JPH0425797B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、動物細胞培養用組成物の製造法に関
する。 従来の技術 動物細胞や動物組織の培養には、細胞増殖促進
物質として、動物血清を基礎培地へ添加すること
が不可欠とされているが、近年の細胞学や免疫学
の進歩、動物細胞の大量培養法の進歩等に伴ない
血清の需要は著しく増加している。 血清の使用に際しては、動物の年令、微生物迷
入の有無、細胞毒性物質の有無、抗体や増殖阻害
物質の有無等の厳重なチエツクが必要とされ、そ
れ等に要する労力、費用はかなりのものとなり、
又希望条件に見合う血清ロツトの数や量も限られ
る場合が多い。 各種の血清のなかで、胎児牛血清および新生仔
牛血清は細胞増殖促進効果、不要物質混在量等の
面で他の血清より優れているため需要量は著しく
増大しているが、これらは供給源が限られている
ため、工業的に使用するには不適である。 また、成熟動物(哺乳動物)の血清については
細胞増殖阻害活性を有する場合が多いため、その
ままでは使用されなかつたが、本発明者らは、そ
の処理方法を発明し、動物細胞培養用組成物とし
ての原料にしうることを明らかにし、その成果を
バイオテクノロジー開発技術研究組合主催の第2
回次世代産業基盤シンポジウム(昭和59年11月27
日〜28日)で発表した。 発明が解決しようとする問題点 一方、血漿は、新鮮血を放置して凝固するのを
待ち、生じた赤血球、白血球等を含む血餅を分離
して得られる血清に比べ、血液にクエン酸等の凝
固防止剤を添加した後赤血球、白血球、血小板等
を除去するのみで得られるので大量採取が容易で
ある。しかし血漿においては、血小板に含まれる
血小板由来増殖因子(PDGF)が除去されるた
め、これにより動物細胞を増殖させることは不利
と考えられていた(例外的に培養細胞系に属する
特殊なガン細胞が血漿の存在下に生育したという
事実が報告されている。) 問題点を解決するための手段 かかる状況下、本発明者らは、鋭意研究を行な
い、胎児や新生の仔牛のみならず成牛はもとより
豚、馬、羊等の大量採取および血液蛋白質の分離
が容易な動物の血漿を原料とする、優れた細胞増
殖効果を有し、不要または有害物質の混在が少な
い本発明の動物細胞培養用組成物を完成した。 本発明は、微生物および成長阻害物質を実質的
に含まない哺乳動物血漿由来の成長促進因子を含
有する動物細胞培養用組成物、哺乳動物の血漿
を、混在微生物の不活性化工程および塩析、脱塩
工程を含む精製処理に付すことを特徴とする微生
物および成長阻害物質を実質的に含まない哺乳動
物血漿由来の成長促進因子を含有する動物細胞培
養用組成物の製造法および微生物および成長阻害
物質を実質的に含まない哺乳動物血漿由来の成長
促進因子を含有する動物細胞培養用組成物を基礎
培地と共に含有してなる動物細胞培養用培地を提
供するものである。 本発明の動物細胞培養用培地は、哺乳動物の血
漿を原料として使用するものである。 微生物とは、動物体由来または採血後に迷入し
てくる可能性のある混在微生物をいい、通常ウイ
ルスやマイコプラズマである。これらの微生物は
後述する本発明の混在微生物の不活性工程で不活
性化される。 成長阻害物質とは、血漿中に存在するイムノグ
ロプリンなど細胞増殖に悪影響を与えたり、それ
を阻害する各種物質であり、後述する本発明の塩
析、脱塩工程で除去される。 成長促進因子とは、血漿に含まれるアルブミ
ン、血漿蛋白質、各種微量成長促進因子等をい
う。 本発明に原料として用いられる哺乳動物の血漿
は、いかなる種に由来するものでもよいが、原料
入手の容易さなどから牛、豚、馬、羊などの血漿
が有利に使用される。 哺乳動物の年令は、胎児、新生仔動物、子動
物、成熟動物のいずれをも問わないが、本発明に
おいては、成熟動物の血漿をも原料としうる。 なお原料となる血漿は、市販の各種動物の保存
血または採血後血液凝固防止剤(クエン酸ソーダ
など)を添加して得られたものを遠心分離してそ
の上清として得られる。 本発明において、混在微生物の不活性化工程
は、動物体由来のまたは採血後に迷入してくる可
能性のある微生物を不活化することを目的とする
が、混在微生物は通常ウイルスやマイコプラズマ
などであるので、これらに対する不活化力が強力
でかつ血漿中の細胞増殖促進物質には悪影響が少
