JPH02195876A - ヒト―ヒトハイブリドーマの製造方法並びに該ハイブリドーマからモノクローナル及びポリクローナル抗体を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト−ヒトハイブリドーマの製造方法、該方
法により製造されたハイブリドーマ及び該ハイブリドー
マからのモノクローナル抗体の製造に関する。又、本発
明は、ヒトの戻患の治療にふけるモノクローナル抗体の
利用に関する。

〔従来技術及び発明が解決しようとする課題〕最初のハ
イブリッドミエローマ、即チ、ハイブリドーマは、マウ
スミエローマ細胞と、特定の抗原で免疫化したマウスの
脾臓由来のリンパ細胞との融合により得られた。この融
合又はハイブリドーマ細胞は、親脾臓細胞の特異的抗体
産生とミエローマ細胞の永久増殖性の両方を示した。各
ハイブリッド細胞は、クローン化でき且つクローンが単
一抗原決定基に対する抗体を多量に産生ずることがまも
なく判明した。各クローンは、無期限に維持できるとと
もに、いつでも、試料を培養成長するか又は動物に注射
して大規模にモノクローナル抗体を製造することができ
る。この技術は、すぐに、マウスのミニロール細胞から
の抗体の製造に発展した。

ヒトにおいて、このような抗体を治療に用いることは、
明白であると思われる。しかしながら、マウス系及びラ
ット系抗体を使用するのは、ある種の悪性腫、特に白血
病及びリンパ腫の治療においては一時的にしか有効でな
いことが判明した。

例えば、ヒ）Ｔ細胞白血病及びリンパ腫における抗体実
験が、マウス系又はラット系モノクローナル抗体を用い
て行われ、Ｔ細胞の特異性が確認された。又、Ｌｅｕ−
１を用いたとき、循環悪性Ｔ細胞を有する患者の抹消血
における自立性細胞のカウントが一時的に低下すること
が報告されている。

マウス系又はラット系抗体が、白血球数を急激に低下さ
せるのに効果的であったが、治療効果は、短時間であり
、数時間しか持続しなかった。モノクローナル抗イデオ
タイプ抗体をパルス療法により投与したとき、より持続
した応答が得られた。

これに関しては、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）等、レスポン
スオブ　キュテネアスＴセル　リンホーマ　ツーセラピ
ー　ウィズ　モノクローナル　アンチボデオタイプ　ア
ンチボデー（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　Ｃｕｔａｎｅ。

ｕｓ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　ｔｏ　Ｔｈｅ
ｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａＩ　Ａｎｔｉ
−ｉｄｉｏｔｙｐｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）　、−＝−ニ
ー　　ｘンジジェイ　メディ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、
　Ｍｅｄ、）、３０６　　：５１７〜５２２　（１９８
２）を参照のこと。

腫瘍における同様な一時的な減少が、リンパ球性白血病
、皮膚Ｔ細胞リンパ腫及び通常の急性白血病の患者にお
いて認められたの記録がナショナル・キャンサー・イン
スティチニート（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ
５ｔｉｔｕｔｅ）にある。骨髄及び皮膚における白血病
性細胞に結合した抗体の存在が、イムノペルオキシダー
ゼ及びフローサイトホトメトリー分析により明らかとな
った。皮膚Ｔ細胞リンパ腫の患者は、Ｔ細胞抗原に対す
る抗体療法での応答が小さかった。

悪性黒色腫及び固形腫瘍にあける結果は、腫瘍のサイズ
並びに抗体が抗体依存性又は細胞媒介毒性を固定、捕捉
又は開始するかどうかにより大きく異なる。

モノクローナル抗体の治療効果の機構は明確でない。又
、補体媒介細胞障害作用、抗体依存、細胞媒介毒性及び
直接増殖抑制効果が要望されている。網内系が被覆循環
細胞を除去するので、網内系が抗体効果において主要な
役割を果たすという仮説が立てられている。更に、抗体
処理後における肺でのリンパ球の凝集又はトラッピング
についての報告がある。逆に、骨髄白血病性細胞に対す
る抗体療法の効果不足も報告されている。

又、流出又は内在化により細胞表面から抗原が消失する
抗原転調が、抗体の投与後数時間以内に起こるとの記載
もある。この転調は、−時的であり、投与を中断後抗原
が戻る。これは、モノクローナル抗体に暴露後、全ての
抗原において生じるわけではない。抗原転調が、造血細
胞に対する抗原の場合の方が、固形腫瘍に対する抗原の
場合よりもより多く観察される。転調は、免疫結合分子
が細胞に入る量を増加することのできる機構の場合があ
る。しかしながら、抗原流出は、抗体複合体の網内系吸
収を増加を生じる。マウス系及びラット系抗体をヒトに
投与したときに得られる一時的な治療効果の他に、これ
らの抗体が、所望の治療効果を妨害する免疫反応を生じ
ることがあることも判明した。バイプリドーマの生成の
ためにヒト細胞以外を使用すると、患者が抗種免疫応答
が顕著な発生と関連がある。ある研究によれば、治療を
受ける患者において、各「異種移植片コに対する宿主応
答を避けながら抗体の連続投与を可能にするために、多
種多様の種において抗体が製造された。それにもかかわ
らず、多数の患者が、動物由来タンパクに対して急速な
応答が生じた。マウス系抗体を使用すると、網内系によ
る吸収の増加及び清浄化と関連がある。

マウス系抗体の静脈内注入と関連のある毒性及び副作用
については、異なる１０種の悪性腫の１０２人の患者に
ついての詳細な報告がある。これについては、アールオ
ー・ディルマン（Ｒ，Ｏ，Ｏｉｌｌｍａｎ）等、「トキ
シティー　アンド　サイド　エフエクツ　アソシエーテ
ッド　ウィズ　イントラベナス　インフュージョン　オ
ブ　ムリーン　モノクローナル　アンチボデ−ズ（Ｔｏ
ｘｉｃｌｔｙ　ａｎｄｅｆｆｅｃｔｓ　ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ　１ｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　１ｎｆｕｓｉｏｎｓ
　ｏｆｍｕｒｉｎｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ）　Ｊ　、（Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｒｅｓ、　
Ｍｅｄ、　、１９８６　；５　　：　７３−８４を参照
のこと。副作用の主要なものとしては、注入速度（２０
ｍｇ／ｈｒ）を低くすることにより制御できる気管支痙
彎がある。

又、じんま疹も普通の副作用である。大きな割合の患者
が、注入後に抗マウス抗体を示し、免疫系に繰り返し抗
原投与すると、貧血を生じる。これらの免疫反応のため
に、非ヒト系モノクローナル抗体をイメージング又は治
療用に広範囲に使用することが制限されている。モノク
ローナル抗体の使用におけるより具体的な手法が、ミラ
ー（Ｍ　ｉ　ｌ　ｌ　ｅｒ）等により、トリートメント
　オブＢセル　ウィズ　モノクローナル　アンチボデオ
タイブ　アンチボデー（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂ
−ｃｅｌｌ　Ｉｙｍｐｈｏｍａ　ｗｉｔｈ　ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ　ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ）　、二、、　−エンジ　ジェイ　メディ（Ｎｅ
ｗεｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）、３０６：５１７〜５２
２　（１９８２）に記載されている。細胞毒及びインタ
ーフェロンに対して耐性のあるＩｇＭ産生Ｂ細胞リンパ
腫の一人の患者を、４週間の間、１週間に２回抗イデオ
タイプ抗体で治療した。低い投与量で４回注入後に、全
身性の症状が消えた。

第５回目の治療で投与量を７５ｍｇに増加したところ、
腫瘍の退縮が始まった。第８回目の治療の後、患者は、
完全に回復し、４年間そのままの状態であった。次に、
スタンフォードで治療したＢ細胞すンパ腫の５人の患者
の場合には、部分応答を示した。これについては、ケー
・メーラー（Ｋ、Ｍｅｅｌｅｒ）等、「クリニカル　ト
ラライアル　オブ　アンチイデオタイプ　セラピー　フ
ォーＢセル　マリグナンシー（Ａ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　
ｔｒｉａｌ　ｏｆ　ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅｔｈｅ
ｒａｐｙ　ｆｏｒ　Ｂ−ｃｅｌｌ　ｍａｌｉｇｎａｎｃ
ｙ）　Ｊ　、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　　；　６５　：
　１３４５〜１３６３　（１９８５）を参照のこと。

