CN114107391B - 利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：1)制备重组质粒；2)制备重组Bacmid；3)利用步骤2)得到的重组Bacmid制备杆状病毒；4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒，然后进行纯化；5)在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育，然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。本发明通过利用染料木黄铜(Genistein)的酪氨酸激酶抑制剂的特点，将其与AAV介导的基因治疗联合起来使用，显著提高了AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法。
背景技术
细胞治疗作为癌症治疗的新型手段，已经显示出其独有的优势和特点。免疫细胞作为细胞治疗的重要功能细胞，包括淋巴细胞、抗原提呈细胞、粒细胞以及其他参与免疫应答和效应的细胞。在2017年，美国食品药品监督管理局(FDA)，批准了两个CAR-T细胞产品上市，使得T淋巴细胞成为细胞治疗药物的热点目标改造细胞。T淋巴细胞作为主要免疫细胞，可以识别APC提呈的相关抗原，进而活化和增值，最终分化为效应细胞，杀伤表达特异性抗原的靶细胞。嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法，是指通过基因编辑手段，人工使T淋巴细胞携带一个可以识别靶细胞的抗原，进而可以高效特异性的杀伤和识别目标细胞。
腺相关病毒(AAV)，目前作为对T淋巴细胞进行基因编辑的主要载体之一，如何提高AAV对T淋巴细胞的编辑效率，一直是科学家关注的方向。AAV来源于细小病毒，具有自然缺陷、无包被和无致病原性等特点。其基因组是由一个4680个核苷酸，线性、单链DNA(ssDNA)分子组成，在每个末端含有一个145个碱基组成的末端重复序列(ITR)。然而，大多数AAV对T细胞的转导效率都极低，目前研究发现AAV6对T细胞有相对高的趋向性，但也需要比较高的感染复数(MOI)才能获得有效转导。当AAV进入T细胞后，会受到酪氨酸激酶的影响，抑制其第二条链的合成，最终影响目的蛋白的表达，所以，AAV对T细胞相对低下的转导效率限制了其在T细胞免疫治疗中的应用。
所以，显著亟需一种能提高AAV介导的基因在T淋巴细胞中表达的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备重组质粒；
2)利用步骤1)得到的重组质粒制备重组Bacmid；
3)利用步骤2)得到的重组Bacmid制备杆状病毒；
4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒，然后进行纯化；
5)在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育，然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。
优选的是，所述步骤1)包括：分别制备pFastbacdual-ITR-inCap6质粒、pFastbacdual-ITR-EGFP质粒和pFastbacdual-inrep质粒。
优选的是，所述步骤2)中，分别利用步骤1)得到的三种质粒，按以下步骤分别制备三种重组Bacmid：
2-1)在冰上缓慢融化100μL DH10Bac感受态细胞于容器中；
2-2)向上述容器中加入50ng步骤1)获得的三种质粒中的一种，轻轻混匀；
2-3)将容器在冰上放置30min，42℃热休克90s，立即转入冰上放置2min；
2-4)再向容器中加入900μL SOC培养基，37℃225rpm离心4h，取沉淀，重悬得到菌液；
2-5)在含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet的预制的90mm琼脂板中央滴加40μL浓度为20mg/mL的Blue-gal和7μL浓度为200mg/mL的IPTG，得到琼脂培养板；然后使用无菌涂布器将步骤2-4)获得的菌液分散涂布于琼脂培养板整个表面，于室温孵育直至全部液体消失；
2-6)将步骤2-5)获得的细胞用SOC培养基按10倍梯度稀释细胞得到若干组细胞悬浮液，每个梯度取100μL涂布在新的琼脂培养板上，在37℃放置48h；
2-7)挑取若干个白斑，蘸取到新的琼脂培养板上，37℃过夜；接种到LB液体培养基中，LB液体培养基含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet；
2-8)4℃放置过夜；
2-9)对白斑进行PCR鉴定，以判断是否为重组Bacmid菌种；
