EA005425B1 - Способы получения мембранных везикул - Google Patents
Способы получения мембранных везикул Download PDFInfo
- Publication number
- EA005425B1 EA005425B1 EA200201150A EA200201150A EA005425B1 EA 005425 B1 EA005425 B1 EA 005425B1 EA 200201150 A EA200201150 A EA 200201150A EA 200201150 A EA200201150 A EA 200201150A EA 005425 B1 EA005425 B1 EA 005425B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- peptide
- membrane
- vesicles
- membrane vesicles
- cells
- Prior art date
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 245
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 202
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 97
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 24
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 366
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 129
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 90
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 90
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 90
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 86
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 70
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 62
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 54
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 34
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 23
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 claims description 23
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 claims description 23
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 22
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 17
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 16
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 abstract description 143
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 144
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 90
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 90
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 59
- 239000000047 product Substances 0.000 description 47
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 45
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 39
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 38
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 37
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 27
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 23
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 23
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 23
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 21
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 20
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 19
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 19
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 17
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 14
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 12
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 11
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 10
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 10
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 10
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 9
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 9
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 9
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- -1 phosphatidylinositol mannosides Chemical class 0.000 description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 9
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 235000009421 Myristica fragrans Nutrition 0.000 description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000001115 mace Substances 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 7
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 7
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 6
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 238000011095 buffer preparation Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 4
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 4
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 3
- 101710197836 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Proteins 0.000 description 3
- 108010004141 HLA-B35 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 102100039648 Lactadherin Human genes 0.000 description 2
- 101710191666 Lactadherin Proteins 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010068647 P2 peptide Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 2
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001685 time-resolved fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- VJTZIJOEPIURRT-UHFFFAOYSA-N (2-methylquinolin-8-yl) n-methylcarbamate Chemical compound C1=C(C)N=C2C(OC(=O)NC)=CC=CC2=C1 VJTZIJOEPIURRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100021257 Beta-secretase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010027616 Hemoglobin A2 Proteins 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000894895 Homo sapiens Beta-secretase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000581326 Homo sapiens Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- BVARSKHQNMUXIB-WOUBZNJSSA-N L-idopyranose 6-monomycolate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@@H](CCCCCCCC)C(=O)OC[C@@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O BVARSKHQNMUXIB-WOUBZNJSSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101150064138 MAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710120903 Malignant T-cell-amplified sequence 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710186853 Malignant T-cell-amplified sequence 1 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102100027643 Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100034068 Monocarboxylate transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007560 sedimentation technique Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002325 super-antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
- C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
- C23C16/00—Chemical coating by decomposition of gaseous compounds, without leaving reaction products of surface material in the coating, i.e. chemical vapour deposition [CVD] processes
- C23C16/44—Chemical coating by decomposition of gaseous compounds, without leaving reaction products of surface material in the coating, i.e. chemical vapour deposition [CVD] processes characterised by the method of coating
- C23C16/4401—Means for minimising impurities, e.g. dust, moisture or residual gas, in the reaction chamber
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
- C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
- C23C16/00—Chemical coating by decomposition of gaseous compounds, without leaving reaction products of surface material in the coating, i.e. chemical vapour deposition [CVD] processes
- C23C16/44—Chemical coating by decomposition of gaseous compounds, without leaving reaction products of surface material in the coating, i.e. chemical vapour deposition [CVD] processes characterised by the method of coating
- C23C16/50—Chemical coating by decomposition of gaseous compounds, without leaving reaction products of surface material in the coating, i.e. chemical vapour deposition [CVD] processes characterised by the method of coating using electric discharges
- C23C16/505—Chemical coating by decomposition of gaseous compounds, without leaving reaction products of surface material in the coating, i.e. chemical vapour deposition [CVD] processes characterised by the method of coating using electric discharges using radio frequency discharges
- C23C16/509—Chemical coating by decomposition of gaseous compounds, without leaving reaction products of surface material in the coating, i.e. chemical vapour deposition [CVD] processes characterised by the method of coating using electric discharges using radio frequency discharges using internal electrodes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J37/00—Discharge tubes with provision for introducing objects or material to be exposed to the discharge, e.g. for the purpose of examination or processing thereof
- H01J37/32—Gas-filled discharge tubes
- H01J37/32431—Constructional details of the reactor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Metallurgy (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к способам приготовления биологического материала для использования при различных экспериментальных, диагностических или терапевтических применениях, включая иммунотерапевтическое лечение или профилактику опухолей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам приготовления мембранных везикул (в частности, экзосом), которые высвобождаются различными типами клеток млекопитающих, включая диафильтрацию и/или центрифугирование в градиенте плотности. Настоящее изобретение также предусматривает новые способы для характеризации и анализа препаратов экзосом, которые могут использоваться в исследованиях для контроля качества в целях производства фармацевтического продукта. Настоящее изобретение является пригодным для использования при получении препаратов фармацевтического качества из таких мембранных везикул и для полной характеризации указанных препаратов с целью использования на людях.
Description
Настоящее изобретение относится к способам приготовления биологического материала для использования при различных экспериментальных, диагностических или терапевтических применениях, включая иммунотерапевтическое лечение или профилактику опухолей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам приготовления мембранных везикул (в частности, экзосом), которые высвобождаются различными типами клеток млекопитающих, включая диафильтрацию и/или центрифугирование в градиенте плотности. Настоящее изобретение также предусматривает новые способы для характеризации и анализа препаратов экзосом, которые могут использоваться в исследованиях для контроля качества в целях производства фармацевтического продукта, а также способы нагрузки мембранных везикул иммуногенными соединениями. Настоящее изобретение является пригодным для использования при получении препаратов фармацевтического качества из таких мембранных везикул и для полной характеризации указанных препаратов с целью использования на людях.
Предпосылки изобретения
Мембранные везикулы являются, по существу, сферическими везикулами, как правило, меньшими, чем 130 нм в диаметре, состоящими из двойного слоя липидов, содержащими цитозольную фракцию. Конкретные мембранные везикулы, более конкретно, производятся клетками из внутриклеточных компартментов путем слияния с плазматической мембраной клетки, что приводит к их высвобождению в биологические жидкости или в супернатант культуры клеток. Такие везикулы, как правило, упоминаются как экзосомы. Экзосомы имеют, более конкретно, размер примерно между 30 и примерно 120 нм, предпочтительно 50 и 90 нм, более конкретно примерно между 60 и 80 нм в диаметре, и преимущественно несут в себе мембранные белки (в частности, белки главного комплекса гистосовместимости, или другой белок, который непосредственно или опосредованно участвует в презентировании антигена). Кроме того, в зависимости от их происхождения, экзосомы содержат мембранные белки, такие как МНС I, МНС II, СЭ63. СЭ81 и/или Н8Р70, и не имеют эндоплазматического ретикулума или аппарата Гольджи. Более того, экзосомы, по существу, не содержат нуклеиновых кислот (например, ДНК или РНК).
Высвобождение экзосом продемонстрировано на различных типах клеток и в различном физиологическом контексте. В частности, продемонстрировано, что экзосомы, высвобождаемые В-лимфоцитами, несут в себе молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II, которые играют роль в презентировании антигенов (Карою с1 а1., 1. Ехр. Меб. 183 (1996) 1161). Подобным же образом продемонстрировано, что дендритные клетки производят экзосомы (то есть, декзосомы, Эех), с определенными структурными и функциональными характеристиками, играющие роль в опосредовании иммунного ответа, в частности, в стимуляции цитотоксических Т-лимфоцитов (ΖίΙνο^Ι е1 а1., ЛаШге Меб1еше 4 (1998) 594). Также продемонстрировано, что клетки опухоли регулируемо секретируют определенные экзосомы (то есть, текзосомы, Тех), которые несут на себе антигены опухоли и способны к презентированию этих антигенов или к их передаче антиген-презентирующим клеткам (патентная заявка Νο. №О 99/03499). Также известно, что клетки мастоцитов накапливают молекулы во внутриклеточных везикулярных компартментах, которые могут секретироваться под воздействием сигналов (διηίΐΐι апб №е18, [ттипо1оду Тобау 17 (1996) 60). Следовательно, как правило, клетки испускают сигналы и общаются друг с другом посредством мембранных везикул, которые они высвобождают и которые могут нести в себе белки антигенов (или полипептиды, или пептиды), молекулы МНС или любые другие сигналы (цитокин, фактор роста, и тому подобное) со специфическими структурными и функциональными характеристиками, производимые в различных физиологических ситуациях. Эти везикулы, в частности экзосомы, таким образом, представляют собой продукт, являющийся объектом особого интереса для применения в диагностике, вакцинации или терапии, или для доставки молекул, представляющих интерес. Следовательно, было бы особенно интересно иметь эффективный способ, который может быть использован в промышленном масштабе, для приготовления мембранных везикул, совместимых с биологическим применением, в частности фармакологическим применением.
Обычные способы для получения мембранных везикул (например, экзосом) включают в себя ряд различных стадий центрифугирования для отделения везикул от клеток или остатков клеток, присутствующих в культуральной среде. В этом отношении документы, упомянутые выше, по существу описывают приготовление везикул с помощью последовательных центрифугирований при 300 д, 10000 д и 70000 д или 100000 д, после которых полученный осадок повторно суспендируется до 1/1000 от ее исходного объема в солевом растворе с получением концентрированного раствора экзосом. Однако по ряду причин, эти способы являются, по существу, непригодными для клинических применений: 1) долгое время, 2) масштабирование и проверка в СМР окружении, 3) значительный риск загрязнения остатками клеток, 4) плохая воспроизводимость из-за разброса, связанного с человеческим фактором, 5) агрегация экзосом, полученных из осадка (высокая локальная концентрация экзосом в лепешке) и 6) низкое извлечение в конце обработки. Существует, следовательно, потребность в усовершенствовании способов приготовления мембранных везикул, пригодных для использования при промышленных ограничениях и дающих возможность получения препаратов везикул терапевтического качества.
- 1 005425
Заявка на международный патент № РСТ/ЕК. 00/00105 описывает способы приготовления мембранных везикул с помощью хроматографических методик, таких как анионобменная хроматография и/или гель-проникающая хроматография.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новым способам приготовления мембранных везикул с высокими выходами, высокого качества и в относительно короткие периоды времени. Настоящее изобретение также описывает способы характеризации (или анализа, или дозирования) препарата мембранных везикул, которые могут использоваться в фармацевтическом производстве для определения активности, фенотипа и/или количества везикул. Настоящее изобретение теперь дает возможность получения и характеризации клинически пригодных партий мембранных везикул с воспроизводимостью, малым разбросом, связанным с человеческим фактором, и с повышением качества продукта. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам удаления частиц, таких как гаптоглобин, из различных сред или композиций, к полученным композициям и средам и к их применениям. Настоящее изобретение также касается новых способов нагрузки мембранных везикул иммуногенными соединениями и их применений.
Более конкретно один из аспектов настоящего изобретения заключается в способах приготовления мембранных везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности.
Другой аспект настоящего изобретения заключается в способах приготовления мембранных везикул с использованием ряда стадий ультрафильтрации и/или стадии осветления, более конкретно, сочетания концентрирования и диафильтрации с помощью ультрафильтрации, предпочтительно с предварительным осветлением.
Другой аспект настоящего изобретения заключается в способах приготовления мембранных везикул с использованием сочетания центрифугирования в градиенте плотности и ультрафильтрации, и/или стадии осветления, более конкретно, сочетания концентрирования и диафильтрации с помощью ультрафильтрации, предпочтительно, с предварительным осветлением, за которым следует центрифугирование в градиенте плотности.
В конкретном аспекте способ по настоящему изобретению включает в себя центрифугирование в градиенте плотности с предварительной или последующей диафильтрацией.
Способ настоящего изобретения может относиться к различным биологическим образцам, содержащим мембранные везикулы, включая биологическую жидкость, супернатант культуры, клетки лизата или предварительно очищенный раствор. В конкретном воплощении способ используется для получения (например, очистки или разделения, или выделения) мембранных везикул из биологического образца, обогащенного мембранными везикулами.
Конкретный аспект настоящего изобретения заключается в способе приготовления мембранных везикул из биологического образца, включающем в себя:
a. культивирование популяции клеток, продуцирующих мембранные везикулы, при условиях, делающих возможным высвобождение везикул,
b. стадию накопления мембранных везикул и
c. обработку указанного обогащенного биологического образца с помощью центрифугирования в градиенте плотности.
В дополнительном предпочтительном воплощении клетки продуцирующие мембранные везикулы культивируют в культуральной среде с пониженным содержанием частиц, предпочтительно в среде, не содержащей агрегированного гаптоглобина. Как будет продемонстрировано в этой заявке, использование такой среды дает возможность достижения повышенных выходов производства и/или более высоких уровней чистоты и качества.
Стадия обогащения может включать в себя одну или несколько стадий центрифугирования, осветления, ультрафильтрации, нанофильтрации, аффинной хроматографии и/или диафильтрации. Более предпочтительно, стадия обогащения включает в себя осветление, и/или концентрирование, и/или диафильтрацию.
Препарат экзосом может быть собран после стадии с) с помощью любых соответствующих средств, включая пипетирование, или с помощью иглы.
В предпочтительном воплощении способ дополнительно включает в себя стерильную фильтрацию б) препарата после стадии с.
Настоящее изобретение может использоваться для получения мембранных везикул из различных источников, включая мембранные везикулы, полученные с помощью антиген-презентирующих клеток (таких как макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты), клеток опухолей или любых других клеток, или линий клеток, продуцирующих везикулы, предпочтительно трансдуцированные для продукции антигенов. Это является, в частности, пригодным для использования при приготовлении мембранных везикул, продуцируемых дендритными клетками, предпочтительно незрелыми дендритными клетками (то есть, декзосом). Более того, мембранные везикулы или соответствующие клетки могут быть сенсибилизированы по отношению к одному или нескольким антигенам до, во время или после приготовления.
Более предпочтительные воплощения настоящего изобретения включают в себя:
- 2 005425
- способ приготовления мембранных везикул, включающий в себя:
b. культивирование популяции антиген-презентирующих клеток, в частности дендритных клеток, при условиях, обеспечивающих высвобождение мембранных везикул антиген-презентирующими клетками, в частности, дендритными клетками, с. стадию накопления мембранных везикул и а. выделение мембранных везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности.
- способ приготовления мембранных везикул, включающий в себя:
а. получение популяции незрелых дендритных клеток Ь. культивирование популяции незрелых дендритных клеток при условиях, обеспечивающих высвобождение мембранных везикул незрелыми дендритными клетками,
c. стадию накопления мембранных везикул и б. выделение мембранных везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности.
Как показано выше, дополнительная стадия сенсибилизации везикул (или полученных клеток) по отношению к одному или нескольким конкретным антигенам может быть введена в способ, либо перед стадией Ь) для сенсибилизации полученных клеток, либо после стадии Ь), для сенсибилизации непосредственно мембранных везикул.
В этом отношении, настоящее изобретение описывает процедуру для непосредственной нагрузки экзосом, в частности для прямого введения иммуногенных соединений (таких как пептиды или липиды) в комплексы МНС на экзосомах, предварительно приготовленных и очищенных от культуры антигенпрезентирующих клеток. Способ в соответствии с настоящим изобретением является особенно предпочтительным для непосредственной нагрузки пептидов на комплексы МНС (класса I) на декзосомах, предварительно очищенных от культуры незрелых дендритных клеток.
Как указано выше, нагрузка экзосом, полученных из дендритных клеток (декзосом), пептидами, связанными с НЬА класса I или II, до сих пор достигалась с помощью опосредованной нагрузки, то есть, с помощью добавления терапевтического (антигенного) пептида (например, рестриктированного пептида опухоли класса I) (например, при 10 мкг/мл, в день 6) к культуре клеток, продуцирующих везикулы (например, дендритных клеток (ОС), дифференцировавшихся из обогащенных моноцитами адгезивных клеток в присутствии СМ-С8Е и [В-4) (смотри, например, патент США 5846827 и цитируемые там ссылки). Предполагается, что ОС поглощают экзогенные пептиды и при этом производят декзосомы с закреплением этих пептидов класса I на поверхности экзосомы. Ш νίνο эксперименты с моделью Р1А опухоли мастоцитомы мышей показывают, что декзосомы, продуцируемые таким образом, вызывают антиопухолевые иммунологические ответы, которые приводят к регрессии опухоли. Декзосомы, опосредованно нагруженные пептидом Май-1, могут также стимулировать маргинальную секрецию ΓΕΝ-γ у специфичного к Май-1 клона СТЬ, ЬТ 11, что говорит о том, что некоторая степень нагрузки пептидом действительно осуществляется. Однако, даже используя флуориметрию с временным разрешением (ТНЕ), биохимический подход с чувствительностью, подобной радиоактивному детектированию, связывание пептидов класса I на этих декзосомах едва детектируется.
В порядке повышения эффективности и промышленного осуществления процессов, авторы теперь неожиданно обнаружили, что является возможным осуществление подхода с непосредственной нагрузкой, при котором стадия добавления пептида к культуре ОС заменяется добавлением пептида на декзосомы после того, как они очищаются от культуры ОС. В частности, авторы теперь обнаружили, что могут быть разработаны и определены выбранная кислотная среда или буфер для защиты мембранных везикул и предоставления возможности непосредственной нагрузки иммуногенными соединениями антиген-презентирующих молекул на поверхности указанных везикул, в частности молекул МНС, таких как молекулы класса-!, класса-П или СЭ1.
Конкретная цель настоящего изобретения, таким образом, заключается также в способе приготовления иммуногенной мембранной везикулы, способ включает в себя выделение или очистку мембранной везикулы из биологического образца и взаимодействие указанной выделенной или очищенной мембранной везикулы с иммуногенным соединением (например, с пептидом или липидом) при условиях, дающих возможность иммуногенному соединению для связывания антиген-презентирующих молекул (например, МНС класса I или класса II для пептидов, и СЭ1 для липидных антигенов) на поверхности указанной мембранной везикулы.
В предпочтительном воплощении, способ включает в себя стадию воздействия на выделенные или очищенные мембранные везикулы выбранной кислой средой или обработку до, во время или после взаимодействия указанных везикул с помощью указанного иммуногенного соединения с тем, чтобы сделать возможной или облегчить их нагрузку. В этом отношении, использование выбранных кислых сред или обработок, как описано в настоящей заявке, предоставляет возможность, по меньшей мере, для частичного удаления эндогенных пептидов или липидов, связанных на поверхности везикул, и/или облегчения обмена иммуногенных соединений.
В дополнительном предпочтительном воплощении, после взаимодействия с иммуногенным соединением, везикулы подвергаются центрифугированию, предпочтительно, центрифугированию в градиенте плотности, или диафильтрации для удаления несвязанных иммуногенных соединений.
- 3 005425
Иммуногенное соединение может быть, например, любым пептидом или липидом, которые презентируются иммунной системе в связи с антиген-презентирующими молекулами. Пептиды могут быть рестриктированными пептидами класса-1, рестриктированными пептидами класса-ΙΙ, либо сами по себе, либо в смеси, либо в сочетании с другими пептидами, или даже пептидным элюатом клеток опухоли. Настоящее изобретение является, в частности, пригодным для использования при непосредственной нагрузке рестриктированными пептидами класса-1. Липиды могут быть микробным липидом, микробным гликолипидом, или липидным или гликолипидным антигеном опухоли либо в выделенной форме, либо в различных сочетаниях, или смесью (смесями).
Способ непосредственной нагрузки обеспечивает значительные преимущества по сравнению с известными ранее методиками. В частности, как иллюстрируется в примерах, непосредственная нагрузка пептидами является более эффективной, чем известная ранее опосредованная нагрузка, в том, что при этом может быть получена более высокая доля занятых НЬА рецепторов на поверхности с использованием более низкого количества пептида. Это явным образом повышает иммуногенный потенциал мембранных везикул. Кроме того, структура нагруженного пептида может контролироваться более точно, так как нагруженные пептиды не обрабатываются клеткой в целом и, таким образом, остаются интактными и не модифицированными при нагрузке. Настоящее изобретение теперь показывает впервые, что непосредственная нагрузка пептидами может быть осуществлена с использованием очищенных мембранных везикул, таких как декзосомы. В этом отношении, настоящее изобретение показывает, что мембранные везикулы выдерживают условия с низкими значениями рН без потери своей активности и функциональности. Настоящее изобретение также описывает конкретные условия, дающие возможность усовершенствования непосредственной нагрузки. Настоящее изобретение, в частности, показывает, что обычные буферные среды, используемые для опосредованной нагрузки (то есть для нагрузки всей клетки) могут быть с преимуществами заменены различными буферными средами для повышения эффективности непосредственной нагрузки и получения более высоких долей занятой поверхности, что указывает на то, что везикулы ведут себя не так, как целые клетки.
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение направлено на способ для приготовления иммуногенной мембранной везикулы, содержащей комплекс экзогенного пептида класса-Ι, связанного с молекулой НЬА класса I, способ включает в себя (ί) воздействие на выделенную или очищенную мембранную везикулу выбранной кислой средой, (и) взаимодействие указанной выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом класса Ι при условиях, дающих возможность образования комплекса пептида и молекулы НЬА класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, и (ίίί) сбор нагруженных мембранных везикул. Термин экзогенный обозначает, что пептид добавляется к композиции.
В конкретном варианте способ включает в себя стадии (ί) воздействия на выделенные или очищенные мембранные везикулы выбранной кислой средой, (ίί) взаимодействия указанной выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом класса-Ι в присутствии бета-2микроглобулина, при условиях, дающих возможность для образования комплекса пептида и молекулы НЬА класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, и (ίίί) сбор нагруженных мембранных везикул. Более предпочтительно стадия (ί) включает в себя воздействие на выделенные или очищенные мембранные везикулы кислой средой при значении рН, попадающем в пределы между примерно 3 и 5,5, еще более предпочтительно, между примерно 3,2 и 4,2, в течение менее чем 5 мин. Подход с непосредственной нагрузкой в присутствии бета-2-микроглобулина является предпочтительным, так как он предоставляет возможность эффективной нагрузки, даже если доступными являются только очень малые количества иммуногенных соединений. В самом деле, когда используется бета-2-микроглобулин, как показали авторы, является возможным использование определенных кислых сред, которые удаляют, по существу, все эндогенные пептиды с мембранных везикул и, таким образом, способствуют восстановлению функциональных комплексов МНС даже при низких уровнях иммуногенных соединений (например, от 0,005 до 50 мкг/мл). Этот подход, таким образом, является особенно пригодным для использования при непосредственной нагрузке элюатами опухолей, липидами, природными антигенами или другими иммуногенными соединениями, которые не могут быть произведены экономично в больших количествах (например, путем синтеза).
Там, где являются доступными более высокие количества иммуногенных соединений, авторы определяют второй общий подход с нагрузкой, в котором бета-2-микроглобулин не является необходимым. Это воплощение является преимущественным, так как необходимо меньше стадий обработки (так, что экзосомы не изменяются), и нет необходимости в экзогенном β2-ιη. что может понижать стоимость и потенциальные погрешности при добавлении экзогенного материала к способу. В этом отношении, в другом конкретном варианте способ включает в себя стадии (ί) взаимодействия выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным иммуногенным соединением (например, с пептидом или липидом) класса-Ι в отсутствие бета-2-микроглобулина, (ίί) воздействие на смесь из (ί) выбранной кислой средой или обработку при условиях, дающих возможность для обмена иммуногенного соединения с любым эндогенным соединением, с целью связывания с молекулой НЬА класса Ι на поверхности указанной мембранной везикулы, (ίίί) нейтрализацию среды для прекращения обмена и/или стабилиза
- 4 005425 ции комплекса, сформированного в (и), и (ίν) сбор нагруженных мембранных везикул. Более предпочтительно, стадия (ίί) включает в себя воздействие на смесь кислой средой при значении рН, находящемся в пределах примерно между 4 и 5,5, в течение периода времени, достаточного для осуществления обмена между любой эндогенной молекулой и иммуногенным соединением, с целью связывания с комплексом МНС. В самом деле, авторы показали теперь, что, в противоположность клетке в целом мембранные везикулы могут выдерживать длительное соприкосновение с кислой средой или условиями, таким образом, делая возможной замену эндогенных молекул с помощью любого желаемого иммуногенного соединения, без изменения или дестабилизации молекулы МНС и, по существу, без деградации или удаления эндогенного β2-ιπ. Авторы также определили конкретные кислые среды и условия, дающие возможность для осуществления обмена без изменения функциональности мембранных везикул. Эти выбранные среды более конкретно характеризуются значением рН, находящимся в пределах примерно между 4 и 5,5, более предпочтительно между 4,2 и 5,2. Мембранные везикулы предпочтительно взаимодействуют с выбранными выше кислотными средами в течение периода времени, превышающего 15 мин, как правило, меньшего чем 2 ч, еще более предпочтительно в течение менее чем 1 ч. В соответствии с этим вариантом способ не включает в себя использование бета-2-микроглобулина, и нагрузка осуществляется путем обмена между желаемым пептидом и эндогенным пептидом, без высвобождения эндогенного β2-ιη. В этом не содержащем бета-2-микроглобулина воплощении выделенная или очищенная мембранная везикула, как правило, взаимодействует с избытком экзогенного иммуногенного соединения, например с 5-500 мкг/мл рестриктированного пептида или липида класса-1, в отсутствие бета-2-микроглобулина. Это воплощение является, в частности, пригодным для использования при нагрузке иммуногенных соединений, доступных в больших количествах, таких как пептиды, получаемые путем синтеза.