又、非腫瘍性細胞による直接増殖抑制又は成長調節効果
が要望されている。

従って、疾病を治療するために、種特異性及び腫瘍特異
性抗体が必要とされている。特に、直接患者に注射して
、患者の自然免疫機構を増大及び刺激し及び特異的腫瘍
細胞を見出し且つ攻撃することにより、患者自身の抗体
応答を強めることのできるモノクローナル抗体が必要と
されている。

又、抗体は単なる一時的な治療効果以上のものが得られ
るのが理想的である。更に、抗体は、所望の治療効果を
妨害する免疫反応を生じてはならない。ヒトハイブリド
ーマから産生じた抗イデオタイプ抗体は、標的悪性腫を
退縮させることが予想される。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、ヒト−ヒトハイブリドーマの製造方法を提供
することにより、当該技術分野においてこれらの要望を
満たすことを可能とする。本発明による方法は、 （ａ）ヒト膵臓細胞と混合して融合する前に、凍結保存
及び感作するヒト腫瘍細胞懸濁液を用意し、 （ｂ）前記感作ヒト腫瘍細胞を、腫瘍細胞を感作するの
に使用した脾臓細胞とは異なる細胞系由来のＢリンパ球
と融合し、 （Ｃ）得られた融合細胞をスクリーニングして、特異的
ヒト腫瘍抗原と反応性の抗体を産生ずる一つのハイブリ
ドーマを選択し、 （ｄ）選択したハイブリドーマを制限希釈によりクロー
ニングし、そして （ｅ）選択したハイブリドーマの成長、精製及び特性決
定を行う、 工程を包んで成る。

又、本発明により、上記方法により製造されたハイブリ
ドーマが提供される。

更に、本発明のハイブリドーマを培地で培養後、培地か
ら抗体を回収することによる、モノクローナル抗体の製
造方法が提供される。本発明のモノクローナル抗体とし
ては、例えば、結腸の腺癌、肺の腺癌、乳腺癌、粘膜表
皮癌、肝細胞筋、平滑筋肉腫、黒色腫、神経繊維肉腫、
舌及び肛門の扁平上皮癌、膵臓腺癌、リンパ芽球（急性
白血病）、菌状息肉腫、えん麦細胞癌、前立腺癌細胞、
食道扁平上皮癌、胃腺癌、胆管腺癌、卵巣腺癌（粘液性
及び漿液）、リンパ芽球（リンパ腫）、クリア芽細胞腫
並びに肺胞細胞癌が挙げられる。

更に、本発明により、特異的筋に対する抗体を産生ずる
連続細胞系が提供される。この方法は、（ａ）ヒト胎児
骨髄又はリンパ芽球細胞から抗体産生細胞を調製し、 （ｂ）前記抗体産生細胞をヒト腫瘍細胞と融合してハイ
ブリドーマを製造し、 （Ｃ）前記ハイブリドーマの中から、ただ一つの免疫グ
ロブリンと反応性の抗体を産生ずるハイブリドーマを選
択し、そして （ｄ）前記選択したハイブリドーマをクローン的に細胞
系とする、 工程を包含する。

又、本発明により製造された連続細胞系も提供される。

要するに、ここで説明するヒト−ヒトパイブリドーマを
製造する方法は、白血病及びリンパ腫だけでなく固形腫
瘍の治療に有効な特異的抗イデイオタイプ抗体をコスト
の面から効果的に多量製造することができる。特許請求
の範囲に記載した発明の抗体は、モノクローナルであれ
ポリクローナルであれ、種間ハイブリドーマ由来のモノ
及びポリクローナル抗体により生じる免疫反応を起こさ
ないので、長年求められていた要望を満足するものであ
る。

又、本発明の抗体は、癌の診断（ＣＥＡに類似）：金属
ガドリニウムを固定してＭＲＬにおける利用を容易にし
たり又はテクネチウム又はインジウムを固定して核医療
スキャンニングにおける利用を容易にすることによる診
療用イメージング；腫瘍を局在化するための他の化合物
用のキャリア及びアロン（Ａｌｏｓｏ）等、［ラジオラ
ベルド　モノクローナル　アンチボデー　ツー　パンク
レアス　カルシノーマ（Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ　
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　Ｐａ
ｎｃｒｅａｓ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）　　；ブレリミナ
リー　エバリユエーション　フォー　アトジャンクチイ
ブユース　イン　トリートメント（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａ
ｒｙ　Ｂｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ａｄｊｕｎｃｔ
ｉｖｅ　Ｕｓｅ　ｉｎ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）　Ｊ、サ
ザーン　メディカル　ジャーナル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ）、第７９巻（補遺２
）　；　２７（１９８６）　（この文献に記載の事項は
本発明に利用できる）に記載の腫瘍の放射線療法におけ
るキャリアとして使用することができる。

モノクローナル抗体は、「セオリー　アンドメンツズ　
フォー　イムニゼーション　イン　カルチャー　あんど
　モノクローナル　アンチボデー　プロダクション（Ｔ
ｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　１ｍｍ
ｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ）　、Ｊ、　　ＩｍｍｕｎｏｌｏＭｅｔｈｏ
ｄｓ　、第５３巻；２６１〜２９１（１９８２）の論文
（この論文に記載の事項は本発明に利用できる）に記載
されているような無血清培養におけるヒト−ヒト系にお
いて製造され、５Ｏ３−ＰＡＧＥ！電気泳動及びウェス
タンプロット免疫結合により特性決定される。新鮮腫瘍
を細かく刻み、篩に通し、単一細胞懸濁液を調製する。

腫瘍細胞を、ダルベツコ・ミニマム・イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）　（ＧＩＢＣＯ製）で洗浄し、ヒト脾臓細胞を
感作するのに使用する。ＤＭＢＭ　Ｆ１２における１０
６／ｍｕ！の濃度の腫瘍細胞を１０’／ｍ１の濃度の脾
臓細胞と交換し、Ｃ０２富化大気中で３７℃においてイ
ンキュベーションする。４日で細胞を集め、ＤＭＥＭに
おいて、５０％ポリエチレングリコール（シグマ社、セ
ントルイス、ＭＯ）中で１０’／ｍＩ！の濃度で混合す
る。

脾臓細胞を感作するとは、外来（即ち、膵臓と同じ供与
体由来のものでない細胞）表面細胞抗原を、脾臓細胞と
接触させて置（。これらの細胞は、抗原を、外来性と認
識し、それらの外来性の性質を特徴づける免疫応答を開
始する。これにより、脾臓に存在するリンパ球が、その
情報を抗体形成細胞（融合系）に伝達してその識別され
た抗原に対する抗体を発生する。表面抗原に対する感作
応答は非特異的であるので、得られるクローンを試験し
て、所望の抗体を有するものを見出す必要がある。従っ
て、細胞懸濁液を、次に、ＤＭＥＭ　Ｆ１２において、
９６ウ工ル組織培養プレートに入れ、Ｃ０２富化大気中
において、３７℃でインキュベーションを行う。ＢＬＩ
ＳＡでの色変化を示すとともに種々の型の細胞との交差
感受性を示さないことで明らかとなる抗体製造でのこれ
らのクローンは、組織フラスコ中での抗体製造のために
拡大する。回収する抗体を、氷で５０％硫酸アンモニウ
ムにより沈澱させ、、１５Ｍ塩化ナトリウムにより、３
回緩衝液を変えて４８時間透析する。セファロースカラ
ムを用いたクロマトグラフィーにより物質を回収し、画
分を採取する。限外濾過（バイオラド、リッチセント、
ＣＡ）　により、検体をさらに濃縮できる。組織化学分
析のためには、間接的２段階免疫ペルオキシダーゼ法が
用いられる。

ハイブリドーマにおいて用いられる腫瘍及び膵臓細胞を
感作するのに用いることができるインターロイキン−２
は、ヒトリンパ球から成長させ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（米国）　　：　７７　：　６１３
４〜６１３ｇ（１９８０）に記載されているガロ（Ｇａ
ｌｌｏ）の方法を用いて分離される（この文献に記載さ
れている内容は、本発明に利用できる）。旧Ｖ　５ＨＢ
Ｖの負の供与体からロイコホレシス（ｌｅｕｃｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ）　　により得られる白血球層は、アメリカ
ン・レッド・クロス（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｅｄ　Ｃｒ
ｏｓｓ）　（アトランタ、ＧＡ）から人手できる。白血
球層は、血液型により分離し、細胞ラフイコール−ハイ
パーク（シグマ社、セントルイス、ＭＯ）で分離する。

これらをダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）　（
ギブコ社、ニューヨーク）で洗浄し、ＤＥＭＢ中におい
て１％（Ｖ／Ｖ）ファイトへマグルチニンーＰ（シグマ
社、セントルイス、ＭＯ）で刺激する。ＣＯ２富化大気
中において、３７℃で４日間インキュベーション後、上
滑を回収し、非インターロイキジ−２タンパクを５５％
硫酸アンモニウムで沈殿させる（シグマ社、セントルイ
ス、Ｍ　Ｏ）。上清を、ＴＲｒＳ緩衝液（ｐＨ８）（シ
グマ社、セントルイス、ＭＯ）中で透析浴を更新しなが
ら冷蔵透析する。透析液を、次に、セファロースカラム
（ファーマシア製、ビス力タウエイ、ＮＪ）を通過させ
、、０２Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８）で溶離する。その
後、最も高い吸光度を示す分画をプールして、セファデ
ックス（ファーマシア製、ビスカタウエイ、ＮＪ）　を
用いた第二クロマトグラフィー工程に付し、分画を採取
する。１単位を、インターロイキン−２依存、ＰＨ＾非
依存型細胞を４日間で５倍にするものを意味する。

用いられる他の全ての試薬は、医薬品の許可を受けた販
売業者から得られる。

抗イデイオタイプ抗体の研究では、現在のところ８人の
患者を治療した。抗体での骨髄パージを、−人の自家骨
髄移植患者について完了した。８００ｍｇまでの抗体注
入が難無く行われ、抗イデイオタイプ抗体の腫瘍細胞へ
の結合が、注入４８時間後の遅い時期に採取した生検材
料に観察される。生体内結合が、生検材料と注入前の半
ビボ抗体との間に見られる結合と矛盾しない。赤血球に
よる非特異的吸収は見られない。非特異的結合は、注入
後に得られる生検材料では明らかでなく、注入前の半ビ
ボでの知見と矛盾しない。注入中に腫瘍退縮が見られた
。最大縮化が４日で見られ、７日で再成長が見られる。

４週間以上引き続き観察したところ、抗ヒト抗体生成、
腎若しくは肝機能の変調、甲状腺若しくは副賢機能の変
調又は循環抗原−抗体複合体は見られなかった。免疫複
合体の補体活性クリアリングが、注入後に増加した。

〔実施例〕

ハイブリドーマの調製及び特性決定並びに得られる抗イ
デイオタイプ抗体は、下記の実施例によりよりよく理解
できるであろう。

実施例１：ヒト腫瘍−ヒトリンパ球ハイブリドーマの製
造 下記の全ての操作は、グツド・ラボラトリ−・スタンダ
ーズ（Ｇｏｏｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ　５ｔａｎｄａｒｄｓ）に準じたものである。

腫瘍細胞懸濁液の調製：新鮮腫瘍を、生理食塩水又は（
他の）組織培養／ウィルス輸送培地に入れる。検体を、
無菌性小力及び鉗子を用いて、層状フローフード中で、
細かく刻む。次に、細かく刻んだ組織を、１００メツシ
ユの網上に置いておろす。処理した材料を、無菌ＤＭＥ
Ｍ培地でグリッドから洗浄して、無菌ペトリ皿に入れる
くいずれの組織培養媒体を使用することができる）。グ
リッドに残っている組織断片を、鉗子で除去し、分離を
更に行うためにガラス組織ホモジナイザーに入れる。組
織を、中心管の回転と関連した中心管の垂直（上下）運
動で粉砕する。ＤＭＥＭ培地を用いて組織ホモジナイザ
ーの保持容器を洗浄し、受理容器と中心管との間の間隔
を最小にして中心管を配置して、細胞物質を無菌ペトリ
皿にデカンテーションする。次に、プールした物質を、
プラスチックシリンジに吸引し、２１ｇａ、　針を通し
て第二器に入れる。次に、この物質を吸引して、上記し
たようにして２３ｇａ、　針を通過させる。このプロセ
スを繰り返して３回目に、物質を２５ｇａ、　　針を通
過させる。その後、現在単一細胞懸濁液の状態である分
離した検体を、パスツールピペットを備えた目盛付ポリ
カーボネートコニカル管に入れる。その後、等容量のＤ
Ｍ　Ｅ　Ｍ培地で洗浄し、１０分間２００　ｘ　ｇで遠
心分離する。上清を捨て、細胞物質をパスツールピペッ
トで再懸濁し、再び等容量のＤＭＥＭ培地で洗浄する。

これを、室温で１０分間、２００　ｘ　ｇで２回目の遠
心分離する。

細胞懸濁液を、血球計でカウントする。ザーリーピペッ
トを用いて１：１００希釈を作製する。この希釈流体は
、、２％トリバンブルーと生理食塩水との１　：１混合
物を含有している。この希釈流体を、手で回転させて細
胞懸濁液と混合し、室温で５分間接触後、血球計のカウ
ントチャンバー（２個）にピペットで移す。９個の大き
な正方形中の細胞数をカウントする。色素を吸収しない
ものについては別途求める。生存可能な細胞の数を下記
のようにして測定する。

総則ｌＩ凹刀ワント 次に、血球計に置いた物質を再吸引し、遠心分離し、組
織検査のために細胞ブロックを作製した。

細胞懸濁液を、ダルベツコミニマムイーグル培地（ＯＭ
ＢＭ）を用いて、１０７細胞／ｍｊｉ’生存腫瘍細胞を
含有する容積に希釈する。４ｍｌのフィコール−ハイバ
ークを加えて、目盛付ポリカーボネート管（コニカル状
底）を作製する。次に、ポリカーボネート管をある角度
に維持し、パスツールピペットを用いて、管底の透明な
粘着性の培地を分断しないように、懸濁液を管の壁に沿
ってゆっくり移動させることにより、細胞懸濁液（管当
たり１０１１１１ＥＪ下）ヲ、フィコール−ハイバーク
上に置く。

２０００Ｘ　ｇで２０分間、室温で遠心分離する。ペレ
ット上の流体を全て採取する。これには、生存細胞がは
いっており、赤血球の汚染はない。ＤＭＢＭを１０ｍ１
！添加し、３００Ｘ　ｇで１０分間遠心分離する。その
後、傾しゃする。ベレットをＤＭＢＭで２回洗浄し、毎
回、２５０　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離する。

細胞懸濁液を、次に、組織フラスコ（細胞の成長を容易
にするために、海洋二枚貝由来の上皮細胞マ）　ＩＪフ
ックス質又は接着性タンパクで被覆してもよい）に入れ
、ＤＭＥＭ　Ｆ１２をｌＱｎ＋ｊ！添加する。

インシュリン、β−プロゲステロン又は他の成長刺激剤
を、腫瘍細胞懸濁液の入ったフラスコに添加する。トラ
ンスフェリンを供給して、細胞への鉄の移動を容易にす
る。ライスル汚染を避は且つ使用前に抗体を容易にクリ
ーンアップできるように、血清及び抗体を添加しないこ
とが望ましい。

しかしながら、無血清及び無抗体成長を維持することは
困難であるので、必要に応じて、ヒトＡＢｒｈネガティ
ブ血清及びゲンタマイシンを使用してもよい。このフラ
スコを、ＣＯ□発生剤とともに袋に入れ、３７℃のイン
キュベーターに入れる。

７日の終わりに成長状態を調べる。媒体中の指示薬色素
により色が変化した場合には、早めに培地を交換する。

フラスコから機械的に細胞を取り出し、ＤＭＥＭで洗浄
し、２５０　ｘ　ｇで１０分間遠心分離（２回）　する
。

細胞懸濁液を、１０６細胞／ｍｌ！に再構成し、１ｍｌ
をとって、冷凍保存する。検体の残りを免疫化及び調査
に用いることができる。

冷凍保存：１０ｓ細胞／ｍＩ！ＤＭＢＭ懸濁液を標識及
び日付の書いである凍結管に添加する。又、＾Ｂｒｈネ
ガティブヒト血清も添加して、１０％の濃度とする。こ
の際、ＨＢＶ及び旧Ｖを含有しないヒト血清を用いても
よいが、自己由来血清が好ましい。次に、水中で１５分
間冷却する。細胞懸濁液をゆっくりと振り動かしながら
、最終濃度が１０％となるようにＤＭＳＯ（ジメチルス
ルホキシド）を添加する。

数回逆にして完全に混合する。これを、液体窒素容器の
液体窒素の蒸気相に挿入する。凍結管は、少なくとも２
時間の間、蒸気相にそのままにしておく必要があるが、
それ以上の時間、その環境に置いておいてもよい。次に
、容器を装置から取り出し、板紙ケインに入れ、液体窒
素中に保存する。