ないような不活化剤を血漿に添加して処理するこ
とが好ましい。 不活剤としては、エチレンオキサイド、プロピ
レンオキサイドなどのC2-4のアルケニルオキサイ
ド類やグリオキサール、グルタールアルデヒドな
どジアルデヒド類が有効であるが、不活化力およ
び増殖促進物質にたいする影響度等の点からエチ
レンオキサイドが特に優れており、とりわけ液状
エチレンオキサイドが好ましい。 液状エチレンオキサイドを用いる場合、その添
加量は0.1〜5容量%、好ましくは0.3〜2容量%
であり、不活化処理条件としては、0〜30℃、好
ましくは10〜30℃で1〜7日間、好ましくは2〜
4日間放置する。他の不活化剤を用いる場合も上
記に準じて使用することができる。混在微生物の
不活化のために添加された不活化剤の除去にあた
つては、通常特別な処理を必要とせず、放置する
ことによりまたは他の操作を行なつている間に除
去されるが、透析等により積極的に除去すること
もできる。 本発明における塩析、脱塩工程は、例えば下記
により行なわれる。 塩折には、無機塩類などの塩類が用いられる。
無機塩としては、アンモニウム塩(硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウムなど)、ナトリウム塩
(塩化ナトリウム)、カリウム塩(炭酸カリウム)
などがあげられるが、アンモニウム塩とりわけ硫
酸アンモニウム(硫安)が好適である。 本発明においては、通常の塩析方法に従い、原
料の血漿または前記した混在微生物の不活化工程
を経た血漿を、溶媒(水、エタノール、含水エタ
ノールなど)に溶解または懸濁させ、無機塩類を
55%以上の硫酸アンモニウム濃度に相当する下限
濃度になるまで加えて飽和させ、析出した沈澱を
除去し上清を得る。この上清にさらに無機塩類を
加え70%以下の硫酸アンモニウム濃度に相当する
濃度の上限濃度にして飽和させ、析出する沈澱を
採取することにより必要な画分が得られる。なお
本操作は中性付近(PH6〜8)で行うことが好ま
しい。 さらに具体的には、塩類として硫酸アンモニウ
ムを使用する場合、それの下限濃度として、55%
以上、上限濃度して、70%以下で塩析するのが好
ましい。また他の塩類を使用する場合は、上記し
た硫酸アンモニウム濃度に相当する所定濃度で塩
析することができる。上清と沈澱の分離は、遠心
等により有利になされる。 得られた沈澱は生理食塩水等に溶解した後、透
析、限外ろ過等の方法で脱塩する。 透析は、例えば透析膜などを用いて公知の方法
に準じて実施できる。限外を過を行なう場合は、
例えば分子量1000以下の物質を通過させる限外ろ
過膜を用いて加圧してろ過すればよい。 得られた動物細胞培養用組成物は通常20〜80
mg/mlの濃度になるよう生理食塩水等で調製して
メンブランフイルター等による除菌ろ過を行なつ
た後、必要により凍結または凍結乾燥して保存す
ることができる。 本発明の哺乳動物由来の動物細胞培養用組成物
の製造法においては、上記した混在微生物の不活
化工程および塩析、脱塩工程の順序はいずれが先
でもよい。 本発明の動物細胞培養用組成物は、迷入が懸念
されるろ過微生物を含まない無菌性の高いもので
あり、取り扱いも安全で良好な細胞増殖促進効果
が得られる。本発明の動物細胞培養用組成物は胎
児や牛血清や新生仔牛血清をはじめとする公知の
各種動物血清や牛血清アルブミンと同等もしくは
それ以上の細胞増殖促進効果が得られ、各種ミエ
ローマ、ハイブリドーマ、単層細胞その他浮遊細
胞系および接着細胞系の動物細胞の培養に有利に
使用できる。 本発明の動物培養組成物は、単独でまたは胎児
牛血清や新生仔牛血清などの公知の各種動物血清
もしくは血清由来の動物細胞培養用組成物[特願
昭59−521号明細書(昭和59年1月7日出願)参
照]との混合物として使用できる。混合物として
使用する場合は、例えば、本発明の動物細胞培養
用組成物に、1/10〜9/10量(V/V)の上記血清
もしくは血清由来の組成物を混合するか、下記す
る基礎培地に上記の量比でそれぞれ添加する。 使用に際しては本発明の組成物または上記混合
物を基礎培地に1〜10mg/mlになるよう単独また
はインシユリン等の微量増殖促進物質と混合添加
して用いることができる。 浮遊細胞系もしくは接着細胞系動物細胞におい
