CN110049771A - 癌症干细胞的外泌体 - Google Patents

癌症干细胞的外泌体 Download PDF

Info

Publication number
CN110049771A
CN110049771A CN201780076138.1A CN201780076138A CN110049771A CN 110049771 A CN110049771 A CN 110049771A CN 201780076138 A CN201780076138 A CN 201780076138A CN 110049771 A CN110049771 A CN 110049771A
Authority
CN
China
Prior art keywords
excretion body
cancer
cell
method described
excretion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780076138.1A
Other languages
English (en)
Inventor
K·尼亚齐
F·柯西奥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vbc Holding Co Ltd
Original Assignee
Vbc Holding Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vbc Holding Co Ltd filed Critical Vbc Holding Co Ltd
Publication of CN110049771A publication Critical patent/CN110049771A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明包括制备从癌症干细胞分离的灭活外泌体的方法，以及由本发明所述方法制备的灭活外泌体。本发明还提供了通过将失活外泌体给药于受试者用于抑制癌症的生长和/或进展的方法。

Description

癌症干细胞的外泌体
技术领域
本发明主要涉及从癌症干细胞中分离的灭活的外泌体及获得或生产它的方法。
背景技术
背景技术包括用于理解本发明的信息。它并不意味着承认在此提供的信息都是现有技术或都与本发明相关，或承认直接引用或间接引用的出版物均为现有技术。
外泌体(exosomes)是宽分类范围内的生物体中包括干细胞在内的大多数种类细胞分泌的小的膜结合颗粒(Yu et al.,2014,Int J Mol Sci.7；15(3):4142-57.doi:10.3390/ijms15034142)。外泌体源于细胞内化过程中细胞质膜的内出芽，源于被认定为多泡核内体(MVE)的细胞结构，该细胞结构包裹细胞质材料作为膜结合的囊泡。各种报道称外泌体的直径范围为30nm至约200nm，更具体为约40nm至约100nm。外泌体被发现利于细胞间蛋白质、脂肪和核酸的运输和转移。正常和病变细胞均释放外泌体，外泌体也存在于血液和其他体液中。
已经证明外泌体具有调节免疫系统的免疫刺激和免疫抑制调节作用，例如由Zitvogel等US20040028692,Whiteside等2005,British Journal of Cancer 92:209-211。此外，Robbins等US20060116321描述了源自树突细胞的外泌体的免疫抑制特性。
最近，已经证实癌症来源的外泌体在肿瘤微环境的形成和肿瘤进展中发挥作用(Falcon等人,2015,J Exp Clin Cancer Res.34(1):32,线上公布于2015年4月2日，doi:10.1186/s13046-015-0148-3)。癌症来源的外泌体还有助于引发炎症反应，在纤维母细胞和间充质细胞分化成肌成纤维细胞中发挥作用，并触发血管生成过程。癌症来源的外泌体还通过促进肿瘤细胞的上皮向间充质转化以及通过在新的解剖学位置创造肿瘤微环境(niche)来增强肿瘤的转移演化。
此外，已经证实源自结直肠癌细胞(CRC)的外泌体负责转移来自突变的-KRAS(mutant-KRAS)和ΔNp73细胞的mRNAs，因而增强受体CRC细胞的侵袭性、增殖和治疗抗性。源自SW480 CRC细胞系的微泡富含与细胞周期相关的促进内皮细胞增殖的mRNAs(Hong等人,2009,BMC Genomics 10:556,DOI:10.1186/1471-2164-10-556)。此外，外泌体miR-17-92a群的表达水平与CRC的复发相关(Matsumura等人,2015,Br J Cancer.2015,113(2):275-81.doi:10.1038/bjc.2015.201.Epub 2015Jun 9)。
Ichim等人US8,288,172描述了通过体外过滤将肿瘤促进的外泌体从抗体包覆的微珠(microbeads)上进行脱除。但是，仍然需要更实际有效的方法来抑制源自癌症干细胞的外泌体在癌症促进方面的影响。
发明内容
因此，本发明提供了灭活的CSC外泌体及其制备方法，以及使用该灭活的CSC外泌体抑制源自CSC的外泌体的癌症促进效应的方法。本发明的主题涉及各种组合物、方法以及外泌体的用途，所述外泌体是从暴露于炎性条件下的癌症干细胞中分离出来的。
