JPS60133886A - 細胞生長培地成分の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、哺乳類の細胞の組織培養に適した細胞生長培
地成分の調製方法に関するもので、特に、現在使用され
ている胎児期の子牛血清の一部もしくは全部の代替物と
して哺乳類の不死細胞の培養に適用できる。

従来の技術 および 哺乳類の細胞の栄養的要件は大部分の微生物の場合より
も厳しく、十分には規定されていない。

自由生活性（ｆｒｅｅ−１ｉｖｉｎｇ）生物よりも、哺
乳類の細胞は、多くの他の細胞の分化機能および各細胞
に対して正確に訓整されて安定な環境を保証する循環系
に応じて、有機組織の一部として分化生物（ｓｐｅｃｉ
ａｌｉｓｅｄ　Ｉｉ［りに適応される。このような細胞
は組織から分離して人工培地で生長させることは困難で
ある。大部分の動物細胞は懸濁液中では全く生長せず、
表面においてのみ生長するに過ぎない。しかしながら、
哺乳類の細胞を実験室において小規模に生長させる技術
か開発されている。

哺乳類の細胞培養は哺乳類の組織から出発する。

組織を機械的な方法もしくは酵素的な方法またはこれら
の両方法によって解離させてシンクル細胞と細胞小塊と
の混合物とする。この混合物を適当な液状生長培地へ接
種する。この種の培地は普通、塩類、グルコース、アミ
ノ酸、ビタミンおよび血清を通常は培地の５〜２０係の
割合で含有する。

血清は、現在のところ同定されていないが、人工培地に
おいて細胞が生存して生長するためには必要な成分類の
供給源として含有される。この目的のために最良な血清
と考えられている胎児期の子牛血清は高価であり、培養
を経済的に実施できるかどうかは主として該血清の価格
によって決定される。また、ＦＣ５中で生長させた細胞
から得られる生産物は、ヒトの臨床応用にとって望まし
くないボビン蛋白質によって汚染されるという問題があ
る。

大部分の哺乳類細胞は固体表面に担持しなければならな
いが、血液もしくはリンパ組織を原料とする細胞は、大
部分の腫瘍細胞および他の不死細胞（ｉ＋ｎｍｏｒｔａ
ｌ　ｃｅｌｌｓ）と共に、懸濁液中での生長に適合させ
ることかできる。

本明細書で使用する「不死細胞」という用語は、本来的
に不死の細胞を意味するもので、例えは腫瘍発現性ミエ
ロマ細胞や不死（ヒ細胞（例えばミ工ロマ細胞と融合し
て不死ハイブリドーマ細胞を与える哺乳類身体各部の細
胞）が例示される。その他の不死細胞としては、ニブス
タイ／−バーウィルスのような特定のウィルスによって
形質転換された細胞や化学的突然変異生成によって形質
転換された細胞が例示される。インターフェロ／の生産
に使用されているナマルワ（Ｎａｍａ　１ｗａ　７Ｉ＋
ｌＢ胞ｉ；！、ガール（ｇｉｒｌ）にみられる腫瘍から
自然発生的に生じる本来的に不死なセルライ／の一例で
ある。

従来は、不死細胞はＲＰＭＩ　１６４０のような確定さ
れた成分および高価なＦ　ＣＳのような不確定な成分を
含有する培地中で生長させなければならなかった。

哺乳類の血液、特にヒトの血液の加工処理によって入手
し得る生成物を血清の代りに使用するのは有利である。

ヒトの血液は輸血機関によるサプライから大量に加工処
理されている。血漿フラクションを調製して、例えばア
ルブミ７、イムノクロブリ／、および血液凝固チェーン
の欠失の治療に不可欠な蛋白質サプライを生産すること
かおこなわれている。

ヒトの血漿は冷エタノール沈殿法によって都合よく分別
される。この方法では、血漿を５℃以下のエタノールで
処理し、エタノールの濃度ヲ高メ、ＰＨ値を下げてゆく
ことによって逐次フラクションを沈殿させる。各沈殿後
の上澄み液は次の沈殿処理に付される。全体のテクノロ
ジーは［コーン沈殿法（Ｃｏｈｎ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａ
ｔｉｏｎ）　Ｊという包括的な用語で通常は記述される
。これはコーン（Ｅ、Ｊ。

Ｃｏｈｎ）らの方法に基つ（（Ｊ　、Ａｍｅ　ｒ　、Ｃ
ｈｅ＋ｎ、Ｓｏ　ｃ　、。

第６８巻、第４５９頁〜第４７５頁（１９４６年）参照
）。もつとも、この文献に記載されている最初の方法は
長い間に改良修正されている。このようなものとしては
次の支献が挙げられる：Ｊ、Ｇ。

Ｗａｔｔ、Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｉｎ　ＨｅａｍａｔｏＬｏ
ｇｙ、第５巻、第９５頁〜第１１２頁（１９７６年）、
Ｐ、　Ｋ１５ＬｌｅｒおよびＩ（、Ｆｒ１ｅｄｌ　ｉＪ
メソツズ・オブ・プラズマ。

プロティン・フラクショネーション（Ｍｅ　Ｌ　ｌ］ｏ
ｄ　ｓｏｆ　Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｒａｃ
ｔｉｏｎａｔｉｏｎ）Ｊ（Ｊ、Ｍ。

Ｃｕｒｌｉｎｇ１％、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（
１９８０年））、第３頁〜第１５頁。おおまかに言えは
、沈殿する第１フラクシヨノはフイブリノーゲ７とフイ
フ゛ロネクチンを含有し、第２フラクシヨンはガノマー
グロブリンを含有し、第３フラクシヨ７はベータークロ
ブリ／を含有し、第４フラクシヨ／はアルファークロブ
リ／を含有し、第５フラクシヨ／はア／ｌ／フミ７を含
有スる。第５フラクソヨンはエタノール濃度４０％、ｐ
ｉ−１５２で捕集される多量生成物で、商業的に有用な
生成物である。各フラクションは他の７ラクシヨ／の成
分およびその他の物質によってかなり汚染される。フラ
クソヨ７　ＩＶを種々の異なった条件下で回収すると種
々の生成物が得られる。例えは、フラクションＩＶ　は
ＩＶ　（１１およびＩＶ（４１として知られている２種
のカットとして捕集され、後者の方がより多（のトラン
スフェリンとアルブミンを含んでいる。