Как показано выше, способ может быть осуществлен с использованием различных иммуногенных молекул. Пептиды являются предпочтительно пептидами, презентируемыми молекулами класса I или класса II, то есть пептидами, которые получают в результате обработки антигенов антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки и макрофаги, и В-лимфоцитами. Предпочтительный класс пептидов представлен рестриктированными пептидами класса-1, еще более предпочтительно, рестриктированными пептидами опухоли класса-1, то есть пептидами, полученными из антигенов опухоли, которые представлены дендритными клетками или макрофагами иммунной системы. Конкретные пептиды включают в себя, например, НБА-Л1. НБА-А2, НЬА-АЗ, НБА-А24. НБА-В35 или другие гаплотипы рестриктированных пептидов опухоли, из различных клеток опухолей, или антигены, такие как Маде, Ваде, Маг!, СЕА, Р8А и тому подобное. Нужно понять, что способ может быть осуществлен с использованием выделенных пептидов или их смесей, таких как элюаты пептидов клеток опухоли или других сочетаний пептидов. Антигенные пептиды, полученные от других патогенных агентов (вирусов, клеток, паразитов и тому подобного) могут также нагружаться в соответствии с настоящим изобретением, например, для получения иммуногенных мембранных везикул, пригодных для использования при лечении различных болезненных состояний, таких, например, как злокачественные заболевания, инфекции или иммунные заболевания.
Липиды могут представлять собой любой липид, гликолипид или липопротеин, презентированный иммунной системе с помощью молекулы СЭ1 на поверхности антиген-презентирующих клеток. Молекулы СЭ1 представляют собой МНС-подобные молекулы, ответственные за презентирование липидных или гликолипидных антигенов Т-лимфоцитам. Описано несколько изотопов СЭ1, включая СЭ1а, СЭ1Ь, СО1е, СЭ1б и СЭ1е, которые участвуют в презентировании липидных антигенов. В конкретном воплощении, способ используется для нагрузки липидными антигенами молекул СЭ1 на поверхности мембранных везикул, в частности, СЭ1Ь и СЭ1б. Липид может представлять собой любой микробный липид, микробный гликолипид, липид или гликолипид, антиген опухоли и тому подобное. Более предпочтительные примеры липидов включают в себя микобактериальные липиды, такие как миколевые кислоты, мономиколят глюкозы, гексоз-1-фосфоизопреноиды и производные липоарабиноманнанов (БАМ), такие как фосфатидилинозитол маннозиды. Другие примеры включают в себя сами керамиды, такие как ганглиозиды, гликолипидные антигены опухоли и тому подобное.
Конкретные воплощения настоящего изобретения включают в себя:
способ приготовления иммуногенных мембранных везикул, включающий в себя:
b) культивирование популяции антиген-презентирующих клеток, в частности дендритных клеток, при условиях, дающих возможность для высвобождения мембранных везикул антиген-презентирующими клетками, в частности дендритными клетками,
c) накопление мембранных везикул или стадию их очистки и
б) взаимодействие мембранных везикул с иммуногенным соединением при условиях, дающих возможность иммуногенному соединению для связывания молекулы МНС на поверхности указанных мембранных везикул, с целью получения иммуногенных мембранных везикул.
Способ приготовления иммуногенных мембранных везикул, включающий в себя:
а. получение популяции незрелых дендритных клеток
- 5 005425
b. культивирование популяции незрелых дендритных клеток при условиях, дающих возможность для высвобождения мембранных везикул незрелыми дендритными клетками,
c. стадию накопления или очистки мембранных везикул и
б. взаимодействие мембранных везикул с иммуногенным соединением при условиях, дающих возможность иммуногенному соединению для связывания молекулы МНС на поверхности указанных мембранных везикул, с целью получения иммуногенных мембранных везикул.
Способ приготовления иммуногенных мембранных везикул, включающий в себя:
a. получение популяции незрелых дендритных клеток,
b. культивирование популяции незрелых дендритных клеток при условиях, дающих возможность для высвобождения мембранных везикул незрелыми дендритными клетками,
c. стадию накопления или очистки мембранных везикул и
а. взаимодействие мембранных везикул с липидным антигеном при условиях, дающих возможность липидному антигену для связывания с молекулой СО 1 на поверхности указанных мембранных везикул, с целью получения иммуногенных мембранных везикул.
Обогащение или очистка предпочтительно выполняются, как описано выше, также как и непосредственная нагрузка.
Конкретное воплощение настоящего изобретения заключается в способе приготовления мембранных везикул, включающем в себя:
a. получение популяции антиген-презентирующих клеток, более предпочтительно незрелых дендритных клеток,
b. необязательно, сенсибилизирование антиген-презентирующих клеток, более предпочтительно, незрелых дендритных клеток, по отношению к одному или нескольким антигенам,
c. культивирование популяции антиген-презентирующих клеток, более предпочтительно незрелых дендритных клеток, при условиях, дающих возможность для высвобождения мембранных везикул антиген-презентирующими клетками, более предпочтительно незрелыми дендритными клетками,
б. осветление супернатанта культуры,
е. концентрирование осветленного супернатанта,
£. диафильтрацию концентрированного супернатанта,
д. выделение мембранных везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности,
11. необязательно, взаимодействие мембранных везикул с пептидом для получения нагруженных пептидом мембранных везикул и
1. стерильную фильтрацию мембранных везикул, полученных в д.
Стерильная фильтрация ί) может предваряться стадией замены буфера, например, путем диафильтрации. Типичная схема процесса изображена на фиг. 1. В процессе выше осуществляется либо стадия Ь) либо стадия 1).
Более того, настоящее изобретение также предусматривает способы удаления частиц из различных сред или композиций. Более конкретно, настоящее изобретение демонстрирует, что обычные культуральные среды включают в себя частицы, такие как гаптоглобин и связанные с ним полимеры (например, агрегированный гаптоглобин), и указывает способы их удаления. В более общем смысле, эти способы предоставляют возможность для производства культуральных сред или любых других биологических продуктов, таких как белки крови или полипептиды (или их производные), растворы препаратов, фетальная сыворотка теленка и тому подобное, которые по существу не содержат агрегированного гаптоглобина.
Агрегированный гаптоглобин может проявлять иммуносупрессивную активность и, таким образом, воздействовать на биологические свойства, безопасность и чистоту мембранных везикул или других биологических продуктов, как будет показано ниже. Однако проблема удаления конкретных частиц не решена в данной области, их присутствие в различных биологических продуктах не определяется, и эффективные способы их удаления недоступны. Настоящее изобретение теперь предусматривает эффективные способы для приготовления биологических продуктов высокого качества, указанные конечные продукты также представляют собой цели настоящего изобретения.
В этом отношении, настоящее изобретение заключается, в целом, в композиции, содержащей культуральную среду клеток млекопитающего, по существу не содержащую частиц, более предпочтительно не содержащую агрегированного гаптоглобина.
Настоящее изобретение также заключается в культуральной среде клеток, не содержащей агрегированного гаптоглобина.
Настоящее изобретение дополнительно заключается в композиции материала, содержащего антиген-репрезентирующие клетки (или любые другие клетки, продуцирующие мембранные везикулы, в частности дендритные клетки) в культуральной среде, имеющей пониженное содержание частиц, более конкретно, по существу не содержащей агрегированного гаптоглобина. Более предпочтительно, культуральная среда представляет собой культуральную среду, обработанную с целью удаления частиц или агрегированных соединений, более конкретно, путем ультрафильтрации.
- 6 005425
Другой аспект настоящего изобретения заключается в способе получения или культивирования антиген-презентирующих клеток (или любых клеток, продуцирующих мембранные везикулы), в частности дендритных клеток, с использованием культуры или продуцирующей среды с пониженным содержанием частиц. Более предпочтительно, культуральная среда представляет собой культуральную среду, которая является по существу не содержащей агрегированного гаптоглобина, более конкретно, средой, обработанной с помощью ультрафильтрации.
Настоящее изобретение является также пригодным для использования при получении композиции продуктов крови, которые являются, по существу, не содержащими агрегированного гаптоглобина, а также с целью обработки различных буферных растворов перед приготовлением продуктов для фармацевтического применения.
В этом отношении, настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей полипептид крови или его производное, которая является, по существу, не содержащей агрегированного гаптоглобина. Более конкретно, настоящее изобретение заключается в композиции, содержащей термически инактивированный продукт крови, которая является, по существу, не содержащей агрегированного гаптоглобина. Еще более предпочтительно настоящее изобретение относится к композиции (термически инактивированной) сывороточного альбумина, более предпочтительно сывороточного альбумина человека, по существу, не содержащей агрегированного гаптоглобина.
Настоящее изобретение также относится к способу обработки биологического продукта, более предпочтительно термически инактивированного биологического продукта, в порядке понижения количества агрегированного гаптоглобина, содержащегося в нем, который включает в себя воздействие на продукт фильтрации, более предпочтительно ультрафильтрации.
Конкретный ответ настоящего изобретения также заключается в способе приготовления биологического продукта, включающем в себя (ί) термическое инактивирование биологического продукта и (ίί) фильтрование термически инактивированного биологического продукта. Более предпочтительно способ дополнительно включает в себя стадию (ίίί) концентрирования фильтрованного, термически инактивированного биологического продукта, и/или (ίν) их сочетание. Способ может использоваться для различных биологических продуктов, включая любой белок или полипептид (или их производное), выделенные (или экстрагированные) из биологических жидкостей млекопитающих, таких как кровь человека, или плазма, или сыворотка. Как будет дополнительно показано в этой заявке, этот способ впервые предоставляет возможность для получения термически инактивированных биологических продуктов, имеющих пониженное содержание агрегированного гаптоглобина, более предпочтительно, по существу, не содержащих агрегированного гаптоглобина и, таким образом, имеющих повышенную безопасность. Способ является особенно пригодным для использования при приготовлении фармацевтических белков, экстрагированных из крови или плазмы, таких как сывороточный альбумин, более предпочтительно сывороточный альбумин человека, гамма иммуноглобулин, факторы коагуляции крови и тому подобное.
Настоящее изобретение также заключается в способе обработки препарата сыворотки, более предпочтительно препарата фетальной сыворотки теленка, для понижения количества агрегированного гаптоглобина, содержащегося в ней, включающем в себя воздействие на препарат фильтрации, более предпочтительно ультрафильтрации.
Как будет дополнительно показано ниже, выражение по существу не содержащий указывает на то, что композиция или среда содержит меньше чем примерно 1 м.д. агрегированного гаптоглобина, более предпочтительно меньше, чем примерно 0,5 м.д., еще более предпочтительно агрегированный гаптоглобин не детектируется с помощью 8Ό8 РАСЕ анализа, а также с помощью количественного анализа ЕЫ8А.
Другой аспект настоящего изобретения заключается в способах анализа или характеризации (или дозирования) мембранных везикул в препарате, в порядке определения их фенотипа и/или активности, и/или количества.
Более конкретно, один из аспектов настоящего изобретения заключается в способе характеризации мембранных везикул, включающем в себя взаимодействие мембранных везикул, параллельно с двумя или более видами антител, специфичных к маркерным компонентам мембранных везикул, и определение образования иммунных комплексов антиген-антитело.
Другой конкретный аспект включает в себя способ характеризации активности препарата на основе мембранных везикул, включающий в себя взаимодействие нагруженных суперантигеном везикул с Тлимфоцитами в присутствии А-клеток, и определение активации Т-лимфоцитов.
Настоящее изобретение также предусматривает способ дозирования мембранных везикул в образце, включающий в себя (ί) нагрузку образца на твердой подложке, (ίί) взаимодействие подложки с антителом анти-класса II (или другими компетентными антителами) и (ίίί) определение присутствия иммунных комплексов антитело-антиген.
Настоящее изобретение также включает в себя композиции, содержащие (ί) мембранные везикулы, (ίί) буферный агент и (ίίί) криопротекторное или стабилизирующее соединение.
Настоящее изобретение также охватывает фармацевтические композиции, содержащие иммуногенную мембранную везикулу и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, где иммуноген
- 7 005425 ную мембранную везикулу получают с помощью непосредственной нагрузки, например путем выделения мембранной везикулы из биологического образца, содержащего антиген-презентирующие клетки (например, дендритные клетки), и нагрузки указанной выделенной мембранной везикулы иммуногенным соединением, и предпочтительно удаления несвязанного иммуногенного соединения (преимущественно, с помощью центрифугирования в градиенте плотности или диафильтрации). Предпочтительные композиции содержат иммуногенные мембранные везикулы, где по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40% молекул НЬА на поверхности везикул являются нагруженными экзогенным пептидом или липидом.
Настоящее изобретение также охватывает способы приготовления фармацевтического продукта, содержащего иммуногенные мембранные везикулы и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, где способ включает в себя (ί) выделение мембранной везикулы из биологического образца (например, содержащего антиген-презентирующие клетки (например, дендритные клетки)), (ίί) нагрузку указанной выделенной мембранной везикулы иммуногенным соединением для получения иммуногенной мембранной везикулы, (ίίί) предпочтительно удаление несвязанного иммуногенного соединения (преимущественно, с помощью центрифугирования в градиенте плотности или диафильтрации), и (ίν) взаимодействие иммуногенной мембранной везикулы с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
Другие аспекты настоящего изобретения включают в себя наборы, диагностические тест-системы, композиции мембранных везикул, устройство (устройства) для приготовления мембранных везикул или антиген-нагруженные антиген-презентирующие клетки (такие как дендритные клетки) или мембранные везикулы.
Это включает в себя способ возбуждения иммунного ответа у субъекта, включающий в себя (ί) получение биологического образца, содержащего дендритные клетки, (ίί) выделение мембранной везикулы из указанного биологического образца или его очистку, (ίίί) взаимодействие указанной очищенной мембранной везикулы с иммуногенным соединением при условиях, дающих возможность иммуногенному соединению для связывания молекулы МНС на поверхности указанной мембранной везикулы, и (ίν) введение мембранной везикулы из (ίίί) субъекту для возбуждения иммунного ответа у указанного субъекта. Субъектом является предпочтительно человек, хотя предполагается также и ветеринарное применение.
Настоящее изобретение является, в частности, пригодным для использования с целью приготовления декзосом (то есть мембранных везикул, полученных с помощью дендритных клеток) или текзосом (то есть мембранных везикул, полученных с помощью клеток опухолей), более конкретно, происходящих от человека. Эти мембранные везикулы могут использоваться в различных экспериментальных, биологических, терапевтических, диагностических или профилактических применениях. В частности, мембранные везикулы могут использоваться для модуляции иммунного ответа у субъекта, в частности в патологических условиях, таких как злокачественные заболевания, аутоиммунные заболевания, аллергия, бронхиальная астма, воспаление и тому подобное.
Подписи к фигурам
Фиг. 1. Блок-схема конкретного способа аутологичного выделения и очистки декзосом.
Фиг. 2. ЭС культивируют в присутствии рестриктированного пептида СМУ рр65 НЬЛ-Л2 в день 5. Декзосомы собирают в день 7 и очищают. Очищенные СМУ декзосомы, в которые введен пептид, затем добавляют к линии Т-лимфоцитов с рестриктированным СМУ рр65 НЬЛ-Л2 в присутствии положительных по отношению к НЬЛ-Л2 или отрицательных по отношению к НЬЛ-Л2 ОС. Культивирование клеток производится в формате ЕЫ8РОТ, где лунки для культур покрываются антителами, специфичными по отношению к ΙΕΝ-γ, и присутствие клеток, специфично секретирующих этот цитокин, отмечается числом как мера активации Т-лимфоцитов.
Образцы представляют собой следующее:
1. Т + А2+ ОС + ехо/А2+ ОС/ Без пептида
2. Т + А2+ ОС + ехо/А2+ ОС/ Пептид СМУ
3. Т + А2- ОС + ехо/А2+ ОС/ Без пептида
4. Т + А2- ОС + ехо/А2+ ОС/ Пептид СМУ
Специфичная по отношению к пептиду реакция Т-лимфоцитов на декзосомы может наблюдаться путем сравнения образца 2 с образцом 1, и доказательство того, что стимуляция вызывается пептидом, введенным в декзосомы, а не свободным пептидом, непосредственно стимулирующим ОС, иллюстрируется путем сравнения образца 4 с образцом 3.
Фиг. 3. 8Ό8-ΡΑΟΕ сред А1М У до и после обработки с помощью ультрафильтрации через 500 кДа (МУСО) мембран в виде полого волокна. А1М У и обработанные УФ А1М У осаждаются с помощью ультрацентрифугирования при 100000 х д в течение 1 ч. Супернатант удаляют и осадочный слой повторно суспендируют в РВ8 и центрифугируют в ультрацентрифуге второй раз при 100000 х д в течение 1 ч. Осадок повторно суспендируют до 1/1000 от исходного объема в РВ8. 20 мкл осадка (восстанавливающие условия) помещают в 8-16% акриламидный гель, который впоследствии окрашивают с помощью коллоидного Сооша881е В1ие.
- 8 005425
Фиг. 4. 8Ό8-ΡΑΟΕ среды ΑΙΜ V через 3 месяца после обработки с помощью ультрафильтрации через 500 кДа (М^СО) мембрану в виде полого волокна. Обработанную УФ ΑΙΜ V осаждают путем ультрацентрифугирования при 100000 х д в течение 1 ч. Супернатант удаляют и осадочный слой повторно суспендируют в ΡΒ8 и ультрацентрифугируют во второй раз при 100000 х д в течение 1 ч. Осадок повторно суспендируют до 1/1000 исходного объема вместе с ΡΒ8. 20 мкл осадка (восстанавливающие условия) помещают на 8-16% акриламидный гель, который впоследствии окрашивают с помощью коллоидного Соотакые В1ие.
Фиг. 5. Блок-схема системы микрофильтрации с помощью 3/0,8 мкм фильтра в виде мешка.
Фиг. 6. Схема: Ультрафильтрация осветленного супернатанта культуры ткани с использованием системы с картриджем в виде полого волокна.
Фиг. 7. 8Ό8-ΡΑΟΕ супернатанта концентрированной культуры ткани, содержащей декзосомы, до и после диафильтрации вместе с ΡΒ8 и с использованием 500 кДа мембраны в виде полого волокна. Образец подвергают диафильтрации вместе с 5 объемами ΡΒ8. Декзосомы до и после диафильтрации дополнительно очищают с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности, состоящем из 30% сахарозы/Трис Э2О буфера. Концентрация складок обозначена для каждого анализируемого образца. 20 мкл вещества осадка (восстанавливающие условия) помещают на 8-16% акриламидный гель, который впоследствии окрашивают с помощью коллоидного Соотакые Β1ικ.
Фиг. 8а. Ультрацентрифугирование концентрированных декзосом в градиенте плотности 30% сахарозы/Трис Ό2Ο (плотность = 1,190-1,210 г/мл). Приготовление образца.
Фиг. 8Ь. Сбор образца от ультрацентрифугирования декзосом в градиенте плотности, состоящем из 30% сахарозы/Трис Ό2Ο буфера. Осадок повторно суспендируется до 1/1000 от его исходного объема вместе с буфером для приготовления.
Фиг. 9а. 8Ό8-ΡΑΟΕ фракции декзосом, собранной после ультрацентрифугирования в градиенте плотности, состоящем из 30% сахарозы/Трис Ό2Ο буфера. Все образцы нормализуют до 1/21 от исходного объема. Фракции представляют собой следующее: дорожка 1 - после ультрафильтрации/перед ультрацентрифугированием, дорожка 2 - фракция от УЦ в градиенте плотности, дорожка 3 - УЦ осадок на дне в градиенте/восстановлена до 1/1000 от исходного объема, дорожка 4 - осадок от УЦ, полученный классическим способом седиментации/восстановлена до 1/1000 от исходного объема, и дорожка 5 - от УЦ выше в градиенте плотности.
Фиг. 9Ь. Результаты НБЛ/ОВ ΕΕΙ8Α для различных фракций ступенчатого распределения плотности сахаро8а/Э2О после ультрацентрифугирования при 100000 х д в течение 1 ч. Никакого ΗΕΑ/ΌΒ не наблюдается выше плотной части в градиенте, приблизительно 10% соответствует восстановленному осадку (1/1000), и 90% находится в градиенте.
Фиг. 10. 8Ό8-ΡΑΟΕ декзосом и диафильтрация в буфере ΡΒ8 для приготовления. Декзосомы дополнительно концентрируются с помощью седиментации путем ультрацентрифугирования при 100000 х д в течение 1 ч. Осадок восстанавливается в ΡΒ8 до 1/2800 от исходного объема супернатанта. 3,3 мкл декзосом (восстанавливающие условия) нагружают на 8-16% акриламидный гель, который впоследствии окрашивают с помощью коллоидного Соотакые Β1ικ.
Фиг. 11. ΕΕΙ8Α экзосом. Экзосомы очищаются либо путем осаждения с помощью ультрацентрифугирования, либо путем ультрацентрифугирования в растворе с градиентом плотности (30% сахароза/ 20 мМ Трис в Э2О). Для сравнения, лизат ОС используют в качестве эквивалентов эквивалентных культур клеток. Сайты неспецифичного связывания блокируются с помощью нежирного сухого молока, и СЭ81 (фиг. 11а) и ΗΕΑ-ΌΒ (фиг. 11Ь) детектируются посредством специфичного тАЬ с последующим детектированием с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Образцы количественно характеризуются с помощью хемилюминесцентного детектирования, и строится график как функция эквивалентности культуры клеток.
Фиг. 12. ΕΕΙ8Α препарата декзосом ΗΕΑ/ΌΒ (фиг. 12а, Ь) и МНС I (фиг. 12с, б). Препарат декзосом получают с помощью способов, описанных ранее. Супернатант культуры клеток (3,7 л) осветляют путем фильтрования, концентрируют путем ультрафильтрации, концентрируют путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахароза/Э2О и концентрируют с помощью обмена буферов путем ультрафильтрации/диафильтрации. Объем нормализуют, чтобы он представлял 1000х (1 мкл эквивалентность = 1 мл супернатанта) концентрацию исходного объема супернатанта.
Фиг. 12а: титрование анти-ΗΕΑ/ΏΒ с избытком экзосом. Фиг. 12Ь: титрование декзосом после ультрацентрифугирования в градиенте (УЦ-в градиенте плотности) и после диафильтрации в буфере для приготовления (2-ая УФ) с избытком анти-ΗΕΑ/ΏΚ Фиг. 12с: титрование анти-МНС Ι (гибридома НС-
10) с избытком декзосом. Фиг. 12б: титрование декзосомы А и В с избытком анти-МНС Ι.
Фиг. 13. Фиг. 13а: анализ декзосом с помощью проточной цитометрии на специфичные поверхностные рецепторы. Черные гистограммы иллюстрируют удельную интенсивность связывания флуоресцентно меченых антител, распознающих указанные рецепторы, и белые гистограммы показывают неспецифическое фоновое связывание.
Фиг. 13Ь. Как и для фиг.13а, за исключением того, что окрашивание осуществляется с использованием немеченых первичных антител с последующим флуоресцентным мечением вторичных антител,
- 9 005425 поскольку лактадгериновое антитело является недоступным для прямого флуоресцентного конъюгирования.
Фиг. 14. Суперантигенный анализ с использованием декзосомы с присоединенным 8ЕЕ. Декзосомы очищают и к ним присоединяют 8ЕЕ, как определено в примерах, а затем инкубируют вместе с сочетанием Т-лимфоцитов 1игка1 и клеток КфЕ Продукция 1Ь-2 измеряется с помощью ЕБ18А и изображается на графике как функция от количества молекул НЬА-ЭК на лунку, как определяется с помощью анализа НЬА-ЭК ЕЫ8А. Данные аппроксимируют с использованием 8-образной подгоночной кривой, и вычисленную дозу, половинную от максимальной эффективной дозы (ΈΌ50) используют как меру сильнодействия препарата декзосом.
Фиг. 15. В разбавленные порции декзосомы (показанные на рисунке в виде надписи) вводят 8ЕЕ и культивируют вместе с клетками 1шка1 и Кар с целью исследования сильнодействия препаратов декзосом. После извлечения из плотной части ступенчатого распределения Орйргер, каждый образец подвергается последовательному титрованию и исследуется в анализе клеток. Данные показывают, что после коррекции на разбавление каждого препарата декзосом регистрируется такой же уровень активности, как если смотреть на область кривых, приблизительно соответствующую половинной максимальной активности (приблизительно 350 пг/мл 1Ь-2) для диапазона от 0,7 до 50 мкл экзосом, что представляет собой диапазон приблизительно 100-кратного превышения того уровня, при котором анализ является линейным. Этот результат является неожиданным для такого анализа и делает такой анализ очень полезным при измерениях в широком диапазоне неизвестных препаратов декзосом.
Фиг. 16. Сравнение с помощью НЬА/ΌΚ ЕЬ18А комплексов экзосома/8ЕЕ, очищенных путем осаждения и зонального ультрацентрифугирования.
Фиг. 17. Связывание пептидов с декзосомами НЬА-А2+ (вверху) и НБА-А2- (ниже). Биотинилированный пептид сравнения используется при концентрации, указанной в надписи на фигуре, для нагрузки декзосом. Количество связанного пептида указано по оси у в единицах флуоресцентного Ей (отсчеты в секунду) как функция от анализируемого количества лизата декзосом (указанного в единицах мкл объема по оси х).
