JP2003531864A

JP2003531864A - 膜小胞を生成する方法

Info

Publication number: JP2003531864A
Application number: JP2001579831A
Authority: JP
Inventors: ランパルスキー，ヘンリー; ルエッグ，カーティス; ル・ペック，ジャン−ベルナール; シュー，ティ−ウェイ; ヤオ，チェン−ユアン
Original assignee: ANOSTS, INC.
Current assignee: ANOSTS, INC.
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2003-10-28
Also published as: WO2001082958A3; EA005425B1; AU6587301A; US20040241176A1; EP1278825A2; EP1278825B1; WO2001082958A2; CA2407225A1; IL152472A0; EA200201150A1; CN1426461A; ATE330002T1; DE60120683D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍の免疫療法による治療または予防を包含する、様々な実験的、診断的もしくは治療的用途に用いるための、生物学的材料を調製する方法に関する。より詳しくは、本発明は、様々な種類の哺乳動物細胞が放出する膜小胞（特にエキソソーム）を調製する方法であって、ダイアフィルトレーションおよび／または密度クッション遠心分離を含む方法に関する。本発明は、また、製剤製品の製造を目的とする品質管理アッセイに用いることができる、エキソソーム調製品を特性記述かつ分析する新規な方法を提供する。本発明は、ヒトに用いるための、そのような膜小胞の製剤等級の調製品を製造し、該調製品を充分に特性記述するのに適する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、腫瘍の免疫療法による治療または予防を包含する、様々な実験的、
診断的もしくは治療的用途に用いるための、生物学的材料を調製する方法に関す
る。より詳しくは、本発明は、様々な種類の哺乳動物細胞が放出する膜小胞（特
にエキソソーム）を調製する方法であって、ダイアフィルトレーションおよび／
または密度クッション遠心分離を含む方法に関する。本発明は、また、製剤製品
の製造を目的とする品質管理アッセイに用いることができる、エキソソーム調製
品を特性記述かつ分析する新規な方法はもとより、膜小胞に免疫原化合物を担荷
する方法も提供する。本発明は、ヒトに用いるための、そのような膜小胞の製剤
等級の調製品を製造し、該調製品を充分に特性記述するのに適する。

【０００２】

【発明の背景】

膜小胞は、基本的には、細胞質画分を含有する脂質二重層で構成された、直径
が一般的には１３０nm未満の球形の小胞である。特定の膜小胞は、より具体的に
は、細胞によって、細胞の原形質膜との融合を通じて細胞内区画から形成されて
、生物体液、または培養体中の細胞上清へのそれらの放出を招く。そのような小
胞は、一般的には、エキソソームと呼ばれる。エキソソームは、より詳しくは、
直径が約３０〜約１２０nm、好ましくは５０〜９０nm、より特定的には約６０〜
８０nmであり、好都合には、膜タンパク質（特に主要組織適合性複合体タンパク
質その他の、直接または間接的に抗原提示に参加するタンパク質）を担持する。
加えて、その起源に応じて、エキソソームは、ＭＨＣＩ、ＭＨＣII、ＣＤ６３、
ＣＤ８１および／またはＨＳＰ７０のような膜タンパク質を含み、小胞体または
ゴルジ装置は皆無である。さらに、エキソソームは、本質的に核酸（たとえばＤ
ＮＡまたはＲＮＡ）を欠く。

【０００３】エキソソームの放出は、生理学的に様々に関連する異なる細胞型から立証され
ている。特に、Ｂリンパ球は、抗原提示に役割を果たす、クラスIIの主要組織適
合性複合体分子を担持する〔Raposo et al., J. Exp. Med. 183 (1996) 1161〕
ことが立証されている。同様に、樹状細胞は、特定の構造および機能的特徴性を
有し、免疫応答の仲介、特に細胞毒性Ｔ細胞刺激におけるそれに役割を果たすエ
キソソーム（すなわちデキソソーム、Ｄｅｘ）を生成する〔Zitvogel et al., N
ature Medicin 4 (1998) 594〕。腫瘍細胞は、腫瘍抗原を担持し、これらの抗原
を提示すること、またはこれらを抗原提示細胞へと伝達することができる、特定
のエキソソーム（すなわちテキソソーム、Ｔｅｘ）を、調節された方式で分泌す
ることも立証されている〔特許願のWO99/03499〕。肥満細胞は、分子を細胞内小
胞区画に蓄積し、それが、シグナルの作用下で分泌され得ることも公知である〔
Smith & Weiss, Immunology Today 17 (1996) 60〕。したがって、一般則として
、細胞は、シグナルを発し、それらが放出する、抗原タンパク質（またはポリペ
プチドもしくはペプチド）、ＭＨＣ分子その他の、異なる生理学的状況下で生成
された、特定の構造および機能的特徴性を有するいかなるシグナル（サイトカイ
ン、成長因子等々）も担持し得る膜小胞を介して、互いに連絡し合うように思わ
れる。すなわち、これらの小胞、特にエキソソームは、診断、予防接種または治
療に適用するための特に関心が持たれる生成物を代表する。したがって、生物学
的用途、特に薬理学的用途に適合した膜小胞を調製するための、工業的規模で用
いることができるような、効果的な方法を有することは、特に関心が持たれるで
あろう。

【０００４】膜小胞（たとえばエキソソーム）を調製するための慣用の方法は、培地中に存
在する細胞または細胞砕片から小胞を分離するための、一連の分別細胞工程を必
要とする。ちなみに、上に列挙された文書は、基本的には、３００×g、１０，
０００×gおよび７０，０００×gまたは１００，０００×gでの一連の遠心分離
（こうして、遠沈管の底に得られるペレットを、生理食塩水溶液で本来の体積の
１，０００分の１に再懸濁させて、濃縮されたエキソソーム溶液を構成する）に
よる小胞の調製を記載している。しかし、これらの方法は、数多くの理由から、
臨床的適用には本質的に不適切である：（１）時間の長さ、（２）ＧＭＰ（医薬
品適正製造基準）の環境での規模拡大およびバリデーション、（３）細胞砕片に
よる汚染の有意な危険性、（４）操作者の変動による不充分な再現性、（５）ペ
レット形成の結果生じるエキソソームの凝集（ペレット中のエキソソーム濃度の
高度の局在）、および（６）加工処理の終点での低い回収率。したがって、工業
的制約下で適し、治療用品質の小胞調製品の製造を可能にする、改良された膜小
胞を調製法の必要性が存在する。

【０００５】国際出願のPCT/FR/00/00105は、クロマトグラフィーの手法、たとえば陰イオ
ン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲル浸透クロマトグラフィーによる、
膜小胞調製の方法を開示している。

【０００６】（要約）ここに、本発明は、高収量、高純度、かつ比較的短時間で膜小胞を調製する新
規な方法を提供する。本発明は、膜小胞調製品を特性記述（または分析もしくは
調薬）する方法であって、小胞の活性、表現型および／または品質を決定するた
めに製剤製造に用いることができる方法も開示する。ここに、本発明は、臨床的
に許容され得るロットの膜小胞の、再現性があり、操作者による変動が限定され
た、かつ製品の質が高い特性記述を可能にする。さらに、本発明は、粒状体、た
とえばハプトグロビンを、様々な培地または組成物から除去する方法、その結果
得られる組成物、およびその用途にも関する。本発明は、膜小胞に免疫原化合物
を担荷する方法、およびその用途にも関する。

【０００７】より具体的には、本発明の一態様は、密度クッション遠心分離を用いて膜小胞
を調製する方法にある。

【０００８】本発明のもう一つの態様は、一連の限外濾過工程および／または清澄化工程、
より具体的には、好ましくは清澄化が先行する、濃縮と限外濾過によるダイアフ
ィルトレーションとの組合せを用いて、膜小胞を調製する方法にある。

【０００９】本発明のもう一つの態様は、密度クッション遠心分離と限外濾過および／また
は清澄化工程との組合せ、より具体的には、好ましくは清澄化が先行する、濃縮
と限外濾過によるダイアフィルトレーションとの組合せの後、密度クッション遠
心分離を用いて、膜小胞を調製する方法にある。

【００１０】特定の態様では、本発明の方法は、ダイアフィルトレーションの前または後で
の密度クッション遠心分離を含む。

【００１１】本発明の方法は、膜小胞を含有する、生物体液、培養上清、細胞溶解物、また
は予備精製された溶液を包含する、様々な生物学的サンプルに適用することがで
きる。特定の実施態様では、該方法は、膜小胞を富化した生物学的サンプルから
膜小胞を調製（たとえば精製または分離もしくは単離）するのに用いられる。

【００１２】本発明の特定の態様は、生物学的サンプルから膜小胞を調製する方法であって
、（ａ）小胞の放出を可能にする条件下で、膜小胞産生細胞の集団を培養する工程
と、（ｂ）膜小胞を富化する工程と、（ｃ）該富化された生物学的サンプルを密度クッション遠心分離によって処理す
る工程とを含む。

【００１３】さらに一つの好適実施態様では、膜小胞産生細胞は、粒状体の含量を低減した
培地、好ましくはハプトグロビン凝集体を枯渇させた培地で培養する。本願で立
証されるとおり、そのような培地の使用は、高い生成物収量、ならびに／または
より高い純度および品質レベルが達成されるのを可能にする。

【００１４】富化工程は、一つまたはいくつかの遠心分離、清澄化、限外濾過、ナノ濾過、
アフィニティークロマトグラフィーおよび／もしくはダイアフィルトレーション
工程を含んでよい。より好ましくは、富化工程は、清澄化および／または濃縮お
よび／またはダイアフィルトレーションを含む。

【００１５】エキソソームの調製品は、ピペット吸引または針によるなどを包含する、適切
ないかなる手段によっても、工程（ｃ）から捕集してよい。

【００１６】好適実施態様では、この方法は、工程（ｃ）からの調製品を滅菌濾過する工程
（ｄ）をさらに含む。

【００１７】本発明は、抗原提示細胞（たとえばマクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球）
、腫瘍細胞その他の、好ましくは抗原について形質導入された、小胞を産生する
いかなる細胞または細胞系によって産生された膜小胞も包含する、様々な起源か
らの膜小胞を調製するのに用いることができる。これは、樹状細胞、好ましくは
未成熟樹状細胞によって産生された膜小胞（すなわちデキソソーム）を調製する
のに特に適する。さらに、膜小胞、または対応する産生細胞は、調製の前、間ま
たは後に、１もしくは数種類の抗原に対して感作することができる。

【００１８】本発明の、より好適な実施態様は、

【００１９】 −膜小胞を調製する方法であって、（ｂ）抗原提示細胞、特に樹状細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、
抗原提示細胞、特に樹状細胞の集団を培養する工程と、（ｃ）膜小胞を富化する工程と、（ｄ）密度クッション遠心分離を用いて、膜を単離する工程とを含む方法、

【００２０】 −膜小胞を調製する方法であって、（ａ）未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、（ｂ）未成熟樹状細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、未成熟樹状細
胞の集団を培養する工程と、（ｃ）膜小胞を富化する工程と、（ｄ）密度クッション遠心分離を用いて、膜小胞を単離する工程とを含む方法を含む。

【００２１】上に示したとおり、１または数種類の特定の抗原に対して小胞（または産生細
胞）を感作する追加的工程は、産生細胞を感作するには、この方法中の工程（ｂ
）の前でか、または直接に膜小胞を感作するには、工程（ｂ）の後でかのいずれ
かに導入することができる。

【００２２】ちなみに、本発明は、抗原提示細胞培養体から予め調製かつ精製されたエキソ
ソーム上のＭＨＣ複合体への、エキソソームの直接担荷のため、特に免疫原化合
物（たとえばペプチドまたは脂質）の直接組込みのための手順を開示する。本発
明による方法は、未成熟樹状細胞培養体から予め精製されたデキソソーム上のＭ
ＨＣ（クラスＩ）複合体にペプチドを直接担荷するのに特に好都合である。

【００２３】上に示したとおり、ＨＬＡクラスＩまたはII関連ペプチドを有する樹状細胞に
由来するエキソソーム（デキソソーム）の担荷は、現在までは、間接担荷、すな
わち治療的（抗原性）ペプチド（たとえばクラスＩ制限腫瘍ペプチド）を、小胞
産生細胞（たとえば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で単球富化接着細胞
から分化した樹状細胞（ＤＣ））の培養体に（たとえば第６日目に１０μg/mlで
）加えることによって取り組まれている〔たとえば、US5,846,827および引用文
献を参照されたい〕。ＤＣは、外因性ペプチドを取り込み、それによって、これ
らのクラスＩペプチドをエキソソームの表面に宿すデキソソームを産生すると仮
定されている。マウスＰ１Ａ肥満細胞腫の腫瘍モデルによるin vivoの実験は、
このようにして産生されたデキソソームが、抗腫瘍の免疫学的応答を誘導し、そ
れが腫瘍の衰退を招いたことを示している。Ｍａｒｔ−１というペプチドを担荷
したデキソソームは、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＴＬクローン、すなわちＬＴ１１か
らのＩＦＮ−γの僅かな分泌も刺激することができて、何らかの程度のペプチド
担荷が実際に生じたことを示唆する。しかし、放射能検出に類似する感度を有す
る生化学的取組み方である、時間分解蛍光測定法（ＴＲＦ）を用いてさえ、これ
らのデキソソーム上でのクラスＩペプチドの結合は、ほとんど検出できなかった
。

【００２４】この方法の効果性および工業的実施を改良するため、ここに、本発明者らは、
ＤＣ培養体にペプチドを加える工程を、ＤＣ培養体から精製された後のデキソソ
ームにペプチドを加える工程に置き換えた、直接担荷を実施することが可能であ
ることを驚異的にも見出した。特に、本発明者らは、ここに、選ばれた酸性培地
または緩衝液を開発し、膜小胞を防護するよう規定し、該小胞の表面での抗原提
示分子、特にクラスＩ、クラスIIまたはＣＤ１分子のようなＭＨＣ分子への免疫
原化合物の直接担荷を可能にすることができることを発見した。

【００２５】したがって、本発明の特定の目的は、免疫原性膜小胞を調製する方法であって
、生物学的サンプルから膜小胞を単離または精製する工程と、免疫原化合物が該
膜小胞の表面で抗原提示分子（たとえば、ペプチド抗原に対してはＭＨＣクラス
Ｉ、および脂質抗原に対してはＣＤ１）と結合するのを可能にする条件下で、該
精製された膜小胞を免疫原化合物（たとえばペプチドまたは脂質）に接触させる
工程とを含む方法にもある。

【００２６】好適実施態様では、この方法は、該小胞を該免疫原化合物に接触させる前、間
または後に、単離または精製された膜小胞を選ばれた酸性培地もしくは処理に付
して、その担荷を容易にする工程を含む。ちなみに、本願に開示されたような選
ばれた酸性培地または処理の利用は、小胞の表面に付随する外因性ペプチドまた
は脂質を少なくとも部分的に除去し、および／または免疫原化合物の交換を容易
にするのを可能にする。

【００２７】さらに一つの実施態様では、免疫原化合物との接触後に、小胞を遠心分離、好
ましくは密度勾配遠心分離、またはダイアフィルトレーションに付して、未結合
免疫原化合物を除去する。

【００２８】免疫原化合物は、たとえば、抗原提示分子に関連する免疫系に提示される、い
かなるペプチドまたは脂質であってもよい。ペプチドは、クラスＩ制限ペプチド
でも、クラスII制限ペプチドでも、単独、または他のペプチドとの混合物もしく
は組合せでも、あるいは腫瘍細胞のペプチド溶出物であってさえよい。本発明は
、クラスＩ制限ペプチドの直接担荷に特に適する。脂質は、単離された形態でか
、または様々な組合せもしくは混合物での、微生物の脂質、微生物の糖脂質、ま
たは脂質もしくは糖脂質の腫瘍抗原であってもよい。

【００２９】直接担荷法は、従来の手法に優る有意な利点を提供する。特に、実施例に例示
されるとおり、直接ペプチド担荷は、より少量のペプチドを用いて、より高い表
面ＨＬＡ受容体の占有率を達成することができるという点で、従来の間接担荷よ
り効率的である。このことは、膜小胞の免疫原としての潜在的可能性を明確に高
める。加えて、担荷されるペプチドの構造は、担荷されるペプチドが、全細胞に
よってプロセシングされず、そのため、担荷に際して健全かつ未変質のままであ
ることから、より精密に制御することができる。本発明は、ここに、直接ペプチ
ド担荷が、デキソソームのような精製膜小胞を用いて実施できることを初めて示
す。ちなみに、本発明は、膜小胞が、その活性および機能性を失うことなく、低
いpH条件に耐えることを示す。本発明は、改良された直接担荷を可能にする特定
の条件も記載する。本発明は、間接担荷（すなわち全細胞への担荷）に慣用され
る緩衝培地を、異なる緩衝培地に好都合にも置き換えて、直接担荷の効率を高め
、より高い占有率を達成し得ることを特に示して、小胞が全細胞のようには挙動
しないことを示す。

【００３０】好適実施態様では、本発明は、ＨＬＡクラスＩ分子と結合した外因性クラスＩ
ペプチドの複合体を含む免疫原性膜小胞を調製する方法であって、（ｉ）単離ま
たは精製された膜小胞を、選ばれた酸性培地に付す工程と、（ii）該単離または
精製された膜小胞を、ペプチドが該膜小胞の表面でＨＬＡクラスI分子と複合す
るのを可能にする条件下で、クラスＩ制限ペプチドに接触させる工程と、（iii
）担荷された膜小胞を回収する工程とを含む方法を対象とする。

【００３１】特定の変化形では、この方法は、（ｉ）単離または精製された膜小胞を、選ば
れた酸性培地に付す工程と、（ii）該単離または精製された膜小胞を、ペプチド
が該膜小胞の表面でＨＬＡクラスI分子と複合するのを可能にする条件下、β₂ミ
クログロブリンの存在下で、クラスＩ制限ペプチドに接触させる工程と、（iii
）担荷された膜小胞を回収する工程とを含む。より好ましくは、工程（ｉ）は、
単離または精製された膜小胞を、約３〜５．５、はるかに好ましくは約３．２〜
４．２のpHの酸性培地に５分未満にわたって付す工程を含む。β₂ミクログロブ
リンの存在下での直接担荷という取組み方は、非常に小量の免疫原化合物が入手
できるにすぎない場合でさえ、効率的な担荷を可能にすることから、好都合であ
る。実際、β₂ミクログロブリンを用いたとき、本発明者らは、膜小胞から基本
的にすべての内在性ペプチドを除去し、そのため、低レベル（たとえば０．００
５〜５０μg/ml）の免疫原化合物によってさえ、機能的なＭＨＣ複合体の再構成
に有利である、規定された酸性培地を用いることができることを示している。し
たがって、この取組み方は、腫瘍溶出物、脂質、自然抗原その他の、（たとえば
合成によって）経済的に大量には生成されることができない免疫原の直接担荷に
特に適する。

【００３２】より大量の免疫原化合物が入手できる場合、本発明者らは、β₂ミクログロブ
リンを全く必要としない、第二の一般的な直接担荷の取組み方を規定した。この
実施態様は、より僅かな処理を必要とし（その結果、エキソソームは改変されな
い）、外因性のβ₂−ｍの必要性が皆無であって、コスト、および外因性の材料
を工程に加えるという潜在的短所を低減することができる。この面で、もう一つ
の特定の変化形では、この方法は、（ｉ）単離または精製された膜小胞を、β₂
ミクログロブリンの不在下で、クラスＩ制限免疫原化合物（たとえばペプチドま
たは脂質）に接触させる工程と、（ii）（ｉ）の混合物を、ペプチドがいかなる
外因性ペプチドとも交換して、該膜小胞の表面でＨＬＡクラスI分子と結合する
のを可能にする条件下で、選ばれた酸性培地または処理に付す工程と、（iii）
培地を中和させて、交換を停止するか、および／または（ii）で形成された複合
体を安定化する工程と、（iv）担荷された膜小胞を回収する工程とを含む。より
好ましくは、工程（ii）は、混合物を、約４〜５．５のpHの培地に、いかなる外
因性分子と免疫原化合物との交換にも充分な時間にわたって付して、ＭＨＣ複合
体と結合させる工程を含む。実際、本発明者らは、ここに、全細胞によるのとは
対照的に、膜小胞は、酸性培地または条件との延長された接触に耐え、こうして
、望みのいかなる免疫原化合物との内在性分子の交換をも、ＭＨＣ分子を改変ま
たは不安定化することなく、かつ本質的に内在性β₂−ｍを分解もしくは除去す
ることなく可能にすることを示している。本発明者らは、また、交換を、膜小胞
の機能性を改変することなく実施するのを可能にする、特定の酸性培地および条
件を規定している。これらの選ばれた培地は、より詳しくは、約４〜５．５、よ
り好ましくは４．２〜５．５のpHを特徴とする。膜小胞は、好ましくは、上記の
選ばれた酸性培地に、１５分を越える、代表的には２時間未満の、はるかに好ま
しくは１時間未満の時間にわたって接触させる。この変化形によれば、この方法
は、β₂ミクログロブリンの使用を含まず、担荷は、望みのペプチドと内在性ペ
プチドとの交換を通じて、内在性β₂−ｍの放出なしに生じる。このβ₂ミクログ
ロブリン無用の実施態様では、単離または精製された膜小胞を、代表的には、β₂ ミクログロブリンの不在下で、過剰な外因性免疫原化合物に、たとえば５〜５
００μg/mlのクラスＩ制限ペプチドに接触させる。この実施態様は、大量に入手
できる免疫原化合物、たとえば合成によって製造されるペプチドを担荷するのに
特に適する。

【００３３】上に示したとおり、この方法は、様々な免疫原性分子を用いて実施することが
できる。ペプチドは、好ましくは、クラスＩまたはクラスII分子が提示するペプ
チド、すなわち、樹状細胞およびマクロファージやＢリンパ球のような、抗原提
示細胞による抗原のプロセシングの結果得られるペプチドである。ペプチドの好
ましい一群は、クラスＩ制限ペプチド、はるかに好ましくはクラスＩ制限腫瘍ペ
プチド、すなわち樹状細胞またはマクロファージによって免疫系に提示される、
腫瘍抗原に由来するペプチドによって代表される。特定のペプチドは、たとえば
、様々な腫瘍細胞または抗原、たとえばＭａｇｅ、Ｂａｇｅ、Ｍａｒｔ、ＣＥＡ
、ＰＳＡ等々からの、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ
２４、ＨＬＡ−Ｂ３５その他のハプロタイプ制限腫瘍ペプチドを包含する。理解
すべきことに、この方法は、単離されたペプチドまたはその混合物、たとえば腫
瘍細胞のペプチド溶出物、または他のペプチドの組合せを用いて実施することが
できる。他の病理学的作用因（ウイルス、細胞、寄生生物等々）に由来する抗原
ペプチドも、本発明によれば担荷して、たとえば癌、感染または免疫疾患のよう
な、様々な疾患状態を治療するのに適する、免疫原性膜小胞を生成することがで
きる。

【００３４】脂質は、抗原提示細胞の表面でＣＤ１分子によって免疫系に提示される、いか
なる脂質、糖脂質またはリポタンパク質であってもよい。ＣＤ１分子は、脂質ま
たは糖脂質の抗原をＴ細胞に提示することを担当する、ＭＨＣ複合体様分子であ
る。ＣＤ１のいくつかのイソ型が、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄお
よびＣＤ１ｅを含めて記載されていて、脂質抗原の提示に関与する。特定の実施
態様では、この方法を用いて、脂質抗原を膜小胞の表面でＣＤ１分子、特にＣＤ
１ｂおよびＣＤ１ｄに担荷する。脂質は、いかなる微生物脂質、微生物糖脂質、
脂質または糖脂質の腫瘍抗原等々であってもよい。より好適な脂質の例は、微生
物脂質、たとえばミコール酸、グルコース−１−ミコール酸、ヘキソース−１−
ホスホイソプレノイド、およびホスファチジルイノシトールマンノシドのような
リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）の誘導体を包含する。その他の例は、ガングリ
オシド、糖脂質腫瘍抗原等々のような、自己セラミドを包含する。

