JPS6229968A - 動物細胞培養用組成物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 めじ老生 ′− ・、′動物細胞や動物組織の培養には、細胞増殖促進物
質として、動物血清を基礎培地へ添加することが不可欠
とされているが、近年の細胞学や免疫学の進歩、動物細
胞の大量培養法の進歩等に伴ない血清の需要は昔しく増
加している。

血清の使用に際しては、動物の年令、微生物速入の有無
、細胞毒性物質の有無、抗体や増殖阻害物質の有無等の
厳重なヂエックが必要とされ、それ等に要する労力、費
用はかなりのものとなり、又希望条件に見合う血清ロッ
トの数や量も限られる場合が多い。

各種の血清のなかで、胎児牛血清および新生仔牛血清は
細胞増殖促進効果、不要物質混在量等の面で他の血清よ
り優れているため需要量は著しく増大しているが、これ
らは供給源が限られているため、工業的に使用するには
不適である。

また、成熟動物（哺乳動物）の血清については細胞増殖
阻害活性を有ずろ場合が多いため、そのままでは使用さ
れなかったが、本発明者らは、その処理方法を発明し、
動物細胞培養用組成物としての原料にしうろことを明ら
かにし、その成果をバ一方、血漿は、新鮮血を放置して
凝固ずろのを待ち、生じた赤血球、白血球等を含む血餅
を分離して得られる血清に比べ、血液にクエン酸等の凝
固防止剤を添加した後赤血球、白血球、血小板等を除去
するのみで得られるので大量採取が容易である。しかし
血漿においては、血小板に含まれろ血小板由来増殖因子
（ｊ”Ｉ）ＧＰ）が除去されるため、これにより動物細
胞を増殖させることは不利と考えられていた（例外的に
培養細胞系に属する特殊なガン細胞か血漿の存在下生育
したという事実が報告されている。）。

叩−すハ今翠姥−夫Ａす！ぽど貝え かかる状況下、本発明者らは、鋭意研究を行ない、胎児
や新生の仔牛のみならず成牛はもとより豚、馬、羊等の
大量採取および血液蛋白質の分離が容易な動物の血漿を
原料とする、優れた細胞増殖効果を有し、不要または有
害物質の混在が少ない本発明の動物細胞培養用組成物を
完成した。

本発明は、微生物および成長阻害物質を実質的に含まな
い鋪乳動物血漿由来の成長促進因子を合物および成長阻
害物質を実質的に含まない鋪乳動物面漿由来の成長促進
因子を含有する動物細胞培養用組成物の製造法および微
生物および成長阻害物質を実質的に含まない咽乳動物血
漿由来の成長促進因子を含有する動物細胞培養用組成物
を基礎培地と共に含有してなる動物細胞培養用培地を提
供するものである。

本発明の動物細胞培養用培地は、鋪乳動物の血漿を原料
として使用するものである。

微生物とは、動物体由来または採血後に迷太してくる可
能性のある混在微生物をいい、通常ウィルスやマイコプ
ラズマである。これらの微生物は後述する本発明の混在
微生物の不活化工程で不活性化される。

成長阻害物質とは、血漿中に存在するイムノグロブリン
など細胞増殖に悪影響を与えたり、それを阻害する各種
物質であり、後述する本発明の塩析、脱塩工程で除去さ
れる。

成長促進因子とは、血漿に含まれるアルブミン。

血漿蛋白質、各種微量成長促進因子等をいう。

本発明に原料として用いられる晴乳動物の血漿成熟動物
のいずれをも問わないが、本発明においては、成熟動物
の血漿をも原料とじつる。

なお原料となる血漿は、市販の各種動物の保存能または
採血後血液凝固防止剤（クエン酸ソーダなど）を添加し
て得られたものを遠心分離してその上清として得られる
。

本発明において、混在微生物の不活化工程は、動物体由
来のまたは採血後に速入してくる可能性のある微生物を
不活化することを目的とするが、混在微生物は通常ウィ
ルスやマイコプラズマなどであるので、これらに対する
不活化力が強力でかつ血漿中の細胞増殖促進物質には悪
影響が少ないような不活化剤を血漿に添加して処理する
ことが好ましい。

不活剤としては、エヂレンオキザイド、プロピレンオキ
サイドなどのＣ，−４のアルケニルオキサイド類やグリ
オキサール、ゲルタールアルデヒドなどジアルデヒド類
が有効であるが、不活化力および増殖促進物質にたいす
る影響度等の点から工あり、不活化処理条件としては、
０〜３０°Ｃ１好ましくは１０〜３０°Ｃで１〜７日間
、好ましくは２〜４日間放置する。他の不活化剤を用い
る場合も上記に準じて使用することができろ。混在微生
物の不活化のために添加された不活化剤の除去にあたっ
て（Ｊ、通常特別な処理を必要とせず、放置することに
よりまたは他の操作を行なっている間に除去されるが、
透（バ等により積極的に除去することもてきる。

