CN114107391A - 利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,该方法包括以下步骤:1)制备重组质粒;2)制备重组Bacmid;3)利用步骤2)得到的重组Bacmid制备杆状病毒;4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒,然后进行纯化;5)在染料木黄铜的促进作用下,利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞:先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育,然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。本发明通过利用染料木黄铜(Genistein)的酪氨酸激酶抑制剂的特点,将其与AAV介导的基因治疗联合起来使用,显著提高了AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法。
背景技术
细胞治疗作为癌症治疗的新型手段,已经显示出其独有的优势和特点。免疫细胞作为细胞治疗的重要功能细胞,包括淋巴细胞、抗原提呈细胞、粒细胞以及其他参与免疫应答和效应的细胞。在2017年,美国食品药品监督管理局(FDA),批准了两个CAR-T细胞产品上市,使得T淋巴细胞成为细胞治疗药物的热点目标改造细胞。T淋巴细胞作为主要免疫细胞,可以识别APC提呈的相关抗原,进而活化和增值,最终分化为效应细胞,杀伤表达特异性抗原的靶细胞。嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法,是指通过基因编辑手段,人工使T淋巴细胞携带一个可以识别靶细胞的抗原,进而可以高效特异性的杀伤和识别目标细胞。
腺相关病毒(AAV),目前作为对T淋巴细胞进行基因编辑的主要载体之一,如何提高AAV对T淋巴细胞的编辑效率,一直是科学家关注的方向。AAV来源于细小病毒,具有自然缺陷、无包被和无致病原性等特点。其基因组是由一个4680个核苷酸,线性、单链DNA(ssDNA)分子组成,在每个末端含有一个145个碱基组成的末端重复序列(ITR)。然而,大多数AAV对T细胞的转导效率都极低,目前研究发现AAV6对T细胞有相对高的趋向性,但也需要比较高的感染复数(MOI)才能获得有效转导。当AAV进入T细胞后,会受到酪氨酸激酶的影响,抑制其第二条链的合成,最终影响目的蛋白的表达,所以,AAV对T细胞相对低下的转导效率限制了其在T细胞免疫治疗中的应用。
所以,显著亟需一种能提高AAV介导的基因在T淋巴细胞中表达的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足,提供一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,该方法包括以下步骤:
1)制备重组质粒;
2)利用步骤1)得到的重组质粒制备重组Bacmid;
3)利用步骤2)得到的重组Bacmid制备杆状病毒;
4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒,然后进行纯化;
5)在染料木黄铜的促进作用下,利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞:先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育,然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。
优选的是,所述步骤1)包括:分别制备pFastbacdual-ITR-inCap6质粒、pFastbacdual-ITR-EGFP质粒和pFastbacdual-inrep质粒。
优选的是,所述步骤2)中,分别利用步骤1)得到的三种质粒,按以下步骤分别制备三种重组Bacmid:
2-1)在冰上缓慢融化100μL DH10Bac感受态细胞于容器中;
2-2)向上述容器中加入50ng步骤1)获得的三种质粒中的一种,轻轻混匀;
2-3)将容器在冰上放置30min,42℃热休克90s,立即转入冰上放置2min;
2-4)再向容器中加入900μL SOC培养基,37℃225rpm离心4h,取沉淀,重悬得到菌液;
2-5)在含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet的预制的90mm琼脂板中央滴加40μL浓度为20mg/mL的Blue-gal和7μL浓度为200mg/mL的IPTG,得到琼脂培养板;然后使用无菌涂布器将步骤2-4)获得的菌液分散涂布于琼脂培养板整个表面,于室温孵育直至全部液体消失;
2-6)将步骤2-5)获得的细胞用SOC培养基按10倍梯度稀释细胞得到若干组细胞悬浮液,每个梯度取100μL涂布在新的琼脂培养板上,在37℃放置48h;