Фиг. 18. Нагрузка пептидом для различных буферов и значений рН. Биотинилированный пептид сравнения нагружается с использованием ацетатного или цитратного буфера при значении рН 3,2-5,2. Количество нагруженного пептида указывается по оси у в единицах отсчетов флуоресцентного Ей.
Фиг. 19. Декзосомы, обработанные слабой кислотой при значении рН 4,2 в Να-ацетатном буфере, сохраняют лучшую функциональную активность, чем декзосомы, обработанные лимонной кислотой при значении рН 4,2.
Декзосомы обрабатывают либо с помощью лимонной кислоты (буфер А), либо ацетата Να (буфер В), вводят в них суперантиген '8ЕЕ' и исследуют в функциональном анализе для оценки воздействия на биологическую активность декзосом, что измеряется по их способности выявлять секрецию 1Ь-2 эффекторными клетками. Секреция 1Ь-2 указывается по оси у как функция от объема декзосом.
Фиг. 20. в2-микроглобулин облегчает прямую нагрузку пептидами. Биотинилированный пептид сравнения нагружают при концентрациях в2-микроглобулина 0-80 мкг/мл. Количество связанного пептида указывается по оси у в единицах флуоресцентного Ей (отсчеты в секунду) как функция от концентрации в2-микроглобулина.
Фиг. 21. Насыщение связывания пептида сравнения с декзосомами. Биотинилированный пептид сравнения нагружают при концентрации 0-20 мкг/мл. Количество связанного пептида указывается по оси у в единицах флуоресцентного Ей (отсчеты в секунду) как функция от количества пептида сравнения.
Фиг. 22. Кинетика связывания пептида сравнения с декзосомами. Биотинилированный пептид сравнения нагружают при комнатной температуре в течение 0,5-4 ч. Количество связанного пептида указывается по оси у в единицах флуоресцентного Ей (отсчеты в секунду) как функция от времени инкубации пептида сравнения вместе с декзосомами.
Фиг. 23. Конкурентное связывание немеченого пептида сравнения, МАСЕ3, 4 и 10 с биотинилированным пептидом сравнения на декзосомах. 1-100х немеченого пептида сравнения, МАСЕ-3, 4 и 10 инкубируют вместе с биотинилированным пептидом сравнения (5 мкг/мл) с целью конкурентного связывания с декзосомами. Процент ингибирования указывается по оси у как функция от количества конкурирующего пептида.
Фиг. 24. Анализ клона Т-лимфоцитов с использованием декзосом, нагруженных Май-1.
Фиг. 25. Анализ клона Т-лимфоцитов с использованием декзосом, нагруженных Р1А. Κ&Ό представляет собой стандартный анализ с использованием 100 единиц 1Ь-2.
Фиг. 26. Сравнение связывания биотин-меченого пептида сравнения с декзосомами в ацетатном буфере при значении рН 4,8 и 5,2 в отсутствие бета-2-микроглобулина. Количество нагруженного пептида указывается по оси у в единицах отсчетов флуоресцентного Ей.
Фиг. 27. Декзосомы, обработанные слабой кислотой при значении рН 4,8 и 5,2 в Να-ацетатном буфере, сохраняют такую же функциональную активность, как и необработанные декзосомы. Декзосомы обрабатывают при значении рН 4,8 или 5,2 Να-ацетатом (буфер А), в них вводят суперантиген '8ЕЕ' и
- 10 005425 исследуют в функциональном анализе с целью оценки воздействия на биологическую активность декзосомы, которая измеряется по их способности выявлять секрецию 1Ь-2 эффекторных клеток. Секреция 1Ь2 указывается по оси у как функция от объема декзосом.
Фиг. 28. Конкурентное связывание МАСЕ 4 и 10 с биотинилированным пептидом сравнения на декзосомах. 5-20 х МАСЕ-4 и 10 инкубируют вместе с 100 мкг/мл биотинилированного пептида сравнения с целью конкурентного связывания с декзосомами при значении рН 4,8, в отсутствие бета-2микроглобулина. Процент ингибирования указывается над каждым столбиком как функция от количества конкурирующего пептида.
Фиг. 29. Конкурентное связывание МАСЕ 3 с биотинилированным пептидом сравнения на декзосомах. 5-20 х МАСЕ-3 инкубируют вместе с 100 мкг/мл биотинилированного пептида сравнения с целью конкурентного связывания с декзосомами при значении рН 4,8 в отсутствие бета-2-микроглобулина. Процент ингибирования указывается над каждым столбиком как функция от количества конкурирующего пептида.
Фиг. 30. Секреция ΙΕΝ-γ ЬТ 11, стимулируемая декзосомами, нагруженными пептидом Маг1-1. в отсутствие бета-2-микроглобулина. Клетки ЬТ 11 стимулируются декзосомами, нагруженными пептидом Маг1-1, в присутствии ОС как А-клеток, и секреция ΙΕΝ-γ ЬТ 11 указывается по оси у как функция декзосом. В качестве контроля Ехо 447 также нагружаются при значении рН 4,2 в присутствии бета-2микроглобулина.
Фиг. 31. Связывание (верхний график) и ингибирование (нижний график) рестриктированного пептида НЬА-А1 в присутствии бета-2-микроглобулина. Верхний график: рестриктированный биотинмеченый пептид НЬА-А1, МАСЕ-3С5, специфично связанный с декзосомами НЬА-А1+. Нижний график: связывание ингибируется немеченым пептидом МАСЕ-3 А1.
Фиг. 32. Конкуренция между рестриктированным биотин-меченым пептидом НЬА-А1/В35, МАСЕ3С5, и немеченым пептидом МАСЕ-3А1/В35 на декзосомах НЬА-В35+ (Ехо 426) в отсутствие бета-2микроглобулина.
Подробное орисание изобретения
Как показано выше, настоящее изобретение предусматривает новые способы и композиции для получения и/или характеризации мембранных везикул, которые являются пригодными при использовании в области фармации, например при иммунотерапии различных патологических состояний. Настоящее изобретение также указывает способы удаления агрегированного гаптоглобина из таких композиций, как среды, биологические продукты и тому подобное, которые могут использоваться в различных фармацевтических или экспериментальных областях.
Теперь будет приведено подробное описание различных стадий, которые могут быть использованы для приготовления мембранных везикул в соответствии с предпочтительными конкретными воплощениями настоящего изобретения. Необходимо понять, что настоящее изобретение не ограничивается способами, содержащими все эти стадии, но также включает в себя индивидуальные стадии сами по себе, как указано выше.
Блок-схема всего способа для приготовления мембранных везикул изображена на фиг. 1. Этот общий способ содержит несколько основных фаз, включая (ί) получение (биологического) образца, содержащего мембранные везикулы, (ίί) фазу накопления, (ίίί) разделение фаз в градиенте плотности, (ίν) фазу приготовления и кондиционирования, и (ν) фазу контроля качества или характеризации. Более того, настоящее изобретение также описывает способы удаления гаптоглобина из биологических материалов, таких как культуральные среды.
Удаление агрегированного гаптоглобина
Конкретный и важный аспект настоящего изобретения заключается в создании композиций, которые по существу не содержат таких частиц, как гаптоглобин (и родственные полимеры), более конкретно, агрегированного гаптоглобина. В частности, настоящее изобретение заключается в создании сред для культивирования клеток или биологических продуктов, таких как белки или полипептиды (или их производные), выделенные от биологических жидкостей (например, Й8А композиций, гамма иммуноглобулинов, факторов коагуляции, сывороток и тому подобное) или препаратов буферов, которые являются по существу не содержащими агрегированного гаптоглобина.
Гаптоглобин представляет собой сложный (альфа-бета)2 тетрамерный белок, содержащий два типа альфа цепей, альфа-1 (8,86 кДа) и альфа-2 (17,3 кДа), в различных сочетаниях). Как сообщается, гаптоглобин может формировать большой агрегированный белок при термической инактивации продуктов из сыворотки (Вю1ощса1 Еипсйопз о£ Нар1од1оЬш - Νο\ν Рюссз ίο ап Θ16 Ριιζζΐο. ОоЬгук/уска, Еиг. 1. С11п. Сйст. Вюсйст. 1997, 35(9), р. 647-654; 1ттипо5ирргс551тс ЕПес1 АссиР-Рйазс Всас1аи1 РгсЛспъ ίη νίΙΐΌ аиб ίΐ8 Кс1стапсс 1о Саиссг, К. 8атак с1 а1., Сапссг 1ттипо1 1ттипо1йсг 1982, 13, р. 38-43).
Более того, является известным, что гаптоглобин может проявлять иммуногенную активность (ЭоЬгу^уска, выше, Ой с1 а1., 1. №йюпа1 Сапссг 1п8Й1и1с 1990, 82(11), р. 934-940). Настоящее изобретение теперь учитывает принципиальную важность агрегированного гаптоглобина, который присутствует во
- 11 005425 многих биологических продуктах, и предлагает новые способы, которые предоставляют возможности для его удаления.
Более конкретно в контексте настоящего изобретения агрегированный гаптоглобин обозначает любую частицу, содержащую полипептид или цепь гаптоглобина, более предпочтительно поперечно сшитую с любым другим полипептидом или белком через 8-8 связь, например, в частности, любой смешанный агрегат полипептида гаптоглобина и альбумина. Такой агрегированный гаптоглобин может также содержать дополнительные компоненты, такие как гемогексин, трансферрин, Ос-глобулин и/или β2гликопротеин, как описано бепкеп с1 а1. (Уох 8аид 67, 1994, 125).
В то время как культуральные среды повсеместно используются как в исследовательских, так и в клинических применениях, проблема больших растворимых агрегированных белков (или частиц) в данной области не решена, и их удаление не обеспечивается. Настоящее изобретение теперь показывает, что агрегированный белок ΑΙΜ V очищается вместе с декзосомами при осаждении посредством ультрацентрифугирования. Более того, эта заявка показывает, что концентрация декзосом, генерируемая в ΑΙΜ V с помощью ультрафильтрации, приводят к концентрированию белков ΑΙΜ V. Более того, 8Ό8-ΡΑΟΕ (фиг.
3) концентрированных декзосом показывает 2 главных полосы при 42 кДа и 64 кДа, соответствующих βцепи гаптоглобина и альбумину.
Настоящее изобретение, таким образом, демонстрирует, что агрегированный гаптоглобин (включая субъединицы, поперечно сшитые цепи, агрегированные формы и тому подобное) находится в обычных средах для культивирования клеток млекопитающих. Настоящее изобретение дополнительно показывает, что агрегированный гаптоглобин не удаляется с помощью обычных способов очистки экзосом. Настоящее изобретение теперь предусматривает способы удаления частиц, более предпочтительно агрегированного гаптоглобина, из биологических материалов, таких как культуральные среды, биологические композиции, препараты буферов и тому подобное. Настоящее изобретение также предусматривает новые композиции материалов, которые являются по существу не содержащими агрегированного гаптоглобина, и их применение. Удаление (или понижение концентрации) большого агрегированного белка, такого как агрегированный гаптоглобин, предоставляет несколько значительных преимуществ, таких как повышение чистоты, повышение безопасности, понижение неспецифичной иммуносупрессивной активности и тому подобное. Более того, настоящее изобретение описывает, что культуральные среды, не содержащие агрегированного гаптоглобина, все еще предоставляют возможности для эффективного культивирования клеток и продукции экзосом, при этом значительно облегчая очистку экзосом. Удаление агрегированного белка из сред предоставляет дополнительную защиту против индуцирования нежелательных иммунных ответов на такие компоненты сыворотки, как гаптоглобин (ОоЬгукхуска. выше). В этом отношении предполагается, что агрегированный гаптоглобин может вызывать более нежелательный иммунный ответ, чем не агрегированный гаптоглобин, который, как уже известно, является иммуносупрессивным (8еКуиид Ой е1 а1 б. №111 Сапсег Ιπδΐ. 1990, 82, 934-940. Взаимодействие с иммунным ответом на уровне генерации эффекторных клеток связанного с опухолью гаптоглобина). Агрегированный белок, как известно, является в 10000 (десять тысяч) раз более иммуногенными, чем растворимые формы, поскольку они предпочтительно иммобилизуются антиген-презентирующими клетками (М. 1<оуас5О\зс5-Вапко\\ък| е1 а1 Ргос №111 Αсаά 8α υ8Α 1993, 90, 4942-4946. Эффективная презентация главным комплексом тканевой совместимости класса I экзогенного антигена при фагоцитозе макрофага). Итак, присутствие даже очень низкой дозы агрегированного гаптоглобина может быть нежелательным.
Кроме того, способы настоящего изобретения также предоставляют возможности для удаления других частиц, таких как экзосомы, которые могут присутствовать в содержащих сыворотку культуральных средах. Удаление присутствующих ранее экзосом дополнительно увеличивает очистку продуктов и прекращает загрязнение с помощью других иммунно-стимулирующих агентов.
Способ удаления
Различные способы могут использоваться для удаления частиц (например, агрегированного белка, более конкретно, агрегированного гаптоглобина) в соответствии с настоящим изобретением, такие как (ультра) фильтрация, микрофильтрация, эксклюзионная хроматография (8ЕС), аффинная хроматография, ионобменнная хроматография и ультрацентрифугирование. Может также быть возможным удаление агрегированного белка в компоненте сыворотки человека (то есть фракции V) с помощью этих способов перед приготовлением вместе со средой.
В предпочтительном воплощении среду или композицию обрабатывают путем ультрафильтрации для удаления агрегированного белка или других частиц, более конкретно агрегированного гаптоглобина.
В конкретном воплощении ультрафильтрация осуществляется с использованием 500 кДа мембраны в виде полого волокна. Это представляет собой предпочтительный порог по молекулярной массе (М^СО) для этого применения, так как белки, такие как трансферрин (приблизительно 75-80 кДа), должны проходить через мембрану. Измерение концентрации трансферрина с помощью ЕЫ8Л показывает, что он количественно проходит через поры этого размера. Этот размер мембраны задерживает агрегированный белок в удерживаемом материале, в то же время давая возможность не агрегированным бел
- 12 005425 кам проходить вместе с пермеатом. Пермеат собирают, фильтруют в стерильных условиях через 0,22 мкм фильтр в бутылки и хранят при 4°С до тех пор, пока их не используют.
В то время как мембрана с Μ\νθϋ 500 кДа в виде полого волокна является предпочтительной для ультрафильтрации культуральной среды, могут использоваться также и мембраны с другими размерами, такие как 750 кДа, 300 кДа, 100 кДа и тому подобное. Предпочтительно, среда подвергается ультрафильтрации с помощью мембраны, имеющей диаметр, находящийся в пределах между 100 кДа и 1000 кДа, более предпочтительно между 200 кДа и 750 кДа. В этом отношении, авторы в настоящее время определили, что 90% агрегированного гаптоглобина, присутствующего в культуральных средах или других биологических продуктах, таких как нагретая сыворотка альбумина, имеют диаметр, находящийся в пределах между примерно 40 и примерно 200 нм, как измеряется с помощью динамического рассеяния света. Соответственно, любая мембрана (или другое разделительное устройство, такое как фильтры, полые волокна и тому подобное), имеющая диаметр пор ниже примерно 40 нм, является пригодной для использования при осуществлении и предпочтительной для осуществления настоящего изобретения. В качестве иллюстрации, Μ\νθϋ 500 кДа обеспечивает диаметр поры, находящийся в пределах между примерно 20 и 25 нм.
Также, в то время как формат мембраны в виде полого волокна представляет собой предпочтительное воплощение для ультрафильтрации, могут использоваться и другие типы устройств для ультрафильтрации в формате кассеты (то есть планшета или рамочной кассеты), такие как МгШроге Рейсоп и родственные продукты, а также кассеты от Зайопик 1пс или П11гоп1С5 1пс. Материал мембраны, как правило, состоит из полиэфирсульфона (РЕЗ), однако могут быть использованы также и другие материалы, такие как полипропилен.
Кроме того, при ультрафильтрации сред может использоваться большой диапазон рабочих параметров. Типичными рабочими параметрами являются такие, что входное и выходное давление находятся в пределах между 5-15 фунт/кв.дюйм для оптимальной обработки. Во время обработки может использоваться и гораздо более низкое или высокое давление.
В другом конкретном воплощении среду обрабатывают с помощью микрофильтрации (0,05 мкм, 0,1 мкм, 0,2 мкм и тому подобное) для удаления частиц (например, агрегированного белка). Предпочтительный диаметр просвета волокна составляет 0,5 мм, однако могут также использоваться и другие диаметры, такие как 0,25 мм, 0,75 мм, и 1 мм.
Эти различные обработки предоставляют возможности для получения сред или биологических продуктов с пониженным содержанием частиц, которые, как теперь показано, значительно облегчают очистку экзосом, а также улучшают качество полученного препарата.
Среда, не содержащая агрегированного гаптоглобина
В конкретном аспекте настоящее изобретение, таким образом, основывается на использовании предварительно обработанных культуральных сред, имеющих пониженное содержание частиц, а также композиций материалов, содержащих такие предварительно обработанные среды. В самом деле, как теперь показано, предварительная обработка сред для понижения содержания белковых частиц (или агрегированного белка) значительно понижает присутствие загрязняющих веществ в процессе, повышает эффективность способа, предоставляет возможность для получения препаратов экзосом с высокой чистотой и безопасностью и не воздействует на эффективность культуры или жизнеспособность клеток.
Соответственно, в конкретном воплощении настоящего изобретения мембранные везикулы приготавливают из биологических образцов, полученных с помощью культивирования клеток в культуральной среде с пониженным содержанием частиц (или агрегированного белка).
Более того, другая цель настоящего изобретения заключается в способе получения дендритных клеток, содержащих культивированные предшественники дендритных клеток, в среде, содержащей факторы роста и/или цитокины для воздействия на различные указанные предшественники или для стимулирования их дифференциации в дендритные клетки, в частности, в незрелые дендритные клетки, где среда имеет пониженное содержание частиц, более предпочтительно, является по существу не содержащей агрегированного гаптоглобина.
Настоящее изобретение также распространяется на композицию, содержащую дендритные клетки (или любые другие клетки, продуцирующие мембранные везикулы) в культуральной среде с пониженным содержанием таких частиц, как агрегированный гаптоглобин, более конкретно, в среде, которая является по существу не содержащей агрегированного гаптоглобина.
Культуральная или продуцирующая среда может быть любой средой, пригодной для использования при культивировании клеток млекопитающих, в частности клеток человека. Примеры таких сред включают в себя А1М V, КРМ1, ΌΜΕΜ и тому подобное, более обычно, любую среду для культивирования клеток млекопитающего, содержащую белки (или сыворотку, или ее замену). Предпочтительные среды включают в себя бессывороточные среды, которые являются пригодными для использования при клинических применениях.
Термины по существу не содержащий, не содержащий или пониженное содержание в... агрегированного гаптоглобина указывают на то, что среда или продукт предпочтительно содержат меньше, чем 1 м.д. агрегированного гаптоглобина, более предпочтительно меньше, чем 0,5 м.д. агрегированного
- 13 005425 гаптоглобина. Более конкретно, как теперь определили авторы, с помощью 8Ό8 РАСЕ и ЕЬ18А свыше 99% агрегированного гаптоглобина может быть удалено из таких биологических продуктов, как среды А1М V. Более конкретно, культуральная среда является по существу не содержащей частиц (включая агрегированный белок, преципитаты и тому подобное), имеющих диаметр свыше 100 нм. В дополнительном предпочтительном воплощении среда является по существу не содержащей частиц (включая агрегированный белок, преципитаты и тому подобное), которые не проходят через 500 кДа мембрану. Более предпочтительная культуральная среда настоящего изобретения представляет собой культуральную среду, которая содержит менее чем примерно 20 нг/мл, более предпочтительно, менее, чем примерно 10 нг/мл агрегированного гаптоглобина, как определяется с помощью ЕЫ8А (с использованием, например, моноклонального антитела Н6395 81дта). Более того, необходимо заметить, что присутствие агрегированного гаптоглобина является, как правило, незаметным до тех пор, пока среды не концентрируются (с помощью ультрацентрифугирования или ультрафильтрации). Предпочтительные среды настоящего изобретения, таким образом, не содержат агрегированного гаптоглобина, как измеряется с помощью анализов 8Ό8 РАСЕ и ЕЫ8А.
Биологические продукты, не содержащие агрегированного гаптоглобина
Настоящее изобретение является также пригодным для использования при получении композиций биологических продуктов (например, продуктов крови), которые являются по существу не содержащими агрегированного гаптоглобина, а также для обработки различных буферных растворов перед приготовлением продуктов для фармацевтических применений.
В этом отношении настоящее изобретение относится к композиции, содержащей биологический полипептид или его производное, который является по существу не содержащим агрегированного гаптоглобина. Более конкретно, настоящее изобретение заключается в композиции, содержащей термически инактивированный биологический полипептид, который является по существу не содержащим агрегированный гаптоглобин. Биологический полипептид может быть любым полипептидом, белком или пептидом, выделенным (или экстрагированным) из биологической жидкости млекопитающего, в частности, из крови, сыворотки или плазмы. Предпочтительные примеры биологических полипептидов включают в себя сывороточный альбумин, гамма иммуноглобулин, факторы коагуляции (например, фактор VIII, фактор IX), более предпочтительно происходящие от человека. Композиция по настоящему изобретению еще более предпочтительно характеризуется как содержащая менее чем примерно 0,01%, в особенности, менее чем примерно 0,001% агрегированного гаптоглобина.
В конкретном примере настоящее изобретение относится к композиции термически инактивированного сывороточного альбумина, более предпочтительно сывороточного альбумина человека, по существу не содержащего агрегированного гаптоглобина. Очищенный 18А широко используется в фармацевтической промышленности (компонент плазмы, агент, стабилизирующий белок и тому подобное). Присутствие гаптоглобина в растворе 118А. как показано, является ответственным за образование агрегатов во время термической обработки. Более того, агрегированные белки, видимо, являются, по меньшей мере, в десять тысяч раз более иммуногенными, чем их не агрегированные формы, так что их присутствие может быть вредным для активности и безопасности препарата. Настоящее изобретение теперь предоставляет возможности для удаления любого такого агрегированного гаптоглобина из препаратов 118А, более конкретно, с помощью ультрафильтрации, как описано выше, при этом создавая новые композиции 18А с высокой чистотой и качеством для фармацевтического применения. Более конкретно, настоящее изобретение теперь предусматривает препараты 18А, которые содержат менее чем примерно 0,01 мас.% агрегированного гаптоглобина, еще более предпочтительно менее чем примерно 0,001 мас.% Конкретные примеры, описанные в этой заявке, демонстрируют, что по настоящему изобретению могут быть получены препараты альбумина, содержащие примерно 0,00025 мас.% агрегированного гаптоглобина или менее. Более предпочтительно, препараты альбумина (или композиции) настоящего изобретения являются нагретыми препаратами (или композициями) 18А, главным образом, для фармацевтического применения.
Настоящее изобретение также заключается в способе обработки биологического продукта, более предпочтительно термически инактивированного биологического продукта, в порядке понижения количества агрегированного гаптоглобина, содержащегося в нем, способ включает в себя воздействие на продукт фильтрования, более предпочтительно ультрафильтрации.
Конкретный объект настоящего изобретения также заключается в способе приготовления биологического продукта, включающего в себя (ί) термическую инактивацию биологического продукта и (и) фильтрование термически инактивированного биологического продукта. Более предпочтительно, способ дополнительно включает в себя стадию (ίίί) концентрирования отфильтрованного, термически инактивированного биологического продукта и/или (ίν) его кондиционирования. Способ может использоваться для различных биологических продуктов, включая любой белок или полипептид (или их производные), выделенные (или экстрагированные) из биологических жидкостей млекопитающих, таких как кровь человека, или плазма, или сыворотка. Как будет дополнительно показано в этой заявке, этот способ предоставляет возможность впервые для получения термически инактивированных биологических продуктов, имеющих пониженное содержание агрегированного гаптоглобина, более предпочтительно по суще
- 14 005425 ству не содержащих агрегированного гаптоглобина и, таким образом, с повышенной безопасностью. Способ является, в частности, пригодным для использования при приготовлении фармацевтических белков, экстрагированных из крови или плазмы, таких как сывороточный альбумин, более предпочтительно сывороточный альбумин человека, гамма иммуноглобулин, факторы коагуляции и тому подобное. Стадия фильтрования включает в себя предпочтительно ультрафильтрацию, еще более предпочтительно со значением Μ\νί'Ό. находящимся в пределах между примерно 100 кДа и примерно 1000 кДа, как правило, между 200 и 750 кДа. Фильтрование может проводиться в любом устройстве и при любых условиях, как описано выше. Более того, могут также быть использованы способы, альтернативные тому, что описано выше.
В этом отношении, настоящее изобретение также относится к способам обработки препаратов альбумина, включающих в себя воздействие на препарат альбумина фильтрации, предпочтительно ультрафильтрации. Более предпочтительный способ заключается в обработке нагретой композиции (или препарата) 118А с помощью ультрафильтрации в пористом устройстве, имеющем средний диаметр пор, находящийся в пределах между 200 и 750 кДа. Поскольку большие количества Н8А используются в фармацевтической области, предлагаемые авторами способ и композиции более высокого качества представляют собой значительное преимущество с точки зрения безопасности.