在第一个实施方式中，本发明提供了抑制制备灭活的外泌体的方法，该方法包括：
(a)从人癌症组织中分离癌症干细胞(CSCs)，
(b)在培养基中，使步骤(a)中分离的CSCs与一定浓度的促炎性细胞因子接触一定时间，所述一定浓度、一定时间足以诱导炎症诱导的外泌体的释放，
(c)从步骤(b)的培养基中分离出炎症诱导的外泌体，以及
(d)灭活步骤(c)的分离的外泌体同时保留分离的外泌体的膜结构。
优选地，所述促炎性细胞因子为干扰素-γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1-β(1IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和/或它们的组合。在某些实施方式中，至少一种细胞因子以约10ng/ml至约50ng/ml的浓度存在。
通常，促炎性培养的时间为约1天至约8天，或更具体为约1天至约4天。
所述分离的外泌体例如通过暴露于254nm的紫外辐射(UV)并持续能够有效灭活外泌体而不破坏外泌体包膜的时间和强度。例如，所述UV暴露例如约1h的暴露足以灭活所包裹的(encapsulated)RNA分子和/或使所包裹的蛋白质变性或交联。
在某些实施方式中，所述CSC为结肠癌干细胞(CCCS)。
优选地，通过诸如聚合物沉淀、免疫分离、磁免疫捕获(magneticimmunocapture)、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤和/或它们的组合的方法从培养基汇总分离所述外泌体。
在第二个实施方式中，本发明提供了由上述方法制备得到的分离的纯化的外泌体。
在第三个实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，包含本发明所述的灭活外泌体，所述灭活外泌体悬浮于生理上可接受的载体中。
在第四个实施方式中，本发明提供了一种抑制有此需要的受试者中肿瘤或癌症生长或进展的方法，包括：将有效量的本发明所述的灭活外泌体给药于受试者。
优选地，外泌体通过静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、鞘内注射或输注和/或器官内输注(intra-organ infusion)进行给药。例如，外泌体以每千克总体重约1.5×1010至约1.5×1013个外泌体颗粒的量进行全身给药。在一个替代实施例中，外泌体以约1.5×1010和1.5×1011个外泌体颗粒的量注射或输注入局部组织或解剖学空间(anatomical space)中而进行给药。在某些其他实施方式中，本发明还包括使用至少一种额外的抗癌剂共同治疗所述受试者。
在第五个实施方式中，本发明提供了制备灭活的外泌体的方法，包括以下步骤：
(a)从人癌症组织中分离癌症干细胞(CSCs)，
(b)在培养基中，将步骤(a)分离的CSCs与一定浓度的促炎性细胞因子接触一定时间，所述一定浓度、一定时间足以诱导炎症诱导的外泌体的释放，
(c)修饰步骤(a)或步骤(b)分离的CSCs以抑制编码癌症促进RNA或多肽的基因的转录或翻译，以及
(d)从步骤(b)的培养基中分离炎症诱导的外泌体。
具体实施方式
本发明提供了外泌体和抑制源自癌症干细胞(CSC)的外泌体在癌症促进方面的特性的方法。
除非另有说明，否则将使用下列术语，并且除非另有说明，否则应按所述进行定义。在整个说明书中可以出现其他术语的定义。除非另有说明，否则所有单数术语也包括术语的复数、主动时态和过去时形式。
如本领域所理解的，术语“肿瘤”和“癌症”是重叠的术语。广泛认为“肿瘤”是生物体中发现的肿块(mass)或增生。肿瘤细胞是源自这种肿块的细胞。肿瘤可以是良性的或癌性的。癌性肿瘤或“癌症”是能够失控扩散并侵入其他组织，或者在血癌的情况下，覆盖循环系统和/或在体内其他地方萌发癌症的组织增生。癌细胞是源自癌症的细胞。出于本发明的目的，术语“肿瘤细胞”和“癌细胞”可互换使用，应理解两者均指在肿瘤或癌症中发现的或从肿瘤或癌症提取并培养的哺乳动物细胞，并且其异常复制，没有分化的哺乳动物细胞所表现出的局限性(limits)。
本发明所述的外泌体是由肿瘤细胞干细胞分泌的外泌体，在本文中肿瘤细胞干细胞也称为癌细胞干细胞。如本文所用，术语“癌症干细胞”或CSC旨在包括源自受试者癌性组织的细胞，其具有类似干细胞的特性，并且代表具有自我更新能力的癌细胞的子集。
通常，由CSC分泌的外泌体为颗粒，所述颗粒与正常细胞或组织接触时将促进肿瘤发展，下调抗肿瘤免疫反应，和/或修饰局部组织以接受建立已形成的肿瘤或癌症的转移性分支。
短语“炎性条件”是指促进炎症的条件。对于体内组织，促炎性条件包括促进促炎性细胞因子水平提高的条件。例如，促炎性细胞因子包括干扰素-γ，白细胞介素-1α、白细胞介素-1-β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α及其组合。
这些条件包括，例如，需要治疗或抗感染反应的病症，例如物理损伤、感染、由代谢功能紊乱或外来物质渗入组织引起的组织慢性刺激。对于体外的组织或细胞，促炎性条件包括在促炎性细胞因子存在下培养细胞或组织，或者与分泌促炎性细胞因子的细胞或组织共同培养细胞或组织。