2-10)取出鉴定正确的重组Bacmid菌种，按照1:300的比例接种于3mL LB液体培养基中摇菌12h；再然后按照1:100的比例接种于150mL LB液体培养基中摇菌16h；然后采用质粒提取试剂盒抽提重组Bacmid，以备转染细胞制备杆状病毒。
优选的是，所述步骤2-9)中，PCR鉴定重组Bacmid菌种采用的引物对为：
上游引物：5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’，
下游引物：5’-GCT CTA GAT TAC TTG TAC AGC TCG TCC AT-3’。
优选的是，所述步骤3)具体包括：
3-1)培养Sf9细胞；
3-2)确保细胞密度在1.5～2.5×106cells/mL时，加2mL无抗生素和血清的Grace培养基到六孔板中，然后接种8×105cells/mL步骤1)得到中的Sf9细胞到该六孔板中，让细胞室温贴壁15min；
3-3)配制转染试剂：
a)将步骤2)得到的重组Bacmid在70℃水浴里面温浴20min，12000g离心10min取上清液；
b)取5μL步骤a)得到的上清液加入到95μL不含抗生素和血清的Grace培养基中，轻轻混匀；
c)混匀cellfectinⅡ，加入8μL cellfectinⅡ到92μL不含抗生素和血清的Grace培养基中，涡旋混匀；
d)将步骤b)和c)得到的两溶液混匀，室温孵育30min，得到DNA-Lipid混合物；
3-4)滴加上述步骤d)得到的DNA-Lipid混合物到步骤3-2)制备的铺有Sf9细胞的六孔板的孔中，27℃孵育细胞5h；
3-5)移去六孔板中的培养基，换2mL完全培养基；
3-6)在27℃孵育72h，观察杆状病毒感染迹象；
3-7)分离P1:证实细胞处于晚期感染阶段后，每孔收集2mL含杆状病毒的培养基到无菌的15mL离心管中，1000g离心5min去除细胞碎片；上清经0.22μm滤器过滤到无菌的15mL离心管中，得到P1，4℃避光保存；
3-8)利用P1扩增杆状病毒，备用。
优选的是，所述步骤3-8)具体包括：
3-8-1)将Sf9细胞按2×106cells/孔铺六孔板中；
3-8-2)每孔加入适量的由步骤3-7)制得的P1，27℃培养48h～72h；
3-8-3)每孔收集2mL含杆状病毒的培养基于无菌的15mL离心管中，1000g离心5min；
3-8-4)转移上清到无菌的15mL离心管中，该病毒上清为扩增后得到的P2，4℃避光保存，备用。
优选的是，所述步骤4)具体包括：
通过上述步骤1)-3)得到了三种杆状病毒，将三种杆状病毒共同感染昆虫细胞Sf9，包装获得重组rAAV病毒，然后采用CsCl密度梯度离心的方法纯化；
采用荧光定量PCR检测重组rAAV病毒的滴度，采用SDS-PAGE检测重组rAAV病毒的纯度。
优选的是，所述步骤5)具体包括：
5-1)配制染料木黄铜试剂：称取25mg染料木黄铜溶于92ul的DMSO中，保存备用；
5-2)采用PBMC分离方法制备PBMC细胞；
5-3)T淋巴细胞培养：
将步骤5-2)制得的PBMC细胞用RPMI-1640细胞培养基重悬于T25培养瓶中，置于37℃5％CO2恒温培养箱，隔48h全量换液，培养得到T淋巴细胞，备用；
其中，RPMI-1640细胞培养基中包括质量分数为10％胎牛血清、质量分数1％的青霉素和链霉素双抗，以及浓度为50ng/ml的OKT3、50ng/ml的CD28、300u/ml的IL-2；
5-4)将步骤5-1)得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3)得到的T淋巴细胞共孵育2h，然后用完全培养基洗涤两次，最后用步骤4)得到的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞，培养72h。
本发明的有益效果是：本发明提供的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，通过利用染料木黄铜(Genistein)的酪氨酸激酶抑制剂的特点，将其与AAV介导的基因治疗联合起来使用，显著提高了AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达效果。
附图说明
图1为本发明的实施例1中的SDS-PAGE电泳检测rAAV纯度的结果；
图2为本发明的实施例2中的不同染料木黄铜试剂浓度下，促进AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达的荧光显微镜观察结果；
图3为本发明的实施例2中的不同染料木黄铜试剂浓度下，促进AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达的流式分析结果；
图4为本发明的实施例3中的不同染料木黄铜试剂处理时间下，对AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达的荧光显微镜观察结果；
