜脂質血清からの分離は任意の公知の物理的分離方法、例えば遠 心分離、濾過、傾瀉などにより行うことができる。連続カラム方法においてはそ の様な分離は勿訣必要としない、脂質の含量は比色薄葉分析により追跡すること ができる。

シリカ処理は脂質（コレステロール及びトリグリセリドを含む）を除去するのみ ならず、又ヘモグロビン含量１ｋ　２０　ｍｇ／ｄ　１まで減少する役目を果た し、又任意の膜包囲ウィルス及びマイコプラズマの除去の役割を果たす。

通常１０，０００以上の分子ｆ９！：有するペプチドである内毒素の除去は任意 の血清から低分子量物質を除去する方法により行うことができる。その様な方法 としては透析濾過、透析、ゲル濾過クロマトグラフ、限外濾過などが挙げられる が、これらに限定されるものではない。その迅速性及び効率故に最も好ましい方 法は１０．０００の分子量の分画フィルターを有する市販の中空フィルター装置 を使用した透析濾過である。透析濾過はｐＨ範囲５〜９の血清により、０℃〜呈 温までの温度において任意の生理緩衝液系統例えばＨＥＰＥＳ、’ｌ’ｒｉｓ、 −グリセロールホスフェート、ＰＩＰＥＳ。

イミダゾール、炭酸、酢酸などを用いて行うことができる。好ましい緩衝液は酢 酸緩衝液、炭酸緩衝液である。緩衝液変化の数は所望の内毒素水準ｂ′−達成さ れるまで常法により調整することができる。これらの状況下での透析濾過は又そ の他の低分子量物質例えｉｆその他の毒素（例ＰＣＢ）、ホルモン類、殺虫剤な ども除去する。内毒素の含量は開業的に利用可能な方法を用いて容易に追跡する ことができる。最も好ましく１のを１、Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｆ形細胞溶解産物分析 法である。

ウシ胎児血清の通常の範囲のより近（にガンマ−グロブリンの含量を持ってくる ように低含量のガンマーグロブリｙを含有する血清を製造したｔへ場合Ｋ　ｔ’ ！　、これらのグロブリンは標準的塩析工程により容易に血清から分離すること ができる。これらの塩析工程は公知であり、例えば米国％ＦＦ３，１２８，２２ ８号明細書ＩＥ１％は米国特ｌＦＦ３，４２９，８６７号明細書中に記載されて −する。グロブリンを沈澱させろことのできる任意の塩を本発明において使用す ることが出来、例えば硫鈑アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウムなどカ ー挙げられ、好ましくは硫酸ナトリウムが用いられる。沈澱は２５℃において塩 を徐々に血清の攪拌溶液に処方量の塩になるまで添加することにより行われるＯ グロブリン含量を低下させるために蚤１、硫酸アンモニウムな痩和量の２０％〜 ３５％或いは９〜１６％（Ｗ／マ）。

好ましくは１２％の硫酸ナトリウムをｐＨが７〜８の範囲に調整された血清に添 加することが好ましい、塩が完全に溶解された後、溶液を２４〜４８時間放置し 、沈澱した蛋白質を濾過又は遠心分離によって分離する。塩添加及び蛋白質沈＃ 後上澄液中に溶存している塩な除去することが好ましい、これは通常透析、透析 濾過、ゲル濾過その他の任意の公知の方法（より行われる。

プロセスに蛋白質の塩分別が含まれる場合には、これらの任意の方法による上澄 液からの塩分離は、又内毒素並びに殺曵剤、ホルモン類などの分離の工程として も又役立つものである。即ち、その様な操作態様において内毒素除去及び塩除去 を一工程に合一して行わせることが可能である。

血清の更に別の精製工程はステロイド類、ホルモン類並びにその他の毒生成物を 除去するための活性炭による処理である。活性炭という用語は木材由米或いは褐 炭白米の活性炭を包含するものである。この工程においては、通常の塩濃度を有 する血清を用いて行うことが重要である。即ち、塩分側工程がこの方法に含まれ る場合には、活性縦処理紡に塩を透析或いは透析濾過により除去する必要がある 。血清の活性炭処理は回分式Ｗ−或いは活性炭なフィルターマット或いはＡット に固定することにより行うことができる。Ｉ１ｇＩ分式に行う場合には、活性炭 を十分Ｋｍ拌された血清試料に２０〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５０−１００ｇ ／ｌの範囲、最も好ましくは７０ｇ／ｌｒＣ添加する。活性炭含有血清は１時間 Ｓ４８時間、０℃〜呈温和おいて攪拌することができる。ｐＨは５〜１０．５の 範囲ＶＣＩＩＩＩ整されるべきである。沈澱後、透明な血清が上澄液（得られる ことを攪拌して遠心分離或いは濾過により活性炭を分離する。

活性炭をマット或いはパッド内に固定する場合には、これらを円筒状カラム九光 填し、血清を年に過当な速度でその中を流せばよい。これは連続方法な可能にす るものである。物理的に８末活性炭をフィルターパッドに捕集した活性炭含有マ ットを使用することができる。約ＩＡツド／１（７０〜２００ｇ活性炭／パッド ）を血清の繰返し：ｊ！ｉ過サイクサイクル使用する連続方法が回分式方法より も好ましい。

本発明の最も高度に精製された血清は出発血清を脱脂質し、塩分別を行い、透析 ν過酸いは透析な行い活性炭処理を行い、かつ熱不活性化を行ったものである。

これらの工程は任意の順序で行うことが出来るが。

但し、塩分別の後罠は常に上澄液からの塩イオンの除去を行わなければならない 。

５０〜６０℃における約２０Ｓ４０分間の熱不活性化は血清の毒性を低下させる 。これは多くの毒性血清成分１例えば補助蛋白質が比較的低温において不活性化 されるためにおこるものである。一つの最終処置として、本発明の血清中の蛋白 質含量を過当な渉ａ＋＊いは稀釈により３〜７　ｇ／ｄ　１　、好ましくは約５ ｇ／ｄｉの所望１？１１１１１範囲１’ｃｌｉｌ整することができる。同時に電 解質分（Ｋ”、Ｎａ＋など）を任意の所望含量に調整することができる。好まし くはそれらはそれぞれ次の範囲（設定される＊　（Ｎａ”）＝１００〜２００ｍ ｅｑ／１゜（Ｋ＋）　＝　１〜２０　ｍｅｑ／１　、　［Ｃａ”］　＝　１〜５ ｍｅｑ／ｌ、最も好ましくは、これらの値は［Ｎａ”）〜１５０ｍｅｑ／１　、 ［Ｋ＋］＝５−６ｍｅｑ／ｌ、［Ｃａ”］＝３〜４ｍｅｑ／ｌである。ｐＨは６ 〜８．好ましくは７．５ｔＣｍ整される。

もう一つの最終処置は血清の例えば殺ＩＮ濾過による殺菌である。これは汚染物 質として存在する如何なるバクテリアも除去するものである。バクテリア含量は これ罠より米国薬局方標準第２１巻の分析法により検出不能となる。

これらの条件下に本発明の梅漬は、１！１．（限なく凍結成いは凍結乾燥されて も安定である。

本発明の方法の異った選択された段階で調製された個々の血清は勿論最良の、最 ７％に精製された血清’に調製する中間体として有用であることは勿論である。

本発明の血清はウシ胎児血清が使われてきた或いは使われているあらゆる用途に おいて有用である。それは又本発明において準用する上記）（ａｍ、Ｒ，Ｇ、及 びＭｃＫｅｅｈａｍ　Ｗ、Ｌ、の著書に示されるようなその他の当該技術分野の その他の生育媒体の代りに用いることも可能である。通常血清の細胞培養媒体中 の値は２〜２０容量％、最も好ましくは約１０％である。用途としては単層培養 、懸濁培養及びクロナール培養などが含まれる。最も重要な用途は生体外（ｓｎ 　ｖｉｔｒ。

）の動物細胞の組織培養の栄養源としての用途である、本発明の培養媒体中にお いては数多くの異った細胞系を生育することが出来、細胞の生育方法は如何なる 特別の細胞系に限定されるものではない。テえば１本発明の血清を用いて通常の 或いは形質転換された細胞及びウィルス産生細胞を生育することが出来る。細胞 系の具体例としては中国＾ムスター卵巣、！ウス。

３丁３．ひよこ胚線維芽細胞、あひる胚線維芽細胞。

ヒト包皮、サル腎臓、シリアハムスター腎臓、ヒヒ腎臓、マウス繊維芽細胞、Ｂ ＩＩＩＫ、ＢＧＭ％ＲＤ％ＤＩ’ｒ５５０　、Ｗ２Ｂ５．ＨｅＬａ、　マウスリ ンパ細胞、Ｐ８１５大赤血球ガｙ、Ｄｓｉ９赤白血病などが挙げられる。

これらの細胞系は二つの広い範−に分類することかできる。第一のものは、無限 に生育することのできる細胞系である。それらは通常形質転換或いは腫１ｌＩＩ Ｉｌ胞である。第二のものは永久には生育することのできない細胞である。これ らの細胞はむしろ正常な組織により近似するものである。

本発明の血清は、牌臓細胞及び骨髄種の一合から得られ、通常モノクロナール抗 体の製造に使用される動物及びヒト起源のバイブリド−１の生育に応用すること が可能である。その様な融合細胞系は、例えばＫｏｈｌｅｒ等のＮａｔｕｒｅ　 ２５６：４９５〜４９７（１９７５年）或いは米国特許４，１７２，１２４及び ４．１９６，２６５号各明１Ｉｌ１畳参照。

本発明の血清の特徴の一つは成る株の細胞の種類がより低い代謝及び生育速度の ため［Ｆｅ２中よりもより容易に維持されることである。これは長期間の細胞の 維持が望ましい場合、例えばウィルス診断などにおいてｒ＃に有利である。ステ ロイド類例えばニス）ｏゲンの制御された含量は、本発明の血清を天然の血清製 品においては広範ｔｃ変化する生育速度を示すエストロゲン依存の乳房Ｉｉ擾細 胞の生育に対して極めて有用なものとする。

本発明の血清はそれ自体で使用することもでき（「非スノイク」血清）或いは天 然のウシ胎児血清、天然の新生仔つシ血清或いはその他の任意の従来技術の組織 培養媒体或いは生育因子と組合わせて使用することもできる。特に好ましいのは １本発明の血清と天然ウシ胎児血清との組合せ（「スパイク」血清）である。

その様な混合物においては、本発明の血清は混合液容量の１〜９９％、及びウシ 胎児血清は９９〜１％で存在し得る。好ましいものはＦｅ２の量が得られた混合 物の機能的生育特性が対象とする特別の細胞系に応じてウシ胎児血清のそれと近 似するような混合物である。最も好ましいものは、本発明の血清が、全混合物の ５０〜９８％で存在し、Ｆｅ２が２−５０容愈％で存在するものであり、％ＫＦ Ｃ８が５〜１０容量％で存在するものである。その様な混合物の使用は、それが ニストナ減少させ、本発明の血清の有用性の範囲を拡張する点において有利であ る。本発明の血清は又合成媒体及び合成生育因子と組合わせることも可能である ％に、リン２球或いは白血球型細胞（Ｔａ胞、細胞分裂誘起剤分析物、ハイブリ ドーマなど）なとの生育は非スパイク向清を用いて行うのが好ましいのに対し、 その他の細胞培養例えばウィルス産生成いは一般的細胞生育には、好ましくはス Ａイク血ｉｗを用いて行われる。

細胞を生体外においｃ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）生育する場合には、これらの細胞は 定期的に洗浄して代謝廃物を除去しなければならない。あらゆる必要な条件が満 足された場合には、継続的或いは形質転換された細胞が一定の速度で何年も生育 し、分裂することが可能であり、組繊細胞が取出された動物或いは植物が通常死 亡した長年月の後にも生存可能であり、十分に活気を有することも可能である（ 例えばａｔｅ＠ｅ　＠Ｃｅ目Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ”第３版１９６８年６００− ６０１参照）。

以上１本発明を一般的に説明したが、以下に具体例に従って本発明を説明する。

これらは例示のために示したものであり、本発明の範囲を限定するものではない ｊ Ｌ　ウシの血液は約１才の飼育仔ウシを殺して集めたλ　血液はＢｅｃｋｍａｎ 　Ｊ６遠心分離器内において１１のポリカー−ネート容器内で４２００ＲＰＭＸ ４５分で遠心分離した。

１　上澄液を吸引分離し、プールし、８０００ＲＰＭの連続フロー遠心分離器を 通過させた。

４、上澄液を攪拌混合し、３０ｇ／ｌの発煙シリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ■）を添加 し、２時間濱合し４℃において一晩沈澱させた。

５゜　上澄液を威出し、乾燥硫酸ナトリウムを１２％Ｗ／マ（１２０ｇ／ｌ）添 加した。混合物１に：４時間攪拌し、２５℃において一晩沈澱させた。

６、混合物を連続フロー遠心分離器内において８０００ＲＰＭで回転させ、微細 孔フィルター１＆！を通して沖過した。

７、　清澄化された物質なムｍ１ｃｏｎ　ＤＣ−３０透析許過装置を用いて透析 濾過させた。４容の水の後１ｃ８容の透析溶液を用いた。

８、透析濾過後に蛋白質含量は約４−ＯＫ／１００ｍ１に−整され、血清を活性 炭を含浸したフィルターオツドで構成されたカラムを通過させた。２サイクル後 に血清を集め蛋白質１に５．０　ｇ／１００ｍ１Ｎ：ｌｌＩ整した９、血清１０ ．２ｍの微細孔（ｚｅｔａｐｏｒｅ■）フィルターを通過させて殺菌濾過し瓶詰 した０１０、血清な５６℃（おいて３０分間加熱不活性化し、次いで凍結保存し た。

ｆｌ＋　１からの血清の生化学的１［Ｉｆｔ表２に示す。この表は又米国特Ｆ３ ９４２９，８６７号明細＠に従って調製された「ＡｇａｍｍａＪ血清の生化学的 分析も示す。

例　２ 大きなセルロース繊維（＋４００−＋８００Ｃ８Ｆ）を水スラリー上に１％固形 分に分散した６分散完結後。

短繊維化セルロース繊維（＋４０〜−１０　Ｃ３Ｆ）を３．５％のコンシスチン シーまでスラリーに添加した。

これに引続いて発煙シリカ（ムｅｒｏｓｉｌ　３８０■、７ミリミクロン）、ア ニオン性重合体、比較的径の大きいシリカ（例えばｇｉｐｅｒす”　２２＠）及 びカチオン性重合体を添加した。

各添加段階において十分１．撹拌及び混合が行われた。涜合物を１００メツシユ スクリーンの真空形成ピットを通してＩンゾ送りし、真空適用時にフィルターパ ッドを形成して水を傾瀉分離した。真空適用後にポット内の水の消失するに必襞 な時間をフェルト化時間と定義する。スラリー内の粒径が小さければ小さい程フ ィルターパッドを形成するフェルト化時間が長くなる。表３に示すように二種の フィルターを調製した。

表　３ ≠１　≠２ 大セルロースＣｏｈｏ繊維　２０　％　２０　％短做細片　１０　％　１０　％ Ａｅｒｏｉｉ１３８０■　３５　％　３５　％５ｉｐｅｒｎｅｔ　２２■　３５ ％３５％ぼりカップ１８８４■樹脂　１．０％　１．０％ぎりスチレンスルホン 酸１．０％　− ポリアクリル酸　−２，０％ ５００ｍｇ／ｄｌの脂質含量を有する未濾過ヒト血清を連続的に複数のフィルタ ー１及び複数のフィルター２を通して濾過し、脂質濃度の減少％を脂質分除去の ％で表わして表４に示す。

表　４ １　１０　１５　７．２　１．６　１０　３０　８７１５　７５ ５ ２０　１７０ ０ ２５　３００ ０ ２　１８　８　６．２　０Ｊ　２０　２０　６０２６　５０ ５ ３０　７５ ９ この結果は固定化発煙シリカを用いて多量の血清が迅速且つ効率よく脱脂質され ることを示す。

四種の哺乳動物及び二株の鳥類の細胞系を平行して、（ａ）ウシ胎児血清（ＦＣ Ｂ）（市販品）ｆｔ補給したＤｕｌｂｅｃｃｏの変成Ｅａｇｌｅ培地（にｊｂｃ ｏ）及び（ｂ）例１の高度に精製した血清中において培養した。

例１の血清がニワトリ胚繊維芽細胞の増殖を支持する効率も又ウシ胎児血清のそ れと比較した０倍増時間。

飽和密度及び継代数は全ての場合について一比教した。

結果を表５に示す。

！！５ 細　胞　系　胎児崩潰＋１１ｆｌｌｌの血清３Ｔ３マウス胚 倍増時間（時間砂）　２６　２６ 倍増時間　１４　１５ ＢＧＭＡツ７アローミドリデル腎臓 倍増時間　１７　１７ Ｒ，Ｄ、横紋筋肉腫、ヒトの胚 継代数　＞１００　５ 飽和密度　５Ｘ１０″　４Ｘ１０’ 倍増時間　１８　１８ 飽和密度　３．３Ｘ１０　３．２Ｘ１０’継代数　＞Ｚｏｏ　８ 飽和密度　３．８Ｘ１０　３．５Ｘ１０’倍増時間　１４　１６ 表５（つづき） 倍増時間　２４　２７ これらの結果は、本発明の血清が各株異った１８砲の培養に適していることを示 す。

中国ハムスターの卵巣細胞を７５ｍｍプラスチック製細胞培養板に３００細胞軟 ／板で平板培養した。培養７日後に巨視的なコロニー数を勘定した。この試験は 一般的に細胞培養分析の最も説得力のあるものの一つと考えられている。

結果を表６に示す。

表　６ ＰＣＢ、１０％　１００　％ ｆｌｌｌの血清、１０％　９５　％ 例１の血清、９％十ＦＣ８，１％　９５　％ＦＣＢ、１０％　１００　％ ＦＣ８，５％　８８．６％ 例１の血清、１０％　８６．５％ ｆｉｌｌの血清、　５％　８４．０％ これらの結果は、本発明の精製梅漬がその細胞培養支持能力においてＦＣＢと同 様であることを示す。

１０％ＦＣ８中で生育されたＢ（、ＭＫｆｌ胞同の（：ｏｘｓａｃｋｉ　Ｂ３ウ ィルスを例１の１０％血清中で生育されたそれと対比して滴定した。いずれの血 清中における生育後においてもウィルスの収率に差は見られハイブリドーマＰ− ３担体細胞は例１の血清内で首尾よく生育された。細胞数倍増時間、飽和密度及 び細胞形態はＦＣＢ及び例１の血清において共に実質的に同等であった。

ｆｉｌ７ ！ウス繊維芽細胞インターフェロン（ベータ型）及びマウス免疫インターフェロ ン（ガン−ｆｆＪｉ）の誘発及び分析：Ｒｅｈｅｉｓ＠　ウシ胎児血清と本発明 の血清との比較。

Ａ、方法１．　−ｒウス繊維芽細胞におけるインターフェロンの誘発 ネズミ繊維芽細砲の継続系であるＬ−９２９細胞なＲｅｈｅｉｓ＠　ウシ胎児血 清或いは本発明の血清（例１）Ｋおける生育を適応化させるためにこの細胞をこ れらの血清を補給したＲＰＭＩ　１６４０培地中において６継代（はぼ６０回の 細胞倍増）生育を行った。マウス繊維芽細胞インターフェロンをこれらの適応化 された細胞内において強力なインターフェロン誘発剤である合成二本鎖ポリヌク レオチド重合体であるポリイノシン酸：ぼりシチジル酸複合体（／すＩ　：Ｃ） を用いて公知方法（Ｓｔｒａｕｂ、Ｇａｒｒｙ　ａｎｄ　ＭｃＧｅｅ。

１９７４、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１０ニア８３−７ ９２　；　Ｇａｒｒｙ　ａｎｄ　Ｗａｉｔｅ、１９７９゜ＶｉｒｏｌｏｇＹ　９ ６：１２０−１２８）Ｋより誘発した。簡単に述べると、１００ｐｇ／ｍｌのポ リＩ：Ｃ′ＩｋＲｅｈｅｉｌ■或いはｆｉｌ　１の血清のいずれかに適応化され たＬ−９２９縁給芽細胞の培養液に一添加した。１時間１合体の吸着の後、細胞 を十分に洗浄し、培養物内の媒体を置換した。インターフェロン産生に最適な時 間である８時間収穫を行った。マウス繊維芽細胞インター７エａンはｐＨ２にお いて４℃で２日間処即した。

２　マウス免疫インターフェロン（ガンマ型インマウス免疫インターフェロンは マウス牌臓細胞円において、公知技術によって誘発された。簡単に述べると、マ ウスの牌臓細胞は頚椎脱臼により殺してマウスカラ得り、９７２球を赤血球から Ｆｉｃｏｌ−ｈｙｐａｑ−ｕｅ上で密度遠心分離により分離した。免疫型マウス インターフェロンを１＊ｇ／ｍｌのファイトへマグルチ二）−〇（Ｓｉｇｍ＋１ ）を用いて＃５発した。インターフェロンは誘発後４時間収穫した０ ３、Ｒｅｈｅｉｓ■或いは例１の血清く適応化されたマウス細胞上のネズミイン ターフェロンのプラーク減少分析 マウス繊維芽細胞及び免疫インターフェロンナ椋準的ウィルスプラーク減少分析 により分析した。簡単に述べると、インターフェロン試料の稀釈液（ＬＯｇ３） をＲｅｈｅｉｓ＠血清或いはｆｌｌｌの血清の両名に適応化されたＩ、＝９２９ 細胞の融合性単層に添加した。インターフェロンを１時間結合の後、媒体を培養 液に添加し、史に８時間インキュベートさせてインターフェロン−′ｔｊ発抗ウ ィつス状Ｉｌｔ確立した。この時点において培養液に水痘性口内炎ウィルス（Ｖ ＳＶ−インディアナ株）を作用させ、次いで０．９％Ｂａｃｔｏ寒天及び１Ｌｅ ｈｅｉｓ■或いはｆｌｌ　１の血清を補給したＲＰＭＩ１６４０培地を重層した 。プラークは４８時間後赤色染料で対比染色することにより視覚化された。イン ターフェロンの一単位はｖＳｖのプラーク数を５０％減少させるのに必要なイン ター７二ロンの量と定義される。

Ｂ、結果 Ｒｅｈｅｉｓ■或いはｆｉｌｌの血清に適応化されたマウス細胞のインターフェ ロンの誘発及び分析の比較の結果を表７に示す。

免役インタ　マウス牌ａｉｉ細胞　２９７率位Ａ４　３３０単位／―Ｃ０結論 本発明の血清はマウス繊維芽細胞の誘発を支持する点においてＲｅｈｅｉｓ■の ウシ胎児血清と同等である。本発明の血清はマウス峻維芽細胞或いは免疫型のイ ンターフェロンの分析においてＲｅｈｅｉｓ＠のウシ胎児血清と同等である。

例　８ Ｒｅｈｅｉｓ■ウシ胎児血清或いは本発明の血清に適応化されたマウス細胞にお けるｖＳｖの生育速度の比較 ＾、方法 Ｌ　Ｒｅｈｅｉｓ■ウシ胎児血清或いは例１の血清のいずれかを補給したＲＰＭ Ｉ培地に適応化されたＬ−９２９細胞の培養液にｖＳｖを０．０１プラ一ク形成 率位／細胞の感染乗数で感染させた。ウィルス′１ｋ１ｗ８間吸着後細胞を十分 に洗浄し、培養液４Ｒｅｈｅｉｓ＠或いは例１の血清で補給したＲＰＭＩで置換 した。ウィルスを１時間間隔で試料採取し、培地を新たな培地で置換した。ウィ ルスなＬ−９２９細胞上で上記の如く（Ｇａｒｒｙ　ａｎｄ　Ｗａｉｔｅ、１９ ７９年）胸定した。

簡単に述べれば、ウィルスを含有する試料を稀釈した（　Ｌｏｇｌ（１）。稀釈 試料１に：Ｌ−９２９細胞の率廣に添加した。１時間ウィルスを吸Ｎ後培養液を ウシ血清及び０．９％Ｂａｃｔｏ　寒天で補給したＲＰＭＩ培地ｆｔ重層した。

Ｂ、結果 ｇｅｈｅｉｓ■ウシ胎児血清或いは例１の血清を含有する培地中で培養したＬ− ２９２ｊｉＩ１１胞内におけるｖＳｖの生育速度を第１図に示す。

Ｃ０結論 Ｒｅｈｅｉｓ＠　ウシ胎児血清或いは本発明の血清で補給された培地中で生育さ れたＬ−２９２細胞中のｖｓｖの生育速度は区別が不可能である。

ｌ１９ 本発明の血清とウシ血清（Ｋ暑ｎ５ａｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｍｌ）　との細胞分 裂誘起剤分析における比較二匹の生後４ケ月のマウスな頚椎脱臼により殺した、 これらのＳ臓を取出し、ザムの先端の付いた注射器で小メツシユ篩な通してすり つぶし、５％ウシ血清（ＣＢ−ＫＣＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）或いは５％の例１の 血清を有するＲＰＭＩＣ１％ｐｅｎ一連鎖球菌、０．５％真菌領域）Ｋ入れた。

細胞は１２００ｒｐｍで１０分間洗浄した。それらは稀釈し、数ｔ−数え１ｍｌ のアリコー）と１．て１２Ｘ７５ｍｍのチューブに分散させた。二稚の異った細 胞量につい℃試ｋを行った（１０　及び４　Ｘ　１０　’　）　＊ファイトへマ グルチニン−Ａ　（ＰＨＡ）を４ｍの培養液に添加した。２個の培養液は対照例 とした。三重の異ったＰＨＡ濃度を試験した（１．２．５及び５　ｔｔ　ｌ　／ ｍ　１　）　＊培養液を次いで４８時間反応させ、その後０．１ｍ１（２声ｃｔ ）の三重水素含有チミジンな各チューブに添加した。２３時間Ａルス後、細胞な 激しく攪拌してガラス繊維フィルター上罠注加した。チューブは二回培地で洗浄 した。フィルターは二回６％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）及び二回エタノールで洗 浄してＢｒａｙ　ｔｎ＠液と共にシンチレーション容器内でシンチレーションカ ウンターで計数測定を行った。結果を表８に示す。

表　８ ＣＢ（ＫａｎｓａｓＢｉｏｌ）　１，８６９±　６４７　８３３士　辺例１の血 清　９，５４８±　６１６　３．２１８士謳＋２＋　４Ｘ１０　ｍ胸、５Ｊ１屑 Ｉ　ＰＨＡｃ　８　５０，３９８±１４．１２０　６．４２７±１，１１４−１ の血清　４２，０９７±５．２１８　２０，８２５±　７１１ＣＢ　３，５４９ ±　９７０　９８９士　諺例１の血清　１５，０６２±３．１２４　２．５７４ ±４２８１４１　４Ｘ１０　細胞、　２，５Ｊ１１ＡＩ　ＰＥＡＣＢ　５６，３ ３Ｈ＝　３．２４３　７．４９２±７６０Ｃ８１，８９３±　４３２　９８３士 　亦例１の血清　１１，９３０±４．７１２　２．７４６±　７５５（６）　４ ｘｌＯＰＡＤ、　Ｉ　ＪＩＩＡＩＩ　ＰＥＡＣＢ　３０，４１９±９．０２ｆｔ 　６，４６４ｆ　３５９１１１の血清　３９，２３３±１４．３７２　２１．５ ８１±（３）結論 本発明の血清はウシ血清の品質と相対的に−ｅｒウスの牌臓すンＡ球のＰＨＡＫ 対応する能力′１に実質的に増強細網組織症ウィルス（ＲＥＶ−〒）ｒ！る未熟 リンΔ９１１の血清　Ｆｅ２ 箭　照　ｆｌ　５１４±　１１コロニー／板　２１２±　６２コロニｉ／板１ｘ ウイルスストツク　４９６±１３６；ｉロニ〒／板　３５３±　１９コロニー／ 板１／１５Ｘウイルスストツク　５４７±　２４コロニー／板　３６７±　７３ コロニー／板非ウィルス−処即の対照例の板上においては多数の巨視的コロニー が見られたために１ｆＬｌｋ：顕微鏡により調べて真の形質転換コロニーの％な めた。表１０には真の形質転換体の数を反映するように補正が行われている。

表　１０ 対照−〇十〇 ！×ウィルスストック　４０コロニー／板　５３コロニー／板十　真の形質転換 体／１０７　牌臓細胞に対する補正＝巨視的コロニーの数Ｘ各稀釈液に対する真 の形質転換体のコロニー数％ 対照板の両セットは多数の巨視的コロニーを含有するのが見られるのく対し、Ｒ ｅｈｅｉｓ＠の対照板に見られるコロニーｔｔＲＥＶ−丁形質転換クローンから は巨視的に容易に区別することのできる非増殖性細胞の塊であった。これに対し て１本発明の対照板上に見られる巨視的コロニーはマクｏ７アージ／顆粒球ＣＰ Ｕのそれに類似した増殖性細胞よりなるものであった。これらのコロニーは太き （、ＲＥＶ−形質転換クローンから巨視的に区別することが困難であった。更に 、これらのマクロファージ／顆粒球用コロニーはＲＥＶ−形質転換クローンの増 殖を阻害した。従って、このコロニー−刺戟性活性は本発明の血清を造血起源の 細胞を用いる生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）形質転換分析には不適当なものとする 。

本発明の血清はｇｅｈｅｔｓ＠の血清よりもはるかに有効な正常なマクロファー ジの生育を促進するようである。ウシ血清はしばしば本発明の血清から除去され たマクロファージ生育の阻害剤（リポプロティン類）を含有する。しかしながら 、これらのマクロ７了−ジの過度の成長は造血性細胞転換の分析をよりｌ！ｌＩ 難にする。形質転換体の通常のコロニーから区別するためには顕微鏡によるコロ ニーの検査が必要である。本発明の血清な用いてマクロファージ培養液の確立を 容易和することが可能であろう。

本発明の血清、１ｅｈｅｉｓ■ウシ胎児血清及びＫａｎｓａｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌウシ血清の細胞血清を支本発明の血清の生育及び維持の潜在能力を試験す るために下記の細胞系を二次培養した： ３丁　−胚、！ウス ＢＢＫ−腎臓、シリア或いはザールデンハムスターＢＧＭ−メツ７アローンドリ ザル腎臓 ＲＤ　−横紋筋肉職、胚、ヒト ＤＥＴ５５０−　皮膚、ヒト Ｗ２Ｂ５−肺、二倍体、ヒト Ｈｅ　ＬＡ−上皮ガン、頚部、ヒト ニワトリ胚ｔｌＩ維芽細胞（ＣＥＦ）も又二次培養を行い維持された。更に、細 網組織症ウィルスにより形質転換されたＣＥＦ及び鳥の造血細胞の試験も行った 。

−べられた生育及び給持ノラメータは継代数、世代時間、ヤ和密度及び細胞の生 育力であった。

全ての細胞系は１０％の血清を補給されたＤｏ　ｌ　ｂ−ｅｃｃｏ　の変成Ｅａ ｇｌｅ培ｆｉ（ＤＭＥ）を用い″Ｃ２５週間に亘ってはぼ２週間に一回継代培養 を行った。

例　１１ ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＩＦ）、培地：　Ｄｕｌｂｅ−ｃｃｏの変成］ｉ：ａ ｇｌｅ（ＤＭＩ：）（Ｆｌｏｗ　ｊｍｂ）試験： １）初代のＣＥＦはＢｏｓｅ　＆　Ｌｅｖｉｎｅ（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、６：１１１７〜１１２１）の操作に従って１０日口の５ＰＡＦム８ の胚から調整した。初代のＣＥＦは常法に従って最初の平板作製後３日後に継代 培養を行い、その後隔日継代培養な行った。各々の継代に際して細胞はｌフラス コから２フラスコ（分裂した（１：２分裂）。

２）ＣＥＦを又監視して本発明の血清（ｆｌ！１）維持潜在能力を分析した。Ｃ ＩＣＦの二次細胞を５％而面を補給したＤＭＥを用いて２日毎に栄養供給？行っ た。このスケジュールは細胞が死ぬまで保たれた。ＷＡ微鏡検棄及びトリパンゾ ル−排除を生育力のＡラメ−ターとして使用した。

３）細網組織症ウィルス（ＲＥＶ−Ｔ）で感染されたＣＥＦの二次細胞を１０％ 血清で補給されたＤＭＥｌに用いて２日毎に継代培養を行った。

１！　１１ 本　発　明 （ｂ）＋細胞１＋／３ｋ”　２．９　ＸＩＯ’　２．９　ＸＩＯ’　２．９　Ｘ ＩＯ’　２．９　ＸＩＯ’１８時間　３．７５Ｘ１０’　２．６　ＸＩＧ’　３ ．３　ＸＩＯ’　２．９　ＸＩＯ’４０時間　６．２５Ｘ１０’　４．７　ＸＩ Ｏ’　５．５　ＸＩＯ’　４．８　ＸＩＧ’４８時間　７．３　ＸＩＯ’　５． ７　ＸＩＯ’　６．８　ＸＩＯ’　５．７　ＸＩＯ’７２ｗ＃間　Ｉ　ＸＩＯ’ 　９　ＸＩＧ’　９　ＸＩＯ’　９　ＸＩＯ’新鮮な培地な添加。しかし細胞は 継代培養せず１２０時間　１．８２Ｘ１０’　１．１４Ｘ１０’　１．３３Ｘ１ ０’　１．２５Ｘ１０’表　１２ 本　発　明 Ｆｅ２　Ｃ８ロットナ１　ロット＋２ １−０　３　ＸＩＯ’　３　ＸＩＯ’　３　ＸＩＯ’　３　ＸＩＯ’ｔ　−１８ ２，８Ｘ１０’　２．ｌＸ１０’　２．３Ｘ１０’　２．５　ＸＩＯ’感染有／ ＲＥＶ−Ｔ ｔ−２２４３，５Ｘ１０’　２−５Ｘ１０’　２．７Ｘ１０’　３．ＯＸＩＯ’ ｔａ　４８　６　ＸＩＯ’　３．４Ｘ１０’　４　ＸＩＯ’　４．５Ｘ１０’７ ２　１．２Ｘ１０’　５　ＸＩＯ’　６　ＸＩＯ’　７　ＸＩＯ’ノ培地 ９６　２．５Ｘ１０’　３　ＸＩＯ’　８５Ｘ１０’　Ｉ　ＸＩＯ’１２０　３ ．２Ｘ１０’　１．０Ｘ１０’　１．８０Ｘ１０’−−１，０Ｘ１０’　６　ｘ ｌＯ’ 継代培養数≠　３５　２　１１　１２ 平拘倍増時間　２４　ＮＡ　７２　６０結果はＨ！１１．１２に示す。

１）本発明の血清内で継代培養されたＣＥＦは健康であり８〜９ｔＩ！Ｆ代まで 分裂する。この時点において細胞は顆粒化したようであり、２０％未満しか次の 代に付随しなかった。＊際に付随した細胞も殆んど分裂せず３０時間に全ての細 胞は死亡した。Ｒｅｈｅｉｓ［相］のウシ胎児血清で継代培養したＩａ砲は本発 明の血清を用いた場合の細胞と同様の病態で衰退するＩＩＩ＃１ｃ１１継代まで 発育能力を有した。ウシ血清な補給した培地中においてはＣＥＰはわずかに５Ｓ ６世代継代培養されたにすぎなかった（＠２図）。

２）ＣＫＦ二次細胞は単層剥離前に１２−１４日間健康（非顆粒化、付着及び生 育能カ有り）Ｊ！Ｌ層として維持され、残存した。Ｒｅｈｅｉｓ＠　ウシ胎児血 清中に維持された細胞は剥離前に４Ｎ５日間健康であった。ウシ血清中で維持さ れた細胞は１４〜１５日間生存した３）ＲＥＶ−Ｔで感染されたＣＥＦ二次細胞 は形質転換され（５日間において細胞形態の変化が見られ世代時間、飽和密度が 変化）、かつ本発明の血清を用いて１２継代にわたって継代培養な行うことが可 能であった。

ウシ血清はＲＥＶ−〒＃ＣよるＣＥＦ二次培養の形質転換な支持するが、しかし 、形質転換細胞の２継代ｔｌ−越える生育要件を満足させない。

Ｒｅｈｅｊｓ■クシ胎児血清は形質転換及び細胞生育及び分裂を３５継代まで支 持する（第３図）・【 進する能力においてウシ血清よりもはるかに性能が良好であり、健康な単層を維 持する能力において同等である。ウシ胎児血清と比較すると本発明の血清は、細 胞生育及び分裂の促進においてはわずかに劣るものの健康な単層の維持は２倍も 長く維持した。Ｆｅ２はＣＥ？ｆ刺戟して融合点を越える分裂を起こした結果、 単層の応力及び剥離を生じたものである。

形質転換績維芽＃砲は多くの増大した生育要請を有するものである。ウシ血清は これらの細胞の生育及び分裂を維持することができない。本発明の血清は１２継 代を通じてのＲＥＶ−Ｔ形質転換繊維芽細胞及びほぼ４０ｗ＃間の世代時間を維 持した。ウシ胎児血清はこれらの細胞１３５１！代にわたりはぼ２４時間の世代 時間をもって支持する。

ＲｌＶ−Ｔ　（細網組織症ウィルス）で形質転換された鳥牌臓細胞の二種類のク ローンを本発明の血清を補給したＤＭＥ中で培養した。ウシ胎児血清も又比較対 照−として用いた。クローニング動車も又試験した。

結果 ＫＢＭＣ及びＣ４す１は共に本発明の血清ＤＭＣ中で良好に生育した０両クロー ン共にこの血清中において１００回を越える倍増を行い、何等の不燵康の徴候を 示さなかった。

本発明の血清 本発明の血清はＲＥＶ−Ｔ形質転換細胞細胞の成長を倍増時間、飽和密度及びク ローニング動車くおいて極めて僅かの減少をもって支持する。

例　１３ ＫＢＭＣのＲＥＶ−〒形質転換ニワトリ骨髄細胞を生育したー結果は表１３に示 す、培養媒体：ｌｏ％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）、ウシ血＊（Ｃ８）或いは本発明 の血清を禍給したＲＰＭＩ　１６４０゜ ！！１３ 本　発　明 １２ｑＭ　３．２Ｘ１０’　２．５Ｘ１０’　３．０Ｘ１０”　３．０Ｘ１０’ ２４時間　６　ＸＩＯ’　５　ＸＩＯ’　５．５Ｘ１０’　５・７　Ｘ　１０’ ３６時間　Ｉ　ＸＩＯ’　８　ＸＩＯ’　９　ＸＩＯ’　Ｉ　ＸＪＯ’６０時間 　３．２Ｘ１０’　２．０Ｘ１０’　３．ｌＸ１０’　３．２Ｘ１０’Δ培地 ７２時間　３．８Ｘ１０’　３．２Ｘ１０’　３．５Ｘ１０’　３．６Ｘ１０’ 継代培養数　＞　Ｚｏｏ　＞　Ｚｏｏ　＞　１００　＞　１００Ｃｔ＋１のＲＥ Ｖ−Ｔ形質転換細胞）　ＩＪ牌に細胞（非ウィルス産生）を表１４に示した通り に培責液媒体鳴ＲＰＭＩ＋１０％血清中において生育した。

表　１４ 本　発　明 ｔ−０２ＸＩＯ’　２　ＸＩＯ’　２　ＸＩＯ’　２　ＸＩＯ’１２時間　３　 ＸＩＯ’　２．３Ｘ１♂２．４Ｘ１０’　２．５Ｘ１０’２４ｗ８間　５．４Ｘ １０’　４．１Ｘ１０’　４．５Ｘ１０’　５　ＸＩＯ’３６時間８．８Ｘ１０ ’　６　ＸＩＯ’　７　ＸＩＯ’　７．９Ｘ１０’４８時間　１．８Ｘ１０＠Ｉ 　ＸＩＯ＠１．２Ｘ１０’　１．５Ｘ１０’６０ｑ間　３　ＸＩＯ’　１．４ｘ ｌＯ’　１．６ｘｌＯ＠２　ＸＩＯ’Δ培地 ７２ｗ＃関　３．２Ｘ１０’　２．２Ｘ１０’　３．０Ｘ１０’　３．２Ｘ１０ ’８４ｑ間　３．２Ｘ１０’　２．４Ｘ１０’　３．（ＩＸＩＯ’　３．２Ｘ１ ０’継代培養数　＞１００　＞１００　＞１００　＞１００平均倍増時間　１６ 　２２　２０　１８本発明の血清（スロット）について、それらの下肥の細胞系 の生育及び分裂を支持する有効性について試験を行った。

１）ＢＨＫ−２１（腎臓、シリア或いはザールデンへムスター〕 ２）３Ｔ３　（胚、マウス） ３）ＨｅＬａ　（上皮ガン、頚部、ヒト）４）ＨＤ　（横紋筋肉城、胚、ヒト） ５）ＢＧＭ　（バッファローンＦリプル腎１１）ｓ　）　Ｄｅｔｒｏｉｔ　５５ ０　（皮膚、ヒドン７）ｗＩａ８　（肺１倍体、ヒドン Ｒｅｈｅｉｓ■ウシ胎児血清及びＫＣＢｉｏｌｏｇｉｃ−（１のウシ血清を比較 例として使用した。上記全ての細胞系は１０％血清な補給したＤａｌｂｅｃｃｏ 　の変成Ｅａｇｌｅ　（ＤＭＩＣ）（Ｆｌｏｗ　ｊｍｂ）ｆ用いて毎週１〜２回 継代培養した。全ての一清は使用前に５０℃で３０分間熱不活性化した。培地の ｐＨは７．１〜７．２に保った。細胞は毎日それらの健康及び生育能力な監視す るために顕微鏡で検査した０次の生育ノラメータ−１に測定した。

ｌ）　平均倍増時間 ２）　飽和密度 ３）継代数 ４）　平板培養効率 ＢＨＫ、３Ｔ３．ＢＧＭ及びＲＤは全てＡＴＣＣＫより証明され工いる継続性細 胞系である。全て無限の寿命を有する。これらの細胞系１に：ｉｏ％のウシ血清 〔本発明、ウシ血清（ＫＢ）或いは仔ウシ胎児（Ｒｅｈｅｉｓ■）〕す補給した Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　の変成Ｅａｇｌｅ培地（ｐＨ７，２）中で培養した。細胞は 毎日、定量的な生育変化□顆粒化円形化細胞、融合性などについて検査した。各 細胞系は単層融合に到達時に継代培養した、更に、定量的な生育オラメーターを ２０継代毎にチェックした□倍増時間、飽和密度、平板培養効率。

結　果： 上記細胞系は全て本発明の血清円（おいて５０継代を越えた後にもなお健康な分 裂性の培養液である。本発明の梅漬或いはウシ胎児血清を補給した培養液中にお いては顆粒化１倍増時間の遅れ或いは平板培養効率の減少くつい℃の何等の徴候 も観察されなかった。

ｌ　１５ ＢＩ’ｌＫ、、細胞の増殖 表　１５ ａｄｄｅｄ　５　３．６刈０’　３．６Ｘ１０’　３．６Ｘ１０’　３．６刈０ ４２０　３．６刈０’　３．６Ｘ１０’　３．６刈０’　３．６刈０４５０　３ ．６Ｘ１０’　３．６Ｘ１０’　３．６刈０’　３．６Ｘ１０’１０時間 細胞数／ａｍ２ｓ　７．０刈０’　６．ｌＸ１０’　６．５刈０４７．０刈０４ ２０　７．０刈０’　６．０刈０’　６．４刈０’　７．０ｘｌＩＯ’５Ｑ　６ ．９刈０’　６．０Ｘ１０’　６．５Ｘ１０’　８．３Ｘ１０’２４時間 ｍ胞数／ｃＪ　５　２．０Ｘ１０’　１．２Ｘ１０’　２　ＸＩＯ’　２　ＸＩ Ｏ’２０　２．０Ｘ１０’　１．０Ｘ１０’　２　ＸＩＯ’　２　ｘｉｏ’５０ 　２、ｌＸ１０’　１．０Ｘ１０’　１．９Ｘ１０Ｓ２．ｌＸ１０Ｂ２０時間 細胞数／ｃＩＬ”　５　２．７Ｘ１０５２刈０’　２．５刈０’　２．８Ｘ１０ ’２０　２．８刈０’　２　ＸＩＯ’　２．５Ｘ１０’　２．６Ｘ１０５５０　 ２．６刈０５２．０Ｘ１０’　２．４刈０’　２．８刈０５４８時間 細胞数／ｃｒｎ２５　６．０Ｘ１０５４．５刈０’　５．０Ｘ１０’　５．３Ｘ １０５２０　６．０Ｘ１０５４．６Ｘ１０’　５．０Ｘ１０’　５．２Ｘ１０’ ５０　６．０刈０　４．８Ｘ１０　５．２刈０　５．５Ｘ１０５）培地 ７２時間 細胞数／ｃＩＩＬ２５　６．７刈０５４．８Ｘ１０５６．０Ｘ１０’　６．ｌＸ １０Ｂ２０　６．５Ｘ１０５５．０Ｘ１０５６．０ｘｌＯ’　６．２ｘｌＯ’５ ０　６．５Ｘ１０５５．０Ｘ１０’　６．０Ｘ１０’　６．２Ｘ１０’継代培養 数（最大）　＞１００　＞１００　＞１００　＞１００飽和密度φ 細胞／ｃＲ”　６．５刈０’　５　ＸＩＯ’　６　ｘ１０５６．２刈０５例　１ ６ マウス３Ｔ３細胞の増殖 ２０　２．６Ｘ１０Ｂ　２．６刈０”　２．６刈０３２．６刈０４５０　２．６ ｘｌＯ”　３．６刈０”　２．６刈０”　２．６Ｘ１０’１０時間 細胞数／ｃＩＬ”　５　２．４Ｘ１０”　２．０Ｘ１０”　２．２Ｘ１０’　２ ．２刈０４２０　２．２Ｘ１０３２．０Ｘ１０”　２．１刈０”　２．１５Ｘ１ ０’５０　１．９Ｘ１０”　１．８ｘ１０３１．８ｘ１０３１．８４Ｘ１０’３ ４時間 細胞数／ｃｍ”　ｓ　４．６Ｘ１０”　４．４Ｘ１０”　４．６刈０”　４．５ Ｘ１０’２０　４．４Ｘ１０”　４．２刈０３４．２刈０’　４．２ｘｌＯ’５ ０　４．３ｘ１０３４ｘｌＯ”　３．５刈０”　４Ｘ１０’５８時間 細胞数／ａｍ”　５　７．５刈０’　７．４ｘｌＯ”　？、０ｘｔＯ”　７，０ ｘｌＯ’２０　７．３刈０”　７．２刈０”　７．１刈０”　７．２Ｘ１０’５ ０　７．０Ｘ１０”　６．８Ｘ１０”　６．９Ｘ１０”　６．９５Ｘ１０’８２ 時間 細胞数／ｃｒｎ２５　１．３刈０’　９．２Ｘ１０”　１．０刈０’　１．１刈 ０５２０　１、ｌＸ１０’　９．０Ｘ１０”　１．０Ｘ１０’　１．ｌＸ１０’ ５０　９刈ｏ’　ｓ、６刈０３９刈０５９刈０４Δ培地 ７２時間　５　２．２刈０’　２．０Ｘ１０’　２．ｌＸ１０’　２．３刈０５ ２０　２．１刈０’　１．８Ｘ１０’　２．ｌＸ１０’　２．２Ｘ１０’５０　 ２．０Ｘ１０’　１．８Ｘ１０’　２．０刈０’　２．０刈０５１５４時間　４ ．２Ｘ１０’　３．８刈０’　４．０Ｘ１０’　４．１刈０４４．１刈ｏ’　３ ．７Ｘ１０’　３．９刈０’　４．０刈０４４刈♂　３．７Ｘ１０’　３．９Ｘ １０’　３．９Ｘ１０’継代数（最大’Ｉ　＞１００　５０　５０　５０飽和密 度す　４．１刈０’　３．８刈０３．９刈０　４．０Ｘ１０細胞数／ｃＩＩＬ２ 平均倍増時間（時間数）　４８　４９　４８　４８平板培養効率（チ）　２５　 ＜１０　２０　２０例　１７ ＨｅＬａ細胞の増殖 細胞数／１ｘ２２Ｘ１０’　ｚＸ１ｏ’　２ｘｌＯ’　２ｘｌＯ’１２時間　３ 刈０’　２．２Ｘ１０’　２．５Ｘ１０’　２．８刈０４２４時間　６刈０’　 ３．６Ｘ１０’　４．３Ｘ１０’　４．５刈０４４８時間　１．３Ｘ１０５７刈 ０’　１刈０５１．ｌＸ１０５Δ培地 ７２時間　３．２Ｘ１０５２．０Ｘ１０５２．６Ｘ１♂　２．８刈０５９６時間 　７．０刈０５５刈０’　６．４Ｘ１０５６．４刈０５１２０時間　７．ｌＸ１ ０５５．２Ｘ１０５６．６刈０５６．５ｘｌＯ５継代培養数　〉旬　＞５０　５ ０　５０飽和密度 細胞数／ｃｍ２７　Ｘ　１♂　５．２Ｘ１０５６．６刈０’　６．５刈０５平均 倍増時間（時間数）　１８　２２　２０　２０平板培養効率（チ）　５０　２０ 　４０　４５例１８ ノツファローミドリヂル腎臓細胞の増殖表　１８ 本発明 Ｆｅ２　Ｃ８ロットエ　ロット■ ｔ−０２刈♂　２刈０’　２Ｘ１０’　２Ｘ１０’ｔ−１１８２，１刈０４１． １刈０’　１．５Ｘ１０’　２．０Ｘ１０’ｔ−２４８８刈０４５刈０’　８． ６Ｘ１０’　９刈０４ｔ−３７２１，８刈０５１．２Ｘ１０’　１．７刈０５２ 本１０５ノ培地　３．ｌＸ１０’　２．０Ｘ１０’　２．９刈０’　３．５Ｘ１ ０５１２０　３ｘｌＯ’　２．０刈０’　２．９Ｘ１０’　３．２Ｘ１０’継代 培養数　５０　５０　５０　５０ 倍増時間　１８　２０　１８　１８ 平板培養効率　２０　＜１０　１５　１５例１９ ＲＤ細胞の増殖 本発明 Ｆｅ２　Ｃ８ロットエ　ロット■ ｔ−０２Ｘ１０’　２刈０４２刈０４２刈０４細胞数／ｃｍ” １２　時間　２．８Ｘ１０’　２．ｌＸ１０’　２．２Ｘ１０’　２．５Ｘ１０ ’２４　時間　４．１刈０’　３Ｘ１０’　３．８刈０’　４Ｘ１９’４８　時 間　８．０刈０’　５Ｘ１０’　６Ｘ１０’　６．５Ｘ１０’７２　時間　１． ４刈０’　９Ｘ１０’　ｌＸｌ０５１．２刈０５Δ　培地 ９６　時間　２．５刈０５１．７Ｘ１０５２刈０５２．３Ｘ１０５１２０時間　 ３．５刈０５２．８刈０’　３．４ｘｌＯ’　３．５刈０５１４４時間　３．０ 刈０５２．８刈０’　３．３Ｘ１０５３．２Ｘ１０５継代培養数　＞５０　５０ 　５０　５０飽和密度 ｍｕｍ／ｃｍ”　３．５Ｘ１０５２．８Ｘ１０５３．４Ｘ１０５３．５Ｘ１０’ 平均倍増時間 （時間数）　２４　２６　２４　２４ 平板培養効率チ　１０　＜１　１０　１０Ｂ）有限の生育潜在能力ｖ有する二倍 体細胞　の増殖ＷＩ３８及びＤｅｔｒｏｉｔ　ｓｓｏはＡＴＣＣの証明する有限 の寿命を有するヒトの二倍体細胞系である。これらの系を逐次ウシ血清〔本発明 、２０ット、ウシ胎児（Ｒｅｈｅｉ畠■）、或いはウシ血清（ＫＣＢｉｏｌ、） 〕１０％を補給したＤｕｌｂｅｃｃｏの変成Ｅａｇｌｅ培地（ｐＨ７，２）中に おいて継代培養した。培養液について毎日定性的生育変化を検量した。生育パラ メーターは各種継代数において測定した。

結果 本発明の血清（両ロット共に）はウシ血清よりも性能がすぐれており、ウシ胎児 血清よりもはんの僅か劣るものであった。ＷＩ３８は連続的［６０〜６５回継代 培養することが小米、本発明の血清は危機直前であった。（危機は細胞内の顆粒 の発現、薄い線状の細胞の出現、融合性の円い細胞の結合、継代培養の不能など により示される。）胎児血清は細胞系を更に５〜１０継代促進したのに対し、ウ シ血清は生育支持１代が２０〜２５継代少なかった。

Ｄｅｔｒｏｉｔ　５５０細胞系はＦｅ２においては３８において到達したのに対 し、本発明においては３０〜３４において到達した。この時点において細胞は一 週間毎日培地を代え、より小さな容器に移して回収されたが繊維芽様乃至は上皮 様からは変化した形態を示した。ウシ血清中からの細胞は全（回収されなかった 。

２０ ＷＩ３８の増殖 １２　２０　２　ＸＩＯ’　２．８Ｘ１０’　２．４Ｘ１０’　２．６Ｘ１０’ ２４　２０　４．４ｘｌＯ’　３　ｘｌＯ’　３．８Ｘ１０’　４．０ｘｌＯ’ ４８　２０　１．３Ｘ１０’　６．ｌＸ１０’　８．０Ｘ１０’　１．０Ｘ１０ ’７２　２０　３　ＸＩＯ’　１．３Ｘ１０’　１．８Ｘ１０’　２．２Ｘ１０ ’Δ培地 ９６　２０　４．２Ｘ１０’　！、５Ｘ１０″　３．８Ｘ１０’　４　ＸＩＯ’ １２０　２０　４．０ｘｌＯ’　３．５ｘｌＯ’　３．９ｘｌＯ’　４　ｘｌＯ ’継代培養ＩＩ（１０）　７０　４０　６０　６５餅和密Ｉｆ　４　ＸＩＯ’　 ３．５Ｘ１０’　３．９Ｘ１０’　４　ＸＩＯ’倍増時間　２０　２４　２２　 ２２ 平板培養効率％　３０　１５　２０　２５例　２１ Ｄｅｔｒｏｉｔ　５５０　の増殖 本発明 ｔ−０２０２ＸＩＯ’　２　ＸＩＯ’　２　ＸＩＯ’　２　ＸＩＯ’細胞数／３ １２ １２　２０　２．６Ｘ１０’　２．ＯＸ］０’　２．２Ｘ１０’　２．５ＸＩＯ ’２４　２０　３．５Ｘ１０’　２．８Ｘ１０’　３　ＸＩＯ’　３．２Ｘ１０ ’４８　２０　７−３Ｘ１０’　５　ＸＩＯ’　６．３Ｘ１０’　７．ｌＸ１Ｇ ’７２　２０　１．６Ｘ１０’　８　ＸＩＯ’　１．３Ｘ１０’　１．４Ｘ１０ ’Δ培地 ９６　２０　３　ＸＩＯ″　１．２Ｘ１０’　２．５Ｘ］０’　２．９Ｘ１０’ １２０　２０　３．５Ｘ１０’　２．５Ｘ１０’　３．０Ｘ１０’　３　ＸＩＯ ’１４４　２０　３　ＸＩＯ’　３　ＸＩＯ’　３．０Ｘ１０５３　ＸＩＯ’継 代培養ＩＴ（９）　３８　２５　３０　３５餅和密［３，５Ｘ１０’　３　ＸＩ Ｏ’　３　ＸＩＯ’　３　ＸＩＯ’平板培養効車％動車　１０％　く１％　〈１ ％　〈１％＊　Ｄｅｔ５５０＠ｌ胞系は使維芽様乃至上皮様の細胞からの継代的 変化な行った。こＣＫ報告されている継代竺はこの危機時点までの継代数である 。

例　２２ 三重の別々の細胞融合な適当な型のウシ血清及び三匹のＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃ マウスから集めた膵臓す／Ａ球中で生育した等しい数のＭＳ−１ａｌｉｌ胞（Ｈ ＧＰＲＴの産生に欠けたマウス骨髄種細胞）を用いて行った。使用された特別の 血清は本発明の血清２０ツト及び１ｅｈｅｉｓ＠からのウシ胎児血清であった。

細胞は血清のないＲＰＭＩ　１６４０培地中において洗浄し、１．５ｍｌの５０ ％ＰＥＧ　（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓｇ／リエチレングリコール４０００）中 において２分間３７°で融合した、血清のない培地を次いで融合細胞にそれらが １０ｍ１　ｐｃ＠濁されるまで０．２ｍｌ／３０秒の速度で添加した。血清のな いＲＰＭＩ　１６４０培地を次いで５０ｍ１　まで添加し、細胞を靜か（ベレッ ト化した。細胞を注意深＜２５ｍ１のピルビン酸塩、アルファチオグリセロール 、トランスフェリン、グルタミン、ヒ？キサンチン、チミン、及びアミノプテリ ンを含有するｌ５ｃｏｖｅｓｆ＃：Ｄｕｌｂｅｃｃｏの最少必須培地（Ｇｉｂｃ ｏ　）（ＨＡＴ培地）中に再懸濁させた。

ＨＡＴ選択は３７°ｃｏ、インキヱベーター内のＣｏ１−ｔａｒ９６ウエルのマ イクロ滴定板中に＆いて行った。

融合したアミノプテリン耐性の細胞のクローンが３週間以円に見えるよう（なっ た。

本発明のロフト番号ｌの血清を用いる融合は僅かに４コロニー（１９２クエル数 から）を与えたにすぎなかった。本発明のロフト番号２の血清は５６のゴロニー を与えＲｅｈｅｉｓ＠のウシ胎児血清は７１コロニーを与えた（表２２）。コロ ニーは本発明の血清円においてより迅速に生育しきってしまい、より拡散的であ った。

これらの融合効率における相違は融合条件における極めて小さな変化によって容 易に影響され得るものであった。その他の実験において、融合ｖｔ、に行った稀 釈速度における備かな変化が生育能力のある融合細胞に大きな相違？もたらして いたので、この実験においては融合条件をなるべ（同様和するように試みた。し かし、なお稀釈速度は実数における可能な誤差の源として留まるものである。

本発明のロフト１　４　２．０８％ 本発明のロットＩＩ　５６　２９．１７％Ｒｅｈｅｉｓ■ＦＣ８７１３６，９９ ％本実験は細網組織症関連ウィルス（ＲＥＶ−Ａ）である鳥レトロウィルスの１ ０％ウシ胎児血清或いは１０％本発明血清１ｋｌｌ＋給したＲＰＭＩ　１６４０ 培地中で生育されたニワトリ胚繊維芽細胞の培養液中における生育な比較するこ とを意図するものである。各時点において産生さねたＲＥＶ−ムの量を逆転写酵 素による粒子放出を分析することにより測定した。

方法 ニワトリ胚繊維芽細胞の初代培養液（ＣＥＦ％５ＰＡＦＡ８．Ｎｏｒｗａｌｋ、 Ｃｏｎｎ、）　は９日目の胚から調製された。４８時間後に初代培養液の細胞を トリジクン化し、平板から洗い出しＲＰＭＩ　１６４０培地中に懸濁させた。４ ．０〜４．５Ｘ　１０’　の細胞数な含有する等容量を１２本の組織培養フラス コ（７５ｃｍ　）の各々（添加した。パすの６本のフラスコには１０％の熟年活 性化つ　Ｘ、、ｒλ（Ｒｅｈｅｉｓ■）を補給した１２ｍ１のＲＰＭＩ　Ｉ　Ｒ ４０培地を入れた。ａＰ１１２時間後に、培地１に：フラスコから敗出し、１％ の本発明の血清或いはウシ胎児血清を補給したポリブレン（２ｎｇ／ｍｌ　）１ に含有するＲＰＭＩ　１６４０培地で置換した。１時間後＃′ｃ１０本のフラス コ（本発明の血清５本及びウシ胎児血ｆＲ５本）円の細胞を予め５ＰＡＦＡＳＣ ＥＦの二次培養液から得ていたＲＥＶ−５１１の等容量のストックＫ１１ｊＫし た。残りの２本の７ラスコはポリブレ／のみを含有し、対照ｆｌｌ（Ｃ，及びＣ Ｆ）として役立つ郷ｇ量の培地に１賑した。１時間の吸着時間の後、全てのフラ スコ内の培地を１０％の本発明の血清或いは１０％のウシ胎児血清を補給した新 鮮なＲＰＭ１１６４０培地で置換した。

感染後各種の時点において培地を各フラスコから集め適当な新鮮な培地で置換し た。集められた培地は２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い細胞及び細胞破 片を除去した。各試料ＩＱｍｌ中のウィルスな１００、ＯＯＯＸｇ　において１ 時間濃縮した。得られたウィルスのベレツ）Ｖｏ、２＋１ｎｌのＴＴ−２緩衝液 （０，０５Ｍ　Ｔｒｉｍ、ｐＨ３，０，２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−Ｚｏ。

］中に懸濁させた。各試料中のウィルス量は濃縮ウィルス試料内に存在する逆転 写酵素活性のｔを測定することＫよりめられた。標準的外因性逆転写酵素反応は １００ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ（１）Ｈ８，３）、５ｎＭ 　ジチオトレイトーｎ（ＤＴ↑）　、０．０５Ｍ酢酸第一マ７ガ７．７．５ｍＭ ｄす（ｒＡ）、ｌｓＪＭオリゴ（ｄＴ）１２　Ｎ１８．０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ −Ｚｏｏ’及び２０μＣＩ［、Ｈ］−チミジントリホスフェート。

４０〜６０　Ｃｉ／ｍＭ　）を含有する０、１ｍｌの最終容量中和おいて行った 。ウィルス試料の２５μｌのアリコ−）Ｙ７５μｍの反応液Ｋｍ加し、３７℃に おいて１時間インキエペートした。全てのウィルス試料は二重に分析を行った。

インキュベーション期間の終りに２ｍｌの冷Ｔ　Ｐ　（０，４Ｍ　）リクｎｏ酢 ＃、０．０２Ｍピクリン酸ナトリウム）を各試験管に添加し、試験管を４℃にお いて１時間貯蔵した。各試験管内の沈ｊｌｌＩｔＯ，４５ｍ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒ ｅ■フイ／Ｌ／／−上ニ集メ、洗浄乾燥してＢｒａｙの８ｃｉｎｔｉｌｌａ目ｏ ｎ　液及びＰａｇｋｍｒｄ　Ｔｒｉ−Ｃｕｒｂ　シンチレーションカウンターを 用いて放射能のｔｔ’測定した。

結、　果 表２３は各フラスコウィルス試料について７！！ｒ時点において行われた二重の ８丁−分析の平均を示すことにより結果をまとめて示すものである。又、第４図 に図示される所定の時点における５フラスコ全てにより生成するＲｉ活性の平均 量も示される。

表　２３ ウシ胎児血清　本発明の血清 （ｅｔｓ／分）　（ｅｔａ／分）　フラスコ　（ｅｔｓ／分）　（ｃｔｓ／分） ３．８９６　Ａ　２．１９６ ２．５４１　Ｂ　３，６４９ ２．０４９　Ｃ４，００３ ３，３１７Ｄ　２，５７１ ２．９２２　Ｅ　３．０６２ ２．９４５．０　３，８７０．５ ２．８９６．０　Ｃ２２，９４９，５ １０，４１０，５Ａ　３，７１６ ６．１２８　Ｂ　４．６９３ ６．５２０　Ｃ５９，３５８ ５，２９９Ｄ　６．３４３．５ ３．８０８　Ｅ　５，０６０．５ ６．４３３．１　１５．８３４．２ ２．５６７、ＯＣ２２，４６３ １９２，２８５Ａ　８４．４４６ １０．７５６．５　Ｂ　１０３．６８９３５８．３７６　Ｃ６７，６２７ ３６９，３０９Ｄ　７０．９６７ ３８３．４７１　Ｋ　１１４．２００ ２６２．８６９．５　８８，１８５．７３．１０２　Ｃ２３，００１，５ ４７６，４５７，５Ａ　２１０．５５２３４８．７１８．５　Ｂ　２１７．５９ ７５６９．５６２．５　Ｃ２６６，５７５，５４２５，８０７Ｄ　２４８，１８ ７ ５１２．２９５．５　Ｅ　１８５，３６５４６６．５６８．２　２２！ｉ、６５ ５．３２．３４１　Ｃ２２，３９１ １３９，４７５Ａ　１８８，４９３．５２２８．０４３　Ｂ　１５６．１７６ １６２．１５０　Ｃ１２０，５６９ １５０，３２４Ｄ　８５．６９６．５ ２４０．１３９．５　Ｋ　９８，３７２．５１８４．０２６．３　１２９，８６ １．５２．０５７　Ｃ２２，１７２ ２７４，０５３，５Ａ　１５１．００８．５３１９．０１９　Ｂ　１６８，０６ １ ３０４．２８３　Ｃ１４８，１５２，５２０５，３３７Ｄ　１３９．２４１ １１９．８９４　Ｅ　１３９，３６１．５２４４．５１７．３　１４９，１６４ ．９３．６０７　Ｃ２２，９４３ １０％ウシ胎児血清の存在下で生育された培養液の方がより迅速に融合性単層を 発育させたように思われる。これらの培養液におけるこのより迅速な細胞の生育 の結果、単層のフラスコからの解離が感染後５日後に開始し、５日後（は実質的 に全での単層が除去された。しかしながらウシ胎児血清の存在下におい℃生育し た培養液は本発明の血清の存在下罠おける同一の培養液よりも感染後３日後のウ ィルス産生のピークにおけるＲＥＶ−ムの二倍と思われるものｔａ生した。比較 的迅速なＲＥＶ−Ａ産生における衰退は遵質層から解離する融合性培養単層と関 連しているように思われる。

本発明の血清を補給した培地中において生育された培養液はウシ胎児血清の存在 下における培養液のような迅速な生育は見せなかった０本発明の血清中で生育さ れた培養液は感染後約１４日まで浮き上り始めなかった０本発明の血清の存在下 におけるピークのウィルス産生はウシ胎児血清培養液の約半分であるが、培養液 はウィルス′ｌｔ３倍長く産生じ続け、２棟類の培養液の生育速度における相違 を反映している０本発明の血清はＣＥＦ培養液の生育をウシ胎児血清よりもより 遅い速度で生育させ、培養液はウィルスをより置時間産生する結果をもたらす。

ウシ胎児血清（ＫＣＢｉｏｌｏｇｊｃｉｌｓ）ｇ本発明の血清と細胞分裂誘起剤 によるマウス膵臓細抱の刺戟忙及ぼす影響について比較した。

膵臓′ｋｓ匹の生後４〜５ケ月のマウスから取出し。

微細メツシュ篩を取出して注射針先端ですりつぶしてＲＰＭＩ　真６４０培地中 に入れた。細胞は１２００ｒｐｍＫおい１１０分間ベレット化し、６本の試験管 内に分けて入れ、再び数を数え洗浄した。適当な血清の種類及び量を各試験管に 龜加しくＲＰＭＩ　１６４０中）、Ｓａを１２Ｘ７５ｍｍ試験管当り０．５ｍ１ Ｋ分散した＊　ＰＩＨＡ（Ｄｉｆｃｏ）を四重の培養液（各試験管当り１：８０ 稀釈液のＱ、１ｍ１）Ｋ用い、又二重の対照例培養液を用いた。

培養液を４８時間３７℃においてインキユベートし次いで三重水素含有チミジン （０，０５ｍ１媒体中１ｍ　Ｃｉ　／管）で２４時間パルス処理した。細胞な激 しく攪拌しガラスＭ！維フィルター上に注いだ。試験管は二回ＴＣムで洗浄し、 フィルターＹＦいでシンチレーションカウンターにおいて計数測定した。

血清の二つの濃度（５％及び１０％）及び細胞の二つの濃度（２Ｘ１０／ｍｌ及 び５　Ｘ　１０　／ｍｌ　）　ｌ’ｃツイて試験を行った。結果を表２４に示す 。

表　２４ ＦＣＢ　２００５±１１７４　６８２±　８６　２．９本発明ロット◆１　２１ ５７±８７２　２１３９±１３５１本賢明ロフト４２　３８０１±８９８　６８ ８±８４　５．５Ｂ、１０％ ＦＣＢ　１２７５２±３６７６　２１１５±１１７　６．０ロ　ッ　ト　→）ｌ 　４５１Ｂ±　４８３　６４６±　５５　６．９９０　ッ　ト　＋２　３３４８ ±　４０５　１７８９±５２８　１．９Ｆ　Ｃ８７３ｆ５９±１８１６　１２７ ９±１６６　５．８ｏ　ッ　）　＋１　５６９０５ｆ２７２９　８８０２ｆ１８ ２１　６．５０　ッ　ト　→ト２　６８９８±　５９５　１５６７±２４８　４ ．４Ｂ、１０％ ＦＣＢ　３２０９３±２９９０　５２０３±２０５　Ｌ２ａ　ッ　ト　４←ｌ　 ８１４７±３１４３　１３７９±２２５　５．９ａ　’ｌ　）　４２　１３４２ ８±　７０１　１６０１±　６５　８．４本発明の血清はｉウス細胞のＰＨＡＫ よる刺戟の増強忙おいて同様に良好である。

ｇ＠２５ コンカナバリンＡ（より刺戟されたポリクロナール活性化リンＡ球におけるＤＮ Ａ合成の分析１）’Ｎ　Ａ合成はＣｏｏム刺戦ｉｎ−チｉ　Ｉｙ（１ａＣｉ／ｍ ｌ）により追跡した。対照例培養液は５％の通常のウシ胎児血清（Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉ−ａｔｅｓｌｌｌ）を含有した。「ｚｅｔａ Ｊと呼ばれる培養液は５％の本発明の血清（ｆｉｌ　１　）　’に含有した。各 セットは５培養液よりなる。

４８ｑ間値 対照例　１５０８７２　±　８４９６ 本発明血清　１２８３６１　±　７２３６ＤＮＡ合成の速度は第５図に示される 。

例　２６ イリクロナール活性化マウスリン／ｅ球におけるコレステロールの合成 ステロール合成は非−ケン化性脂質画分のデイジトーン沈澱中に　Ｃ−アセテー トを尋人することにより測定した。

ＤＰＭ／１０’　細＠叡／時間 対照−２４１±　８ 本発明血清　１５１９　±　２２４ 第６図はその様な培養液におけるステロール合成９時間道行状態を示すものであ る。各点は３個の培養液な表わす。本発明血清におけるステロール合成の第二の ピークに注意、これは、多分第二の細胞周期の始まりを示すものと思われる・ 細胞毒力価は４８時間において　Ｃｒ標繊化Ｐ８１５標的細胞（乳ガン細胞）′ ４ｆ用いてめられた。作動体細胞（リンパ球）或いは標的細胞はそれぞれ第７図 （示されるように対照血清（Ｆｅ２）或いは本発明血清内において培養された。

第８図はステロール合成阻害剤２５−０Ｒ−コレステロールを加えた或いは加え ない本発明血清の異ったロフト中和おける細胞毒力価を示す。

第９図ｔＩＣｏａ　Ａ刺戟ｖｋｄ、４８時間及び７２時間において測定奈ねた別 の一連の実験における細胞毒力価を示す、明らかに本発明の血清は通常のウシ胎 児血清において祷られるものよりも良好な細胞毒力価の結果を祷ている。

ｇ＠２８ Ｐ８１５大赤血球禮瘍細胞内におけるコレステロールの合成 培養液を２時間１４Ｃ−アセテート（５μＣｉ／ｍｌ）ト３７°においてインキ ュベートさせ、脂質分を次いで抽出し、分別し、放射能をデイジトニンー沈澱画 分中（おいて測定した。

ＤＰＭＡ／１０　＃胞／時間 対照−（５％ＦＣＳン　１６２６Ｇ　±　２７３２本発明血渭　血清　２５４９ ３　±　３９３１本発明血清におけるより高いステロール合成はこの血清内のよ り低いコレステロール含量に帰することが細胞Ｙ　３Ｈ−ＴｄＲ（１ｔｔＣｉ／ ｍｌ　）と１時間３７℃でインキュベートさせ、放射能を酸−年齢画分中におい て測定した。

ＤＰＭ／１０　ｍ胞／時間 対照ｆｌｌ（５％ＦＣＢ）　２０６３５０　±　１７８０８本発明血清　５％　 ２０４６９Ｂ　±　１０９８８３０ Ｄ８１９　白血病側　（おける分化の酵発Ｄ８１９赤白血病細胞系＠Ｆｒ１ｅｎ ｄ白血病ウィルスで形質転換すると成る糧の化学薬品（誘発剤）′ｌｋ培養培地 に添加するとヘモダロピン産生細胞（分化する興味深い能力を有するようになる 。最も強力な誘発剤の一つはへキナメチレ／−ビス−アセタミド（ＨＭＢＡ）で ある。本発明の血清の二つのロットな含む二つの実験が行われた。第１０図及び 第１１図において、これらの実験がそれぞれ両ロフトについて示されている。対 照例は分化誘発剤を含まない本発明血清内で生育された培養液である。それらは 増殖するが、へ°モグロピンを産生しない、１１ＭＢＡな添加された培養液（十 ＨＭＢム）は相当量のヘモグロビンを産生ずる。これらの結果は通常のウシ胎児 血清中で生育された培養液（図示せず）と比較して同等或いはむしろより良好で 試験された三種の細胞について（ｆ！！Ｊクロナール活性化りンノ球、Ｐ８１５ 大赤血球に瘍及びＦＬＹ赤白血病）、これらの細胞系については全ての条件にお いてウシ胎児血清と比較して本発明血清内において少なくとも同等或いはむしろ より良く生育する。

以上十分に本発明を説明したが、当業＠にはその配合或いは操作の詳細を本発明 の主旨或いはその任意の実施態様から離れることな（変更することが可能である ことは明らかであろう。

浄書（内容に変更なし） 黙染禮時間（時間数） ＦＩＧ、／ 培ＩＩ峙間仮 ＦＩＧ、　５ 尾ＩＢ！門数 ＦＩＧ、　６ 溶解のパーセント 溶解のパーセント 溶解のパーセント ＨＭＢＡシ示加１麦日数 １−ＩＭＢＡ　滞り口（支　日　数 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 組織培養媒体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 エイエムエフ　インコーホレーテッド ５、補正命令の日付 昭和５７年１１月１８日 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、３０ｍｇ／ｄＩ未満の全脂質分、Ｏ〜１０ｍｇ／ｄＩ以内の；レステロ−λ 分、０〜２０ｍｇ／ｄｉ以内のトリダリセリ「分、　２０　ｍｇ／４１未満のへ モグロぎン分、実質的に検知不能であるマイコプラズマ分及び膜包囲つィルス分 を含む天然ウシ血清から由来する血清。 λ　クシ胎児血清と同様な量のアルブミン、α−グロブηン及びβ−グロブリン を含有する請求の範囲第１項記載の血清。 ３．２−４ｇ／ｄｉ以内のアルジミン含量、０．４〜２．０ｇ／ｄｊ以内のグロ ブリン含量及び０．４〜２．０ｇ／ｄｌ以円のβ−ダロッリン含量を有する請求 の範８第１項記載の血清。 ４、更に０次の生化学的特性の一つ以上を有する請求の範囲第１項、第２項又は 第３項のいずれかに記載の血清： （ａ）０．１〜１．０ｇ／ｄ１以内の１ン−ｖ−／ｃｙブ９ン含景。 （ｂ）５μｇ／ｍ１未満のコルチゾール含量、（ｃ）２．０ｎｇ／ｍ１　未満の 内毒素含量も５、０．ＯＳ−０，５ｇ／ｄ１以内のガン！−グロブリン含量を有 する請求の範囲ｔａ４項記載の血清。 ６、＃特性（暑）及び（Ｃ）　を有する請求の範囲＃！４７、　該特性（ｂ）！ 有する請求の範囲第４項記載の血清。、 ＆　該特性Ｃａ）〜（Ｃ）Ｖ全て有する請求の範囲第４項記載の血清。 ９、請求の範囲第１凋記載の血清と、天然ウシ胎児血清との組合せよりなる血清 において、該ウシ胎児血清が該組合せの１〜９９％に℃存在し、請求の範囲第１ 項記載の骸血清が該組合せの９９〜１％にて存在する血清。 １０、請求の範囲第４項記載の血清と天然ウシ胎児血清との組合せよりなる血清 において、該ウシ胎児血清が該血清の１〜９９％にて存在し、該請求の範囲第４ 項記載の血清が該組合せの９９〜１％九て存在する血清。 １１、該ウシ胎児血清が該組合わせの５〜１０容量％で存在する請求の範囲第９ 項又は第１０項記載の組合わせ血清。 １２、下肥成分割合を含んでなる天然ウシ血清由来の血清： （ａ）　１　ｏ　ｍｇ／ｄｉ　未ｆｌｉｔノ全脂’ＪＫ分。 （ｂ）Ｃ）−２ｒｎｇ／ｄｌｆ＞コｖスｆａ−ル分。 （Ｃ）０〜５ｍｇ／ｄｉの）　リ／リセリＦ分。 （ｄ）　英實的に検知不能量の膜包囲つィルス分及びマイコプラノ１分。 Ｃｅ）Ｏ〜５ｍｇ／ｄｉのへ％／ｃｒピｙ分。 （ｆ）２〜４ｍｇ／ｄｉ　のアｘブミン分。 Ｃｇ）０．４〜２．０ｇ／ｄｌのアル７アーダａブｙ７分。 （ｈ）０．４〜２．０ｇ／ｄｉのペーターグロ！りン分（ｉ）０〜０．５ｇ／ｄ ｌのガンマ−グロブリン分。 （ｊン　０．１１ｇ／ｍｌ　の内毒素分。 （ｋ）１μｇ／ｄ１のコルチゾール分。 １３、動物又は植物細胞と請求の範囲第１項記載の血清を含んでなる生体外（ｉ ｎ　マ１ｔｒｏ）細胞培養液。 １４、該血清が生育促進量にで存在する請求の範囲第１３璃記載の細胞培養液。 １５、＃血清が天然ウシ胎児血清と同様なα−グロブリン及びβ−グロブリン含 量を有する請求の範囲第１４項記載の細胞培養液。 １６、＃血清が２〜４ｇ／ｄｉ以内のアルブミン含量。 ０．４−２．０　ｇ／ｄｉのアルファーグロブリン含量及び０．４〜２．０ｇ／ ｄｌのベーターグロブリン含量ヲ有する請求の範囲第１３項記載の細胞培養液。 １７、該血清が更に下記の生化学的？＃性の一つ以上を有する請求の範囲第１４ 項、第１５項又は第１６３Ｊｌ紀載の細胞培養液： （ａ）０．１〜１−Ｏｇ／ｄｉ以内のＴ−グログリン含量。 （ｂ）５ｇ／ｍ１　未満のプルチゾール含量。 （Ｃ）２．Ｏｎｇ／ｍ１　未満の内毒素含量。 １８、該血清が０．０−０．５ｇ／ｄ１以内のｒ−グロブリン含量を有する請求 の範囲第１７項記載の細胞培養液。 １９、該血清が該特性（鳳）及び（Ｃ）ｖ有する請求の範囲第１７項記載の細胞 培養液。 ２０、該血清が該特性（ｂ）を有する請求の範囲第１７項記載の細胞培養液。 ２１、該血清が該特性Ｃ８）〜（Ｃ）　’ｔ’全て有する請求の範囲第１７項記 載の細胞培養液。 ２２、該血清が１〜９９％の割合で９９〜１％と組合わされてなる請求の範囲第 １４項記載の細胞培養液。 ２３、該細胞が形質転換或いは非−形質転換動物細胞である請求の範囲第１４項 記載の細胞培養液。 ２４、該細胞がハイプリドーマである請求の範囲第１４ｍ記載の細胞培養液。 ２５、該血清が天然ウシ胎児血清との組合せよりなり、該ウシ胎児血清が該組合 せの１〜９９％において存在し、請求の範囲第１項記載の該血清が該組合せの９ ９〜１％において存在する請求の範囲第１４項記載の細胞培養液。 ２６、該ウシ胎児血清が該組合せの５〜１０容ｉｉ％で存在する請求の範囲第２ ５項記載の細胞培養液。 ２７、動物又は植物細胞を生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で培養する方法において 、該細胞を生育促進量の請求の範囲第１項記載の血清と接触させることを特徴と する方法。 ２８、＃血清が天然ウシ胎児血清と同様なα−グロブリン及びβ−グロブリン含 量を有する請求の範囲第２７璃記載の方法。 ２９、該血清が２〜４ｇ／ｄｉ以内のアルブミン含量。 ０．４〜２．０ｇ／ｄｌのアルファーグロブリン含量、ＪＩＦｏ、４〜２．０ｇ ／ｄｌのベーターグロブリン含量を有する請求の範囲第２７項記載の方法。 ３０、該血清が更に下記の生化学的特性の一つ以上を有する請求の範囲第２７項 、第２８項又は第２９項記載の方法： （１）　０．１−１　、Ｏｆ／ｄｉ　以内ｆ）ｒ　−ｆａ　ｆ　リｙ含量。 （ｂ）５μｇ／ｍ１未満のコルチゾール含量。 （ｃ）２．Ｏｎｇ／ｍ１　未満の内毒素含量。 ３１、該血清が０．０〜０．５ｇ／ｄ１以内のγ−グロブリン含量を有する＾請 求の範囲第３０項記載の方法。 ３２−該血清が該特性（ａ）及び（Ｃ）Ｖ有する請求の範囲第３０項記載の方法 。 ３３、該血清が該特性（ｂ）を有する請求の鍵囲第３０璃１載の方法。 ３４、＃血清が該特性Ｃａ）〜ＣＣ）’に全て有する請求の範囲域３０項記載の 方法。 郭 ３５、該血清がｌ５９９％の割合で９９Ｓ１％の天然ウシ胎児血清と組合わされ てなる請求の範囲第３１項記載の方法。 ３６、該ウシ胎児血清が該組合せの５〜１０容量％で存在する請求の範囲第３５ 項記載の方法。 ３７、該細胞が９７７球又は白血球であるか或いはこれらに由来するものである 請求の範囲第２７項記載の方法。 ３８、該細胞がウィルス製造用に使用される請求の範囲第３５項又は第３６項記 載の方法。 ３９、天然ウシ血清ｆ　３０　ｍｇ／ｄ　１未満の脂質分含量までに脱脂質する ことを特徴とする血清の製造方法。 ４０、該脱脂質処理が該血清を発煙シリカと接触させて行われる請求の範囲第３ ９項記載の方法。 ４Ｌ該発煙シリカが該血清に約１０〜１００ｇ／ｌまで回分的に添加される請求 の範囲第４０項記載の方法４２、該発煙シリカが繊維上マトリックス内に固定さ れている請求の範囲第４０項記載の方法。 ４３、該シリカと接触前に、該血清を０．０〜０．５Ｍの濃度の二価金属イオン で処即する請求の範囲第４０項記載の方法。 ４４、更に該血清を活性辰と接触させる請求の範囲第３９項記載の方法。 ４５、更に、沈澱量のグロブリンを沈澱させ、次いで沈澱した蛋白質を上澄液か ら分離し、上澄液を回収し及び上置液内に＠存する塩の濃度を減少させる請求の 範囲ｓ１！３９項又は第４４項記載の方法。 ４６、Ｔ１工程を含んでなる請求の範囲第３９項１載の（ＩＩ）該血清ＫＯ，０ １〜０．５Ｍの濃度になるよう九二価金属イオンを添加し、次いで （ｂ）　該血清を発煙シリカと全脂質分濃度が３０ｒｎｇ／ｄｌＫなるに十分な 時間接触させ、次いで （Ｃ）＃シリカを該血清から分離し、 （ｄ）＃血清から沈澱量の塩を用いてグロブリンＹ沈澱させ、次いで （ｅ）＃沈澱蛋白質を上澄から分離させ、かつ該血清円に溶存する沈澱塩の濃度 を実質的に減少させ、次いで ＜ｆ）　該実質的に塩のない上澄液を活性炭と接触させ、該血清な該炭から分離 して装置化された血ｆｆＩを得１次いで （ｇ）　該清澄化血清内の蛋白質１１１度な３〜７ｇ／ｄｌの範囲に調整し、次 いで （ｈ）　該血清を加熱不活性化する。 ４７、更に、該血ＷＲｔ工程（ｈ）の後に殺菌することを特徴とする請求の範囲 第４６項記載の方法。 ４８、該二価金属イオンがカルシウムイオンであるＭＸの範囲第４３項又は第４ ４項記載の方法−４９、請求の範囲第３９項の方法により調製された血清５０、 請求の範囲第４６項の方法によりｐａｖされた血清５Ｌ精求の範囲第１項、第２ 項、第３項、第９項又は第１２３Ｊｌのいずれかの血清な含んでなる細胞培養媒 体。 ５２、天然ウシ血清の細胞生育促進能力を高める方法において、該血清ン精求の 範囲第３５ｇ４記載の方法により処即することを特徴とする方法。