これらの細胞は、使用する必要のあるときに、３７℃の
水浴に入れ、攪拌せずに液相への転移まで暖め、迅速に
解凍してもよい。その後、この細胞を、ポリカーボネー
トコニカル管に迅速に移し、１０％ＡＢｒｈネガティブ
ヒト血清を含有するＤＭＥＭで１０倍に希釈する。２０
０　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離して２回洗浄する。再懸
濁し、フラスコに入れる。

感作：ヒト胎児又は成人から得た膵臓細胞を用いて、融
合前に腫瘍細胞を感作する。新鮮胎児又は成人脾臓を、
無菌セットに入れ、カプセルを無菌器具で細かく裂く。

牌髄を、上記した腫瘍細胞懸濁液の調製に記載した方法
で調製する。細胞を、冷凍保存し、感作前に解凍及び複
製する必要がある。凍結系は、解凍時には安定である。

ヒト膵臓細胞を、融合前に、（１）トランスファー因子
、（２）ＰＨＡ又はＣａｎＡ等の芽細胞トランスファー
を刺激する通常のマイトジェン又は（３）ＩＬ−２等の
免疫応答を低下させない特異的リンホカインで刺激する
。

上記全てについて使用してみたところ、効果は同等であ
った。２−メルカプトエタノールを培地に添加して脾臓
細胞成長を増強してもよい。

腫瘍細胞を、Ｄ旺Ｍ　Ｆ１２中の濃度が１０’／ｍ　ｌ
となるようにする。膵臓細胞を、ＤＭＥＭで３回洗浄し
、毎回、２００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離して、血清
痕跡物を除去する。次に、膵臓細胞を、１０６細胞／ｍ
ｌの濃度とする。インターロイキン−２（ｌｙ）１０単
位／ｍｌを懸濁液に添加する。１　：１６の希釈まで、
連続２倍希釈をＤＭＢＭ　Ｆ１２を用いて行う。腫瘍細
胞Ｑ、ｌ＋ｎ１と膵臓細胞、１ｍｌを混合してゼロ希釈
を生成する。希釈液２４ウエルプレートに入れ、培地を
添加して、各ウェルの総容積を１１′ｌｌｌ１とする。

全ての培養を調製後、蓋をしめ、袋に入れ、３７℃のイ
ンキュベーター中にＣＯ２発生剤とともに配置する。毎
日、ＯＭＥＭ　Ｆ１２を、０５ｍ　ｌ再供給する。又、
袋に入れ、発生剤を添加する。４日間のインキニベーシ
ョン後、両方の細胞の培養を、各ウェルをポリスマンで
こすって採取して、内容物をパスツールピペットを用い
てポリカーボネート管に移し、２００　Ｋ　ｇで１０分
間遠心分離してペレット化する。

細胞をＤＭＥＭで洗浄し、融合準備完了とする。

スクリーニングプレート：感作用に腫瘍細胞を調製する
際に、腫瘍細胞も、９６ウエルマイクロプレートに分配
する（各ウェルに、０５ｍ　ｌのＷ５濁液を入れる）。

細胞を乾燥させ、７０％アルコールで固定する。抗体生
成用のスクリーニングのために融合実験後に使用する前
に、ウェルを生理食塩水で洗浄し、振って乾燥する。次
に、プレートをプロットする。

使用懸濁液を用いてできるだけ多くのプレートを作製し
、ラベルを付けて後日使用する。余分のプレートを交差
反応性スクリーニングに用いてもよい。

融合：胎児骨髄系、リンパ芽球系及びミエローマからの
プラズマ細胞系の３つの異種の細胞系を融合に使用した
。胎児骨髄系は、腫瘍細胞を感作するのに使用する胎児
脾臓系のものとは異なる。

全ての融合細胞を１０６細胞／ｒｎｌで調製し、抗体製
造用にスクリーニングする。陽性のウェルをＩＬ−２又
は普通マイトジェン又はトランスファー因子で刺激し、
下記する制限希釈によりクローニングする。一種類の免
疫グロブリンのみを産生ずる単一クローンを選択する。

これは、下記する免疫ペルオキシダーゼ染色により決定
される。胎児骨髄（ＢＧ−２３１）由来のＩｇＧ系、リ
ンパ芽球組織（ＢＭ−９５）由来のＩｇＧ系及びミエロ
ーマ（ＢＡ　−１６０）由来のＩｇＧ系を順次使用した
。これらの３つの融合系を１９８８年の９月１６日に、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシＢ　ン（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）に、それぞれ、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ９８３
５号、第ＣＲＬ９８３２号及び第ＣＲＬ９８３４号の番
号で寄託した。

全ての系を冷凍保存して、融合前に、解凍及び複製する
必要がある。又、全ての系は、解凍時には安定である。

融合に用いる系は、１０５細胞７ｍｌの濃度になるまで
成長する。ＤＭＥＭを洗浄後、生存度を、トリバンプル
ー排除法で測定すると、９５％以上である。

ＤＭＥＭで３回洗浄する。

感作腫瘍及び１０６細胞／ｍβの濃度の膵臓細胞を、１
０６細胞７ｍｌの濃度の融合系と混合し、ポリカーボネ
ート遠心分離管に入れ、４００　ｘ　ｇで１０分間遠心
分離する。ペレットから上清を除去し、３７℃の水浴中
で維持する。１ｔｎｌｌピペツトを用いて、暖かい５０
％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をｌ　ｍＩ！、１
分間かけて、ペレットに添加する。ポリエチレングリコ
ールを添加している間、ピペットの先端を用いて、細胞
ペレットを静かに攪拌する。細胞懸濁液が均一の細胞集
塊のように見えるまで、もう−分間攪拌を継続する。同
じピペットを用いて、３７℃に暖めたＤＭＢＭ　１　ｍ
ｌ中で攪拌する。

これにより、細胞を溶解せずにＰｔ！Ｇが希釈される。

最後に、１０ｍ１ピペツトを用いて、ＤＭｆｉＭ７　ｍ
　ｉ中で２〜３分間攪拌する。この際、ピペッティング
を行ってはならない。その後、検体を、４００　ｘ　ｇ
で１０分間遠心分離して上清を除去する。ピペットの先
端を細胞ペレットに向は且つ攪拌して、ＤＭＩＥＭ３Ｑ
ｍ　ｉを添加して細胞集塊の懸濁液を得る。この懸濁液
のＱ、１ｍｊ！を、３つの９６ウ工ル組織培養プレート
の各ウェルに入れ、ＣＯ２発生剤とともに袋にいれ、３
７℃のインキュベーターに入れる。

融合の後、その日に、各ウェルに、ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン（）ＩＡＴ）培地の０゜１ｍｌ
をを添加する。それぞれ、２日目、３日目、５日目、８
日目及び１１１日目、各ウェルか・ら培地を吸引除去し
、吸引後ＨＡＴをＱ、ｌ＋ｎｊ’各ウェルトウエルる。

再び袋に入れ、インキュベーターに入れる前に、毎回、
ＣＯ２発生剤を添加する。

１４日目に、培地をＨＴで毎日又は３〜４日おきに交換
する。２４日目までに、細胞は、ＤＭＥＭ　Ｆ１２のみ
のものにに移される。又、ＨＡＴ及びＨＴを省略して、
１日日からＤＭεＭ　Ｆ１２のみを使用してもよい。

最初のスクリーニング：細胞融合後、２週間と４週間の
間に、各培養プレートウェルごとにそれぞれのピペット
を用いて、上清を採取する。これらを、１　：１０の希
釈倍数く９部の生理食塩水に対して１部の上清）で試験
をする。

上記で作製した抗原被覆プレートを用いる。内容物をフ
リックして溜に入れ、きれいなタオル上で軽く叩いて乾
燥させる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＳｐＨ７，４
）を静かにプレートウェルに流し込みいっばいとする。

この際、気泡がウェルのいずれにもトラップされていな
いことを確認する必要がある。フリックし、乾燥し且つ
ＰＢＳで２回満たす。

抗原でプレコートしたウェルに各ノ１イブリドーマ上清
を、０５１１１　ｆ添加する。更に、、０５ｍ　ｌのＰ
ＢＳを各ウェルに添加する。少なくとも１時間室温でイ
ンキュベーションヲ行つ。

ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトグロブリンを、ＰＢ
Ｓで１：１００に希釈する。上清インキコベーションプ
レートの内容物をフリックして溜に入れ、バット乾燥す
る。蒸留水を静かに流して、各ウェルを洗浄する。この
際、気泡がウェルのいずれにもトラップされていないこ
とを確ｌ忍する。フリックし、乾燥し且つ水で２回満た
す。最後の洗浄の後、各ウェルに、Ｏ，ｔｏｍ　ｌの希
釈抗−ヒトゲロブリンペルオキシダーゼ複合体を添加し
、プレートを室温（１８〜２０℃）で、少なくとも１時
間で且つ２時間を超えない時間インキュベーションする
。１％過酸化尿素を含有するクエン酸緩衝液を調製し、
発色団、即ち、０−フ二二レンジアミン、を添加し溶解
する。プレートをフリツク後、乾燥する。ウェルを、蒸
留水で３回洗浄する。この際、いずれのウェルにも気泡
がトラップされていないことを確認する。気泡かトラッ
プされなくなるまで洗浄する。最後の洗浄に続いて、ク
エン酸緩衝液の基質発色団溶液をｏ、　１０ｍ　ｆづつ
各ウェルに添加する。室温で、少なくとも２０分間であ
るが３０分を超えない時間（この点を超える色の変化は
、グロブリン含量又は基質７発色団の有効性とは無関係
である）室温でインキュベーションする。

陽性ウェルは、黄色がかった琥珀色を生じ、−方、陰性
ウェルは透明〜淡黄色の色相のままである。

制限希釈によるクローニング：意図する抗体を生産する
細胞を、２４ウエルプレートの１ｍ１組織培養ウェルに
移す。、５ｍｌのＨＴ又はＯＭＢＭ　Ｆ１２培地を、各
ウェルに入れる。ＤＭＢＭ　Ｆ１２を基剤１培地として
使用する。各抗体産生マスタープレートウェルの内容物
を、ピペットを用いて再懸濁し、懸濁液全体をトランス
ファーウェルに移す。この混合物を再懸濁後、この懸濁
液の５滴を、最初のマスタープレートウェルに添加する
。これにより、同型培養ができる。２〜３日後、Ｑ、５
ｍ！！のＨＴ又はＤＭＥＭ　Ｆ１２培地を再供給する。

２日後、上清を除去し、新鮮なＨＴ又はＤＭＥＭ　Ｆ１
２培地を添加する。成長がほぼ集密的となったとき、再
スクリーニングをして上記した抗体活性とする。

培養が、意図する抗体を産生じ続ける場合には、細胞を
分割する。このうち、一つの分割物をクローニング用と
する。第二の分割物を凍結及び保存用に増加させる。凍
結すべき混合物を、１０％＾Ｂｒｈネガティブヒト血清
を含有するＤＭＥＭ５ｍｆの入ったフラスコに入れ、袋
に入れ、ＣＯ２発生剤とともに配置し、３７℃でインキ
ュベーションする。凍結操作は、上記した通りである。

培養１ｍｌから意図する細胞を取り出し、トリバンブル
ーで生存細胞濃度を測定する。方法は、前記で説明した
通りである。２３０個の生存／％１イブリッド細胞を、
成長因子（インシュリン、プロゲステロン、ビタミンＣ
，）ランスフェリン）ヲ含有するＤＭＥＭ　Ｆ１２に懸
濁するように、クローニングすべき培養の試料を希釈す
る。９６ウエルのうちの３６ウエルに、この混合物のＱ
、ｌｎ＋ｊ！を入れる。細胞懸濁液の残りのｌ、Ｑｍｊ
ｉ！に、口ＭＢＭ　Ｆ１２をもう４゜０ｍｌ添加し、別
の３６ウエルに入れる。残りの細胞懸濁液に、ＤＭＥＭ
　Ｆ１２を１．４ｍｌ添加し、残りの混合物を、この場
合も、Ｏ，１ｍ　Ｒのアリコツトで分配する。

５日日及び１２日日日、プレートに、ＤＭＢＭ　Ｆ１２
を０、０５ｍ　ｆ添加供給する。１４日口座でには、ク
ローンを試験するに十分な量とする必要がある。平板培
養する３つの希釈液のうちの一つは、成長のないウェル
を生じるものでなければならない（平均１細胞／ウエル
を平板培養する場合、ウェルのうちの３７％では、成長
を生じないことが必要である）。

モノクローナルと思われるウェルは、ふたたび、抗体活
性の試験をする必要がある。

６個の陽性クローンを、２４ウエルプレートの分離した
１ｍｌ培養ウェルに移し、上記したようにして、ＨＴ培
地（基剤としてのＤＭＥＭ中）Ａ又はＤＭＥＭのみを添
加する。上記した方法で、上滑について抗体の試験を行
う。連続して陽性となったら、陽性クローンを５ｍｌフ
ラスコに移し、ＤＭＥＭ　Ｆ１２で培養を増やす。クロ
ーンの一部分を上記した方法で凍結する。

抗体の製造：陽性クローンを静置フラスコに人れ（この
フラスコは、海洋二枚貝由来の上皮細胞マトリックス物
質又は接着性タンパクで被覆したものでもよい）　、Ｄ
ＭＢＭ　Ｆ１２を添加する。細胞を過剰成長させる。フ
ラスコを、３７℃のインキュベーターにおいて、ＣＤ□
発生剤とともに、袋に入れた状態で維持する。週に一度
、上清を除去し、このフラスコで操作を繰り返す。上滑
をとっておいて、複数の上清をプールして精製する。こ
の上清は、室温又は３７℃又は冷蔵庫中では長期間安定
である。

この反復に用いたフラスコにより、全ての採取物が確実
に同一の成長相からであることを可能にするマスターワ
ーキング細胞バンクを維持できる。

生産規模を拡大するには、陽性クローンを静置フラスコ
から除去し、ＤＭＥＭ　Ｆ１２を添加したスピナーフラ
スコに入れる。このフラスコを、５〜７％Ｃ０２７９３
〜９５％空気を維持するように監視した雲囲気で、３７
℃の水浴に入れた状態で維持する。フラスコを、細胞に
対する剪断損傷を最小とするために、連続的に１５ｒｐ
ｍで攪拌する。上清を連続して除去するとともに０Ｍ８
Ｍ　Ｆ１２を添加するか、又は毎日上清を除去して０１
４８Ｍ　Ｆ１２を添加する。

精製：免疫グロブリンを４０％飽和硫酸アンモニウム（
ｐＨ７，４）で沈澱させる。上清を、２．０００　Ｘ　
ｇで３０分間遠心分離する。免疫グロブリンの採取物に
、攪拌しながら、飽和度４０％となるまで、硫酸アンモ
ニウムをゆっくり添加する。その後、この物質を、水中
に１６時間保持する。沈澱を再懸濁し、２．０００　Ｘ
　ｇで３０分間遠心分離する。次に、沈澱を最少量の水
に溶解し、緩衝液を３回交換して、２００容の、１５Ｍ
　ＮａＣ１（ｐＨ７，４）で、４８時間透析する。

透析すべき物質を導入する前に、透析膜を、緩衝液で予
備処理する。

透析物質を回収し、ＤＥＡＢ−セファロース（２５ｘ５
０ｍｍ）のカラムに添加する。この物質を、、０５ＭＮ
ａＣ１（ｐＨ７，４）を低圧で徐々に添加して溶離させ
る。

５ｍ１分画を採取する。透析液の各容に対して２００容
の溶離剤を用いる。分画を、２８Ｏｒ＋ｍで試験し、最
大、Ｄ、を有するものをとって置く。次に、ＵＶスペク
トル（１９０〜３４０　ｎ＋ｎ）を得て、純度を調べる
。

トラスフェリンのみの場合は、透析物質中に見られる汚
染物であり、これは、ゲルクロマトグラフィーで除去さ
れる。この検体は、限外濾過により更に濃縮してもよい
。アリコツトを、膜分離管において、２，０ＯＯｘ　ｇ
で２０分間遠心分離する。その後、上層を回収する。

特性決定：細胞試料を生理食塩水で再構成して、タンパ
ク質濃度を１　ｍｇ／ｍβとする。公知のタンパク質標
準と屈折率を比較して、抗原のタンパク質濃度を概算す
るのに利用する。次に、抗原標本の可溶化溶液に対する
比が１　：１となるように、２％アガロースを有するセ
プラゾルを添加してこの物質を可溶化する。少なくとも
９．５ｍ１の抗原溶液から開始する。混合試料を６０℃
で５分間加熱し、、２ｍｆピペットに吸引させて、ゲル
に添加する前に冷却する。予め染色した分子量標準を、
２％アガロースを有するセブラゾルで、■　＝２に希釈
し、６０℃で３分間加熱し、、２ｍＩ！ピペットに吸引
させて、ゲルに添加する前に冷却する。標準物をゲル中
で冷却する。