图5为本发明的实施例3中的不同染料木黄铜试剂处理时间下，对AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达的流式分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例提供了一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备重组质粒；
2)利用步骤1)得到的重组质粒制备重组Bacmid；
3)利用步骤2)得到的重组Bacmid制备杆状病毒；
4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒，然后进行纯化；
5)在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育，然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。
染料木黄铜(Genistein)是一种大豆来源的异黄酮和植物雌激素，具有抗肿瘤活性。同时还是一种酪氨酸激酶抑制剂，可以明显的抑制酪氨酸激酶的活性，本发明基于染料木黄铜的特性，提供的方法有效提高了AAV介导的基因表达效率。
以下提供更为具体的实施例，以对本发明做进一步说明。
实施例1
一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：
1、制备重组质粒
分别制备pFastbacdual-ITR-inCap6质粒、pFastbacdual-ITR-EGFP质粒和pFastbacdual-inrep质粒：
A.pFastbacdual-ITR-inCap6的制备
质粒包含AAV2 cap基因、intron序列，其表达受pFastbacdual质粒载体上的p10启动子和HSV tk polyA元件调控，由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术，本实施例中按照以下方法获得：参考文献：李泰明等，昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体，生物工程学报，2015,31(8)，1232页，1.2.2方法中的“构建pFastBacdual-incap质粒”。
B.pFastbacdual-ITR-EGFP的制备
pFastbacdual-ITR-EGFP质粒包含AAV2的两个ITR和CMV启动子、beta-globin内含子、编码EGFP基因、hGH polyA序列，由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术，本实施例中按照以下方法获得：参考文献：李泰明等，昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体，生物工程学报，2015,31(8)，1232页，1.2.1方法中的“构建pFastBacdual-ITR-EGFP质粒”。
C.pFastbacdual-inrep质粒的制备
pFastbacdual-inrep质粒包含AAV2 rep基因、intron序列，其表达受pFastbacdual质粒载体上的p10启动子和HSV tk polyA元件调控，由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术，本实施例中按照以下方法获得：参考文献：李泰明等，昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体，生物工程学报，2015,31(8)，1232页，1.2.2方法中的“构建pFastBacdual-inrep质粒”。
2、利用步骤1得到的重组质粒制备重组Bacmid；
分别利用步骤1)得到的三种质粒，按以下步骤分别制备三种重组Bacmid：
2-1)在冰上缓慢融化100μL DH10Bac感受态细胞于容器中；
2-2)向上述容器中加入50ng步骤1)获得的三种质粒中的一种，轻轻混匀；
2-3)将容器在冰上放置30min，42℃热休克90s，立即转入冰上放置2min；
2-4)再向容器中加入900μL SOC培养基，37℃225rpm离心4h，取沉淀，重悬得到菌液；
2-5)在含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet的预制的90mm琼脂板中央滴加40μL浓度为20mg/mL的Blue-gal和7μL浓度为200mg/mL的IPTG，得到琼脂培养板；然后使用无菌涂布器将步骤2-4)获得的菌液分散涂布于琼脂培养板整个表面，于室温孵育直至全部液体消失；
2-6)将步骤2-5)获得的细胞用SOC培养基按10倍梯度稀释细胞得到若干组细胞悬浮液(10-1，10-2，10-3)，每个梯度取100μL涂布在新的琼脂培养板(同步骤2-5制备的琼脂培养板)上，在37℃放置48h；