【００３５】本発明の特定の実施態様は、

【００３６】 −免疫原性膜小胞を調製する方法であって、（ｂ）抗原提示細胞、特に樹状細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、
抗原提示細胞、特に樹状細胞の集団を培養する工程と、（ｃ）膜小胞を富化または精製する工程と、（ｄ）免疫原化合物が該膜小胞の表面でＭＨＣ分子と結合するのを可能にする条
件下で、膜小胞を免疫原化合物に接触させて、免疫原性膜小胞を生成する工程と
を含む方法、

【００３７】 −免疫原性膜小胞を調製する方法であって、（ａ）未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、（ｂ）未成熟樹状細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、未成熟樹状細
胞の集団を培養する工程と、（ｃ）膜小胞を富化または精製する工程と、（ｄ）免疫原化合物が該膜小胞の表面でＭＨＣ分子と結合するのを可能にする条
件下で、膜小胞を免疫原化合物に接触させて、免疫原性膜小胞を生成する工程と
を含む方法、

【００３８】 −免疫原性膜小胞を調製する方法であって、（ａ）未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、（ｂ）未成熟樹状細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、未成熟樹状細
胞の集団を培養する工程と、（ｃ）膜小胞を富化または精製する工程と、（ｄ）脂質抗原が該膜小胞の表面でＣＤ１分子と結合するのを可能にする条件下
で、膜小胞を脂質抗原に接触させて、免疫原性膜小胞を生成する工程とを含む方法を含む。

【００３９】富化または精製は、好ましくは、上記のとおりにばかりでなく、直接担荷して
も実施する。

【００４０】本発明の特定の実施態様は、膜小胞を調製する方法であって、（ａ）抗原提示細胞、より好ましくは未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、（ｂ）場合により、抗原提示細胞、より好ましくは未成熟樹状細胞の集団を、１
または数種類の抗原で感作する工程と、（ｃ）抗原提示細胞、より好ましくは未成熟樹状細胞による膜小胞の放出を可能
にする条件下で、抗原提示細胞、より好ましくは未成熟樹状細胞の集団を培養す
る工程と、（ｄ）培養上清を清澄化する工程と、（ｅ）清澄化された上清を濃縮する工程と、（ｆ）濃縮された上清をダイアフィルトレーションに付す工程と、（ｇ）密度クッション遠心分離を用いて、膜小胞を単離する工程と（ｈ）場合により、膜小胞をペプチドに接触させて、ペプチド担荷膜小胞を生成
する工程と、（ｉ）工程（ｇ）で得られた小胞膜を滅菌濾過する工程とを含む方法にある。

【００４１】滅菌濾過（ｉ）の前に、たとえばダイアフィルトレーションによる緩衝液交換
工程を実施してもよい。代表的な工程図式を図１に示す。上記の方法では、工程
（ｂ）または工程（ｈ）のいずれかを実施する。

【００４２】さらに、本発明は、様々な培地または組成物から粒状体を除去する方法も提供
する。より詳しくは、本発明は、慣用の培地が、粒状体、たとえばハプトグロビ
ン、および関連する重合体（たとえばハプトグロビン凝集体）を含有することを
立証し、それを除去する方法を開示する。より一般的には、この方法は、ハプト
グロビン凝集体を本質的に枯渇させた、培地その他のいかなる生物学的産物、た
とえば血液タンパク質またはポリペプチド（またはその誘導体）、配合物溶液、
ウシ胎児血清等々の製造も可能にする。

【００４３】ハプトグロビン凝集体は、下記にさらに文書で記録されるとおり、免疫抑制活
性を示し、そのため、膜小胞その他の生物学的産物の生物学的特性、安全性およ
び純度に影響を及ぼすことがある。しかし、粒状体の問題は、当技術では取り扱
われず、様々な生物学的産物中のその存在は、決定されず、これを除去する効率
的な方法は、入手できていない。本発明は、ここに、高品質の生物学的産物を製
造する効率的な方法を提供し、該得られる産物も、本発明の目的を表す。

【００４４】ちなみに、本発明は、一般的には、粒状体、より好ましくはハプトグロビン凝
集体を本質的に含まない哺乳動物細胞の培地を含む組成物にある。

【００４５】本発明は、ハプトグロビン凝集体を枯渇させた細胞培地にもある。

【００４６】本発明は、粒状体含量を低下させた、より具体的にはハプトグロビン凝集体を
本質的に含まない培地中に、抗原提示細胞（または他のいかなる膜小胞産生細胞
、特に樹状細胞）を含む物質組成物にある。より好ましくは、この培地は、粒状
体または凝集体化合物を除去するよう、より詳しくは限外濾過によって処理され
た培地である。

【００４７】本発明のもう一つの態様は、粒状体含量を低下させた培養または生産培地を用
いて、抗原提示細胞（またはいかなる膜小胞産生細胞）を生成または培養する方
法にある。より好ましくは、この培地は、ハプトグロビン凝集体を本質的に含ま
ない、より具体的には限外濾過によって処理された培地である。

【００４８】本発明は、凝集したハプトグロビンを本質的に含まない、血液産物の組成物の
製造はもとより、製剤の用途のために、産物を配合する前に、様々な緩衝液の処
理にも適する。

【００４９】これに関連して、本発明は、ハプトグロビン凝集体を本質的に枯渇させた、血
液ポリペプチドまたはその誘導体を含む組成物にも関する。より詳しくは、本発
明は、ハプトグロビン凝集体を本質的に枯渇させた、熱不活性化した血液産物を
含む組成物にある。はるかに好ましくは、本発明は、凝集したハプトグロビンを
本質的に含まない（熱不活性化された）、血清アルブミン、より好ましくはヒト
血清アルブミンの組成物に関する。

【００５０】本発明は、生物学的産物、より好ましくは熱不活性化された生物学的産物を、
それに含有されるハプトグロビン凝集体の量を低減するよう処理する方法であっ
て、該産物を、濾過、より好ましくは限外濾過に付す工程を含む方法にもある。

【００５１】本発明の特定の目的は、生物学的産物を調製する方法であって、（ｉ）該生物
学的産物を熱不活性化する工程と、（ii）熱不活性化された生物学的産物を濾過
する工程とを含む方法にもある。より好ましくは、この方法は、（iii）濾過さ
れた、熱不活性化された生物学的産物を濃縮する工程、および／または（iv）そ
の順化工程をさらに含む。この方法は、ヒトの血液または血漿もしくは血清のよ
うな、哺乳動物の生物体液から単離（または抽出）されたいかなるタンパク質ま
たはポリペプチド（またはそれらの誘導体）も包含する、様々な生物学的産物に
用いることができる。本願でさらに文書で記録されるとおり、この方法は、ハプ
トグロビン凝集体の含量が低減された、より好ましくはハプトグロビン凝集体を
本質的に含まず、そのため高められた安全性を有する、熱不活性化された生物学
的産物の製造を初めて可能にする。この方法は、血清アルブミンのような血液ま
たは血漿、より好ましくはヒトの血清アルブミン、γ−免疫グロブリン、凝固因
子等々から抽出される製剤タンパク質の調製に特に適する。

【００５２】本発明は、血清調製品、より好ましくはウシ胎児血清調製品を、それに含有さ
れるハプトグロビン凝集体の量を低減するよう処理する方法であって、該調製品
を、濾過、より好ましくは限外濾過に付す工程を含む方法にもある。

【００５３】下記にさらに文書で記録されるとおり、表現「実質的に含まない」は、組成物
または培地が、約１ppm未満、より好ましくは約０．５ppm未満のハプトグロビン
凝集体を含有するか、はるかに好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析はもとより、
定量的ＥＬＩＳＡによっても検出できるハプトグロビンを全く含有しないことを
表す。

【００５４】本発明のもう一つの態様は、その表現型ならびに／または活性および／もしく
は量を決定するために、調製品中の膜小胞を分析もしくは特性記述（または調薬
）する方法にある。

【００５５】より詳しくは、本発明の一態様は、膜小胞を特性記述する方法であって、膜小
胞を、そのマーカー成分に特異的な２種類またはそれ以上の抗原に並行して接触
させ、抗原−抗体免疫複合体の形成を決定する工程を含む方法にある。

【００５６】もう一つの特定の態様は、膜小胞調製品の活性を特性記述する方法であって、
補助細胞の存在下で、スーパー抗原担荷小胞をＴ細胞に接触させる工程と、Ｔ細
胞の活性化を決定する工程とを含む方法を包含する。

【００５７】本発明は、サンプル中の膜小胞を調薬する方法であって、（ｉ）該サンプルを
固体支持体に担持させる工程と、（ii）該支持体を抗クラスII抗体（または他の
適切な抗体）に接触させる工程と、（iii）抗体−抗原免疫複合体の存在を決定
する工程とを含む方法も提供する。

【００５８】本発明は、（ｉ）膜小胞と、（ii）緩衝剤と、（iii）細胞防護剤または安定
化化合物とを含む組成物も包含する。

【００５９】本発明は、免疫原性膜小胞と、薬学的に許容され得る希釈剤または担体とを含
む医薬組成物であって、免疫原性膜小胞が、たとえば、抗原提示細胞（たとえば
樹状細胞）を含有する生物学的サンプルから膜小胞を単離し、該単離された膜小
胞に、免疫原化合物を担荷することによる、直接担荷、および好ましくは未結合
の免疫原化合物の（好都合には密度勾配遠心分離またはダイアフィルトレーショ
ンによる）除去によって得られる医薬組成物も包含する。好適な組成物は、小胞
表面のＨＬＡ分子の１５％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％
以上に外因性ペプチドまたは脂質が担荷された、免疫原性膜小胞を含む。

【００６０】本発明は、免疫原性膜小胞と、薬学的に許容され得る希釈剤または担体とを含
有する医薬組成物を製造する方法であって、（ｉ）（たとえば抗原提示細胞（た
とえば樹状細胞）を含有する）生物学的サンプルから膜小胞を単離する工程と、
（ii）該単離された膜小胞に、免疫原化合物を担荷して、免疫原性膜小胞を生成
する工程と、（iii）好ましくは、未結合の免疫原化合物を（好都合には密度勾
配遠心分離またはダイアフィルトレーションによって）除去する工程と、(iv)免
疫原性膜小胞を、薬学的に許容され得る希釈剤または担体に接触させる工程とを
含む方法も包含する。

【００６１】本発明のその他の態様は、膜小胞、または抗原担荷した抗原提示細胞（たとえ
ば樹状細胞）もしくは膜小胞を調製するためのキット、診断用アッセイ、膜小胞
組成物、装置を包含する。

【００６２】これは、対象者に免疫応答を生成する方法であって、（ｉ）樹状細胞を含有す
る生物学的サンプルを得る工程と、（ii）該生物学的サンプルから膜小胞を単離
または精製する工程と、（iii）該精製された膜小胞を、免疫原化合物が該膜小
胞の表面でＭＨＣ分子と結合するのを可能にする条件下で、免疫原化合物に接触
させる工程と、（iv）工程（iii）の膜小胞を対象者に投与して、該対象者に免
疫応答を生成する工程とを含む方法を包含する。対象者は、好ましくはヒトであ
るが、獣医学の用途も企図される。

【００６３】本発明は、デキソソーム（すなわち樹状細胞が産生する膜小胞）またはテキソ
ソーム（すなわち腫瘍細胞が産生する膜小胞）、より詳しくはヒトを起源とする
それらを調製するのに特に適する。これらの膜小胞は、様々な実験的、生物学的
、治療用、診断用または予防用適用に用いることができる。特に、膜小胞は、対
象者、特に、癌、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、炎症などのような病理学的
状態の対象者における、免疫応答を調整するのに用いることができる。

【００６４】（発明の詳細な説明）上に示したとおり、本発明は、製剤領域、たとえば様々な病理学的状態の免疫
療法に用いるのに適する、膜小胞を調製かつ／または特性記述するための新規な
方法および組成物を提供する。本発明は、培地、生物学的産物などのような組成
物からハプトグロビン凝集体を除去する、様々な製剤または実験の分野に用いる
ことができる方法も開示する。

【００６５】本発明の好適な特定の実施態様に従って、膜小胞を調製するのに実行できる、
様々な工程の詳しい説明を、ここに提供する。本発明は、これらの工程をすべて
含む方法に限定されず、上記のとおり、個々の工程それ自体も包含することを理
解しなければならない。

【００６６】膜小胞を調製するための完全な工程図式の模式的表現を、図１に示す。この一
般的な方法は、（ｉ）膜小胞を含有する（生物学的）サンプルの製造、（ii）富
化段階、（iii）密度クッション分離段階、（iv）配合および調整段階、および
（ｖ）品質管理または特性記述段階を包含する、いくつかの主要な段階を含む。
さらに、本発明は、ハプトグロビンを培地のような生物学的材料から除去する方
法も記載する。

【００６７】（ハプトグロビン凝集体の除去）本発明の特定の、かつ重要な態様は、ハプトグロビン（および関連する重合体
）のような粒状体、より具体的にはハプトグロビン凝集体を本質的に含まない組
成物を提供することにある。特に、本発明は、凝集したハプトグロビンを本質的
に含まない、細胞培養の培地、または生物学的産物、たとえば生物体液から単離
されたタンパク質もしくはポリペプチド（またはその誘導体）（たとえばｈＳＡ
組成物、γ−免疫グロブリン、凝固因子、血清等々）、または緩衝液配合物を提
供することにある。

【００６８】ハプトグロビンは、複合した（α−β）₂四量体タンパク質であって、２種類
のα鎖、すなわちα１（８．８６kDa）およびα２（１７．３kDa）を様々な組合
せで取り込んでいる。ハプトグロビンは、血清産物の熱不活性化の際に、大きい
タンパク質凝集体を形成しかねないことが報告されている〔“Biological Funct
ions of Haptoglobin - New Pieces and Old Puzzle”, W. Dobryszycka, Eur.
J. Clin. Biochem. 1997, 35(9), p.647-654；“Immunosuppressive Effect of
Accute-Phase Reactant Proteins in vitro and its Relevance to Cancer”, R
. Samak et al., Cancer Immunol. Immunother., 1982, 13, p.38-43〕。さらに
、ハプトグロビンは、免疫原活性を示し得ることが知られている。本発明は、こ
こに、多くの生物学的産物中に存在する、ハプトグロビン凝集体の決定的な重要
性を認識し、その除去を可能にする新規な方法を提唱する。

【００６９】より詳しくは、本発明の文脈中で、ハプトグロビン凝集体は、ハプトグロビン
ポリペプチドまたは鎖を含むいかなる粒状体、より好ましくは、他のいかなるポ
リペプチドまたはタンパク質ともＳ−Ｓ結合によって架橋結合した粒状体、たと
えば、特にハプトグロビンポリペプチドおよびアルブミンのいかなる混合凝集体
も意味する。そのようなハプトグロビン凝集体は、Jensenら〔Vox Sang., 67, 1
994, 125〕が記載したとおり、ヘモペキシン、トランスフェリン、Ｇｃグロブリ
ンおよび／またはβ₂糖タンパク質のような、追加的成分も含み得る。

【００７０】培地は、研究および臨床的用途に定型的に用いられるが、大きい可溶性タンパ
ク質凝集体（または粒状体）の問題は、当技術で対処されたことがなく、その除
去が示唆されたこともない。本発明は、ここに、ＡＩＭＶからのタンパク質凝集
体が、超遠心分離によるペレット化の際に、デキソソームとともに同時精製され
ることを示す。さらに、本願は、限外濾過によってＡＩＭＶ中に生成されたデキ
ソソームの濃縮は、ＡＩＭＶタンパク質の濃縮も招くことを示す。さらに、濃縮
したデキソソームのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）は、ハプトグロビンβ鎖およびア
ルブミンに相当する４２kDaおよび６４kDaに二つの主要バンドを示す。

【００７１】したがって、本発明は、（サブユニット、架橋結合した鎖、凝集した形態等々
を包含する）ハプトグロビン凝集体が、慣用の哺乳動物細胞培地に見出されるこ
とを立証する。本発明は、さらに、ハプトグロビン凝集体が、慣用のエキソソー
ム精製法によっては除去されないことを示す。本発明は、ここに、粒状体、より
好ましくはハプトグロビン凝集体を、培地、生物学的組成物、緩衝配合物等々の
ような生物学的材料から除去する方法を提供する。本発明は、また、ハプトグロ
ビン凝集体を本質的に枯渇させた、新規な物質の組成物、およびその用途を開示
する。ハプトグロビン凝集体のような大きいタンパク質凝集体の除去（または濃
度の低減）は、純度の上昇、安全性の向上、非特異的免疫抑制活性等々のような
、いくつかの有意な利点を提供する。さらに、本発明は、凝集したハプトグロビ
ン凝集体を含まない培地が、依然として、効率的な細胞培養、およびエキソソー
ムの生成を、エキソソームの精製を大いに促進しつつ可能にすることを開示する
。培地からのタンパク質凝集体の除去は、ハプトグロビンのような血清成分に対
する望ましくない免疫応答の誘発に対する追加的な防護手段を提供する〔Dobrys
zycka、前掲〕。ちなみに、ハプトグロビン凝集体は、免疫抑制性を有すること
が既に公知である、非凝集ハプトグロビンより望ましくない免疫応答を生起しか
ねないと考えられる〔Se-kyung Oh et al., J. Natl. Cancer Inst., 1990, 82,
934-940, “Interference with immune response at the level of generating
effector cells by tumor-associated haptoglobin”〕。タンパク質凝集体は
、抗原提示細胞によって優先的に捕獲されるため、可溶形態より１０，０００（
一万）倍も免疫原性に富むことが公知である〔M. Kovacsovics-Bankowski et al
., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 4942-4946, “Efficient major hi
stocompatibility complex class I presentation of exogenous antigen upon
phagocytosis by macrophage”〕。そのため、たとえ非常に低用量で存在してさ
え、ハプトグロビン凝集体は、有害であり得る。

【００７２】さらに、本発明の方法は、血清含有培地中に存在し得るエキソソームのような
、その他の粒状体を除去するのも可能にする。予め存在するエキソソームの除去
は、産物の精製を高め、その他の免疫刺激性作用因による汚染を回避する。

【００７３】（除去の方法）本発明による粒状体（たとえば、タンパク質凝集体、より詳しくはハプトグロ
ビン凝集体）を除去するには、様々な方法、たとえば（限外）濾過、精密濾過、
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、アフィニティークロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィーおよび超遠心分離を用いることができる。ヒト
の血清成分（すなわち第Ｖ画分）中のタンパク質凝集体を、これらの方法によっ
て除去してから、培地とともに配合することも可能であり得る。

【００７４】好適実施態様では、培地または組成物を、限外濾過によって処理して、タンパ
ク質凝集体その他の粒状体、より具体的には凝集ハプトグロビンを除去する。

【００７５】特定の実施態様では、限外濾過は、５００kDaの中空繊維膜を用いて実施する
。これは、トランスフェリン（約７５〜８０kDa）のようなタンパク質が、この
膜を通過する必要があることから、この用途に好適な分子量カットオフ（ＭＷＣ
Ｏ）である。ＥＬＩＳＡによるトランスフェリン濃度の測定は、それがこの細孔
径を定量的に通過することを示している。この膜サイズは、非凝集タンパク質が
透過物質とともに通過するのを許しつつ、タンパク質凝集体を保持物質中に保持
する。透過物質は、捕集し、０．２２μmフィルターを通してビンへと滅菌濾過
し、使用するまで４℃で貯蔵する。

【００７６】５００kDaのＭＷＣＯの中空繊維膜は、培地の限外濾過に好適であるが、他の
サイズの膜、たとえば７５０kDa、３００kDa、１００kDa等々も用いてよい。好
ましくは、培地は、１００〜１，０００kDa、より好ましくは２００〜７５０kDa
の直径を有する膜で限外濾過する。ちなみに、本出願人らは、ここに、培地、ま
たは加熱血清アルブミンのようなその他の生物学的産物中に存在するハプトグロ
ビン凝集体の９０％が、動的光散乱によって測定した限りで、約４０〜約２００
nmの直径を有することを決定している。したがって、約４０nm未満の細孔直径を
有するいかなる膜（またはフィルター、中空繊維等々のようなその他の分離装置
）も、本発明を実施するのに適し、好ましいものと思われる。一例として、５０
０kDaのＭＷＣＯは、約２０〜２５nmの細孔直径を表す。

【００７７】また、中空繊維膜のフォーマットは、限外濾過に好適な実施態様であるが、カ
セットフォーマット（すなわち平板またはフレームカセット）をなすその他の形
式の限外濾過装置、たとえばミリポアペリコンMillipore Peliconおよび関連す
る製品はもとより、Sartorius Inc.またはFiltronics Inc.からのカセットも、
用いてよい。膜材料は、代表的には、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）で構成さ
れるが、ポリプロピレンのようなその他の材料も、用いてよい。

【００７８】加えて、培地の限外濾過には、広い範囲の操作パラメータを用いてよい。代表
的な操作パラメータは、入口および出口圧力が、最適の加工処理のためには約０
．３５〜約１．０５kg/cm²（５〜１５psi）となるようなものである。

【００７９】もう一つの特定の実施態様では、培地を、精密濾過（０．０５μm、０．１μm
、０．２μm等々）によって処理して、粒状体（たとえばタンパク質凝集体）を
除去する。繊維の好適な内腔径は０．５mmであるが、０．２５mm、０．７５mmお
よび１mmのようなその他の直径も、用いてよい。

【００８０】これらの様々な処理は、粒状体含量が低下した培地または生物学的産物の製造
を可能にするが、それらは、ここに、エキソソームの精製はもとより、得られる
調製品の品質も有意に高めることが示されている。

【００８１】（凝集ハプトグロビンを含まない培地）こうして、特定の態様では、本発明は、粒状体含量が低減された処理済み培地
の用途はもとより、そのような処理済み培地を含む物質の組成物にもある。実際
、粒状タンパク質（またはタンパク質凝集体）の含有量を低減するための、培地
の前処理が、工程中に存在する汚染物質を有意に低減し、方法の効力を高め、よ
り高い純度および安全を有するエキソソーム調製品の製造を可能にすることが示
されている。

【００８２】上記により、本発明の特定の実施態様では、粒状体（またはタンパク質凝集体
）含量を低減した培地で培養された細胞が産生した生物学的サンプルから、膜小
胞を調製する。

【００８３】さらに、本発明のもう一つの目的は、樹状細胞を生成する方法であって、樹状
細胞の前駆細胞を、増殖因子および／またはサイトカインを含む、粒状体含量を
低減した、より好ましくはハプトグロビン凝集体を本質的に含まない培地で培養
して、該前駆細胞の樹状細胞、特に未成熟樹状細胞への分化を作動または刺激す
る工程を含む方法にある。

【００８４】本発明は、ハプトグロビン凝集体のような粒状体含量を低減した培地、より具
体的には凝集したハプトグロビンを本質的に含まない培地中に、樹状細胞を（ま
たは膜小胞を産生するその他いかなる細胞も）含む組成物にもある。

【００８５】培養または生産培地は、哺乳動物細胞、特にヒトの細胞を培養するのに適した
いかなる培地であってもよい。そのような培地の例は、ＡＩＭＶ、ＲＰＭＩ、Ｄ
ＭＥＭなど、より一般的には、タンパク質（または血清もしくはその代替物）を
含むいかなる哺乳動物細胞用培地も包含する。好適な培地は、無血清培地であっ
て、臨床的用途に適する。