ては、基礎培地に本発明の組成物または上記その
混合物を添加して培養することができる。ミエロ
ーマまたはハイブリドーマにおいては、基礎培地
に、本発明の組成物または上記その混合物および
微量増殖促進物質を添加することにより有利に培
養することができる。 上記本発明の動物細胞培養用組成物を添加する
基礎培地として、例えば下記の公知の基礎培地が
挙げられる。 Iscove:イスコブの培地[ジヤーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メジン、147、923(1978)] FI2:ハムのF12培地[プロシージングス・オ
ブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス(USA)、53、288(1965)] Serumless Medium:ギブコの無血清培地[プ
ロシージングス・オブ・ザ・ソサイテイ・オ
ブ・エクスペリメンタル・バイオロジー・アン
ド・メジシン、104、525(1960)] aupha−MEM:アルフア培地[ネイチヤー、
230、310(1971)] DME:ダルベコの改変イーグル培地[ビロロジ
ー、8、396(1959)] これらの基礎培地は単独でまたは2〜4種を混
合して用いてもよく、とりわけIscove/F12、
Isove/Serumless Medium、F12/Serumless
Medium、alpha−MEM/Serumless Medium、
DME/F12のように2種の基礎培地を1:1〜
1:15の割合で混合して使用するのが好ましい。 本発明の動物細胞培養用組成物は、入手が容易
で大量処理が可能な哺乳動物の血漿を原料として
使用するもので、接着細胞系動物細胞はもちろ
ん、工業上有用生理活性物質の産生等に用いられ
る浮遊細胞系の動物細胞においても公知の胎児牛
血清や血清由来の動物培養用培地と同等もしくは
それ以上の細胞増殖促進効果を奏する。 作用および実施例 以下に実施例により、本発明をさらに具体的に
説明するがこれらに本発明が限定されるものでは
ない。 実施例 1 (各種動物血漿中の細胞増殖促進物質の検索) 牛、馬、豚および羊の血漿(採血した血液に直
ちに最終濃度が1%(V/V)になるようクエン
酸ソーダを添加した後、遠心分離して得た上清
液)それぞれに0.75%(V/V)液状エチレンオ
キサイドを添加し25℃48時間放置して迷入微生物
の滅菌処理を行なつた後、硫酸アンモニウム55〜
70%飽和の塩析画分を採取し、生理食塩水に溶解
し生理食塩水に対して透析した。 各透析液をメンブレンフイルター(マイレツク
スーGV、0.22um:ミリポア社)を用い除菌ろ過
した後、基礎培地であるIscove培地(GIBCO社)
とF−12培地(日水製薬社製)の1:1の混合基
礎培地(以下Iscove/F−12と略称する)に該透
析液を蛋白量にして3mg/ml、増殖促進物質であ
るインスリン(シグマ社製)2μg/ml、トラン
スフエリン(ミドリ十字社)2μg/ml、エタノ
ールアミン(和光純薬製)2μMおよび亜セレン
酸ソーダ(和光純薬製)2×10-8M(以上の各増
殖促進物質およびそれらの濃度の混合添加物を
ITESと略称する;村上ら、[プロシージングス・
オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス(USA)79、1158−1162、(1982)])を添加し
た培地による細胞増殖率を検討した。 対照として胎児牛血清(5mg/ml)を置いた。
使用細胞はIgE産生ヒトミエローマであるU266
〔ジヤーナル・オブ・クリニカル・エクスペリメ
ンタル・イムノロジー、7、477(1970)〕をクロ
ーニングして得たNGE−44細胞を使用した。各
種調製培地を24穴マルチデイツシユに1ml/ウエ
ルずつ分注した後、NGE−44細胞浮遊液(細胞
数5×105〜15×105/ml)0.1mlずつ分注し、5
%CO2インキユベーターで37℃7日培養し、3代
継代後の各ウエルの細胞数をコールターカウンタ
ー(日本科学機械製)で測定した。細胞増殖促進
効果は対照である胎児牛血清の培養増殖後の細胞
数を100とした時の各試料の培養増殖後の細胞数
を%で示すと、牛の血漿由来塩析処理画分(以後
血漿画分と略称する)では113、馬の血漿画分で