2-7)挑取10个白斑，蘸取到新的琼脂培养板同步骤2-5制备的琼脂培养板)上，37℃过夜；接种到LB液体培养基中，进行显色反应，LB液体培养基含50μg/mL Kan、7μg/mLGen、10μg/mL Tet；
2-8)4℃放置过夜，使蓝色在这一期间充分显色；
2-9)对白斑进行PCR鉴定，以判断是否为重组Bacmid菌种；
在一种实施例中，该步骤2-9)中，使用OMEGA试剂盒抽提分离重组的杆粒DNA，实验方法参照试剂盒说明书，测量杆粒浓度后分装后冻于–20℃，避免反复冻融；PCR鉴定重组Bacmid菌种采用的引物对为：
上游引物：5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’，
下游引物：5’-GCT CTA GAT TAC TTG TAC AGC TCG TCC AT-3’。
2-10)取出鉴定正确的重组Bacmid菌种，按照1:300的比例接种于3mL LB液体培养基中摇菌12h；再然后按照1:100的比例接种于150mL LB液体培养基中摇菌16h；然后采用大型/大量质粒提取试剂盒抽提重组Bacmid，以备转染细胞制备杆状病毒。
3、利用步骤2得到的重组Bacmid制备杆状病毒；
3-1)培养Sf9细胞：Sf9细胞提前一天铺六孔板，50％的孔密度，使用完全培养基，95％存活度；
3-2)确保细胞密度在1.5～2.5×106cells/mL时，加2mL无抗生素和血清的Grace培养基到六孔板中，然后接种8×105cells/mL步骤1)得到中的Sf9细胞到该六孔板中，让细胞室温贴壁15min；
3-3)配制转染试剂：
a)将步骤2)得到的重组Bacmid在70℃水浴里面温浴20min，12000g离心10min取上清液；
b)取5μL步骤a)得到的上清液(杆状病毒质粒浓度500ng/μL，保证杆状病毒质粒的量为2～3μg)加入到95μL不含抗生素和血清的Grace培养基中，轻轻混匀；
c)混匀cellfectinⅡ，加入8μL cellfectinⅡ到92μL不含抗生素和血清的Grace培养基中，涡旋混匀；
d)将步骤b)和c)得到的两溶液混匀，室温孵育30min，得到DNA-Lipid混合物；
3-4)滴加上述步骤d)得到的DNA-Lipid混合物到步骤3-2)制备的铺有Sf9细胞的六孔板的孔中，27℃孵育细胞5h；
3-5)移去六孔板中的培养基，换2mL完全培养基；
3-6)在27℃孵育72h，观察杆状病毒感染迹象；
3-7)分离P1:证实细胞处于晚期感染阶段后，每孔收集2mL含杆状病毒的培养基到无菌的15mL离心管中，1000g离心5min去除细胞碎片；上清经0.22μm滤器过滤到无菌的15mL离心管中，得到P1，4℃避光保存；若想长期保存，分装冻于–80℃；
3-8)利用P1扩增杆状病毒，备用。
3-8-1)将Sf9细胞按2×106cells/孔铺六孔板中；室温放置1h使其贴附，显微镜下观察；
3-8-2)每孔加入适量的由步骤3-7)制得的P1，27℃培养48h～72h；
3-8-3)每孔收集2mL含杆状病毒的培养基于无菌的15mL离心管中，1000g离心5min；
3-8-4)转移上清到无菌的15mL离心管中，该病毒上清为扩增后得到的P2，4℃避光保存，备用；若想长期保存，分装冻于–80℃。
再按上述方法扩增得到P3(通常得到的P1病毒滴度在1×106～1×107之间，P2滴度在1×107～1×108之间)。
本实施例中，采用噬菌斑法测定病毒滴度，详细实验步骤如下：
(1)按2mL/孔细胞(5×105cells/mL)种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度；
(2)将4％agarose gel放入70℃水浴锅融解，将2×Grace与一个100mL无菌瓶放入40℃水浴锅预热；
(3)将杆状病毒用无血清supplemented Grace进行梯度稀释：10-1～10-8；
(4)弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1mL/孔(复孔)室温孵育1h。
(5)配置上层琼脂：加20mL高温灭活FBS到2×Grace 100mL培养基中，然后从该2×Grace 100mL培养基中，然后从该培养基中取25mL加入到至预热的100mL无菌瓶，无菌瓶再加入12.5mL无菌水、12.5mL 4％agarose gel，轻轻混匀，得到上层琼脂，放入37℃水浴锅备用；
(6)弃6孔板内上清，快速加2mL上层琼脂，以防菌层干燥，静置10～20min使其凝固；将6孔板放入27℃培养箱，培养5天；
(7)配制1mg/mL中性红溶液，在Grace完全培养基中，无菌过滤。
(8)将1.5mL的中性红溶液、16.5mL Grace完全培养基、6mL 4％的琼脂配制成中性红上层琼脂；
(9)在病毒感染4天后，加1mL中性红上层琼脂；