对于本发明，该条件还包括已确诊存在的肿瘤或癌症病症的存在，其中施用本发明所述的灭活外泌体以抑制这种存在的肿瘤或癌症病症的形成和扩散。
术语“培养”是指于体外在合适的培养基中维持、分化和/或增殖细胞。当提及“富集的”培养物时，其是指包含组分的组合物中所述组分(例如细胞)以更高的总细胞百分比含量存在，与发现其存在生物体的组织中时相比。
短语“基本上由......组成”是指组合物或方法可包括额外的成分和/或步骤，但只要额外的成分和/或步骤不实质地改变要求保护的组合物或方法的基础且新颖的特征，即，额外的成分和/或步骤对于要求保护的组合物或方法提供无用的材料。
优选地，作为CSC来源的受试者为动物，例如哺乳动物或鸟(avian)。动物包括人和非人兽类受试者(veterinary subject)。兽类受试者包括哺乳动物和鸟。哺乳动物包括但不限于家犬和其他犬科动物(canines)、家猫和其他猫科动物(felines)、猪和其他猪科动物(porcines)、绵羊、山羊、马和其他马科动物(equines)、骆驼、牛和其他有蹄类动物。鸟包括家禽，例如鸡、鸭、火鸡、鹅、鸵鸟等，和/或宠物鸟，例如雀科和/或鹦形目的成员，例如鹦鹉和长尾小鹦鹉。
分离CSC的方法是本领域已知的。例如，在一种方法中，癌组织被解聚、酶促消化、洗涤和过滤。然后将收获的细胞在允许细胞形成球体的培养基中进行培养。参见，例如，Pramudita等,2013,Methods Mol Biol,1035:247-59,doi:10.1007/978-1-62703-508-8_21(公布于STEM CELL NICHE METHODS AND PROTOCOLS中的第21章,Springer,Ed.:Turksen,Kursad)。还可参见Yamazaki等,US 20140314675和Yu,US20100173344描述了分离CSCs的其他途径。
将分离的CSC在合适的培养基中培养并维持(maintain)，例如，如Pramudito，Id所述。
在本发明的一个优选实施方式中，在补充有一种或多种促炎性细胞因子的培养基中培养分离的CSC，例如干扰素-γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1-β(1IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)及其组合。所述细胞因子以足以诱导源自CSC的炎症相关的外泌体释放的浓度和持续时间存在。例如，一种或多种细胞因子以约10ng/ml至约50ng/ml的浓度存在。通常，CSC培养约1天至约8天，或更长时间。或者，将CSC培养约1天至约4天，或更长时间。
在将培养的CSC培育足够的时间，例如在37℃下培养约2至约4天，以得到足够的CSC外泌体后，收集培养基并从培养基中纯化和分离外泌体。这可以通过本领域已知的任何合适的方法来实现。例如，参见Robbins等，US20060116321或Lane等，Id.，Brownlee等，2014，J Immunol Methods，407：120-126。doi：10.1016/j.jim.2014.04.003。这些方法包括，例如，通过差异超速离心分离外泌体的原始方法，以及更新的方法，例如聚合物沉淀(来自SBI，Palo Alto，CA的ExoQuickTM)、免疫亲和捕获(Greening等人2015，Methods inMolecular Biology，影响因子：1.29)、免疫磁捕获(Exo-FLOWTM，SBI)，Invitrogen总外泌体分离试剂盒(Life Technologies，USA)和ExoSpin外泌体纯化试剂盒(Cell GuidanceSystems，USA)。
免疫亲和纯化是基于表面标志物选择性捕获特定外泌体的方法。该方法使用被链霉亲和素共价包覆的磁珠，其可以以高亲和力方式与生物素化的捕获抗体偶联。所捕获的外泌体被洗脱并且是完整的且具有生物活性。
通过测定蛋白质含量和乙酰辅酶A乙酰胆碱酯酶的活性来量化纯化的外泌体，并通过纳米颗粒追踪分析来分析尺寸分布和浓度。通过流式细胞术和蛋白质印迹验证分离的外泌体的外泌体标志物表达。
然后将分离的外泌体灭活而不破坏外泌体的膜结构。这可以通过将分离的外泌体暴露于已知的导致外泌体包裹的蛋白质和/或RNA分子断裂或交联的条件来实现。例如，将外泌体暴露于一定频率、强度和持续时间的紫外线辐射下，所述一定频率、强度和持续时间足以使分离的外泌体携带的RNA分子灭活而不破坏外泌体的表面蛋白。参见，例如，Pusic等人，WO2014028763。或者，对分离的CSC进行遗传修饰以抑制癌症促进RNA或蛋白质的产生，使得产生的外泌体缺失促进癌症进展的活性。在另一个替代方案中，制备具有与CSCs的细胞表面抗原表位匹配的包膜蛋白的人工外泌体，其中所述人工外泌体不携带癌症促进蛋白和/或癌症促进RNA分子。
本发明还提供了治疗受试者的方法，所述受试者包括哺乳动物受试者。特别地，本发明提供了抑制或减少受试者中肿瘤或癌症病症扩散的方法，所述受试者已经因为这种肿瘤或癌症病症而接受了诊断和/或治疗。
不受任何关于本发明操作的理论或假设的束缚，可以认为本发明的灭活外泌体与体内产生的未修饰的天然CSC外泌体进行竞争，从而更新目标细胞和组织。用这种方式抑制了天然产生的CSC外泌体的癌症促进作用。