本発明にお１′：ｌる塩析、脱塩工程は、例えば下記に
より行なわれろ。

塩析には、無機塩類などの塩類が用いられる。無機塩と
しては、アンモニウム塩（硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウムなど）、ナトリウム塩（塩化ナトリウ１、）、
カリウム塩（炭酸カリウム）などがあげられろが、アン
モニウム塩とりわ（づ硫酸アンモニウム（硫安）か好適
である。

本発明においては、通んの塩析方法に従い、原料の血漿
また（Ｊ前記した混在微生物の不活化工程を経た血漿を
、溶媒（水、エタノール、含水エタノールなど）に溶解
または懸濁させ、塩類を所定の下限濃度になるまで加え
て飽和させ、析出した沈澱を除刀りしＩ清４得７　この
」清にさり１−蜘類を加７所７一 定の」−眼濃度にして飽和させ、析出する沈澱を採」−
１好ましくは５０％以上、とりわ（′１１５５％、上限
濃度として８０％以下、とりわけ７０％で塩析するのが
好ましい。また他の塩類を使用する場合は、上記した硫
酸アンモニウム濃度に相当する所定濃度で塩析すること
ができろ。」−清と沈澱の分離ｌＪ、遠心等により有利
になされる。

得られた沈澱は生理食塩水等に溶解した後、透析、限外
ろ過等の方法で脱塩する。

透析は、例えば透析膜などを用いて公知の方法に準じて
実施できる。限外ろ過を行なう場合は、例えば分子１１
０００以下の物質を通過させる限外ろ過膜を用いて加圧
してろ過すればよい。

得られた動物細胞培養用組成物は通常２０〜８０ｍｇ／
ｍｌの濃度になるよう生理食塩水等で調製してメンブラ
ンフィルタ−等による除菌ろ過を行なった後、必要にに
り凍結または凍結乾燥して保存することができる。

本発明の哺乳動物由来の動物細胞培養用組成物の製造法
においては、」１記した混在微生物の不活であり、取り
扱いも安全で良好な細胞増殖促進効果が得られる。本発
明の動物細胞培養用組成物は胎児牛血清や新生仔牛血清
をはじめとする公知の各種動物血清や牛血清アルブミン
と同等もしくはそれ以」二の細胞増殖促進効果が得られ
、各種ミエローマ、ハイブリドーマ、単層細胞その他浮
遊細胞系および接着細胞系の動物細胞の培養に有利に使
用できる。

本発明の動物細胞培養用組成物は、単独でまたは胎児牛
血清や新生仔牛血清などの公知の各種動物血清もしくは
血清由来の動物細胞培養用組成物［特願昭５９−５２１
号明細書（昭和５９年１月７日出願）参照］との混合物
として使用できる。混合物として使用する場合は、例え
ば、本発明の動物細胞培養用組成物に、１／１０〜９／
１０量（ｖ／ｖ）の」二記血清もしくは血清由来の組成
物を混合するか、下記する基礎培地に」１記の量比でそ
れぞれを添加する。

使用に際しては本発明の組成物または上記混合物を基礎
培地に１〜ｉｏｍｇ／ｍｌになるよう単独またはインシ
ュリン等の微量増殖促進物質と混合添加して用いること
ができる。

浮遊細胞系もしくは接着細胞系動物細胞においては、基
礎培地に本発明の組成物または上記その混合物を添加し
て培養することができる。ミエローマまたはハイブリド
ーマにおいては、基礎培地に、本発明の組成物または」
１記その混合物および微量増殖促進物質を添加すること
により有利に培養することができる。

」−証本発明の動物細胞培養用組成物を添加する基礎培
地として、例えば下記の公知の基礎培地が挙げられる。

ｌ５ｃｏｖｅ　　イスコブの培地［ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メジシン、１．４７．９２３（１
９７８）］ ＦＩ２　　　ハムのＦ１２培地［プロン−ジンゲス・才
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳ
Ａ）、５３．２１’１８（１９６５）］Ｓｅｒｕｍｌｅ
ｓｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　　ギブコの無血清培地［プロノー
ジンゲス・オブ・ザ・ソザイティ・オブ・エクスペリメ
ンタル・バイオロジー・アンド・メジンン、爪、　５２
５（１９６０）］ａｌｐｈａ−ＭＥＭ：　ＭＥＭアルフ
ァ培地［ネイチャー２見用、　３］、０（１９７１，）
］ ＤＭＥ　＋　　ダルベコの改変イーグル培地［ピロロジ
ー、埃、　３９６（１９５９）］ これらの基礎培地は単独でまたは２〜４種を混合して用
いてもよく、とりわけ１ｓｃｏｖｅ／Ｆ１２．　ｌ５ｃ
ｏｖｅ／Ｓｅｒｕｍｌｅｓｓ　Ｍｅｃｌｉｕｍ、　ＦＩ
２／Ｓｅｒｕｍｌｅｓｓ　Ｍｅｄｉｕｍ。