分子量標準を、直径１゜５　ｍｍＯロッドの形態で取り
出し、ｌ　ｃｍの長さに切断する。各セプラゲルに、２
個のｌ　ｃｍの分子量標準を、分離ゲルの頂部の端から
ｌ　ｃｍのところに配置する。ＳＯ３走行緩衝液におけ
る溶融１％アガロースの深さｌ、５＋＋＋ｍの層を、ロ
ッド上に添加してそれらをゲルに固定する。プラグが凝
固したら、抗原試料をウェルのゲル上に重ね且つその上
に走行緩衝液アガロースを重ねて、室温で凝固させる。

全ての試料を加え且つ冷却したら、ゲルを、電気泳動タ
ンクに入れ、ＳＯ８走行緩衝液中で、周囲温度において
、２００　Ｖ（一定電圧）で、トラッキング色素（ブロ
モフェノールブルー）がカセットから移動するまで電気
泳動する。次に、カセットを、タンクから取り出し、開
き、ゲルを、１０％メタノールの２５ｍＭ　ＴＲｌ５　
、１９２＋ｎＭグリシン溶液の入ったプラスチックタブ
に移し、室温で３０分間平衡化する。

電気泳動物質を、電気泳動タンクの中の膜上に配置し且
つ冷却コイルを用いてイモピロンＰＶ叶膜に移し、トリ
スグリシン緩衝液のメタノール溶液を用いて、１５０ボ
ルトの一定電圧において室温で４時間陽極方向に移動さ
せる。次に、膜を取り除き、、０５％ツイーン（Ｔｗｅ
ｅｎ）　２０を含有するＰＢＳでゆすぎ、濾紙上に置い
て乾燥させる。その後、膜をｌ　ｃｍストリップに切断
し、用いる抗原及び抗体ヲ示す２桁のコードのラベルを
付ける。

次に、ストリップを、１００％メタノールを迅速に通過
させて湿潤し、、５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで
ゆすぐ。その後、ストリップを、、５％ツイーン２０を
含有する５％牛血清アルブミンのＰａＳ溶液１０ｍ　Ｒ
とともに、１３Ｘ１００スクリユートツプ試験管に入れ
、３７℃で２０分間揺動する。揺動後、溶液を傾しゃし
、−次抗体溶液で置換する。

この抗体溶液は、ｌ　ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、、０
５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで１　：１０及び１
：１００に希釈する。この溶液を、ストリップとともに
１時間室温でインキュベーションする（対照ストリップ
は、−次抗体なしでインキュベーションする）。次に、
ストリップを、傾しゃし、ＰＢＳ及び、５％ツイーン２
０で１０分間室温でゆすぐ。

ストリップを、各々、室温で１０時間、抗ヒト／アルカ
リ性ホスファターゼの１　　：２０００希釈液３ｍβ中
でインキュベーションする。ストリップを、、５％ツイ
ーン２０を含有するＰＢＳで２０分間２回ゆすぐ。この
際、各溶液とも１０ｍ１が必要である。

ストリップをトリス（１００ｍＭＳｐｉ４８．８）　、
ＮａＣ１（１００ｍＭ）、ＭｇＣｈ　（５ｍＭ）緩衝液
で１０分間浸漬する。適当に展開したら、ストリップを
水でゆすぎ且つ乾燥する。

ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）塩を７０％Ｎ。

Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＮＮＤＭＦ）水溶液に７５
ｍｇ／ｒｎ１１の濃度に溶解し、１００％ＮＮＯＭＦに
５０１１１ｇ希釈して５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンシリルホスフェ−）　（ＢＣＩＰ）を調製する。これ
らのものは、使用毎に新鮮なものを調製する。、０７ｍ
　Ｉ！のＮＢＴを、２５ｍ１のトリス、ＮａＣ１，Ｍｇ
Ｃ１ｚ緩衝液を添加し、よく混合し、ｏ、　Ｏｌｍ　ｉ
のＢＣＩＰを配合し、ストリップの入った容器に添加す
る。試験管当たり少なくとも３ｍ！！必要である。適当
に展開したところで読み取る。

泳動により、分子量が推定（標準物は一次元で泳動する
）でき；反応により、免疫グロブリンの型の特性が決定
され；免疫反応性が二次元トランスファーで示される。

結合：意図する細胞系は、抗原が調製される腫瘍のもの
だけでなく、クリア、孔部、肺、胃、肝臓、結腸、卵巣
及び前立腺の腫瘍を含むセルパネルを包含する。細胞系
は１０’／ｍｉ’に調製し、上記の抗体希釈液と反応す
る。これは、抗体Ｑ、２ｍｌを細胞系のＤ　Ｍ　Ｂ　Ｍ
溶液Ｑ、２ｍｊ！に添加して行う。３７℃でインキュベ
ーションを３０分行った後、ＤＭＥＭで洗浄（４００ｘ
　ｇ　、　５分間）し、遠心分離によりペレット化する
。次に、抗ヒト／ペルオキシダーゼ二次抗体のｌ　　：
２０００希釈液をＤＭｌＥＭ中で再構成したペレットに
添加し、３７℃で３０分間インキニペーションする。Ｄ
ＭＥＭで洗浄し、遠心分離（４００ｘ　ｇ　、　５分間
）によりペレット化後、過酸化尿素を含有するクエン酸
緩衝液を添加し、１５分間インキコベーションすること
により発色する。細胞標本を、次に、血球計に入れ、発
色を評価する。発色細胞の割合をカウントして測定する
。

胎児細胞スクリーニング：胎児組織の凍結断面標本を作
製する。脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、膵臓、膵臓、副腎
、胃、結腸、卵巣、前立腺、骨髄及びリンパ節を検査す
る。まず、スライドを冷気中、ＰＢＳで５分間洗浄し、
−次抗体を冷気中に５分間置く。次に、このスライドを
、ふたたびＰＢＳで洗浄する。その後、ペルオキシダー
ゼを有する二次抗体を、５分間適用し、洗浄後、過酸化
尿素を含有するクエン酸緩衝液でインキュベーションす
る。対照スライドには、牛血清アルブミンで処理したも
のだけでなく、ペルオキシダーゼで予備処理したものが
用いられる。発色は、顕微鏡で評価し、強度に関して評
点する。スライドは、ハリスへマドキシリンで対比染色
する。

ヌクレオチド汚染：透析前に、Ｌｏｎｇの公知のＤＮＡ
をｌ＋＋＋ｊ！の組成抗体標本に添加する。この添加標
本を、平行精製工程に付し、上記した方法で電気泳動す
る。ビオチン化プローブを試験ストリップに添加し、緩
衝液でゆすぎ、発色する。一つのストリップに１１００
ｎの公知のＤＮＡを添加する。

精製ス）　ＩＪツブが発色しない場合は還元レベルを示
している。

ニックトランスレーションキット　（エンゾバイオケム
社製）を用いて、ポリヌクレオチド汚染物質のスクリー
ニングを行う。供給するＤＮＡ５ｅを、１　ｍｇ／ｍｊ
！ヌクレアーゼフリー牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　を
含有するｌＯｍＭ）リスＭＣＩ緩衝液で１　：５００に
希釈する。２つの反応バイアルを作製する。

このうちの一つには、キットに設けられている公知のＤ
ＮＡが入っている。第二のものには、精製後に試験する
抗体標本が入っている。各バイアルに、ＢＳＡを含有す
るトリス塩酸緩衝液、キットに入っているヌクレオチド
溶液、ビオチン化デオキシ１１０Ｐ　、　ＤＮＡポリメ
ラーゼ、及び希釈ＤＮＡ５ｅ溶液を入れる。これらを、
１４℃で２時間インキュベーションする。２時間の終わ
りに、、２Ｍ　ＢＤＴＡを用いて反応を停止する。次に
、この物質を６５℃で１０分間放置し、取り込み分析の
準備を完了する。

ＤＮＡの変性を、混合物を急速に煮沸後冷却することに
より行う。これをデンハルト溶液、及び５０％ホルムア
ミド含有、１％ＳＯ３，３，６Ｍ　ＮａＣ１，０゜２Ｍ
　Ｎａ２ＰＯ＜及び、２Ｍ　ＥＤＴＡの溶液に添加する
。その後、キットに設けられているフィルターを、ホル
ムアミド溶液に１００分間置て接種の準備をする。