例如，所述方法包括将本发明所述的灭活外泌体给药于已被诊断患有癌症的受试者，其中，将所述外泌体以一定量进行全身给药，和/或输注到组织或解剖学空间中，并持续一定时间，所述一定量和一定时间足以抑制原始癌症的恶性扩散或进一步的恶性扩散。
“有效量”是足以产生有益或期望的结果的量，例如肿瘤或癌症进展速率的降低。有效量可以以一次或多次给药、施用或剂量进行给药。有效量，即合适的剂量，将根据待治疗的体重、年龄、健康、疾病或病症以及给药途径而发生变化。施用于受试者的外泌体的剂量是随时间推移有效地在受试者体中实现期望的有益治疗反应的量。
本领域技术人员将能够容易地通过滴定剂量和给药持续时间来确定待给药灭活外泌体的量，以达到最佳临床反应，例如癌症进展速率和/或扩散速率的降低，和/或诱导癌症的消退。
在一个具体实施方式中，将灭活外泌体以每千克总体重约1.5×1010至约1.5×1013个外泌体颗粒的量全身给药。或者，将灭活外泌体以约1.5×1010至1.5×1011个外泌体颗粒的量注射或输注入局部组织或解剖学空间中。
灭活外泌体任选地通过选自由静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、鞘内注射或输注以及器官内输注所组成的组中的途径进行给药。器官内输注包括输注至解剖学空间中，例如，作为例子，胆囊、胃肠腔、食道、肺系统(通过吸入)和/或膀胱。
制剂中灭活外泌体的数量可通过本领域已知的任何方法进行测定。在非限制性实例中，外泌体颗粒数可以通过使用NanoSight仪器直接计数来确定，例如NS300，NanoSight或LM10(Malvern Instruments，Ltd，Worcestershire，UK)。或者，可以通过测量乙酰辅酶A乙酰胆碱酯酶(外泌体内存在的酶)的活性，然后通过参考预先制得的外泌体计数与乙酰辅酶A水平的标准曲线来估计外泌体的数量。
根据需要重复治疗直至获得积极结果。任选地，根据需要以每日、每周或每月的间隔重复治疗，以维持对癌症促进过程的抑制。
在另一个实施方式中，本发明考虑用至少一种额外的抗癌剂共同治疗有此需求的受试者，所述至少一种额外的抗癌剂例如烷化剂，包括铂化合物，例如顺铂、卡铂和/或奥沙利铂；抗代谢物，例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和/或阿糖胞苷(cytarabibe)，源自天然产品的试剂，例如L-天冬酰胺酶、阿霉素、博来霉素，紫杉烷如紫杉醇、多烯紫杉醇表鬼臼毒素(docetaxel epipodophyllotoxins)：依托泊苷、喜树碱和/或伊立替康。
特别地，所述至少一种额外的抗癌剂包括但不限于多烯紫杉醇、吉西他滨、伊马替尼(imatinib)5-氟尿嘧啶、9-氨基喜树碱、胺修饰的格尔德霉素、阿霉素、紫杉醇顺铂、甲基苄肼，羟基脲、内消旋-e-二氢卟吩(meso-e-chlorin)、Gd(+3)化合物、天冬酰胺酶和/或放射性核素(例如，I131、Y90、In111和Tc-99m)。在某些实施方式中，两种或更多种抗癌剂与本发明所述的灭活外泌体一起给药。
特别地，所述至少一种额外的抗癌剂包括但不限于多烯紫杉醇、吉西他滨、伊马替尼5-氟尿嘧啶、9-氨基喜树碱、胺修饰的格尔德霉素、阿霉素、紫杉醇顺铂、甲基苄肼、羟基脲、内消旋e-二氢卟酚、Gd(+3)化合物、天冬酰胺酶和放射性核素(例如I131，Y90，In111和Tc-99m)。一些实施方式包括两种或更多种补充抗癌剂。在某些实施方式中，两种或更多种抗癌剂与本发明所述的灭活外泌体一起给药。
实施例
以下提供的实施例用于解释说明本发明，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1
分离结肠癌干细胞(CCSCs)
通过分离从患有结肠癌的受试者身上得到的组织样品中的细胞得到分离的结肠癌干细胞或CCSC。所述受试者可以是人或动物，包括例如具有移植的肿瘤的小鼠，所述肿瘤是由起源于人或非人癌细胞系的结肠癌细胞生长的。
然后基本上按照Pramudita等人，2013，Methods Mol Biol，1035：247-59，doi：10.1007/978-1-62703-508-8_21(在Springer所著的STEM CELL NICHE METHODS ANDPROTOCOLS中第21章公开，编辑：Turksen，Kursad；通过引用整体并入本文，并使用其中描述的方法和试剂分离结肠癌干细胞和腺瘤(adenoma)干细胞)处理所述组织样品。
在无菌条件下同时遵循生物安全性2级规程通过Pramudita等人在该出版物的第3.1节描述的方法处理切除的癌组织样品。本文应用用于分离结肠癌干细胞的Pramudita方法，简要概述如下：
将组织样品直接放入一个或多个适当尺寸的管中，所述管中含有Hank's平衡盐溶液1×(HBSS)，不含Ca 2+和Mg 2+(Invitrogen)。
然后洗涤组织样品以去除血液和手术碎屑。从样品中除去多余的坏死组织，然后用HBSS进一步洗涤。然后将洗过的样品切碎，并将切碎的组织在37℃下于含有IV型胶原酶(Sigma，在磷酸盐缓冲液[PBS]中浓度为100mg/ml，工作稀释率为1/100)和透明质酸酶IV-S型(Sigma，在PBS中的浓度为10mg/ml，工作稀释率为1/500)的培养基中进行不定时搅拌(occasional agitation)而消化30-60min。