2-7)挑取若干个白斑,蘸取到新的琼脂培养板上,37℃过夜;接种到LB液体培养基中,LB液体培养基含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet;
2-8)4℃放置过夜;
2-9)对白斑进行PCR鉴定,以判断是否为重组Bacmid菌种;
2-10)取出鉴定正确的重组Bacmid菌种,按照1:300的比例接种于3mL LB液体培养基中摇菌12h;再然后按照1:100的比例接种于150mL LB液体培养基中摇菌16h;然后采用质粒提取试剂盒抽提重组Bacmid,以备转染细胞制备杆状病毒。
优选的是,所述步骤2-9)中,PCR鉴定重组Bacmid菌种采用的引物对为:
上游引物:5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’,
下游引物:5’-GCT CTA GAT TAC TTG TAC AGC TCG TCC AT-3’。
优选的是,所述步骤3)具体包括:
3-1)培养Sf9细胞;
3-2)确保细胞密度在1.5~2.5×106cells/mL时,加2mL无抗生素和血清的Grace培养基到六孔板中,然后接种8×105cells/mL步骤1)得到中的Sf9细胞到该六孔板中,让细胞室温贴壁15min;
3-3)配制转染试剂:
a)将步骤2)得到的重组Bacmid在70℃水浴里面温浴20min,12000g离心10min取上清液;
b)取5μL步骤a)得到的上清液加入到95μL不含抗生素和血清的Grace培养基中,轻轻混匀;
c)混匀cellfectinⅡ,加入8μL cellfectinⅡ到92μL不含抗生素和血清的Grace培养基中,涡旋混匀;
d)将步骤b)和c)得到的两溶液混匀,室温孵育30min,得到DNA-Lipid混合物;
3-4)滴加上述步骤d)得到的DNA-Lipid混合物到步骤3-2)制备的铺有Sf9细胞的六孔板的孔中,27℃孵育细胞5h;
3-5)移去六孔板中的培养基,换2mL完全培养基;
3-6)在27℃孵育72h,观察杆状病毒感染迹象;
3-7)分离P1:证实细胞处于晚期感染阶段后,每孔收集2mL含杆状病毒的培养基到无菌的15mL离心管中,1000g离心5min去除细胞碎片;上清经0.22μm滤器过滤到无菌的15mL离心管中,得到P1,4℃避光保存;
3-8)利用P1扩增杆状病毒,备用。
优选的是,所述步骤3-8)具体包括:
3-8-1)将Sf9细胞按2×106cells/孔铺六孔板中;
3-8-2)每孔加入适量的由步骤3-7)制得的P1,27℃培养48h~72h;
3-8-3)每孔收集2mL含杆状病毒的培养基于无菌的15mL离心管中,1000g离心5min;
3-8-4)转移上清到无菌的15mL离心管中,该病毒上清为扩增后得到的P2,4℃避光保存,备用。
优选的是,所述步骤4)具体包括:
通过上述步骤1)-3)得到了三种杆状病毒,将三种杆状病毒共同感染昆虫细胞Sf9,包装获得重组rAAV病毒,然后采用CsCl密度梯度离心的方法纯化;
采用荧光定量PCR检测重组rAAV病毒的滴度,采用SDS-PAGE检测重组rAAV病毒的纯度。
优选的是,所述步骤5)具体包括:
5-1)配制染料木黄铜试剂:称取25mg染料木黄铜溶于92ul的DMSO中,保存备用;
5-2)采用PBMC分离方法制备PBMC细胞;
5-3)T淋巴细胞培养:
将步骤5-2)制得的PBMC细胞用RPMI-1640细胞培养基重悬于T25培养瓶中,置于37℃5%CO2恒温培养箱,隔48h全量换液,培养得到T淋巴细胞,备用;
其中,RPMI-1640细胞培养基中包括质量分数为10%胎牛血清、质量分数1%的青霉素和链霉素双抗,以及浓度为50ng/ml的OKT3、50ng/ml的CD28、300u/ml的IL-2;
5-4)将步骤5-1)得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3)得到的T淋巴细胞共孵育2h,然后用完全培养基洗涤两次,最后用步骤4)得到的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞,培养72h。
本发明的有益效果是:本发明提供的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,通过利用染料木黄铜(Genistein)的酪氨酸激酶抑制剂的特点,将其与AAV介导的基因治疗联合起来使用,显著提高了AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达效果。
附图说明
图1为本发明的实施例1中的SDS-PAGE电泳检测rAAV纯度的结果;
图2为本发明的实施例2中的不同染料木黄铜试剂浓度下,促进AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达的荧光显微镜观察结果;
