CN115873810B

CN115873810B - 一种鼠白血病病毒的纯化方法

Info

Publication number: CN115873810B
Application number: CN202211677324.XA
Authority: CN
Inventors: 殷文静; 孙莉洁; 薛亚芬; 陆海燕; 王小瑜
Original assignee: Liangchen Bio (suzhou) Corp
Current assignee: Liangchen Bio (suzhou) Corp
Priority date: 2022-12-26
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2042-12-26
Also published as: CN115873810A

Abstract

本发明提供一种鼠白血病病毒的纯化方法。包括如下步骤：(1)采用mustang Q膜层析对鼠白血病病毒粗提液进行初步分离得到病毒初步纯化液；(2)采用蔗糖密度梯度离心对所述的病毒初步纯化液进行二次分离得到病毒二次纯化液；(3)对所述的病毒二次纯化液进行超滤浓缩得到鼠白血病病毒浓缩液。本发明针对白血病病毒特点，将mustang Q层析与蔗糖密度梯度离心法结合，并对操作条件进行优化，有效去除培养液中DNA杂质和蛋白杂质。处理条件温和，对鼠白血病病毒无损伤，更利于保持病毒粒子完整性，且相比现有纯化方法，更加简便，成本更低，更适合指示病毒鼠白血病病毒大规模制备。

Description

一种鼠白血病病毒的纯化方法

技术领域

本发明属于指示病毒技术领域，具体涉及一种鼠白血病病毒的纯化方法。

背景技术

在国家药监局制定的法规文件《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》、《生物制品病毒安全性控制.中华人民共和国药典2020年版三部,生物制品通则》中指出，小鼠及其他啮齿类动物来源的细胞系含有逆转录病毒基因序列，可能会表达内源性逆转录病毒颗粒，因此，以这类特定啮齿类动物来源的细胞(如CHO、NS0和Sp2/0)作为细胞系，经体外细胞培养制备的人用生物技术类产品，应在生产工艺中增加病毒灭活/去除工艺。

病毒灭活/去除有效性验证研究通常是将已知量的指示用活病毒，加入到待验证的工艺步骤处理前的模拟原材料或中间品中，然后定量测定经工艺步骤处理后指示病毒数量下降的幅度，由此评价生产工艺的去除/灭活病毒效果。病毒清除/灭活验证中，使用高滴度、低杂质的指示病毒，可减少样品中病毒掺入的体积百分比。

鼠白血病病毒含有单链RNA基因组，病毒外壳由囊膜包裹，球形，大约80-100nm，被作为一种特异性模型病毒，评价纯化工艺对CHO细胞逆转录颗粒的清除能力。然而逆转录病毒的稳定性较差，因此对纯化工艺有更高的要求。目前常规的纯化病毒的方法主要有沉淀法、离心法、透析法和亲和层析法等。其中超速离心法是应用最广泛的一种方法，其存在部分质粒DNA和宿主DNA残留的问题。沉淀法和透析法纯化效果不如亲和层析法和氯化铯平衡密度梯度离心的纯化效果，但是亲和层析法需要有特异性亲和位点，并设计特异性的结合填料，成本较高，不易推广。氯化铯平衡密度梯度离心法中会产生铯盐残留，需要进行去除铯盐的步骤，增加了工艺损耗。

目前针对鼠白血病病毒设计的纯化工艺公开的较少，更多是猪伪狂犬病毒，例如专利“一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法(CN107254449 A)”中，采用连续流离心、中空纤维澄清过滤、超滤浓缩、分子筛纯化工艺，制备用于疫苗的PRV浓缩液，由于分子筛是以物质分子量的不同作为分离依据的，对于分子量相差不大的物质难以达到很好的分离效果，分辨率较低，因此分子筛工艺对鼠白血病病毒纯化作用不理想。专利“一种慢病毒的纯化方法”中，采用沉淀法，Benzonase核酸酶酶切法，蔗糖密度梯度离心法获得了无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留度低的慢病毒纯化液，实践发现该方法对磷脂性包膜有损伤，会导致鼠白血病病毒的活性损伤较大，可能与其使用的高浓度金属盐或高分子两性溶剂有关，因此也不适合作为指示病毒鼠白血病病毒的纯化方法。