(10)继续放到培养箱中，4～5天后即可观察噬菌斑，计数噬菌斑的数量，求得病毒滴度。注：病毒滴度(pfu/mL)＝1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积
4、利用步骤3得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒，然后进行纯化：
通过上述步骤1-3得到了三种杆状病毒，将三种杆状病毒共同感染昆虫细胞Sf9，包装获得重组rAAV病毒，然后采用CsCl密度梯度离心的方法纯化，得到高浓度的重组rAAV病毒；
采用荧光定量PCR检测重组rAAV病毒的滴度；
采用SDS-PAGE检测重组rAAV病毒的纯度，检测结果如图1所示，其中，A为：rAAV6-CMV-EGFP；B为：rAAV6-S663L-CMV-EGFP；C为：rAAV6-S663L-GFAP-EGFP。
5、在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育，然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。
具体包括：
5-1)配制染料木黄铜(Genistein)试剂：称取25mg染料木黄铜溶于92ul的DMSO中，保存备用；
5-2)采用PBMC分离方法制备PBMC细胞；
本实施例中，具体方法为：
取新鲜抗凝全血(EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可)或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血；
在离心管中加入适量分离液(当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；当稀释后血液体积大于等于3mL，加入等体积分离液，但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果)，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰(可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象)；
室温，水平转子500～1000g，离心20～30min(血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，离心转速最大不超过1200g)；离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞；
小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，用10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞；250g，离心10min；弃上清，用5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min；弃上清，细胞重悬，得到PBMC细胞，备用。
5-3)T淋巴细胞培养：
将步骤5-2)制得的PBMC细胞用RPMI-1640细胞培养基重悬于T25培养瓶中，置于37℃5％CO2恒温培养箱，隔48h全量换液，培养得到T淋巴细胞，备用；
其中，RPMI-1640细胞培养基中包括质量分数为10％胎牛血清、质量分数1％的青霉素和链霉素双抗，以及浓度为50ng/ml的OKT3、50ng/ml的CD28、300u/ml的IL-2；
5-4)将步骤5-1)得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3)得到的T淋巴细胞共孵育2h，然后用完全培养基洗涤两次，最后用步骤4)得到的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞，培养72h。
72h后利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达情况。
利用流式细胞仪分析EGFP荧光表达百分比和强度：流式细胞分析时细胞处理方法如下：
1)直接吸取细胞，250g离心5min，收集细胞；
2)用PBS洗涤两次，去上清；
3)EP管中加入500ul PBS，轻轻贴壁吹打润洗细胞后将细胞液转入流式管中，准备上机分析。
通过荧光显微镜观察和流式分析发现，染料木黄铜(Genistein)促进了AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达。
实施例2
不同染料木黄铜(Genistein)试剂浓度下，AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达实验。