图3为本发明的实施例2中的不同染料木黄铜试剂浓度下,促进AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达的流式分析结果;
图4为本发明的实施例3中的不同染料木黄铜试剂处理时间下,对AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达的荧光显微镜观察结果;
图5为本发明的实施例3中的不同染料木黄铜试剂处理时间下,对AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达的流式分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例提供了一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,该方法包括以下步骤:
1)制备重组质粒;
2)利用步骤1)得到的重组质粒制备重组Bacmid;
3)利用步骤2)得到的重组Bacmid制备杆状病毒;
4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒,然后进行纯化;
5)在染料木黄铜的促进作用下,利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞:先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育,然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。
染料木黄铜(Genistein)是一种大豆来源的异黄酮和植物雌激素,具有抗肿瘤活性。同时还是一种酪氨酸激酶抑制剂,可以明显的抑制酪氨酸激酶的活性,本发明基于染料木黄铜的特性,提供的方法有效提高了AAV介导的基因表达效率。
以下提供更为具体的实施例,以对本发明做进一步说明。
实施例1
一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,该方法包括以下步骤:
1、制备重组质粒
分别制备pFastbacdual-ITR-inCap6质粒、pFastbacdual-ITR-EGFP质粒和pFastbacdual-inrep质粒:
A.pFastbacdual-ITR-inCap6的制备
质粒包含AAV2 cap基因、intron序列,其表达受pFastbacdual质粒载体上的p10启动子和HSV tk polyA元件调控,由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术,本实施例中按照以下方法获得:参考文献:李泰明等,昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体,生物工程学报,2015,31(8),1232页,1.2.2方法中的“构建pFastBacdual-incap质粒”。
B.pFastbacdual-ITR-EGFP的制备
pFastbacdual-ITR-EGFP质粒包含AAV2的两个ITR和CMV启动子、beta-globin内含子、编码EGFP基因、hGH polyA序列,由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术,本实施例中按照以下方法获得:参考文献:李泰明等,昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体,生物工程学报,2015,31(8),1232页,1.2.1方法中的“构建pFastBacdual-ITR-EGFP质粒”。
C.pFastbacdual-inrep质粒的制备
pFastbacdual-inrep质粒包含AAV2 rep基因、intron序列,其表达受pFastbacdual质粒载体上的p10启动子和HSV tk polyA元件调控,由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术,本实施例中按照以下方法获得:参考文献:李泰明等,昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体,生物工程学报,2015,31(8),1232页,1.2.2方法中的“构建pFastBacdual-inrep质粒”。
2、利用步骤1得到的重组质粒制备重组Bacmid;
分别利用步骤1)得到的三种质粒,按以下步骤分别制备三种重组Bacmid:
2-1)在冰上缓慢融化100μL DH10Bac感受态细胞于容器中;
2-2)向上述容器中加入50ng步骤1)获得的三种质粒中的一种,轻轻混匀;
2-3)将容器在冰上放置30min,42℃热休克90s,立即转入冰上放置2min;