は103、豚の血漿画分では147、羊の血漿画分では
140となつた。このようにいずれの血漿画分も胎
児牛血清と同等もしくはそれ以上の良好な細胞増
殖促進効果を示した。 実施例 2 (牛血漿硫安処理画分の細胞増殖促進効果) 実施例1においてとりわけ良好な細胞増殖促進
効果を示した牛血漿についてさらに頭数を増して
検討した。屠畜場にて採取した4〜7才の成牛血
液よりそれぞれ実施例1と同様の方法で血漿画分
を得た。対照として胎児牛血清および牛血清アル
ブミン(5mg/ml:BSA)添加群を置いた。使
用した細胞は浮遊細胞系として抗CEA抗体産生
マウスハイブリドーマ(以下CEAと略す)およ
びマウスミエローマであるMPC−11(大日本製薬
から購入)、接着細胞系としてVero(フロー社
(米国)から購入)およびBHK−21(フロー社か
ら購入)を使用した。接着細胞系の培養はトリプ
シン消化して浮遊化した各細胞(1×105/ml)
を前記と同様に0.1mlずつ分注し、5%CO2イン
キユベーターで37℃4日培養した後、トリプシン
消化にて細胞を浮遊化して各ウエルの細胞数をコ
ールターカウンターで測定した。結果を第1表に
示す。細胞増殖促進効果はIscove/F12に胎児牛
血清(5mg/ml:FCS)を添加した培地の培養増
殖後の細胞数を100とした時の各培養後細胞数を
%で示した。 すべての牛の処理前血漿および血清は強い細胞
毒性を示し細胞が死滅したにもかかわらず血漿を
不活性化処理および硫安塩析処理して得られる血
漿画分では良好な細胞増殖促進効果が得られた。 【表】 * 試験せず
実施例 3 (血漿画分と血清画分の混合による細胞増殖促
進効果の増強) 実施例1および2において血漿画分の細胞増殖
促進効果が認められたが、効果をさらに高めるた
め血清より実施例1と同様の操作で得られる血清
画分を本発明の血漿画分に混合添加した。最終蛋
白量にして3mg/mlになるよう牛、豚および羊の
血清画分と血漿画分を1:0、1:1、1:2、
1:3、1:9および0:1(V/V)の割合で
混合し、実施例1と同様の方法で細胞増殖促進効
果を調べた。使用細胞は、CEA(前出)および抗
HBsAg抗体産生マウスハイブリドーマであるHS
−IIを使用した。その結果を第2表に示す。細胞
増殖促進効果は血漿画分単独(0:1)の培養増
殖後の細胞数を100とした時の各試料の培養増殖
後の細胞数を%で示した。 いずれも血漿画分に血清画分を混合添加するこ
とにより血漿画分単独より優れた効果が得られ
た。 【表】 発明の効果 本発明の動物細胞培養用組成物は、アルブミン
を主とする蛋白質を含有するが、従来の牛血清ア
ルブミンに比べ、より多種類の動物細胞に優れた
細胞増殖促進効果が得られ、またそれらの動物細
胞の継代培養が可能である。
する。 従来の技術 動物細胞や動物組織の培養には、細胞増殖促進
物質として、動物血清を基礎培地へ添加すること
が不可欠とされているが、近年の細胞学や免疫学
の進歩、動物細胞の大量培養法の進歩等に伴ない
血清の需要は著しく増加している。 血清の使用に際しては、動物の年令、微生物迷
入の有無、細胞毒性物質の有無、抗体や増殖阻害
物質の有無等の厳重なチエツクが必要とされ、そ
れ等に要する労力、費用はかなりのものとなり、
又希望条件に見合う血清ロツトの数や量も限られ
る場合が多い。 各種の血清のなかで、胎児牛血清および新生仔
牛血清は細胞増殖促進効果、不要物質混在量等の
面で他の血清より優れているため需要量は著しく
増大しているが、これらは供給源が限られている
ため、工業的に使用するには不適である。 また、成熟動物(哺乳動物)の血清については
細胞増殖阻害活性を有する場合が多いため、その
ままでは使用されなかつたが、本発明者らは、そ
の処理方法を発明し、動物細胞培養用組成物とし
ての原料にしうることを明らかにし、その成果を
バイオテクノロジー開発技術研究組合主催の第2
回次世代産業基盤シンポジウム(昭和59年11月27
日〜28日)で発表した。 発明が解決しようとする問題点 一方、血漿は、新鮮血を放置して凝固するのを
待ち、生じた赤血球、白血球等を含む血餅を分離
して得られる血清に比べ、血液にクエン酸等の凝
固防止剤を添加した後赤血球、白血球、血小板等
を除去するのみで得られるので大量採取が容易で
ある。しかし血漿においては、血小板に含まれる