将消化的组织和培养基离心，回收含有单细胞的上清液、再次离心、洗涤、过筛(70μm筛目)并根据需要洗涤以除去未消化的片段和消化酶。将剩余的洗涤的细胞沉淀(pellets)重新悬浮，并将重新悬浮的活单细胞进行计数。
在超低附着的容器中，将5×104至10×104个细胞/cm2接种到补充生长因子的培养基DMEM F12高级培养基中，其中补充有N2补充剂100x、葡萄糖8.5mM、微量元素B和C 1000x、羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)50μM、肝素(Heparine)2μg/ml、胰岛素10μg/ml、β-巯基乙醇0.1mM、L-谷氨酰胺0.4mM、EGF 20ng/ml和bFGF 10ng/ml，在容器中CCSC细胞应自组织成小的球状结构。如Pramudita等人在出版物第3.2节中所述，培养物根据需要传代以保持生存能力。
实施例2
在炎性条件下培养分离的CSC
根据Pramudita等人所述，将按照实施例1分离的CCSC在相同的培养基中继续，或传代到新鲜的培养基中。培养基补充有一种或多种促炎性细胞因子，例如干扰素-γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1-β(1IL-1β)，白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)中的一种或多种。将每种促炎性细胞因子以约10ng/ml至约50ng/ml的浓度加入培养基中。
实施例3
从结肠癌干细胞中分离出外泌体
在培养CSC 1天至8天后，从实施例2使用的培养基中分离出外泌体。通过聚合物沉淀(ExoQuickTM，产自SBI，Palo Alto，CA)分离外泌体。该技术将外泌体捕获并收集于“聚合物网”中，所述聚合物网通过低速离心回收。一旦获得外泌体沉淀，除去含有过量聚合物的上清液，然后将沉淀的外泌体重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，溶解聚合物网并释放完整的外泌体。
实施例4
验证分离的CCSC外泌体
为了证实通过实施例3所述的聚合物沉淀方法分离的功能性外泌体，通过测量合适的生物标志物的存在来验证外泌体的身份，如下所述。
通过上述方法分离外泌体，通过蛋白质印迹验证外泌体，使用针对特定外泌体标志物：四跨膜蛋白(tetraspanins)、CD9、CD63、CD81(位于外泌体表面)的抗体以及存在于外泌体内的由肿瘤易感基因101(“TSG101”)表达的蛋白质。
将分离的外泌体在补充有蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的RIPA缓冲液(150mM氯化钠、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％的SDS、50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH8.0)中在冰上裂解30分钟。将裂解物定量用于Bradford测定(Bio-Rad)，并将25μg蛋白质与4x样品缓冲液(8％SDS、20％的2-巯基乙醇、40％甘油、0.008％溴酚蓝、0.25M的Tris，pH6.8)混合并在95℃下煮沸10分钟。通过SDS-PAGE分离(resolve)蛋白质，并将其转移至PVDF膜，在5％脱脂奶粉或BSA的TBS-T(20mM的Tris,pH 7.5，150mM的NaCl，0.1％的Tween-20)溶液中进行封闭(block)，并使用以下抗人抗体进行探测：抗CD9(1:1000，SBI)、抗CD63(1:1000，LSBio)、抗CD81(1:500，Abcam)、抗TSG101(1:500，Abcam)。与辣根过氧化物酶(1:1000，Dako)缀合的二抗通过化学发光(ECL Western印迹基质，Thermo Scientific)使蛋白质可视化。
另外，为了通过流式细胞术进一步验证外泌体，外泌体与缀合有抗CD63抗体的乳胶微珠(beads)结合，从而避免了由于它们的小尺寸可能导致的微珠的任何非特异性结合。通过细胞荧光数据证实外泌体表达的CD81和CD9，其中CD7用作阴性对照以证明测定的特异性。所使用的一抗为：抗CD9 Alexa 647(Serotec)、抗CD81 FITC(Biolegend)和抗CD7PE(Becton Dickinson)或同型对照(BD Biosciences)。使用FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences)分析外泌体。
通过测定乙酰辅酶A酯酶(“AChE”，“ExocetTM测试试剂盒，SBI”)的活性来定量获得的外泌体。AChE是迄今为止已知发现于所有测试的外泌体中的酶。通过分析测得的标准曲线(校准为外泌体数量)包括于Exocet试剂盒中。
实施例5
分离的CCSC外泌体的灭活
通过以下方法使膜包封的RNA和/或蛋白质失活，从而灭活如上获得的分离的外泌体而不破坏外泌体膜。