哺乳類の細胞を培養する場合の血清の代替物としてヒト
の血漿成分を使用する多くの試みがなされている。以下
の説明は、種々の研究方針の代表例と考えられる先行技
術をほぼ年代順に抜粋したものである。

Ｋ、　ＬａｍｂｅｒＬおよびＳＪ、Ｒｒｔ］論文［Ｄｅ
ｖｅｌｏｐ。

１）ｉｏｌ　、５ｔａｎｄａｒｄ、第３７巻、第６３頁
〜第６６頁（１９７７年）（ウィルスワクチン生産用細
胞サブストレートの規格１ヒに関するＷＩ−１０／ＩＡ
ＢＳ合同シンポジウム、１９６６年１２月、シュネーブ
）〕は、ヒトのディプロイド細胞を生長させるための生
長培地の成分としての血清の代替物に関する問題点を再
検討したものである。これらの研究者はコーン沈殿法に
より血液の蛋白質フラクションの生長ファクター活性を
調べた。生長ファクターは特にコーンフラコションＩＶ
において回復さぜることがてきるか、この方法は再現性
が悪く、このようなフラクションで全血清を代替するこ
とはできないことか報告されている。血漿中に含まれて
いるツマトメジノまたは非抑制性イノシュリン様アクチ
ベータ−（ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　ｉｎｓ
　−ｕｌ　１ｎ−１ｉｋｅ　ａｃｔ　１ｖａｃｏｒ　；
ＮＳ　ＩＬＡ　）がヒトのティプロイド細胞の生長にお
いて血清の代替物としての役割を果たすかもしれないこ
とが推測されている。

Ｊ、Ｌ、　ＭｅｌｎｉｃｋおよびＣ０Ｗａｌ　Ｉ　ｉ　
ｓの論文’Ｉ）ｅｖｅｌｏｐ。

ｂｉｏｌ　、　５ｔａｎｄａｒｄ、第３７巻、第７７頁
〜第８２頁（１９７７年））は、生長培地中での血清の
重要な機能は蛋白質分解酵素トリジン／を抑制する能力
であるという理論を追跡したものである。トリプシンの
インヒビターとして種々の培地を用いることによってこ
の理論か調へられた。これらにはアルブミ／、ヒトの血
漿のコーンフラクショ／ＣＩＶ、ＩＶ（１１およびＩｖ
　（４）　’ＩＩ、フェツイン（［ｅｔｕｉｎ）。

べ一ターグロブリ／、ガンマーグロブリ／および子牛血
清が含まれる。十分に洗浄し、血清なして培養させた細
胞は血清フラクショ／１Ｖ（４）　もしくはフェツイン
が存在する場合にのみ効率よ（単一層に生長した。

Ｎ、Ｎ、　ｌ５ｃｏｖｅおよびＦ、　Ｍｃｌｃｂｅｒｓ
　の論文（，１ｏｕｒｎａｌ　ｏ［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４７巻、第９２３頁〜
第９３３頁（１９７８年））は、アルブミン、トランス
フェリンおよびリピドとの混合物かりポポリサツカライ
ド（Ｌ１’Ｓ）−刺激されたマウスＢリンパ球のサポー
タ−として血清と完全に代替し得るということを提案し
ている。

しかしながらこれらの結果は、新しい培地、即ち常套の
Ｒ１）Ｍ１１６４０培地よりもアミノ酸やビタミンの含
有量の多イＩ）ｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（
１）　Ｍ、　Ｅ　Ｍ　）を併用して得られたものである
。載置相から生長を誘発させ、またイムノグロブリノが
分泌される段階まで生長させるには、細胞はＬ　Ｉ）　
Ｓを必要とする。

Ｋ、　ＬａｍｂｅｒＥおよびＳ、Ｊ、　ＰｉｒＬは子牛
血清の限外濾過７ラクノヨ／を用いる試験をおこなった
（Ｊ　、Ｃｅ１ｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、第３５巻、第３８
１頁〜第３９２頁（１９７９年））。この物質（分子量
１０．０００ダルトノもしくはそれゆ、下）はヒトのデ
ィプロイド細胞の生長を補助した。このことは、Ｎ５Ｉ
ＬＡ、ソマトメジンおよび表皮性生長ファクターＣＦＣ
Ｆ）のような生長ファクター混合物に起因すると結論づ
けられている。

生長刺激性培地としてヒトのｍｔｉフラクショ７を使用
する詳細な研究が１−１．５ｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ
らによッテなされた（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ部４４巻、第１４４頁〜第１５６頁（１９７９
年））。

ミトゲン・コノカナバリノＡによって刺激されたマウス
とラットのり７８球は蛋白質を含まない培地中ではほと
んど生長ぜず、アルブミンを培地に含ませると十分に生
長し、ヒトの血漿のコーンフラクションＶＩをアルブミ
ンの代りに培地に含ませるとある程度は生長するが、コ
ーノフラク７う／ＩＪ、用またはＩＶを用いるとほとん
どもしくは全く生長しないことが見出された。

１ｉｉｌ記のＭｅｌｎｉｃｋとＷａｌｌｉｓの研究はＡ
、　Ｊ　、Ｎ４ａｃＬｅｏｄとＯ、Ｉ）ｒ　＋ｎｎｍｏ
　ｎ　ｄによって追跡された（１）ｅｖｅｌｏｐｂｉｏ
ｌ　、　５ｔａｎｄａｒｄ、第４６巻、第１７頁〜第２
０頁（１９８０年））。種々の血清およびヒトの血漿分
別の副生成物から調製された蛋白質溶液か分析された。

フラクションＩｖ（４１溶液、および凝固ファクターを
欠いた血漿（他のファクターは全て含有〕から調製され
た溶液か高い細胞密度での細胞生長を補助することか報
告されている。細胞の種類については言及されていない
か、実際はスキンの繊維芽細胞であった。