前処理後、デンハルト混合物を添加し、フィルターを袋
に入れて、４２℃で４〜６時間インキュベーションする
。次に、このハイブリダイゼーション溶液ヲ、再び、、
２　ｍｌ／　ｃｍ’の濃度で添加し、フィルターを袋に
入れて、４２℃で１６時間インキュベーションする。イ
ンキ二ベーション完了後、フィルターを、塩化ナトリウ
ム／リン酸ナトリウム／ホルムアミド／ＳＤＳ緩衝液中
で、−回目を室温で１５分間、２回目を６０℃で１５分
間洗浄した。フィルターを最後に、塩化ナトリウム／リ
ン酸ナトリウム中で室温で洗浄し、アビジン−ペルオキ
シダーゼでの検出の準備を完了する。

検出キットで供給されるストレプトアビジン混合物を濾
過物質に適用する。室温で３０分間このままとする。次
に、フィルターを、ＰＢＳで洗浄し、ホースラデイツシ
ュペルオキシダーゼを添加して発色させる。ペルオキシ
ダーゼをクエン酸緩衝液で維持する。発色は、１０分で
生じる。照射３０分前にフィルターの読み取りを行う。

添加する対照ヌクレオチドは、希釈強さで可視できなけ
ればならない。抗体標本における可視ヌクレオチドを定
量し、投与量光たりのヌクレオチド汚染を明確にする必
要がある。処理工程でのヌクレオチド汚染の減少も、こ
の手法で定量できる。

無菌性；抗体を、使用前に、、２２μｍフィルターを通
して無菌濾過する。濾過した物質ＯＡｍｌを、チオグリ
コレートブロス（ＧＩＢＣＤ）及びチョコレート寒天プ
レート上に配置し、３７℃でインキュベーション（ＣＤ
□富化大気中のチョコレートプレート）する。このプレ
ートと管の読み取りを、２４時間、４８時間及び７２時
間目に行う。

濾過した物質も、サボラウド（Ｓａｂｏｒａｕｄ）管（
ＧＩＢＣＯ）上に接種し、室温及び３５℃で、６週間イ
ンキュベーションして菌を成長させる。２４時間、３日
、５日及び週に一度試験する。

濾過した物質も、ヒト胎芽系〔パーチル（Ｂａｒｔｅｌ
）Ｗｌ−３８１及びサル腎培養系（パーチルＲＭＫ）に
接種してウィルス成長を評価する。腫瘍系の試料も、接
種して細胞変性効果を評価する。系を３５℃で維持する
。系を、７日、１４日、２１日、２８日口重こ、細胞変
性効果について試験する。「０」赤血球（クーパーバイ
オロジカル製）を細胞上に配置して接着性を評価する。

又、マイコプラスマ試験も行う。物質を、マイコトリム
ＲＳフラスコ（ハナバイオロジカルズ社製）に入れ、寒
天表面を、接種面に沿ってスクラッチする。このフラス
コを、寒天側を上にして３５℃でインキニベーションし
、毎日成長を観察する。７２２時間目、フラスコを再接
種し、更に７２時間成長を毎日観察する。

エンドトキシン汚染に関するリムルス溶解産物試験を行
う（シグマ社）。濾液Ｑ、１ｍ１を試験バイアルに注入
し、大腸菌エンドトキシンの入っている同時調製したバ
イアルと比較する。３７℃でインキニベーションして１
時間目に、濾液を、ノλ−ドゲル生成について試験する
。

全ての濾液を、ＥＬＩＳＡ（アボットラボラ）　ＩＪ−
ズ）を用いて、Ｂ型肝炎ウィルス及びヒト免疫不全につ
いて試験する。濾液を、発色団結合抗体と反応させ、光
学濃度を公知の対照と比較する。

全ての試験は、投与量バイアルを満たす前は陰性である
。タンパク質濃度を、ローリ−法（２８０ｎｍでの００
）で測定する。

実施例２ 成人脾臓細胞で感作したヒト神経繊維腫を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製したリンパ芽球細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマ（ＮＦＳ−８４Ｂ）は、分子１２２
１．０００のイディオタイプ表面抗原と反応するモノク
ローナルイディオタイプＩｇＭ抗体を分泌する。膵臓系
（ＡＳ−１５１）は、１９８８年９月１６日１ご、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ
）に寄託した（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ９Ｂ３３号）。リンパ
芽球融合系（ＢＭ　−９５）　は、１９８８年９月１６
日に、ＡＴ（１’ｃに寄託した（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ９８
３２号）。

又、ハイブリドーマは、１９８８年９月１６日に、ＡＴ
ＣＣに寄託した（ＡＴＣＣ第８８９８３号）。この系由
来の抗体は、１９８７年１０月２３日に、ＰＤＡに寄託
した。

実施例３ 胎児膵臓細胞で感作したヒト神経繊維腫を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製し、１９８８年９月１６日にＡＴＣＣ
に寄託（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ９８３５号）した胎児骨髄細
胞（ＢＧ−２３１）から成る。得られるハイブリドーマ
は、イディオタイプ表面抗原と反応するモノクローナル
ＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例４ 成人脾臓細胞で感作したヒト神経繊維腫を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製した胎児骨髄細胞（ＢＧ−２３１）を
含有する。得られるハイブリドーマは、イディオタイプ
表面抗原と反応するモノクローナルＩｇＧ抗体を分泌す
る。

実施例５ 胎児脾臓細胞で感作したヒト神経繊維腫を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製し、１９８８年９月１６日にＡＴＣＣ
に寄託（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ９８３２号）したリンパ芽球
様細胞（ＢＭ−９５）から成る。得られるハイブリドー
マは、イディオタイプ表面抗原と反応するモノクローナ
ルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例６ 成人脾臓細胞で感作したヒト神経繊維腫を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製し、１９８８年９月１６日にＡＴＣＣ
に寄託（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ９８３４号）したプラズマ細
胞（ＢＡ−１６０）から成る。得られるハイブリドーマ
は、イディオタイプ表面抗原と反応するモノクローナル
ＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例７ 胎児膵臓細胞で感作したヒト神経繊維腫を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製したブラズヤ細胞（ＢＡ−１６０）を
含有する。得られるハイブリドーマは、イディオタイプ
表面抗原と反応するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌す
る。

実施例８ 成人膵臓細胞で感作した肺腺癌細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得られ
るハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応す
るモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例９ 成人膵臓細胞で感作した肺腺癌細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られるハ
イブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応するモ
ノクローナルＩｇへ抗体を分泌する。

実施例１０ 成人膵臓細胞で感作した乳腺癌細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得られ
るハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応す
るモノクローナルｔｇＭ抗体を分泌する。

実施例１１ 成人膵臓細胞で感作した乳腺癌細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られるハ
イブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応するモ
ノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例１２ 成人膵臓細胞で感作した粘膜表皮癌細胞を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得
られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反
応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例１３ 成人膵臓細胞で感作した粘膜表皮癌細胞を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られ
るハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応す
るモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例１４ 成人膵臓細胞で感作した肝細胞癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例１５ 成人膵臓細胞で感作した肝細胞癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例１６ 成人膵臓細胞で感作した平滑筋肉腫細胞を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得
られるバイブリド、−マは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例１７ 成人脾臓細胞で感作した平滑筋肉腫細胞を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られ
るハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応す
るモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例１８ 成人脾臓細胞で感作した黒色腫細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得られ
るハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応す
るモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例１９ 成人脾臓細胞で感作した黒色腫細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られるハ
イブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応するモ
ノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例２０ 成人脾臓細胞で感作した結腸腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例２１ 胎児膵臓細胞で感作した結腸腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製した胎児骨髄細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＧ抗体を分泌する。

実施例２２ 成人脾臓細胞で感作した結腸腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製した胎児骨髄細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＧ抗体を分泌する。

実施例２３ 胎児膵臓細胞で感作した結腸腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例２４ 成人＃［細胞で感作した結腸腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例２５ 成人脾臓細胞で感作した舌扁平上皮癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。

得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例２６ 成人脾臓細胞で感作した舌扁平上皮癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例２７ 成人脾臓細胞で感作した膵臓腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナル１ｇＭ抗体を分泌する。

実施例２８ 成人膵臓細胞で感作した膵臓腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例２９ 成人脾臓細胞で感作した急性白血病リンパ芽球細胞を用
いて、実施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合
系は、実施例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含
有する。得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表
面抗原と反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する
。