综上，目前指示病毒的生产工艺中纯化步骤复杂、纯化成本高、指示病毒收率低，长期以来，仍然缺乏高效、简便且成本更低的鼠白血病病毒的纯化方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、简便且成本更低的鼠白血病病毒的纯化方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种鼠白血病病毒的纯化方法，其包括如下步骤：

(1)采用mustang Q膜层析对鼠白血病病毒粗提液进行初步分离得到病毒初步纯化液；

(2)采用蔗糖密度梯度离心对所述的病毒初步纯化液进行二次分离得到病毒二次纯化液；

(3)对所述的病毒二次纯化液进行超滤浓缩得到鼠白血病病毒浓缩液。

优选地，步骤(1)中，所述的鼠白血病病毒粗提液的上样速度为5～20mL/min，例如5mL/min、10mL/min、15mL/min、20mL/min，上样载量≤100mL/mL。

优选地，步骤(1)中，所述的鼠白血病病毒粗提液上样通过mustang Q膜层析后，采用梯度洗脱液进行洗脱，所述的梯度洗脱液如下：

洗脱组分	第一PB缓冲液(％)	第二PB缓冲液(％)
			0％洗脱组分	100	0
10％洗脱组分	90	10
			20％洗脱组分	80	20
30％洗脱组分	70	30
			40％洗脱组分	60	40
50％洗脱组分	50	50

其中，所述的第一PB缓冲液为35～45mM PB缓冲液，所述的第二PB缓冲液为含有1.5～2.5M NaCl的35～45mM PB缓冲液，收集20％洗脱组分～40％洗脱组分，即为所述的病毒初步纯化液。

进一步优选地，所述的第一PB缓冲液和所述的第二PB缓冲液的pH值分别为7.2～8.5，例如7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5。

进一步优选地，所述的梯度洗脱液的流速为5～10mL/min。

优选地，步骤(1)中，在进行所述的洗脱前，采用pH为7.2～8.5的35～45mM PB缓冲液对所述的mustang Q膜层析进行清洗。

优选地，步骤(2)中，蔗糖密度梯度离心采用质量分数为10％～60％的蔗糖梯度溶液体系，所述的病毒初步纯化液从上方加入到质量分数为10％的蔗糖梯度溶液中。

进一步优选地，步骤(2)中，自下向上依次包括质量浓度为10％、30％、40％、50％和60％的蔗糖梯度溶液，离心后收集质量浓度为30％～50％的蔗糖梯度溶液；和/或，所述的蔗糖密度梯度离心采用的离心条件为30000～40000rpm，2～6h。

进一步优选地，步骤(3)中，所述的超滤采用的滤膜的孔径为3KD～10KD。

优选地，所述的鼠白血病病毒为鼠白血病病毒细胞培养液经反复冻融裂解，离心除去细胞碎片制得。

本发明还提供由所述的鼠白血病病毒的纯化方法制得的鼠白血病病毒浓缩液在生物制品的病毒灭活工艺验证中的应用，所述的生物制品为小鼠及其他啮齿类动物来源的细胞系经体外细胞培养制备的生物制品。

本发明与现有技术相比具有如下优势：

本发明针对白血病病毒特点，将mustang Q层析与蔗糖密度梯度离心法结合，并对操作条件进行优化，有效去除培养液中DNA杂质和蛋白杂质。处理条件温和，对鼠白血病病毒无损伤，更利于保持病毒粒子完整性，且相比现有纯化方法，更加简便，成本更低，更适合指示病毒鼠白血病病毒大规模制备。