通过本领域已知的任何方法灭活分离的外泌体。在一种实施方式中，如WO2014028763所述，通过暴露于254nm紫外(UV)光下1h，灭活外泌体。
实施例6
灭活外泌体的癌症抑制活性
测试通过实施例5所述的方法从CCSC获得的外泌体，验证其抑制癌症促进微环境的维持和/或发展的性质。实现方式为：测量相对于使用缺乏灭活外泌体的对照制剂处理的相同模型中接种人癌细胞的进展，小鼠异种移植模型中注入灭活CCSC外泌体的小鼠中接种人癌细胞的进展速率，如下所示。
通过将1×106个细胞/小鼠皮下注射到右侧辅助侧腹(auxiliary flank)中，将人HT-29结直肠肿瘤引入24只裸鼠中。当肿瘤平均体积达到100mm3时，给一半的小鼠静脉注射(每天一次，持续14天)每kg/总体重1.5×1010至约1.5×1013的灭活外泌体颗粒(悬浮于生理学上可接受的载体中)，使用不含任何外泌体的生理学上可接受的载体溶液处理另一半小鼠作为对照。监测小鼠的肿瘤生长。通过尾静脉静脉给药外泌体和对照液。
与对照小鼠相比，处理的小鼠的结果(在体内和解剖小鼠受试者后测得)证实，在注射灭活外泌体的12只小鼠组中，异种移植癌的体积、重量和扩散(继发性肿瘤的数量)的增长速率显著降低。
参考文献的引入
本文引用的所有出版物均以引用方式并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指出通过引用并入本文。如果并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反，则适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在参考文献中的定义。

Claims (18)

1.一种制备灭活的外泌体的方法，包括以下步骤：
(a)从人癌症组织中分离癌症干细胞(CSCs)，
(b)在培养基中，将步骤(a)中分离的CSCs与一定浓度的促炎性细胞因子接触一定时间，以诱导炎症诱导的外泌体的释放，
(c)从步骤(b)的培养基中分离出炎症诱导的外泌体，以及
(d)灭活步骤(c)分离的外泌体同时保留分离的外泌体的膜结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述促炎性细胞因子选自由干扰素-γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1-β(1IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和它们的组合所组成的组中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子以约10ng/ml至约50ng/ml的浓度存在。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，促炎性培养的时间为约1天至约8天。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，促炎性培养的时间为约1天至约4天。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，通过暴露于紫外辐射灭活分离的外泌体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述紫外辐射具有足以实质上灭活所述分离的外泌体中所含的RNA的强度和频率。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CSC为结肠癌干细胞(CCCS)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过选自由聚合物沉淀、免疫分离、磁免疫捕获、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤和它们的组合所组成的组中的方法从培养基中分离所述外泌体。
10.由权利要求1所述的方法制备的分离的纯化的外泌体。
11.一种药物组合物，包含权利要求11所述的外泌体和生理上可接受的载体。
12.一种抑制有此需求的受试者中肿瘤或癌症的生长或进展的方法，包括：将有效量的权利要求11所述的外泌体给药于所述受试者。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述受试者为选自由人、犬科动物、猫科动物、猪科动物和马科动物所组成的组中的哺乳动物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述外泌体通过选自由静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、鞘内注射或输注以及器官内输注所组成的组中的途径进行给药。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述外泌体以每千克总体重约1.5×1010至约1.5×1013个外泌体颗粒的量进行全身给药。
16.根据权利要求13所述的方法，其中，所述外泌体以约1.5×1010至1.5×1011个外泌体颗粒的量注射或输注入局部组织或解剖学空间中而进行给药。
17.根据权利要求13所述的方法，进一步包括使用至少一种额外的抗癌剂，和/或它们的组合共同治疗所述哺乳动物。