Получение образца
Как показано выше, настоящее изобретение относится к получению мембранных везикул и является пригодным для использования при приготовлении мембранных везикул из различных источников, включая мембранные везикулы, полученные с помощью антиген-презентирующих клеток (таких как макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты), клетки опухоли или любые другие клетки, или линии клеток, продуцирующих мембранные везикулы. Оно является, в частности, пригодным для использования при приготовлении мембранных везикул, полученных из дендритных клеток, предпочтительно незрелых дендритных клеток (то есть, декзосом). Более того, мембранные везикулы или соответствующие продуцирующие клетки могут быть сенсибилизированы по отношению к одному или несколько антигенам до, во время или после приготовления.
Культура клеток моноцитов
Различные способы получения биологических образцов, содержащих декзосомы или другие мембранные везикулы, описаны в νθ 99/03499, включенной сюда в качестве ссылки.
Предпочтительная методология в рамках настоящего изобретения основана на получении дендритных клеток (ЭС) из предшественников моноцитов или клеток костного мозга, более предпочтительно, незрелых ОС. В самом деле, авторы показывают, что незрелые ОС имеют способность к продуцированию экзосом, в то время как зрелые ОС, по существу, не могут этого делать. Более конкретно, в рамках настоящего изобретения является предпочтительным использование композиции незрелых дендритных клеток, полученных с помощью обработки предшественников моноцитов (содержащихся в крови или костном мозге) в присутствии комбинации цитокинов, более предпочтительно в отсутствие фактора или условий для созревания ОС и/или в течение периода времени, который не предоставляет возможности для созревания ОС.
Композиции незрелых дендритных клеток предпочтительно содержат в основном (то есть, по меньшей мере, 60%, предпочтительно 70%), незрелые дендритные клетки.
Следовательно, стадия приготовления дендритных клеток преимущественно включает в себя приготовление композиции незрелых дендритных клеток, в частности происходящих от человека, главным образом, из предшественников моноцитов, более конкретно с помощью обработки с помощью комбинации цитокинов, таких как СМ-С8Р+1Ь-4 или СМ-С8Р+1Ь-13, в отсутствие факторов созревания и/или в средах, не содержащих сыворотки, для предотвращения созревания.
Кроме того, в рамках настоящего изобретения, является также возможным использование иммортализованных популяций дендритных клеток. Они могут состоять из иммортализованных линий дендритных клеток (например, линии Ό1 или любой другой линии, полученной, например, с помощью введения тус онкогена в дендритные клетки). Они могут также состоять из дендритных клеток, приготовленных и иммортализованных ίη νίίτο. Представляющие интерес иммортализованные дендритные клетки лежат в банках замены клеток, сенсибилизированных по отношению к данным группам антигенов, которые могут быть использованы в промышленных масштабах для приготовления декзосом, совместимых при введении целым семьям пациентов.
Для получения мембранных везикул (декзосом) популяция незрелых дендритных клеток может просто культивироваться при обычных условиях, известных специалисту в данной области. Однако является предпочтительным культивирование этих клеток согласно условиям, стимулирующим продуцирование декзосом, в частности в присутствии факторов, способных к стимулированию продуцирования декзосом, в частности цитокинов, таких как гамма интерферон, интерлейкин 10 или интерлейкин 12 (например, смотри заявку νθ 99/03499). В предпочтительном воплощении процесса в соответствии с настоящим изобретением популяцию незрелых дендритных клеток культивируют в соответствии с условиями, стимулирующими продуцирование мембранных везикул. Предварительные эксперименты пока
- 15 005425 зывают, что добавление интерферона гамма повышает эффективность декзосом ίη νί\Ό в преклинических моделях опухолей мышей. В день 7 среды собирают для последующего выделения декзосом.
В конкретном воплощении настоящего изобретения образцы периферической крови пациента культивируют в АБМ V клинического качества, бессыворотночной среде для культивирования клеток (Ьйё Тес11по1од1е5, Шс). Перед использованием культуральная среда подвергается ультрафильтрации для удаления агрегированных белков (например, гаптоглобина), удаление которого, как показано авторами, не воздействуют на рост клеток, но значительно способствует последующему выделению чистых декзосом.
Является понятным, что мембранные везикулы могут быть приготовлены с помощью любого другого метода и использоваться в настоящем изобретении. В частности, мембранные везикулы могут быть получены искусственно или с помощью иммортализованных линий клеток, или получены из предварительно созданных коллекций или банков.
Сенсибилизация клеток или везикул. Нагрузка антигена
Клетки, продуцирующие мембранные везикулы (например, дендритные клетки), могут быть сенсибилизированы по отношению к антигену до (или во время) получения мембранной везикулы. Альтернативно, мембранные везикулы могут быть сенсибилизированы сами по себе. Это воплощение дает возможность получения везикул с заданной иммуногенностыо. Сенсибилизация может быть осуществлена с использованием различных хорошо известных технологий, включающих в себя, например, размещение клеток в контакте с антигенными пептидами, антигенами, комплексами белков, клетками или мембранами клеток, экспрессирующих антигены, апоптическими частицами, мембранными везикулами, липосомами, РНК опухоли или любой нуклеиновой кислотой, кодирующей один или несколько антигенов, антигенных детерминантов или эпитопов (возможно переносимых вирусным или невирусным вектором) и тому подобное (например, смотри заявку XVО 99/03499). Альтернативно, сенсибилизация может быть осуществлена путем непосредственной нагрузки везикул пептидами, то есть путем размещения везикул в контакте с антигенными пептидами. В самом деле, настоящая заявка показывает, что непосредственная нагрузка везикул пептидами является возможной и обеспечивает повышение иммуногенности для везикул. В предпочтительном способе, сенсибилизацию выполняют путем инкубирования полученных клеток с пептидами, антигенами, РНК или нуклеиновыми кислотами, или путем непосредственной нагрузки везикул пептидами. Является понятным, что эта заявка не является ограниченной методиками сенсибилизации или продуцирования.
Многие антигены могут использоваться для сенсибилизации дендритных клеток (или мембранных везикул), путем соприкосновения клеток (или везикул) с указанными антигенами, соответствующими белками, пептидами, нуклеиновыми кислотами и тому подобное. Предпочтительные антигены представляют собой опухолевые антигены, вирусные антигены, бактериальные антигены и тому подобное. Типичные опухолевые антигены включают в себя антигены меланомы МАСЕ, МАКТ, ВАСЕ и тому подобное), простата-специфичные антигены (например, Р8МА), СЕА, гка, р53, КЬ, антигены опухоли печени и тому подобное.
Белковые антигены нарабатываются внутри дендритных клеток (ОС) к конкретным пептидам, которые затем иммобилизуются с помощью молекул МНС для презентирования на поверхности клетки. Для данного белка ОС человека с различными гаплотипами НЬА презентируют различные пептиды (эпитопы). Участвующие в процессе пептиды могут быть нагружены на МНС ОС класса I путем инкубирования ОС и пептидов при соответствующих условиях. Является также возможным нагружать антигены непосредственно на выделенные декзосомы ίη уйго. В конкретном примере, пептиды МАСЕ-А3 и -А4, содержащие эпитопы для НБА-А2, синтезируют для использования при нагрузке декзосом пациента. Критерии включения для пациента в этом эксперименте включают в себя экспрессию гаплотипа НБАА2. Гаплотип НЬА А2+ встречается относительно часто, являясь представленным приблизительно у 50% человеческой популяции.
Более того, также могут быть добавлены контрольные антигены, такие как ТТ (столбнячный токсин) и пептиды СМУ, в частности пептид ТТ Р2. Целью контрольных антигенов является служить в качестве внутреннего контроля для исследования функционирования декзосомы при презентировании антигена с использованием известных антигенов. Следовательно, в качестве положительного контроля декзосомы также нагружаются, например, пептидом СМУ (класс I) и пептидом ТТ Р2 (класс II). Положительный ответ при таком контроле показывает, что декзосомы являются активными. СМУ имеет то преимущество, что обеспечивает исследование как исходной, так и вызванной реакции на антиген, поскольку приблизительно 50% от всей популяции имеют иммунитет по отношению к СМУ (вызванный), а остальные - нет (исходный).
Другие антигены представляют собой липидные антигены, такие как любой липид, гликолипид или липопротеин, презентируемый иммунной системе с помощью молекул СЭ1. Липид может быть любым микробным липидом, микробным гликолипидом, липидом или гликолипидом опухолевых антигенов и тому подобное. Конкретные примеры липидов включают в себя микобактериальные липиды, такие как миколевые кислоты, глюкоза мономиколят, гексоза-1-фосфоизопреноиды и производные липоарабиноманнана (БАМ), такие как фосфатидилинозитол маннозиды. Другие примеры включают в себя сами керамиды, такие как ганглиозиды, антигены гликолипидов опухоли и тому подобное.
- 16 005425
Пример 3 описывает ниже предварительные результаты, полученные на модельной системе для нагрузки и анализа пептида (антигена) СМУ на дендритных клетках и декзосомах. Результаты демонстрируют способность нагруженных везикул к стимулированию антиген-специфичных СТЬ (фиг. 2).
Необходимо понять, что и любой другой способ сенсибилизации и антиген (антигены) могут использоваться в настоящем изобретении для придания желаемых иммуногенных свойств мембранным везикулам.
В этом отношении настоящее изобретение также описывает способ непосредственной нагрузки мембранных везикул, например, декзосом. Способ может быть осуществлен с использованием пептидов или липидов класса I или класса II и обеспечивает значительные преимущества по сравнению с известными методиками. В частности, как иллюстрируется в примерах, непосредственная нагрузка является более эффективной, чем известная непосредственная нагрузка, в том, что могут быть получены более высокие доли занятых рецепторов НЬА на поверхности при использовании более низкого количества пептида. Это четко увеличивает иммуногенный потенциал мембранных везикул. Кроме того, структура нагруженного пептида может контролироваться более прецизионно, так как пептиды, нагруженные красителем, не обрабатываются целыми клетками и, таким образом, остаются интактными и не модифицированными при нагрузке. Настоящее изобретение теперь предлагает и демонстрирует впервые, что непосредственная нагрузка может быть осуществлена с использованием очищенных мембранных везикул, таких как декзосомы. В этом отношении настоящее изобретение описывает, что мембранные везикулы выдерживают условия низких значений рН без потери их активности и функциональности. Настоящее изобретение также описывает конкретные условия, дающие возможность усовершенствования непосредственной нагрузки. Настоящее изобретение, в частности, показывает, что обычные буферные среды, используемые для опосредованной нагрузки (то есть при нагрузке целой клетки), могут преимущественно быть заменены различными буферными средами для повышения эффективности непосредственной нагрузки и с целью получения более высоких долей покрытия, указывая на то, что везикулы не ведут себя как целые клетки. Настоящее изобретение также показывает впервые, что в противоположность целым клеткам мембранные везикулы могут выдерживать длительные кислотные обработки или среды, при этом давая возможность непосредственной нагрузки путем замещения, даже в отсутствие добавленного в2-т.
В первом варианте способ непосредственной нагрузки пептидов включает в себя стадию (ί) воздействия на выделенные или очищенные мембранные везикулы выбранной кислой средой и (ίί) взаимодействия мембранных везикул (ί), предпочтительно во время или после нейтрализации, с выбранным пептидом, в присутствии бета-2-микроглобулина, таким образом, что указанный пептид нагружается на указанные мембранные везикулы. В дополнительном предпочтительном воплощении, выбранный пептид представляет собой пептид антигена опухоли, презентируемый с помощью молекулы класса I, то есть рестриктированного пептида опухоли класса-Ь
В этом первом варианте мембранные везикулы (например, декзосомы) сначала подвергаются воздействию выбранной кислой среды. Это кислотное элюирование удаляет, по меньшей мере, часть эндогенных пептидов и бета-2-микроглобулина ф2-т), связанного с молекулами НЬА класса I или класса II на поверхности везикул, без изменения биологических и иммунологических свойств экзосом. Эта обработка является преимущественной, так как она предотвращает или понижает вторичные иммунные ответы, направленные против эндогенных пептидов. Как определено авторами, выбранная кислая среда или обработка предпочтительно включает в себя воздействие везикул со средой при значении рН, находящимся в пределах между 2 и 6, более предпочтительно между 3 и 5,5. Настоящая заявка, в самом деле, показывает, что экзосомы могут обрабатываться при таких кислотных значениях рН и все еще сохранять свои биологические свойства. В частности, настоящая заявка неожиданно показывает, что экзосомы могут подвергаться обработке слабой кислотой, нейтрализации и нагрузке желаемыми пептидами и при этом все еще демонстрировать способность к стимулированию эффективного иммунного ответа против желаемых пептидов. Среда может дополнительно содержать любой пригодный для использования буферный раствор, такой как цитратный, ацетатный и тому подобное. В этом отношении авторы показывают, что наиболее предпочтительная среда содержит ацетат натрия, который обеспечивает улучшение рабочих характеристик нагрузки по сравнению с обычным цитратным буфером. Выбранные среды могут быть получены из любой обычной культуральной среды или среды роста и приготовлены путем создания в ней условий буфера с целью достижения такого значения рН, как описано. Среды могут быть также искусственными или определенными с использованием различных буферных пищевых добавок согласно способам, известным в данной области. По существу, выбранные кислые среды в соответствии с настоящим изобретением обозначают любую культуральную среду, среду роста, кондиционирующий или другой жидкий раствор или буфер, дающий возможность поддержания мембранных везикул, раствор, имеющий значение рН, как описано выше, и предпочтительно содержащий ацетат, например ацетат натрия.
Обработка слабой кислотой осуществляется при низкой температуре, как правило, ниже 8°С, предпочтительно примерно при 4°С в течение периода времени в основном 15 мин или меньше, предпочти
- 17 005425 тельно 10 мин или меньше, еще более предпочтительно 5 мин или меньше. Необходимо понять, что условия обработки (среда, значение рН, температура, длительность и тому подобное) могут устанавливаться специалистом в данной области без отклонения от настоящего изобретения с использованием концепции настоящей заявки и примеров.
Нейтрализация может быть осуществлена в соответствии с обычными способами путем увеличения значения рН раствора. Нейтрализация предпочтительно приводит к получению среды с значением рН, превышающим 5,5, как правило находящимся в пределах между примерно 6 и примерно 9. Нейтрализация, как правило, осуществляется путем добавления к среде нейтрализующей среды со значением рН примерно 10 или 11, например, раствора Трис-буфера.
Взаимодействие пептида и экзосом должно осуществляться при условиях, достаточных для предоставления возможности пептидам для связывания молекул МНС на поверхности экзосом. Как правило, экзогенный (класса Ι) пептид и β2-ιη добавляют во время нейтрализации или после нее, предпочтительно в избытке, чтобы облегчить восстановление НЬА класса Ι после формирования комплексов с пептидом и β2-ιη таким образом, чтобы пептид был нагружен. Не является необходимым устранение диссоциированных эндогенных пептидов перед нейтрализацией или удаление несвязанных пептидов после взаимодействия. Как правило, может использоваться от 0,005 до 50 мкг/мл экзогенного пептида (предпочтительно от 0,01 до 10 мкг/мл) и от 1 до 80 мкг/мл β2-ιη. Пептид и β2-ιη могут быть получены путем различных технологий, таких как рекомбинантное продуцирование, синтез и тому подобное. Необходимо понять, что β2-ιη предпочтительно является происходящим от человека ф2-т человека является коммерчески доступным (81дта) и может быть получен с помощью обычных технологий). Взаимодействие может быть осуществлено в течение вплоть примерно до 2 ч, например, при комнатной температуре. Примеры показывают, что насыщение происходит самое раннее через 30 мин после взаимодействия. Используя ТКЕ с биотинилированным пептидом сравнения, авторы могут определить количество пептида, непосредственно нагруженного на декзосомы, и демонстрируют, что существует конкурентное связывание между меченым пептидом сравнения и немечеными целевыми пептидами, что указывает на то, что непосредственная нагрузка целевых пептидов на декзосомы является успешной. Декзосомы, нагруженные таким путем пептидом Маг1-1 при концентрациях не выше 0,1 мкг/мл, четко и воспроизводимым образом стимулируют специфичный по отношению к МаП-1 клон СТЬ ЬТ 11 к продуцированию ΙΤ-2 (пример 12).
В другом варианте способ не требует использования бета-2-микроглобулина. В самом деле авторы показывают, что является возможным определение пригодных для использования условий с целью удаления эндогенных пептидов без значительного удаления или дестабилизации эндогенного β2-ιη, так что непосредственная нагрузка является возможной даже без использования экзогенного β2-ιη. В этом предпочтительном варианте способ включает в себя стадии (ί) взаимодействия выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом или липидом класса Ι в отсутствие бета-2микроглобулина, (ίί) воздействия на смесь после (ί) выбранной кислотной обработкой при условиях, дающих возможность пептиду или липиду для образования комплекса с молекулой НЬА класса Ι на поверхности указанной мембранной везикулы, и (ίίί) сбора нагруженных мембранных везикул. Более предпочтительно, стадия (ίί) включает в себя воздействие на смесь обработки слабой кислотой при значении рН, находящемся в пределах примерно между 4 и 5,5, в течение менее чем 2 ч, еще более предпочтительно, примерно между 4,2 и 5,2, в течение менее чем 1 ч. Это воплощение является преимущественным, так как требует меньших обработок и не существует потребности в экзогенном β2-ιη, что уменьшает стоимость, объем работы и возможные проблемы, связанные с продуктами, получаемыми от людей как доноров. В этом воплощении не содержащая бета-2-микроглобулина выделенная или очищенная мембранная везикула, как правило, взаимодействует с избытком экзогенного пептида, например с 5-500 мкг/мл рестриктированного пептида класса Ι, в отсутствие бета-2-микроглобулина. Во время взаимодействия при соответствующих условиях, описанных выше, нагрузка осуществляется путем замещения эндогенных соединений, связанных с антиген-презентирующими молекулами (например, МНС класса Ι или ΙΙ, для пептидов, и 0Ό1, для липидов) с помощью представляющего интерес пептида или липида (процесс обмена). Этот обмен становится возможным или достаточным из-за наличия выбранных кислотных условий, определенных авторами. Обмен также становится возможным благодаря тому, что авторы продемонстрировали, что мембранные везикулы, такие как экзосомы, выдерживают долговременное соприкосновение с кислотой, в противоположность целым клеткам, и могут, таким образом, подвергаться воздействию определенной кислотной обработки, достаточной для облегчения стадии замещения без добавления экзогенного β2-ιη. После осуществления обмена или замещения, обычно по прошествии от 15 до 30 мин (или более, если необходимо, или меньше, в зависимости от условий), нагруженные везикулы могут быть стабилизированы путем увеличения значения рН раствора, при этом обмен блокируется. Нейтрализация может быть осуществлена так, как определено выше.
Как показано выше, способ может быть осуществлен с использованием различных иммуногенных соединений, таких как пептиды или липиды. Пептиды являются предпочтительно пептидами, презентируемыми с помощью молекул класса Ι или класса ΙΙ, то есть пептидами, которые получают в результате
- 18 005425 обработки антигенов антиген-презентирующими клетками, такими как дендритные клетки и макрофаги, и В-лимфоциты. Предпочтительный класс пептидов представлен в виде рестриктированных пептидов класса I, еще более предпочтительно рестриктированных пептидов опухоли класса-1, то есть пептидов, полученных из антигенов опухоли, которые презентируются иммунной системе с помощью дендритных клеток или макрофагов. Необходимо понять, что способ может быть осуществлен с использованием выделенных пептидов или их смесей, таких как элюаты пептидов клеток опухоли или других сочетаний пептидов. Конкретные примеры липидов включают в себя бактериальные липиды и гликолипиды антигенов опухолей, как описано выше.
Пример 12 ниже описывает результаты непосредственной нагрузки декзосом. Результаты демонстрируют способность нагруженных везикул к стимулированию антиген-специфичных СТЬ.
Обогащение образца
Как показано выше, образец (например, супернатант, лизат, биологическая жидкость и тому подобное) может быть подвергнут воздействию стадии обогащения, которая может включать в себя одну или несколько стадий центрифугирования, осветления, ультрафильтрации, нанофильтрации, аффинной хроматографии и/или диафильтрации. В конкретном воплощении стадия обогащения включает в себя (1) удаление клеток и/или остатков клеток (осветление), возможно с последующей (и) стадией концентрирования и/или диафильтрации. Предпочтительная стадия обогащения в соответствии с настоящим изобретением включает в себя (1) удаление клеток и/или остатков клеток (осветление), (и) концентрирование и (ш) диафильтрацию.
Осветление образца
Клетки и/или остатки клеток могут быть удалены путем центрифугирования образца, например, при низкой скорости вращения, предпочтительно ниже 1000 д, например в пределах между 100 и 700 д. Предпочтительными условиями центрифугирования во время этой стадии является ускорение приблизительно 300 или 600 д в течение периода, например, в пределах между 1 и 15 мин.
Предпочтительно, клетки и/или остатки клеток удаляются с помощью фильтрации образца, возможно в сочетании с центрифугированием, описанным выше. Фильтрация может, в частности, быть осуществлена путем последовательных фильтраций с использованием фильтров с пониженной пористостью. Для этой цели предпочтительно используются фильтры с пористостью выше 0,2 мкм, например между 0,2 и 10 мкм. Является, в частности, возможным использование последовательности фильтров с пористостью 10, 1, 0,5, а затем 0,22 мкм.
Культуральные среды для клеток фильтруют с помощью микрофильтрации через одноразовый 0,8 мкм пакетный фильтр, состоящий из ацетата целлюлозы, для удаления клеток и остатков. Пакет для микрофильтрация является одноразовым. Схема процесса показана на фиг. 5. Минимум из 10 экспериментов показывает, что емкость микрофильтра с площадью поверхности, например, 500 см2 является достаточной для фильтрования супернатантов культур дендритных клеток объемом от 2,5 л до более чем 4 л. Если необходимо, может использоваться и большая площадь поверхности (например, 1000 см2) в зависимости от количества остатков в суспензии.
Другие размеры пор: 2, 1, 0,65, 0,45 мкм и тому подобное, также могут использоваться для разделения при осветлении клеток и остатков клеток от декзосом. Микрофильтр может содержать предварительный фильтр, например 0,8 мкм 8айос1еаи СА (8айогш5 Шс.) содержит предварительный фильтр 3,0 мкм ацетата целлюлозы. Более того, фильтр может состоять из других материалов, кроме ацетата целлюлозы, таких как полипропилен или полиэфирсульфон (РЕ8).
Другие способы, которые могут использоваться для удаления клеток и остатков из декзосом, представляют собой центрифугирование при низкой скорости вращения, непрерывную проточную микрофильтрацию через полое волокно и хроматографию.
Концентрирование
Может быть осуществлена стадия концентрирования в порядке уменьшения объемов образца, который должен быть обработан на стадии центрифугирования в градиенте плотности. Таким образом, концентрирование может быть осуществлено путем центрифугирования образца при высоких скоростях вращения, например, в пределах между 10000 и 100000 д, чтобы вызвать седиментацию мембранных везикул. Она может состоять из серии различных центрифугирований, при этом последнее центрифугирование осуществляется приблизительно при 70000 д.
Мембранные везикулы в полученном остатке могут быть извлечены в меньшем объеме и в буфере, пригодном для использования на последующих стадиях процесса.
Стадия концентрирования предпочтительно осуществляется путем ультрафильтрации. В соответствии с предпочтительным воплощением (осветленный) биологический образец (например, супернатант) подвергается воздействию ультрафильтрации, предпочтительно тангенциальной ультрафильтрации. Тангенциальная ультрафильтрация включает в себя концентрирование и фракционирование раствора между двумя отделениями (фильтрат и удерживаемая фракция), разделение с помощью мембран с определенными порогами отсечки по молекулярной массе. Разделение осуществляют с помощью приложения потока в отделении для удерживаемой фракции и трансмембранного давления между этим отделением и отделением фильтрата. Для осуществления ультрафильтрации могут использоваться различные системы,
- 19 005425 такие как спиральные мембраны (М1Шроге, Ашкоп), плоские мембраны или полые волокна (Ашкои, М1Шроге, 8айогш5, Ра11, СЕ, 8ергасог). В рамках настоящего изобретения использование мембран с порогом отсечки по молекулярным массам ниже 1000 кДа, предпочтительно между 300 кДа и 1000 кДа, или еще более предпочтительно между 300 кДа и 500 кДа, является преимущественным.
В конкретном воплощении осветленный супернатант культуры ткани (например, полученный после осветления через 0,8 мкм фильтр) концентрируется путем ультрафильтрации через мембрану с порогом отсечки по молекулярным массам (МУСО) 500 кДа, мембрану в виде полого волокна, имеющего диаметр просвета 0,5 мм (А/С Тес1по1оду 1пс). Картридж с таким размером пор удерживает декзосомы в удерживаемой фракции, в то же время давая возможность белкам, которые являются меньшими, чем размер пор, проходить через мембрану. Картридж на основе полых волокон имеет площадь поверхности, достаточную для того, чтобы дать возможность концентрированию происходить быстро и без избыточных сдвиговых усилий, прилагаемых к декзосомам. Типичный объем исходного супернатанта, который подвергается ультрафильтрации, составляет 2-4 л, затем он понижается приблизительно до 100 мл (2040-кратное уменьшение). Схема рабочей установки приведена на фиг. 6.
Другие размеры пор, такие как 30 кДа, 100 кДа, 300 кДа и 750 кДа, также могут использоваться для концентрирования объема декзосом. Однако эффективность процесса и процент извлечения при этом могут понизиться. Более того, могут использоваться и другие форматы ультрафильтрации, такие как пластинчатые и рамочные кассеты от таких компаний как М1Шроге, 8аг1опи5 и ЕШгопкх. Ячейки с перемешиванием, такие как те, которые поставляет Ашкоп 1пс, также могут использоваться для уменьшения объема декзосом.