Ａ、、　Ｊ　、　Ｍａ　ｃＬｅｏｄの論文（Ｎａｔｕｒ
ｅ、第２８５巻、第１３６頁〜第１３７頁（１９８０年
））は、組換１）　Ｎ　Ａ技術の使用を含むヒトの蛋白
質の生産方法およびハイブリドーマセルラインの調製を
含む哺乳類細胞の形質転換に関するものである。ヒトの
血漿の分別の副生成物が、インヴイトロで培養されたヒ
トの細胞生長のサポータ−となり得ることが提案されて
いるが、それ以上明確な提案はなされておらず、このよ
うな副生成物か主としてアルファーおよびベーターグロ
ブリン並ひに低分子量蛋白質から成り、これらか培養に
とって必要な多くの特定の成分を含有することは既に知
られている旨のコメントかみられる。

ＲｏＷｅｉｎｓＬｅｉｎらの論文（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　ＣｃｌｌｕｌａｒＰｌｌｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１１
０巻、第２３頁〜第２８頁（１９８２年））には、正常
なヒトの包皮繊維芽細胞（Ｎ　ＨＦ　Ｆ　）のインウ゛
イトロでの培養用の血清を含まない培地が記載されてい
る。酸および熱抽出されたコーン７ラクシヨノＩＶを含
む培地を用いて試験がおこなわれた。酸および熱抽出の
ステップはソマトメジンを生産するためのものである。

この論文ではこの物質を単に「ＣＦｌｖ」として記載し
ているか、完全なフラクションよりも、この酸および熱
抽出された物質を意味することは明らかである。「ｃＦ
’ｌＶＪ　ツマトメジノを省略してもＮ　ＩＩ　Ｉ＝’
　１；の生長度は低下しないことか記載されている。こ
の論文では結論的には、［ｃＦＩＶＪを含有せずに、イ
／ソユリノ、トランスフェリン、トロ／上／、ヒドロコ
ルチソ／＋オバルブミ７、アスコルビン酸、微量元素お
よびＩ）　Ｍ　Ｅ　Ｍを含有する「培地Ｆ」が推奨され
ている。

Ｔ、Ｋａｗａｍｏｔｏ　らの論文（ＡｎａｌｙＬｉｃａ
ｌ　Ｂｉｏｃ　−１〕ｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒ　ｙ　、第１
３０巻、第４４５頁〜第４５３Ｊ（１９８３年））には
、マウスのミエロマ細胞の培養用の血清を含まＩＪい培
地［Ｋ　Ｓ　１−　ＭＪが記載されており、該培地はＲ
ＰＭＩ　１６４０．１）へ４ＥＭおよびＨａｍ　Ｆ　１
２　として知られている培地を２：１：１の体積比で含
む混合物、Ｌ−クルクミン、ピルピノ酸ナトリウム、グ
ルコース、ベニシリ／、アノピノリンおよびストレプト
マイシンを含有し、さらに結晶性のボビンインシュリン
、Ｆｅ”十を含ｔ　すいトランスフェリン、２−゛アミ
／エタノール、２−メルカプトエタノール、亜セレン酸
ナトリウム、ヒトの低密度リポ蛋白質、および結晶性の
脂肪酸不含ＢＳＡとコンプレックスを形成したオレイン
酸を添加したものである。この研究はＮｉＪ記のｌ５ｃ
ｏｖｅ　（！：　Ｍｅｌｃｂｅｒｓの研究方針に従うも
のである。

最近、（：、Ａ、　Ｃｏｎｏｖｅｒらニヨッテ、ｌニド
（７）下−ｍ体機能低下症血清（１−１１（Ｓ）の存在
下でのヒトの繊維芽細胞の生長と複製についての研究か
なされた（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　
Ｐｈｙｓｉｏｌｎｇｙ、第１１６巻、第１９１頁〜第１
９７頁（１９８３））。この場合の実験は、ソマトメジ
アＣ（ＳＭ−Ｃ：）としても知られているインシュリン
様生長ファクター−１を含有するコーン７ラクシヨノＴ
Ｖ＋１１のサブフラクションを用いておこなわれた。細
胞の生長は胎児期の子牛血清（Ｆｅ５）を２０楚含有し
たＩ）　Ｍ　Ｅ　Ｍ中でおこなわれた（Ｆｅ３は種々の
量のＳＭ−Ｃによって置き換えられた）。

ＳＭ、−（：はそれ自体（ＨＨＳ不存在）ではＦ　ＣＳ
の代替物とはならなかった。ｌ−口４Ｓか１Ｌｆｂ存在
すると、ＳＭ−ＣはＦｅ５の場合はとてはないか、細胞
生長を補助した。

舅、上のように、血漿成分の役割に関する先行技術には
多くの矛盾や不確定な点があることは明らかである。例
えば、ＭａｃＬｅｏｄとＤｒｕｍｍｏｎｄ（１９８０年
）およびＭｅｌｎｉｃｋとＷａｌｌｉｓ　（１９７７年
）はコーンフラクションＩ　Ｖ（４１が細胞生長を促進
すると提案し、Ｌａｍｔ〕ｃｒｔとＰｉｒｔ　（１９７
７年、１９７９年９おヨヒＣ；ｏｎｏｖｅｒ　（１９８
３年）はソマトメジンのようなフラクシヨンＩＶの他の
サブ成分に注目しており、一方、５ｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏ
ｌｅｉ　（１ｇ７ｇ年）らはフラクシヨンＩＶを有用な
生長ファクターを与えるものから除外し、またＷｅｉｎ
ｓｃｅｉｎ（］　９９８２年らはフラクションＩＶを最
適な血清不含生成物の成分から除外している。

問題点を解決するための手段 本発明者は驚くへきことにべの知見を見出した。

即ち、コーンフラクションＩＩ　十ＩＩＩ、■１、ＩＶ
（１１もしくはＩＶ（４１に相当する冷エタノール沈殿
フラクションを特定の方法によって加工処理して得られ
る生成物は、哺乳類の細胞生長用の培地の血清不含成分
として直接使用することができ、血漿の他のサブ成分ま
たは血清中に存在する生長ファクターの添加を必要とし
ない。しかしながらフラクションＩＩ単独またはフラク
ションＶがらは有用な生成物は得られない。

フラクションの加工処理には次のステップが不可欠であ
る： １、冷却したフラクションの温度を過度に上昇しないよ
うに保存する、 ２、フラクションを均質化する、 ３、　ホモジエネートのｐＦｌ値を高めて蛋白質を再溶
解さぜる、および ４、生成物を滅菌処理に付す。