18.一种制备灭活的外泌体的方法，包括以下步骤：
(a)从人癌症组织中分离癌症干细胞(CSCs)，
(b)在培养基中，将步骤(a)分离的CSCs与一定浓度的促炎性细胞因子接触一定时间，以诱导炎症诱导的外泌体的释放，
(c)修饰步骤(a)或步骤(b)分离的CSCs以抑制编码癌症促进RNA或多肽的基因的转录或翻译，以及
(d)从步骤(b)的培养基中分离炎症诱导的外泌体。
CN201780076138.1A 2016-10-13 2017-10-12 癌症干细胞的外泌体 Pending CN110049771A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662407835P 2016-10-13 2016-10-13
US62/407,835 2016-10-13
PCT/US2017/056355 WO2018071681A1 (en) 2016-10-13 2017-10-12 Cancer stem cell exosomes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110049771A true CN110049771A (zh) 2019-07-23

Family

ID=60382589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780076138.1A Pending CN110049771A (zh) 2016-10-13 2017-10-12 癌症干细胞的外泌体

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20200046766A1 (zh)
EP (1) EP3525802B1 (zh)
CN (1) CN110049771A (zh)
WO (1) WO2018071681A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110029088A (zh) * 2019-04-15 2019-07-19 中山大学 肿瘤细胞凋亡小体及其制备方法和应用
CN110499287A (zh) * 2019-08-30 2019-11-26 博雅干细胞科技有限公司 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法
CN111117964A (zh) * 2019-07-30 2020-05-08 段海峰 一种肿瘤来源外泌体及其制备方法和用途

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020081859A1 (en) * 2018-10-18 2020-04-23 Nantbio, Inc. Mesenchymal stem cell derived exosomes and methods
KR102130502B1 (ko) * 2019-06-12 2020-07-07 브렉소젠 주식회사 P 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1265038A (zh) * 1997-07-16 2000-08-30 法国国家卫生及研究医学协会 被称作胞外体的细胞囊泡,其制备方法及在免疫刺激中的用途
CN1426461A (zh) * 2000-04-27 2003-06-25 阿诺塞斯公司 膜囊的生产方法
CN101022824A (zh) * 2004-07-01 2007-08-22 匹兹堡大学联邦系统高等教育 免疫抑制外体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3517151T3 (da) 2006-03-09 2021-07-12 Aethlon Medical Inc Ekstrakorporal fjernelse af mikrovesikulære partikler
WO2008024832A2 (en) 2006-08-24 2008-02-28 Cedars-Sinai Medical Center Methods for isolating and using pituitary adenoma stem cells and pituitary adenoma cells
EP2749641B1 (en) 2011-09-07 2021-06-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell isolation
EP2885414B1 (en) 2012-08-15 2020-09-23 The University of Chicago Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1265038A (zh) * 1997-07-16 2000-08-30 法国国家卫生及研究医学协会 被称作胞外体的细胞囊泡,其制备方法及在免疫刺激中的用途
CN1426461A (zh) * 2000-04-27 2003-06-25 阿诺塞斯公司 膜囊的生产方法