血小板由来増殖因子(PDGF)が除去されるた
め、これにより動物細胞を増殖させることは不利
と考えられていた(例外的に培養細胞系に属する
特殊なガン細胞が血漿の存在下に生育したという
事実が報告されている。) 問題点を解決するための手段 かかる状況下、本発明者らは、鋭意研究を行な
い、胎児や新生の仔牛のみならず成牛はもとより
豚、馬、羊等の大量採取および血液蛋白質の分離
が容易な動物の血漿を原料とする、優れた細胞増
殖効果を有し、不要または有害物質の混在が少な
い本発明の動物細胞培養用組成物を完成した。 本発明は、微生物および成長阻害物質を実質的
に含まない哺乳動物血漿由来の成長促進因子を含
有する動物細胞培養用組成物、哺乳動物の血漿
を、混在微生物の不活性化工程および塩析、脱塩
工程を含む精製処理に付すことを特徴とする微生
物および成長阻害物質を実質的に含まない哺乳動
物血漿由来の成長促進因子を含有する動物細胞培
養用組成物の製造法および微生物および成長阻害
物質を実質的に含まない哺乳動物血漿由来の成長
促進因子を含有する動物細胞培養用組成物を基礎
培地と共に含有してなる動物細胞培養用培地を提
供するものである。 本発明の動物細胞培養用培地は、哺乳動物の血
漿を原料として使用するものである。 微生物とは、動物体由来または採血後に迷入し
てくる可能性のある混在微生物をいい、通常ウイ
ルスやマイコプラズマである。これらの微生物は
後述する本発明の混在微生物の不活性工程で不活
性化される。 成長阻害物質とは、血漿中に存在するイムノグ
ロプリンなど細胞増殖に悪影響を与えたり、それ
を阻害する各種物質であり、後述する本発明の塩
析、脱塩工程で除去される。 成長促進因子とは、血漿に含まれるアルブミ
ン、血漿蛋白質、各種微量成長促進因子等をい
う。 本発明に原料として用いられる哺乳動物の血漿
は、いかなる種に由来するものでもよいが、原料
入手の容易さなどから牛、豚、馬、羊などの血漿
が有利に使用される。 哺乳動物の年令は、胎児、新生仔動物、子動
物、成熟動物のいずれをも問わないが、本発明に
おいては、成熟動物の血漿をも原料としうる。 なお原料となる血漿は、市販の各種動物の保存
血または採血後血液凝固防止剤(クエン酸ソーダ
など)を添加して得られたものを遠心分離してそ
の上清として得られる。 本発明において、混在微生物の不活性化工程
は、動物体由来のまたは採血後に迷入してくる可
能性のある微生物を不活化することを目的とする
が、混在微生物は通常ウイルスやマイコプラズマ
などであるので、これらに対する不活化力が強力
でかつ血漿中の細胞増殖促進物質には悪影響が少
ないような不活化剤を血漿に添加して処理するこ
とが好ましい。 不活剤としては、エチレンオキサイド、プロピ
レンオキサイドなどのC2-4のアルケニルオキサイ
ド類やグリオキサール、グルタールアルデヒドな
どジアルデヒド類が有効であるが、不活化力およ
び増殖促進物質にたいする影響度等の点からエチ
レンオキサイドが特に優れており、とりわけ液状
エチレンオキサイドが好ましい。 液状エチレンオキサイドを用いる場合、その添
加量は0.1〜5容量%、好ましくは0.3〜2容量%
であり、不活化処理条件としては、0〜30℃、好
ましくは10〜30℃で1〜7日間、好ましくは2〜
4日間放置する。他の不活化剤を用いる場合も上
記に準じて使用することができる。混在微生物の
不活化のために添加された不活化剤の除去にあた
つては、通常特別な処理を必要とせず、放置する
ことによりまたは他の操作を行なつている間に除
去されるが、透析等により積極的に除去すること
もできる。 本発明における塩析、脱塩工程は、例えば下記
により行なわれる。 塩折には、無機塩類などの塩類が用いられる。
無機塩としては、アンモニウム塩(硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウムなど)、ナトリウム塩
(塩化ナトリウム)、カリウム塩(炭酸カリウム)
などがあげられるが、アンモニウム塩とりわけ硫
酸アンモニウム(硫安)が好適である。 本発明においては、通常の塩析方法に従い、原
料の血漿または前記した混在微生物の不活化工程
を経た血漿を、溶媒(水、エタノール、含水エタ
ノールなど)に溶解または懸濁させ、無機塩類を
55%以上の硫酸アンモニウム濃度に相当する下限
濃度になるまで加えて飽和させ、析出した沈澱を