Концентрирование декзосом путем ультрафильтрации с помощью мембран в виде полого волокна происходит при низких сдвиговых усилиях. Сдвиговое усилие во входном потоке (например, при скорости потока <300 мл/мин для площади поверхности 0,7 кв.фт.) является меньшим, чем 2000 с-1. Входное и выходное давление системы во время процесса составляют в пределах между 3 и 8 фунт/кв.дюйм. Для концентрирования декзосом могут использоваться более жесткие условия, по сравнению с используемыми в настоящее время параметрами.
Другие технологии, такие как ионобменная и аффинная хроматография, а также гидродинамическое проточное фракционирование, также могут использоваться для концентрирования декзосом в способе приготовления по настоящему изобретению.
Диафильтрация
Диафильтрация концентрированного препарата декзосом может быть использована для понижения концентрации загрязняющих сред и клеточных белков. Диафильтрация может быть осуществлена в соответствии с несколькими технологиями, которые дают возможность замены буфера образца на буфер препарата, включая ультрафильтрацию, хроматографию, ультрацентрифугирование и диафильтрацию посредством диализного мешка.
В предпочтительном воплощении диафильтрация осуществляется с помощью системы ультрафильтрации. Как демонстрируется в экспериментальном разделе, это воплощение является эффективным. Более того, когда препарат везикул концентрируется с помощью ультрафильтрации, стадия диафильтрации легко может быть объединена с ней с использованием такой же методики.
В этом отношении, в конкретном воплощении экзосомы подвергаются диафильтрации с помощью ультрафильтрации, с использованием таких же мембран для ультрафильтрации (то есть мембран с МУСО 500 кДа в виде полого волокна), какие используются на стадии концентрирования. Это воплощение является преимущественным, так как обе стадии могут быть осуществлены по существу в одном и том же устройстве с ограничением вмешательства и манипулирования экзосомами, то есть с помощью одной только модификации продукта, вводимого в полое волокно.
Кроме 500 кДа мембран в виде полого волокна, могут использоваться и другие размеры пор, такие как 30, 100, 300 и 750 кДа, предпочтительно находящиеся в пределах между 30 и 1000 кДа, более предпочтительно между 200 и 750 кДа. Буфер для диафильтрации может состоять из наполнителей, отличных от тех, которые находятся в РВ8. Объем буфера, используемого при диафильтрации, может составлять где-то от 1 до 10 объемов концентрата декзосом.
Рабочие параметры, используемые для диафильтрации, являются подобными тем, которые описаны ранее для концентрирования декзосом из осветленных сред для культур тканей.
Выделение и очистка экзосом в градиенте плотности
Как указывалось, настоящее изобретение описывает обработку биологического образца, содержащего мембранные везикулы, с помощью центрифугирования в градиенте плотности и извлечение очищенных везикул из плотной части градиента плотности. Центрифугирование в градиенте плотности обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с известными ранее методиками с использованием последовательных центрифугирований или центрифугирования в градиенте плотности. Они включают в себя отсутствие агрегирования везикул, которые, таким образом, подвергаются меньшим физическим повреждениям, дополнительную очистку везикул, так как могут быть удалены дополнительные загрязнения, как будет обсуждаться ниже, отсутствие токсичности используемых компонентов в градиенте плотности, пониженную концентрацию сахарозы и тому подобное. В частности, градиент плотности
- 20 005425 предоставляет возможность для предотвращения образования осадка из экзосомы, когда образец подвергается ультрацентрифугированию. Различие в удельном парциальном объеме растворимого белка (примерно 0,73) и экзосом (примерно 0,88) и агрегированного белка делает его идеальным способом для разделения и очистки. Агрегированный белок (плотность примерно 1,35), как ожидается, осаждается сквозь градиент плотности, в то время как экзосомы удерживаются в плотной части градиента плотности. Вкратце, способ описывается следующим образом (схема этого процесса приведена на фиг. 8а и 8Ь).
Добавление раствора в нижней части пробирки центрифуги с более высокой плотностью (то есть нижнего слоя в градиенте), по сравнению с концентрированным раствором декзосом, приводит к формированию прерывистости или градиента (то есть к резкому изменению плотности). Градиент приводит к исключению молекул с более низкими коэффициентами седиментации. Более того, градиент делает более легким повторное суспендирование любого седиментировавшего материала в конце процесса и предотвращает повреждение частиц, которые не могут противостоять образованию осадка.
Более того, в качестве другого преимущества предполагается, что градиент плотности предоставляет возможность для дополнительного устранения из композиции любого потенциально загрязняющего агрегированного белка, в частности агрегированного гаптоглобина.
Мембранные везикулы, в частности декзосомы, как показано, имеют плотность от 1,100 до 1,140 г/мл. Соответственно, градиент плотности должен иметь конечную плотность в пределах примерно между 1,10 и примерно 1,15.
Композиция градиента плотности может быть адаптирована специалистом в данной области с тем, чтобы была достигнута указанная выше предпочтительная конечная плотность. Раствор для градиента плотности является предпочтительно слегка гиперосмотическим с осмолярностью в пределах 700-800 мОс. В предпочтительном воплощении градиент плотности состоит из сахарозы/О2О в Трис буфере. Добавление тяжелой сахарозы/Трис Ό2Ο буфера в нижнюю часть каждой пробирки вытесняет концентрированный раствор декзосом вверх, с формированием видимой границы раздела. Ультрацентрифугирование при 100000 х д в течение приблизительно одного часа или получаса осаждает декзосомы в более тяжелой области градиента плотности сахароза/Трис Ό2Ο. Тяжелая область градиента содержит популяцию обогащенных и более очищенных декзосом. Очень мало декзосом находится либо выше тяжелой области градиента плотности, либо в осадке, который иногда виден на дне пробирки. Более того, Ό2Ο ранее использовался при клинических исследованиях и не демонстрирует никаких токсических воздействий при тех концентрациях, которые используются. В этом отношении природное содержание дейтерия у человека составляет 15 мг/кг (0,15 мас.%).
Предпочтительно, когда используется градиент плотности О2О/сахароза, плотность исходного раствора для градиента должна находиться в пределах примерно 1,175-1,210 г/мл (отклонения от этих конкретных пределов также могут использоваться). В самом деле, авторы теперь доказали, что диффузия О2О/сахарозы осуществляется в градиенте плотности во время центрифугирования, приводя к образованию мини-градиента и конечной плотности в пределах между примерно 1,1 и примерно 1,15 г/мл (то есть плотность в сформировавшемся тяжелом слое градиента плотности, согласно измерениям, составляет между 1,100 и 1,150 г/мл). Этого не ожидалось, и это обеспечивает дополнительные преимущества на стадии очистки, так как при формировании мини-градиента градиент плотности предоставляет возможность для дополнительной очистки экзосом.
В других случаях могут быть приготовлены другие растворы наряду с раствором сахароза/О2О, когда плотность раствора является более высокой, чем у экзосом. В этом отношении может использоваться вода с двумя изотопными метками (то есть, Ό2 17Ο или Ό218Ο), которая предоставила бы возможность даже для дополнительного уменьшения количества сахарозы в градиенте плотности. Плотность доступной Ό218Ο (97% чистота) составляет 1,22. Смесь Ό2Ο и Ό217Ο или Ό218Ο может использоваться для выделения везикул и клеточных фракций различной плотности без добавления дополнительных компонентов.
Более высокие концентрации сахарозы в Η2Ο (не дейтерированной) также могут быть приготовлены для получения раствора со сравнимой плотностью, хотя такой раствор был бы значительно более гиперосмотическим и может вызывать лизис декзосом. Коммерческие среды для создания градиента плотности, включающие йодиксанол (то есть ΟρΙιΓίΌρ). Регсо11 и Исо11, могут использоваться для удержания декзосом подобным же образом, для лабораторных процессов и аналитических целей.
Очищенные экзосомы могут быть собраны из плотной части градиента с помощью любого соответствующего средства, включая прокалывание пробирки с помощью иглы, пипетирование и тому подобное.
Приготовление и кондиционирование
Приготовление экзосом с помощью диафильтрации
Очищенные экзосомы могут быть приготовлены в различных буферах или суспензиях, пригодных для использования при клиническом применении или при дальнейшем хранении.
Для этой цели очищенные экзосомы могут подвергаться замене буфера с помощью диафильтрации, с использованием 500 кДа картриджа для ультрафильтрации в виде полого волокна, идентичного по формату тому, который использовался ранее для концентрирования и/или диафильтрации (смотри предыдущее обсуждение). Картридж предпочтительно предварительно кондиционируется с помощью буфе
- 21 005425 ра, содержащего 18А (например, 100 мкг/мл), который является не содержащим загрязнений гаптоглобином, в течение минимум 15 мин перед диафильтрацией. Видимо, присутствие 18А предотвращает неспецифичные потери декзосом из-за связывания с подложкой в виде полого волокна. Фракции, полученные при ультрацентрифугировании в градиенте плотности (приблизительно 16 мл), содержащие очищенные (с введенным антигеном) экзосомы, подвергаются минимум 5-кратной по объему замене буфера для удаления компонентов градиента плотности (то есть минимум 98% замене буфера). Используется установка, идентичная той, которая изображена на фиг. 5, однако картридж с полыми волокнами уменьшается в размерах для согласования с меньшим объемом. Как описано ранее, диафильтрация осуществляется при низких усилиях сдвига (то есть 2000 с-1), которые могут вообще не потребоваться.
Типичный результат 8Э8-РАСЕ образца декзосом при 1/2800 от его исходного объема представлен на фиг. 10.
Несколько препаратов буфера могут использоваться для приготовления экзосомы. Типичный буфер содержит разбавители υ8Ρ/ΝΡ. Раствор препарата может содержать следующие компоненты:
1) буферный агент, такой как Трис, 2) криопротектор, такой как сахароза, треалоза, глюкоза, глицерин и тому подобное, 3) соли, такие как №С1, КС1, МдС12, СаС12 и тому подобное, 4) разрыхляющие агенты, такие как маннит, глицин, крахмал и тому подобное, 5) антиоксиданты, 6) витамины, 7) стабилизирующие белки и пептиды, такие как 118А, и 8) другие широко применяемые разбавители, используемые в препаратах.
В этом отношении цель настоящего изобретения заключается в композиции, содержащей (ί) мембранные везикулы, (ίί) буферный агент и (ίίί) криопротектор или стабилизирующее соединение. Композиция, предпочтительно, дополнительно содержит (ίν) соли и/или разрыхляющий агент, и/или антиоксиданты, и/или витамины.
Типичные буферы содержат РВ8, 20 мМ Трис/5% сахарозы/1 мМ МдС12, значение рН составляет 7,4 или 20 мМ Трис/5% сахарозы/1 мМ МдС12 100 мкг/мл 18А, значение рН составляет 7,4 и подвергаются ультрафильтрации для удаления гаптоглобина.
Предпочтительно, раствор препарата, как описано выше, является по существу не содержащим гаптоглобина (или родственных полимеров, а также частиц). В этом отношении раствор препарата (или его отдельные индивидуальные компоненты, такие как раствор альбумина) могут быть подвергнуты ультрафильтрации для устранения гаптоглобина, как описано ранее. Эта конечная обработка дополнительно дает гарантию более высокого качества продукта.
Стерильная фильтрация и замораживание экзосом
Наконец, собранный (или приготовленный) материал может подвергаться дополнительной обработке (обработкам) и/или стадиям фильтрации, в частности, для целей стерилизации. В этом отношении экзосомы могут быть отфильтрованы в стерильных условиях через фильтры с диаметром, меньшим или равным 0,3 мкм. Типичная стерилизация включает в себя фильтрацию через 0,22 мкм шприцевый фильтр (25 мм) с минимальными потерями (смотри результаты анализа НЬА/ΌΕ). Фильтры, состоящие из материала Иигароге от М1Шроге, могут использоваться при стерильной фильтрации. Другие материалы фильтров, состоящие из ацетата целлюлозы или полиэфирсульфона, также могут использоваться. Шприцевые фильтры предпочтительно смачиваются предварительно препаратом буфера, содержащим 100 мкг/мл 18А (минус гаптоглобин), перед фильтрованием экзосом. Образец экзосом (~16 мл) может фильтроваться в стерильных условиях либо при контролируемых параметрах с помощью плунжерного насоса, либо с помощью давления, производимого вручную.
Очищенные экзосомы (по выбору, приготовленные и/или стерилизованные) могут также быть заморожены и храниться при -80°С, или при других температурах хранения, -20°С или 4° С. Охлаждение предпочтительно осуществляется при контролируемой скорости 1°/мин с помощью криоконтейнера Мг. Егойу -1°С Ща1деие Фе). Другие способы медленного или быстрого замораживания в жидком Ν2 также могут быть использованы.
В этом отношении цель настоящего изобретения также заключается в композиции, содержащей замороженные экзосомы.
Контроль качества
Настоящее изобретение также описывает и предусматривает новые композиции и способы, которые могут использоваться для характеризации препаратов мембранных везикул, которые приготавливаются (например, очищенных и/или в виде препарата), или во время процесса приготовления. Композиции и способы настоящего изобретения могут использоваться для определения количества экзосом в образце или композиции, для определения фенотипа экзосом в препарате и для оценки биологической активности препарата экзосом. Эти способы являются особенно пригодными для использования при характеризации продукта, предназначенного для использования в клинических применениях, то есть для контроля качества и композиции препарата экзосом. Эти способы являются очень важными для терапевтических целей, так как используются по существу аутологичные (то есть пациент для пациента) препараты везикул, которые требуют индивидуальной характеризации параметров. Эти композиции и способы могут использоваться для характеризации препаратов экзосом из различных источников (то есть антигенпрезентирующих клеток, клеток опухолей и тому подобное), восприимчивость к антигену (нагруженные
- 22 005425 антигеном, не содержащие антигенов и тому подобное), только что приготовленных или хранимых, из первичных клеток или иммортализованных линий клеток и тому подобное.
Дозирование экзосом
Разработан способ для оценки количества мембранных везикул, присутствующих в образце (или в очищенной композиции). Способ включает в себя формирование и детектирование иммунного комплекса с использованием антител, которые распознают поверхностные маркеры клеток, присутствующие на экзосомах.
Более конкретно, способ дозирования мембранных везикул в образце в соответствии с настоящим изобретением включает в себя (ί) адсорбцию образца на твердой подложке, (ίί) взаимодействие адсорбирующей подложки с (иммобилизованным) антителом, специфичным по отношению к поверхностным маркерам клеток на экзосоме, и (ίίί) определение присутствия иммунных комплексов антитело-антиген (или их дозирование).
Более предпочтительно, антитело, специфичное по отношению к поверхностному маркеру клеток на экзосомах, представляет собой антитело анти-класса ΙΙ, то есть антитело, которое связывает молекулы МНС класса ΙΙ, или антитело анти-класса Ι. Более того, в конкретных воплощениях используется, по меньшей мере, одно второе иммобилизованное антитело, параллельно, для дополнительного повышения селективности анализа по отношению к экзосомам. Например, предпочтительные дополнительные иммобилизованные антитела являются направленными против поверхностного маркера клеток СЭ81 или против молекул МНС класса I. Использование антитела анти-СО81 является преимущественным для характеризации (дозирования) декзосом, так как СО 81 является значительно меньшим, чем дендритные клетки и, таким образом, обеспечивает сигнал, который является специфичным по отношению к декзосомам. На этой стадии могут использоваться и другие антитела, специфичные по отношению к экзосомам, например, такие как анти-СБбЗ или анти-СЭ9.
В предпочтительном воплощении экзосомы, таким образом, адсорбируются на твердой подложке и взаимодействуют по отдельности с антителом анти-класса II и с антителом анти-СО81.
Иммунные комплексы антитело-антиген, формируемые в результате на стадии взаимодействия, могут детектироваться в соответствии с обычными иммунологическими методиками. Предпочтительно, комплексы обнаруживают с использованием меченого антитела обнаружения, которое связывает первое и/или второе иммобилизованное антитело. Обнаруженное антитело может быть помечено с помощью радиоактивности, ферментативной активности, флуоресцентной метки, хемилюминесцентной метки и тому подобное. Измерение комплексов коррелирует с количеством экзосом, присутствующих в образце (то есть, обеспечивает их прямую индикацию). Когда используются два антитела (например, анти-класса II и анти-СО81), среднее количество или отношение количеств комплексов, детектируемых с помощью каждого антитела, могут быть использованы в качестве параметра для количественного определения.
Различные антитела, которые должны использоваться в способе, могут быть моноклональными или поликлональными антителами либо в природной форме, либо модифицированными (например, очеловеченными) фрагментами или их производными. В типичных экспериментах иммобилизованные антитела являются моноклональными антителами. В другом типичном эксперименте антитело обнаружения представляет собой меченое моноклональное или поликлональное антитело.
При осуществлении настоящего способа могут использоваться различные твердые подложки, такие как многолуночный планшет, в частности 96-луночный планшет или любой другой титровальный планшет.
Более того, при осуществлении настоящего способа дозирования является в высшей степени предпочтительным использование очищенных образцов экзосом в порядке уменьшения неспецифичного фонового сигнала. Для этой цели образец является предпочтительно очищенным образцом экзосом, еще более предпочтительно образец подвергается (ультра) центрифугированию в градиенте плотности. Для аналитических целей несколько миллилитров раствора экзосом из 200 мкл центрифугируют в градиенте плотности из Ό20 и сахарозы. Анализ ΕΗ8Α может быть осуществлен непосредственно в растворе с градиентом плотности. Эта простая стадия очистки предоставляет возможность для достаточного концентрирования и очистки. Извлечение является близким к 100%.
В одном из конкретных воплощений анализы на основе ΕΟ8Α разрабатываются в порядке обеспечения количественной меры экзосом в образце, композиции, жидкости и тому подобное. Фигура 11а иллюстрирует измерение ΗΕΑ-ΟΚ (то есть, МНС II), и фиг. 11Ь иллюстрирует измерение СО81 в декзосомах. Анализ ΗΕΑ/ΟΚ является как чувствительным, так и функционально соотносимым с активностью декзосом, так как ΗΕΑ/ΟΚ участвуют в презентировании антигенов. Этот анализ выбирается в качестве количественного анализа для препарата декзосом. Анализ ΕΟ8Α для определения ΗΕΑ/ΟΚ количественно определяет декзосомы в конечном продукте. Так как этот анализ может также измерять ΗΕΑ/ΟΚ на дендритных клетках, такой анализ обеспечивает средства для соотнесения дозы ΗΕΑ/ΟΚ с количеством дендритных клеток и с объемом выделенных декзосом.
Определение фенотипа экзосом
Разработан способ для оценки фенотипа мембранных везикул, присутствующих в образце (или в очищенной композиции). Способ включает в себя формирование и детектирование иммунного комплек
- 23 005425 са с использованием антител, которые распознают несколько маркеров (поверхности) клеток, присутствующих на (в) экзосомах. Способ дополнительно включает в себя образование комплексов экзосом на твердой подложке, такой как шарики, с целью предоставления возможности для чувствительного и безопасного определения фенотипа каждого препарата.
В этом отношении цель настоящего изобретения заключается в способе характеризации мембранных везикул в препарате, включающем в себя взаимодействие, параллельно, образцов препарата мембранных везикул с двумя или более антителами, специфичными по отношению к маркеру везикул, и определение формирования иммунных комплексов антиген-антитело.
Способ, более конкретно, является направленным на определение фенотипа препарата экзосом, то есть, конкретного типа маркеров на поверхности клеток, экспрессируемых экзосомами в препарате. Принимая во внимание аутологичную природу препаратов экзосом, фенотип является главным при характеризации композиции препарата как с точки зрения структуры, так и с точки зрения потенциальной активности.
Более предпочтительно, способ характеризации препарата включает в себя исходную стадию связывания экзосомы на твердых подложках, таких как шарики. Еще более предпочтительно, экзосомы являются ковалентно связанными с твердыми подложками, такими как шарики, или с помощью аффинного связывания, опосредуемого антителом. В типичном воплощении используются шарики диаметром примерно от 1 до 10 нм, более предпочтительно от 3 до 5 мкм, и они могут нести на себе свыше 1000 экзосом, ковалентно связанных с ними или присоединенных с помощью иммуноаффинности, более предпочтительно в пределах между 2000 и 5000 экзосомами. Покрытые экзосомами шарики затем распределяются в лунки планшета и приводятся в контакт параллельно с выбранными антителами.
Антитела могут связывать либо маркеры поверхности клетки, либо внутренние белки. В самом деле, предполагается, что связывание экзосом с твердыми подложками, такими как шарики, делает определенные внутренние белки доступными для внешних агентов, таких как антитела.
Предпочтительно, используются два антитела или более из перечисленных ниже в табл. 1.
Таблица 1
| Антитело | Источник Ркагтхпдеп |
| анти СЦ 11, более предпочтительно анти Οϋΐΐο анти СИНЬ | 30485* 30455х |
| анти НЬА, более предпочтительно анти ΗΙΛ аЬс | 32295х |
| анти С081 | 33475х |
| анти СО63 | 36585х |
| анти Οϋ58 | 36895» |
| анти СЭ1а | 34224» |
| анти СЦ1Ь | |
| анти СЦ9 | 30374» |
| анти СИ86 | 33409» |
| анти СО82 | 35394» |
| анти СО83 | 36934» |
| Анти-лактадгерин* | - |
*: антисыворотка кролика против пептида лактадгерина
Предпочтительно, эти антитела метятся с целью предоставления возможности для детектирования и/или дозирования формирующихся иммунных комплексов. Метка может быть радиоактивной, химической, ферментативной, флуоресцентной и тому подобное. Предпочтительными метками являются флуоресцентные, такие как МТС или РЕ.
Более предпочтительно, используются по меньшей мере 5 различных антител, еще более предпочтительно по меньшей мере 8 различных антител. Антитела являются предпочтительно моноклональными.
В одном из конкретных воплощений иммунологическое определение фенотипа осуществляется с использованием способа прямого окрашивания. Малую аликвоту очищенных экзосом инкубируют вместе с магнитными сферами, покрытыми антиклассом ΙΙ (например, анти-ΗΕΑ/ϋΚ). Экзосомы, связанные с магнитными сферами, покрытыми анти-ΗΕΑ-ΌΚ, затем инкубируются вместе с мечеными антителами, более предпочтительно флуоресцентно конъюгированными моноклональными антителами (например, МТС или РЕ). При использовании проточной цитометрии могут быть измерены четыре параметра: прямое рассеяние, обратное рассеяние и два флуоресцентных канала. Этот анализ на основе двухцветной
- 24 005425 проточной цитометрии дает возможность для идентификации антигенов на экзосомах в одном измерении.
Результаты, полученные для нескольких препаратов декзосом, представлены на фиг. 14. Эти результаты четко демонстрируют эффективность и быстроту заявляемого способа при иммунологическом определении фенотипа экзосом в препаратах.
Функционирование экзосом
Разработан дополнительный способ для оценки биологической активности мембранных везикул, присутствующих в образце (или в очищенной композиции). Способ включает в себя оценку активации СТЬ лимфоцитов из популяции Т-лимфоцитов с использованием антигена сравнения, например суперантигена (например, 8ЕЕ).
Конкретная цель настоящего изобретения, таким образом, заключается в способе характеризации активности мембранных везикул, включающем в себя взаимодействие везикул, нагруженных суперантигеном, Т-лимфоцитами, в присутствии А-клеток и определение активации Т-лимфоцитов.
Суперантигены получают с помощью множества различных патогенов, подобных бактериям и вирусам. Суперантигены связываются с молекулами МНС II непосредственно, не подвергшись обработке. Вместо связывания в бороздке молекулы МНС II суперантигены связываются на наружной поверхности молекулы МНС II и в области Ур рецептора Т-лимфоцита (ТСН) и являются способными к стимулированию очень большого количества Т-лимфоцитов (2-20%). Тот факт, что суперантигены могут связываться с различными МНС II и ТСН и индуцировать сильные реакции Т-лимфоцита, делает их привлекательными агентами для создания общего и чувствительного анализа для исследования функции презентирования антигенов декзосом. Суперантиген может быть приготовлен или выделен из различных источников. Предпочтительный суперантиген для использования в настоящем изобретении представляет собой антиген 8ЕЕ, ЕТ 404 (Тохт Тес1то1оду Шс.). Могут использоваться и дополнительные суперантигены, такие как 8ЕА и 8ЕВ.
Т-лимфоциты могут быть любой только что приготовленной популяцией клеток, содержащей Тлимфоциты, таких, например, как одноядерные клетки периферийной крови (РВМС), а также любой иммортализованной линией Т-лимфоцитов, такой как клетки Лисак Клетки Лиса1 представляют собой иммортализованные Т-лимфоциты человека, секретирующие ГЬ-2 при активации, которые могут функционировать в качестве иммунореактивных клеток при этом анализе. ТСН Ур 8 клеток Лпса1 ассоциируется с 8ЕЕ. Как иммортализованные клетки опухоли, клетки Лпса1 являются, в частности, полезными, так как они гораздо менее гетерогенны и их легче выращивать в лаборатории, чем первичные клетки.