【００８６】用語：ハプトグロビン凝集体「を実質的に含まない」、「を枯渇させた」また
は「の含量を低減した」は、その培地または生成物が、好ましくは１ppm未満の
ハプトグロビン凝集体、より好ましくは０．５ppm未満の凝集ハプトグロビンを
含有することを示す。より詳しくは、本出願人らは、ここに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびＥＬＩＳＡによって、９９％を越えるハプトグロビン凝集体を、ＡＩＭＶ
培地のような生物学的産物から除去できたことを決定した。より具体的には、こ
の培地は、１００nmを越える直径を有する、（タンパク質凝集体、沈澱などを包
含する）粒状体を本質的に欠く。さらに一つの好適実施態様では、該培地は、５
００kDaの膜を通過しない、（タンパク質凝集体、沈澱などを包含する）粒状体
を本質的に欠く。本発明の、より好適な培地は、（たとえば、Sigmaのモノクロ
ーナル抗体Ｈ６３９５を用いた）ＥＬＩＳＡによって決定された限りで、約２０
ng/ml未満、より好ましくは約１０ng/ml未満の凝集ハプトグロビンを含有する培
地である。さらに、注目すべきことに、ハプトグロビン凝集体の存在は、一般的
に、培地を濃縮するまでは認識できない。したがって、本発明の好適な培地は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＥＬＩＳＡによって測定された限りで、ヘパトグロ
ビン凝集体を含有しない。

【００８７】（凝集ハプトグロビンを含まない生物学的産物）本発明は、凝集ハプトグロビンを本質的に含まない生物学的産物（たとえば血
液産物）の組成物の製造はもとより、製剤用途向けの製品を配合する前の様々な
緩衝液の処理にも適する。

【００８８】ちなみに、本発明は、生物学的ポリペプチドまたはその誘導体を含む組成物で
あって、ハプトグロビン凝集体を本質的に枯渇させた組成物に関する。より詳し
くは、本発明は、ハプトグロビン凝集体を本質的に枯渇させた、熱不活性化した
生物学的ポリペプチドを含む組成物にある。生物学的ポリペプチドは、哺乳動物
の生物体液、特に血液、血清または血漿から単離（または抽出）された、いかな
るポリペプチド、タンパク質もしくはペプチドであってもよい。生物学的ポリペ
プチドの好適な例は、血清アルブミン、γ−免疫グロブリン、凝固因子（たとえ
ば因子VIII、因子IX）、より好ましくはヒトを起源とするそれを包含する。本発
明の組成物は、はるかに好ましくは、約０．０１％未満、特に約０．００１％未
満のハプトグロビン凝集体を含有することを特徴とする。

【００８９】特定の例では、本発明は、凝集ハプトグロビンを本質的に含まない、熱不活性
化された血清アルブミン、より好ましくはヒト血清アルブミンの組成物に関する
。精製ｈＳＡは、製剤業界では広く用いられている（血漿補足剤、タンパク質安
定剤等々）。ｈＳＡ溶液中のハプトグロビンの存在は、熱処理の際に凝集体の形
成の原因となることが立証された。さらに、凝集したタンパク質は、その非凝集
形態より少なくとも１万倍も免疫原性に富むと思われるため、その存在は、調製
品の活性および安全性に有害となり得る。本発明は、ここに、そのようないかな
るハプトグロビン凝集体も、より詳しくは上記のとおりの限外濾過によって、ｈ
ＳＡ調製品から除去するのを許して、それによって、製剤用途向けの高い純度お
よび品質を有する新規なｈＳＡ組成物を提供する。より詳しくは、本発明は、こ
こに、約０．０１重量％未満、はるかに好ましくは約０．００１重量％未満の凝
集ハプトグロビンを含有する。本願に記載された特定の例は、約０．０００２５
重量％またはそれ以下の凝集ハプトグロビンを含有するアルブミン調製品が、本
発明で得られることを立証する。より好ましくは、本発明のアルブミン調製品（
または組成物）は、加熱されたｈＳＡ調製品（または組成物）、特に製剤用途向
けのそれである。

【００９０】本発明は、生物学的産物、より好ましくは熱不活性化された生物学的産物を処
理して、それに含有されるハプトグロビン凝集体の量を低減する方法であって、
該産物を、濾過、より好ましくは限外濾過に付す工程を含む方法にもある。

【００９１】本発明の特定の目的は、生物学的産物を調製する方法であって、（ｉ）該生物
学的産物を熱不活性化する工程と、（ii）該熱不活性化された生物学的産物を濾
過する工程とを含む方法にもある。より好ましくは、該方法は、（iii）濾過さ
れた、熱不活性化された生物学的産物を濃縮する工程、および／または（iv）そ
れの順化工程をさらに含む。この方法は、ヒトの血液または血漿もしくは血清の
ような、哺乳動物の生物体液から単離（または抽出）されたいかなるタンパク質
またはポリペプチド（またはその誘導体）も包含する、様々な生物学的産物に用
いることができる。本願中にさらに文書で記録されるとおり、この方法は、ハプ
トグロビン凝集体の含有量が低減された、より好ましくは、ハプトグロビン凝集
体を本質的に含まず、そのため安全性が高められた、熱不活性化された生物学的
産物の製造を初めて可能にする。該方法は、血液または血漿から抽出された製剤
用タンパク質、たとえば血清アルブミン、より好ましくはヒトの血清アルブミン
、γ免疫グロブリン、凝固因子等々の調製に特に適する。濾過工程は、好ましく
は限外濾過、はるかに好ましくは、約１００〜約１，０００kDa、代表的には２
００〜７５０kDaのＭＷＣＯでのそれを含む。この濾過は、上に開示されたいか
なる装置および条件においても実施してよい。さらに、上記のような代替的方法
を用いてもよい。

【００９２】ちなみに、本発明は、処理する方法であって、アルブミン調製品を濾過、好ま
しくは限外濾過に付す工程を含む方法にも関する。より好適な方法は、２００〜
７５０kDaの平均細孔径を有する多孔性の装置での限外濾過による、加熱された
ｈＳＡ組成物（または調製品）の処理にある。製剤の分野では、大量のｈＳＡが
用いられるため、本出願人らの、より高い品質を有する方法および組成物は、安
全確保の面で有意な利点を代表する。

【００９３】（サンプルの作成）上に示したとおり、本発明は、膜小胞の製造に関し、かつ抗原提示細胞（たと
えばマクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球）、腫瘍細胞その他の、膜小胞を産
生するいかなる細胞または細胞系によって生成される膜小胞も包含する、様々な
起源からの膜小胞を調製するのに適する。それは、樹状細胞、好ましくは未成熟
樹状細胞が産生する膜小胞（すなわちデキソソーム）を調製するのに特に適する
。さらに、該膜小胞、または対応する生成細胞は、調製の前、間または後に、１
種類もしくは数種類の抗原に対して感作することができる。

【００９４】（単球の細胞培養）デキソソームその他の膜小胞を含有する生物学的サンプルを作成する様々な方
法が、WO99/03499（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【００９５】本発明の対象範囲内の好適な方法論は、単球前駆細胞または骨髄、より好まし
くは未成熟樹状細胞（「ＤＣ」）からのＤＣの生成に基づく。実際、本発明者ら
は、未成熟ＤＣは、エキソソームを産生する能力を有するが、成熟ＤＣは、そう
することが本質的にできないことを示した。より具体的には、本発明の対象範囲
内では、サイトカインの組合せの存在下で、より好ましくはＤＣ成熟因子もしく
は条件の不在下で、および／またはＤＣの成熟を許さない時間にわたって、（血
液または骨髄に含まれる）単球前駆細胞を処理することによって得られる、未成
熟樹状細胞の組成物を用いるのが好ましい。

【００９６】未成熟樹状細胞の組成物は、好ましくは、未成熟樹状細胞を実質的に（すなわ
ち少なくとも６０％、好ましくは７０％）含む。

【００９７】したがって、樹状細胞調製工程は、好都合には、未成熟樹状細胞、特にヒトを
起源とするそれ、具体的には単球前駆細胞からの調製、より具体的には、成熟因
子の不在下、および／または成熟を回避するための無血清培地での、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ＋ＩＬ−４もしくはＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−１３のようなサイトカインの組合せ
での処理による調製を含む。

【００９８】加えて、本発明の対象範囲内では、不死化された樹状細胞集団を用いることも
可能である。これらは、不死化された樹状細胞系（たとえば、Ｄ１系その他の、
たとえば樹状細胞にｍｙｃという癌遺伝子を導入することによって生成された系
統）からなってよい。それらは、in vitroで調製され、かつ不死化された樹状細
胞からなってもよい。不死化樹状細胞系の問題は、与えられた抗原群に対して感
作された保存細胞を構成することにあって、この保存細胞を用いて、患者の家族
全体への投与に適合するデキソソームを調製してよい。

【００９９】膜小胞（デキソソーム）を調製するには、未成熟樹状細胞の集団を、当業者に
は公知の慣用の条件下で単純に培養してよい。しかし、デキソソームの産生を刺
激する条件下、特にデキソソーム産生を刺激できる因子、特にγ−インターフェ
ロン、インターロイキン１０またはインターロイキン１２のようなサイトカイン
の存在下で、これらの細胞を培養するのが好ましい（たとえば、WO99/03499を参
照されたい）。本発明による方法の好適実施態様では、未成熟樹状細胞の集団を
、膜小胞の産生を刺激する条件下で培養する。予備実験は、γ−インターフェロ
ンの添加が、前臨床マウス腫瘍モデルでのin vivoでのデキソソームの薬効を高
めることを示す。７日目に、培地を捕集し、次いでデキソソームを単離する。

【０１００】本発明の特定の実施態様では、患者の末梢血サンプルを、臨床等級のＡＩＭＶ
、すなわち無血清細胞培養培地（Life Technologies, Inc.）中で培養する。用
いる前に、培地を限外濾過に付して、凝集したタンパク質（たとえばハプトグロ
ビン）を除去するが、その除去は、細胞増殖に影響せずに、その後の純粋なデキ
ソソームの単離を少なからず助けることが、本出願人らによって示された。

【０１０１】膜小胞は、他のいかなる手段によっても調製することができ、本発明に用い得
ることが理解される。特に、膜小胞は、人工的にか、または不死化させたか、も
しくは既に確立されている収集機関またはバンクから得た細胞系を用いて、産生
させてもよい。

【０１０２】細胞または小胞の感作：抗原担荷膜小胞産生細胞（たとえば樹状細胞）は、膜小胞の産生前（またはその間）に
、抗原に対して感作することができる。これに代えて、膜小胞自体を感作しても
よい。この実施態様は、与えられた免疫原性を有する小胞の産生を可能にする。
感作は、たとえば、細胞を抗原性ペプチド、抗原、タンパク質複合体、抗原を発
現する細胞もしくは細胞膜、アポトーシス体、膜小胞、リポソーム、腫瘍ＲＮＡ
、または１種類もしくはそれ以上の抗原、抗原決定基もしくはエピトープ（ウイ
ルスまたは非ウイルスベクターが担持していることもあり得る）をコーディング
しているいかなる核酸にも接触させることを含む、異なる周知の手法を用いて実
施してよい（たとえば、WO99/03499を参照されたい）。これに代えて、感作は、
小胞の直接ペプチド担荷、すなわち、小胞を抗原性ペプチドに接触させることに
よって実施してもよい。実際、本発明は、小胞の直接ペプチド担荷が可能であり
、向上した免疫原性を小胞に与えることを示す。好適実施態様では、感作は、産
生細胞を、ペプチド、抗原、ＲＮＡもしくは核酸とともに温置すること、または
小胞の直接ペプチド担荷によって実施する。本願は、感作または産生の手法に限
定されないことが理解される。

【０１０３】細胞（または小胞）を該抗原、対応するタンパク質、ペプチド、核酸などに接
触させることによって、樹状細胞（または膜小胞）を感作するのに多くの抗原を
用いることができる。好適な抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌性抗原など
である。代表的な腫瘍抗原は、黒色腫抗原（ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ。ＢＡＧＥ等々
）、前立腺特異的抗原（たとえばＰＳＭＡ）、ＣＥＡ、ｒａｓ、ｐ５３、Ｒｂ、
肝腫瘍抗原等々を包含する。

【０１０４】タンパク質抗原は、樹状細胞（「ＤＣ」）内で特異的なタンパク質へとプロセ
シングされ、次いで、それらは、ＭＨＣ分子によって捕捉されて、細胞表面で提
示される。与えられたタンパク質については、異なるＨＬＡハプロタイプのヒト
ＤＣが、異なるペプチド（エピトープ）を提示する。ＤＣとペプチドとを適正な
条件下で温置することによって、適切なペプチドをＤＣのＭＨＣクラスＩに担荷
することができる。抗原を、単離されたデキソソームにin vitroで直接担荷する
こともできる。特定の例では、ＨＬＡ−Ａ２に対する公知のエピトープを含む、
ＭＡＧＥ−Ａ３および−Ａ４ペプチドを合成して、患者のデキソソームを担荷す
るのに用いる。この実験での患者についての編入基準は、ＨＬＡ−Ａ２ハプロタ
イプの発現を包含する。ＨＬＡ−Ａ２⁺ハプロタイプは、比較的高頻度であって
、ヒトの集団のほぼ５０％に存在する。

【０１０５】さらに、ＴＴ（破傷風トキソイド）およびＣＭＶペプチド、特にＴＴＰ２ペプ
チドのような対照抗原も、加えることができる。対照抗原の目的は、公知の抗原
による、抗原提示の際のデキソソームの機能を試験するための内部対照として役
立てることである。そのため、正の対照として、デキソソームに、たとえばＣＭ
Ｖペプチド（クラスＩ）およびＴＴＰ２ペプチド（クラスII）も担荷する。これ
らの対照による陽性の応答は、デキソソームが活性を有することを示す。ＣＭＶ
は、一般集団のほぼ５０％が、ＣＭＶ（リコール）に免疫であり、残余は、未感
染（初回）であるため、初回およびリコール抗原応答の双方についての試験を与
えるという利点を有する。

【０１０６】その他の抗原は、ＣＤ１分子によって免疫系に提示される、いかなる脂質、糖
脂質またはリポタンパク質のような脂質抗原である。脂質は、いかなる微生物脂
質、微生物糖脂質、脂質または糖脂質腫瘍抗原等々であってもよい。脂質の具体
的な例は、ミコバクテリア脂質、たとえばミコール酸、グルコース−１−ミコー
ル酸、ヘキソース−１−ホスホイソプレノイド、およびホスファチジルイノシト
ールマンノシドのようなリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）の誘導体を包含する。
その他の例は、ガングリオシド、糖脂質腫瘍抗原等々のような、自己セラミドを
包含する。

【０１０７】下記の例３は、樹状細胞およびデキソソームに対するＣＭＶペプチド（抗原）
の担荷およびアッセイのためのモデル系で得られた、予備的な結果を記載する。
結果は、担荷された小胞が抗原特異的ＣＴＬを刺激できることを立証する（図２
）。

【０１０８】その他のいかなる感作法および抗原も、本発明に用いて、望みの免疫原特性を
膜小胞に付与しえることを理解しなければならない。

【０１０９】ちなみに、本発明は、膜小胞、たとえばデキソソームを直接担荷する方法も記
載する。該方法は、クラスＩおよびクラスIIペプチドまたは脂質を用いて実施す
ることができ、従来手法に優る有意な利点を与える。特に、実施例に示されると
おり、直接担荷は、従来の間接担荷より、少ない量のペプチドを用いて、表面Ｈ
ＬＡ受容体の高い占有率を達成することができるという点で、効率的である。こ
のことは、膜小胞の免疫原としての潜在的可能性を明確に高める。加えて、担荷
されるペプチドの構造は、担荷されるペプチドが、全細胞によってプロセシング
されず、そのため、担荷に際して健全かつ未変質のままであることから、より精
密に制御することができる。本発明は、ここに、直接ペプチド担荷が、デキソソ
ームのような精製された膜小胞を用いて実施できることを初めて提唱し、かつ示
す。ちなみに、本発明は、膜小胞が、その活性および機能性を失うことなく、低
いpH条件に耐えることを示す。本発明は、改良された直接担荷を可能にする特定
の条件も記載する。本発明は、間接担荷（すなわち全細胞への担荷）に慣用され
る緩衝培地を、異なる緩衝培地に好都合にも置き換えて、直接担荷の効率を高め
、より高い占有率を達成し得ることを特に示して、小胞が全細胞のようには挙動
しないことを示す。本発明は、全細胞とは対照的に、膜小胞は、長期間の酸処理
または培地に抵抗し、それによって置換えによる直接担荷を、加えるβ₂−ミク
ログロブリンの不在下でさえ許し得る。

【０１１０】第一の変化形では、直接ペプチド担荷の方法は、（ｉ）単離または精製された
膜小胞を、選ばれた酸性培地に付す工程と、（ii）（ｉ）の膜小胞を、好ましく
は中和の間または後に、β₂−ミクログロブリンの存在下で、選ばれたペプチド
に接触させる結果、該ペプチドが該膜小胞に担荷される工程とを含む。

【０１１１】この第一の変化形では、膜小胞（たとえばデキソソーム）を、初めに、選ばれ
た酸性培地に付す。この酸溶離は、小胞の表面のＨＬＡクラスＩおよびクラスII
分子に付随する、内因性ペプチドおよびβ₂−ミクログロブリン（β₂−ｍ）の少
なくとも一部を、エキソソームの生物学的および免疫学的特性を変えることなく
除去する。この処理は、内因性ペプチドに対して誘発される二次免疫応答を回避
または低減することから、好都合である。本出願人らが決定したとおり、選ばれ
た酸性培地または処理は、好ましくは、小胞を２〜６、より好ましくは３〜５．
５のpHを有する培地に付す工程を含む。本願は、実際に、エキソソームは、その
ような酸性pHで処理することができ、その生物学的特性を依然として保持するこ
とを示す。特に、本願は、意外にも、エキソソームは、穏やかな酸処理に付し、
中和し、望みのペプチドを担荷することができ、望みのペプチドに対する効果的
な免疫応答を刺激できる能力を依然として示すことを示す。培地は、適切ないか
なる緩衝液、たとえばクエン酸塩、酢酸塩等々をさらに含んでもよい。ちなみに
、本発明者らは、はるかに好適な培地は、酢酸ナトリウムを含むが、これは、慣
用のクエン酸緩衝液と比較して、高い担荷性能を与えることを示した。選ばれた
培地は、慣用のいかなる培養または増殖用培地から誘導してもよく、かつ望みど
おりのpHに達するための緩衝性条件をそれに加えてもよい。この培地は、当技術
に公知の方法による様々な緩衝液栄養素を用いた、人工的であるか、または規定
されたものであってもよい。基本的には、本発明による選ばれた酸性培地は、膜
小胞を維持するのを可能にする、いかなる培養、増殖、条件調整その他のための
液体溶液または緩衝液も意味して、該溶液は、上記のとおりのpHを有し、好まし
くは、酢酸塩、たとえば酢酸ナトリウムを含む。

【０１１２】穏やかな酸処理は、低い温度、代表的には８℃未満、好ましくは約４℃で、基
本的には１５分未満、好ましくは１０分未満、はるかに好ましくは５分未満の時
間にわたって実施する。処理の条件（培地、pH、温度、持続等々）は、当業者が
、本願の教示および実施例を用いて、本発明から逸脱することなく調整できるこ
とを理解しなければならない。

【０１１３】中和は、慣用の方法に従って、溶液のpHを上昇させることによって実施するこ
とができる。中和の結果は、好ましくは、５．５を越える、代表的には約６〜約
９の両端を含むpHを有する培地を生じる。中和は、代表的には、約１０または１
１のpHでの中和媒体、たとえばトリス緩衝液を培地に加えることによって実施す
る。

【０１１４】ペプチドとエキソソームとの接触は、ペプチドがエキソソームの表面でＭＨＣ
分子と結合するのを可能にするのに充分な条件下で実施しなければならない。代
表的には、中和の間または後に、外因性（クラスＩ）ペプチドおよびβ₂−ｍを
、好ましくは、ペプチドが担荷されるよう、ペプチドとβ₂−ｍとの複合体を形
成した後に、ＨＬＡクラスＩの再構成に有利なだけ過剰に加える。中和前に解離
した内因性ペプチドを排除したり、または接触後に未結合ペプチドを除去するこ
とは不要である。代表的には、０．００５〜５０μg/mlの外因性ペプチド（好ま
しくは０．０１〜１０mg/ml）、および１〜８０μg/mlのβ₂−ｍを用いてよい。
ペプチドおよびβ₂−ｍは、様々な手法、たとえば組換え生成、合成等々によっ
て生成してよい。β₂−ｍは、好ましくは、ヒトを起源とする（ヒトβ₂−ｍは、
商業的に入手でき（Sigma）、慣用の手法によって生成することができる）。接
触は、たとえば室温で、約２時間まで実施してよい。実施例は、飽和が、接触後
３０分という早期に達成されることを示す。ビオチニル化された参照ペプチドと
ともにＴＲＦを用いて、本発明者らは、デキソソームに直接担荷されたペプチド
の量を決定し、標識された参照ペプチドと非標識化標的ペプチドとの間に、結合
の競合が存在して、デキソソームへの標的ペプチドの直接担荷が成功したことを
示すことを立証することができる。このようにして、０．１μg/mlという低濃度
でＭａｒｔ−１ペプチドを担荷したデキソソームは、一貫して、かつ再現できる
ように、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＴＬクローンのＬＴ１１を刺激して、ＩＬ−２を
生成する（例１２）。

【０１１５】もう一つの変化形では、この方法は、β₂−ミクログロブリンの使用を必要と
する。実際、本発明者らは、内因性β₂−ｍを強烈に除去または不安定化するこ
となく、内因性ペプチドを除去するのに適する条件を規定することができ、その
結果、外因性β₂−ｍを用いずに直接担荷が可能であることを示した。この好適
な変化形では、該方法は、（ｉ）単離または精製された膜小胞を、β₂ミクログ
ロブリンの不在下で、クラスＩ制限ペプチドまたは脂質に接触させる工程と、（
ii）（ｉ）の混合物を、ペプチドまたは脂質が該膜小胞の表面でＨＬＡクラスI
分子と複合するのを可能にする条件下で、選ばれた酸性培地に付す工程と、（ii
i）担荷された膜小胞を捕集する工程とを含む。より好ましくは、工程（ii）は
、混合物を、約４〜５．５の両端を含むpHで２時間未満、はるかに好ましくは約
４．２〜５．２のpHで１時間未満にわたって、穏やかな酸処理に付す工程を含む
。この実施態様は、より少ない処理を必要とし、外因性β₂−ｍの必要が皆無で
あって、ヒト由来の産物に付随するコスト、操作、あり得る問題を軽減する。こ
のβ₂−ミクログロブリン無用の実施態様では、単離または精製された膜小胞を
、代表的には、過剰量の外因性ペプチド、たとえば５〜５００μg/mlのクラスＩ
制限ペプチドに、β₂−ミクログロブリンの不在下で接触させる。上に定義され
たとおりの適切な条件下で接触させると、担荷は、抗原提示分子に付随する内因
性化合物（たとえば、ペプチドに対してはＭＨＣクラスＩまたはII、脂質に対し
てはＣＤ１）と、問題のペプチドまたは脂質との交換（交換工程）によって生じ
る。この交換は、本発明者らが規定した、選ばれた酸の条件の存在によって可能
または充分にされる。交換は、本出願人らによる、エキソソームのような膜小胞
は、全細胞によるのとは対照的に、長期の援助接触に抵抗し、そのため、内因性
β₂−ｍを加えることなく交換工程を容易にするのに充分な、規定された酸処理
に付すことができるとの立証によって可能にされる。通常、１５〜３０分後（必
要ならばより長く、または条件に応じて、より短く）に交換または置換を実施し
たならば、担荷された小胞は、溶液のpHを上昇させ、それによって効果を遮断す
ることによって安定化してよい。中和は、上記のとおり実施してよい。