附图说明

图1为病毒洗脱液加入质量分数为10％的蔗糖溶液中，鼠白血病病毒在不同蔗糖梯度组分中的分布图；

图2为病毒洗脱液加入质量分数为60％的蔗糖溶液中，鼠白血病病毒在不同蔗糖梯度组分中的分布图；

图3为实施例1中的病毒洗脱液的层析峰分离图；

图4为不同层析峰中的病毒和蛋白分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

以下实施例中，mustang Q膜层析购自Pall Corporation。

本发明中，根据一些实施方式，鼠白血病病毒粗提液的制备方法如下：

1.从液氮中取出由良辰种子库制备的主代细胞库中的转染鼠白血病病毒的Mv-1Lu细胞株，迅速放入37℃水浴中(注意：最好不要让水没过冻存管口，以免污染细胞)，在水浴中不断摇晃，待冻存管中剩余1片冰晶时取出，得到细胞悬液。

2.用无菌移液管吸出步骤1的细胞悬液，注入离心管中，并缓慢滴加5倍以上(稀释比例为1:5～1:15)培养液，混匀后室温3000rpm，离心5分钟(或37℃培养4小时后，显微镜观察贴壁后再换液)。弃去上清液，用培养液将细胞稀释到合适密度后，接种于培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱孵育。4小时后将培养瓶/皿取出，放置于倒置生物显微镜下观察细胞形态。

3.待细胞长至培养瓶/皿的80％及以上时，将培养瓶/皿从培养箱中取出，在生物安全柜中弃去培养液，然后用DMEM(H)细胞培养液洗涤1～2次，每次5ml(也可用0.25％胰酶溶液代替)，倒净剩余DMEM(H)细胞培养液，再用1～5mL 0.25％胰酶溶液消化后，用含10％胎牛血清的DMEM(H)细胞培养液5～10mL配制成单细胞悬液。

4.用无菌移液管将细胞吹打均匀，细胞按1：1～1：4的比例分装至不同培养瓶/皿中。

5.每瓶补加含10％胎牛血清的培养液至10～30mL左右。然后将培养瓶/皿放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育。

6.每观察到细胞长至培养瓶/皿的80％及以上时，重复步骤3～5，细胞传代次数达到8～15代后，将细胞瓶/皿放-35℃或以下低温冰箱中反复冻融2～3次，待细胞完全破碎后，收集培养液，即为鼠白血病病毒粗提液。

下面结合具体实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。

实施例1

制备鼠白血病病毒粗提液：

2.用无菌移液管吸出步骤1的细胞悬液，注入离心管中，并缓慢滴加5mL(稀释比例为1:5)培养液，混匀后室温3000rpm，离心5分钟(或37℃培养4小时后，显微镜观察贴壁后再换液)。弃去上清液，用培养液将细胞稀释到合适密度后，接种于培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱孵育。4小时后将培养瓶/皿取出，放置于倒置生物显微镜下观察细胞形态。

3.待细胞长至培养瓶/皿的80％及以上时，将培养瓶/皿从培养箱中取出，在生物安全柜中弃去培养液，然后用DMEM(H)细胞培养液洗涤2次，每次5mL，倒净剩余DMEM(H)细胞培养液，再用5mL 0.25％胰酶溶液消化后，用含10％胎牛血清的DMEM(H)细胞培养液10mL配制成单细胞悬液。

4.用无菌移液管将细胞吹打均匀，细胞按1:1～1:4的比例分装至不同培养瓶/皿中。

5.每瓶或每皿中补加含10％胎牛血清的培养液至25mL。然后将培养瓶/皿放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育。

6.每观察到细胞长至培养瓶/皿的80％及以上时，重复步骤3～5，细胞传代次数达到10代后，将细胞瓶/皿放-35℃或以下低温冰箱中反复冻融2次，待细胞完全破碎后，收集、合并各瓶培养液，即为鼠白血病病毒粗提液。