本発明の重要な特徴によれは、 （ａ）フラクション中の全蛋白質重量に基ついて８５％
以下、好ましくは７５％以下、より好ましくは６５％υ
、下のアルブミンと６５係以下のガンマーグロブリノを
含有する脱繊維素１ヒ血漿フラクシヨンを冷エタノール
沈殿によって曲乳類の血漿から抽出し、（１））抽出物
を次のステップ（Ｃ）による均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉ
ｓａｔ　１ｏｎ）をおこなうまで１０’Ｃ以下の温度で
冷却保存し、（Ｃ）冷却抽出物を均質化し、（ｄ）ホモ
ジエネートのｐｆ（を高めて実質上すべての沈殿蛋白質
を再溶解させ、（ｅ）該調製物のｐｉ４を１ｌＩ８乳類
の細胞生長にとって生理学的に許容されうる値に調整し
および調製物を滅菌処理に付すこと（ｐｉ−１調整と滅
菌処理はいずれの順序でおこなってもよい）を含む、イ
ンヴイトロで哺乳類の細胞を生長させるための成分であ
って、特定の培地のザプルメ／トとして有用な細胞生長
培地成分の調製方法が提供される。

冷エタノール沈殿法による抽出操作には、Ｐｌ−１値を
下げ、エタノール濃度を高め、このような各ステップ後
に得られる沈殿物を捕集する操作が含まれる。類似のコ
ーンフラクションを沈殿させるにはｐＨ値とエタノール
濃度との種々の組合せを用いてもよく、所定の数的表示
による各コーンフラクションは、所定のエタノール濃度
での小さなｐＨ値の範囲または所定のｐＨ値でのエタノ
ール濃度の小さな範囲において得られる沈殿物を示す。

従って、本発明の好ましい態様をより正確に説明するた
めに、ｐ　Ｉ−１値（横軸）とエタノール濃度（縦軸）
とのマトリックスもしくは２次元プロットを示す添付図
（第１図）を参照する。これによって本発明において特
に有用であると考えられるコーンフラクションはｐＨ値
とエタノール濃度によって適切に限定することかできる
。

第１図において、破線（１）および点線（２）はコーン
沈殿の異なったレジームを示す。両者ともＩ〕１（７２
の血漿から開始し、エタノールを８係まで添加するとフ
ラクション１（Ｆｌ）が沈′殿する。次いで」ニ澄みＰ
ｌ」を６．８まで下げ（水平線９、エタノール濃度を増
加させる。この手順はもちろん逆にしてもよい。エタノ
ール濃度をレジーム１においては２５％まで増加させ、
レジーム２においては２２φまで増加させる。得られる
沈殿物はコーンフラクションＩＩ　＋ＩＩＩの混合物で
ある。次いで上澄みを２つのレジームにおいて異なった
処理に付す。

レシーム１においては、エタノール濃度を大きく増加さ
せ、ｐ　Ｉ−１を適度に減少させることによってコーン
フラクションＩＶ（４＋を得た後、ｐＨをさらに減少さ
せ、ｐｆ−１４，７でエタノール４０％のときにフラク
ショ／Ｖ　＋Ｖｌ　を得る。レジーム２においては、フ
ラクションＩＩ　＋１．１１の」―澄のｐ　Ｈを大きく
低下させ、エタノール濃度を適度に増加させることによ
ってフラクションｉＶ　（１１を得た後、田４７でエタ
ノール３０％のときにフラクション１ｖｔ４＋とＶの混
合物を得る。

レジーム１および２は、フラクションＩｌおよび１１、
Ｉ　をＩＶから別々に捕集し、次いでＩＶ　（１１また
ハＩＶｆＪ　ノフラクションＩＶを捕集する分別過程を
示す。特にこの種の過程において、本発明方法に最も有
用なフラクションの範囲には四辺影領域ＥＸＹＺ内のフ
ラクションＩＩ十用または１１１　のタイプ、方形領域
ＡＪ　ＫＬ内のＩＶ　（１１タイプおよび方形領域ＭＮ
ＣＰ内のＩＶ（４１タイプのものが含まれる。

他のレジームにおいては分別はフラクションＩからフラ
クションＩＶ　まで連続的におこなわれる。

従って、本発明において有効なフラクションＩＶの大部
分を包囲する領域として五角形領域ＡＢＣＥ　＋）を限
定するのが有用である。この領域内においては、領域Ｍ
ＮＣＰによって限定される１、Ｖ（４１タイプのフラク
ションよりも本発明においては幾分良好な結果を示すの
で好ましい領域ＡＪＫＬによってＩＶ（１１タイプのフ
ラクションか限定される。

使用スるツー／フラクションは常にフラクシヨンｌ以後
のものでなければならない。即ち、フィブリノーゲンや
フィブロネクチンのようなフィブリンを含有しないもの
でなけれはならない。また、フラクソヨンＩＪ自体、即
ちフラクション１．１１　と混合しないフラクションＩ
■はガンマーグロブリノ含有量が高いので通常は本発明
に使用するには不適である。一般的に言って、出発フラ
クシヨンのガンマ−グロブリン含有量は出来る限り低く
ずへきで、フラクシヨンＩＩ　＋ＩＩＩの場合には典型
的には６５％までである。（本明細書においては、ガン
マ−グロブリンおよびアルブミンの含有量は全蚤白質の
重量に基づ（重量係で表わす。）この含有量ハフラクシ
ョノＩＩ　十ＩＩＩからフラクション川を分離するか、
またはｎ　＋ｌｌ−１の代りにまず第一にフラクノヨノ
用　を取り出すことによって減少させることかできる。

フラクソヨＺ　ＩＩ　十ＩＩＩに基づく調製物を含有す
る培地中ての細胞の生長は遅いので、フラクションＩＶ
を使用するのか好ましい。フラクションＩＶのカフマー
グロブリン含有量は、最初にフラクショ７　ＩＩもしく
はＩＩＩ　を取り出さないときでも１５％を越えること
はなく、フラクションＩＩもしくはＩＩＪ　を最初に取
り出した時は５％を越えない。このようなフラクション
は本発明に使用するには好ましい。アルブミンは細胞の
生長にとって有毒ではないと考えられているが。

