NL9401535A - Uit serum bereid eiwitmengsel voor het gebruik als component in media voor het in vitro kweken van dierlijke cellen. - Google Patents

Description

Uit serum bereid eiwitmengsel voor het gebruik als component in media voor het in vitro kweken van dierlijke cellen.

De uitvinding heeft betrekking op het gebied van de celkweek van dierlijke cellen.

Geïmmortaliseerde dierlijke celculturen ofwel cellijnen worden in toenemende mate gebruikt voor het produceren van bepaalde biologische produkten, bijvoorbeeld eiwitten. Meer in het bijzonder worden deze cellen toegepast in de bereiding van vaccins of hormonen. Met name worden cellen van zoogdieren, vogels en insekten voor verschillende doeleinden gebruikt.

Voorbeelden van veel toegepaste cellijnen zijn: a. BHK-cellen (baby hamster kidney); Vero-cellen (cellen afkomstig uit de nieren van een Afrikaanse groene aap) en MDCK-cellen (cellen afkomstig uit de nieren van een hond): voor vaccinbereiding. Daartoe worden deze cellen geïnfecteerd met een virus, waartegen het vaccin gericht moet zijn.

b. CHO-cellen (Chinese hamster ovarium): voor o.a. bereiding van hormonen en eiwitten die bijvoorbeeld in de diagnostiek en voor onderzoeksdoeleinden worden toegepast.

Meer in het bijzonder worden recombinant-DNA-eiwitprodukten bereid uit dergelijke CHO-cellen die zijn getransfecteerd met een vector die een bepaald gen bevat.

c. Hybridoma's. Dit zijn somatische celhybriden die zijn gemaakt door b.v. een SP2/0-Ag of P3X63-Ag muizen-myelomacellijn te fuseren met B-lymfocyten van geïmmuniseerde knaagdieren, zoals BALB/c-muizen. Zij worden toegepast in de produktie van monoclonale antilichamen; zowel als passieve vaccins, voor diagnóstische en onderzoeksdoeleinden en voor medicijn-"targetting".

Voorts worden cellen die doorgaans niet getransformeerd zijn voor medische doeleinden gekweekt. Deze cellen worden geënt op een substraat, onder andere voor wondheling of voor het aanbrengen van protheses.

Over het algemeen worden dierlijke cellen gekweekt in rolflessen, in geroerd-vat-bioreactoren, waarbij men de cellen eventueel op microdragers kan laten groeien, of in holle-vezel-bioreactoren.

Voor de cel- en eiwitproduktie zijn de celculturen sterk afhankelijk van de samenstelling van het kweekmedium. Het meest eenvoudige en tevens meest gebruikte kweekmedium bestaat voor 80-95% uit een oplossing die essentiële bestanddelen voor celgroei bevat. Deze oplossing wordt in de regel als minimaal essentieel medium (MEM) aangeduid. MEM, dat zoals de deskundige weet voor ieder te kweken celtype kan verschillen, bevat onder andere enkele essentiële aminozuren, vetzuren, koolhydraten, vitaminen en sporeëlementen. Het is gebufferd op een pH van ongeveer 7, en heeft een osmotische druk van ongeveer 250 mosm/kg H2O.

Uit onder andere Hodgson, Bio/Technology 2. (1991), 1320 en Hodgson, Bio/Technology UL. (1993) , 49 is bekend dat cel- en eiwitprodukties worden bereikt die zeer moeilijk te evenaren zijn, wanneer aan MEM 5-20% foetaal runderserum (FBS; Fetal Bovine Serum) wordt toegevoegd.

Indien het door de cellen geproduceerde eiwit wordt uitgescheiden - hetgeen de voorkeur verdient - moeten aan de zuiveringsprocedure van het eiwit hoge eisen worden gesteld. Dit is noodzakelijk in verband met het voorkomen van een immuunrespons van het organisme dat het door de cellen geproduceerde eiwitpreparaat krijgt toegediend. Daarnaast is de samenstelling van FBS variabel, waardoor de snelheid van de celproliferatie en de eiwitsynthese aanzienlijk kan variëren tussen verschillende serumbatches. Ten derde is er een kans op infectie van de bloedserumdonoren met microörganismen waardoor het uiteindelijk geproduceerde eiwitprodukt niet altijd pyrogeenvrij is. Tenslotte is foetaal runderserum zelf vanwege de geringe beschikbaarheid duur.

Hoewel een kweekmedium dat FBS bevat, een hoog eiwitgehalte (2 tot 9 g/1) en een zeer diverse samenstelling heeft, geven cellen gekweekt in alternatieve media zelden een cel- en eiwitproduktie die de produktie in een FBS-houdend medium kan evenaren. Ondanks de geschetste nadelen zullen de zeer hoge opbrengsten aan cellen en celprodukten in een medium dat FBS bevat vaak de balans naar het toepassen van dit medium laten doorslaan.

Overigens zijn alternatieve media waarin FBS is vervangen door een gedefinieerd mengsel van synthetische componenten, eventueel in combinatie met een mengsel van bepaalde gezuiverde eiwitten, evenals FBS zeer duur. Dergelijke alternatieve media kunnen slechts voor bepaalde cellijnen concurreren met FBS media. In dit verband wordt verwezen naar Methods for Serum-Free Culture of Epithelial and Fibroblastic Cells; serie: Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology, ed. D.W. Barnes, D.A. Sibarsku and G.H. Sato (1984) Alan R. Liss Inc., New York.

Er is derhalve behoefte aan ofwel een medium waarmee een hogere opbrengst aan cellen en/of produkten van de gekweekte cellen kan worden verkregen ofwel een medium dat aanzienlijk goedkoper is.

Een mogelijkheid die zich meteen lijkt aan te dienen om een aanzienlijk goedkoper medium te bereiden is het vervangen van FBS door een veel goedkoper serum van postnatale donoren. Toevoeging van alternatief serum aan een kweekmedium heeft uiteraard wel dezelfde genoemde nadelen als FBS. Er is evenwel gevonden, zie bijvoorbeeld P.J. Price, E.A. Gregory, In Vitro, 18 (1982) 576, dat een kweekmedium dat FBS bevat over het algemeen een hogere celgroei geeft dan een medium dat in plaats van FBS ander serum, zoals serum van pasgeboren of volwassen donoren, bevat. Daarnaast is in de regel het eiwitgehalte van pdstnataal serum nog hoger dan dat van FBS. Een en ander maakt de toepassing van postnatale sera in veel gevallen ongeschikt.

Meer in het bijzonder wordt onderzoek naar het effect van eiwitmengsels op de celkweek in MEM voornamelijk uitgevoerd met BHK21-cellen die in een monolaag op "Tissue Culture Polystyrene” (TCPS) worden gekweekt. Deze cellen worden in de onderzoeken betrokken, omdat ze, naast Vero-cellijnen, vaak worden aangewend om op grote schaal viruspreparaten te maken. Uit eigen bevindingen is gebleken dat BHK21-cellen in MEM een veel lagere cel- en eiwitproduktie geven als in plaats van FBS volwassen runderserum (ABS; adult bovine serum) aan het medium wordt toegevoegd.

Volgens de uitvinding is thans verrassenderwijs gevonden dat, wanneer een uit serum bereid eiwitmengsel dat behandeld is met een bepaald adsorptiemiddel, wordt toegevoegd aan een minimaal essentieel medium, een kweekmedium voor dierlijke cellen wordt verkregen, waarbij zowel de proliferatie van cellen als de produktie van eiwitten toenemen in vergelijking met een MEM waaraan een even grote hoeveelheid onbehandeld serum is toegevoegd.

Derhalve heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een uit serum bereid eiwitmengsel verkrijgbaar door serum of een uit serum verkregen eiwitmengsel te behandelen met een adsorptiemiddel, dat bestaat uit deeltjes met een hydrofobe kern en ten minste een gedeeltelijk hydrofiel buitenoppervlak, in een zodanige hoeveelheid dat wanneer het eiwitmengsel aan een minimaal essentieel medium voor dierlijke cellen wordt toegevoegd een verhoogde proliferatie van de cellen en een verhoogde eiwitproduktie door die cellen wordt verkregen.

Bij voorkeur wordt het eiwitmengsel volgens de uitvinding verkregen door toepassing van een adsorptiemiddel bestaande uit deeltjes met een polysiliciumoxide-kern.

Een polysiliciumoxidedeeltje, dat op zich hydrofoob is, moet om een eiwitmengsel volgens de uitvinding te kunnen verschaffen voorzien zijn van een ten minste gedeeltelijk hydrofiel buitenoppervlak. Bij voorkeur wordt een adsorptiemiddel toegepast bestaande uit deeltjes met silanolgroepen aan het buitenoppervlak.

Het is noodzakelijk dat de adsorptiemiddelen die kunnen worden toegepast om een eiwitmengsel volgens de uitvinding te creëren, zowel met een hydrofiel als hydrofoob gedeelte interacteren met het serum of een uit serum verkregen eiwitmengsel. Een dergelijk adsorptiemiddel moet ofwel uit (macro-)poreuze hydrofobe deeltjes bestaan waarvan alleen het buitenoppervlak en niet de gehele porieoppervlakken voorzien zijn van een hydrofiele laag, ofwel uit deeltjes waarbij naast hydrofiele oppervlakgroepen ook hydrofobe oppervlakgroepen aanwezig zijn.

Zeer goede resultaten worden verkregen onder toepassing van een eiwitmengsel volgens de uitvinding waarbij een adsorptiemiddel wordt toegepast gekozen uit Aerosil® (Degussa AG, Frankfurt, Duitsland) en Bio-Sil C8® (BioRad Laboratories, Nazareth, België).

Overigens is bekend dat serum gedelipideerd kan worden onder toepassing van adsorptiemiddelen op basis van siliciumoxiden. Zo wordt delipidering van serum vaak toegepast om (1) lipid-vrije sera te bereiden ten behoeve van experimenten betreffende het lipidenmetabolisme; (2) zogenaamde referentiesera te bereiden, dat wil zeggen helder gemaakte sera die kunnen worden gebruikt voor kwaliteitscontrole en als secundaire calibratiestandaards (zie bijvoorbeeld Agnese et al., Clin. Biochem. ü (1983), 98-100); en (3) een meer of minder zuiver lipiden- of lipoproteïnenpreparaat te bereiden (zie bijvoorbeeld EP-A1-0 048 209).

De behandeling van serum volgens de uitvinding met als doel de geschiktheid ervan te verbeteren als component in een kweekmedium wordt echter niet geopenbaard of gesuggereerd in de stand der techniek. Bovendien zal uit het onderstaande duidelijk blijken dat een medium met serum, waarin het lipidgehalte sterk is gereduceerd, juist de celproliferatie en eiwitsynthese verlaagt in vergelijking met een medium met onbehandeld serum.

Zo beschrijven Stephan en Róka in Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. 6. Jahrg. 1968, pagina 186 e.v dat door humaan serum te behandelen met 2 gew.% Aerosil betrokken op het serum alle lipoproteïnen worden verwijderd. Wanneer serum met een zo grote hoeveelheid Aerosil (20 g/1 serum) wordt behandeld, blijken dierlijke cellen niet meer in een medium waaraan het aldus behandelde serum is toegevoegd te groeien.

De invloed van de toevoeging van serum dat met een van beschreven methoden is behandeld, op een celkweek is sterk afhankelijk van het materiaal dat voor de delipidering wordt gebruikt en de verhouding tussen de massa van dit materiaal en het volume van het te behandelen serum. Zoals uit het onderstaande zal blijken, is de hoeveelheid van een bepaald adsorptiemiddel die wordt toegevoegd aan een hoeveelheid serum of een uit serum bereid eiwitmengsel bepalend voor de kwaliteit van het na behandeling verkregen eiwitmengsel. Waarschijnlijk stelt zich tijdens de behandeling een evenwicht in waarbij in het bijzonder voor de celkweek schadelijke stoffen aan het adsorptiemiddel binden. Wanneer teveel adsorptiemiddel aanwezig is worden kennelijk ook essentiële of nuttige stoffen, bijvoorbeeld groeifactoren die in het serum aanwezig zijn, weggevangen. De duur van de behandeling is in principe niet essentieel. Het is slechts noodzakelijk dat het invangen van voor de celkweek schadelijke stoffen kan plaatsvinden. In de regel stelt het genoemde evenwicht tussen adsorptiemiddel en te verwijderen verbindingen zich binnen ongeveer 15 minuten in. Door het serum of het uit serum bereide eiwitmengsel ten minste 1 uur met het adsorptiemiddel in aanraking te laten, wordt gegarandeerd dat in essentie de voor celkweek nadelige stoffen worden weggevangen.

Daarnaast heeft ook het te kweken type dierlijke cellen een invloed. Een serum dat met bijvoorbeeld een bepaalde hoeveelheid Aerosil is behandeld, is mogelijk zeer geschikt voor de kweek van CHO-Kl-cellen, doch heeft daarentegen (nog) een negatief effect op de kweek van BHK21-cellen in vergelijking met onbehandeld serum.

Voorts is gevonden, dat per batch serum of uit serum bereid eiwitmengsel de hoeveelheid toe te passen adsorptie- middel kan verschillen, die nodig is om een eiwitmengsel te verkrijgen met de volgens de uitvinding beoogde voordelen.

Een en ander maakt het noodzakelijk dat een deskundige proefondervindelijk moet vaststellen hoeveel gram van een bepaald adsorptiemiddel hij moet toevoegen aan een bepaald serum.

De vereiste verhouding tussen de massa Aerosyl 300 en het volume van het FBS- of ABS-serum tijdens de behandeling voor een zo groot mogelijke celproliferatie en eiwitsynthese is afhankelijk van de celcultuur waarvoor het partieel gedelipideerde serum wordt gebruikt. Over het algemeen zal 0,5 tot 5 g Aerosyl 300 per liter FBS- of ABS-serum moeten worden gebruikt.

Het is niet bekend welke stoffen uit het serum of uit het uit serum bereide eiwitmengsel moeten worden verwijderd om een toeslagstof voor minimaal essentieel medium te verkrijgen die leidt tot een verhoogde celproliferatie en een verhoogde eiwitproduktie.

Bij enkele in de stand der techniek geteste celkweken is een correlatie tussen de lipidconcentratie in FBS en de celadhesie en/of de celproliferatie gevonden. Hierbij wordt verwezen naar H. Rigg, P. Knox, Biochem. Soc. Trans., lü (1988) 560;.C.W. Boone et al., In Vitro, 2 (1972) 174; en C.

De Luca, et al., Exp. Cell. Res., 42 (1966) 451. Naarmate de lipidconcentratie in FBS hoger is, blijken de celadhesie en/of de celproliferatie af te nemen.

Lipiden zijn in verschillende vormen aanwezig in serum: als triglyceriden (TGC) in very low density lipoproteinen (VLDL) en chylomicronen; als fosfolipiden (PL) in high density lipoproteirien (HDL) ; als cholesterol (ne-CH) in HDL; als veresterd cholesterol (e-CH) in low density lipoproteinen (LDL) en als niet-veresterde vetzuren (NEFA), die worden getransporteerd door albumine. Het lipidgehalte en de samenstelling ervan in serum wisselen sterk. De concentraties van de verschillende lipidvormen zijn sterk afhankelijk van het dieet van de donoren, vooral vlak voor donatie van het bloed, waaruit het serum wordt bereid.

R.G. Ham concludeert in Tissue Growth Factors, Editor R. Baserga, Springer Verlag, Heidelberg, New York, 1982, hoofdstuk 2, pagina 13 dat met name vrije vetzuren toxisch lijken te zijn voor cellen, hetgeen mogelijk bijdraagt aan de genoemde correlatie.

In dezelfde publicatie stelt Ham dat, hoewel alle lipiden de novo kunnen worden gesynthetiseerd door gekweekte cellen, de aanwezigheid van lipiden in het kweekmedium tot een veel snellere celproliferatie leidt.

Uit een en ander lijkt te kunnen worden afgeleid dat de onderhavige uitvinding niet meer is dan een gedeeltelijke delipidatie van een serum, waarbij eventueel aanwezige overtollige, voor dierlijke cellen toxische lipiden worden verwijderd.

Er is evenwel aangetoond dat alleen uit sera bereide eiwitmengsels die volgens de uitvinding verkrijgbaar zijn door serum of een uit serum verkregen eiwitmengsel te behandelen met een adsorptiemiddel dat bestaat uit deeltjes met een hydrofobe kern en ten minste een gedeeltelijk hydrofiel buitenoppervlak, de voornoemde voordelige eigenschappen bezitten.

Voor de verwijdering van de lipiden uit serum zijn verschillende methoden bekend. Uit proeven is echter gebleken, dat serum dat al dan niet gedeeltelijk is gedelipideerd met dextraansulfaat, Sephadex en Perlite niet tot zowel een verhoogde celproliferatie als een verhoogde eiwitproduktie leidt, wanneer het aan MEM wordt toegevoegd. Meer in het bijzonder remt ABS 'dat gedeeltelijk gedelipideerd is door middel van suspensieïncubatie met 0,1-2,5 g/1 dextraansulfaat (Mr=5-105) de celproliferatie van BHK21-cellen nagenoeg volledig. Suspensieïncubaties van ABS en FBS met Sephadex G50 (Pharmacia), het filterhulpmiddel Perlite U128 (gefuseerd Na/K/Al-silicaat afkomstig van Dicalite, Grefco) en hydroxy- apatiet (Bio-Rad) hebben geen effect op de celproliferatie van BHK21-cellen.

Slechts een uit serum verkregen eiwitmengsel behandeld met een proefondervindelijk te bepalen hoeveelheid adsorptiemiddel volgens de uitvinding, geeft na toevoeging aan MEM een verhoogde cel- en eiwitproduktie. Wanneer de behandeling van het serum met een te grote hoeveelheid adsorptiemiddel wordt uitgevoerd, treedt, zoals onderstaand nader zal worden toegelicht, een verlaging van de cel- en eiwitproduktie op.

Het uit serum bereide eiwitmengsel kan afkomstig zijn van zoogdieren zoals mensen (HuS); paarden (HS); runderen (BS); varkens (PS) en knaagdieren. Deze sera zijn afhankelijk van de te kweken cellen meer of minder geschikt als component in een kweekmedium. Van deze sera is foetaal runderserum (FBS) het meest universeel toepasbaar als component in een kweekmedium. ABS en PS en in mindere mate HS zijn evenwel in veel grotere hoeveelheden verkrijgbaar en derhalve veel goedkoper dan FBS. Humaan serum komt nagenoeg volledig ten goede aan direkte medische toepassingen en zal om deze reden niet snel in aanmerking komen als toeslagstof voor kweekmedia voor cellijnen.

Als voorbeeld van uit serum bereide eiwitmengsels die volgens de uitvinding kunnen worden toegepast kan worden genoemd een ABS-serum, waaruit de inunuunglobulines zijn verwijderd. Verwijdering van immuunglobulines kan worden uitgevoerd door adsorptie gebaseerd op elektrondonor/-acceptor (EDA) interactie.

Bij voorkeur wordt volgens de uitvinding een eiwitmengsel verkregen uit foetaal of volwassen runderserum aan MEM toegevoegd.

Voorts heeft de uitvinding betrekking op de toepassing van het boven beschreven uit serum bereide eiwitmengsel in een kweekmedium voor dierlijke cellijnen.

Tenslotte betreft de uitvinding een werkwijze voor het verhogen van de proliferatie van cellen en de eiwitproduktie in een kweek van dierlijke cellen, waarbij het bovenbeschreven uit serum bereide eiwitmengsel wordt toegevoegd aan een voor de kweek van de genoemde cellen geschikt minimaal essentieel medium.

Thans zal de uitvinding aan de hand van de figuren en de onderstaande voorbeelden nader worden toegelicht.

In fig. la en b worden de resultaten getoond van de verwijdering van de hiervoor nader opgesplitste soorten lipiden uit een batch foetaal runderserum (FBS) en volwassen runderserum (ABS) als functie van de hoeveelheid Aerosyl 300 betrokken op het volume van het serum tijdens de behandeling.

Fig. 2 toont de produktie van BHK21-cellen en van 3H-leucine-pulsincorporatie na 7 dagen in kweek op TCPS in MEM met 10 % (v/v) FBS of ABS (serumbatch als fig. 1). In de grafiek wordt de cel- en eiwitproduktie uitgedrukt in waarden gerelateerd aan de produktie in MEM met 10 % (v/v) onbehandeld ABS gegeven als functie van de hoeveelheid Aerosyl 300 betrokken op het volume van het serum tijdens de voorbehandeling (condities als fig. 1) .

In fig. 3 wordt de produktie van BHK21-cellen en de 3H-leucine-pulsincorporatie na 3 en 7 dagen in kweek in MEM met 10 % (v/v) FBS en ABS, al dan niet vooraf geïncubeerd met 2,5 g/1 Aerosyl 300, inzichtelijk gemaakt(condities als fig.1).

Fig. 4 toont de produktie van CHO-2-cellen en 3H-leucine pulsincorporatie na resp. 7 en 8 dagen in kweek in MEM met 10 vol.% FBS of ABS als functie van de hoeveelheid Aerosyl 300 betrokken op het volume van het serum tijdens de voorbehandeling (serumbatches en condities als fig. 1). Wederom zijn de waarden gerelateerd aan de produktie in MEM met 10 % (v/v) onbehandeld ABS.

In fig. 5 wordt de produktie van hybridomacellen in suspensie in MEM met 10 % (v/v) FBS (HyClone Laboratories Inc., Logan, Utah, USA) als functie van de hoeveelheid Aerosyl 300, betrokken op het volume van het serum, tijdens de voorbehandeling getoond (condities als fig. 1).

Fig. 6a toont de verwijdering van de lipiden uit een batch volwassen-runderserum (ABS) als functie van de hoeveelheid Bio-Sil C8 betrokken op het volume van het serum tijdens de behandeling. Fig 6b vergelijkt het lipidgehalte in ABS na behandeling met 4 g Bio-Sil C8 per liter serum met het lipidgehalte in onbehandeld ABS, dat in ABS na behandeling met 2,5 g Aerosyl 300 per liter serum en dat in onbehandeld FBS.

Tenslotte toont fig. 7 de produktie van BHK21-cellen en 3H-leucine pulsincorporatie na resp. 4 en 3 dagen in kweek op TCPS in MEM met 5 % (v/v) ABS als functie van de hoeveelheid Bio-Sil C8 betrokken op het volume van het serum tijdens de voorbehandeling (serumbatch en condities als fig. 6) . De uitgezette waarden zijn gerelateerd aan de produktie in MEM met 5 % (v/v) onbehandeld ABS.

De behandeling van serum of uit serum verkregen eiwitmengsel wordt bij voorkeur uitgevoerd met kleine, al dan niet bolvormige deeltjes ten einde het serum aan een zo groot mogelijk adsorberend oppervlak per serumvolume en per massa adsorptiemiddel te kunnen bloot stellen. De deeltjes die volgens de uitvinding als adsorptiemiddel kunnen worden toegepast, kunnen uit ieder hydrofoob materiaal met een hydrofiel oppervlak zijn gevormd.

In het bijzonder zijn de volgende materialen geschikt voor de beoogde behandeling van serum: - Polymeren of andere dragermaterialen met een hydrofiel oppervlak en hydrofobe liganden; bijvoorbeeld hydrofiele silicageldeeltjes (M) waaraan alifatische liganden, zoals M- (CH2)n-CHa-groepen zijn gekoppeld.

- Deeltjes, bestaande uit een matrix met de structuur [Si02]n met vrije Silanolgroepen aan het oppervlak en met een afmeting groter dan 5 nm. Hoewel het adsorptiemiddel een (macroporeuze) gel kan zijn, gaat de voorkeur uit naar colloidale deeltjes met een doorsnede van ongeveer 5-10 nm, zoals bijvoorbeeld Aerosyl 300 of 380 van Degussa A.G. (Frankfurt, Duitsland) of andere deeltjes uit gerookt silica met een hydrofiel oppervlak. Deze deeltjes kunnen worden gesteriliseerd (bv. 2 uur bij 180‘C) en kunnen na een korte suspensieïncubatie met serum (b.v. gedurende 1 uur) uit het behandelde serum worden verwijderd door middel van centrifugering (b.v. 30 min. bij 3000 g).

Andere geschikte materialen zijn gebaseerd op deeltjes uit gerookt silica of aluminadeeltjes met een hydrofiel gemaakt oppervlak of meer of minder gezuiverde diatomeeën-aarde.

Zoals reeds opgemerkt, moet de verhouding tussen de massa van het adsorptiemiddel en het serumvolume of de droge massa van het serum zo worden bepaald, dat een maximale stimulatie van de celproliferatie en/of eiwitsynthese door het serum wordt verkregen, indien het wordt toegevoegd aan het kweekmedium. Deze verhouding is afhankelijk van de volgende variabelen: 1. De bron en de samenstelling van het serum, omdat niet alle componenten die een bepaalde mate van affiniteit voor het adsorptiemiddel bezitten, in alle sera in dezelfde concentatie en in dezelfde onderlinge verhouding aanwezig zijn.

2. De aard van de verwijderingsmethode, met name van het gebruikte adsorptiemiddel, omdat door de verschillende verwijderingsmethoden mogelijk ook, en in verschillende mate, groeibevorderende componenten worden verwijderd uit serum.

3. De celcultuur die gekweekt wordt in het medium met het aldus behandelde serum, omdat niet iedere celcultuur dezelfde gevoeligheid heeft voor de samenstelling van het serum in het kweekmedium.

De genoemde materialen kunnen met serum in suspensie worden geïncubeerd.' Al deze materialen moeten na de incubatie met het serum eenvoudig kunnen worden verwijderd, zonder dat daarbij de kwaliteit van het serum wordt beïnvloed. Zo kunnen deze adsorptiemiddelen in de vorm van beads in een kolom worden gepakt voor een kolomsgewijze behandeling van serum.

Ook kan het adsorptiemiddel worden ingebed in een drager-materiaal, zodat ook adsorptie door middel van filtratie kan worden uitgevoerd. De voorkeur wordt echter gegeven aan een werkwijze waarbij het adsorptiemiddel aan het serum of het uit serum bereide eiwitmengsel wordt toegevoegd en later door centrifugatie wordt verwijderd.

YQQrbseldJL

Incubatie van Aerosyl 300 met foetaal of volwassen runderserum.

Volwassen runderserum (ABS) en foetaal runderserum (FBS) zijn afkomstig van Sera-Lab (Crawley Down, Groot-Brittannië); Aerosyl 300 is afkomstig van Degussa (Frankfurt, Duitsland) . Disposable centrifugebuizen en microtiterplaten zijn afkomstig van Greiner (Alphen a/d Rijn, Nederland). Disposable filters (0,2 μπι) zijn afkomstig van Gelman Sciences (Ann Arbor, Michigan, USA). Enzymatische kleurtests voor de bepaling van de concentratie van triglyceriden (TGC); vrij en totaal cholesterol (resp. ne-CH en (e- + ne-CH)) en calibratie-concentraties TGC en CH zijn afkomstig van Boehringer Mannheim (Mannheim, Duitsland). Enzymatische kleurtests voor de bepaling van fosfolipiden (PL) en niet-veresterde vetzuren (NEFA) met de bijbehorende standaarden zijn afkomstig van Wako Chemicals (Neuss, Duitsland).

Afgewogen hoeveelheden Aerosyl 300 werden in glazen potjes minimaal 2 uur geïncubeerd bij 120 tot 180'C in een stoof. De Aerosyl werd steriel aan serum in een centrifugebuis toegevoegd en gesuspendeerd en gedurende 2 uur in suspensie geïncubeerd bij 20 tot 25 *C. Na een uur werd de suspensie gecentrifugeerd (3000g, 30 min.) en het supernatant gefiltreerd m.b.v. een 0,2 μπι filter en eventueel ingevroren (Si -20*C) voor verder gebruik.

De enzymatische tests werden uitgevoerd onder toepassing van microtiterplaten met onverdund serum (25 μΐ voor TGC; 10 μΐ voor ne-CH; 5 μΐ voor PL; NEFA en totaal CH) en 250 μΐ reagens. De extinctie (495 nm) werd gemeten met behulp van een Elisa Micro Reader (Organon Teknika, Turnhout, België).

Onder verwijzing naar figuur 1 bleek het lipidgehalte in onbehandeld ABS meer dan twee maal zo hoog als in FBS. Alleen de TGC-concentratie lag in FBS hoger dan in ABS. Op de TGC-concentratie na, nam de lipidconcentratie af met een toenemende verhouding tussen Aerosyl en serum tijdens de incubatie.

Voorbeeld 2

Gebruik van met een adsorptiemiddel behandeld serum voor het kweken van BHK21-cellen.

EMEM (minimal essential medium Eagle(modified) with earle's salts) met HEPES-buffer, EMEM met carbonaat-buffer, tryptose-fosfaat bouillon; glutamine, penicilline/streptomycine, Fungizon (amphotericine B), trypsine/EDTA zijn afkomstig van ICN-Flow (ICN-Biomedicals, Zoetermeer, Nederland). FBS en ABS zijn afkomstig van Sera-Lab (Crawley-Down, Groot-Brittannië). Disposable kweekflessen en kweekschaaltjes (TCPS), pipetten, flessen en Biofreeze vials zijn afkomstig van Costar Europe (Badhoevedorp, Nederland). Disposable reageerbuizen (PP) zijn afkomstig van Greiner (Alphen a/d Rijn, Nederland). Disposable filters (0,2 μπ\) zijn afkomstig van Gelman Sciences (Ann Harbor, Michigan, USA).

DMSO (dimethyl sulfonoxide) (analytical grade), TCA (trichloorazijnzuur) en NaOH zijn afkomstig van Merck Schuchardt (Hohenbrunn, Duitsland). PBS (fosfaat gebufferde fysiologisch zout-oplossing) en fysiologische zout-oplossing zijn afkomstig van NPBI (Amstelveen, Nederland). Baso-dilute is afkomstig van Technicon (Technicon Instruments, Tarrytown, New York, USA). L-[4,5-3H]-Leucine (specifieke activiteit: 120 - 190 Ci/mmol, 5 Ci/1) is afkomstig van Amersham International (Buckinghamshire, Groot-Brittannië). Telpotjes (Pony Vial H/I) zijn afkomstig van Packard Canberra Company (Packard Instrument, Groningen, Nederland). Atomlight scintillatievloeistof is afkomstig van Du Pont de Nemours (Hamburg, Duitsland).

Kweken van BHK21-cellen:

De oorspronkelijke BHK21-cellijn werd, in een dichtheid van 109 tot 1010 cellen per liter EMEM met 10 mM HEPES en 1 g/1 carbonaatbuffer met 7 % (v/v) DMSO en met 25 % (v/v) FBS, bewaard in vloeibare stikstof en hoogstens 2 maal doorgekweekt voor hernieuwde opslag. De cellen werden in kweek gebracht na snel ontdooien bij 37‘C en vervanging van het vriesmedium door kweekmedium. Minimaal essentieel medium voor BHK21-cellen (verder genoemd MEM) bestaat uit EMEM met 10 mM HEPES en 1 g/1 carbonaatbuffer; 2 mM glutamine en 0,15 % (v/v) tryptose-fosfaat bouillon, met als antibiotica 105 IU/1 penicilline; 0,1 g/1 streptomycine en 2,5 mg/1 amphoterycine B. Spoelen van de cellen vond plaats met PBS. Cellen werden gekweekt op TCPS in MEM met 10 % (v/v) FBS (37*C; 5 % CO2; > 80 % rel.H). De cellen werden in een dichtheid van 4-107 cellen per liter geënt (6Ί03 cellen per cm2) . Het kweekmedium werd na 1 dag en na 4 dagen ververst. Na 7 dagen werden de cellen getrypsineerd (0,5 g/1 trypsine; 0,2 g/1 EDTA) en gesuspendeerd in MEM met 10 % (v/v) FBS of ABS. De cellen in MEM met FBS werden na centrifugering (600 g, 8 min.) in dezelfde dichtheid in MEM met 10 % FBS opnieuw geënt (een passage). De cellen werden maximaal 6 passages gekweekt.

Testen van serum na behandeling met Aerosyl 300:

Na minimaal 1 passage in kweek en na trypsinering, suspendering en centrifugering werden de cellen opgenomen in MEM. De cellen werden geënt op TCPS in MEM met een bepaalde volumefractie te testen serum in een dichtheid van 2,5-107 cellen per liter (5-103 cellen per cm2, telling m.b.v. een hemocytometerkamer) . Het medium werd na 1 dag en na 4 dagen ververst. Het relat'ief aantal cellen werd iedere dag geteld om een proliferatiecurve te maken. Hierbij werden de cellen gelyseerd in Baso-dilute,waarna het relatieve aantal kernen werd bepaald door middel van een gecalibreerde licht-verstrooiingsmeting met een flow cytometer.

Voor de eiwitsynthese-test (3H-Leucine-incorporatie) werd 3 uur voor de meting het kweekmedium ververst en werd 5 μΐ 3H-Leucine-oplossing in fysiologisch zout (100 mCi per 1) per ml medium toegevoegd (0,5 mCi per 1). Na 60 min. werden de cellen met ijskoude PBS gespoeld en werd eiwit geprecipiteerd met ijskoude TCA (10 % (m/v) in water) . Na verwijdering van TCA werden de cellen opgelost in 0,1 M NaOH. De relatieve incorporatie van 3H-Leucine, die recht-evenredig is met de eiwitsynthese per tijdseenheid, werd bepaald door middel van P(dpm)-scintillatietelling (Wallac 1410 Liquid scintillation counter, Pharmacia, Turku 10, Finland).

In figuur 2 zijn zowel voor ABS en FBS behandeld met Aerosil 300 de relatieve celproliferatie en de relatieve eiwitproduktie afhankelijk van de hoeveelheid Aerosil uitgezet.

In vergelijking met een celcultuur in MEM met onbehandeld serum, treedt een maximale toename van de cel- en eiwitproduktie op als ABS vooraf wordt behandeld met ongeveer 2,5 g Aerosyl 300 (Degussa A.G., Frankfurt, Duitsland) per 1 serum. Wanneer FBS vooraf wordt behandeld met Aerosyl 300 per liter serum ligt het maximum voor beide genoemde grootheden bij ongeveer 1 g Aerosil 300. Een en ander blijkt ook uit de volgende tabel, waarin gegevens zijn opgenomen bepaald na 7 dagen kweken:

Volume Behandeld Natief Behandeld fractie FBS t.o.v. ABS t.o.v. ABS t.o.v.

serum referentie: referentie: referentie referentie

in MEM natief FBS natief FBS natief FBS natief ABS

c.a.* p.s.# c.a. p.s. c.a. p.s. c.a. p.s.

(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 2 vol.% 119 100 19 11 38 20 196 190 10 vol.% 121 120 32 44 46 55 144 126 *c.a. is hoeveelheid cellen ♦p.s. is eiwitsynthese

De totale hoeveelheid cellen in een medium waaraan 10 vol.% FBS was toegevoegd, was 2, lx zo groot als in een medium waaraan 2 vol.% FBS was toegevoegd. Voor de eiwitproduktie werd een 3,0x zo grote produktie gevonden indien 10 vol.% FBS was toegevoegd.

Bij behandeling van ABS met 2,5 g Aerosyl per liter serum werd slechts ongeveer 20 % van de lipiden verwijderd.

Aangezien ABS gemiddeld meer dan twee maal zoveel lipiden bevat als FBS, zijn er dus ook na een behandeling van ABS met de genoemde hoeveelheid Aerosyl aanzienlijk meer lipiden aanwezig dan in al dan niet behandeld FBS.

Na een aanvankelijk lagere cel- en eiwitproduktie in MEM met volgens de uitvinding behandeld serum (FBS of ABS) trad, in vergelijking met onbehandeld serum, na een adaptatieperiode van de cellen van enkele dagen, een verhoogde cel- en eiwitproduktie op (fig. 3).

Bij een celcultuur in MEM met aldus voorbehandeld ABS trad daarnaast, na een periode van verhoogde celsterfte, na twee weken in dit medium een verdere adaptatie op, die leidde tot een verder verhoogde cel- en eiwitproduktie. In de derde passage waren de relatieve waarden voor de cel- en eiwitproduktie, na 7 dagen kweken, in vergelijking met een celcultuur in medium met onbehandeld ABS resp. 258 en 264 % en in vergelijking met onbehandeld FBS resp. 59 en 71 %.

Voorbeeld 3

Gebruik van voorbehandeld serum voor het kweken van CH02-cellen.

Op het minimale essentiële medium voor CH02-cellen (MEM) na, is de kweekprocedure voor CH02-cellen hetzelfde als voor BHK21-cellen (zie voorbeeld 2). Het kweekmedium voor CH02-cellen bestaat uit een gelijke hoeveelheid DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium) met 20 mM HEPES en Ham's F12 met 1,2 g/1 carbonaatbuffer, beide van ICN-Flow. De hoeveel- heden glutamine, penicilline; streptomycine en Fungizon zijn hetzelfde als in het MEM voor BHK21-cellen.

Bij CH02-cellen was er, waarschijnlijk als gevolg van een zeer snelle adaptatie aan een kweekmedium dat in plaats van FBS ander serum bevat, nagenoeg geen verschil in de celproduktie en de eiwitsynthese van een celcultuur in MEM met FBS of met ABS. Zowel bij een celcultuur in FBS- als in ABS-houdend medium (5 vol.% serum) is de celproduktie na 8 dagen in kweek 5 % hoger als serum wordt gebruikt dat vooraf is behandeld met 1 g Aerosyl per liter serum. De eiwitsynthese is na 7 dagen kweken, als gevolg van de genoemde Aerosyl behandeling, bij gebruik van beide sera, met 7 % toegenomen (fig. 4) .

Voorbeeld 4

Gebruik van voorbehandeld serum voor het kweken van hybridomacellen.

In fig. 5 wordt de produktie van hybridomacellen in suspensie in IMDM (ISCOV's modification of Dulbecco's medium) waaraan 10 % (v/v) FBS (HyClone Laboratories Inc., Logan,

Utah, USA) was toegevoegd, als functie van de hoeveelheid Aerosyl 300, betrokken op het volume van het serum, tijdens de voorbehandeling getoond (condities als in voorbeeld 1).

Voorbeeld 5

Gedeeltelijke verwijdering van lipiden uit foetaal en volwassen runderserum met Bio-Sil C8 Silica.

Bio-Sil C8 Sil'ica (hydrofiele poreuze ruwe silicadeelt jes (poriegrootte ± 9 nm) met een diameter tussen 15 en 35 μιη en met alifatische C8-liganden) is afkomstig van Bio-Rad Laboratories (Nazareth, België). Andere materialen zijn hetzelfde als in voorbeeld 1.

Voorbeeld 1 werd herhaald onder toepassing van Bio-Sil in plaats van Aerosil.

Door een behandeling van ABS met 4 g Bio-Sil C8 Silica per liter serum werd het cholesterol- en het vetzuurgehalte sterk gereduceerd. Het cholesteryl- en het fosfolipidengehalte blijft echter hoog in vergelijking met de respectievelijke gehaltes in FBS (fig.6).

Voorbeeld 6

Gebruik van serum voorbehandeld met Bio-Sil C8 Silica voor het kweken van BHK21-cellen.

Voorbeeld 2 werd herhaald, echter met die aanpassing, dat het ABS thans werd voorbehandeld met maximaal 4 g Bio-Sil C8 Silica per liter serum. De cellen werden gekweekt in een medium waaraan 5 % (v/v) met Bio-Sil behandeld serum was toegevoegd.

De produktie van het aantal cellen nam toe naarmate het ABS was voorbehandeld met meer Bio-Sil C8 Silica per serum-volume (tot 4 g/1 getest). De eiwitsynthese bereikte een maximale waarde na een voorbehandeling van ABS met meer dan 2 g Bio-Sil C8 Silica per liter serum (fig.7).

i

Claims (9)

1. Uit serum bereid eiwitmengsel, verkrijgbaar door serum of een uit serum verkregen eiwitmengsel te behandelen met een adsorptiemiddel dat bestaat uit deeltjes met een hydrofobe kern en ten minste een gedeeltelijk hydrofiel buitenoppervlak in een zodanige hoeveelheid dat wanneer het eiwitmengsel aan een minimaal essentieel medium voor dierlijke cellen wordt toegevoegd een verhoogde proliferatie van de cellen en een verhoogde eiwitproduktie door die cellen wordt verkregen.

2. Eiwitmengsel volgens conclusie 1, waarbij het adsorptiemiddel is toegepast in een hoeveelheid van 0,5 tot 5 g/1.

3. Eiwitmengsel volgens conclusie 1 of 2, waarbij een adsorptiemiddel is toegepast bestaande uit deeltjes met een polysiliciumoxide-kern.

4. Eiwitmengsel volgens conclusie 1, 2 of 3, waarbij een adsorptiemiddel is toegepast bestaande uit deeltjes met silanolgroepen aan het buitenoppervlak.

5. Eiwitmengsel volgens conclusie 4, waarbij een adsorptiemiddel is toegepast bestaande uit deeltjes met hydrofobe groepen aan het oppervlak.

6. Eiwitmengsel volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij een adsorptiemiddel wordt toegepast gekozen uit Aerosil® en Bio-Sil C8®.

7. Eiwitmengsel volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij wordt uitgegaan van foetaal of volwassen runderserum.

8. Toepassing van het uit serum bereide i eiwitmengsel volgens een van de conclusies 1-7 in een kweekmedium voor dierlijke cellijnen.

9. Werkwijze voor het verhogen van de proliferatie van cellen en de eiwitproduktie in een kweek van dierlijke cellen, waarbij het uit serum bereide eiwitmengsel volgens een van de conclusies 1-7 wordt toegevoegd aan een voor de kweek van de genoemde cellen geschikt minimaal essentieel medium.