CN101022824A (zh) * 2004-07-01 2007-08-22 匹兹堡大学联邦系统高等教育 免疫抑制外体

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110029088A (zh) * 2019-04-15 2019-07-19 中山大学 肿瘤细胞凋亡小体及其制备方法和应用
CN110029088B (zh) * 2019-04-15 2021-03-19 中山大学 肿瘤细胞凋亡小体及其制备方法和应用
CN111117964A (zh) * 2019-07-30 2020-05-08 段海峰 一种肿瘤来源外泌体及其制备方法和用途
CN111117964B (zh) * 2019-07-30 2020-12-01 段海峰 一种肿瘤来源外泌体及其制备方法和用途
CN110499287A (zh) * 2019-08-30 2019-11-26 博雅干细胞科技有限公司 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法
CN110499287B (zh) * 2019-08-30 2021-07-23 博雅干细胞科技有限公司 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3525802A1 (en) 2019-08-21
EP3525802B1 (en) 2021-05-26
WO2018071681A1 (en) 2018-04-19
US20200046766A1 (en) 2020-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110049771A (zh) 癌症干细胞的外泌体
US11873514B2 (en) Method of screening for a substance that acts on a cell mass
KR20200088408A (ko) Msc 유래의 엑소좀의 제조 방법
CN110072534A (zh) 外泌体的医学应用
CN107206100A (zh) 自然杀伤细胞的方法和组合物
CN110621774A (zh) 用于治疗中枢神经系统疾病和病症的组合物和方法
CN103243074B (zh) 一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用
CN104093314A (zh) 使用针对t/b细胞耗尽的特异性方案的用于稳定和长期植入的联合疗法
CN106659740A (zh) 凋亡小体
CN106222141B (zh) Nk细胞培养液和细胞培养方法
CN107405377A (zh) 外泌体的破坏方法、外泌体的破坏试剂盒及来自正常细胞的外泌体的分离方法
CN106102753A (zh) 治疗赘生物形成的方法
CN109762821A (zh) 抑制afap1-as1表达的干扰rna及在增加乳腺癌放疗敏感性中的应用
CN104894243A (zh) 用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针、装置及其应用
Wang et al. Spinal cord injury target-immunotherapy with TNF-α autoregulated and feedback-controlled human umbilical cord mesenchymal stem cell derived exosomes remodelled by CRISPR/Cas9 plasmid
Li et al. Simultaneous blockage of contextual TGF-β by cyto-pharmaceuticals to suppress breast cancer metastasis
CN107868786A (zh) 多药耐药结肠癌细胞的单链dna适配体
CN106390123B (zh) miR-29及其抑制剂在制备抗器官移植排斥药物中的应用
CN104231050A (zh) 一种抑制肿瘤转移和治疗白血病的多肽和多肽复合物、其制备方法及其应用
CN103805563A (zh) 一种脑靶向干细胞及其制备方法和应用
WO2020180744A1 (en) Natural killer cell induced cellular vesicles for cancer therapy
CN113388586B (zh) 一种溶瘤病毒ndv-nrp1及其构建方法与应用
CN115029320A (zh) 用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体、制备方法、应用
CN106924748A (zh) 高穿透性肿瘤靶向脂质插件的构建及其促进细胞及细胞膜制剂向肿瘤聚集的作用
CN107921277A (zh) 使用循环肿瘤细胞作为生物标志物来监测癌症疗法的功效的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190723