А-клетками могут быть любые клетки, которые являются способными к опосредованию активационного сигнала для Т-лимфоцитов в настоящем биологическом анализе. А-клетки могут быть дендритными клетками, такими как любая иммунокомпетентная культура первичных дендритных клеток или линия дендритных клеток. А-клетки могут также быть другими иммунными клетками или линиями клеток, в частности антиген-презентирующими клетками или линиями клеток, такими как клетки Кар. Клетки Ка_р представляют собой ЕВУ-иммортализованные В-лимфоциты и, как показано, функционируют при настоящем анализе. Клетки Ка_р могут культивироваться в любой пригодной для использования среде, такой, например, как КРМ!
При осуществлении заявляемого способа везикулы, нагруженные суперантигеном, приводятся в контакт с иммунореактивными Т-лимфоцитами в присутствии А-клеток, и оценивается активация Тлимфоцитов.
Измерение активации Т-лимфоцитов может быть осуществлено в соответствии с различными методиками, такими как высвобождение цитокинов, синтез белков, лизис иммунореактивных клеток и тому подобное. В предпочтительном воплощении активация Т-лимфоцитов измеряется с помощью определения продуцирования цитокинов в среде, более конкретно, продуцирования в среде интерлейкина-2. Как правило, ГЬ-2 измеряется с помощью ЕЫ8А.
В настоящем способе могут быть нагружены суперантигеном мембранные везикулы сами по себе или клетки, продуцирующие мембранные везикулы (полученные в результате везикулы затем соприкасаются с суперантигеном). В предпочтительном воплощении в контакт с суперантигеном приводятся везикулы.
В конкретном воплощении в этом функциональном анализе суперантиген 8ЕЕ сначала инкубируют вместе с экзосомами, приготовленными из супернатанта культуры клеток с помощью ультрафильтрации, центрифугирования в градиенте плотности и диафильтрации в препарате буфера. Выделенные экзосомы могут использоваться свежими или могут также храниться замороженными при -80°С в РВ8. Комплексы экзосом и 8ЕЕ затем отделяются от несвязанного 8ЕЕ путем аналитического зонального центрифугирования с использованием, например, Орйргер. Ор11ргср (также известный как йодиксанол) представляет собой йодированные среды для создания градиента плотности (Цусотеб), которые предоставляют возможность для количественного извлечения комплексов экзосома/8ЕЕ из свободного 8ЕЕ. Эта стадия является, таким образом, важной при биологическом анализе, для количественного анализа каждой полученной партии экзосом. Выделенные комплексы используются для индуцирования активации Т
- 25 005425 лимфоцита в присутствии клеток Кац в качестве А-клеток. Признаком активации Т-лимфоцитов является секреция 1Ь-2 клетками 1игка1.
Конкретными преимуществами настоящего способа приготовления по сравнению с известными методиками седиментации с использованием последовательных стадий центрифугирования являются следующие.
Продолжительность обработки: обработка с помощью седиментации является более длительной по сравнению с ультрафильтрацией и ультрацентрифугированием. 4 л супернатанта культуры ткани потребовали бы как минимум 12 ч для обработки с помощью седиментации, в то время как сочетание ультрафильтрации и одного захода ультрацентрифугирования заняло бы 6-7 ч, как это и происходит в настоящее время.
Замкнутая система - совместимость с СМР: единственная стадия центрифугирования в процессе осуществляется с использованием малого объема и может быть реализована в доступных в настоящее время герметичных пробирках (емкость ротора - 6 пробирок, по 33 мл каждая). Это устраняет проблему, которая возникла бы, если бы стадия центрифугирования осуществлялась на большом объеме (несколько литров). В настоящее время не существует герметичных пробирок для центрифугирования, предназначенных для такого большого объема. Центрифугирование должно производиться в открытых пробирках, которые не являются одноразовыми и не соответствуют существующим ограничивающим предписаниям. Осветление, ультрафильтрация и стерильная фильтрация, все вместе, выполняются в биологически безопасном боксе и рассматриваются как закрытая, по существу, система. Ультрацентрифугирование теперь осуществляется также и в закрытых пробирках, что устраняет проблемы, которые могли бы возникнуть из-за загрязнения в открытой пробирке.
Ультрафильтрация сред: повторная обработка сред, таких как А1М V, для удаления агрегированного белка является важной стадией в общей схеме процесса очистки. Предварительное удаление белков, которые выделяются вместе с ними, приводит к получению более чистого продукта экзосом после обработки. В частности, установлено, что настоящее изобретение предоставляет возможность для получения композиций, которые являются по существу не содержащими агрегатов, то есть, когда агрегатов имеется меньше, чем 2-4% от всего белка. Более того, удаление гаптоглобина уменьшает нежелательные иммунные ответы.
Потенциальное агрегирование экзосом после седиментации: седиментация экзосом приводит к очень высокой их локальной концентрации. Высокая концентрация экзосом в лепешке может приводить к образованию агрегированного продукта. Электронная микроскопия дает некоторые указания относительно того, что экзосомы образуют агрегаты после седиментации по сравнению со способом, использующим ультрафильтрацию. Во-вторых, видимо, ультрафильтрация экзосом приводит к меньшему количеству остатков, что можно увидеть с помощью электронного микроскопа.
Температура обработки: Обработка, такая как диафильтрация, может выполняться на льду, то есть, при температуре в пределах примерно между 4 и 10°С. Это является преимуществом, так как равновесие между свободными пептидами и теми, которые связаны с экзосомами посредством МНС1, может подвергаться воздействию температуры, и поскольку такие температуры предотвращают воздействие гидролитических загрязняющих ферментов, таких как протеазы.
Чистота экзосом: седиментация экзосом привносит риск загрязнения остатками клеток и примесями из сред. Удаление загрязняющих агрегированных белков является, в частности, важным из-за их высокой иммуногенности.
Извлечение экзосом: окончательное извлечение составляет 60-75%, значительно больше, чем при исходном способе седиментации (в среднем, 15% из 9 экспериментов). Это означает, что доза, доступная для лечения пациента, может быть увеличена в 5 раз, если потребуется, или возникает возможность осуществления афереза на меньшем объеме крови и культивирования в 5 раз меньше клеток, что обуславливает значительное понижение стоимости процесса.
Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут ясны из следующих примеров, которые должны рассматриваться в качестве иллюстративных и не ограничивающих.
Примеры
1. Приготовление сред.
Перед использованием культуральную среду (в этом примере А1М V клинического качества, бессывороточную культуральную среду для клеток от Ь1£е ТесЬпо1од1ек, 1пс.) обрабатывают с помощью ультрафильтрации для удаления агрегированных белков, их удаление не влияет на рост клетки, но значительно способствует последующему выделению чистых декзосом.
Ультрафильтрация сред осуществляется с использованием 500 кДа мембран в виде полого волокна (от А/С ТесЬпо1о§у, ЫеебЬат, Макк или от поставщика, поставляющего родственный продукт). Этот размер мембраны удерживает агрегированный белок в удерживаемой фракции, в то же время давая возможность не агрегированным белкам проходить сквозь нее вместе с пермеатом. Пермеат собирают, фильтруют в стерильных условиях через 0,22 мкм фильтр в бутылки и хранят при 4°С до тех пор, пока он не потребуется.
- 26 005425
В конкретном эксперименте для обработки 50 л А1М V используется картридж с полыми волокнами ИЕР-500-С-35А (диаметр просвета 0,5 мм, площадь поверхности 14,5 кв.фут) от А/С 1ес11по1оду. Входной поток имеет скорость потока 13 л/мин, что приводит к возникновению потока растворенного вещества 1 л/мин и входного и выходного давления 12-16 фунт/кв.дюйм и 10 фунт/кв.дюйм, соответственно. Процесс завершается в пределах 1 ч. Пермеат фильтруют в стерильных условиях через 0,22 мкм фильтр 8ατЮРоге или 8ατίοΒΓαη (8;·ΐΓΐοπι.ΐ5 1пс). Фиг. 3 и 4 демонстрируют пониженное содержание агрегатов в среде. Количественное определение гаптоглобина с помощью ЕЫ8А показывает, что более чем 99% агрегатов, связанных с гаптоглобином, удаляется путем ультрафильтрации. Более конкретно, УФ среды содержат меньше, чем примерно 5 нг/мл агрегированного гаптоглобина.
В частности, анализ ВСА показывает, что ультрафильтрация сред А1М V удаляет 2-4% от всего белка в средах. Большая часть фракции удаленного белка представляет собой агрегаты. Концентрирование белка в средах не изменяет значительно процесс ультрафильтрации, только концентрацию частиц. Осаждение подвергнутой ультрафильтрованию А1М V (УФ А1М V) приводит к некоторому набору белков, по существу отличному от того, который наблюдается у сред А1М V, которые не подвергались ультрафильтрованию (смотри фигуру 3). Более того, осаждение подвергнутой ультрафильтрованию А1М V через 3 месяца после обработки не обнаруживает присутствия агрегированного белка, как показано с помощью 8Э8-РАСЕ (смотри фигуру 4), подтверждая, что обработанная среда может храниться в течение долгих периодов времени.
Ультрафильтрация композиций на основе альбумина (например, 118 А) также предоставляет возможность для приготовления нагретых продуктов 118А. содержащих менее, чем примерно 10 нг агрегированного гаптоглобина на мг 118А, то есть меньше, чем примерно 0,001% агрегированного гаптоглобина (масс).
2. Продуцирование и культивирование незрелых дендритных клеток.
Предшественники дендритных клеток отбираются из периферической крови пациента после лейкофереза. Процедура культивирования клеток является бессывороточной и осуществляется в средах для культивирования клеток клинического качества, которые дополнительно подвергаются ультрафильтрованию для удаления агрегированного белка (или частиц), как определено в примере 1. Типичный выход от лейкофереза содержит примерно от 1 до 2 х Е10 клеток. Клетки промывают четыре раза в РВ8, с добавлением 0,1% сывороточного альбумина человека (клиническая чистота), для удаления тромбоцитов. Затем клетки размещают в Т-образных колбах площадью приблизительно 100-150 см2 при плотности клеток 200 х 106 клеток/колба в бессывороточных средах, подвергнутых ультрафильтрованию. Очистка предшественников дендритных клеток от лейкоцитов в материале, полученном после лейкофереза, основывается на адгезивных свойствах моноцитов на заряженных полистирольных поверхностях, таких, как те, что имеются в стандартных коммерческих колбах для культур тканей. После двух часов инкубирования моноциты прилипают и удерживаются, в то время как оставшиеся не прилипающие клетки удаляют с помощью замены среды, с использованием сред, где имеется СМ-С8Е и 1Ь-4 или 1Ь-13, при концентрации 50 нг/мл, каждый, а также гамма интерферон. Прилипшие моноциты подвергаются дифференциации в присутствии СМ-С8Е и 1Ь-4 или 1Б-13, превращаясь в незрелые дендритные клетки. В день 5 культивирования к этим клеткам добавляют дополнительно СМ-С8Е и 1Б-13 или 1Ь-4. Интерферон гамма, при концентрации 500 ед/мл может быть добавлен к клеткам в порядке поддержания дендритных клеток в незрелом состоянии.
3. Процедура нагрузки антигеном в модельной системе.
Проделываются предварительные эксперименты с целью оценки технических параметров для нагрузки антигенов на дендритные клетки. Для этой цели в незрелые дендритные клетки вводится пептид СМV в порядке получения декзосом, нагруженных пептидами. Затем декзосомы выделяются с помощью стандартных процедур, и их активность анализируется путем измерения высвобождения ΙΕΝ-γ с помощью СМV-специфичного клона Т-лимфоцитов. Декзосомы, нагруженные пептидами СМV, специфично стимулируют клон анти-СМV Т-лимфоцитов и требуют присутствия дендритных клеток согласно с данными авторов с использованием анализа активности с использованием 8ЕЕ (фиг. 2).
Таким образом, при использовании модельной системы СМV пептид может быть включен в декзосомы путем добавления пептида к культуре ИС в день 5. Кроме того, данные авторов о том, что декзосомы, нагруженные пептидом, требуют присутствия ИС для их стимуляторного воздействия на Тлимфоциты, находятся в согласии с требованием включения Т-лимфоцитов, ИС и декзосом в биологический анализ с использованием 8ЕЕ, тем самым подчеркивая тесную взаимосвязь между поведением декзосом в этих двух анализах.
4. Осветление.
л супернатанта культуры ткани собирают и фильтруют через 3/0,8 мкм 8αήο^αη СА (площадь поверхности 500 см2) (8;·ΐΓΐοπι.ΐ5 1пс) при скорости потока 250 мл/мин. Давление на входе фильтра не превосходит 10 фунт/кв.дюйм (фиг. 5).
5. Концентрирование.
- 27 005425 л осветленной среды культуры ткани концентрируют до 100 мл с помощью картриджа с полыми волокнами ИЕР-500-С-4А (площадь поверхности 0,7 кв.фут.; диаметр просвета 0,5 мм) от А/С 1ес11по1оду. Скорость потока пермеата составляет между 225 и 275 мл/мин, а входное и выходное давление 4-7 фунт/кв.дюйм и 3-6 фунт/кв.дюйм, соответственно. Скорость потока пермеата при этих условиях находится в пределах между 40 и 60 мл/мин.
Процесс требует для завершения приблизительно 60-80 мин (фиг. 6).
6. Диафильтрация.
В конкретном примере концентрат экзосом подвергают диафильтрации вместе с 5 объемами РВ8 (то есть 100 мл концентрата декзосом, подвергающегося диафильтрации, против 500 мл РВ8). Результаты δΌδ-РАСЕ концентрированных декзосом до и после диафильтрации приведены на фиг. 7. Эта стадия, а также все последующие стадии, выполняются в условиях охлаждения (примерно между 4 и 10°С).
7. Разделение в градиенте плотности (прерывистый градиент).
В конкретном примере концентрированная и диафильтрованная культуральная среда, содержащая экзосомы, а также в тех примерах, когда в экзосомы вводится антиген (антигены), очищается с помощью (ультра)центрифугирования в градиенте плотности следующим образом: концентрат экзосом (приблизительно 100 мл) в равных аликвотах помещается в пробирки для центрифугирования поверх 4 мл буфера сахароза/Трис Ό2Ο. Градиент плотности с применением Ό2Ο состоит из 25-30% сахароза/20 мМ Трис Ό2Ο (мас./мас.%) (значение рН 7,5-7,7). Плотность изменяется в пределах между 1,18 и 1,21 г/мл. Пробирки герметизуются для обеспечения замкнутости системы.
Фиг. 9а изображает результаты δΌδ-РАСЕ образца до и после ультрацентрифугирования, а также содержимого области выше градиента плотности в плотной части градиента или в осадке. Как показано, большая часть белка не седиментирует в область плотной части градиента плотности сахароза/Трис Ό2Ο. Это дополнительно подтверждается на фиг. 9Ь, которая демонстрирует, что по меньшей мере 90% экзосом извлекаются в область плотной части градиента плотности.
8. Приготовление и кондиционирование.
Очищенные экзосомы подвергаются замене буфера путем диафильтрации с помощью 500 кДа картриджа для ультрафильтрации в виде полого волокна, идентичного по формату тому, который использовался ранее для концентрирования и/или диафильтрации (смотри примеры 5 и 6). Картридж предварительно кондиционируется с помощью 118А (например, 100 мкг/мл) в течение, как минимум, 15 мин перед диафильтрацией, и его размер подгоняется для обработки 10-20 мл среды. Типичные результаты 8Ό8РАСЕ для образца декзосом при 1/2800 от его исходного объема приведены на фиг. 10.
Приготовленные экзосомы фильтруют в стерильных условиях через 0,22 мкм шприцевой фильтр (МШех СУ (шприц 25 мм)).
Количество агрегированного гаптоглобина, присутствующего в препарате экзосом (200-кратное концентрирование от исходной среды), кондиционированном в буфере РВ8, измеряется с помощью ЕЫ8А и, как определено, является по существу более низким, чем примерно 0,1 нг/мл, более конкретно 0,091 нг/мл или 0,044 нг/мл для двух исследованных препаратов. Для сравнения, содержание агрегированного гаптоглобина в препарате экзосом, полученном в соответствии с опубликованными ранее способами, после идентичного 200-кратного концентрирования, как обнаружено с помощью ЕЫ8А, составляет 400 мкг/мл. Это соответствует количественному извлечению агрегированного гаптоглобина, присутствующего в неочищенной среде АГМ У (2 мкг/мл). Таким образом, способ по настоящему изобретению, по сравнению с известными ранее способами, приводит к уменьшению загрязнения агрегированным гаптоглобином препаратов экзосом в 5-10 миллионов раз (400 мкг/мл против 40-90 пг/мл). Так как ультрафильтрация сред понижает содержание агрегированного гаптоглобина с коэффициентом примерно пятьсот, дополнительные стадии ультрафильтрации, диафильтрации и/или центрифугирования в градиенте плотности также вносит очень значительный вклад в улучшение рабочих характеристик очистки. Эти результаты дополнительно иллюстрируют эффективность настоящих способов при удалении агрегированного гаптоглобина.
9. Дозирование экзосом.
В конкретном воплощении разработан анализ на основе ЕЫ8А в порядке обеспечения количественного измерения экзосом в образце, композиции, жидкости и тому подобное. Фиг. 11 иллюстрирует измерение НЬА-ЭК (то есть МНС II) (11Ь) и СЭ81 (11а) в декзосомах. Анализ НЬА/ΏΚ является как чувствительным, так и функционально представляющим активность декзосом. Этот анализ выбран в качестве анализа для количественного определения препарата декзосомы. Анализ подробно описывается ниже.
Сигнал НЬА/ΏΚ, измеряемый с помощью ЕЬЕЗА, используется для определения количества молекул МНС II, полученных из препарата декзосом. Количество МНС II, связанных с рядом типов клеток, описывалось ранее (Се11а е1 а1 1997). Эти значения приведены в табл. 2.
- 28 005425
Таблица 2. Приблизительные количества молекул МНС II на количество клеток (взято из Сс11а с! а1 997)
| Тип клеток | Молекулы МНС II/клетка (χ Е6) |
| Свежие моноциты | <0,1 |
| Культивируемые моноциты | <1,0 |
| Клетки На | 2,0 |
| Незрелые ОС | 5,2 |
| Зрелые ОС | 8,3 |
Для количественного определения молекул НЬА/ΌΡ лизат ОС или лизат клеток Ρφί используются в качестве стандартов. Фиг. 11 показывает титрование анти-НЬА/ΌΡ при фиксированной концентрации лизата незрелых ОС. Из этого графика вычисляется количество НЬА/ΌΡ молекул по отношению к незрелым дендритным клеткам, которое равно 5,8 χ 106 молекул/клетка, что находится в согласии с литературными данными, приведенными в табл. 1. Идентичный результат получен и для лизата клеток Раф (данные не показаны).
Пример результатов анализа НЬА/ΌΡ, полученных на препарате декзосом, приведен на фиг. 12 (А, В). Сигнал НЬА/ΌΡ представлен на графике как функция от эквивалентного объема супернатанта. Количество молекул НЬА/ОШмкл декзосом определено как равное 4,7 χ 1010, после ультрацентрифугирования в градиенте плотности (то есть в УЦ-градиенте) и диафильтрации в препарате буфера. % извлечения для этого образца составляет 73% НЬА/ΌΡ. Более конкретно, % извлечения является следующим:
| Стадия процесса | Общий % извлечения |
| Осветление через 0,8 мкм | 100% |
| 1 Ультрафильтрация - Концентрирование | 100% |
| 1 Ультрафильтрация - Диафильтрация | 86+/-2% |
| Градиент - | |
| 2 Ультрафильтрация - Диафильтрация | 85+/-2% |
| Стерильная фильтрация, 0,2 мкм | 75+/-3% |
В итоге, анализ ЕЫ8А для определения НЬА/ΌΡ количественно определяет декзосомы в конечном продукте. Так как этот анализ может также измерять НЬА/ΌΡ на дендритных клетках, этот анализ обеспечивает средства для соотнесения дозы НЬА/ΌΡ на дендритную клетку и на объем выделенных декзосом. В этом отношении авторы, как правило, являются способными к генерации, как минимум, 100000 НЬА/ΌΡ молекул на одну незрелую ОС после очистки (10-12 экспериментов).
Подобный анализ осуществляется с использованием антител анти-класса I для иммобилизации, а именно антител, производимых клетками НС-10. Результаты представлены на фиг. 12(С,О). Согласно кривой титрования (12С), количество молекул МНС-Ι может быть определено с помощью любого неизвестного препарата экзосом (120).
10. Определение фенотипа экзосом.
5-10 мкл покрытых анти-НЬА-ΌΡ магнитных сфер промывают в пробирке для микрофугирования вместе с 500 мкл РВ8 с использованием магнитного штатива. Супернатант удаляют и к промытым сферам добавляют 25, 50 или 100 мкл концентрированного препарата экзосом (концентрация экзосом может быть вплоть до 1000 раз). Смесь инкубируют при 4°С в течение примерно 2 ч, на вращающемся столике. После инкубирования 500 мкл РВ8 добавляют к сферам со связанными экзосомами и сферы промывают с использованием магнитного штатива. Супернатант удаляют и сферы со связанными экзосомами суспендируют в 200 мкл окрашивающего буфера. 20 мкл раствора сфер со связанными экзосомами аликвотируют в пробирки для анализа, которые затем приводятся в контакт, каждая по отдельности, с одним из меченых антител, выбранных для анализов. Антитела инкубируют в течение примерно 30 мин при 4°С. Затем к пробиркам добавляют окрашивающий буфер и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляют и добавляют раствор фиксатива (0,5 мл) в каждую пробирку. Каждая пробирка для анализа отбирается и анализируется с помощью проточной цитометрии с использованием устройства ЕАС8Са11Ьиг™.
Результаты, полученные для нескольких препаратов декзосом, представлены на фиг. 13. Эти результаты ясно демонстрируют эффективность и быстроту заявляемого способа для иммунологического определения фенотипа препаратов экзосом.
11. Функциональный анализ.
Приблизительно 20 мкл выделенных декзосом требуется для каждого исследования. Декзосомы инкубируют вместе с 8ЕЕ при концентрации 100 нг/мл (10 мкл исходного раствора из 1 мкг/мл 8ЕЕ в РВ8 с 0,1% В8А) в конечном объеме 100 мкл, в течение 1 ч, при 37°С. После 1 ч инкубирования комплексы декзосом и 8ЕЕ (декзосома/8ЕЕ) отделяют от несвязанного 8ЕЕ путем зонального ультрацентрифугирования (2,2 мл) на двухступенчатом градиенте плотности, состоящем из растворов ОрБргср (фиг. 14-16).
Градиент ОрБргср получают путем сначала добавления 1,7 мл 10% Ор(1ргср (1,67 мл ОрБргср плюс 8,33 мл ΡРМI) в каждую пробирку для анализа. Затем 100 мкл 20% Ор(1ргср (3,33 мл ОрБргср плюс 6,67 мл ΡРМI) добавляют в нижнюю часть каждой пробирки, с последующим добавлением 100 мкл 40%
- 29 005425
ОрБргер (6,67 мл Орйргер плюс 3,33 мл ПРМк) под 20% ОрБргер. Затем образцы экзосома/8ЕЕ наслаивают поверх ступеньки, при конечном объеме 200 мкл, в 0,1% В8А в РВ8. Пробирки центрифугируют в течение 40 мин при 100000 об/мин при 4°С с использованием медленного ускорения и замедления в роторе с качающимися подвесками (ТБ8-55). 200 мкл образцов собирают со дна пробирки, которая содержит комплексы экзосома/8ЕЕ, освобожденные от несвязанного 8ЕЕ. Свободный 8ЕЕ остается в зональном слое (10% Орйргер), в то время как комплекс экзосома/8ЕЕ седиментирует в 20-40% области пробирки. Поскольку ОрБргер, как обнаружено, вмешивается в определение с помощью ЕЫ8А, использование распределения плотности из Б2О и сахарозы является предпочтительным, если такое определение потребуется.
Клетки Кар, декзосома/8ЕЕ (или суррогат/8ЕЕ), а затем клетки Л1гса1 добавляют в лунки планшета (100 мкл (30000 клеток) каждого вида клеток используется для каждой лунки). Также добавляют положительный и отрицательный контроли: клетки 1игса1 сами по себе (отрицательный контроль), Л1гка1 плюс 1 нг/лунка 8ЕЕ (отрицательный контроль), Кар сами по себе (отрицательный контроль), Кар и 1игка1 плюс декзосомы, в которые не вводится 8ЕЕ (фоновый контроль), Кар и 1игка1 плюс 1 нг/лунка 8ЕЕ (положительный контроль). Планшет инкубируют в течение 18 ч при 37° с 5% СО2. Супернатант культуры клеток собирают из каждой лунки планшета с помощью центрифугирования при 1200 об/мин (с использованием держателей для планшета) в течение 15 мин. 200 мкл супернатанта используются в анализе ЕЫЗА для измерения секреции ГБ-2. Анализ ЕЫЗА может быть осуществлен немедленно или позднее (в этом случае планшет может быть завернут в парапленку и заморожен до тех пор, пока он не будет использоваться).