除去し上清を得る。この上清にさらに無機塩類を
加え70%以下の硫酸アンモニウム濃度に相当する
濃度の上限濃度にして飽和させ、析出する沈澱を
採取することにより必要な画分が得られる。なお
本操作は中性付近(PH6〜8)で行うことが好ま
しい。 さらに具体的には、塩類として硫酸アンモニウ
ムを使用する場合、それの下限濃度として、55%
以上、上限濃度して、70%以下で塩析するのが好
ましい。また他の塩類を使用する場合は、上記し
た硫酸アンモニウム濃度に相当する所定濃度で塩
析することができる。上清と沈澱の分離は、遠心
等により有利になされる。 得られた沈澱は生理食塩水等に溶解した後、透
析、限外ろ過等の方法で脱塩する。 透析は、例えば透析膜などを用いて公知の方法
に準じて実施できる。限外を過を行なう場合は、
例えば分子量1000以下の物質を通過させる限外ろ
過膜を用いて加圧してろ過すればよい。 得られた動物細胞培養用組成物は通常20〜80
mg/mlの濃度になるよう生理食塩水等で調製して
メンブランフイルター等による除菌ろ過を行なつ
た後、必要により凍結または凍結乾燥して保存す
ることができる。 本発明の哺乳動物由来の動物細胞培養用組成物
の製造法においては、上記した混在微生物の不活
化工程および塩析、脱塩工程の順序はいずれが先
でもよい。 本発明の動物細胞培養用組成物は、迷入が懸念
されるろ過微生物を含まない無菌性の高いもので
あり、取り扱いも安全で良好な細胞増殖促進効果
が得られる。本発明の動物細胞培養用組成物は胎
児や牛血清や新生仔牛血清をはじめとする公知の
各種動物血清や牛血清アルブミンと同等もしくは
それ以上の細胞増殖促進効果が得られ、各種ミエ
ローマ、ハイブリドーマ、単層細胞その他浮遊細
胞系および接着細胞系の動物細胞の培養に有利に
使用できる。 本発明の動物培養組成物は、単独でまたは胎児
牛血清や新生仔牛血清などの公知の各種動物血清
もしくは血清由来の動物細胞培養用組成物[特願
昭59−521号明細書(昭和59年1月7日出願)参
照]との混合物として使用できる。混合物として
使用する場合は、例えば、本発明の動物細胞培養
用組成物に、1/10〜9/10量(V/V)の上記血清
もしくは血清由来の組成物を混合するか、下記す
る基礎培地に上記の量比でそれぞれ添加する。 使用に際しては本発明の組成物または上記混合
物を基礎培地に1〜10mg/mlになるよう単独また
はインシユリン等の微量増殖促進物質と混合添加
して用いることができる。 浮遊細胞系もしくは接着細胞系動物細胞におい
ては、基礎培地に本発明の組成物または上記その
混合物を添加して培養することができる。ミエロ
ーマまたはハイブリドーマにおいては、基礎培地
に、本発明の組成物または上記その混合物および
微量増殖促進物質を添加することにより有利に培
養することができる。 上記本発明の動物細胞培養用組成物を添加する
基礎培地として、例えば下記の公知の基礎培地が
挙げられる。 Iscove:イスコブの培地[ジヤーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メジン、147、923(1978)] FI2:ハムのF12培地[プロシージングス・オ
ブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス(USA)、53、288(1965)] Serumless Medium:ギブコの無血清培地[プ
ロシージングス・オブ・ザ・ソサイテイ・オ
ブ・エクスペリメンタル・バイオロジー・アン
ド・メジシン、104、525(1960)] aupha−MEM:アルフア培地[ネイチヤー、
230、310(1971)] DME:ダルベコの改変イーグル培地[ビロロジ
ー、8、396(1959)] これらの基礎培地は単独でまたは2〜4種を混
合して用いてもよく、とりわけIscove/F12、
Isove/Serumless Medium、F12/Serumless
Medium、alpha−MEM/Serumless Medium、
DME/F12のように2種の基礎培地を1:1〜
1:15の割合で混合して使用するのが好ましい。 本発明の動物細胞培養用組成物は、入手が容易
で大量処理が可能な哺乳動物の血漿を原料として
使用するもので、接着細胞系動物細胞はもちろ