ａｌｐｈａ　−ＭＥＭ／Ｓｅｒｕｍｌｅｓｓ　Ｍｅｄｉ
ｕｍ、　ＤＭＥ／Ｆ１２のように２種の基礎培地を１１
〜１１５の割合で混合して使用ずろのが好ましい。

本発明の動物細胞培養用組成物は、入手が容易て大量処
理が可能な哺乳動物の血漿を原料として使用するもので
、接着細胞系動物細胞はもちろん、工業上ｎ用生理活性
物質の産生等に用いられる浮遊細胞系の動物細胞におい
ても公知の胎児牛血清や血清由来の動物培養用培地と同
等もしくはそれ以上の細胞増殖促進効果を奏する。

作用およ顛末」１明 以下に実施例により、本発明をさらに具体的に説明する
がこれらに本発明が限定されるものではない。

実施例１　（各種動物血漿中の細胞増殖促進物質の検索
） 牛、馬、豚および羊の血漿（採血した血液に直ちに最終
濃度が１％（Ｖ／Ｖ）になるようクエン酸ソーダ、′１
＋ ″また後、硫酸アンモニウム５５〜７０％飽和の塩析画
分を採取し、生理食塩水に溶解し生理食塩水に対して透
析した。

各透析液をメンブレンフィルター（マイレックス−ＧＶ
、０．２２ｕｍ　　ミリポア社）を用い除菌ろ過した後
、基礎培地であるｌ５ｃｏｖｅ培地（ＧＩＢＣＯ社）と
Ｆ−１２培地（白水製薬社製）の１・ｌの混合基礎培地
（以下１ｓｃｏｖｅ／　Ｆ−１２と略称する）に該透析
液を蛋白量にして３ｍｇ／ｍｌ、増殖促進物質であるイ
ンスリン（シグマ社製）２μｇ／ｍ１．トランスフェリ
ン（ミドリ十字社）２μｇ／ｍｌ、エタノールアミン（
和光純薬製）２／１Ｍおよび亜セレン酸ソーダ（和光純
薬製）２Ｘ　１０−８Ｍ（以」二の各増殖促進物質およ
びそれらの濃度の混合添加物をＴＴＥＳと略称する；村
上ら、［プロン−ジンゲス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）田、　１１５８−１
１６２．（１９８２）］）を添加した培地による細胞増
殖率を検討した。

対照として胎児牛血清（５ｍｇ／ｍｌ）を置いた。使用
細胞はＩｇＥ産生ヒトミエローマであるＵ２６６　（ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・エクスペリメンタル・イ
ムノロノー、７．４７７（１９７０）　）をクローニン
グして得たＮＧＥ−４４細胞を使用した。各種調製培地
を２４穴マルヂデイツシユに１ｍｌ／ウェルずつ分注し
た後、ＮＧＥ−４４細胞浮遊液（細胞数５Ｘ１０５〜１
．５Ｘ１．ｏ５／ｍｌ）をＯ，１ｍｌずつ分注し、５％
ＣＯ，インキュベーターで３７℃７日培養し、３代納代
後の各ウェルの細胞数をコールタ−カウンター（日本科
学機械製）で測定した。細胞増殖促進効果は対照である
胎児牛血清の培養増殖後の細胞数を１００とした時の各
試料の培養増殖後の細胞数を％て示すと、牛の血漿由来
塩析処理画分（以後血漿画分と略称する）では１１３、
馬の血漿画分では１０３、豚の血漿画分では１４７、羊
の血漿画分では１４０となった。このようにいずれの血
漿画分も胎児牛血清と同等もしくはそれ以上の良好な細
胞増殖促進効果を示した。

実施例２　（牛血類硫安処理画分の細胞増殖促進効果） 実施例１においてとりわけ良好な細胞増殖促進効果を示
した牛血類についてさらに頭数を増して検討した。屠畜
場にて採取した４〜７オの成牛血液よりそれぞれ実施例
１と同様の方法で血漿画分を得た。対照として胎児牛血
清および牛血清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ）添
加群を置いた。使用した細胞は浮遊細胞系として抗ＣＥ
へ抗体産生マウスハイブリドーマ（以下ＣＥＡと略す）
およびマウスミエローマであるＭＰＣｌ、１．（犬日本
製薬から購入）、接着７′１ −・Ｍの培養はトリプシン消化して浮遊化した各細胞（
ＩＸ　Ｉ０５／ｍｌ）を前記と同様にＯ，１ｍｌずつ分
注し、５％００．インキュベーク−で３７°０４日培養
した後、トリプノン消化にて細胞を浮遊化して各ウェル
の細胞数をコールタ−カウンターで測定した。結果を第
１表に示す。細胞増殖促進効果はｌ５ｃｏｖｅ／Ｆ１．
２に胎児牛血清（５ｍｇ／　ｍｌ　：Ｆｅ２）を添加し
た培地の培養増殖後の細胞数を１００とした時の各培養
後細胞数を％で示した。