Анализ Ш2 с помощью ЕЫ8А осуществляется с использованием набора ЕЫЗА I Ш-2 (набор Ойо ΌΥ202, Β&Ό 8у51ет5) в планшетах Со51аг ЕЫ8А (Сойаг 2581), следуя инструкциям производителя. Результаты показывают зависимую от дозы связь между секрецией №2 и количеством экзосом на лунку, которое преобразуется в объем, эквивалентный объему исходного раствора для экзосом. Секреция ]Б2 является зависимой от 8ЕЕ, поскольку экзосомы требуют 8ЕЕ для стимулирования антигеннеспецифичных Т-лимфоцитов (например, Л1гка1). Единица половины от максимального значения вводится как полуколичественная мера для титра декзосом в этом способе. Она определяется как объем экзосомы, при котором половина от максимальной секреции №2 клетками Лиса! достигается при условиях, используемых в эксперименте. Чем меньшая единица половины от максимума измеряется, тем больше титр.
12. Непосредственная нагрузка пептидов.
Этот пример описывает методологию непосредственной нагрузки, параметры, влияющие на нагрузку, конкуренцию при связывании, между пептидом сравнения и целевыми пептидами, с декзосомами и биологическую активность декзосом, нагруженных антигеном. Г енерируется протокол, основывающийся на непосредственной нагрузке рестриктированного пептида НБА-А2. Такой же протокол может быть использован для рестриктированных пептидов НБА-А1. Также обсуждаются значение и преимущества непосредственной нагрузки декзосомы пептидами в клинических испытаниях при терапии.
Этот пример показывает, что является возможным нагружать антигенные молекулы непосредственно на декзосомы, и что такие декзосомы с непосредственной нагрузкой являются способными к стимулированию клонов СТБ. Результаты показывают, что непосредственная нагрузка может быть более эффективной, чем опосредованная нагрузка ОС, так как необходимо более низкое количество пептидов.
12.1. Способы.
Непосредственная нагрузка пептидов на экзосому в присутствии и отсутствие β2-ιη.
Рестриктированный петид сравнения НБА-А2 ЕЕР8БСЕР8У, полученный из природного эпитопа антигена из ядра НераИИз В, биотинилируется посредством цистеина. Он конкурирует с немеченым пептидом сравнения, что говорит о том, что биотинилированный пептид сохраняет свою способность к связыванию с молекулами НБА-А2. Для непосредственной нагрузки пептидами в присутствии экзогенного β2-ιη 100 мкл очищенных НБА-А2+ и НБА-А2- отрицательных декзосом обрабатывают с помощью равного объема лимонной кислоты или ацетатного буфера, значение рН 3,2-5,2, при 4°С, в течение 90 с, понижение значения рН способствуют элюированию связанных эндогенных пептидов. После обработки препарат немедленно нейтрализуют с помощью коктейля, значение рН 11, содержащего Трис, экзогенный пептид (конечная концентрация от 0,01 до 10 мкг/мл) и β2-ιη (конечная концентрация от 0 до 80 мкг/мл), и инкубируют при комнатной температуре для предоставления возможности преобразования тримолекулярного комплекса класса I, β2-ιη и пептида на поверхности декзосомы. Для непосредственной нагрузки в отсутствие экзогенного β2-ιη декзосомы сначала смешивают с экзогенным пептидом (конечная концентрация 10 или 100 мкг/мл), затем с равным объемом ацетатного буфера, значение рН 4,2-5,2, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Во время этого периода, осуществляется обмен пептидов, приводящий к связыванию экзогенного пептида, присутствующего в избытке. Экзогенный пептид может быть одним только биотинилированным пептидом или смесью меченого пептида с увеличенным количеством целевого пептида. Удаление несвязанного пептида и β2-ιη не является необходи
- 30 005425 мым, так как источник сигнала происходит из комплексов пептидов класса Ι, иммобилизованных на анти-НБА антителах класса Ι, описанных ниже.
Измерение количества пептида сравнения, связанного с декзосомой, с помощью ТКЕ
Декзосомы, нагруженные пептидом, лизируются с помощью 1% ΝΡ 40 на льду в течение 30 мин. Комплексы молекул класса Ι, содержащие меченый пептид сравнения, в лизатах иммобилизуются с помощью антитела антикласса Ι посредством анти-мышиного ΙβΟ кролика, нанесенного на планшет ЕБ18А. После инкубирования и промывания добавляют меченый европием стрептавидин, и флуоресцентный сигнал от европия генерируется с помощью ЕпйапссшсЩ ВиГГег и считывается с помощью νΐοΐοτ 2 Е1иоГс5сспсс Кеабег в соответствии с инструкциями производителя (\Уа11ас). Путем сравнения уровня флуоресцентного сигнала с количественным стандартом европия может быть установлено абсолютное количество биотинилированного пептида сравнения на основе удельной активности стрептавидина, меченого европием.
Конкуренция при связывании с декзосомой пептида сравнения с целевыми пептидами
Конкуренция в присутствии β2-ιη.
Вплоть до 100-кратного избытка пептидов МАСЕ 3А1, МАСЕ-3, 4 и 10 смешивают с 5 мкг/мл биотинилированного пептида сравнения в буфере для нагрузки, содержащем 20 мкг/мл β2-ιη, и нагружают на обработанные кислотой декзосомы. Сигнал от пептида сравнения детектируется с помощью ТКЕ, вычисляется уменьшение сигнала от МАСЕ 3, 4 и 10.
Конкуренция в отсутствие β2-ιη.
Немеченый пептид, в 5-20-кратном избытке относительно биотинилированного пептида и пептида сравнения (100 мкг/мл) приготавливают в ацетатном буфере при значениях рН 4,8 или 5,2. Этот пептид добавляют к равному объему декзосом и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Сигнал от пептида сравнения детектируется с помощью ТКЕ и вычисляется уменьшение сигнала от МАСЕ-3, 4 и 10 или МАСЕ-3А1.
Анализ с помощью 8ЕЕ
100 мкл пептида, непосредственно нагруженного декзосомами, в присутствии и в отсутствие β2-ιη инкубируют вместе со 100 нг/мл 8ЕЕ при 37°С в течение 1 ч. После удаления несвязанного 8ЕЕ с помощью зонального центрифугирования в градиенте плотности комплексы декзосом и 8ЕЕ инкубируют вместе с клетками Кар и клетками 1игса1 в течение 18 ч. Супернатант культуры собирают для измерения секреции ΙΕΝ-γ клетками Лиса!
Анализ стимуляции клона СТЬ, специфичного по отношению к Магк-1
Декзосомы, непосредственно нагруженные пептидом МАКТ-1, как описано выше, отмывают от свободного пептида после нагрузки и инкубируют вместе с клетками ОС и клоном ЬТ 11 Т-лимфоцитов в течение 24 ч. Биологическую активность измеряют по секреции ГБ-2 с помощью ЕБ18А в соответствии со следующим анализом клона Т-лимфоцитов.
Используемый пептид представляет собой рестриктированный петид НБА-А2 МАКТ-1, имеющий последовательность оснований Е^АСIСI^ТV.
Несвязанный пептид Май-1 удаляют с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Необходимо понять, что удаление несвязанного пептида с декзосом не является обязательным, но понижает неспецифическое связывание.
Анализ клона Т-лимфоцитов х 103 полученных из НБА положительных или отрицательных А2 моноцитов дендритных клеток (ВМ-ЭС) инкубируют в течение 2 ч вместе с 15 мкл (1 х 1010 класс ΙΙ) препарата декзосом в круглодонном 96-луночном планшете при 37°С, затем 20 х 103 клеток клона БТ11 Т-лимфоцитов добавляют к клеткам ВМ-ЭС человека, конечный объем на одну лунку составляет 200 мкл. Спустя 24 ч супернатанты собирают и анализируют на присутствие Ш-2 с помощью ЕБ18А. Клетки ВМ-ЭС НБА А2+, в которые непосредственно вводится 10 мкм пептида Май (ЕБАСЮШТ^, используются в качестве положительного контроля.
Декзосомы, нагруженные пептидом Р1А
Декзосомы мышей Н2Ь и Н2б непосредственно нагружаются пептидом ΟVА 257-269 (8П№ЕКБ) следующим образом: 1 объем №1-ацетатного буфера (0,2 М, рН 5) добавляют к 1 объему экзосом и инкубируют в течение 90 с при 4°С, затем нейтрализуют путем добавления 2 М раствора Трис (значение рН
11), содержащего 10 мкм пептида ΟVА и 40 мкг/мл Ь2-микроглобулина человека. После инкубирования в течение 4 ч при комнатной температуре комплексы ΟVА и декзосом отделяются от несвязанного пептида ΟVА с помощью градиента Орбргер.
Анализ клона Т-лимфоцитов х 103 Клеток Ό1 инкубируют в течение 30 мин вместе с 25 мкл или 50 мкл препарата декзосом в круглодонном 96-луночном планшете при 37°С. Затем, 25 х 103 клеток гибридомы Т-лимфоцитов (Β3Ζ) добавляют к клеткам Ό1, конечный объем на одну лунку составляет 200 мкл. Спустя 24 ч супернатанты собирают и анализируют на присутствие Ш-2 с помощью ЕБ18А. Клетки Ό1, в которые непосредственно вводят 10 мкм пептида ОVА, используются в качестве положительного контроля.
- 31 005425
12.2. Результаты.
Непосредственная нагрузка декзосомы Н1А-А2+ в присутствии р2-т
Непосредственная нагрузка пептидов на декзосомы НЬА-А2+ сначала осуществляется с использованием рестриктированного пептида сравнения НЙА-А2 Н-ЕЬР8ПС(биотин)ЕР§У-ОН, как описано. Декзосомы НЙА-А2- используются для контроля специфичности относительно НЬА. Фиг. 17 показывает молекулы НЙА-А2, нагруженные биотин-меченым пептидом сравнения, иммобилизованные на планшете с помощью антител анти-класса Ι, после лизиса декзосом. Связывание пептида сравнения с декзосомой является специфичным по отношению к НЙА-А2, поскольку он не связывается с декзосомами НЙА-А2-. Связывание зависит от количества как пептида, так и декзосом.
Параметры для непосредственной нагрузки пептидов оцениваются с использованием описанного анализа с помощью ТКЕ. Выбор буфера зависит от его воздействия на эффективность нагрузки пептида и на целостность декзосом, что измеряется с помощью анализа с использованием 8ЕЕ. С целью оптимизации условий для нагрузки пептида сравнения исследуется диапазон значений рН у буферов для нагрузки. Авторы обнаружили, что сравнимые сигналы для связывания пептида получаются при использовании подобных условий нагрузки либо с использованием фосфатного буфера с лимонной кислотой, либо натрий-ацетатного буфера (фиг. 18). Чтобы исследовать, может ли обработка слабой кислотой изменить конформацию молекул, экспрессированных на декзосоме, и ослабить их функционирование, авторы осуществляют анализ с использованием суперантигена, в котором суперантиген 8ЕЕ, связанный с молекулами НЬА-ЭК декзосом, индуцирует секрецию 1Ь-2 клетками .Титса! в присутствии клеток Ка_ц в качестве А-клеток. Фиг. 19 показывает, что препараты декзосом, обработанные с помощью ацетата натрия при значении рН 4,2, индуцируют такое же количество секреции -1Ь-2, как и необработанный контроль при анализе с использованием 8ЕЕ. Декзосомы, обработанные с помощью лимонной кислоты/фосфатного буфера при таком же значении рН 4,2, также индуцируют секрецию 1Ь-2, хотя и до гораздо меньшей степени. В этом отношении цитратный буфер может инактивировать экзосомы, так что условия, используемые для нагрузки целых клеток с использованием нитратного буфера, являются неэффективными при нагрузке экзосом. Натрий-ацетатный буфер, таким образом, выбирается для дополнительных исследований. Затем авторы исследуют, улучшается ли связывание пептида с декзосомой НЬАА2 в присутствии экзогенного β2-ιη. Фиг. 20 показывает, что при 10 мкг/мл рестриктированного меченого биотином пептида сравнения НЬА-А2, добавление 20 мкг/мл β2-ιη значительно повышает количество связанного пептида сравнения.
В порядке определения количества пептида, необходимого для насыщения связывания с молекулами НЬА А2, авторы осуществляют титрование пептида, где 0-20 мкг/мл пептида добавляют во время нагрузки. Фиг. 21 показывает, что нагрузка насыщается, когда используется более чем 1,25 мкг/мл пептида сравнения. Кинетика нагрузки пептида оценивается с использованием трех различных препаратов декзосом путем варьирования времени инкубирования при комнатной температуре. Фиг. 22 показывает, что связывание пептида является относительно постоянным в пределах между тридцатью минутами и 4 часами инкубирования для всех трех исследованных декзосом, указывая на то, что большая часть связывания осуществляется в пределах 30 мин. Согласно своим исследованиям, авторы делают вывод о том, что нагрузка при использовании элюирования с помощью слабой кислоты, при значении рН натрийацетатного буфера, равном 4,2, 10 мкг/мл пептида класса I, 20 мкг/мл β2-ιη, при времени нагрузки 30 мин, при комнатной температуре обеспечивает оптимальные условия для нагрузки пептидов класса Ι на декзосомы.
Авторы создали анализ конкуренции между пептидами для получения доказательств того, что немеченые целевые пептиды могут быть нагружены на декзосомы таким же способом. Немеченые целевые пептиды МАСЕ-3, 4 или 10 смешиваются с 5 мкг/мл меченого пептида сравнения при соотношениях 1100. Уменьшение флуоресцентного сигнала от пептида сравнения указывает на конкурентное связывание немеченого целевого пептида с декзосомами. Как демонстрируется на фиг. 23, все три разновидности МАСЕ пептидов выигрывают конкуренцию у пептида сравнения при связывании с декзосомами. МАСЕ 3 и 10 выигрывают конкуренцию у МАСЕ-4, что указывает на то, что они имеют, возможно, более высокую аффинность связывания с молекулами НЬА-А2, чем МАСЕ-4, при условиях нагрузки.
Функциональный анализ с использованием специфичного по отношению к пептиду МАКТ-1 клона Т-лимфоцитов, ЬТ11, производится с целью исследования биологической активности декзосомы, которая является мерой антиген-специфичной реакции Т-лимфоцитов ίη νίΙΐΌ. Следуя протоколу для непосредственной нагрузки декзосомы пептидами класса I, МАКТ-1, рестриктированный пептид НЬА-А2 нагружают на декзосомы НЬА-А2+ или НЬА-А2- при концентрации пептида от 0,01 до 10 мкг/мл. Нагруженные декзосомы затем промывают путем центрифугирования в градиенте плотности для удаления несвязанного пептида. Результаты представлены на фиг. 24, и они показывают, что клетки НЬА А2+ ВМОС, в которые вводится 10 мкМ Май, способны к активации клона ЬТ11, который распознает НЬА А2 с помощью пептида Май. Клетки НЬА А2- ВМ-ЭС не могут стимулировать клон ЬТ11. Клетки ВМ-ЭС, в которые вводится 15 мкл декзосом НЬА А2+, непосредственно нагруженных Май, являются способными активировать клон ЬТ11 независимо от гаплотипа дендритных клеток.
- 32 005425
Ранее декзосомы, опосредованно нагруженные пептидом, индуцировали только незначительные уровни секреции 1Ь-2, даже тогда, когда 10 мкг/мл пептида Май-1 добавлялось к культуре ОС для получения декзосом. Декзосомы, непосредственно нагруженные пептидом Май-1, четко и воспроизводимым образом стимулируют клон ЬТ 11, что говорит о том, что непосредственная нагрузка пептидов представляет собой более эффективный путь для получения биологически активных декзосом.
Такой же протокол применяют для непосредственной нагрузки рестриктированного пептида НЕЛАЕ В эксперименте биотинилированный пептид сравнения ЕУОРС(биотин)СНЬУ, полученный из природного рестриктированного пептида НЬА-А1, МАСЕ3-А1 с последовательностью ЕУОРЮНЬУ, связывается с декзосомой А1+/А2- (Ехо 433), но не с декзосомой А1-/А2+ (Ехо 427). Подобным же образом, рестриктированный пептид сравнения НЬА-А2, полученный из антигена ядра Нерайбк В, связывается с декзосомой А1-/А2+, но не с А1+/А2-, демонстрируя строго НЬА-аллельзависимую нагрузку пептидов антигенов класса I. Нижний график на фиг. 10 показывает немеченый пептид МАСЕ3-А1. конкурирующий с биотинилированным пептидом МАСЕ-3А1 за связывание на декзосоме А1+ (Ехо 433).
Подход с непосредственной нагрузкой также применяется к пептиду Р1А и декзосомам мышей. Результаты представлены на фиг. 25. Клетки Ώ1, в которые вводится 25 мкл или 50 мкл ОУА, непосредственно нагружают на декзосомы Н2Ь, которые способны активировать клетки Β3Ζ, которые распознают Кь с пептидом ОУА. Авторы также наблюдали активацию до меньшей степени, когда в клетки Ώ1 вводятся декзосомы Н2'1, непосредственно нагруженные ОУА.
Подобные же результаты получают с использованием рестриктированных пептидов НЬА-А1. Непосредственная нагрузка декзосом НЬА-А2+ в отсутствие р2-ш
Как показано на фиг. 20, после кислотного элюирования при значении рН 4,2 экзогенный пептид может нагружаться на декзосому при нейтральном значении рН и без добавления экзогенного β2-ιη. Поскольку сигнал от связывания составляет от одной четверти до одной трети от связанного с присутствием 20 мкг/мл β2-ιη, авторы оптимизируют экспериментальные условия для повышения эффективности нагрузки в отсутствие экзогенного β2-ιη. Исследуются две концентрации пептида, 10 и 100 мкг/мл биотинилированного пептида сравнения, и натрий-ацетатные буферы при значениях рН 4,2, 4,5, 4,8 и 5,2. Фиг. 26 показывает, что нагрузка пептида сравнения сильно увеличивается в присутствии 100 мкг/мл ацетатного буфера при значении рН 4,8.
В отличие от нагрузки декзосом в присутствии β2-ιη, в котором декзосомы быстро нейтрализуются через 90 с кислотной обработки, нагрузка декзосом в отсутствие β2-ιη требует их выдерживания при значении рН 4,8 или 5,2 в течение длительного периода, как правило, минимум 30 мин при комнатной температуре. Фиг. 27 показывает, что не существует различий в секреции 1Ь-2 клетками 1игса1, индуцированной декзосомами, нагруженными 8ЕЕ, необработанными или обработанными при значении рН 4,8 или 5,2, что указывает на то, что обработка не повреждает экзосомы.
Чтобы продемонстрировать, что целевые пептиды, МАСЕ-3, 4 и 10, могут быть нагружены в отсутствие β2-ιη, осуществляется ряд экспериментов с конкуренцией. На фиг. 28, 5-20-кратное количество пептидов МАСЕ-4 и МАСЕ-10 конкурирует с пептидом сравнения при значении рН 4,8. Ингибирование с помощью 20-кратного избытка МАСЕ-4 или МАСЕ-10 составляет 35% или 66%, соответственно, подобно уровням ингибирования в присутствии β2-ιη при значении рН 4,2 (см. фиг. 23), указывая на то, что эти два пептида могут быть нагружены обоими способами. Фиг. 29 показывает ингибирование с помощью МАСЕ-3 при значении рН 5,2. Нагрузка МАСЕ-3 выглядит более эффективной при значении рН
5,2, чем при значении рН 4,8, поскольку при значении рН 4,8 конкуренция со стороны МАСЕ-3 является гораздо более слабой (данные не показаны).
На основе указанных выше результатов авторы нагружают пептид Май-1 на НЬА-А2+ в отсутствие β2-ιη и исследуют его при анализе ЬТ 11. Фиг. 30 показывает биологическую активность декзосом, нагруженных пептидом Май-1, в отсутствие β2-ιη. В этом эксперименте, пептид Май-1 при концентрации 10 и 100 мкг/мл нагружают на декзосомы НЬА-А2+ (Ехо 447) и НЬА-А2-(Ехо 450) при значениях рН как 4,8, так и 5,2 в отсутствие β2-ιη. В качестве контроля Ехо 447 также нагружают 10 мкг/мл Май-1 в присутствии β2-ιη. Все декзосомы, нагруженные при трех различных условиях (значение рН 4,8, без β2-ιη, значение рН 5,2, без β2-ιη, значение рН 4,2, с β2-ιη), имеют сходную биологическую активность, что указывает на то, что β2-ιη не является абсолютно необходимым для генерации биологически активных декзосом.
Непосредственная нагрузка декзосомы НЬА-А1+//В35+ в присутствии и в отсутствие в2-т
Такой же протокол может быть применен для непосредственной нагрузки рестриктированного пептида НБА-А1 В35. Нонамерный МАСЕ-3А1 (ЕУОРЮНЬУ), полученный из белка МАСЕ-3, презентируется с помощью НЬА-А1 и НЬА-В35. Чтобы исследовать, может ли этот пептид быть нагруженным на декзосомы НЬА-А1+, авторы создают пептид сравнения, именуемый МАСЕ-3А1С5, в котором изолейцин пептида МАСЕ-3А1 замещается цистеином, и метят его биотином. В эксперименте, представленном на верхнем графике фиг. 31, биотинилированный МАСЕ-3А1С5 нагружают на декзосому НЬА-А1+/А2- (Ехо 433) в присутствии β2-ιη. Авторы обнаружили, что этот же пептид не может быть нагружен на декзосому
- 33 005425
НЬА-А1-/А2+ (Ехо 427) . Подобным же образом рестриктированный биотинилированный пептид сравнения НЬА-А2, полученный из антигена ядра Нера11118 В, может быть нагружен на декзосому А1-/А2+, но не на А1+/А2-, демонстрируя строгую НЬА-аллель-зависимую нагрузку пептидов антигенов класса I. Нижний график фигуры 31 показывает природный пептид МАСЕ3-А1, конкурирующий с биотинилированным пептидом МАСЕ-3А1С5 за связывание на декзосоме А1+ (Ехо 433), указывая на способность связывания немеченого пептида МАСЕ3-А1 с декзосомой А1+.
Из-за ограниченности источников декзосом НЬА-А1+ авторы используют декзосому НЬА-В35+ (Ехо 426) для исследования связывания МАСЕ 3-А1 и ингибирования в отсутствие β2-ιη. Путем использования таких же условий нагрузки для декзосом НЬА-А2+ авторы непосредственно показывают на верхнем графике фиг. 32, что МАСЕ-3А1С5 может связываться с декзосомой НЬА-В35+ либо при значении рН 4,8, либо при значении рН 5,2, при меньшем неспецифичном связывании с декзосомой НЬА-А1-В35-, при рН 5,2 (Ехо 424). Нижний график фиг. 32 показывает ингибирование МАСЕ-3А1С5 природным пептидом МАСЕ-3А1 при значении рН 4,8 и 5,2 в отсутствие β2-ιη. Ингибирование связывания с помощью природного МАСЕ-3А1 является гораздо более сильным при значении рН 4,8, что говорит о лучшей способности немеченого пептида МАСЕ-3А1 к связыванию с декзосомой НЬА-В35+ при этом значении рН. Эти результаты показывают широкое применение непосредственной нагрузки пептидов на других аллелях НЬА класса I.
Этот пример, таким образом, описывает высокоэффективный способ для получения биологически активных декзосом, нагруженных иммуногенными соединениями (например, рестриктированными пептидами класса I, полученными из опухолей) посредством способа, известного как непосредственная нагрузка. Молекулы декзосом класса I, с которых удалены эндогенные пептиды и β2-ιη, путем обработки слабой кислотой могут эффективно нагружаться целевыми пептидами, как показывают биохимические и функциональные данные. Сравнивая сигналы флуоресценции от пептидов сравнения, связанных с декзосомами, и от европиевого стандарта, количество пептида, связанного с декзосомами, может быть измерено количественно. Табл. 3 показывает абсолютное количество пептида сравнения, связанного с декзосомами, в отсутствие β2-ιη. Имеется пептид сравнения в пределах между 0,1 и 1,2 нг на 1014 молекул класса II в зависимости от донора и используемых условий нагрузки. Это количество является очень близким к тому, что находится в полученном препарате декзосом (1 нг на 1014 молекул класса II), в котором нагрузка пептида при значении рН 4,8 при 10 мкг/мл пептида, осуществляется в гораздо большем масштабе. Несмотря на то, что связывание в отсутствие β2-ιη является меньшим (фиг. 23), данные анализа ЬТ 11 (фиг. 30), проведенного авторами, показывают схожую биологическую активность у декзосом, нагруженных при различных условиях, что указывает на то, что непосредственная нагрузка в отсутствие β2-ιη является достаточной для биологического функционирования.
Количественное определение уровня молекул класса I на декзосомах с помощью ТЕЕ и ЕЫЗА делает возможным определение доли сайтов, занятых пептидами, на молекулах класса I. Авторы установили, что доля сайтов, занятых пептидом сравнения, на молекулах НЬА-А2 декзосом достигает 15%, более предпочтительно 40%. Высокая доля сайтов, занятых пептидами, значительно повышает стимулирующую активность Т-лимфоцита, измеренную с помощью анализа Т-лимфоцитов ίη уйго. Более того, количественное определение нагруженного пептида и определение доли сайтов, занятых пептидами, на молекулах класса I, на декзосомах должно помочь при оценке дозировки кандидатов в терапевтические средства на основе декзосом, что является важным аспектом при планировании исследований на животных и будущих терапевтических испытаний.