ん、工業上有用生理活性物質の産生等に用いられ
る浮遊細胞系の動物細胞においても公知の胎児牛
血清や血清由来の動物培養用培地と同等もしくは
それ以上の細胞増殖促進効果を奏する。 作用および実施例 以下に実施例により、本発明をさらに具体的に
説明するがこれらに本発明が限定されるものでは
ない。 実施例 1 (各種動物血漿中の細胞増殖促進物質の検索) 牛、馬、豚および羊の血漿(採血した血液に直
ちに最終濃度が1%(V/V)になるようクエン
酸ソーダを添加した後、遠心分離して得た上清
液)それぞれに0.75%(V/V)液状エチレンオ
キサイドを添加し25℃48時間放置して迷入微生物
の滅菌処理を行なつた後、硫酸アンモニウム55〜
70%飽和の塩析画分を採取し、生理食塩水に溶解
し生理食塩水に対して透析した。 各透析液をメンブレンフイルター(マイレツク
スーGV、0.22um:ミリポア社)を用い除菌ろ過
した後、基礎培地であるIscove培地(GIBCO社)
とF−12培地(日水製薬社製)の1:1の混合基
礎培地(以下Iscove/F−12と略称する)に該透
析液を蛋白量にして3mg/ml、増殖促進物質であ
るインスリン(シグマ社製)2μg/ml、トラン
スフエリン(ミドリ十字社)2μg/ml、エタノ
ールアミン(和光純薬製)2μMおよび亜セレン
酸ソーダ(和光純薬製)2×10-8M(以上の各増
殖促進物質およびそれらの濃度の混合添加物を
ITESと略称する;村上ら、[プロシージングス・
オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス(USA)79、1158−1162、(1982)])を添加し
た培地による細胞増殖率を検討した。 対照として胎児牛血清(5mg/ml)を置いた。
使用細胞はIgE産生ヒトミエローマであるU266
〔ジヤーナル・オブ・クリニカル・エクスペリメ
ンタル・イムノロジー、7、477(1970)〕をクロ
ーニングして得たNGE−44細胞を使用した。各
種調製培地を24穴マルチデイツシユに1ml/ウエ
ルずつ分注した後、NGE−44細胞浮遊液(細胞
数5×105〜15×105/ml)0.1mlずつ分注し、5
%CO2インキユベーターで37℃7日培養し、3代
継代後の各ウエルの細胞数をコールターカウンタ
ー(日本科学機械製)で測定した。細胞増殖促進
効果は対照である胎児牛血清の培養増殖後の細胞
数を100とした時の各試料の培養増殖後の細胞数
を%で示すと、牛の血漿由来塩析処理画分(以後
血漿画分と略称する)では113、馬の血漿画分で
は103、豚の血漿画分では147、羊の血漿画分では
140となつた。このようにいずれの血漿画分も胎
児牛血清と同等もしくはそれ以上の良好な細胞増
殖促進効果を示した。 実施例 2 (牛血漿硫安処理画分の細胞増殖促進効果) 実施例1においてとりわけ良好な細胞増殖促進
効果を示した牛血漿についてさらに頭数を増して
検討した。屠畜場にて採取した4〜7才の成牛血
液よりそれぞれ実施例1と同様の方法で血漿画分
を得た。対照として胎児牛血清および牛血清アル
ブミン(5mg/ml:BSA)添加群を置いた。使
用した細胞は浮遊細胞系として抗CEA抗体産生
マウスハイブリドーマ(以下CEAと略す)およ
びマウスミエローマであるMPC−11(大日本製薬
から購入)、接着細胞系としてVero(フロー社
(米国)から購入)およびBHK−21(フロー社か
ら購入)を使用した。接着細胞系の培養はトリプ
シン消化して浮遊化した各細胞(1×105/ml)
を前記と同様に0.1mlずつ分注し、5%CO2イン
キユベーターで37℃4日培養した後、トリプシン
消化にて細胞を浮遊化して各ウエルの細胞数をコ
ールターカウンターで測定した。結果を第1表に
示す。細胞増殖促進効果はIscove/F12に胎児牛
血清(5mg/ml:FCS)を添加した培地の培養増
殖後の細胞数を100とした時の各培養後細胞数を
%で示した。 すべての牛の処理前血漿および血清は強い細胞
毒性を示し細胞が死滅したにもかかわらず血漿を
不活性化処理および硫安塩析処理して得られる血
漿画分では良好な細胞増殖促進効果が得られた。 【表】 * 試験せず
実施例 3 (血漿画分と血清画分の混合による細胞増殖促
進効果の増強) 実施例1および2において血漿画分の細胞増殖
促進効果が認められたが、効果をさらに高めるた