【０１１６】上に示したとおり、この方法は、様々な免疫原化合物、たとえばペプチドまた
は脂質を用いて実施することができる。ペプチドは、好ましくは、クラスＩまた
はII分子が提示するペプチド、すなわち、樹状細胞ならびにマクロファージおよ
びＢリンパ球のような、抗原提示細胞による抗原のプロセシングの結果生じるペ
プチドである。ペプチドの好適な一群は、クラスＩ制限ペプチド、はるかに好ま
しくはクラスＩ制限腫瘍ペプチド、すなわち、腫瘍抗原から誘導されるペプチド
によって代表されて、それらは、樹状細胞またはマクロファージによって免疫系
に提示される。この方法は、単離ペプチドまたはその混合物、たとえば腫瘍細胞
その他のペプチドの組合せのペプチド溶出液を用いて実施できることを理解しな
ければならない。脂質の具体的な例は、上記のとおり、細菌脂質、および糖脂質
腫瘍抗原を包含する。

【０１１７】下記の例１２は、デキソソームの直接担荷の結果を記載する。これらの結果は
、担荷小胞が、抗原特異的ＣＴＬを刺激できることを立証する。

【０１１８】サンプルの富化前記で示したように、サンプル（例えば上澄、ライゼート、体液等）を富化工
程に供することができ、この工程は１つまたはそれ以上の遠心、清澄化、限外濾
過、ナノフィルトレーション、アフィニティクロマトグラフィー、および／また
はダイアフィルトレーション工程からなってよい。具体的な態様では、富化工程
は（ｉ）細胞および／または細胞砕片の排除（清澄化）、できれば続いて（ii）
濃縮および／またはダイアフィルトレーション工程からなる。本発明による好ま
しい富化工程は（ｉ）細胞および／または細胞砕片の排除（清澄化）、（ii）濃
縮、および（iii）ダイアフィルトレーションからなる。

【０１１９】サンプルの清澄化例えば低速で、好ましくは１０００ｇ以下、例えば１００〜７００ｇでのサン
プルの遠心により細胞および／または細胞砕片を排除できる。この工程中の好ま
しい遠心条件はおよそ３００ｇまたは６００ｇで、例えば１〜１５分間である。

【０１２０】好ましくは、できれば前記の遠心と組み合わせたサンプルの濾過により、細胞
および／または細胞砕片を排除する。とりわけ有孔性を減じたフィルターを用い
る連続濾過により濾過を実施できる。この目的で、０．２μm以上、例えば０．
２〜１０μmの有孔性を有するフィルターを優先的に使用する。とりわけ１０μm
、１μm、０．５μm、続いて０．２２μmの有孔性を有するフィルターの連続使
用が可能である。

【０１２１】酢酸セルロースから成るディスポーザブル０．８μmカプセルフィルターを通
すマイクロフィルトレーションにより細胞培養培地を濾過して細胞および砕片を
除去する。マイクロフィルトレーションカプセルは単回使用用である。方法のス
キームを図５に示す。最低１０回の実験により、例えば表面積５００cm²のマイ
クロフィルターの能力が２．５リットルから４リットル以上までの樹状細胞培養
上澄を濾過するのに十分であることが示される。必要な場合、懸濁液中の砕片の
量に依存してより広い表面積（例えば１０００cm²）を用いることができる。

【０１２２】その他の孔の大きさ、２μm、１μm、０．６５μm、０．４５μm等を用いてデ
キソソーム（dexosomes）から細胞および細胞砕片を清澄化することもできる。
マイクロフィルターはプレフィルターを含んでよく、すなわち０．８μmサルト
クリーンＣＡ（ザルトリウス・インコーポレーティッド）は３・０μm酢酸セル
ロースプレフィルターを含む。さらにフィルターは酢酸セルロースに加えて別の
物質、例えばポリプロピレンまたはポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）から成って
よい。

【０１２３】デキソソームからの細胞および砕片の除去に用いることができるその他の方法
は低速遠心、中空ファイバーを通す連続フローマイクロフィルトレーションおよ
びクロマトグラフィーである。

【０１２４】濃縮密度クッション段階中に処置すべきサンプルの容量を減じるために濃縮工程を
実施できる。このように、膜小胞の沈殿を引き起こす高速で、例えば１０，００
０〜１００，０００ｇでのサンプルの遠心により濃縮を行うことができる。これ
はおよそ７０，０００ｇで実施される最後の遠心を伴う一連の分別遠心からなる
。得られたペレットの膜小胞を小容量で方法の次の工程に適したバッファー中に
取ることができる。

【０１２５】濃縮工程は限外濾過により優先的に実施される。好ましい態様に従って、（清
澄化）生物学的サンプル（例えば上澄）を限外濾過、好ましくはタンジェンシャ
ル限外濾過に供する。タンジェンシャル限外濾過は決定されたカットオフ閾値の
膜により分離された２つの区画（濾液および保持液）の間で溶液を濃縮し、分別
することからなる。保持液区画における流れおよびこの区画および濾液区画間の
膜内外圧を適用することにより分離を行う。異なる系、例えばらせん膜（ミリポ
ア、アミコン）、フラット膜または中空ファイバー（アミコン、ミリポア、ザル
トリウス、ポール、ＧＦ、セプラコア）を用いて限外濾過を実施する。本発明の
範囲内で、１０００kDa、好ましくは３００kDaから１０００kDa、またはより好
ましくは３００kDaから５００kDaのカットオフ閾値を有する膜の使用が有利であ
る。

【０１２６】具体的な態様では、管腔の直径が０．５mmである５００kDa分子量カットオフ
（ＭＷＣＯ）中空ファイバー膜（Ａ／Ｇテクノロジー・インコーポレーティッド
）を通して限外濾過することにより清澄化した組織培養上澄（例えば０．８μm
フィルターを通す清澄化の後に得られた）を濃縮する。このカートリッジの孔の
大きさは保持液のデキソソームを保持するが、孔の大きさよりも小さいタンパク
質は膜を通過させる。中空ファイバーカートリッジはデキソソームに過剰な剪断
力をかけずに濃縮を急速に進行させるのに十分な表面積を含む。限外濾過を行う
出発上澄の典型的な容量は２〜４Ｌであり、次いでこれをおよそ１００mLに減じ
る（２０〜４０倍の減少）。操作の手順を図６に示す。

【０１２７】その他の孔の大きさ、例えば３０kDa、１００kDa、３００kDa、および７５０k
Daを用いてデキソソーム容量を濃縮することもできる。しかしながら、方法の効
率および収率は減少し得る。さらに、その他の限外濾過様式、例えば、ミリポア
、ザルトリウス、およびフィルトロニクスなどの会社の「プレートおよびフレー
ム」カセットを用いることができる。アミコン・インコーポレーティッドにより
提供されるような攪拌された細胞を用いてデキソソームの容量を減じることもで
きる。

【０１２８】中空ファイバー膜による限外濾過によるデキソソームの濃縮は低剪断力下で進
行する。供給流の剪断力（例えば０．７平方フィート面積で流速＜３００mL／分
）は２０００秒^-1以下である。工程中の入口および出口圧は工程中３〜８psi間
である。より厳密な条件を用いて、現在用いられているパラメーターに比較して
デキソソームを濃縮することができる。

【０１２９】別の技術、例えばイオン交換およびアフィニティクロマトグラフィー、並びに
フロー・フィールド・フロー分画を用いて本発明の調製方法におけるデキソソー
ムを濃縮することもできる。

【０１３０】ダイアフィルトレーション濃縮したデキソソーム調製物のダイアフィルトレーションを用いて夾雑培地お
よび細胞性タンパク質の濃度を減じることができる。限外濾過、クロマトグラフ
ィー、超遠心および透析バッグによるなどの、サンプルバッファーを処方バッフ
ァーと交換することができるいくつかの技術に従って、ダイアフィルトレーショ
ンを実施できる。

【０１３１】好ましい態様では、限外濾過系でダイアフィルトレーションを実施する。実験
セクションで示すように、この態様は効率がよい。さらに、同一の方法学を用い
てダイアフィルトレーション工程を限外濾過により濃縮された小胞調製物と容易
に組み合わせることができる。

【０１３２】この点で、特定の態様では濃縮工程と同一の限外濾過膜（すなわち５００kDa
のＭＷＣＯの中空ファイバー膜）を用いる限外濾過によりエキソソームをダイア
フィルトレートする。エキソソームの限定的な介入および処理を伴い、すなわち
中空ファイバーに導入した生成物の単なる修飾により、本質的に同一の装置で双
方の工程を実施できるのでこの態様は有利である。

【０１３３】５００kDa中空ファイバー膜に加えてその他の孔の大きさ、例えば３０kDa、１
００kDa、３００kDa、および７５０kDaを利用でき、好ましくは３０〜１０００k
Da、より好ましくは２００〜７５０kDa含んでなる。ダイアフィルトレーション
バッファーはＰＢＳで見出されるもの以外の賦形剤から成ってよい。ダイアフィ
ルトレーションに用いるバッファーの容量はデキソソーム濃縮物の容量のほぼ１
〜１０倍でよい。

【０１３４】ダイアフィルトレーションに用いられる操作パラメーターは清澄化組織培養培
地からのデキソソームの濃縮に関して前記したものと同様である。

【０１３５】密度クッション分離およびエキソソームの精製示したように、本発明は密度クッションでの遠心による膜小胞を含んでなる生
物学的サンプルの処置、およびクッションからの精製された小胞の収集を開示す
る。密度クッション遠心により一連の遠心または密度グラジエント遠心を用いる
先行技術に対していくつかの利点が提供される。これらには、物理学的損傷が低
減されることになる小胞の凝集の欠如、さらに夾雑物を除去し得るので小胞のさ
らなる精製、以下に論じるようにクッションに用いる構成成分の毒性の欠如、ス
クロース濃度の低減等がある。とりわけ、密度クッションによりサンプルを超遠
心した場合のエキソソームのペレット化を防御できる。可溶性タンパク質（約０
．７３）、エキソソーム（約０．８８）およびタンパク質凝集体の部分的比容積
の差によりこれが分離および精製に理想的な方法になる。エキソソームは密度ク
ッションに保持されるので、タンパク質凝集体（密度約１．３５）は密度クッシ
ョンを通ってペレット化すると予測される。方法を以下に簡単に記載する（この
方法の図式を図８ａおよび８ｂに表す）。

【０１３６】濃縮デキソソーム溶液と比較してより高密度の溶液（すなわちクッション）を
遠心チューブの底部に加えることにより、不連続または段階グラジエントの形成
（すなわち密度の急な変化）に至る。クッションにより低沈殿係数の分子を排除
することになる。さらにクッションは、実行の最後にいずれかの沈殿した物質を
容易に再懸濁し、ペレット化に抵抗し得ない粒子に損傷を与えるのを防御する。

【０１３７】さらに、別の利点としては、密度クッションにより組成物からのいずれかの夾
雑タンパク質凝集体、とりわけハプトグロビン凝集体の可能性を排除できる。

【０１３８】膜小胞、とりわけデキソソームは１．１００〜１．１４０ｇ/mlの密度を有す
ることが示されている。したがって、密度クッションは約１．１０〜約１．１５
の最終密度を有するべきである。

【０１３９】クッションの組成は、前記の好ましい密度に到達するように当業者により適合
されることができる。クッション溶液は浸透圧７００〜８００ｍＯｓのわずかに
高浸透圧性であるのが好ましい。好ましい態様では、密度クッションはトリスバ
ッファー中スクロース／Ｄ₂Ｏから成る。濃厚なスクロース／トリスＤ₂Ｏバッフ
ァーを各チューブの底部に加えることにより濃縮デキソソーム溶液を上方向に置
換して可視的なインターフェースを形成する。１００，０００×gでおよそ１時
間半の超遠心によりデキソソームをより濃厚なスクロース／トリスＤ₂Ｏクッシ
ョンに沈殿させる。濃厚なクッションは富化されより精製されたデキソソーム集
団を含有する。クッション上またはしばしばチューブの底部に見えるペレット中
のいずれかにあるデキソソームは極わずかである。さらにＤ₂Ｏは従来から臨床
現場で用いられており、使用されている濃度で毒性効果は認められていない。こ
の点で、ヒトにおける重水素の天然存在度は１５mg/kg（０．１５重量％）であ
る。

【０１４０】好ましくは、Ｄ₂Ｏ／スクロースクッションを使用する場合、最初のクッショ
ン溶液の密度は約１．１７５〜１．２１０ｇ／mLの範囲であるべきである（これ
らの特定の限界からの偏差を同様に用いることができる）。実際に出願人は現在
、遠心中のクッションにＤ₂Ｏ／スクロースの拡散を生じ、ミニグラジエントの
形成に至り、最終密度が約１．１から約１．１５ｇ/mlになる（すなわちプール
したクッションの密度を測定し、１．１００から１．１５０ｇ/mlになった）と
いう証拠を持つ。これは予期されず、ミニグラジエントを形成することによりク
ッションがエキソソームのさらなる精製を可能にするので、精製工程にさらなる
利点を提供する。

【０１４１】別の例では、スクロース／Ｄ₂Ｏに加えて、溶液の密度がエキソソームよりも
大きい別の溶液を調製できる。この点で、クッション中のスクロース量をさらに
低減させることさえできる二重標識した水（すなわちＤ₂ ¹⁷ＯまたはＤ₂ ¹⁸Ｏ）を
用いることができる。利用可能なＤ₂ ¹⁸Ｏ（純度９７％）の密度は１．２２であ
る。Ｄ₂ＯおよびＤ₂ ¹⁷ＯまたはＤ₂ ¹⁸Ｏの混合物を用いて、添加した成分を含ま
ない種々の密度の小胞および細胞分画を単離できる。

【０１４２】Ｈ₂Ｏ（重水素化していない）中の高濃度スクロースを調製して密度比較でき
る溶液を作製することもできるが、かかる溶液は有意にさらに高浸透圧性であり
、デキソソームの溶解を誘起し得る。イオジキサゾール（すなわちオプチプレッ
プ）、ペルコール、およびフィコールから成る市販の密度培地を用いて類似の様
式で研究方法のために、および分析目的でデキソソームを捕捉することができる
。

【０１４３】チューブに針を刺し通すこと、ピペッティング等のいずれかの適当な手段によ
りクッションから精製されたエキソソームを収集できる。

【０１４４】処方および順化ダイアフィルトレーションによるエキソソームの処方精製されたエキソソームを臨床使用またはさらなる保存に適した種々バッファ
ーまたは懸濁液で処方できる。この目的で、濃縮および／またはダイアフィルトレーションに以前から使用さ
れているものに様式が同等である５００kDaの限外濾過中空ファイバーカートリ
ッジでダイアフィルトレーションすることにより、精製されたエキソソームをバ
ッファー交換させることができる（以前の論考を参照のこと）。ハプトグロビン
夾雑物を含まないｈＳＡ（例えば１００μg/mL）を含有するバッファーでダイア
フィルトレーションの前最低１５分間カートリッジを予め順化するのが好ましい
。中空ファイバー基質への結合のためにｈＳＡの存在がデキソソームの非特異的
損失を防御するようである。精製された（抗原を加えた）エキソソームを含有す
る超遠心クッション分画（およそ１６mL）で最低５容量のバッファー交換を行い
、クッション成分を除去する（すなわち最低９８％のバッファーを交換する）。
図５に表したのと同一の手順を用いるが、しかしながら中空ファイバーカートリ
ッジの大きさを小さくして小容量に適合させる。以前に記載されているように、
ダイアフィルトレーションは必要でない低剪断力（すなわち２０００秒^-1）で実
施される。

【０１４５】その元来の容量の１／２８００でのデキソソームサンプルの典型的なＳＤＳ−
ＰＡＧＥを図１０に表す。

【０１４６】いくつかの処方用バッファーを用いてエキソソームを処方できる。典型的なバ
ッファーはＵＳＰ／ＮＦ賦形剤を含有する。処方溶液は以下の成分を含有できる
：１）緩衝薬、例えばトリス、２）凍結保護物質、例えばスクロース、トレアロ
ース、グルコース、グリセロール等、３）塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣ
ｌ₂、ＣａＣｌ₂等、４）充填剤、例えばマンニトール、グリシン、デンプン等、
５）抗酸化剤、６）ビタミン、７）安定化タンパク質およびペプチド、例えばｈ
ＳＡ、並びに８）その他の広く認められている処方に用いられる賦形剤。

【０１４７】この点で、本発明の目的は（ｉ）膜小胞、（ii）緩衝薬、および（iii）凍結
保護物質または安定化化合物を含んでなる組成物にある。組成物は好ましくはさ
らに（iv）塩および／または充填剤および／または抗酸化剤および／またはビタ
ミンを含んでなる。

【０１４８】典型的なバッファーはＰＢＳ、２０mm トリス／５％スクロース／１mm Ｍ
ｇＣｌ₂、pH７．４、または２０mm トリス／５％スクロース／１mm ＭｇＣ
ｌ₂、１００μg/mL ｈＳＡ、pH７．４を含んでなり、限外濾過に供してハプト
グロビンを除去する。

【０１４９】好ましくは、前記した処方溶液は本質的にハプトグロビン（または関連する重
合体、および微粒子体）不含である。この点で、処方溶液（またはその特定の個
々の成分、例えばアルブミン溶液）を限外濾過に供して以前に開示されたハプト
グロビンを排除できる。この最後の処置によりさらに生成物の高品質が保証され
る。

【０１５０】エキソソームの滅菌濾過および凍結最終的に、収集した（または処方した）物質を、とりわけ滅菌目的でさらに（
複数の）処置および／または濾過段階に供することができる。この点で、エキソ
ソームを直径０．３μmに等しいかまたはそれ以下のフィルターに通して滅菌濾
過できる。典型的な滅菌は損失が最低の０．２２μmシリンジフィルター（２５m
m）を通す濾過が含まれる（ＨＬＡ／ＤＲアッセイの結果を参照）。ミリポアの
「デュラポア」素材からなるフィルターを滅菌濾過に用いることができる。酢酸
セルロースまたはポリエーテルスルホンからなるその他のフィルター素材を用い
ることもできる。エキソソーム濾過の前にシリンジフィルターを、１００μg/mL
ｈＳＡ（ハプトグロビン不含）を含有する処方用バッファーで予め湿らせるの
が好ましい。シリンジポンプで制御したパラメーターで、または手動で誘導した
圧力のいずれかでエキソソームサンプル（〜１６mL）を滅菌濾過できる。

【０１５１】精製した（選択的に、処方したおよび／または滅菌した）エキソソームを凍結
し、−８０℃でまたは−２０℃もしくは４℃の別の保存温度で保存することもで
きる。凍結は「ミスター・フロスティー」クリオ−１℃凍結容器（ナルゲン・イ
ンコーポレーティッド）で、調節速度１°／分で実施するのが好ましい。液体Ｎ₂ 中低速または急速凍結のその他の方法をも用いることができる。この点で、本発明の目的は凍結エキソソームを含んでなる組成物にもある。

【０１５２】品質管理本発明はまた新規組成物および調製された（例えば精製されたおよび／または
処方された）または調製過程の膜小胞調製物を特徴づけるために用いることがで
きる方法をも開示する。本発明の組成物および方法を用いてサンプルまたは組成
物中のエキソソームの品質を評価し、エキソソーム調製物の表現型の決定および
エキソソーム調製物の生物学的活性を評価することができる。これらの方法はと
りわけ臨床適用に使用するための生成物を特徴付ける、すなわちエキソソーム調
製物の品質および組成を調節するのに適している。これらの方法は、本質的に自
己由来の（すなわち患者ごとの）小胞調製物を用いるので、治療目的で非常に重
要であり、これは個々の特性決定パラメーターを必要とする。これらの組成物お
よび方法を用いて種々の起源（すなわち抗原表示細胞、腫瘍細胞等）からのエキ
ソソーム調製物、抗原感受性（抗原担荷、抗原不含等）、新たに調製したかまた
は貯蔵した、１次細胞からまたは不死化細胞系から等を特徴づけすることができ
る。

【０１５３】エキソソームの投与サンプル（または精製された組成物）中に存在する膜小胞の品質を評価する方
法が開発されている。方法はエキソソームに存在する細胞表面マーカーを認識す
る抗体を用いる免疫複合体形成および検出に関与する。

【０１５４】より具体的には、本発明によるサンプル中の膜小胞を投与する方法は（ｉ）サ
ンプルを固体支持体に吸着させること、（ii）吸着した支持体をエキソソームの
細胞表面マーカーに特異的な（捕捉）抗体と接触されること、および（iii）抗
原−抗体免疫複合体の存在を決定すること（または投与すること）からなる。

【０１５５】さらに好ましくは、エキソソームの細胞表面マーカーに特異的な抗体は抗クラ
スII抗体、すなわちＭＨＣクラスII分子に結合する抗体、または抗クラスＩ抗
体である。さらに、特定の態様では、少なくとも第２の捕捉抗体を平行して使用
してエキソソームに関する評価の選択性をさらに増強させる。例えば、好ましい
さらなる捕捉抗体はＣＤ８１細胞表面マーカーに対して、またはＭＨＣクラス
Ｉ分子に対して指向する。ＣＤ８１は樹状細胞から有意に減成されるので、抗Ｃ
Ｄ８１抗体の使用はデキソソームの特徴づけ（投与）に有利であり、したがって
デキソソームに特異的なシグナルを提供する。エキソソームに特異的なその他の
抗体、例えば抗ＣＤ６３または抗ＣＤ９をこの工程で使用することができる。好ましい態様では、このようにエキソソームを固体支持体に吸着させ、抗クラ
スII抗体および抗ＣＤ８１抗体と別個に接触させる。

【０１５６】接触工程の結果として形成される抗原−抗体免疫複合体を従来の免疫学的技術
に従って検出できる。好ましくは、複合体を第１および／または第２の捕捉抗体
に結合する標識した顕示抗体を用いて現す。顕示抗体を放射活性、酵素活性、蛍
光標識、ケムニレセント（chemunilescent）標識等で標識できる。複合体の測定
はサンプルに存在するエキソソームの量に相関する（すなわち直接的指標を提供
する）。２つの抗体（例えば、抗クラスIIおよび抗ＣＤ８１）を使用する場合、
各々の抗体で検出される複合体の平均または比率を定量パラメーターとして実行
する。

【０１５７】方法で用いられる種々の抗体は天然形態であるかまたは修飾（例えばヒト化）
されているかのいずれかのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、そのフラ
グメントまたは誘導体でよい。典型的な実験では、捕捉抗体はモノクローナル抗
体である。別の典型的な実験では、顕示抗体をモノクローナルまたはポリクロー
ナル抗体で標識する。

【０１５８】本発明の方法を実施する場合、種々の固体支持体、例えばマルチウェルプレー
ト、とりわけ９６ウェルプレートまたはいずれかのその他のタイトレーションプ
レートを用いることができる。

【０１５９】さらに、本発明の投与方法を実施する場合、非特異的バックグラウンドシグナ
ルを低減するために、精製されたエキソソームサンプルを使用するのが非常に好
ましい。その目的では、サンプルは精製されたエキソソームサンプルであるのが
好ましく、密度クッション（超）遠心に供されるサンプルであるのがさらに好ま
しい。分析目的では、数mlのエキソソーム溶液をＤ₂Ｏスクロース密度クッショ
ン２００μl上で遠心する。クッション溶液上で直接ＥＬＩＳＡを実施できる。
この単純な精製工程により十分濃縮および精製できる。回収率はほぼ１００％で
ある。

【０１６０】具体的な態様では、サンプル、組成物、液体等のエキソソームを定量するため
に、ＥＬＩＳＡ基盤の分析が開発されている。図１１ａはＨＬＡ−ＤＲ（すなわ
ちＭＨＣ II）の測定を説明し、図１１ｂはデキソソーム中のＣＤ８１の測定を
説明する。ＨＬＡ／ＤＲは抗原提示に関与するので、ＨＬＡ／ＤＲアッセイはデ
キソソームの活性に対して感受性があり、しかも機能的に関連する。このアッセ
イをデキソソーム調製物の定量アッセイとして選択する。ＨＬＡ／ＤＲ決定のた
めのＥＬＩＳＡアッセイにより最終生成物中のデキソソームを定量する。このア
ッセイは樹状細胞のＨＬＡ／ＤＲをも測定し得るので、このアッセイは樹状細胞
ごとの、および単離されたデキソソームの容量ごとの関連ＨＬＡ／ＤＲ投与の手
段を提供する。

【０１６１】エキソソームの表現型分類サンプル（または精製された組成物）に存在する膜小胞の表現型を評価する方
法が開発されている。方法はエキソソーム上（中）に存在するいくつかの細胞（
表面）マーカーを認識する抗体を用いる、免疫複合体形成および検出に関する。
方法はさらにエキソソームを固体支持体、例えばビーズ上で複合体形成させ、各
調製物の表現型の感受性および信頼性のある測定が可能になる。

【０１６２】この点で、本発明の目的は調製物中の小胞膜を特徴付ける方法にあり、この方
法は平行して膜小胞調製物のサンプルを小胞のマーカーに特異的な２つまたはそ
れ以上の抗体と接触させ、抗原−抗体複合体の形成を決定することからなる。

【０１６３】方法はより特異的にエキソソーム調製物の表現型、すなわち調製物中のエキソ
ソームにより発現される細胞表面マーカーの特異的な型の決定に方向付けられる
。エキソソーム調製物の自己由来の特性を鑑み、表現型は構造および潜在活性の
双方に関して調製物の組成の特徴づけに必須である。

【０１６４】より好ましくは、調製物の特徴づけの方法は固体支持体、例えばビーズにエキ
ソソームを結合させる最初の工程を含んでなる。さらに好ましくはエキソソーム
を固体支持体、例えばビーズに共有結合させるか、または抗体媒介アフィニティ
ー結合により結合させる。典型的な態様では、直径約１〜１０μm、より好まし
くは３〜５μmのビーズを用い、そこに共有結合したか、または免疫親和性によ
り連結した１０００以上、より好ましくは２０００〜５０００のエキソソームを
担持できる。エキソソームでコーティングされたビーズを次いでプレートのウェ
ルに分配し、並行して選択された抗体と接触させる。

【０１６５】抗体を細胞表面マーカーまたは内部タンパク質のいずれかに結合させることが
できる。実際に、エキソソームの固体支持体、例えばビーズの結合は外側の物質
、例えば抗体に利用可能な特定の内部タンパク質を与えると考えられる。

【０１６６】好ましくは、以下の表１に列挙した２つまたはそれ以上の抗体を使用する：

【０１６７】

【表１】

【０１６８】好ましくは、これらの抗体を標識して形成した免疫複合体の検出および／また
は投与を可能にする。標識は放射化成、化学的、酵素的、蛍光等でよい。好まし
い標識は蛍光、例えばＦＩＴＣまたはＰＥである。より好ましくは、少なくとも５つの異なる抗体、さらに好ましくは少なくとも
８つの異なる抗体を使用する。抗体はモノクローナルであるのが好ましい。

【０１６９】具体的な態様では、直接染色法を用いて免疫表現型分類を実施する。精製され
たエキソソームの小さいアリコートを抗クラスII（例えば抗ＨＬＡ／ＤＲ）コー
ティングした磁気ビーズと共にインキュベートする。次いで抗ＨＬＡ−ＤＲコー
ティングした磁気ビーズに連結したエキソソームを標識抗体、より好ましくは蛍
光抱合（例えばＦＩＴＣまたはＰＥ）モノクローナル抗体と共にインキュベート
する。フローサイトメトリーを用いて４つのパラメーターを測定できる。前方散
乱、側面方向散乱および２つの蛍光チャンネルである。この２つの着色フローサ
イトメトリー分析により単一の測定でエキソソーム上の抗原の同定が可能になる
。

【０１７０】いくつかのデキソソームに関して得られた結果を図１４に示す。これらの結果
は明らかに、エキソソーム調製物を免疫表現型分類するための請求した方法の有
効性および迅速性を表している。

【０１７１】エキソソームの機能サンプル（または精製された組成物）に存在する膜小胞の生物学的活性を評価
するための別の方法が開発されている。方法は参照抗原、例えば超抗原（例えば
ＳＥＥ）を用いるＴ細胞の集団からのＣＴＬリンパ球の活性化の評価に関与する
。

【０１７２】したがって本発明の特定の目的は膜小胞の活性を特徴付ける方法にあり、この
方法は修飾細胞の存在下で超抗原担荷小胞をＴ細胞と接触させ、Ｔ細胞の活性化
を測定することからなる。

【０１７３】超抗原は細菌およびウイルスのごとき多くの異なる病原体により産生される。
超抗原は加工されずに直接ＭＨＣ II分子に結合する。ＭＨＣ II分子のグルー
ブの結合の代わりに、超抗原はＭＨＣ II分子の外側表面およびＴ細胞レセプタ
ー（ＴＣＲ）のＶ_β領域に結合し、非常に多くのＴ細胞（２〜２０％）を刺激す
ることができる。超抗原が種々のＭＨＣ IIおよびＴＣＲに結合でき、強力なＴ
細胞応答を誘導するという事実により、これはデキソソームの抗原提示機能を試
験する一般的な感受性のあるアッセイを確立するための魅力的な試薬になる。超
抗原を種々の供給源から調製または単離することができる。本発明で使用するの
に好ましい超抗原はＳＥＥ抗原、ＥＴ４０４（トキシン・テクノロジー・インコ
ーポレーティッド）である。別の超抗原、例えばＳＥＡおよびＳＥＢを使用する
ことができる。

【０１７４】Ｔ細胞はＴ細胞を含んでなる任意の新たに調製した細胞集団、例えば末梢血単
核細胞（「ＰＢＭＣ」）、および任意の不死化Ｔ細胞系、例えばジャーカット細
胞でよい。ジャーカット細胞は不死化ヒトＴ細胞であり、活性化されたときにＩ
Ｌ−２を分泌し、このバイオアッセイにおいてキラー細胞として機能し得る。ジ
ャーカット細胞のＴＣＲのＶ_β８はＳＥＥに結合する。ジャーカット細胞はまし
て異種性でなく、実験室において１次細胞よりも容易に成長するので、不死腫瘍
細胞としてとりわけ有用である。

【０１７５】修飾細胞は本バイオアッセイにおけるＴ細胞への活性化シグナルを媒介するこ
とができるいずれかの細胞でよい。修飾細胞は樹状細胞、例えばいずれかのコン
ピテント１次樹状細胞培養物または樹状細胞系でよい。修飾細胞はまた別の免疫
細胞または細胞系、とりわけ特定の抗原提示細胞または細胞系、例えばラジ細胞
でもよい。ラジ細胞はＥＢＶ不死化Ｂ細胞であり、本バイオアッセイにおいて機
能することが示されている。ラジ細胞をいずれかの適当な培地、例えばＲＰＭＩ
中で培養できる。

【０１７６】請求した方法を実施する場合、超抗原担荷小胞を修飾細胞の存在下キラーＴ細
胞と接触させ、Ｔ細胞の活性化を評価する。

【０１７７】Ｔ細胞の活性化の測定は種々の技術、例えばサイトカイン放出、タンパク質合
成、キラー細胞溶解等に従って実施できる。好ましい態様では、培地中のサイト
カインの生成、より具体的には培地中のインターロイキン−２の生成を決定する
ことによりＴ細胞活性化を測定する。典型的にはＩｌ−２をＥＬＩＳＡにより測
定する。

【０１７８】方法では、膜小胞自体を超抗原または膜小胞産生細胞（次いで得られた小胞を
超抗原に暴露する）と共に担荷できる。好ましい態様では、小胞を超抗原と接触
させる。

【０１７９】具体的な態様では、この機能アッセイにおいて、超抗原ＳＥＥを最初に限外濾
過、クッション密度遠心、および処方バッファーでのダイアフィルトレーション
により細胞培養上澄から調製したエキソソームと共にインキュベートする。単離
したエキソソームを新たに用いるか、またはＰＢＳ中−８０度で凍結保存するこ
ともできる。次いで例えばオプチプレップを用いて分析ゾーン遠心によりエキソ
ソームの複合体およびＳＥＥを非結合性ＳＥＥから分離する。オプチプレップ（
イオジキサノールとしても公知）は、遊離のＳＥＥからエキソソーム／ＳＥＥ複
合体を定量的に回収することが可能になるヨウ化密度グラジエント培地である。
したがってこの工程は生物学的アッセイにおいて各々の調製されたエキソソーム
ロットの定量分析に重要である。単離された複合体を用いて修飾細胞としてラジ
細胞の存在下Ｔ細胞の活性化を誘導する。Ｔ細胞活性化の読み出しはジャーカッ
ト細胞によるＩＬ−２分泌である。

【０１８０】一連の遠心工程を用いる先行技術の沈殿技術に優る本調製方法の利点は以下の
通りである：処理時間の長さ：沈殿による処理は限外濾過および超遠心に比較してより時間
がかかる。４Ｌの組織培養上澄は沈殿による処理に最低１２時間必要とし、一方
で限外濾過および単一の超遠心の組み合わせは現在実行されているように６〜７
時間かかる。

【０１８１】閉鎖系−ＧＭＰコンプライアンス：小容量で方法の遠心工程のみを実施し、現
在利用可能な密閉チューブを稼動できる（各々３３mlのローター６チューブの容
量）。これにより大容量（数リットル）での遠心工程を実施しなければならない
場合に遭遇している問題が排除される。現在かかる大容量の密閉遠心チューブは
存在しない。遠心は使い捨てでない開口チューブで行わなければならず、この制
御的な制約に従っていない。清澄化、限外濾過および滅菌濾過はバイオセーフテ
ィーキャビネットで全て実施され、本質的には閉鎖系であると考えられる。超遠
心は現在密閉チューブでも実施され、これにより開口チューブでの夾雑から生じ
得る問題が排除される。

【０１８２】培地の限外濾過：培地、例えばＡＩＭＶのタンパク質凝集物を除去するため
の再加工は、方法全体の精製スキームにおいて重要な工程である。同時精製タン
パク質の上流での除去により加工後にはさらに純粋なエキソソームになる。とり
わけ本発明により本質的に凝集物不含、すなわち凝集物が全タンパク質の２〜４
％未満である組成物を製造することが可能になる。さらに、ハプタグロビンの除
去により望ましくない免疫応答が低減される。

【０１８３】沈殿後のエキソソームの凝集の可能性：エキソソームの沈殿により局所的に非
常に高濃度になる。ペレットにおいて高濃度のエキソソームは凝集生成物に至る
可能性を有する。限外濾過を利用する方法に比較して沈殿後には、電子顕微鏡に
より凝集したエキソソームがいくらか示される。第２に電子顕微鏡により可視化
されるように、エキソソームの限外濾過により砕片が少なくなるようである。

【０１８４】処理温度：ダイアフィルトレーションのように処理を氷上、すなわち約４〜１
０℃の温度で実施できる。遊離のペプチドおよびＭＨＣＩを介してエキソソーム
に結合したペプチド間の平衡が温度により影響を受け、かかる温度がプロテアー
ゼのごとき加水分解性夾雑酵素の作用を防御できるので、これは有利である。

【０１８５】エキソソーム純度：エキソソームの沈殿は細胞砕片および培地夾雑物の夾雑の
危険性を冒す。夾雑タンパク質凝集物の除去はその高度な免疫原性のためにとり
わけ重要である。

【０１８６】エキソソーム回収：最終回収率は６０〜７５％であり、最初の沈殿方法（９実
験で平均１５％）よりも有意に大きい。これは、より少ない容量の血液で血漿交
換を行い、５倍少ない細胞を培養する必要があるかまたはそれが可能になる場合
、患者の処置に利用できる投与量が５倍増加し得ることを意味し、これはかなり
の方法の経費削減になる。

【０１８７】本発明のさらなる態様および利点は以下の実施例から明白であり、これは説明
のためであり、制限するためのものではないことに留意すべきである。

【０１８８】実施例１．培地の精製使用前に、培養培地（この実施例では、ライフテクノロジー・インコーポレー
ティッドの臨床グレードＡＩＭＶ、血清不含細胞培養培地）を限外濾過により
処理し、凝集タンパク質を除去したが、この除去は細胞成長に影響しないが次の
純粋なデキソソームの単離をかなり助ける。

【０１８９】５００kDaの中空ファイバー膜（Ａ／Ｇテクノロジー、ニードハム、マスまた
は関連製品を有する販売者による）を用いて培地の限外濾過を実施した。この膜
の大きさは保持液中にタンパク質凝集物を保持するが、凝集していないタンパク
質は透過液と共に通過できる。透過液を収集し、０．２２μmのフィルターを通
してボトルに滅菌濾過し、使用時まで４℃で保存する。

【０１９０】具体的な実験では、処理には５０ＬのＡＩＭＶ、ＵＦＰ−５００−Ｃ−３５
Ａ（管腔直径０．５mm、表面積１４．５平方フィート）中空ファイバーカートリ
ッジ（Ａ／Ｇテクノロジーによる）を使用する。供給流は流速１３Ｌ／分であり
、透過流は１Ｌ／分になり、入口および出口圧は各々１２から１６psiになる。
方法は１時間以内に完了する。透過液は０．２２μmのサルトポアまたはサルト
ブラン・フィルター（ザルトリウス・インコーポレーティッド）を通して滅菌濾
過される。図３および４は培地の減成凝集物含量を表す。ＥＬＩＳＡによるハプ
タグロビンの量は凝集物に関連するハプタグロビンの９９％以上が限外濾過によ
り除去されることを示している。さらに詳細には、ＵＦ培地は約５ng/ml未満の
ハプトグロビン凝集物を含有する。

【０１９１】とりわけ、ＢＣＡアッセイによりＡＩＭＶ培地の限外濾過により培地中の全
タンパク質の２〜４％が除去される。除去されたタンパク質の分画の大部分が凝
集物である。培地中のタンパク質濃度は限外濾過法では有意に変化せず、粒子の
濃度のみが変化する。限外濾過されたＡＩＭＶ（ＵＦＡＩＭＶ）のペレッ
ト化により限外濾過していないＡＩＭＶ培地で観察されるパターンとは実質的
に異なるいずれかのタンパク質パターンになる（図３参照）。さらに、処理後３
ヶ月の限外濾過されたＡＩＭＶのペレット化はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示され
るようなタンパク質凝集物の存在を示さず（図４参照）、処理された培地が長期
間保存され得ることを確認する。

【０１９２】アルブミン（例えば、ｈＳＡ）組成物の限外濾過により、ｈＳＡのmgあたり約
１０ng未満のハプタグロビン凝集物を含有する、すなわちハプタブロビン凝集物
が約０．００１重量％未満である、加熱されたｈＳＡ生成物を調製することも可
能になる。

【０１９３】２．未成熟樹状細胞生成および培養白血球フェレーシスの後の患者の末梢血から樹状細胞前駆体を収穫する。細胞
培養手順は血清不含であり、さらに限外濾過して実施例１に記載されるようなタ
ンパク質凝集物（または粒子体）を除去した臨床グレードの細胞培養培地で生じ
る。典型的な入ってくる白血球フェレーシスは約１〜２×Ｅ１０セルを含有する
。細胞を０．１％ヒト血清アルブミン（臨床グレード）を補充したＰＢＳで４
回洗浄して血小板を除去する。次いで血清不含限外濾過培地中２００×１０⁶セ
ル／フラスコの細胞密度でおよそ１００〜１５０cm²のＴフラスコに細胞をプレ
ートする。入ってくる白血球フェレーシスにおける白血球からの樹状細胞前駆体
の精製は単球の充填された、例えば標準的な市販の組織培養フラスコ中に存在す
るポリスチレン表面への付着特性に依存する。２時間のインキュベーションの後
、単球は付着性になり、保持されるが、残った非付着性細胞は各々５０ng/mlの
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４またはＩＬ−１３、およびガンマー・インターフェ
ロンを補充した培地を用いて培地交換して廃棄する。付着単球はＧＭ−ＣＳＦお
よびＩＬ−４またはＩＬ−１３の存在下で分化して未成熟樹状細胞になる。培養
の５日目にこれらの細胞をさらなるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１３またはＩＬ−
４で満たす。インターフェロン・ガンマーを５００U/mLで細胞に加えて未成熟状
態の樹状細胞を維持することができる。

【０１９４】３．モデル系における抗原担荷の手順樹状細胞への担荷抗原の技術的パラメーターを評価するために予備実験を行っ
た。この目的で、ペプチド担荷されたデキソソームを作製するための未成熟樹状
細胞をＣＭＶペプチドでパルス化した。次いでデキソソームを標準的な手順によ
り単離し、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞クローンによるＩＦＮ−γ放出を測定することに
よりその活性を評価した。ＣＭＶペプチドを担荷したデキソソームは抗ＣＭＶ
Ｔ細胞クローンを特異的に刺激し、樹状細胞の存在を必要とし、ＳＥＥ基盤の活
性アッセイを用いる本発明者らの知見に合致した（図２）。

【０１９５】このように、ＣＭＶモデル系を用いて５日目のＤＣ培養物にペプチドを添加す
ることによりペプチドをデキソソームに組み込むことができる。さらに、ペプチ
ド担荷されたデキソソームはＴ細胞に及ぼす刺激効果にＤＣを必要とするという
本発明者らの知見がＳＥＥバイオアッセイにおいてＴ細胞、ＤＣおよびデキソソ
ームの封入のための要件に合致し、それによりこれらの２つのアッセイにおける
デキソソームの挙動間で緊密な相関が強調される。

【０１９６】４．清澄化４Ｌの組織培養上澄を収穫し、３／０．８μm サルトクリーンＣＡ（表面積
５００cm²）（ザルトリウス・インコーポレーティッド）を通して２５０mL／分
で濾過する。フィルターの入口圧は１０psiを超過しない（図５）。

【０１９７】５．濃縮ＵＦＰ−５００−Ｃ−４Ａ中空ファイバーカートリッジ（表面積０．７平方フ
ィート、管腔直径０．５mm）（Ａ／Ｇテクノロジーより）で４Ｌの清澄化組織培
養培地を１００mLに濃縮した。供給流の流速は２２５〜２７５mL／分であり、入
口および出口圧は各々４〜７psiおよび３〜６psiであった。透過液の流速はこれ
らの条件下で４０〜６０mL／分であった。この方法は完了するのにおよそ６０〜
８０分必要であった（図６）。

【０１９８】６．ダイアフィルトレーション具体的な実施例では、エキソソーム濃縮物を５容量のＰＢＳに対してダイアフ
ィルトレートした（すなわち１００mLのデキソソーム濃縮物を５００mLのＰＢＳ
に対してダイアフィルトレートした）。ダイフィルトレーションの前および後の
濃縮されたデキソソームのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図７に示す。この工程および続く
全ての工程を冷却条件で実施した（約４〜１０℃の間）。

【０１９９】７．密度クッション分離（不連続グラジエント）具体的な実施例、およびエキソソームが（複数の）抗原でパルス化されている
実施例では、エキソソームを含有する、濃縮され、ダイアフィルトレートされた
培養培地を以下のように密度クッション上で（超）遠心により精製する：エキソ
ソーム濃縮物（およそ１００mL）を遠心チューブに均等にアリコート化し、スク
ロース／トリスＤ₂Ｏバッファー４mLを下層にする。Ｄ₂Ｏ密度クッションは２
５〜３０％スクロース／２０mm トリスＤ₂Ｏ（重量／重量％）（pH７．５〜
７．７）から成る。密度は１．１８から１．２１ｇ/mlの間である。チューブを
密閉して閉鎖系を確保する。

【０２００】図９ａは超遠心前後のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクッション上、クッ
ション中またはペレット中の含量を表す。示すように、大部分のタンパク質がス
クロース／トリスＤ₂Ｏ密度クッション中には沈殿しない。これはさらに図９ｂ
で確認され、エキソームの少なくとも９０％がクッション中で回収されることを
示している。

【０２０１】８．処方および順化精製されたエキソソームを、以前に濃縮および／またはダイアフィルトレーシ
ョンで用いられたのと同一の様式（実施例５および６参照）の５００kDa限外濾
過中空ファイバーカートリッジでのダイフィルトレーションによるバッファー交
換に供した。カートリッジをダイフィルトレーションの前に最低１５分間ｈＳＡ
（例えば１００μg/mL）で予備順化し、培地１０〜２０mLを処理するために寸法
で分類した。元来の容量の１／２８００でのデキソソームサンプルの典型的なＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを図１０に表す。

【０２０２】処方したエキソソーム０．２２μmシリンジフィルター（ミレックスＧＶ（２
５mmシリンジ））を通して滅菌濾過した。

【０２０３】ＰＢＳバッファー中で順化したエキソソーム調製物（元来の培地から２００倍
濃縮）中に存在するハプトグロビン凝集物の量をＥＬＩＳＡにより測定し、実質
的に約０．１ng/ml以下、より具体的には２つの試験した調製物に関して０．０
９１ng/mlまたは０．０４４ng/mlであることが決定された。比較として、先行の
確立された方法により得られた、同一の２００倍濃縮後のエキソソーム調製物中
の凝集へパトグロビンの含量がＥＬＩＳＡにより４００μg/mlであることを見出
した。これは精製されていないＡＩＭＶ培地（２μg/ml）に存在するハプトグロ
ビン凝集物の回収量に相当する。したがって、本発明の方法は先行技術の方法に
比較して、エキソソーム調製物中のハプトグロビン凝集物夾雑が５００〜１００
０万倍減少することになる（４００μg/ml対４０〜９０pg/mL）。培地の限外濾
過によりハプトグロビン凝集物の含量をおよそ５００の係数で低減するので、さ
らなる限外濾過、ダイアフィルトレーションおよび／または密度クッション工程
もまた精製能力の増大に非常に著明に貢献する。これらの結果によりハプトグロ
ビン凝集物除去における本発明の方法の効率がさらに説明される。

【０２０４】９．エキソソーム投与具体的な態様では、サンプル、組成物、液体等の中のエキソソームの定量を行
うためのＥＬＩＳＡ基盤の分析を開発した。図１１はデキソソーム中のＨＬＡ−
ＤＲ（すなわちＭＨＣ II）（１１ｂ）およびＣＤ８１（１１ａ）の測定を説明
する。ＨＬＡ／ＤＲアッセイはデキソソームの活性に対して感受性があり、しか
も機能的である。このアッセイをデキソソーム調製物に関する定量アッセイとし
て選択した。このアッセイの詳細を以下に記載する。

【０２０５】ＥＬＩＳＡにより測定されたＨＬＡ／ＤＲシグナルを用いてデキソソーム調製
物から得られたＭＨＣ II分子数を決定する。多くの細胞型に随伴するＭＨＣ
II数は以前に報告されている（Cellaら(1997)）。これらの値を表２にまとめる
。

【０２０６】

【表２】

【０２０７】ＨＬＡ／ＤＲ分子の量を定量するために、ＤＣライゼートまたはラジ細胞ライ
ゼートを標準として使用する。図１１は未成熟ＤＣライゼートの一定の濃度での
抗ＨＬＡ／ＤＲの力価を示す。このプロットから未成熟樹状細胞に対するＨＬＡ
／ＤＲ分子数を算出し、５．８×１０⁶分子／細胞であり、これは表１に提示し
た文献値に合致する。ラジ細胞ライゼートで理想値が得られた（データは示して
いない）。

【０２０８】デキソソーム調製物から得られたＨＬＡ／ＤＲアッセイ結果の一例を図１２（
Ａ、Ｂ）に示す。ＨＬＡ／ＤＲシグナルを等価の上澄容量の関数としてプロット
する。デキソソームμlあたりのＨＬＡ／ＤＲ分子数を密度クッション（すなわ
ちＵＣクッション）上の超遠心し、処方バッファーにダイアフィルトレートした
後に決定し、４．７×１０¹⁰であった。そのサンプルの回収％は７３％ＨＬＡ
／ＤＲであった。より詳細には回収％は以下のとおりであった：処理工程全体の回収％０．８μを通して清澄化１００％第１の限外濾過−濃縮１００％第１の限外濾過−ダイアフィルトレーション８６＋／−２％クッション−第２の限外濾過−ダイアフィルトレーション８５＋／−２％０．２μm滅菌濾過７５＋／−３％

【０２０９】まとめると、ＨＬＡ／ＤＲ測定に関するＥＬＩＳＡアッセイにより最終生成物
中のデキソソームを定量する。このアッセイは樹状細胞のＨＬＡ／ＤＲをも測定
し得るので、このアッセイは樹状細胞あたり、および単離されたデキソソームの
容量あたりの関連するＨＬＡ／ＤＲ投与に関する手段を提供する。この点で、一
般に精製後の未成熟ＤＣあたり最低１００，０００ＨＬＡ／ＤＲ分子を作製する
ことができる（１０〜１２実験）。

【０２１０】捕捉用に抗クラスＩ抗体、主にＨＣ−１０細胞により生成された抗体を用いて
類似のアッセイを実施した。結果を図１２（Ｃ、Ｄ）に提示する。タイトレーシ
ョン曲線（１２Ｃ）から、いずれかの未知のエキソソーム調製物からＭＨＣ−Ｉ
分子の量を決定できる（１２Ｄ）。

【０２１１】１０．エキソソームの表現型抗ＨＬＡ−ＤＲコーティングした磁気ビーズ５〜１０μlをミクロチューブ中
ＰＢＳ５００μlで磁気ラックを用いて洗浄する。上澄を捨て、濃縮エキソソ
ーム調製物２５、５０または１００μlを洗浄したビーズに加える（エキソソー
ム濃縮は１０００倍までできる）。混合物を４℃で約２時間、回転プレート上で
インキュベートする。インキュベーションの後ＰＢＳ５００μlをエキソソー
ム連結ビーズに加え、磁気ラックを用いてビーズを洗浄する。上澄を除去し、エ
キソソーム連結ビーズを染色バッファー２００μlに懸濁する。２０μlのエキソ
ソーム連結ビーズ溶液を試験チューブ中アリコートに分け、次いで各々を分析用
に選択した標識抗体の１つと別個に接触させる。抗体を４℃で約３０分間インキ
ュベートする。次いでチューブに染色バッファーを添加し、１２００rpmで５分
間遠心する。上澄を捨て、固定溶液（０．５ml）を各チューブに加える。次いで
各アッセイチューブを獲得し、ＦＡＣＳカリブール（商標）装置を用いるフロー
サイトメトリーにより分析する。

【０２１２】いくつかのデキソソーム調製物に関して得られた結果を図１３に提示する。こ
れらの結果はエキソソーム調製物を免疫表現型分類するための請求した方法の有
効性および迅速性を明白に示している。

【０２１３】１１．機能的アッセイ単離されたデキソソームおよそ２０μlが各試験に必要である。デキソソーム
を１００ng/ml（０．１％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中１μg/ml ＳＥＥの貯蔵物１
０μl）でＳＥＥと共に、最終容量１００μlで、３７℃で１時間インキュベート
する。１時間のインキュベーションの後、デキソソームおよびＳＥＥの複合体（
デキソソーム／ＳＥＥ）をオプチプレップ溶液からなる２工程不連続グラジエン
ト上でのゾーン超遠心（２．２mL）により非結合性ＳＥＥから分離する（図１４
〜１６参照）。

【０２１４】最初に１０％オプチプレップ（オプチプレップ１．６７mlプラスＲＰＭＩ
８．３３ml）１．７mlを各試験チューブに加えてオプチプレップグラジエントを
作る。次に２０％オプチプレップ（オプチプレップ３．３３mlプラスＲＰＭＩ
６．６７ml）１００μlを各チューブの底部に加え、続いて２０％オプチプ
レップの下に４０％オプチプレップ（オプチプレップ６．６７mlプラスＲＰＭ
Ｉ３．３３ml）１００μlを加える。次いでＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ最終容
量２００μlでグラジントの上部にエキソソーム／ＳＥＥサンプルを積層する。
スインギング・バケット・ローター（ＴＬＳ−５５）でゆっくりと加速および減
速して１００，０００rpmで、４度で４０分間チューブを遠心する。チューブの
底部から非結合ＳＥＥを除去したエキソソーム／ＳＥＥの複合体を含有するサン
プル２００μlを収集する。遊離のＳＥＥは帯状層（１０％オプチプレップ）
に残るが、エキソソーム／ＳＥＥ複合体はチューブの２０〜４０％の領域に沈
殿する。オプチプレップはＥＬＩＳＡ決定に干渉することが見出されたので、か
かる決定が必要とされる場合、Ｄ２Ｏスクロースグラジエントの使用が好ましい
。

【０２１５】ラジ細胞、デキソソーム／ＳＥＥ（または擬似物質／ＳＥＥ）、およびジャー
カット細胞をプレートの各ウェルに加える（各々の種類の細胞１００μl（３０
，０００セル）を各ウェルで使用する）。陽性および陰性対照もまた加える：ジ
ャーカット細胞単独（陰性対照）、ジャーカットプラス１ng／ウェルＳＥＥ（
陰性対照）、ラジ単独（陰性対照）、ラジおよびジャーカットプラスＳＥＥでパ
ルス化していないデキソソーム（バックグラウンド対照）、ラジおよびジャーカ
ットプラス１ng／ウェルＳＥＥ（陽性対照）。プレートを５％ＣＯ２と共に
３７℃で１８時間インキュベートする。１２００rpm（プレートキャリヤ使用）
で１５分間遠心することによりプレートの各ウェルから細胞培養上澄を収集する
。上澄２００μlをＥＬＩＳＡアッセイに用いてＩＬ−２分泌を測定する。ＥＬ
ＩＳＡアッセイを即座にまたは後に（この場合、プレートをパラフィルムで包み
、使用時まで凍結できる）実施できる。

【０２１６】コスターＥＬＩＳＡプレート（コスター２５８１）でＩＬ２ＥＬＩＳＡキッ
ト（デュオセットＤＹ２０２、ＲアンドＤシステムズ）を用いて、製造者の指示
書に従ってＩＬ２ＥＬＩＳＡアッセイを実施する。結果はＩＬ２分泌およびウ
ェルあたりのエキソソーム量間の用量依存的関係を示し、これをエキソソームス
トックの容量に等価の容量に変換した。エキソソームは非抗原特異的Ｔ細胞（例
えばジャーカット）を刺激するのにＳＥＥが必要であるので、ＩＬ２分泌はＳＥ
Ｅ依存的である。最大値の半分の単位を方法のデキソソーム力価の半定量的測定
として導入する。用いた実験条件下で、ジャーカット細胞によるＩＬ２分泌が最
大値の半分に到達するエキソソームの容量として定義する。測定した小さい方の
最大値の半分の単位は高力価の指標である。

【０２１７】１２．直接ペプチド担荷この実施例は直接担荷の方法、担荷に影響するパラメーター、参照ペプチドお
よび標的ペプチド間のデキソソームに対する結合の競合、並びに抗原を担荷した
デキソソームの生物学的活性について記載する。ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド直接
担荷に基づくプロトコルを作製する。同一のプロトコルをＨＬＡ−Ａ１制限ペプ
チドに適用できる。腫瘍治療臨床試験におけるデキソソームの直接ペプチド担荷
の有意性および利点をも論じる。

【０２１８】この実施例は抗原性分子をデキソソームに直接担荷することができ、かかる直
接担荷デキソソームはＣＴＬクローンを刺激できることを示す。結果により直接
担荷はより少ない量のペプチドを必要とするので、間接的ＤＣ担荷よりも効率的
であることが示される。

【０２１９】１２．１．方法 β２−ｍの存在下および不在下でのエキソソームに対するペプチドの直接担荷
ＨＬＡ−Ａ２制限参照ペプチドＦＬＰＳＤＣＦＰＳＶはＢ型肝炎コア抗原の天
然エピトープに由来し、システインを介してビオチン化されている。これは未標
識参照ペプチドと競合し、これはビオチン化ペプチドがＨＬＡ−Ａ２分子に対す
る結合能力を維持していることを示唆している。外因性のβ２−ｍの存在下の直
接ペプチド担荷に関しては、１００μlの精製されたＨＬＡ−Ａ２⁺およびＨＬＡ
−Ａ２^-陰性デキソソームを等容量のクエン酸または酢酸塩バッファー（pH３．
２〜５．２）で４℃で９０秒間処理し、pHを低下させて結合性内因性ペプチドの
溶出を行いやすくする。処理の後、調製物を即座にトリス、外因性のペプチド（
最終濃度０．０１から１０μg/ml）およびβ２−ｍ（最終濃度０〜８０μg/ml）
を含有するpH１１のカクテルで中和し、室温でインキュベートしてデキソソーム
表面でのクラスＩ、β２−ｍおよびペプチドの３分子複合体の形成が可能になる
。外因性β２−ｍの不在下での直接担荷に関しては、デキソソームを最初に外因
性のペプチド（最終濃度１０または１００μg/ml）と混合し、次いで等容量の酢
酸塩バッファー（pH４．２〜５．２）と混合し、室温で３０分間インキュベート
する。この期間中にペプチド交換を生じ、過剰に存在する外因性ペプチドの結合
に至る。外因性ペプチドはビオチン化ペプチド単独または標識されたペプチドと
漸増量の標的ペプチドとの混合物でよい。以下に記載するようにシグナル供給源
が抗ＨＬＡクラスＩ抗体により捕捉されたクラスＩ／ペプチド複合体に由来する
ので、非結合性ペプチドおよびβ２−ｍの除去は必要でない。

【０２２０】ＴＲＦと共にデキソソームに結合した参照ペプチドの測定ペプチド担荷デキソソームを氷上で３０分間、１％ＮＰ４０で溶解する。ラ
イゼート中に標識された参照ペプチドを含有するクラスＩ分子の複合体を、ＥＬ
ＩＳＡプレート上にコーティングしたウサギ抗マウスＩｇＧを介して抗クラスＩ
抗体により捕捉する。インキュベーションおよび洗浄の後、エウロピウム標識さ
れたストレプトアビジンを加え、増強バッファーによりエウロピウムからの蛍光
シグナルを生じ、製造者の指示書（ワラック）に従ってビクター２蛍光リーダー
で読み出しする。蛍光シグナルレベルを定量用エウロピウム標準と比較すること
により、ビオチン化参照ペプチドの絶対量をエウロピウム標識ストレプトアビジ
ンの特異的活性に基づいて推測できる。

【０２２１】参照ペプチドのデキソソームに対する結合の標的ペプチドとの競合 β２−ｍの存在下での競合１００倍まで過剰のＭＡＧＥ３Ａ１、ＭＡＧＥ−３、４および１０ペプチド
を２０μg/ml β２−ｍを含有する担荷バッファー中でビオチン化参照ペプチド
５μg/mlと混合し、酸処理したデキソソームに担荷した。参照ペプチドのシグナ
ルをＴＲＦにより検出し、ＭＡＧＥ３、４および１０によるシグナルの低減を算
出する。

【０２２２】 β２−ｍの不在下での競合５〜２０倍過剰のビオチン参照ペプチドにおける未標識ペプチドを酢酸塩バッ
ファー（pH４．８または５．２）中で調製した。このペプチドを等容量のデキソ
ソームに加え、室温で１時間インキュベートした。参照ペプチドのシグナルをＴ
ＲＦにより検出し、ＭＡＧＥ−３、４および１０、またはＭＡＧＥ−３Ａ１によ
るシグナルの低減を算出する。

【０２２３】ＳＥＥアッセイ β２−ｍの存在下および不在下でペプチド直接担荷されたデキソソーム１００
μlを１００ng/ml ＳＥＥと共に３７℃で１時間インキュベートする。非結合性
ＳＥＥをゾーン密度グラジエント遠心により除去した後、デキソソームおよびＳ
ＥＥの複合体をラジ細胞およびジャーカット細胞と共に１８時間インキュベート
する。培養上澄を収集し、ジャーカット細胞からのＩＦＮ−γ分泌を測定する。

【０２２４】Ｍａｒｔ−１特異的ＣＴＬクローン刺激アッセイ前記するようにＭＡＲＴ−１ペプチドで直接担荷したデキソソームを担荷後、
ペプチド不含で洗浄し、ＤＣおよびＴ細胞クローンＬＴ１１細胞と共に２４時
間インキュベートする。以下のＴ細胞クローンアッセイに従ってＥＬＩＳＡでＩ
Ｌ−２分泌により生物学的活性を測定する。

【０２２５】用いたペプチドは配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶを有する、ＨＬＡ−Ａ２制限ＭＡ
ＲＴ−１ペプチドである。

【０２２６】非結合性Ｍａｒｔ−１ペプチドを密度グラジエント遠心により除去する。非結
合性ペプチドのデキソソームからの除去は強制的ではないが、非特異的結合を低
減させることを理解するべきである。

【０２２７】Ｔセルクローンアッセイ樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）に由来する２０×１０³ＨＬＡＡ２陽性または陰性
単球をＵ底９６ウェルプレート中デキソソーム調製物１５μl（１×１０¹⁰クラ
スii）と共に３７℃で２時間インキュベートし、次いでＴ細胞クローンＬＴ１１
２０×１０³セルをヒトＢＭ−ＤＣ細胞に添加した。ウェルあたり最終容量は
２００μlであった。２４時間後、上澄を収穫し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２の
存在に関して分析した。マートのペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）１０μmで
直接パルス化したＨＬＡＡ２⁺ＢＭ−ＤＣ細胞を陽性対照として用いた。

【０２２８】ＰＩＡペプチド担荷デキソソームネズミＨ２^ｂおよびＨ２^ｄデキソソームにＯＶＡペプチド２５７〜２６９（Ｓ
ＩＩＮＦＥＫＬ）を以下のように直接担荷した：酢酸Ｎａバッファー（０．２Ｍ
、pH５）１容量をエキソソーム１容量に加え、４℃で９０秒間インキュベートし
、次いでＯＶＡペプチド１０μmおよび４０μg/ml ヒトｂ２マイクログロブリ
ンを含有するトリス２Ｍ溶液（pH１１）を添加することにより中和した。室温で
４時間インキュベートした後、オプチプレップグラジエントによりＯＶＡデキソ
ソーム複合体を非結合性ＯＶＡペプチドから分離した。

【０２２９】Ｔ細胞クローンアッセイ２５×１０³Ｄ１細胞をＵ底９６ウェルプレート中Ｄ１細胞をデキソソーム調
製物２５μlまたは５０μlと共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＴ
細胞ハイブリドーマ（Ｂ３Ｚ）２５１０³セルをＤ１細胞に加えた。最終容量
はウェルあたり２００μlであった。２４時間後、上澄を収穫し、ＥＬＩＳＡに
よりＩＬ−２の存在に関して分析した。ＯＶＡペプチド１０μmで直接パルス化
されたＤ１細胞を陽性対照として使用した。

【０２３０】１２．２．結果 β２−ｍの存在下ＨＬＡ−Ａ２⁺デキソソームの直接担荷前記したようにＨＬＡ−Ａ２⁺デキソソーム上のＨＬＡ−Ａ２制限参照ペプチ
ドＨ−ＦＬＰＳＤＣ（ビオチン）ＦＰＳＶ−ＯＨで最初に直接ペプチド担荷を実
施した。ＨＬＡ−Ａ２^-デキソソームをＨＬＡ特異的対照として使用した。図１
７はデキソソーム溶解の後、抗クラスＩ抗体によりプレート上に捕捉されたビオ
チン標識参照プペプチドで担荷されたＨＬＡ−Ａ２分子を示す。参照ペプチドの
デキソソームに対する結合は、これはＨＬＡ−Ａ２^-デキソソームには結合しな
いので、ＨＬＡ−Ａ２に特異的である。結合はペプチドおよびデキソソーム量の
双方に依存する。

【０２３１】直接ペプチド担荷に関するパラメーターを、記載されたＴＲＦアッセイを用い
て評価した。バッファーの選択はペプチド担荷効率およびＳＥＥアッセイにより
測定されるデキソソームの完全性に及ぼす効果により影響された。参照ペプチド
の担荷の条件を最適化するために担荷バッファーのpH範囲を試験した。本発明者
らはクエン酸リン酸塩バファーまたは酢酸ナトリウムバッファーのいずれかと類
似の担荷条件を用いてペプチド結合に匹敵するシグナルが得られることを見出し
た（図１８）。穏やかな酸処理がデキソソームに発現される分子のコンフォメー
ションを変化させ、その機能を損なうかどうかを試験するために、本発明者らは
修飾細胞としてラジ細胞の存在下、デキソソームのＨＬＡ−ＤＲ分子に結合した
超抗原ＳＥＥがジャーカット細胞からのＩＬ−２の分泌を誘導する超抗原アッセ
イを実施した。図１９はpH４．２で酢酸ナトリウムで処理されたデキソソーム調
製物が、ＳＥＥアッセイにおける未処理対照と同一量のＩＬ−２分泌を誘導する
ことを示している。同一のpH４．２でクエン酸／リン酸塩バッファーで処置され
たデキソソームもまたＩＬ−２を誘導するが、その程度はかなり低かった。この
点で、クエン酸塩バッファーはエキソソームを不活性化することができ、それで
クエン酸塩バッファーを用いて全対細胞を担荷するのに用いられた条件はエキソ
ソームの担荷には効率的ではない。したがってさらなる実験には酢酸ナトリウム
バファーが選択された。次に本発明者らはデキソソームＨＬＡ−Ａ２へのペプチ
ドの結合が外因性β２−ｍの存在により増強されるかどうかを試験した。図２０
は１０μg/ml ＨＬＡ−Ａ２制限ビオチン参照ペプチドで、２０μg/ml β２−
ｍの添加が参照ペプチド結合の量を著明に増加させることを示している。

【０２３２】ＨＬＡＡ２分子に対する結合を飽和させるのに必要なペプチド量を決定する
ために、本発明者らは担荷中に０〜２０μg/mlのペプチドを添加するペプチドタ
イトレーションを実施した。図２１は１．２５μg/ml以上の参照ペプチドを用い
る場合、担荷が飽和されることを示している。室温でインキュベーション時間を
変化させることにより３つの異なるデキソソーム調製物を用いてペプチド担荷の
動態を評価した。図２２は試験した３つ全てのデキソソームの中で３０分から４
時間のインキュベーションの間、ペプチド結合が比較的一定であることを示して
おり、これは大部分の結合が３０分以内に生じていることを示している。本発明
者らの実験から、本発明者らはpH４．２の酢酸ナトリウムバッファー、１０μg/
ml クラスＩペプチド、２０μg/ml β２−ｍで、室温で担荷時間３０分の穏や
かな酸溶出を用いる担荷により、デキソソームへのクラスＩペプチド担荷の最適
条件が提供されることを結論づける。

【０２３３】未標識標的ペプチドを同様にデキソソームに担荷できる証拠を提供するために
、本発明者らはペプチド競合アッセイを設計した。未標識標的ペプチドＭＡＧＥ
−３、４、または１０を１〜１００の比率で５μg/ml 標識参照ペプチドと共に
混合した。参照ペプチドからの蛍光シグナルの低減は未標識標的ペプチドのデキ
ソソームへの競合結合を示している。図２３に示すように、３つのＭＡＧＥ由来
ペプチド全ては、参照ペプチドがデキソソームから結合が切れるのと競合した。
ＭＡＧＥ３および１０はＭＡＧＥ−４よりも良好に競合したが、これは恐らく担
荷条件下でＭＡＧＥ−４よりもＨＬＡ−Ａ２分子に対する結合親和性が高いこと
を示している。

【０２３４】デキソソームの生物学的活性を試験するためにＭＡＲＴ−１ペプチド特異的Ｔ
細胞クローン、ＬＴ１１、を用いる機能的アッセイを確立し、このアッセイはイ
ンビトロで抗原特異的Ｔ細胞応答性を測定する。クラスＩペプチドでのデキソソ
ームの直接担荷のためのプロトコルに従って、ＭＡＲＴ−１、ＨＬＡ−Ａ２制限
ペプチドをペプチド濃度０．０１から１０μg/mlでＨＬＡ−Ａ２⁺またはＨＬＡ
−Ａ２^-デキソソームに担荷した。担荷したデキソソームを続いて密度グラジエ
ント遠心により洗浄し、非結合性ペプチドを除去した。結果を図２４に提示し、
これは１０μM マートでパルス化されたＨＬＡＡ２⁺ＢＭ−ＤＣ細胞がマート
ペプチドでＨＬＡＡ２を認識したＬＴ１１クローンを活性化できることを示し
ている。ＨＬＡＡ２^-ＢＭ-ＤＣ細胞はＬＴ１１クローンを刺激できない。ＨＬ
ＡＡ２⁺デキソソームに直接担荷されたマート１５μlでパルス化されたＢＭ−
ＤＣ細胞はいずれの樹状細胞のハプロタイプでもＬＴ１１クローンを活性化でき
た。

【０２３５】以前に、デキソソームを調製するために１０μg/ml マート−１ペプチドをＤ
Ｃ培養物に添加した場合でさえ、間接的ペプチド担荷デキソソームでは下限レベ
ルのＩＬ−２分泌しか誘導しなかった。マート−１ペプチドで直接担荷されたデ
キソソームはＬＴ１１クローンに一貫して、および再現性のある刺激を与え、こ
れは直接ペプチド担荷が生物学的に活性なデキソソームを生成するのにより効率
のよい方法であることを示唆している。

【０２３６】同一のプロトコルをＨＬＡ−Ａ１制限ペプチドの直接担荷に適用した。この実
験では、天然のＨＬＡ−Ａ１制限された、ＭＡＧＥ３−Ａ１ペプチドＥＶＤＰＩ
ＧＨＬＹに由来する、ビオチン化参照ペプチドＥＶＤＰＣ（ビオチン）ＧＨＬＹ
はＡ１⁺／Ａ２−デキソソーム（Ｅｘｏ４３３）に結合するが、Ａ１^-／Ａ２⁺デ
キソソーム（Ｅｘｏ４２７）には結合しない。逆に、Ｂ型肝炎コア抗原に由来す
るＨＬＡ−Ａ２制限、ビオチン化参照ペプチドはＡ１^-／Ａ２⁺には結合するが、
Ａ１⁺／Ａ２−デキソソームには結合せず、これはクラスＩ抗原ペプチドの厳密
なＨＬＡアレル依存性担荷を示している。図１０の下のパネルは、Ａ１⁺デキソ
ソーム（Ｅｘｏ４３３）への結合に関して未標識ＭＡＧＥ３−Ａ１ペプチドがビ
オチン化ＭＡＧＥ−３Ａ１ペプチドと競合することを示している。