細胞の生長にとって有益な成分かアルブミンによって過
度に希釈される。従って、有意の量のフラクション■を
含有するフラクンヨノＩＶ十Ｖは望ましくないアルブミ
ンを８５％以上含有する。以下の実施例において言及す
るフラクションＩＶ（４）十ｖからは、おそらくこれら
の理由によって、細胞生長を補助するのに有効な調製品
は得られなかった。アルブミン含有量は約７５係以上で
ないのが好ましく、最も好ましくは６５％以上でない。

第１図は通常のイオン強度約０．１（無次元）のモトて
のコーン沈殿に関するものである。」ニ澄の希釈によっ
てイオン強度は低下するので、その後のフラクションを
沈殿させるのに必要なエタノールの濃度も低下する。も
ちろん、これは被処理物の容積を太き（するのみで、通
常は血漿の希釈には影響されない。しかしながら、本発
明において有用なフラクションには、血漿の他のイオン
強度におけるそれらの等何物が含まれる。

フラクションは注意深（制御された冷却下に生成し、沈
殿物は遠心分離機によって分けられる。

遠心分離機から取り出すときの沈殿物は５°Ｃす、下に
冷却される。遠心分離機から取り出した固体状の生成物
は典型的には、乾燥固体的４０％および液体約６０％を
含有するゼラチン状ペーストである。この液体には多量
のエタノールが含まれ、フラクションＩＶ　（１１の場
合には典型的には液体の約２０％Ｖ　／　Ｖ　はエタノ
ールである。この段階での蛋白質は損傷を受けやすく、
エタノールの局部的な高濃度と低いｐ　１−１との組合
せ効果によって不可逆的に変性され、温度が上昇すると
さらに損傷を受けやす（なる。従来の研究者たちはこの
処理段階での蛋白質の厳しい環境条件の重要性を理解し
ていなかったと考えられ、このことか、少なくとも部分
的には細胞生長培地の成分としてのフラクシヨンＩＶ　
ｔ４ｊの量に関する先行技術における矛盾の原因と考え
られる。本発明においては、エタノールの局部的濃ｆヒ
を、その後に続く均質（ヒによって排除するまでの温度
を好ましくは１０’Ｃ以下、最も好ましくは約５℃もし
くはそれ以下に維持する。これは調製物に氷を添加する
ことによっておこなってもよい。

均質化においては、均質状態に達するまで低温を維持し
、次いで上昇、例えは２５℃まで温度を」ニげるのか安
全であるか、次のステップにおいてｐｌ−１を増加させ
るまで１０℃以下の温度に保つのが好ましい。均質化は
激しい「クリーミノグ」をおこなうことができるいずれ
の装置を用いておこなってもよい。氷を冷却段階で添加
する場合、均質化後にいくつかの塊が認められ得る。

ｐ　１−１は毒性生成物を形成させないような常套の強
アルカリ、例えば水酸化ナトリウムを用いて増加させる
ことができる。蛋白質を溶解させるためにｐｌ−１を増
加させることか必要である。一般的に言えば、蛋白質は
溶解しないと細胞生長に寄与しない。蛋白質を溶解させ
るのに必要な典型的なｐｉ−１は６．０〜６５の範囲で
ある。蛋白質か溶解すると、不透明なアイスクリーム状
の物質は半透明の物質に変（ヒし、このことは蛋白質分
子かそのポリマー鎖の再配列によってひずみのより少な
いコノフイグレーショノに便化したことを示すものであ
ると考えられる。この段階では、ｐＨを実質上すべての
蛋白質を溶解するのに有効な値ゆ、上に高めることは不
要である。他方、生成物のｐｌ−１は結局は哺乳類の細
胞にとって生理学的に許容され得る値に調整しなけれは
ならない。換言すれば、生成物を細胞生長培地成分とし
て使用するためには、最終的なｐ　Ｉ−１は、細胞が培
地中で生長するのに許容されうる値でなけれはならない
。この値は細胞の種類にも幾分依存するか、一般的には
、最終的に７．０〜７．５の範囲、好ましくは約７．２
に増加さぜるのか望ましく、これは蛋白質を溶解させる
ためのμｍ■増加ステップの一部としておこなうのが便
利である。

プロセスの残りの段階は滅菌性の生理学的に許容され得
る生成物の調製に関する。滅菌処理は常法による加熱に
よっておこなうことはてきす、最良の方法は漸進的な微
細孔を有する非常に微細なフィルターを１個もしくはそ
れ以上通過させる濾過によっておこｊＳう。濾過をおこ
なう口１」に、フィルターの目詰りをおこさせる粗状固
体を除去しなければならない。粗状固体は遠心分離によ
って除去することができる。（この操作は、微細濾過か
後の処理ステップてないときでも、それ自体望ましいも
のである。）ステップ＋、ｄ）からの生成物を効果的に
遠心分離させるためには、生成物を最初に希釈するのが
通常は実際的である。この希釈には水を用いることもで
きるが、生理的塩類溶液〔緩衝剤で処理して所望の生理
的ｐＨ（例えは約７．２）および所望のイオン強度もし
くはオスモル濃度（例えば生成物に対して約３００　ミ
ＩＪオスモス／即）を付与した塩化すｌ−１Ｊウム水溶
液〕を使用するのがより好適である。遠心分離の前に固
体を凝集させるのが望ましく、これは調製物を３０℃ま
で加温することによっておこなうことかできる。

次いで粗状固体を遠毛・分離によって沈降させ、上澄液
を回収する。

この段階、即ちＰｌ−１調整後において、ガフマーグロ
ブリンを除去するのが望ましい。典型的なフラクション
ＩＶ　（１１においては、ガンマ−グロブリンは全蛋白
質の約２５重量係を占める。ガノマーグロブリ７は細胞
から培地へ分泌されるモノクロナル抗体のような蛋白質
の回収もしくは利用を妨げる。典型的には、このような
ガノマーグロブリンの分子量は約１４５．０００（Ｉｇ
Ｇ）である。全蛋白質中でガノマーグロブリンが占める
割合は例えはポリエチレングリコールによる沈殿、塩析
、冷エタノール沈殿またはサイズ排除クロマトグラフィ
ーによって減少させることかできる。実質」−すべての
ガンマ−グロブリンを除去するのか好ましい。