Прямая нагрузка также может быть осуществлена в отсутствие β2-ιη. При использовании высоких концентраций пептида и слабого кислотного буфера наблюдается обмен пептидов на молекулах НЬА. Авторы демонстрируют с помощью эксперимента по конкуренции, что исследуемые авторами целевые пептиды МАСЕ-3, 4 и 10 могут таким способом специфично нагружаться на декзосомы НЬА-А2+. Декзосома, нагруженная пептидом Маг1-1 в отсутствие β2-ιη, стимулирует секрецию ΓΕΝ-γ ЬТ 11, демонстрируя биологическую активность декзосомы. Следовательно, производство биологически активных декзосом без β2-ιη является возможным, таким образом, устраняя имеющиеся в настоящее время трудности с использованием β2-ιπ, выделенного у доноров-людей, или рекомбинантного β2-ιη с чистотой ниже СМР. Общая нагрузка является более низкой в отсутствие β2-ιη, но это видимо не воздействует на активацию ЬТ 11, что говорит о том, что биологический анализ является гораздо более чувствительным, чем биохимический анализ.
Авторы демонстрируют, что непосредственная нагрузка пептида может иметь широкие применения на различных аллелях НЬА класса I, подобных НЬА-А2, А1 и В35. Ранее нагрузка декзосом пептидами основывалась на опосредованном подходе, включавшем в себя повышенное манипулирование культурой клеток и, таким образом, повышенные шансы загрязнения. Непосредственная нагрузка пептидом является более безопасной при производстве декзосом, из-за устранения необходимости в β2-ιη и в сложной операции добавления пептида в каждую колбу с культурой.
- 34 005425
Таблица 3
| Препарат декзосом рН 5,2, без | ΗΙΑ класса II (1010/мкл) | фмоль пептида/ 16,6 мкд образец Цех | мкг пептида (10~9)/ 10м класса 11 |
| β2-ιη 100 мкг/мп пептида Юех 375 | 2,89 | 1,4 + /-0,1 | 0,42 |
| Оех 430 | 3,99 | 6+/-,05 | 1,3 |
| ϋθχ 431 | 1,44 | 1,99+/-0,1 | 1,2 |
| Ώθχ 447 | 12,7 | 1,52+/-0,1 | 0,01 |
| ΡβΟΙ | 6,57 | 1,3 +/-0,2 | 0,2 |
| ν?0023-02 | 1,21 | 0,93+/-0,1 | 0,7 |
| рН 5,2 без β2-ιη 10 мкг/мл пептида 430 | 3,99 | 0,9+/-0,2 | 0,2 |
| 447 | 12,7 | 1,6+/-0,06 | 0,11 |
| рН 4,8 без β2—т 100 мкт/мл пептида 375 | 2,89 | 4,6 +/-0,4 | 1,4 |
| 447 | 12,7 | 8,8 +/-0,2 | 0, 6 |
| Р<201 | 6,57 | 5,9+/-10 | 0, 8 |
| νΡ0023-02 | 1,21 | 3,6+/-0,3 | 2, 6 |
| рН 4,8 без β2-πι 10 мкг/мл пептида 375 | 2,89 | 1,2+/-0,3 | 0,36 |
| 447 | 12,7 | 2,4 | 0,16 |
| Р001 | 6,57 | 1,1+/-0,1 | 0,14 |
| УР0023-02 | 1,21 | 1,7 +/-0,5 | •1,2 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (26)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ приготовления иммуногенной мембранной везикулы, причем способ включает в себя выделение или очистку мембранной везикулы из биологического образца и взаимодействие указанной очищенной мембранной везикулы с пептидом или липидом при условиях, обеспечивающих связывание пептида или липида с антигенпрезентирующей молекулой на поверхности указанной мембранной везикулы.
- 2. Способ по п.1, где мембранные везикулы выделяют из биологического образца, содержащего антигенпрезентирующие клетки.
- 3. Способ по п.2, где мембранные везикулы выделяют из биологического образца, содержащего дендритные клетки человека.
- 4. Способ по п.1, включающий в себя стадию воздействия выбранной кислой среды на выделенные или очищенные мембранные везикулы до, во время или после взаимодействия указанных везикул с указанным пептидом или липидом.
- 5. Способ по п.1, где после взаимодействия везикулы подвергаются центрифугированию в градиенте плотности или диафильтрации для удаления несвязанного пептида или липида.
- 6. Способ по п.1, где пептид представляет собой рестриктированный петид класса Ι.
- 7. Способ по п.1, где пептид представляет собой рестриктированный пептид класса ΙΙ.
- 8. Способ по п.1, где везикулы взаимодействуют со смесью пептидов.
- 9. Способ по п.8, где везикулы взаимодействуют с элюатом пептидов из клеток опухоли.
- 10. Способ по п.1, где антигенпрезентирующая молекула представляет собой молекулу СЭ1 и липид является выбранным из микробного липида, микробного гликолипида и липидного или гликолипидного антигена опухоли.- 35 005425
- 11. Способ по п.1, предназначенный для приготовления иммуногенной мембранной везикулы, содержащей комплекс экзогенного пептида класса I, связанного с молекулой НЬА класса I, причем способ включает в себя (ί) воздействие на выделенную или очищенную мембранную везикулу выбранной кислой средой, (ίί) взаимодействие указанной выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом класса I в присутствии бета-2-микроглобулина при условиях, обеспечивающих образование комплекса пептида с молекулой НЬА класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, и (ίίί) сбор нагруженной мембранной везикулы.
- 12. Способ по п.11, где стадия (ί) включает в себя воздействие на выделенные или очищенные мембранные везикулы среды при значении рН, находящемся в пределах между примерно 3 и 5,5, в течение менее чем 15 мин.
- 13. Способ по п.11, где стадия (ίί) включает в себя взаимодействие выделенной или очищенной мембранной везикулы с 0,005-50 мкг/мл рестриктированного пептида класса I в присутствии бета-2микроглобулина.
- 14. Способ по п.1, предназначенный для приготовления иммуногенной мембранной везикулы, содержащей комплекс экзогенного пептида класса I, связанного с молекулой НЬА класса I, способ включает в себя (ί) взаимодействие выделенной или очищенной мембранной везикулы с рестриктированным пептидом класса I в отсутствие бета-2-микроглобулина, (ίί) воздействие на смесь после стадии (ί) выбранной кислой средой при условиях, обеспечивающих обмен пептида с любым эндогенным пептидом, с целью связывания с молекулой НЬА класса I на поверхности указанной мембранной везикулы, (ίίί) нейтрализацию среды для прекращения обмена и стабилизации комплекса, сформированного на стадии (ίί), и (ίν) сбор нагруженной мембранной везикулы.
- 15. Способ по п.14, где стадия (ίί) включает в себя воздействие на смесь выбранной кислой средой при значении рН, находящемся в пределах между примерно 4 и 5,5 в течение менее чем 2 ч.
- 16. Способ по п.14, где стадия (ί) включает в себя взаимодействие выделенной или очищенной мембранной везикулы с 5-500 мкг/мл рестриктированного пептида класса I в отсутствие бета-2микроглобулина.
- 17. Способ по п.11, где пептид выбран из антигена опухоли, антигена вируса, антигена паразита и антигена бактерии.
- 18. Способ по п.14, где пептид выбран из антигена опухоли, антигена вируса, антигена паразита и антигена бактерии.
- 19. Способ приготовления нагруженных пептидами мембранных везикул, включающий в себяa) культивирование популяции антигенпрезентирующих клеток, в частности дендритных клеток, при условиях, обеспечивающих высвобождение мембранных везикул антигенпрезентирующими клетками, в частности дендритными клетками,b) стадию обогащения или очистки мембранных везикул иc) взаимодействие мембранных везикул с пептидом при условиях, обеспечивающих связывание пептида с молекулой МНС на поверхности указанных мембранных везикул, с получением нагруженных пептидом мембранных везикул.
- 20. Способ приготовления нагруженных пептидом мембранных везикул, включающий в себяa) получение популяции незрелых дендритных клеток,b) культивирование популяции незрелых дендритных клеток при условиях, обеспечивающих высвобождение мембранных везикул незрелыми дендритными клетками,c) стадию обогащения или очистки мембранных везикул иб) взаимодействие мембранных везикул с пептидом при условиях, обеспечивающих связывание пептида с молекулой МНС на поверхности указанных мембранных везикул, с получением нагруженных пептидом мембранных везикул.
- 21. Способ по п.19, где до или после стадии с) мембранные везикулы подвергаются воздействию выбранной кислой среды.
- 22. Способ по п.20, где до или после стадии б) мембранные везикулы подвергаются воздействию выбранной кислой среды.
- 23. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, причем способ включает в себя (ί) получение биологического образца, содержащего дендритные клетки, (ίί) выделение или очистку мембранной везикулы из указанного биологического образца, (ίίί) взаимодействие указанной очищенной мембранной везикулы с пептидом или липидом при условиях, обеспечивающих связывание пептида или липида с молекулой МНС или СО 1 на поверхности указанной мембранной везикулы, и (ίν) введение мембранной везикулы со стадии (ίίί) субъекту для индукции иммунного ответа у указанного субъекта.
- 24. Способ по п.23, где антигенпрезентирующая молекула представляет собой молекулу ί'Ό1 и липид выбран из липида микроба, гликолипида микроба и липидного или гликолипидного антигена опухоли.
- 25. Способ приготовления фармацевтического продукта, содержащего иммуногенную мембранную везикулу и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, где способ включает в себя (ί) выделение мембранной везикулы из биологического образца, (ίί) нагрузку указанной выделенной мембран- 36 005425 ной везикулы иммуногенным пептидом или липидом с получением иммуногенной мембранной везикулы, (ίίί) предпочтительно удаление несвязанного иммуногенного пептида или липида и (ίν) взаимодействие иммуногенной мембранной везикулы с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
- 26. Способ по любому из пп.1-25, где мембранные везикулы выделяют из биологического образца путем обработки указанного биологического образца с помощью центрифугирования в градиенте плотности.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/561,205 US6812023B1 (en) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | Methods of producing membrane vesicles |
| US09/780,748 US20040241176A1 (en) | 2000-04-27 | 2001-02-09 | Method of producing membrane vesicles |
| PCT/EP2001/004173 WO2001082958A2 (en) | 2000-04-27 | 2001-04-11 | Methods of producing membrane vesicles |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200201150A1 EA200201150A1 (ru) | 2003-04-24 |
| EA005425B1 true EA005425B1 (ru) | 2005-02-24 |
Family
ID=27072576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200201150A EA005425B1 (ru) | 2000-04-27 | 2001-04-11 | Способы получения мембранных везикул |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040241176A1 (ru) |
| EP (1) | EP1278825B1 (ru) |
| JP (1) | JP2003531864A (ru) |
| CN (1) | CN1426461A (ru) |
| AT (1) | ATE330002T1 (ru) |
| AU (1) | AU6587301A (ru) |
| CA (1) | CA2407225A1 (ru) |
| DE (1) | DE60120683D1 (ru) |
| EA (1) | EA005425B1 (ru) |
| IL (1) | IL152472A0 (ru) |
| WO (1) | WO2001082958A2 (ru) |
Families Citing this family (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1356291B1 (de) | 2000-12-06 | 2011-05-04 | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) | Verfahren zur herstellung eines bioanalytischen reagenzes, nachweisverfahren beruhend auf der verwendung des bioanalytischen reagenz, sowie dessen verwendung |
| EP1417229B1 (en) | 2001-08-17 | 2011-06-15 | Exothera L.L.C. | Methods and compounds for the targeting of protein to exosomes |
| AU2002365291B2 (en) | 2001-11-29 | 2007-11-01 | Dandrit Biotech A/S | Pharmaceutical composition for inducing an immune response in a human or animal |
| EP1483372A2 (en) * | 2002-03-14 | 2004-12-08 | Anosys, Inc. | Functionalization of t cell derived vesicles and use thereof for the preparation of immunogenic pharmaceutical compositions |
| KR20030085659A (ko) * | 2002-04-30 | 2003-11-07 | 동부한농화학 주식회사 | 암 치료용 엑소좀 및 그를 이용한 암 백신 |
| KR100519384B1 (ko) * | 2002-08-13 | 2005-10-06 | (주)누백스 | 유전자 이입을 이용한 엑소좀의 제조방법 및 상기 엑소좀의 용도 |
| JP4939926B2 (ja) * | 2003-02-14 | 2012-05-30 | アノシス・インコーポレーテッド | 抗体を生成し抗体レパートリーをスクリーニングするための方法とコンパウンド |
| FR2852393B1 (fr) * | 2003-03-14 | 2007-04-13 | Univ Aix Marseille Ii | Methode de detection et d'analyse d'organelle immobilises sur biopuce et leurs applications |
| GB0316560D0 (en) * | 2003-07-15 | 2003-08-20 | Chiron Srl | Vesicle filtration |
| EP1766053A4 (en) * | 2004-06-02 | 2007-12-12 | Sourcepharm Inc | MICROVESICLES CONTAINING RNA AND METHODS |
| US7901921B2 (en) * | 2004-10-22 | 2011-03-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Viral purification methods |
| CA2504279A1 (en) * | 2005-04-15 | 2006-10-15 | University Of Saskatchewan | Materials and method of modulating the immune response using t helper-antigen presenting cells |
| WO2006116362A2 (en) | 2005-04-25 | 2006-11-02 | The Trustees Of Boston University | Structured substrates for optical surface profiling |
| US8455188B2 (en) * | 2007-01-26 | 2013-06-04 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Modification of exosomal components for use as a vaccine |
| US20100255514A1 (en) | 2007-08-16 | 2010-10-07 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Tumor cell-derived microvesicles |
| US9186405B2 (en) | 2007-08-16 | 2015-11-17 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Tumor cell-derived microvesicles |
| US8617806B2 (en) * | 2008-01-25 | 2013-12-31 | Hansabiomed Ou | Method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids |
| US10545149B2 (en) * | 2008-10-06 | 2020-01-28 | Morehouse School Of Medicine | Detection of HIV-related proteins in urine |
| US9487837B2 (en) | 2008-10-06 | 2016-11-08 | Morehouse School Of Medicine | Exosome-mediated diagnosis of hepatitis virus infections and diseases |
| EP2358912B1 (en) | 2008-10-30 | 2016-10-12 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH | Methods for assessing rna patterns |
| JP2012508577A (ja) | 2008-11-12 | 2012-04-12 | カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス | 表現型を決定するためのエキソソームの使用方法およびそのシステム |
| WO2010065968A1 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Myriad Genetics, Inc. | Cancer detection markers |
| US9835618B1 (en) * | 2009-02-06 | 2017-12-05 | Los Alamos National Security, Llc | Discovery, detection and use of biomarkers |
| CN102497887A (zh) | 2009-04-17 | 2012-06-13 | Isis创新公司 | 递送遗传物质的组合物 |
| CN102596177B (zh) | 2009-07-01 | 2014-05-28 | 阿昂梅迪克斯公司 | 来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡及其应用 |
| RU2012103482A (ru) | 2009-07-02 | 2013-08-10 | АйТиЭйч ИММЬЮН ТЕРАПИ ХОЛДИНГЗ АБ | Способ лечения рака, основанный на использовании экзосом |
| SG2014014617A (en) * | 2009-07-16 | 2014-05-29 | Gen Hospital Corp | Nucleic acid analysis |
| WO2011031877A1 (en) | 2009-09-09 | 2011-03-17 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles |
| EP2475989A4 (en) | 2009-09-09 | 2013-02-27 | Gen Hospital Corp | USE OF MICROVESICLES IN THE ANALYSIS OF KRAS MUTATIONS |
| CN103237901B (zh) | 2010-03-01 | 2016-08-03 | 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 | 用于治疗诊断的生物标志物 |
| KR20130043104A (ko) | 2010-04-06 | 2013-04-29 | 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 | 질병용 순환 생물학적 지표들 |
| US9376679B2 (en) | 2010-05-26 | 2016-06-28 | Micromedmark Biotech Co. Ltd. | Microvesicles carrying small interfering RNAs, preparation methods and uses thereof |
| US9421167B2 (en) | 2010-05-26 | 2016-08-23 | Micromedmark Biotech Co. Ltd. | Preparation of microvesicle-siRNA complexes and use thereof in AIDS treatment |
| US20140045915A1 (en) | 2010-08-31 | 2014-02-13 | The General Hospital Corporation | Cancer-related biological materials in microvesicles |
| JP6219721B2 (ja) | 2010-11-10 | 2017-10-25 | エキソソーム ダイアグノスティックス インコーポレイテッド | 核酸含有粒子の単離および該粒子からの核酸の抽出のための方法 |
| SG183579A1 (en) * | 2011-02-11 | 2012-09-27 | Agency Science Tech & Res | Methods of detecting therapeutic exosomes |
| ITNA20110012A1 (it) * | 2011-03-14 | 2012-09-15 | Amal Raj Delfin Albert | Procedura di isolamento e di purificazione degli esosomi urinari per la ricerca di biomarcatori proteici |
| JP5893742B2 (ja) * | 2011-09-22 | 2016-03-23 | ウニベルシダ デ ロス アンデス | 早期における急性腎損傷をモニタリング、診断、および／または予後診断するための方法 |
| GB201121070D0 (en) | 2011-12-07 | 2012-01-18 | Isis Innovation | composition for delivery of biotherapeutics |
| WO2013109713A1 (en) | 2012-01-18 | 2013-07-25 | The General Hospital Corporation | Targeting rnas to microvesicles |
| CN103479682B (zh) * | 2012-06-14 | 2015-03-11 | 苏州恒宇生物科技有限公司 | 一种植物来源活性成分-纳米级膜性囊泡的制备方法 |
| AU2013302526B2 (en) | 2012-08-15 | 2018-03-22 | The University Of Chicago | Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders |
| US20140186293A1 (en) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Immunoglobulin-bound extracellular vesicles and uses thereof |
| US11274139B2 (en) | 2013-04-12 | 2022-03-15 | Evox Therapeutics Ltd | Therapeutic delivery vesicles |
| CN104274828B (zh) * | 2013-07-04 | 2017-11-17 | 复旦大学 | IFN‑α处理细胞所分泌外体在制备抑制肝炎病毒的药物中的应用 |
| WO2015060446A1 (ja) | 2013-10-25 | 2015-04-30 | 凸版印刷株式会社 | 膜小胞回収デバイス、膜小胞回収方法、及び膜小胞分析方法 |
| WO2016013660A1 (ja) | 2014-07-24 | 2016-01-28 | 凸版印刷株式会社 | 脂質膜構造体、脂質膜構造体固定化担体、及び胞体の融合方法 |
| US10329323B2 (en) | 2014-07-25 | 2019-06-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Method for purifying antibodies using PBS |
| CA2999283A1 (en) | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Trustees Of Boston University | Multiplexed phenotyping of nanovesicles |
| WO2017066454A2 (en) * | 2015-10-14 | 2017-04-20 | X-Therma, Inc. | Compositions and methods for reducing ice crystal formation |
| EP3411713B1 (en) | 2016-02-05 | 2021-06-30 | NanoView Biosciences, Inc. | Detection of exosomes having surface markers |
| EP3467059B1 (en) | 2016-05-24 | 2022-02-23 | Japanese Foundation For Cancer Research | Method of recovering extracellular vesicles and container for extracellular vesicles |
| GB2552473A (en) * | 2016-07-21 | 2018-01-31 | Evox Therapeutics Ltd | Surface decoration of extracellular vesicles |
| CN110049771A (zh) * | 2016-10-13 | 2019-07-23 | Vbc控股有限责任公司 | 癌症干细胞的外泌体 |
| WO2018096481A1 (en) * | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Aman Sharma | Method and kit for exosomes and associated biomacromolecules capture |
| CN107907689A (zh) * | 2017-10-10 | 2018-04-13 | 北京大学 | 外泌体蛋白cd5l的检测方法 |
| NL2019814B1 (en) * | 2017-10-26 | 2019-05-06 | Stichting Het Nederlands Kanker Inst Antoni Van Leeuwenhoek Ziekenhuis | Methods for producing a MHC multimer. |
| EP3775882A1 (en) | 2018-03-30 | 2021-02-17 | Exosomics S.P.A. | Use of hollow fibers to obtain blood or a blood derivative impoverished from blood cells and platelets derived extracellular vesicles |
| JP7376887B2 (ja) * | 2019-08-20 | 2023-11-09 | Ｊｆｅエンジニアリング株式会社 | 動物細胞の増殖促進方法、連続培養方法及び連続培養装置 |
| JP7513869B2 (ja) * | 2020-03-23 | 2024-07-10 | 澁谷工業株式会社 | エクソソーム抽出装置およびエクソソームの抽出方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999003499A1 (fr) * | 1997-07-16 | 1999-01-28 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Vesicule cellulaire denommee ''exosome'', leur preparation et utilisation dans la stimulation d'une reponse immunitaire |
| WO2000028001A1 (fr) * | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Exosomes modifies et utilisations |
-
2001
- 2001-02-09 US US09/780,748 patent/US20040241176A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-11 JP JP2001579831A patent/JP2003531864A/ja active Pending
- 2001-04-11 IL IL15247201A patent/IL152472A0/xx unknown
- 2001-04-11 EA EA200201150A patent/EA005425B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-04-11 WO PCT/EP2001/004173 patent/WO2001082958A2/en active IP Right Grant
- 2001-04-11 AU AU65873/01A patent/AU6587301A/en not_active Abandoned
- 2001-04-11 CA CA002407225A patent/CA2407225A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-11 AT AT01943246T patent/ATE330002T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-04-11 CN CN01808615A patent/CN1426461A/zh active Pending
- 2001-04-11 EP EP01943246A patent/EP1278825B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-11 DE DE60120683T patent/DE60120683D1/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999003499A1 (fr) * | 1997-07-16 | 1999-01-28 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Vesicule cellulaire denommee ''exosome'', leur preparation et utilisation dans la stimulation d'une reponse immunitaire |
| WO2000028001A1 (fr) * | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Exosomes modifies et utilisations |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HSU DI-HWEI ET AL: "Dendritic cell (DC)-derived exosomes (DEX) activate T cells similar to DC: Implications for novel tumor vaccines." PROCEEDINGS OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH ANNUAL, no. 41, March 2000 (2000-03), page 875 XP002188694 91st Annual Meeting of the American Association for Cancer Research.; San Francisco, California, USA; April 01-05, 2000, March, 2000 ISSN: 0197-016X the whole document * |
| WOLFERS J ET AL: "Dendritic cell-derived exosomes (DEX) are effective cancer vaccines: Predinical data towards a clinical trial." PROCEEDINGS OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH ANNUAL, no. 41, March 2000 (2000-03), page 874 XP002188693 91st Annual Meeting of the American Association for Cancer Research.:San Francisco, California, USA; April 01-05, 2000, March, 2000 ISSN: 0197-016X the whole document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL152472A0 (en) | 2003-05-29 |
| CA2407225A1 (en) | 2001-11-08 |
| AU6587301A (en) | 2001-11-12 |
| US20040241176A1 (en) | 2004-12-02 |
| DE60120683D1 (de) | 2006-07-27 |
| EP1278825B1 (en) | 2006-06-14 |
| EA200201150A1 (ru) | 2003-04-24 |
| EP1278825A2 (en) | 2003-01-29 |
| JP2003531864A (ja) | 2003-10-28 |
| CN1426461A (zh) | 2003-06-25 |
| WO2001082958A2 (en) | 2001-11-08 |
| ATE330002T1 (de) | 2006-07-15 |
| WO2001082958A3 (en) | 2002-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA005425B1 (ru) | Способы получения мембранных везикул | |
| US6812023B1 (en) | Methods of producing membrane vesicles | |
| US20210115401A1 (en) | Methods and Materials for the Generation of Regulatory T Cells | |
| AU2003256506B2 (en) | Reagents and methods for engaging unique clonotypic lymphocyte receptors | |
| Wu et al. | Follicular dendritic cell-derived antigen and accessory activity in initiation of memory IgG responses in vitro. | |
| Rechsteiner | Uptake of proteins by red blood cells | |
| JPH11505512A (ja) | マクロファージを調製する方法、ならびにそのためのキットおよび組成物 | |
| Cohn et al. | THE REGULATION OF PINOCYTOSIS IN MOUSE MACROPHAGES: IV. The Immunological Induction of Pinocytic Vesicles, Secondary Lysosomes, and Hydrolytic Enzymes | |
| CA2239729C (en) | Cell separation composition, kit and method | |
| US5789148A (en) | Cell separation composition | |
| JP2001517427A (ja) | 造血幹細胞を結合するための方法および組成物 | |
| EP1907852A2 (en) | Stable quantitation and detection of immune response levels with non-zero background peptides | |
| AU2006201173A1 (en) | Methods of producing membrane vesicles | |
| Koch et al. | Isolation, enrichment, and culture of murine epidermal langerhans cells | |
| US20180280444A1 (en) | Nanoparticle based tumor endothelial targeting vaccine | |
| Johannsen et al. | Characteristics of cytotoxic antibodies against neuraminidase-treated lymphocytes in man | |
| Woda et al. | Mobility of surface proteins on normal rat macrophages and on a" macrophagelike" rat tumor. | |
| Lubetzki‐Korn et al. | Human alpha‐fetoprotein–rich fraction inhibits galactocerebroside antibody–mediated lysis of oligodendrocyte in vitro | |
| Matera et al. | In vitro maturation of dendritic cells from blood progenitors | |
| Ranken | The role and characterization of C3 receptors in the immune response | |
| Nava et al. | An optimized method for the manufacture of a dendritic cell–based vaccine for translational glioblastoma research | |
| JPS58182556A (ja) | 非ａ非ｂ型肝炎アツセイおよびワクチン | |
| Gontar et al. | Emulsive polymerization as a method of enzyme modification preserving biological properties of nanostructures | |
| PT958046E (pt) | Composição, conjunto e processo de separação celular |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |