CN115896017A - 一种加速人t细胞增殖的细胞培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有IL‑23的培养基,在普通人T细胞培养基的基础上，加入IL‑23。本发明的有益效果：增殖效果更好。与现有技术的免疫细胞培养相比较，本发明的培养基培养的人T细胞，增殖效果更好，缩短了培养时间。本发明提供的培养基适用于对人T细胞进行大规模培养。可用于T细胞的增殖，不需要抗原刺激。本发明提供人T细胞的细胞培养基，只要加入适量的IL‑23，浓度为100IU/mL，就可以大大增加T细胞的扩增速度，节约了操作人员时间和耗材成本。

Description

一种加速人T细胞增殖的细胞培养基

技术领域

本发明涉及一种人T细胞培养基，属于生物治疗和细胞生物的技术和材料领域

背景技术

在生物医学工程关于细胞的科研领域中，主要目的是研究细胞的功能和作用，尤其是T细胞的功能，T细胞是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是抑制以及杀伤肿瘤的主要免疫细胞。恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病，“手术、放疗与化疗”三大常规疗法对人体伤害极大，而且肿瘤极易复发，所以对自体的T细胞的研究以及体外改造将成为21世纪人类克服癌症的重要工具。

CAR-T技术目前国际上最前沿的治疗技术，已经在血液瘤中取得重大突破。从人体外周血中分离出单核细胞，再分离出T cell，并且对T细胞进行改造，改造后的T细胞再体外进行大量扩增，以达到可以回输人体的量。改造后的T细胞，回输人体后，可以起到有效抑制肿瘤作用更有甚者可以消灭所有的肿瘤细胞。不管是T细胞研究或者回输人体，都需要大量的T细胞，T细胞的体外扩增仍然是个难题，耗费大量的人力和耗材。

目前市场上的T细胞专用培养基对细胞的T细胞的扩增能力影响有限，使得T细胞生长速度慢，很难达到快速扩增的目的。

白细胞介素-23(IL-23)是2000年新发现的异二聚体结构的造血细胞因子，由p40和p19两个亚基组成，结构上与IL-12共享P40亚基，它们之间通过二硫键相联结。IL-23受体是由IL-12受体β1亚基(IL-12Rβ1)和IL-23受体(IL-23R)两个亚基组成，T细胞上含有大量的IL-23的受体。IL-23是一个具有多种生物学功能的细胞因子，可对多种细胞发挥作用，促进细胞因子的分泌，产生相应的细胞效应。IL-23可作用于T细胞，促进其强烈增殖。

发明内容

现有的T细胞培养基，只是简单的满足了细胞生长的要求，提供一些必要的营养物质，但是并没有利用特定细胞的信号通路促进细胞增殖的培养基

本发明所要解决的技术问题是：提供一种含有IL-23的免疫细胞培养基,在现有培养基的基础上，加入IL-23蛋白,浓度为100IU/mL。

IL-23的获得方法如下：

1.将IL-23的序列合成蛋白，再经过无菌过滤，得到的蛋白后用无菌的DPBS溶解到10000IU/mL.

2.商业化采购IL-23蛋白，蛋白用无菌的DPBS溶解，调到浓度为10000IU/mL。

3.本发明在T细胞普通培养基中加入IL-23蛋白，T细胞细胞膜上有大量的IL-23受体，IL-23与T细胞表面的IL-23受体结合，激活细胞通路后，促进T细胞快速增殖。

4.L-23蛋白溶液灭菌方法：

(1)使用IL-23序列合成的IL-23蛋白，配置成溶液后，使用时的灭菌方法：本蛋白溶液采用过滤除菌法，使用微孔滤膜过滤器。使用装入滤膜，当溶液从针筒注入滤器时，各种微生物被阻留在微孔滤膜上面，而液体和小分子物质通过滤膜，从而达到除菌的目的。其滤膜是由硝酸纤维素、醋酸纤维素等制成，采用0.22μm或者是0.1μm孔径，每张滤膜只使用1次。

(2)若为商业化购买的成品IL-23蛋白,只需用无菌的DPBS配置溶液，不需要进行其他灭菌操作。

5.本发明的有益效果：

增殖效果更好。与现有技术的T细胞普通培养基相比较，本发明的无血清培养基培养的免疫细胞，增殖效果更好，缩短了培养时间，节约了人力和物料的消耗。

6.本发明提供的培养基适用于对所有人T细胞进行大规模培养、临床安全性高。本产品是人T细胞的专业培养基。

7.本发明提供的人T细胞专用培养基，主要是在普通T细胞中加入IL-23蛋白。对于普通T细胞培养基种类和成分并没有限定。

8.本发明主要是通过激活人T细胞的IL-23蛋白信号通路，起到加速T细胞扩增的方式。

附图说明

图1STAT3和STAT4蛋白细胞流式细胞仪分析图。

图2加入IL-23培养基以及普通培养基培养人T细胞增殖速率对比。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，普通培养基为商业采购的一般人T细胞培养基。

实施例1

本实施例提供一种加速人T细胞增值的方法，在人T细胞普通培养基中加入IL-23蛋白。

IL-23蛋白获得：

(1)通过商业化采购。

(2)通过IL-23蛋白序列进行合成

(3)IL-23蛋白配置成溶液后使用采用0.22μm或者是0.1μm孔径的滤膜进行过

(4)加入IL-23蛋白,浓度为100IU/mL

实施例2:信号通路检测，加入IL-23蛋白后，与T细胞受体结合后，激活其信号通路，流式检测信号通路中重要的蛋白STAT3和STAT4，具体步骤如下：

(1)在5mL含有IL-23蛋白的细胞培养基和不含IL-23蛋白的细胞培养基中分别加入2x106的人T细胞放到T25细胞培养瓶中，加入培养24h。

(2)将培养瓶重得细胞取出进行离心(500g，5min)，用DPBS重悬后进行计数，根据计数结果取1x106细胞。

(3)将细胞重新离心(500g，5min)，加入2mL 4％多聚甲醛固定10min。

(4)将细胞离心(500g，5min)，弃去多聚甲醛后，加入2mL DPBS，再次离心(500g，5min)，弃去DPBS，按照操作重复三次。

(5)再用2ml 0.2-0.5％triton X-100(PBS配制)对细胞透化处理10分钟。

(6)重复步骤4，清洗三遍。

(7)加入100μL DPBS后，再加入STAT3和STAT4抗体2μL，再4℃孵育40min。

孵育完成后，按照步骤4清洗1两遍。

(8)清洗完成后，再加入150μL DPBS进行流式检测，检测结果见(图1)

(9)STAN3和STAN4是IL-23信号通路中重要的蛋白信号，我们通过检测STAN3和STAN4就可以确认IL-23是否与IL-23受体结合，信号通路发生作用。

实施例3：在普通培养基中加入IL-23蛋白后，人T细胞增殖速度得到明显提升，具体操作步骤如下：

(1)在5mL含有IL-23蛋白的细胞培养基和不含IL-23蛋白的细胞培养基中分别加入1x106的人T细胞放到T25细胞培养瓶中，培养3天。

(2)将T25培养瓶中培养基全部取出，离心(500g，5min)，祛除培养基后再用新鲜培养基重悬，计数。

(3)根据计数结果，再取x106的人T细胞放到T25细胞培养瓶中，并将其用相应的培养基补充到5mL。继续培养3天。

(4)重复2.3步骤。

(5)一共检测五次，共15天，具体结果见图2。

Claims (3)

1.一种免疫T细胞培养基，其特征在于，在普通培养基的基础上，加入IL-23。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，加入IL-23的量为100IU/mL。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，普通培养基为一般人T细胞培养基，无特殊要求。

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