め血清より実施例1と同様の操作で得られる血清
画分を本発明の血漿画分に混合添加した。最終蛋
白量にして3mg/mlになるよう牛、豚および羊の
血清画分と血漿画分を1:0、1:1、1:2、
1:3、1:9および0:1(V/V)の割合で
混合し、実施例1と同様の方法で細胞増殖促進効
果を調べた。使用細胞は、CEA(前出)および抗
HBsAg抗体産生マウスハイブリドーマであるHS
−IIを使用した。その結果を第2表に示す。細胞
増殖促進効果は血漿画分単独(0:1)の培養増
殖後の細胞数を100とした時の各試料の培養増殖
後の細胞数を%で示した。 いずれも血漿画分に血清画分を混合添加するこ
とにより血漿画分単独より優れた効果が得られ
た。 【表】 発明の効果 本発明の動物細胞培養用組成物は、アルブミン
を主とする蛋白質を含有するが、従来の牛血清ア
ルブミンに比べ、より多種類の動物細胞に優れた
細胞増殖促進効果が得られ、またそれらの動物細
胞の継代培養が可能である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 哺乳動物の血漿を、()アルケニルオキサ
イド類またはジアルデヒド類による混在微生物の
不活化工程、および()下限濃度として55%以
上、上限濃度として70%以下の硫酸アンモニウム
濃度に相当する濃度の無機塩による塩析工程と脱
塩工程とを含む精製処理に付すことを特徴とする
微生物および成長阻害物質を実質的に含まない哺
乳動物血漿由来の成長促進因子を含有する動物細
胞培養用組成物の製造法。 2 不活化工程が、C2-4アルケニルオキサイドに
よる不活化工程である請求項1記載の製造法。 3 C2-4アルケニルオキサイドが、エチレンオキ
サイドである請求項2記載の製造法。 4 エチレンオキサイドが、液状エチレンオキサ
イドである請求項3記載の製造法。 5 不活化工程が、0.1〜5容量%の液状エチレ
ンオキサイドを添加し、0゜〜30℃、1〜7日間で
処理することを特徴とする不活化工程である請求
項1記載の製造法。 6 無機塩が、アンモニウム塩である請求項1記
載の製造法。 7 アンモニウム塩が、硫酸アンモニウムである
請求項6記載の製造法。 8 脱塩工程が、透析による脱塩工程である請求
項1記載の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60167815A JPS6229968A (ja) | 1985-07-31 | 1985-07-31 | 動物細胞培養用組成物の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60167815A JPS6229968A (ja) | 1985-07-31 | 1985-07-31 | 動物細胞培養用組成物の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6229968A JPS6229968A (ja) | 1987-02-07 |
JPH0425797B2 true JPH0425797B2 (ja) | 1992-05-01 |
Family
ID=15856611
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60167815A Granted JPS6229968A (ja) | 1985-07-31 | 1985-07-31 | 動物細胞培養用組成物の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6229968A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5587629B2 (ja) * | 2010-02-04 | 2014-09-10 | パナソニックヘルスケア株式会社 | インキュベーター |
-
1985
- 1985-07-31 JP JP60167815A patent/JPS6229968A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6229968A (ja) | 1987-02-07 |
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