【０２３７】直接担荷研究法をＰＩＡペプチドおよびネズミデキソソームにも適用した。結
果を図２５に提示する。ＯＶＡ直接担荷Ｈ２^ｂデキソソーム２５μlまたは５０
μlでパルス化したＤ１細胞はＯＶＡペプチドでＫ^ｂを認識するＢ３Ｚ細胞を活
性化できる。Ｄ１細胞をＯＶＡ直接担荷Ｈ２^ｂデキソソームでパルス化した場合
、活性化の程度は低いことも観察された。ＨＬＡ−Ａ１制限ペプチドを用いて同様の結果が得られる。

【０２３８】 β２−ｍ不在下でのＨＬＡ−Ａ２⁺デキソソームの直接担荷図２０で示すように、pH４．２で酸溶出した後、外因性β２−ｍを添加せずに
中性のpHで外因性ペプチドをデキソソームに担荷できる。結合シグナルは２０μ
g/ml β２−ｍの存在下の４分の１から３分の１であるので、本発明者らは外因
性β２−ｍの不在下で担荷効率を上昇させるために実験条件を最適化した。２つ
のペプチド濃度、１０および１００μg/ml ビオチン化参照ペプチドおよびpH４
．２、４．５、４．８および５．２の酢酸ナトリウムバッファーを試験した。図
２６は参照ペプチドの担荷がpH４．８の酢酸塩バッファーを用いて１００μg/ml
のときに大きく増強されることを示している。

【０２３９】デキソソームが酸処理の後９０秒後に速やかに中和される、β２−ｍの存在下
でのデキソソーム担荷とは異なり、β２−ｍ不在下でのデキソソーム担荷は、長
時間、典型的には最低３０分間室温でpH４．８または５．２を持続する必要があ
る。図２７はpH４．８または５．２で未処理または処理したＳＥＥ担荷デキソソ
ームにより誘導されるジャーカット細胞のＩＬ−２分泌には差異はなく、これは
処理がエキソソームを損傷しなかったことを示している。

【０２４０】標的ペプチド、ＭＡＧＥ−３、４、および１０をβ２−ｍの不在下で担荷でき
ることを示すために、一連の競合実験を実施した。図２８では、５〜２０倍のＭ
ＡＧＥ−４およびＭＡＧＥ−１０ペプチドがpH４．８で参照ペプチドと競合した
。２０倍過剰のＭＡＧＥ−４またはＭＡＧＥ−１０による阻止は各々３５％また
は６６％であり、pH４．２でβ２−ｍの存在下での阻止レベルに類似しており（
図２３参照）、これは２つのペプチドを双方の方法により担荷できることを示し
ている。図２９はpH５．２でのＭａｇｅ−３による阻止を示す。ＭＡＧＥ−３に
よる競合はpH４．８で非常に弱くなるので、ＭＡＧＥ−３の担荷はpH４．８より
もpH５．２でより有効であるようである（データは示していない）。

【０２４１】前記の結果に基づいて、β２−ｍの不在下でマート−１ペプチドをＨＬＡ−Ａ
２⁺に担荷し、ＬＴ１１アッセイで試験した。図３０はβ２−ｍの不在下でマー
ト−１ペプチドを担荷したデキソソームの生物学的活性を示す。この実験では、
β２−ｍの不在下でpH４．８および５．２の双方で、マート−１ペプチドを１０
および１００μg/mlでＨＬＡ−Ａ２⁺（Ｅｘｏ４４７）およびＨＬＡ−Ａ２^-（Ｅ
ｘｏ４５０）デキソソームに担荷した。対照的にまたβ２−ｍの存在下１０μg/
ml マート−１でＥｘｏ４４７を担荷した。３つの異なる条件で担荷されたデキ
ソソーム（β２−ｍなしでpH４．８、β２−ｍなしでpH５．２、β２−ｍありで
pH４．２）は全て類似の生物学的活性を有し、これはβ２−ｍが生物学的に活性
なデキソソームを作製するのに絶対的に必要というわけではないことを示してい
る。

【０２４２】 β２−ｍの存在下および不在下でのＨＬＡ−Ａ１⁺／Ｂ３５⁺の直接担荷同一のプロトコルをＨＬＡ−Ａ１またはＢ３５制限ペプチドの直接担荷に適用
できる。ＭＡＧＥ−３タンパク質由来の九量体ＭＡＧＥ−３Ａ１（ＥＶＤＰＩＧ
ＨＬＹ）はＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ｂ３５により提示される。このペプチド
をＨＬＡ−Ａ１⁺デキソソーム上に担荷できるかどうかを試験するために、本発
明者らはＭＡＧＥ−３Ａ１ペプチドのイソロイシンがシステインにより置換され
、ビオチンで標識されている、ＭＡＧＥ−３Ａ１Ｃ５と称する参照ペプチドを設
計した。図３１の上部パネルで示される実験では、β２−ｍの存在下、ビオチン
化ＭＡＧＥ−３Ａ１Ｃ５をＨＬＡ−Ａ１⁺／Ａ２^-デキソソーム（Ｅｘｏ４３３）
に担荷した。本発明者らは同一のペプチドをＨＬＡ−Ａ１^-／Ａ２⁺デキソソーム
（Ｅｘｏ４２７）には担荷できないことを見出した。逆に、Ｂ型肝炎コア抗原に
由来するＨＬＡ−Ａ２制限、ビオチン化参照ペプチドをＡ１^-／Ａ２⁺デキソソー
ムに担荷できるが、Ａ１⁺／Ａ２^-デキソソームに担荷できず、これはクラスＩ抗
原ペプチドの厳密なＨＬＡアレル依存性担荷を表している。図３１の下部パネル
は天然のＭＡＧＥ３−Ａ１ペプチドはＡ１⁺デキソソーム（Ｅｘｏ４３３）上の
結合に関してビオチン化ＭＡＧＥ−３Ａ１Ｃ５ペプチドと競合することを示し、
これは未標識ＭＡＧＥ３−Ａ１ペプチドのＡ１⁺デキソソームに対する結合能力
を示す。

【０２４３】ＨＬＡ−Ａ１⁺デキソソームの供給源が限定されているために、本発明者らは
ＨＬＡ−Ｂ３５⁺デキソソーム（Ｅｘｏ４２６）を用いてＭＡＧＥ３−Ａ１の結
合およびβ２−ｍ不在化での阻止を試験した。ＨＬＡ−Ａ２⁺デキソソームに関
して同一の担荷条件を用いて、図３２の上部パネルではＭＡＧＥ−３Ａ１Ｃ５が
pH４．８またはpH５．２のいずれかでＨＬＡ−Ｂ３５⁺デキソソームに結合でき
、pH５．２でＨＬＡ−Ａ１^-Ｂ３５^-デキソソーム（Ｅｘｏ４２４）に対する非特
異的結合は少ない。図３２の下部パネルはβ２−ｍ不在下、pH４．８および５．
２での天然のＭＡＧＥ−３Ａ１ペプチドによるＭＡＧＥ−３Ａ１Ｃ５の阻止を示
す。天然ＭＡＧＥ−３Ａ１による結合阻止はpH４．８でより強力であり、これは
このpHでの未標識ＭＡＧＥ−３Ａ１ペプチドのＨＬＡ−Ｂ３５⁺デキソソームに
対する結合能力がより良好であることを示唆している。これらの結果は別のＨＬ
ＡクラスＩアレルへの直接ペプチド担荷の広範な適用を示している。

【０２４４】したがってこの実施例は、直接担荷として公知の方法により免疫原性化合物（
例えばクラスＩ制限腫瘍由来ペプチド）を担荷した生物学的に活性なデキソソー
ムを生成するための高度に効率的な方法について記載する。生化学的および機能
的データにより示されるように、内因性ペプチドを除去したデキソソームクラス
Ｉ分子および穏やかな酸処理したβ２−ｍは標的ペプチドで効率的に担荷され得
る。デキソソームに結合した参照ペプチドの蛍光シグナルをエウロピウム標準と
比較してデキソソームに結合するペプチド量を定量できる。表３はβ２−ｍの不
在下でのデキソソームに結合した参照ペプチドの絶対量を示す。用いる供与体お
よび担荷条件に依存して、クラスII分子１０¹⁴あたりの参照ペプチドは０．１〜
１．２ngの間である。この数は製造されたデキソソーム調製物の数に著しく近く
（クラスII分子１０¹⁴あたり１ng）、ここでpH４．８での１０μg/mlペプチドで
のペプチド担荷をさらに大きいスケールで実施した。β２−ｍ不在下では結合は
少ないが（図２３）、本発明者らのＬＴ１１アッセイデータ（図３０）は異なる
条件で担荷されたデキソソーム間で類似の生物学的活性を示し、これはβ２−ｍ
不在下での直接担荷が生物学的機能に十分であることを示している。

【０２４５】ＴＲＦおよびElisaによるデキソソーム上のクラスＩ分子レベルの定量により
クラスＩ分子上のペプチドの占有率を決定できる。デキソソームのＨＬＡ−Ａ２
分子上の参照ペプチドの占有率は１５％、より好ましくは４０％までに至ること
を本発明者らは推測している。高度なペプチド占有率は、インビトロＴ細胞アッ
セイにより測定されるＴ細胞刺激活性を大いに改善する。さらに、デキソソーム
のクラスＩ分子上のペプチド担荷の定量およびペプチド占有率の決定は、治療候
補に基づくデキソソームの投与、動物実験を設計するための重要な態様および将
来の臨床試験の評価を助ける。

【０２４６】またβ２−ｍの不在下で直接担荷を実施できる。高濃度ペプチドおよび穏やか
な酸バッファーを用いてＨＬＡ分子上のペプチド交換を観察した。競合実験によ
りこの方法で本発明者らの標的ペプチドＭＡＧＥ−３、４、および１０をＨＬＡ
−Ａ２⁺デキソソームに特異的に担荷できることが示された。β２−ｍ不在下で
のマート−１ペプチド担荷デキソソームはＬＴ１１によるＩＦＮ−γ分泌を刺激
し、これはデキソソームの生物学的活性を示す。したがってβ２−ｍなしでの生
物学的に活性なデキソソームの製造が可能であり、したがってヒト供与体から精
製されたβ２−ｍまたは非ＧＭＰグレード組換えβ２−ｍを用いる現在の困難を
排除できる。全体的な担荷はβ２−ｍの不在下では低いが、ＬＴ１１活性化に影
響しないようであり、これはバイオアッセイが生化学的アッセイよりもさらに感
受性が高いことを示唆している。

【０２４７】本発明者らは直接ペプチド担荷を種々のＨＬＡクラスＩアレル様ＨＬＡ−Ａ２
、Ａ１、およびＢ３５に広範に適用できることを示した。以前は、デキソソーム
のペプチド担荷は間接的研究法に依存し、細胞培養の多くの操作を必要とし、し
たがって夾雑の機会が増す。直接ペプチド担荷はβ２−ｍの必要性および各々の
培養フラスコへのペプチドの添加の困難な作業を排除することによりデキソソー
ム製造においてより安全である。

【０２４８】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】自己デキソソーム単離および精製のための特定の方法の全体像を示す図である
。

【図２】ＤＣをＣＭＶｐｐ６５ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドの存在下で５日目に培養した
。デキソソームは、７日目に採集し、精製した。次いで、精製ＣＭＶペプチドで
パルス標識したデキソソームを、ＨＬＡ−Ａ２陽性またはＨＬＡ−Ａ２陰性ＤＣ
の存在下で、ＣＭＶｐｐ６５ＨＬＡ−Ａ２制限Ｔ細胞系に加えた。細胞培養を、
ＩＦＮ−γに特異的な抗体で培養ウェルを被覆した、ＥＬＩＳＰＯＴフォーマッ
トで実施し、このサイトカインを特異的に分泌する細胞の存在を、Ｔ細胞活性化
の尺度として数値化した。サンプルは、下記のとおりである：１．Ｔ＋Ａ２⁺ＤＣ＋ｅｘｏ／Ａ２⁺＋ＤＣ／ペプチドなし、２．Ｔ＋Ａ２⁺ＤＣ＋ｅｘｏ／Ａ２⁺＋ＤＣ／ＣＭＶペプチド、３．Ｔ＋Ａ２^-ＤＣ＋ｅｘｏ／Ａ２⁺＋ＤＣ／ペプチドなし、４．Ｔ＋Ａ２^-ＤＣ＋ｅｘｏ／Ａ２⁺＋ＤＣ／ＣＭＶペプチド。デキソソームに対するＴ細胞の特異的ペプチド応答は、サンプル２をサンプル
１と比較することによって、検分することができ、刺激がデキソソームに取り込
まれたペプチドによるものであって、ＤＣを直接刺激する遊離ペプチドによるも
のではないことの証明は、サンプル４をサンプル３と比較することによって示さ
れる。

【図３】５００kDa（ＭＷＣＯ）中空繊維膜越しの限外濾過による加工処理の前および
後の、ＡＩＭＶ培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＡＩＭＶおよびＵＦ処
理ＡＩＭＶは、１００，０００×gで１時間の超遠心分離によってペレット化し
た。上清を棄却し、ペプチド領域をＰＢＳに再懸濁させ、２回目の１００，００
０×gで１時間の再超遠心分離に付した。ペレットを、ＰＢＳで本来の体積の１
，０００分の１まで再懸濁させた。ペレット２０μl（還元性条件）を、８〜１
６％のアクリルアミドゲル上に流し、次いで、ゲルをコロイド状クーマシーブル
ーで染色した。

【図４】５００kDa中空繊維膜越しの限外濾過による加工処理３ヶ月後のＡＩＭＶ培地
のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＵＦ処理したＡＩＭＶを、１００，０００
×gで１時間の超遠心分離によってペレット化した。上清を、棄却し、ペプチド
領域をＰＢＳに再懸濁させ、２回目の１００，０００×gで１時間の再超遠心分
離に付した。ペレットを、ＰＢＳで本来の体積の１，０００分の１まで再懸濁さ
せた。ペレット２０μl（還元性条件）を、８〜１６％のアクリルアミドゲル上
に流し、次いで、ゲルをコロイド状クーマシーブルーで染色した。

【図５】３／０．８μmカプセルフィルターを有する精密濾過システムの模式図である
。

【図６】中空繊維カートリッジシステムを用いた、清澄化組織培養上清の限外濾過の模
式図である。

【図７】ＰＢＳ、５００kDa中空繊維膜でのダイアフィルトレーションの前および後の
デキソソームを含有する、濃縮組織培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。サンプ
ルは、５容のＰＢＳでダイア濾過した。ダイア濾過する前および後のデキソソー
ムを、３０％ショ糖／トリスＤ２Ｏ緩衝液で構成される密度クッションでの超遠
心分離によってさらに精製した。分析した各サンプルについて、倍で示される濃
度を示した。ペレット２０μl（還元性条件）を、８〜１６％のアクリルアミド
ゲル上に流し、次いで、ゲルをコロイド状クーマシーブルーで染色した。

【図８ａ】濃縮したデキソソームを、３０％ショ糖／トリスＤ２Ｏ密度クッション（密度
＝１．１９０〜１．２１０g/ml）−サンプル調製品中の超遠心分離に付した。

【図８ｂ】３０％ショ糖／トリスＤ２Ｏ緩衝液で構成される密度クッションで超遠心分離
した、デキソソームからのサンプル捕集を示す図である。ペレットを、配合緩衝
液で本来の体積の１，０００分の１まで再懸濁させた。

【図９ａ】３０％ショ糖／トリスＤ２Ｏ緩衝液で構成される密度クッションでの超遠心分
離後に捕集されたデキソソーム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。すべて
のサンプルを、本来の体積の２１分の１まで正規化した。画分は、下記のとおり
であった：列１−限外濾過後／超遠心分離前、列２−ＵＣ密度クッション、列３
−クッション底の／本来の体積の１，０００分の１まで再構成されたＵＣペレッ
ト、列４−古典的な沈降法で得られた／本来の体積の１，０００分の１まで再構
成されたＵＣペレット、列５−クッション上のＵＣ。

【図９ｂ】１００，０００×gで１時間の超遠心分離後のショ糖／Ｄ２Ｏ密度クッション
の異なる画分のＨＬＡ／ＤＲ−ＥＬＩＳＡを示す図である。ＨＬＡ／ＤＲは、ク
ッション上に全く観察されず、再構成されたペレット（１，０００分の１）には
、シグナルの約１０％が、またクッション中には９０％が観察された。

【図１０】デキソソームのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＰＢＳ配合緩衝液中へのダイアフィ
ルトレーションを示す図である。１００，０００×gで１時間の超遠心分離によ
る沈降によって、デキソソームをさらに濃縮した。ペレットを、ＰＢＳ中で、出
発上清体積の２，８００分の１まで再構成した。デキソソーム３．３μl（還元
性条件）を、８〜１６％のアクリルアミドゲル上に搭載し、次いで、ゲルをコロ
イド状クーマシーブルーで染色した。

【図１１ａ】エキソソームのＥＬＩＳＡを示す図である。エキソソームは、超遠心分離によ
るペレット化、または密度クッション溶液（３０％ショ糖／Ｄ２Ｏ中２０mmのト
リス）上での超遠心分離によるペレット化のいずれかによって精製した。比較の
ため、ＤＣ溶解物を、同等の細胞培養等価体として用いた。非特異的結合部位を
、脱脂乾燥乳で遮断し、ＣＤ８１（図１１ａ）およびＨＬＡ−ＤＲ（図１１ｂ）
を、特異的ｍＡｂ、次いで二次抗体と複合させたセイヨウワサビペルオキシダー
ゼによって検出した。サンプルは、化学発光検出によって定量し、細胞培養当量
の関数としてプロットした。

【図１１ｂ】エキソソームのＥＬＩＳＡを示す図である。エキソソームは、超遠心分離によ
るペレット化、または密度クッション溶液（３０％ショ糖／Ｄ２Ｏ中２０mmのト
リス）上での超遠心分離によるペレット化のいずれかによって精製した。比較の
ため、ＤＣ溶解物を、同等の細胞培養等価体として用いた。非特異的結合部位を
、脱脂乾燥乳で遮断し、ＣＤ８１（図１１ａ）およびＨＬＡ−ＤＲ（図１１ｂ）
を、特異的ｍＡｂ、次いで二次抗体と複合させたセイヨウワサビペルオキシダー
ゼによって検出した。サンプルは、化学発光検出によって定量し、細胞培養当量
の関数としてプロットした。

【図１２ｂ】デキソソーム調製品のＨＬＡ／ＤＲ（図１２ａ、ｂ）およびＭＨＣＩ（図１２
ｃ、ｄ）ＥＬＩＳＡを示す図である。デキソソーム調製品は、これまでに記載し
た方法によって作成した。細胞培養上清（３．７L）を、濾過によって清澄化し
、限外濾過によって濃縮し、ショ糖／Ｄ２Ｏ密度クッション上での超遠心分離に
よって濃縮し、限外濾過／ダイアフィルトレーションによる緩衝液交換で濃縮し
た。体積は、本来の上清体積の１，０００ｘ（１μl当量＝上清１ml）の濃度を
表すよう正規化した。図１２ａ：過剰なエキソソームによる抗ＨＬＡ／ＤＲの滴定。図１２ｂ：クッションへの超遠心分離後の（ＵＣ−クッション）、および過剰
な抗ＨＬＡ／ＤＲによる配合緩衝液中へのダイアフィルトレーション後の（第２
ＵＦ）デキソソームの滴定。図１２ｃ：過剰なデキソソームによる抗ＭＨＣＩ（ＨＣ−１０ハイブリドーマ
）の滴定。図１２ｄ：過剰な抗ＭＨＣＩによるデキソソームＡおよびＢの滴定。

【図１２ｃ】デキソソーム調製品のＨＬＡ／ＤＲ（図１２ａ、ｂ）およびＭＨＣＩ（図１２
ｃ、ｄ）ＥＬＩＳＡを示す図である。デキソソーム調製品は、これまでに記載し
た方法によって作成した。細胞培養上清（３．７L）を、濾過によって清澄化し
、限外濾過によって濃縮し、ショ糖／Ｄ２Ｏ密度クッション上での超遠心分離に
よって濃縮し、限外濾過／ダイアフィルトレーションによる緩衝液交換で濃縮し
た。体積は、本来の上清体積の１，０００ｘ（１μl当量＝上清１ml）の濃度を
表すよう正規化した。図１２ａ：過剰なエキソソームによる抗ＨＬＡ／ＤＲの滴定。図１２ｂ：クッションへの超遠心分離後の（ＵＣ−クッション）、および過剰
な抗ＨＬＡ／ＤＲによる配合緩衝液中へのダイアフィルトレーション後の（第２
ＵＦ）デキソソームの滴定。図１２ｃ：過剰なデキソソームによる抗ＭＨＣＩ（ＨＣ−１０ハイブリドーマ
）の滴定。図１２ｄ：過剰な抗ＭＨＣＩによるデキソソームＡおよびＢの滴定。

【図１２ｄ】デキソソーム調製品のＨＬＡ／ＤＲ（図１２ａ、ｂ）およびＭＨＣＩ（図１２
ｃ、ｄ）ＥＬＩＳＡを示す図である。デキソソーム調製品は、これまでに記載し
た方法によって作成した。細胞培養上清（３．７L）を、濾過によって清澄化し
、限外濾過によって濃縮し、ショ糖／Ｄ２Ｏ密度クッション上での超遠心分離に
よって濃縮し、限外濾過／ダイアフィルトレーションによる緩衝液交換で濃縮し
た。体積は、本来の上清体積の１，０００ｘ（１μl当量＝上清１ml）の濃度を
表すよう正規化した。図１２ａ：過剰なエキソソームによる抗ＨＬＡ／ＤＲの滴定。図１２ｂ：クッションへの超遠心分離後の（ＵＣ−クッション）、および過剰
な抗ＨＬＡ／ＤＲによる配合緩衝液中へのダイアフィルトレーション後の（第２
ＵＦ）デキソソームの滴定。図１２ｃ：過剰なデキソソームによる抗ＭＨＣＩ（ＨＣ−１０ハイブリドーマ
）の滴定。図１２ｄ：過剰な抗ＭＨＣＩによるデキソソームＡおよびＢの滴定。

【図１３ａ】特定の表面受容体についてのデキソソームのフローサイトメトリー分析を示す
図である。陰影を施したヒストグラムは、注目される受容体を認識する蛍光標識
化抗体の結合の比強度を示し、無地のヒストグラムは、無関係のバックグラウン
ド結合を示した。

【図１３ｂ】図１３ａと同様であるが、染色を、非標識化一次抗体、次いで蛍光標識化二次
抗体を用いて実施した。ラクトアドヘリン抗体は、直接の蛍光複合体としては入
手できないためである。

【図１４】ＳＥＥパルス標識したデキソソームを用いたスーパー抗原アッセイを示す図で
ある。デキソソームを、実施例中に記載したとおりに精製し、ＳＥＥでパルス標
識し、次いで、JurkatＴ細胞およびRaji細胞と組み合わせて温置した。ＩＬ−２
の生成を、ＥＬＩＳＡによって測定し、ＨＬＡ−ＤＲＥＬＩＳＡアッセイによっ
て決定されたとおりの１ウェルあたりのＨＬＡ−ＤＲ分子の数の関数としてプロ
ットした。データを、Ｓ字曲線当てはめを用いて当てはめ、算出半数有効量（Ｅ
Ｄ₅₀）を、デキソソーム調製品の効力の尺度として推計した。