设置不同的染料木黄铜(Genistein)试剂浓度(0.03um,0.1um,0.3um,0.5um)，按上述所述转染方法将T淋巴细胞先用不同浓度的染料木黄铜(Genistein)试剂处理2h，然后用重组rAAV病毒转染细胞，72h后利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达情况，利用流式细胞仪分析EGFP荧光表达百分比，调控结果与单转染AAV的结果比较。
参照图2和图3，通过荧光显微镜观察和流式分析发现，在试剂低浓度时(0.03um)，增强效果就已经很明显说明，在浓度达到0.1um时达到最高。说明染料木黄铜(Genistein)试剂可以促进AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达。超过0.1um时，表达受到抑制，主要是由于染料木黄铜具有一定的毒性。图2和图3中，AAV-EGFP为单转染AAV的结果(未采用染料木黄铜)。
实施例3
不同染料木黄铜(Genistein)试剂处理时间下，AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达实验。
设置不同的染料木黄铜(Genistein)试剂处理细胞的时间(0.5h，1h，2h)，按上述所述转染方法将T淋巴细胞先用染料木黄铜(Genistein)试剂处理不同的时间，然后用重组rAAV病毒转染细胞，72h后利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达情况，利用流式细胞仪分析EGFP荧光表达百分比，调控结果与单转染AAV的结果比较。
参照图4和图5，通过荧光显微镜观察和流式分析发现，在处理时间为0.5h时(0.03um)，增强效果不是很明显，在处理时间1h时增强效果最明显2h时略有下降。说明染料木黄铜(Genistein)试剂可以促进AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达。超过2h时，表达受到抑制，主要是由于染料木黄铜具有一定的毒性。图4和图5中AAV-EGFP/AAV-EGFP only为单转染AAV的结果(未采用染料木黄铜)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
苏州市中心血站
<120> 利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法
<140> 2020108973620
<141> 2020-08-31
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
cccagtcacg acgttgtaaa acg 23
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
gctctagatt acttgtacag ctcgtccat 29
Claims (6)
1.一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)制备重组质粒；
2)利用步骤1)得到的重组质粒制备重组Bacmid；
3)利用步骤2)得到的重组Bacmid制备杆状病毒；
4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒，然后进行纯化；
5)在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育，然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞；
所述步骤1)包括：分别制备pFastbacdual-ITR-inCap6质粒、pFastbacdual-ITR-EGFP质粒和pFastbacdual-inrep质粒；
所述步骤5)具体包括：
5-1)配制染料木黄铜试剂：称取25mg染料木黄铜溶于92ul的DMSO中，保存备用；染料木黄铜试剂浓度为0.1um；
5-2)采用PBMC分离方法制备PBMC细胞；
5-3)T淋巴细胞培养：
将步骤5-2)制得的PBMC细胞用RPMI-1640细胞培养基重悬于T25培养瓶中，置于37℃5％CO2恒温培养箱，隔48h全量换液，培养得到T淋巴细胞，备用；
其中，RPMI-1640细胞培养基中包括质量分数为10％胎牛血清、质量分数1％的青霉素和链霉素双抗，以及浓度为50ng/ml的OKT3、50ng/ml的CD28、300u/ml的IL-2；
5-4)将步骤5-1)得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3)得到的T淋巴细胞共孵育1h，然后用完全培养基洗涤两次，最后用步骤4)得到的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞，培养72h。