高纯度鼠白血病病毒浓缩液的制备方法：

1.将收集的鼠白血病病毒粗提液4500×g RCF、4℃离心10分钟，收集上清液，记为病毒液。

2.用40mM PB(磷酸盐)缓冲液在5mL/min下处理mustang Q膜5min，pH约为7.2。在5mL/min流速下将病毒液上样至mustang Q膜中，上样载量≤100mL/mL。设置流速5mL/min。将40mM PB缓冲液和含有2M NaCl的40mM PB缓冲液按表1设置洗脱梯度。

表1

收集20％洗脱组分、30％洗脱组分和40％洗脱组分，标记为病毒洗脱液。病毒洗脱液检测结果见图3，显示4个明显的洗脱峰，收集各个洗脱峰的样品，检测不同洗脱峰中病毒和蛋白含量，不同层析峰中的病毒和蛋白分布见图4。

3.离心管中形成自上而下质量分数依次为10％、20％、30％、40％、50％的蔗糖梯度溶液。将上述收集的病毒洗脱液从上方加入质量分数为10％的蔗糖溶液中，40000rpm离心2h，收集30％～50％蔗糖梯度溶液，3KD孔径的超滤去除蔗糖溶液，得到鼠白血病病毒浓缩液。

实施例2

本实施例提供一种高纯度鼠白血病病毒浓缩液的制备方法，其步骤如下：

1.取实施例1相同方法制备的鼠白血病病毒粗提液。4500×g、4℃离心10分钟，收集上清液，记为病毒液。

2.用40mM PB(磷酸盐)缓冲液在20mL/min下处理mustang Q膜3min，pH约为8.5。在20mL/min流速下将病毒液上样至mustang Q膜中，上样载量≤100mL/mL。设置流速10mL/min。将40mM PB缓冲液和含有2M NaCl的40mM PB缓冲液按表1设置洗脱梯度。收集20％洗脱组分、30％洗脱组分和40％洗脱组分，标记为病毒洗脱液。

离心管中形成自上而下质量分数依次为10％、30％、40％、50％、60％的蔗糖梯度溶液。将上述收集的病毒洗脱液从上方加入质量分数为10％的蔗糖溶液中，30000rpm离心6h，收集30％～50％蔗糖梯度溶液，10KD超滤去除蔗糖溶液，得到鼠白血病病毒浓缩液。

实施例3

本实施例通过与实施例1相同方法制备的鼠白血病病毒粗提液制备高纯度鼠白血病病毒浓缩液。本实施例基本同实施例1，区别仅在于：mustang Q层析中将40mM PB缓冲液和含有2M NaCl的40mM PB缓冲液调整为50mM柠檬酸盐缓冲液和含有2M NaCl的50mM柠檬酸盐缓冲液，pH值与实施例1一致。

实施例4

本实施例对通过与实施例1相同方法制备的鼠白血病病毒粗提液制备高纯度鼠白血病病毒浓缩液。本实施例基本同实施例1，区别仅在于：mustang Q层析中将40mM PB缓冲液和含有2M NaCl的40mM PB缓冲液调整为100mM醋酸盐缓冲液和含有2M NaCl的100mM醋酸盐缓冲液，pH值与实施例1一致。

实施例5

本实施例对通过与实施例1相同方法制备的鼠白血病病毒粗提液制备高纯度鼠白血病病毒浓缩液。本实施例基本同实施例1，区别仅在于：mustang Q层析中将40mM PB缓冲液和含有2M NaCl的40mM PB缓冲液的pH值调整为5。

实施例6

本实施例对通过与实施例1相同方法制备的鼠白血病病毒粗提液制备高纯度鼠白血病病毒浓缩液。本实施例基本同实施例1，区别仅在于：mustang Q层析中将40mM PB缓冲液和含有2M NaCl的40mM PB缓冲液的pH值调整为9。