実施例３０ 成人膵臓細胞で感作した急性白血病リンパ芽球細胞を用
いて、実施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合
系は、実施例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有す
る。得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗
原と反応するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例３１ 成人脾臓細胞で感作した菌状息肉腫細胞を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得
られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反
応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例３２ 成人脾臓細胞で感作した菌状息肉腫細胞を用いて、実施
例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施
例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られ
るハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応す
るモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例３３ 成人脾臓細胞で感作したえん麦細胞癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。

得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇ？Ｊ抗体を分泌する。

実施例３４ 成人膵臓細胞で感作したえん麦細胞癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例３５ 成人脾臓細胞で感作した前立腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例３６ 成人脾臓細胞で感作した前立腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
Ｉに準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例３７ 成人脾臓細胞で感作した食道扁平上皮細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。

得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例３８ 成人脾臓細胞で感作した食道扁平上皮細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１１．：準じて調製したプラズマ細胞を含有する。

得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例３９ 成人脾臓細胞で感作したユーイング癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。

得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例４０ 成人脾臓細胞で感作したユーイング癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例４１ 成人脾臓細胞で感作した両線癌細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得られ
るハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応す
るモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例４２ 成人脾臓細胞で感作した両線癌細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られるハ
イブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応するモ
ノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例４３ 成人脾臓細胞で感作した胆管腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例４４ 胎児脾臓細胞で感作した胆管腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製した胎児骨髄細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＧ抗体を分泌する。

実施例４５ 成人脾臓細胞で感作した胆管腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製した胎児骨髄細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＧ抗体を分泌する。

実施例４６ 胎児脾臓細胞で感作した胆管腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例４７ 成人脾臓細胞で感作した胆管腺癌細胞を用いて、実施例
１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例
１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られる
ハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応する
モノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例４８ 成人脾臓細胞で感作した卵巣粘液腺癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。

得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例４９ 成人脾臓細胞で感作した卵巣粘液腺癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例５０ 成人脾臓細胞で感作した卵巣粘液腺癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。

得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例５１ 成人膵臓細胞で感作した卵巣粘液腺癌細胞を用いて、実
施例１と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実
施例１に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得ら
れるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応
するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例５２ 成人脾臓細胞で感作したヒトリンパ腫由来のリンパ芽球
細胞を用いて、実施例１と概略同様の操作を繰り返す。

この融合系は、実施例１に準じて調製したリンパ芽球様
細胞を含有する。得られるハイブリドーマは、イディオ
タイプ表面抗原と反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を
分泌する。

実施例５３ 成人脾臓細胞で感作したヒトリンパ腫由来のリンパ芽球
細胞を用いて、実施例１と概略同様の操作を繰り返す。

この融合系は、実施例１に準じて調製したプラズマ細胞
を含有する。得られるハイブリドーマは、イディオタイ
プ表面抗原と反応するモノクローナルＩｇＡ抗体を分泌
する。

実施例５４ 成人脾臓細胞で感作した肺胞癌細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したリンパ芽球様細胞を含有する。

得られるハイブリドーマは、イディオタイプ表面抗原と
反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌する。

実施例５５ 成人脾臓細胞で感作した肺胞癌細胞を用いて、実施例１
と概略同様の操作を繰り返す。この融合系は、実施例１
に準じて調製したプラズマ細胞を含有する。得られるバ
イプリドーマは、イディオタイプ表面抗原と反応するモ
ノクローナルＩｇＡ抗体を分泌する。

実施例５６ 成人脾臓細胞で感作した肛門扁平上皮癌細胞を用いて、
実施例１と概略同様の操作を繰り返す。

この融合系は、実施例１に準じて調製したリンパ芽球様
細胞を含有する。得られるハイブリドーマは、イディオ
タイプ表面抗原と反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を
分泌する。

実施例５７ 成人膵臓細胞で感作したクリア芽細胞腫細胞を用いて、
実施例１と概略同様の操作を繰り返す。

この融合系は、実施例１に準じて調製したリンパ芽球様
細胞を含有する。得られるハイブリドーマは、イディオ
タイプ表面抗原と反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を
分泌する。

ムを固定してＭＲＬにおける利用を容易にしたり又はテ
クネチウム若しくはインジウムを固定して核医療スキャ
ンニングにおける利用を容易にすることによる診療様イ
メージング；腫瘍を局在化するための他の化合物のキャ
リア及び腫瘍の放射線治療法におけるキャリアとしても
使用することができる。

〔発明の効果〕

上記で説明したように、本発明によるヒト−ヒトハイブ
リドーマを製造する方法は、白血病及びリンパ腫だけで
なく、固形腫瘍の治療に有効な特異的抗・イディオタイ
プ抗体をコストの面から効果的に多量に製造することが
できる。又、本発明により製造された抗体は、モノクロ
ーナルであれポリクローナルであれ、種間ハイブリドー
マ由来のもの及びポリクローナル抗体により生じる免疫
反応を起こすことはなく、当該技術分野における長年の
要望を満たすものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ヒト腫瘍由来の細胞を含有する懸濁液を用意
   し、 （ｂ）前記細胞をヒト脾臓細胞と混合して懸濁液中の細
   胞を感作し、 （ｃ）前記感作されたヒト腫瘍細胞を、ヒト腫瘍細胞を
   感作するのに使用した脾臓細胞とは異なる細胞系由来の
   Ｂリンパ球と融合せしめ、 （ｄ）得られた融合細胞をスクリーニングして、特定の
   ヒト腫瘍抗原と反応性の抗体を産生する少なくとも一種
   のハイブリドーマを選択し、そして（ｅ）選択したハイ
   ブリドーマをクローニングする、 工程を包んで成るヒト−ヒトハイブリドーマの製造方法
   。 ２、腫瘍細胞の感作に使用する前記脾臓細胞が、ヒト胎
   児から得られたものである請求項１に記載の方法。 ３、腫瘍細胞の感作に使用する前記脾臓細胞が、（１）
   トランスファー因子、（２）マイトジェン又は（３）リ
   ンホカインで刺激した成人ヒト脾臓から得られたもので
   ある請求項１に記載の方法。 ４、前記成人ヒト脾臓細胞が、フィトヘムアグルチニン
   （ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）又はイン
   ターロイキン−２（ＩＬ２）で刺激される請求項３に記
   載の方法。 ５、Ｂリンパ球の融合系が、胎児骨髄系、ヒトリンパ芽
   球細胞系又はヒトプラズマ細胞由来のものである請求項
   １に記載の方法。 ６、単一種類の免疫グロブリンを産生する融合系の単ク
   ローンを選択する請求項１に記載の方法。 ７、請求項２、３、４、５及び６に記載の方法により製
   造したハイブリドーマ。 ８、前記ヒト腫瘍細胞が、結腸腺癌細胞、肺腺癌細胞、
   乳腺癌細胞、粘膜表皮癌細胞、肝細胞癌細胞、平滑筋肉
   腫細胞、黒色腫細胞、神経繊維肉腫細胞、舌扁平上皮癌
   細胞、膵臓腺癌細胞、リンパ芽球（急性白血病）細胞、
   菌状息肉腫細胞、えん麦細胞癌細胞、前立腺癌細胞、食
   道扁平上皮癌細胞、ユーイング細胞、胃腺癌細胞、胆管
   腺癌細胞、卵巣腺癌（粘液性）細胞、卵巣腺癌（漿液）
   細胞、リンパ芽球（リンパ腫）細胞、肺胞細胞癌細胞、
   肛門の扁平上皮癌細胞又はクリア芽細胞腫細胞である請
   求項１に記載の方法。 ９、請求項７に記載の方法により製造したハイブリドー
   マを前記各癌細胞とともに培地で培養し、前記培地から
   前記抗体を回収する、請求項８に記載の各癌細胞のモノ
   クローナル抗体の製造方法。 １０、請求項９に記載の方法により製造したモノクロー
   ナル抗体。 １１、ヒト胎児骨髄又はリンパ芽球細胞から抗体産生細
   胞を調製し、 前記抗体産生細胞をヒト腫瘍細胞と融合してハイブリド
   ーマを製造し、 前記ハイブリドーマの中から、一種類の免疫グロブリン
   とのみ反応性のある抗体を産生するハイブリドーマを選
   択し、そして 前記選択したハイブリドーマをクローン的に細胞系とす
   る、 工程を包んで成る特異的癌に対するモノクローナル抗体
   を産生する連続細胞系の製造方法。 １２、特許請求の範囲第１１項に記載の方法により製造
   した連続細胞系。 １３、治療中の腫瘍に対してイデオタイプであるモノク
   ローナル抗体の効果的な量を投与することによる、ヒト
   腫瘍細胞の治療方法。