すべての牛の処理前面漿および血清は強い細胞毒性を示
し細胞が死滅したにもかかわらず血漿を不活性化処理お
よび硫安塩析処理して得られろ血漿画分では良好な細胞
増殖促進効果が得られた。

第　　１　　表 細胞増殖率（％） 添加した　　　　　　浮遊細胞系　　　接着細胞系本発
明の組成物　　　　ＭＰＣ−１，Ｉ　　ＣＥΔ　　Ｖｅ
ｒｏ　　ＢＨＫ−２］ロツト１（７オ）の血漿画分　８
４　　６８　　８６　　　６８０ツト２（６オ）　　　
〃１１５　　１１５　　　　ＮＴ”　　　　ＮＴｙロッ
ト３（６オ）　　　〃ＩＱ［ｌ　　　１２３　　　９７
　　　’１１３０ット４（４才）〃１００１２３６４９
３実施例３　（血漿画分と血清画分の混合による細胞増
殖促進効果の増強） 実施例１および２において血漿画分の細胞増殖促進効果
が認められたが、効果をさらに高めるため血清より実施
例１と同様の操作で得られる血清画分を本発明の血漿画
分に混合添加した。最終蛋白量にして３ｍｇ／ｍｌにな
るよう牛、豚および羊の血清画分と１■漿両分を１：Ｏ
，１，：１．　］、：２，１：３，１．：９およびＯ：
　１　（Ｖ／Ｖ）の割合で混合し、実施例１と同様の方
法で細胞増殖促進効果を調べた。使用細胞は、ＣＥΔ（
前出）および抗１（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ抗体産生マウスハイ
ブリドーマであるＩｔｓ−Ｉ＋を使用した。その結果を
第２表に示す。細胞増殖促進効果は血漿画分単独（０１
）の培養増殖後の細胞数を１００とした時の各試料の培
養増殖後の細胞数を％で示した。

いずれも血漿画分に血清画分を混合添加することにより
血漿画分単独より優れた効果が得られた。

第　　２　　表 細胞増殖率　（％） １：０　　　　　　１８５　　　１３２１：１　　　　
　　１６９　　　１２９１：２　　　　　　１６５　　
　１２０牛　　　　　　　１　・　３　　　　　　　　
１５０　　　　　１１２１：４．　　　　　　１４６　
　　１０３１　・９　　　　　　１４．３　　　１０３
０　・　＋　　　　　　　１００　　　１００１：０　
　　　　　２３８　　　２６３１：１　　　　　　２＋
２　　　１８７１＋２　　　　　　１９８　　　　＋７
６豚　　　　　　　］：３　　　　　　　　１９０　　
　　　１６３１　・４　　　　　　１９０　　　１５５
１　・９　　　　　　１１２　　　１１６０：ｌ　　　
　　　　１００　　　　＋００］：Ｏ１５６１４１ １・　Ｉ　　　　　　　＋４８　　　１３０１＋２　　
　　　　１３３　　　１２７羊　　　　　　　１：３　
　　　　　　　１３４　　　　　１２４１：４　　　　
　　１３１　　　１１８１　・９　　　　　　１２４　
　　　＋２００：１　　　　　　１００　　　１００余
Ｊ２勾來 本発明の動物細胞培養用組成物は、アルブミンを主とす
る蛋白質を含有するが、従来の牛血清アルブミンに比べ
、より多種類の動物細胞に優れた細胞増殖促進効果が得
られ、またそれらの動物細胞の継代培養が可能である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物および成長阻害物質を実質的に含まない哺
   乳動物血漿由来の成長促進因子を含有する動物細胞培養
   用組成物。
2. （２）哺乳動物の血漿を、混在微生物の不活性化工程お
   よび塩析、脱塩工程を含む精製処理に付すことを特徴と
   する微生物および成長阻害物質を実質的に含まない哺乳
   動物血漿由来の成長促進因子を含有する動物細胞培養用
   組成物の製造法。
3. （３）微生物および成長阻害物質を実質的に含まない哺
   乳動物血漿由来の成長促進因子を含有する動物細胞培養
   用組成物を基礎培地と共に含有してなる動物細胞培養地
   。