【図１５】デキソソームの希釈量（凡例に示す）を、ＳＥＥでパルス標識し、Jurkatおよ
びRaji細胞とともに培養し、Ｄｅｘ調製品の効力を試験した。Optiprepクッショ
ンから回収した後、各サンプルを、系統滴定に付し、細胞アッセイで試験した。
データは、各デキソソーム調製品の希釈について補正した後では、アッセイが線
形である範囲をほぼ１００倍越える範囲を表す、エキソソーム０．７〜５０μl
の範囲について、ほぼ半最大活性（約３５０pg／ＩＬ−２ml）を示す、曲線の領
域を検分するならば、同じレベルの活性が示されることを示している。この結果
は、そのようなアッセイに対しては予測されず、このアッセイを、未知のデキソ
ソーム調製品の広い範囲の濃度を測定するのに非常に役立たせる。

【図１６】ペレット化および帯域超遠心分離によって精製されたエキソソーム／ＳＥＥ複
合体のＨＬＡ／ＤＲ−ＥＬＩＳＡによる比較を示す図である。

【図１７】ＨＬＡ−Ａ２⁺（上）およびＨＬＡ−Ａ２^-（下）デキソソームとのペプチドの
結合を示す図である。ビオチニル化された参照ペプチドを、凡例に示された濃度
で用いて、デキソソームに担荷した。結合したペプチドの量を、検定されたデキ
ソソーム溶解物の量の関数として、Ｅｕ蛍光（毎秒カウント）の形でｙ軸に示し
た（ｘ軸には体積μlの形で示す）。

【図１８】異なる緩衝液およびpHでのペプチド担荷を示す図である。ビオチニル化参照ペ
プチドを、pH３．２〜５．２の酢酸またはクエン酸緩衝液を用いて担荷した。担
荷されたペプチドの量を、Ｅｕ蛍光のカウントの形でｙ軸に示した。

【図１９】 pH４．２の酢酸ナトリウムで穏やかに酸処理したデキソソームは、pH４．２の
クエン酸処理Ｄｅｘより充分な機能的活性を保持していることを示す図である。Ｄｅｘを、クエン酸（緩衝液Ａ）または酢酸ナトリウム（緩衝液Ｂ）のいずれ
かで処理し、「ＳＥＥ」スーパー抗原でパルス標識し、機能アッセイで試験して
、エフェクター細胞からのＩＬ−２分泌を誘発できるその能力によって測定され
る限りでの、デキソソームの生物活性に対する効果を評価した。ＩＬ−２分泌を
、デキソソーム体積の関数としてｙ軸に示した。

【図２０】 β₂ミクログロブリンが直接ペプチド担荷を容易にすることを示す図である。
ビオチニル化参照ペプチドに、０〜８０μg/mlの濃度でβ₂ミクログロブリンを
担荷した。結合したペプチドの量を、β₂ミクログロブリンの濃度の関数として
、Ｅｕ蛍光（毎秒カウント）の形でｙ軸に示した。

【図２１】デキソソームとの参照ペプチドの結合の飽和を示す図である。ビオチニル化参
照ペプチドを、０〜２０μg/mlの濃度で担荷した。結合したペプチドの量を、参
照ペプチドの量の関数として、Ｅｕ蛍光（毎秒カウント）の形でｙ軸に示した。

【図２２】デキソソームとの参照ペプチドの結合の動態を示す図である。ビオチニル化参
照ペプチドを、室温で０．５〜４時間担荷した。結合したペプチドの量を、デキ
ソソームとの参照ペプチドの温置時間の関数として、Ｅｕ蛍光（毎秒カウント）
の形でｙ軸に示した。

【図２３】デキソソームに対する非標識化参照ペプチド、ＭＡＧＥ３、４および１０の結
合のビオチニル化参照ペプチドとの競合を示す図である。１〜１００ｘの非標識
化参照ペプチド、ＭＡＧＥ３、４および１０を、ビオチニル化参照ペプチド（５
μg/ml）とともに温置して、デキソソームとの結合について競合させた。阻害の
百分率を、競合体のペプチドの量の関数としてｙ軸に示した。

【図２４】Ｍａｒｔ−１を担荷したデキソソームを用いた、Ｔ細胞クローンアッセイを示
す図である。

【図２５】Ｐ１Ａ担荷デキソソームを用いた、Ｔ細胞クローンアッセイを示す図である。
Ｒ＆Ｄは、１００単位のＩＬ−２標準アッセイである。

【図２６】 β₂ミクログロブリンの不在下での、pH４．８および５．２の酢酸緩衝液中で
のデキソソームとのビオチン標識化参照ペプチドの結合を比較する図である。担
荷されたペプチドの量を、Ｅｕ蛍光カウントの形でｙ軸に示した。

【図２７】 pH４．２および５．２の酢酸ナトリウムで穏やかに酸処理したデキソソームは
、非処理デキソソームと同じ機能的活性を保持していることを示す図である。Ｄ
ｅｘを、pH４．８および５．２の酢酸ナトリウム（緩衝液Ａ）で処理し、「ＳＥ
Ｅ」スーパー抗原でパルス標識し、機能アッセイで試験して、エフェクター細胞
からのＩＬ−２分泌を誘発できるその能力によって測定される限りでの、デキソ
ソームの生物活性に対する効果を評価した。ＩＬ−２分泌を、デキソソーム体積
の関数としてｙ軸に示した。

【図２８】デキソソームに対するＭＡＧＥ４および１０の結合のビオチニル化参照ペプチ
ドとの競合を示す図である。５〜２０ｘのＭＡＧＥ４および１０を、１００μg/
mlのビオチニル化参照ペプチドとともに温置して、β₂ミクログロブリンの不在
下、pH４．８でのデキソソームとの結合について競合させた。阻害の百分率を、
競合体のペプチドの量の関数として、各列の上端に示した。

【図２９】デキソソームに対するＭＡＧＥ３の結合のビオチニル化参照ペプチドとの競合
を示す図である。５〜２０ｘのＭＡＧＥ３を、１００μg/mlのビオチニル化参照
ペプチドとともに温置して、β₂ミクログロブリンの不在下、pH４．８でのデキ
ソソームとの結合について競合させた。阻害の百分率を、競合体のペプチドの量
の関数として、各列の上端に示した。

【図３０】 β₂ミクログロブリンの不在下での、Ｍａｒｔ−１ペプチドを担荷したデキソ
ソームによって刺激されたＬＴ１１によるＩＦＮ−γの分泌を示す図である。Ｌ
Ｔ１１細胞を、補助細胞としてのＤＣの存在下でＭａｒｔ−１ペプチド担荷デキ
ソソームによって刺激し、ＬＴ１１からのＩＦＮ−γの分泌を、デキソソームの
関数としてｙ軸に示した。対照として、Ｅｘｏ４４７も、β₂ミクログロブリン
の不在下、pH４．２で担荷した。

【図３１】 β₂ミクログロブリンの不在下でのＨＬＡ−Ａ１制限ペプチドの結合（上のパ
ネル）および阻害（下のパネル）を示す図である。上のパネル：ＨＬＡ−Ａ１制
限された、ビオチニル化ペプチドのＭＡＧＥ−３Ｃ５は、ＨＬＡ−Ａ１⁺デキソ
ソームに特異的に結合した。下のパネル：結合は、非標識化ＭＡＧＥ−３Ａ１ペ
プチドによって阻害された。

【図３２】ＨＬＡ−Ａ１／Ｂ３５制限された、ビオチン標識化ＭＡＧＥ−３Ｃ５と非標識
化ＭＡＧＥ−３Ａ１／Ｂ３５ペプチドとの間の、ＨＬＡ−Ｂ３５⁺デキソソーム
（Ｅｘｏ４２６）に対するβ₂ミクログロブリンの不在下での競合を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 37/02 37/08 37/08 Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｎ 5/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ルエッグ，カーティスアメリカ合衆国、カリフォルニア 94062、レッドウッド・シティ、シェパード・ウェイ 826 (72)発明者ル・ペック，ジャン−ベルナールアメリカ合衆国、カルフォルニア 94025、メンロー・パーク、オリーブ・ストリート 675 (72)発明者シュー，ティ−ウェイアメリカ合衆国、カリフォルニア 94087、サニーベール、ナンバー168、イー・エル・カミノ・リアル 1030 (72)発明者ヤオ，チェン−ユアンアメリカ合衆国、カルフォルニア 94040、マウンテン・ビュー、モンテレーナ・コート 166 Ｆターム(参考） 4B065 AA92X BB19 BD14 CA24 CA44 4C085 AA03 BB01 BB11 CC01 CC32 DD42

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫原性膜小胞を調製する方法であって、生物学的サンプル
から膜小胞を単離または精製する工程と、ペプチドまたは脂質が該膜小胞の表面
で抗原提示分子に結合するのを可能にする条件下で、該精製された膜小胞をペプ
チドまたは脂質に接触させる工程とを含む方法。
【請求項２】膜小胞を、抗原提示細胞を含む生物学的サンプルから単離す
る、請求項１記載の方法。
【請求項３】膜小胞を、ヒトの樹状細胞を含む生物学的サンプルから単離
する、請求項２記載の方法。
【請求項４】該小胞を該ペプチドまたは脂質に接触させる前、間または後
に、単離または精製された膜小胞を選択された酸性培地に付す工程を含む、請求
項１記載の方法。
【請求項５】接触後に、小胞を密度遠心分離またはダイアフィルトレーシ
ョンに付して、未結合ペプチドまたは脂質を除去する、請求項１記載の方法。
【請求項６】ペプチドが、クラスＩ制限ペプチドである、請求項１記載の
方法。
【請求項７】ペプチドが、クラスII制限ペプチドである、請求項１記載の
方法。
【請求項８】小胞をペプチドの混合物に接触させる、請求項１記載の方法
。
【請求項９】小胞を腫瘍細胞のペプチド溶出物に接触させる、請求項８記
載の方法。
【請求項１０】抗原提示分子がＣＤ１分子であり、脂質が、微生物脂質、
微生物糖脂質および脂質、または糖脂質腫瘍抗原から選択される、請求項１記載
の方法。
【請求項１１】ＨＬＡクラスＩ分子と結合した外因性クラスＩペプチドの
複合体を含む免疫原性膜小胞を調製するための方法であって、該方法が、（ｉ）
単離または精製された膜小胞を、選択された酸性培地に付す工程と、（ii）該単
離または精製された膜小胞を、ペプチドが該膜小胞の表面でＨＬＡクラスI分子
と複合するのを可能にする条件下で、β₂ミクログロブリンの存在下で、クラス
Ｉ制限ペプチドに接触させる工程と、（iii）担荷された膜小胞を回収する工程
とを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】工程（ｉ）が、単離または精製された膜小胞を、約３〜５
．５のpHの培地に１５分未満にわたって付す工程を含む、請求項１１記載の方法
。
【請求項１３】工程（ii）が、単離または精製された膜小胞を、β₂ミク
ログロブリンの存在下で、０．００５〜５０μg/mlのクラスＩ制限ペプチドに接
触させる工程を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】ＨＬＡクラスＩ分子と結合した外因性クラスＩペプチドの
複合体を含む免疫原性膜小胞を調製するための方法であって、該方法が、（ｉ）
単離または精製された膜小胞を、β₂ミクログロブリンの不在下で、クラスＩ制
限ペプチドに接触させる工程と、（ii）（ｉ）の混合物を、該膜小胞の表面でＨ
ＬＡクラスI分子と結合するためにペプチドを任意の外因性ペプチドとも交換す
ることを可能にする条件下で、選択された酸性培地に付す工程と、（iii）培地
を中和して、交換を停止し、（ii）で形成された複合体を安定化する工程と、（
iv）担荷された膜小胞を回収する工程とを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】工程（ii）が、混合物を、約４〜５．５のpHの選択された
酸性培地に２時間未満にわたって付す工程を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】工程（ｉ）が、単離または精製された膜小胞を、β₂ミク
ログロブリンの不在下で、５〜５００μg/mlのクラスＩ制限ペプチドに接触させ
る工程を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】ペプチドが、腫瘍抗原、ウイルス性抗原、寄生生物性抗原
および細菌性抗原から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】ペプチドが、腫瘍抗原、ウイルス性抗原、寄生生物性抗原
および細菌性抗原から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】ペプチド担荷膜小胞を調製する方法であって、（ａ）抗原提示細胞、特に樹状細胞の集団を、抗原提示細胞、特に樹状細胞によ
る膜小胞の放出を可能にする条件下で培養する工程と、（ｂ）膜小胞を富化または精製する工程と、（ｃ）ペプチドが該膜小胞の表面でＭＨＣ分子と結合するのを可能にする条件下
で、膜小胞をペプチドに接触させて、ペプチド担荷膜小胞を生成する工程とを含む方法。
【請求項２０】ペプチド担荷膜小胞を調製する方法であって、（ａ）未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、（ｂ）未成熟樹状細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、未成熟樹状細
胞の集団を培養する工程と、（ｃ）膜小胞を富化または精製する工程と、（ｄ）ペプチドが該膜小胞の表面でＭＨＣ分子と結合するのを可能にする条件下
で、膜小胞をペプチドに接触させる工程とを含む方法。
【請求項２１】工程（ｃ）の前または後に、膜小胞を選ばれた酸性培地に
付す、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】工程（ｄ）の前または後に、膜小胞を選ばれた酸性培地に
付す、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】対象者に免疫応答を生起させる方法であって、（ｉ）樹状
細胞を含有する生物学的サンプルを得る工程と、（ii）生物学的サンプルから膜
小胞を単離または精製する工程と、（iii）ペプチドまたは脂質が該膜小胞の表
面でＭＨＣもしくはＣＤ１分子と結合するのを可能にする条件下で、該精製され
た膜小胞をペプチドに接触させる工程と、（iv）工程（iii）の膜小胞を対象者
に投与して、該対象者に免疫応答を生起させる工程とを含む方法。
【請求項２４】工程（ｉ）で、樹状細胞を含有する生物学的サンプルを、
処置しようとする対象者から得る、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】工程（iii）の前または後に、膜小胞を穏やかな酸処理に
付す、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】ペプチドが、クラスＩ制限ペプチドである、請求項２３記
載の方法。
【請求項２７】抗原提示分子が、ＣＤ１分子であり、脂質が、微生物脂質
、微生物糖脂質および脂質、または糖脂質腫瘍抗原から選ばれる、請求項２３記
載の方法。
【請求項２８】免疫原性膜小胞と、薬学的に許容され得る希釈剤または担
体とを含む医薬組成物であって、免疫原性膜小胞が、抗原提示細胞を含有する生
物学的サンプルから膜小胞を単離し、該単離された膜小胞に、免疫原ペプチドま
たは脂質を担荷することによって得られる医薬組成物。
【請求項２９】免疫原性膜小胞が、抗原提示細胞を含有する生物学的サン
プルから膜小胞を単離し、該単離された膜小胞に免疫原ペプチドまたは脂質を担
荷し、未結合の免疫原ペプチドまたは脂質を、密度遠心分離またはダイアフィル
トレーションによって除去することによって得られる、請求項２８記載の医薬組
成物。
【請求項３０】免疫原性膜小胞が、樹状細胞を含有する生物学的サンプル
から膜小胞を単離することによって得られる、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３１】免疫原性ペプチドがクラスＩ制限ペプチドである、請求項
３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】小胞表面のＨＬＡ分子の１５％以上、好ましくは４０％以
上にペプチドが担荷された、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３３】免疫原性膜小胞と、薬学的に許容され得る希釈剤または担
体とを含有する医薬組成物を製造する方法であって、（ｉ）生物学的サンプルか
ら膜小胞を単離する工程と、（ii）該単離された膜小胞に、免疫原ペプチドまた
は脂質を担荷して、免疫原性膜小胞を生成する工程と、（iii）好ましくは、未
結合の免疫原性ペプチドまたは脂質を除去する工程と、(iv)免疫原性膜小胞を、
薬学的に許容され得る希釈剤または担体に接触させる工程とを含む方法。
【請求項３４】生物学的サンプルから膜小胞を調製する方法であって、該
生物学的サンプルを密度クッション遠心分離で処理する工程を含む方法。
【請求項３５】密度クッション遠心分離の前及び／または後に、生物学的
サンプルのダイアフィルトレーションをさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】生物学的サンプルが、生物学的流体、培養上清、細胞溶解
物または精製前の溶液である、請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】生物学的サンプルを、膜小胞に富ませるよう処理する、請
求項３６記載の方法。
【請求項３８】生物学的サンプルから膜小胞を調製する方法であって、ａ．小胞の放出を可能にする条件下で、膜小胞産生細胞の集団を培養する工程と
、ｂ．膜小胞を富化する工程と、ｃ．該富化された生物学的サンプルを、密度クッション上での遠心分離によって
処理する工程とを含む方法。
【請求項３９】富化工程が清澄化を含む、請求項３７または３８記載の方
法。
【請求項４０】富化工程が限外濾過による濃縮を含む、請求項３７または
３８記載の方法。
【請求項４１】富化工程が、清澄化、および限外濾過による濃縮を含む、
請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４２】富化工程が、限外濾過によるダイアフィルトレーションを
含む、請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４３】工程ｃからの調製品を滅菌濾過する工程をさらに含む、請
求項３８記載の方法。
【請求項４４】細胞を、粒状体含量を低減した培地で培養する、請求項３
８記載の方法。
【請求項４５】膜小胞産生細胞が、抗原提示細胞または腫瘍細胞である、
請求項３８記載の方法。
【請求項４６】抗原提示細胞を、１または数種類の抗原に対して感作する
、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】抗原提示細胞が樹状細胞、好ましくは未成熟樹状細胞を含
む、請求項４４または４５記載の方法。
【請求項４８】膜小胞を調製する方法であって、（ａ）抗原提示細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、抗原提示細胞の
集団を培養する工程と、（ｂ）膜小胞を富化する工程と、（ｃ）密度クッション遠心分離を用いて、膜を単離する工程とを含む方法。
【請求項４９】膜小胞を調製する方法であって、（ａ）未成熟樹状細胞の集団を得る工程と、（ｂ）未成熟樹状細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、未成熟樹状細
胞の集団を培養する工程と、（ｃ）膜小胞を富化する工程と、（ｄ）密度クッション遠心分離を用いて、膜小胞を単離する工程とを含む方法。
【請求項５０】膜小胞を調製する方法であって、（ａ）抗原提示細胞の集団を得る工程と、（ｂ）場合により、抗原提示細胞を、１または数種類の抗原で感作する工程と、
（ｃ）抗原提示細胞による膜小胞の放出を可能にする条件下で、抗原提示細胞の
集団を培養する工程と、（ｄ）培養上清を清澄化する工程と、（ｅ）清澄化された上清を濃縮する工程と、（ｆ）濃縮された上清をダイアフィルトレーションに付す工程と、（ｇ）密度クッション遠心分離を用いて、膜小胞を単離する工程と（ｈ）場合により、膜小胞をペプチドに接触させて、ペプチド担荷膜小胞を生成
する工程と、（ｉ）工程（ｇ）で得られた小胞膜を滅菌濾過する工程とを含む方法。
【請求項５１】樹状細胞を生成する方法であって、樹状細胞の前駆細胞を
、増殖因子および／またはサイトカインを含む、粒状体含量を低減した培地で培
養して、該前駆細胞の樹状細胞への分化をもたらすかまたは刺激する工程を含む
方法。
【請求項５２】培地が、凝集したハプトグロビンを実質的に含まない、請
求項５１記載の方法。
【請求項５３】粒状体含量を低減した培地中に樹状細胞を含む組成物。
【請求項５４】凝集したハプトグロビンを実質的に含まない培地中に、樹
状細胞を含む組成物。
【請求項５５】（ｉ）膜小胞と、（ii）緩衝剤と、（iii）細胞防護剤ま
たは安定化化合物とを含む組成物。
【請求項５６】（iv）塩および／または充填剤および／または抗酸化剤お
よび／またはビタミンをさらに含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】小胞膜を特徴付ける方法であって、膜小胞を、膜小胞のマ
ーカーに特異的な２種類またはそれ以上の抗原に並行して接触させ、抗原−抗体
免疫複合体の形成を測定する工程を含む方法。
【請求項５８】膜小胞を、固体支持体、たとえばビーズに担荷させる、請
求項５７記載の方法。
【請求項５９】下記の抗体：抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＨＬＡａｂ
ｃ、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ６３、抗ＣＤ５８、抗ＣＤ１ａ、抗ＣＤ１ｂ、抗ＣＤ９
、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ８３、および抗ラクトアドヘリンのうち２種
類以上を用いる、請求項５７または５８記載の方法。
【請求項６０】膜小胞調製品の活性を特徴付ける方法であって、補助細胞
の存在下で、スーパー抗原担荷膜小胞をＴ細胞に接触させる工程と、Ｔ細胞の活
性化を測定する工程とを含む方法。
【請求項６１】膜小胞にスーパー抗原を担荷する、請求項６０記載の方法
。
【請求項６２】スーパー抗原を担荷した細胞を生成することから、膜小胞
を生成する、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】サンプル中の膜小胞を投与する方法であって、（ｉ）該サ
ンプルを固体支持体に担荷させる工程と、該支持体を抗クラスII抗体に接触させ
る工程と、抗体−抗原免疫複合体の存在を測定する工程とを含む方法。
【請求項６４】ハプトグロビン凝集体を実質的に含まない、哺乳動物細胞
培養培地。
【請求項６５】約１０ng/ml未満のハプトグロビン凝集体を含有する、熱
不活性化された哺乳動物細胞培養培地。
【請求項６６】生物学的ポリペプチドまたはその誘導体を含む組成物であ
って、ハプトグロビン凝集体を実質的に除去した組成物。
【請求項６７】熱不活性化された生物学的ポリペプチドまたはその誘導体
を含む組成物であって、凝集したハプトグロビンを実質的に除去した組成物。
【請求項６８】生物学的ポリペプチドが、哺乳動物の生物学的流体から単
離されたポリペプチド、タンパク質またはペプチドである、請求項６６または６
７記載の組成物。
【請求項６９】生物学的ポリペプチドが、血清アルブミン、γ免疫グロブ
リン、および凝固因子から選択される、請求項６８記載の組成物。
【請求項７０】組成物が、約０．０１％未満、特に約０．００１％未満の
ハプトグロビン凝集体を含有する、請求項６６〜６９のいずれか１項記載の組成
物。
【請求項７１】熱不活性化されたヒト血清アルブミンの組成物であって、
凝集したハプトグロビンを実質的に含まない組成物。
【請求項７２】熱不活性化されたヒト血清アルブミンの組成物であって、
約０．００１重量％未満の凝集したハプトグロビンを含む組成物。
【請求項７３】生物学的産物、より好ましくは熱不活性化された生物学的
産物を、それに含有されるハプトグロビン凝集体の量を低減するために処理する
方法であって、該産物を、濾過、より好ましくは限外濾過に付す工程を含む方法
。
【請求項７４】生物学的産物を調製する方法であって、（ｉ）該生物学的
産物を熱不活性化する工程と、（ii）該熱不活性化された生物学的産物を濾過す
る工程とを含む方法。
【請求項７５】（iii）濾過された、熱不活性化された生物学的産物を濃
縮する工程、および／または（iv）それの順化する工程をさらに含む、請求項７
４記載の方法。
【請求項７６】濾過する工程が、好ましくは限外濾過、はるかに好ましく
は、約１００〜約１，０００kDa、代表的には２００〜７５０kDaの平均細孔径を
有する多孔性の装置での濾過する工程を含む、請求項７４または７５記載の方法
。
【請求項７７】ヒト血清アルブミン調製品を、それに含有される粒状体を
低減するよう処理する方法であって、該調製品を熱不活性化した後に限外濾過に
付す工程を含む方法。
【請求項７８】血漿タンパク質調製品を調製する方法であって、該調製品
を熱不活性化した後に限外濾過に付す工程を含む方法。
【請求項７９】膜小胞を含む組成物であって、ハプトグロビン凝集体を実
質的に含まない組成物。