2.根据权利要求1所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，其特征在于，所述步骤2)中，分别利用步骤1)得到的三种质粒，按以下步骤分别制备三种重组Bacmid：
2-1)在冰上缓慢融化100μL DH10Bac感受态细胞于容器中；
2-2)向上述容器中加入50ng步骤1)获得的三种质粒中的一种，轻轻混匀；
2-3)将容器在冰上放置30min，42℃热休克90s，立即转入冰上放置2min；
2-4)再向容器中加入900μL SOC培养基，37℃225rpm离心4h，取沉淀，重悬得到菌液；
2-5)在含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet的预制的90mm琼脂板中央滴加40μL浓度为20mg/mL的Blue-gal和7μL浓度为200mg/mL的IPTG，得到琼脂培养板；然后使用无菌涂布器将步骤2-4)获得的菌液分散涂布于琼脂培养板整个表面，于室温孵育直至全部液体消失；
2-6)将步骤2-5)获得的细胞用SOC培养基按10倍梯度稀释细胞得到若干组细胞悬浮液，每个梯度取100μL涂布在新的琼脂培养板上，在37℃放置48h；
2-7)挑取若干个白斑，蘸取到新的琼脂培养板上，37℃过夜；接种到LB液体培养基中，LB液体培养基含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet；
2-8)4℃放置过夜；
2-9)对白斑进行PCR鉴定，以判断是否为重组Bacmid菌种；
2-10)取出鉴定正确的重组Bacmid菌种，按照1:300的比例接种于3mL LB液体培养基中摇菌12h；再然后按照1:100的比例接种于150mL LB液体培养基中摇菌16h；然后采用质粒提取试剂盒抽提重组Bacmid，以备转染细胞制备杆状病毒。
3.根据权利要求2所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，其特征在于，所述步骤2-9)中，PCR鉴定重组Bacmid菌种采用的引物对为：
上游引物：5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’，
下游引物：5’-GCT CTA GAT TAC TTG TAC AGC TCG TCC AT-3’。
4.根据权利要求2所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括：
3-1)培养Sf9细胞；
3-2)确保细胞密度在1.5～2.5×106cells/mL时，加2mL无抗生素和血清的Grace培养基到六孔板中，然后接种8×105cells/mL步骤1)得到中的Sf9细胞到该六孔板中，让细胞室温贴壁15min；
3-3)配制转染试剂：
a)将步骤2)得到的重组Bacmid在70℃水浴里面温浴20min，12000g离心10min取上清液；
b)取5μL步骤a)得到的上清液加入到95μL不含抗生素和血清的Grace培养基中，轻轻混匀；
c)混匀cellfectinⅡ，加入8μL cellfectinⅡ到92μL不含抗生素和血清的Grace培养基中，涡旋混匀；
d)将步骤b)和c)得到的两溶液混匀，室温孵育30min，得到DNA-Lipid混合物；
3-4)滴加上述步骤d)得到的DNA-Lipid混合物到步骤3-2)制备的铺有Sf9细胞的六孔板的孔中，27℃孵育细胞5h；
3-5)移去六孔板中的培养基，换2mL完全培养基；
3-6)在27℃孵育72h，观察杆状病毒感染迹象；
3-7)分离P1:证实细胞处于晚期感染阶段后，每孔收集2mL含杆状病毒的培养基到无菌的15mL离心管中，1000g离心5min去除细胞碎片；上清经0.22μm滤器过滤到无菌的15mL离心管中，得到P1，4℃避光保存；
3-8)利用P1扩增杆状病毒，备用。
5.根据权利要求4所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，其特征在于，所述步骤3-8)具体包括：
3-8-1)将Sf9细胞按2×106cells/孔铺六孔板中；
3-8-2)每孔加入适量的由步骤3-7)制得的P1，27℃培养48h～72h；
3-8-3)每孔收集2mL含杆状病毒的培养基于无菌的15mL离心管中，1000g离心5min；
3-8-4)转移上清到无菌的15mL离心管中，该病毒上清为扩增后得到的P2，4℃避光保存，备用。
6.根据权利要求5所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括：
通过上述步骤1)-3)得到了三种杆状病毒，将三种杆状病毒共同感染昆虫细胞Sf9，包装获得重组rAAV病毒，然后采用CsCl密度梯度离心的方法纯化；
采用荧光定量PCR检测重组rAAV病毒的滴度，采用SDS-PAGE检测重组rAAV病毒的纯度。
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