低分子量物質、例えば約５．０００１Ｊ、下、好ましく
は約２．０００９、下の物質を除去することもてきる。

分子量が５．０００〜６，０００の物質はいずれにして
も保持すべきである。これは生成物を濃縮し、塩水に対
して透析した後、分子量２．０００孔径のフィルターを
通す濾過によっておこなうのか好適である。別の方法は
、例えは５ｅｐＨａｄｅｘ　Ｇ−２５（Ｐｈａ　ｒｍａ
　ｃ　ｉ　ａ社）を用イルゲル浸透’ｌ　０７　トクラ
フイー法である。

次いで調製物は所望により１回もしくはそれ９゜上の微
細濾過処理に付し、最終的には例えは０．２μｍの粒径
にする。生成物は滅菌容器内において一２０℃で貯蔵す
ることかできる。

この方法による生成物は「本発明調製物」と呼ぶ。これ
は特定の培地、例えはＲＰＭＩ　１６４０培地、ダルベ
ツコの改良イークル培地（ＤＭＥＭ〕、ハムのＦ−１２
培地、またはＩ）　Ｍ　Ｅ　ＭとハムのＦ−１２との混
合培地に添加したときに少な（ともある種の油孔類不死
細胞の生長を補助する完敗 全な成分を意味する。この形態では、ｌ細胞（ｍｏｒｔ
ａｌ　ｃｅｌｌ）を表面に付着させ、それらが生長した
ときに表面に拡散する他のファクターの添加なしでは哺
乳類の不死細胞を通常は補助しない。

一般に、このような目的に必要な物質にはフィブロネク
チンやイ也の蛋白質、例えば゛フィブリノ、フィブリノ
ーゲン、コラーゲンまたはポリリシノか含まれると考え
られている。これらの作用は酵素、例えばファクター刈
１１の添加によって改良され、特に拡散効果を促進する
。表面は必要なファクターを培地内に含有させないて′
＄、覆によって予め調製することができる。

本発明調製物はＲＰＭＩ　１６４０　と共働して、ウィ
ルスによって形質転換された不死細胞を含む柚々の不死
細胞、Ｎａｍａｌｗａや１−ｔ　Ｆｐ　−２のようｊＳ
本来的な不死細胞、および別のノ・イブリドーマセルラ
イン等の生長を補助する場合に十分に作用する。

従って本発明はまた、本発明による生成物を補光した特
定の培地、好ましくはＲ１’ＭＩ］６４０を含有する培
地内において哺乳類の細胞、特に不死細胞の培養方法を
提供する。本発明にはこのような培養による生産物も含
まれる。特に本発明には、本発明調製物を含有する培地
内で培養したハイブリドーマセルラインから得られるモ
ノクロナル抗体が含まれる。

本発明はまたより一般的には、モノクロナル細胞用の昶
１胞生長培地内での本発明調製物の使用方法を提供する
。これは常套の培地の血清成分の一致 部または全部を代替することかできる。普通５些細胞は
いくつかの血清成分、例えは細胞分裂を開始するミトゲ
／として有用なトロンビンまたは前記のファクターＸ用
を必要とする。

本発明をヒトの血漿に関連して説明したか、他の動物の
血漿も必要な変更を加え、特に細胞培養生産物を獣医の
分野に利用する場合に使用することができる。

以下の実施例によって本発明を説明する。温度は℃単位
で示す。比および割合は特に言及しない限り容量に基つ
く。

実施例 実施例１ コーンフラクションはスコツトラッド国立輸血サーヒｙ
、ノ蛋白質分別センター　（１’ｒｏｔｃｉｎ　Ｆｒａ
ｃ　−ｔｉｏｎａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｏＥ　ｌｅ
　５ｃｏｔｔｉｓｈ　Ｎａｔｉ　−ｏｎａｌ　Ｂｌｏｏ
ｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ：Ｅｄｉ
ｎｂｕ−ｒｇｂ）から入手した。分別は、種々のｌ）　
ｉ−１値の血漿へ冷エタノールを添加することによる一
連の蛋白質沈殿によっておこなった。第１フラクシヨン
ＩはｐＺ−１５，８、エタノール濃度８％、温度〜２５
゜において沈殿させた。続いて次のフラクション■十Ｉ
Ｕ　をｐＨ５７、エタノール濃度２１φ、温度−５°で
沈殿させ、第３のフラクションＩＶ　（１）はＰＩ（５
，２、エタノール濃度２１％、温度−５°で沈殿させた
。別の手順においては、プラク９３フ１１士ＩＩＩ　を
ｐＨ６，８、エタノール濃度２５％、温度−５°におい
て沈殿させ、第３のフラクションＩＶ（４１はＰＩ−１
５，８５、エタノール濃度４０％、温度−５゜において
沈殿させた。さらに別の手順においては、フラクション
ＩＶ（４１を■と共にＰＩ（５，２、エタノール濃度４
０％、温度−５°において沈殿させた。

各段階での上澄液のイオン強度は約０．１であった。

蛋白質フラクションペーストを遠心分離機ボウルから取
出し、氷／水を２に９保有した風袋を秤量した鋼製バケ
ツ内へ直ちに移した。ペースト、氷および水を保有する
バケツの全重量からペーストの重量を計算した。氷／水
をさらに添加して氷／水の全重量をペーストの重量と同
一にした。・ペーストを大まかにいくつかのピースに切
断シ、バケツの内容物を素早く手動撹拌させた後、工業
的なフードミキサー（Ｉ−１ｏｂａｒｔ社製）のボウル
内へ移した。混合物を平らなミキシングパドルを用い、
全ての氷か融解する前に、該パドルまたは該ボウルの底
部や側部に何着した懸濁液中にペーストの残塊が認めら
れなくなるまで撹拌した。ｐＨはＩＮＮ　ａ　０ｔＩを
撹拌下に徐々に添加しながら７．２まで上げた。全ての
氷が溶けた後、沈殿物を一２０°で凍結させ、後日のそ
の後の処理のために保存した。

血漿蛋白質調製物の一部を水または塩類溶液（６ｇ　／
　ｌ　ＮａＣｌ、０．４　ｇ／ｌ！Ｋ　ＣＩ　）を用い
て室温で１＝９に希釈し、充分に混合した後、１５℃で
３０分間遠心分離処理に付した（平均Ｒ，Ｃ，Ｆ。

ｓｏｏｏｇ）。上澄を捕集し、厚さＡＰ２５の格子タイ
プのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を通す濾過
処理にイ」し、次いで孔径１．２μｍη、０．４５μｎ
１および０．２２μｍの膜フィルターを通すことによっ
て精製した。最終的な濾液を滅菌フィルター（０，２２
μｍ）を通すことによって滅菌し、ｅ、閉容器内に捕集
して使用に供するまで一２０°Ｃで凍結保存した。最終
生成物の全蛋白質含有量Ｃｇ／ｌ）は、遠心分離および
濾過処理前の調製物の値の９５係以上多かった。典型的
な調製物、即ち、最後に水で希釈したフラクションｒｖ
　（１１の特性は次の通りである： 全蛋白質　１５．２　ｇ／ｌ アルブミン　４．５ｇ／ｊ？（電気泳動による）カリウ
ム０．１４１１ＴｎＯ１／ｌ クエン酸塩　１，１ｍｍｏｌ／１ 塩（ヒ物　４０　ｍｍｏ　ｌ　／１ 燐酸塩　０．４　ｍｅｍｏ　ｌ　７７３工タ／−ル　９
．８ｍＵｌ ＰＨ７，２ 伝導率　１１．３９　ｍＭ　ｈ　。

オスモル濃度　１１８ｍＯｓｍｏ、Ａ９咄乳類の細胞生
長における本発明生成物の使用 これらの実施例においては、以下に記載の点を除き、実
施例１のようにしてコー７フラクション調製物を調製し
た。

実施例２ ヒトの赤血球のグループＡ抗原に対する抗体を作るマウ
ス−マウスハイブリドーマセルラインＥＳ−５を、コー
ンフラクションＩＶ　（１１調製物５％　ｖ／ｖのみを
補光したＲＰＭＩ　１６４０　培地内において生長させ
て抗体を生産した。この培地内で１６力月間生長させた
細胞は、胎児期の子牛血清を補充した培地内で培養した
細胞と比べて同様に生長し、少なくとも同量の抗体を生
産した（血球凝集検定法によって測定）。１Ｏ３／ｒｎ
Ｉ〜１０５／ｍｔの間の種々の細胞密度から出発したが
、約１０〜１５日後の細胞密度は１０６細胞／ｍｌ以」
−になった。

実施例３ エプスタイン−バーウィルス−形質転換ヒト末梢り、／
パ芽球白血球を、Ｍ、　５ｔｅｉｎｉＬｚ　らの方法に
よって調製した（ＮａＬｕｒｅ、第２６９巻、第４２０
頁〜第４２２頁（１９７７年））。これらの細胞を胎児
期の子牛血清を１０φｖ／■補光したＲ　ｌ）Ｍ　１１
６４０内で培養し、次いでフラクションＩＶ　（１１調
製物５％ｖ／ｖのみを補充したＲＰＭＩ］６４０へ移し
た。フラクションＩＶ（１１を補充した培地内でのこれ
らの細胞は４力月後には、胎児期子牛血清を補光した培
地内の場合と同様に生長した。最初は約１０／ｍｌｌで
あった細胞密度は急速に増加シテ１０６／ｍｔとなった
。

実施例４ ヒトの抗生長ホルモン免疫クロプリンを生産する２種の
マウスハイブリドーマセルラインおよび抗プロラクチ／
を生産する２種のラッＩ・ハイブリドーマセルラインを
、フラクソヨ：／　ｌ　Ｖ　（１１調製物を５％ｖ／ｖ
補光したＲＰＭＩ　１６４０内て生長させた。

ＦＣ５を１０楚補光したＲＰ八へＩ　１６４０の場合に
比べて生長は幾分遅かったか、最後の細胞密度および生
産性は同様であった。

実施例５ ヒトのセルライア　Ｎａｍａ　ｌ　ｗａおよび■−Ｉ　
Ｅ　Ｐ　−２（ヒトノ腫瘍セルライン）を、フラクショ
ンＩＶ）ｕ＋調製物を５％ｖ／ｖ補光した培地へ移し、
３力月後の生長を判定したところ、光分に適応した。細
胞密度は１０４／ｒｎ１．から１０６／ｒｎ１．に増加
した。

実施例６ 実施例１のフラクションｘｖｔ１＋ｚ製物をＡｍｉｃｏ
ｎＹＭ２　膜（２，０００分子量孔径）を用いる限外濾
過によって濃縮し、全蛋白質を１６ｏ　ｇ／ｌ　とした
。

この濃縮したフラクションＩ　Ｖ　（１１を生理的塩類
溶液を用いて順次倍増希釈（Ｖ／Ｖ　）することによっ
て２〜３２倍希釈した調製物を得た（１６倍に希釈した
試料は濃縮前のフラクションＩＶ　（１１にほぼ和尚す
る）。これらの６種の調製物の各々を５係ｖ／ｖの割合
で、ＥＳ　−５細胞培養用のＲＰＭＩ　１６４０培地へ
補光した。未希釈調製物および８倍まで希釈した調製物
を補光した４種の培養物はかなり急速に劣化し、この場
合、フラクションＩＶ（１１調製物の濃度が高いほど急
速に劣化かみられた。１６倍希釈した調製物および３２
倍希釈した調製物を用いた場合には細胞は生長し続けて
抗体を生産したが、特に前者の方がかなり効率がよかっ
た。これらの結果は、フラクションＩＶ（１１調製物を
使用した濃度が最適濃度に近いことを示す。

実施例７ 実施例１のようにして調製したフラクショ／■（１）を
、分子量４００Ｏのポリエチレングリコール（ＰＥＧ−
４０００）を１０％ｖ／ｖ添加することによってさらに
分別した。これによってフラクションＩＶ（１１中に存
在する一部の物質が沈殿し、特に上澄に残留するガンマ
ーグロブリノの量が減少する。

Ｉ’ＥＧ−４０００で処理したフラクションＩＶ（１１
を５％Ｖ／Ｖ補光したＲＰＭ１１６４０　培地内におい
てＥＳ−５細胞は生長し、抗体を生産した。生長速度は
、実施例１の未処理フラクションＩＶ（１１を使用した
場合に比べてほんのわずかに遅かった。

実施例８ ｐ　ｌ−１とエタノール濃度を組合せることによって調
製したフラクショｚ　ＩＩ　＋ＩＩＩ　、フラクション
ＩＶ（４）およびフラクシヨンＩＶ（４１＋Ｖ　を、各
フラクション調製物を５％補光した技ＰＭＩ　１６４０
　培地内てのＥＳ−６細胞の生長試験に関して比較した
。

１、Ｖ（４１はＩＶ（１）に比べて細胞生長は幾分遅か
ったが、最後の細胞密度と抗グループＡ抗原の生産性は
類イυした。フラクションＩＩまたはＩＩＩを用いた場
合、細胞生長は非常に遅く、最後の細胞密度も小さかっ
たか、抗体の量は同程度であった。フラクションＩＶ（
４１＋Ｖ調製物は細胞の生長を補助せず、生産性も全く
みられなかった。フラクションＩＶ（４１十Ｖのアルブ
ミン含有量は全蛋白質の重量に基ついて８５％以上であ
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は血漿から細胞生長培地成分を抽出する場合のｐ
Ｉ−１（横軸）とエタノール濃度（縦軸）との関係を示
すマトリックスである。 （１）および（２）はコーン沈殿の異なったレジームを
示す。 特πＦ出願人　ナショナル・リサーチ・デイベロツプノ
ント・第１図 ρ〃

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｌａ）フラクション中の全蛋白質重量に基ついて８
   ５％以下のアルブミンと６５％す、下のガンマーグロブ
   リノを含有する脱繊維素化血漿フラクションを冷エタノ
   ール沈殿によって哺乳類の血漿力ら抽出し、（Ｉ〕）抽
   出物を次のステップ（Ｃ）による均質（ヒをおこなうま
   で１０℃ゆ、下の温度で冷却保存し、（Ｃ）冷却抽出物
   を均質化し、（ｄ）ホモシエネートのμＩを高めて実質
   上すべての沈殿蛋白質を再溶解させ、（ｅ）該調製物の
   ｐ　ｌ−１を哺乳類の細胞生長にとって生理学的に許容
   されつる値に調整することと調製物を滅菌処理に付すこ
   とを含む、インウ゛イト口で哺乳類の細胞を培養するた
   めの細胞生長培地成分の調製方法。 ２、フラクションがアルブミンを７５％ｉＪ下含有する
   第１項記載の方法。 ３．７ラグンヨンがアルブミンを６５饅以下含有する第
   ２項記載の方法。 ４、　フラクションがガンマーグロブリノを１５係以下
   含有する第１項から第３項いずれかに記載の方法。 ５、　フラクションかガンマ−クロプリンを５％以下含
   有する第４項記載の方法。 ６、　フラクションかガンマーグロブリノを実質上含有
   しない第５項記載の方法。 ７、　コーンフラクション１１　＋ｌｌ−１を沈殿させ
   、次いてコーンフラクショ／ＩＶを単独もしくはコーン
   フラクショ／Ｖと共に沈殿させるツー／タイプ法によっ
   て血漿を抽出する第１項から第６項いずれかに記載の方
   法。 ８、ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を、■（１）によって処理した
   後でＶと共にＩＶ　（４１によって処理するが、または
   ＩＶ（４）によって処理する第７項記載の方法。 ９、第１図に示すｐｉ−ｉとエタノール濃度とのマトリ
   ックスによって限定されるフラクション、即ち領域ＥＸ
   ＹＺ内のフラクションＩＩ　十ＩＩＩまたは領域ＡＢＣ
   ＥＤ内のフラクションＩＶから血漿を抽出する第７項ま
   たは第８項記載の方法。 １０．フラクション■ｖが領域ＡＪＫＬもしくはＭＮＣ
   Ｐ内のフラクションである第９項記載の方法。 １１、　７７　クションＩＶがポイント「ＦＩＶ（１）
   」ノ領域内のフラクションＩＶ　（１１またはポイント
   「ＦＩＶ（４）」の領域内のフラクションＩＶ（４）で
   ある第９項記載の方法。 １２、フラクション１１十１１１から回収されるフラク
   ションＩＩＩから血漿を抽出する第９項記載の方法。 １３、均質化ステップ（Ｃ）を５℃までの温度において
   おこなう第１項から第１２項いずれかに記載の方法。 １４、ステップ（ｄ）において、ホモジエネートのμｍ
   １を６０〜６．５に高める第１項から第１３項いずれか
   に記載の方法。 １５、ステップ（ｅ）において、滅菌処理前の調製物の
   かＨを７．０〜７．５にする第１項から第１４項い理前
   に、生理的塩類溶液もしくは水を用いて希釈する第１項
   から第１５項記載いずれかに記載の方法。 １７、　ｐＨを高めるステップ（ｄ）の後および濾過前
   に、分離されないと滅菌フィルターを詰まらせる粗状固
   体を液状媒体から分離させ、少な（とも１回１戒菌フイ
   ルターを通す濾過処理に付すことによって滅菌をおこな
   う第１項から第１６項いずれかに記載の方法。 １８　ステップ（ｄ）からの調製物を希釈し、この希釈
   物を遠心分離処理に例して粗状固体を沈降させ、次いで
   遠心分離上澄み液を回収することによって粗状固体の分
   離をおこなう第１７項記載の方法。 】９．　ステップ（ｄ）の後の調製物からガンマ−グロ
   ブリンを除去する第１項から第１８項いずれかに記載の
   方法。 ２０、ステップ（ｄ）の後の調製物から分子量か約５・
   ０００以下の物質を除去する第１項から第１９項いずれ
   かに記載の方法。 ２１、第１項から第２０項いずれかに記載の方法によっ
   て調製した細胞生長培地成分を補充し、また所望により
   、細胞か付着できるサポートまたは付着プロモーターを
   添加した特定の培地を含有する培地中において、インヴ
   イトロで細胞を培養することを含む哺乳類細胞の培養方
   法。 ２２、培地が血清を含有しない第２１項記載の方法。 ２３、不死細胞を培養する第２１項または第２２項記載
   の方法。 ２４、不死細胞がハイブリドーマまたはミエロマ細胞で
   ある第２３項記載の方法。