检测实施例1～实施例6制备的高纯度鼠白血病病毒浓缩液的病毒滴度。

1.取出培养好PG-4细胞的6孔细胞培养板，弃去培养液，每孔用无血清McCOY’S 5A培养液洗涤1次。取2mL无菌EP管，用含8μg/mL的Polybrene的无血清McCOY’S 5A细胞培养液10倍连续稀释待测鼠白血病病毒浓缩液，将病毒稀释成1:10^-1～1:10^-8等不同浓度。往6孔细胞培养板中加入1:10^-1～1:10^-8稀释度的病毒浓缩液，每个稀释度加3孔，每孔加0.5mL。将6孔板放入37℃含5％ CO₂培养箱孵育2.0小时小时后，补加含有6％胎牛血清的McCOY’S5A的培养液2.5mL。

2.将细胞培养板置37℃，含5％ CO₂培养箱孵育，在第1、4天换2％胎牛血清的McCOY’S 5A细胞培养液，到第7天显微镜下观察结果，并用吉姆萨染液(Gimsa)染色，倒置显微镜下观察并记录蚀斑/空斑的数目，计算滴度。

病毒滴度

采用Bradford法检测实施例1～实施例6制备的高纯度鼠白血病病毒浓缩液的宿主细胞蛋白含量。

1.先配制1mg/mL的牛血清蛋白(BSA)母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液(PBS)配制一组浓度分别为1.0mg/mL，0.8mg/mL，0.6mg/mL，0.4mg/mL，0.2mg/mL的BSA溶液。再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/mL，0.08mg/mL，0.06mg/mL，0.04mg/mL，0.02mg/mL的BSA溶液。另外量取1mL的PBS溶液(BSA溶液浓度为0mg/ml)作对照试验。用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200μL的考马斯亮蓝(CBB)。静置10min后，用酶标仪测A595nm处吸光值。作出吸光度对BSA浓度的关系曲线：y＝7.72x+0.0682，R²＝0.9967，y表示吸光度，x表示BSA浓度。

2.将待测鼠白血病病毒浓缩液用PBS稀释，使用酶标仪测定A595nm吸光度。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

采用qPCR检测实施例1～实施例6制备的高纯度鼠白血病病毒浓缩液的宿主DNA含量。

1.样品提取：在生物安全柜中将待测鼠白血病病毒浓缩液、阳性对照、阴性对照等用柱式DNA抽提试剂盒进行DNA的提取，所有测试品洗脱体积一致。

2.标准曲线样品制备：取质粒标准品，用DNA稀释液进行稀释，以2×10⁷copies/μL、2×10⁶copies/μL、2×10⁵copies/μL、2×10⁴copies/μL、2×10³copies/μL作为标准曲线各点，标记为：SD1～5。

3.PCR扩增：取提取的DNA，以及制备的标准曲线各点各2μL加至PCR扩增缓冲液18μL中，使每管总体积达到20μL，用RNase/Dnase-Free Deionized Water作为无模板对照，标记为NTC。PCR扩增缓冲液按表2配制。

表2

Probe qPCR Mix(2×)	10μL
		Probe(10μM)	0.4μL
Primer F(10μM)	0.6μL
		Primer R(10μM)	0.6μL
RNase/DNase-Free Deionized Water	6.4μL

4.将反应管放入实时荧光PCR检测仪内反应，根据收集的Cq值和荧光曲线判定结果。若样品Cq值≤36.00，则根据标准曲线获得样品DNA浓度(copies/μL)；若样品Cq值＞36.00，则样品DNA浓度(copies/μL)低于检出限20copies/μL。

病毒滴度、宿主细胞蛋白含量及宿主DNA含量检测结果分别见表3。

表3

实施例1和实施例2将mustang Q层析与蔗糖密度梯度离心法结合，并对操作条件进行优化，有效去除培养液中DNA杂质和蛋白杂质的同时，对鼠白血病病毒无损伤，更利于保持病毒粒子完整性，且相比现有纯化方法，更加简便，成本更低，更适合指示病毒鼠白血病病毒的制备。

实施例7

本实施例对通过与实施例1相同法制备的鼠白血病病毒粗提液制备高纯度鼠白血病病毒浓缩液。本实施例基本同实施例1，区别仅在于：在蔗糖密度梯度离心步骤中，将收集的病毒洗脱液从下方加入质量分数为60％的蔗糖溶液中。

实施例1在蔗糖密度梯度离心步骤中，离心后，鼠白血病病毒在不同蔗糖梯度组分中的分布见图1。实施例7在蔗糖密度梯度离心步骤中，离心后，鼠白血病病毒在不同蔗糖梯度组分中的分布见图2。将病毒洗脱液从上方加入质量分数为10％的蔗糖溶液中的方式更优。

对比例1

本对比对通过与实施例1相同方法制备的鼠白血病病毒粗提液制备高纯度鼠白血病病毒浓缩液。本对比例基本同实施例1，区别仅在于：未进行mustang Q层析处理。本对比例在蔗糖梯度上形成的梯度不清晰，分辨率不佳，且处理相同体积样品，对比例1所需时间明显比实施例1所需时间长。

对比例2

本对比对通过与实施例1相同方法制备的鼠白血病病毒粗提液制备高纯度鼠白血病病毒浓缩液。本对比例基本同实施例1，区别仅在于：先进行蔗糖密度梯度离心，再进行mustang Q层析处理。本对比例在蔗糖梯度上形成的梯度不清晰，分辨率不佳，处理效果明显不及实施例1，且处理相同体积样品，对比例2所需时间明显比实施例1所需时间长。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种鼠白血病病毒的纯化方法，其特征在于：所述的纯化方法包括如下步骤：

（1）采用mustang Q膜层析对鼠白血病病毒粗提液进行初步分离得到病毒初步纯化液；

（2）采用蔗糖密度梯度离心对所述的病毒初步纯化液进行二次分离得到病毒二次纯化液；

（3）对所述的病毒二次纯化液进行超滤浓缩得到鼠白血病病毒浓缩液，

步骤（1）中，所述的鼠白血病病毒粗提液的上样速度为5~20 mL/min，上样载量≤100mL/mL，

步骤（1）中，所述的鼠白血病病毒粗提液上样通过mustang Q膜层析后，采用梯度洗脱液进行洗脱，所述的梯度洗脱液如下：

洗脱组分第一PB缓冲液（%）第二PB缓冲液（%） 0%洗脱组分 100 0 10%洗脱组分 90 10 20%洗脱组分 80 20 30%洗脱组分 70 30 40%洗脱组分 60 40 50%洗脱组分 50 50

其中，所述的第一PB缓冲液为35~45 mM PB缓冲液，所述的第二PB缓冲液为含有1.5~2.5M NaCl的35~45 mM PB缓冲液，

收集20%洗脱组分~40%洗脱组分，即为所述的病毒初步纯化液，

所述的第一PB缓冲液和所述的第二PB缓冲液的pH值分别为7.2~8.5，

所述的梯度洗脱液的流速为5~10mL/min，

步骤（2）中，自下向上依次包括质量浓度为10%、30%、40%、50%和60%的蔗糖梯度溶液，离心后收集质量浓度为30%~50%的蔗糖梯度溶液，所述的蔗糖密度梯度离心采用的离心条件为30000~40000 rpm，2~6 h，所述的病毒初步纯化液从上方加入到质量分数为10%的蔗糖梯度溶液中，

步骤（3）中，所述的超滤采用的滤膜的孔径为3 KD~10 KD。

2.根据权利要求1所述的鼠白血病病毒的纯化方法，其特征在于：步骤（1）中，在进行洗脱前，采用pH为7.2~8.5的35~45 mM PB缓冲液对所述的mustang Q膜层析进行清洗。

3.根据权利要求1所述的鼠白血病病毒的纯化方法，其特征在于：所述的鼠白血病病毒为鼠白血病病毒细胞培养液经反复冻融裂解，离心除去细胞碎片制得。