2-4)再向容器中加入900μL SOC培养基,37℃225rpm离心4h,取沉淀,重悬得到菌液;
2-5)在含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet的预制的90mm琼脂板中央滴加40μL浓度为20mg/mL的Blue-gal和7μL浓度为200mg/mL的IPTG,得到琼脂培养板;然后使用无菌涂布器将步骤2-4)获得的菌液分散涂布于琼脂培养板整个表面,于室温孵育直至全部液体消失;
2-6)将步骤2-5)获得的细胞用SOC培养基按10倍梯度稀释细胞得到若干组细胞悬浮液(10-1,10-2,10-3),每个梯度取100μL涂布在新的琼脂培养板(同步骤2-5制备的琼脂培养板)上,在37℃放置48h;
2-7)挑取10个白斑,蘸取到新的琼脂培养板同步骤2-5制备的琼脂培养板)上,37℃过夜;接种到LB液体培养基中,进行显色反应,LB液体培养基含50μg/mL Kan、7μg/mLGen、10μg/mL Tet;
2-8)4℃放置过夜,使蓝色在这一期间充分显色;
2-9)对白斑进行PCR鉴定,以判断是否为重组Bacmid菌种;
在一种实施例中,该步骤2-9)中,使用OMEGA试剂盒抽提分离重组的杆粒DNA,实验方法参照试剂盒说明书,测量杆粒浓度后分装后冻于–20℃,避免反复冻融;PCR鉴定重组Bacmid菌种采用的引物对为:
上游引物:5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’,
下游引物:5’-GCT CTA GAT TAC TTG TAC AGC TCG TCC AT-3’。
2-10)取出鉴定正确的重组Bacmid菌种,按照1:300的比例接种于3mL LB液体培养基中摇菌12h;再然后按照1:100的比例接种于150mL LB液体培养基中摇菌16h;然后采用大型/大量质粒提取试剂盒抽提重组Bacmid,以备转染细胞制备杆状病毒。
3、利用步骤2得到的重组Bacmid制备杆状病毒;
3-1)培养Sf9细胞:Sf9细胞提前一天铺六孔板,50%的孔密度,使用完全培养基,95%存活度;
3-2)确保细胞密度在1.5~2.5×106cells/mL时,加2mL无抗生素和血清的Grace培养基到六孔板中,然后接种8×105cells/mL步骤1)得到中的Sf9细胞到该六孔板中,让细胞室温贴壁15min;
3-3)配制转染试剂:
a)将步骤2)得到的重组Bacmid在70℃水浴里面温浴20min,12000g离心10min取上清液;
b)取5μL步骤a)得到的上清液(杆状病毒质粒浓度500ng/μL,保证杆状病毒质粒的量为2~3μg)加入到95μL不含抗生素和血清的Grace培养基中,轻轻混匀;
c)混匀cellfectinⅡ,加入8μL cellfectinⅡ到92μL不含抗生素和血清的Grace培养基中,涡旋混匀;
d)将步骤b)和c)得到的两溶液混匀,室温孵育30min,得到DNA-Lipid混合物;
3-4)滴加上述步骤d)得到的DNA-Lipid混合物到步骤3-2)制备的铺有Sf9细胞的六孔板的孔中,27℃孵育细胞5h;
3-5)移去六孔板中的培养基,换2mL完全培养基;
3-6)在27℃孵育72h,观察杆状病毒感染迹象;
3-7)分离P1:证实细胞处于晚期感染阶段后,每孔收集2mL含杆状病毒的培养基到无菌的15mL离心管中,1000g离心5min去除细胞碎片;上清经0.22μm滤器过滤到无菌的15mL离心管中,得到P1,4℃避光保存;若想长期保存,分装冻于–80℃;
3-8)利用P1扩增杆状病毒,备用。
3-8-1)将Sf9细胞按2×106cells/孔铺六孔板中;室温放置1h使其贴附,显微镜下观察;
3-8-2)每孔加入适量的由步骤3-7)制得的P1,27℃培养48h~72h;
3-8-3)每孔收集2mL含杆状病毒的培养基于无菌的15mL离心管中,1000g离心5min;
3-8-4)转移上清到无菌的15mL离心管中,该病毒上清为扩增后得到的P2,4℃避光保存,备用;若想长期保存,分装冻于–80℃。
再按上述方法扩增得到P3(通常得到的P1病毒滴度在1×106~1×107之间,P2滴度在1×107~1×108之间)。
本实施例中,采用噬菌斑法测定病毒滴度,详细实验步骤如下:
(1)按2mL/孔细胞(5×105cells/mL)种入6孔板,室温孵育1h使其贴壁,孵育后镜检其贴壁程度;
(2)将4%agarose gel放入70℃水浴锅融解,将2×Grace与一个100mL无菌瓶放入40℃水浴锅预热;
(3)将杆状病毒用无血清supplemented Grace进行梯度稀释:10-1~10-8;
(4)弃6孔板内上清,快速加入稀释好的病毒,1mL/孔(复孔)室温孵育1h。
(5)配置上层琼脂:加20mL高温灭活FBS到2×Grace 100mL培养基中,然后从该2×Grace 100mL培养基中,然后从该培养基中取25mL加入到至预热的100mL无菌瓶,无菌瓶再加入12.5mL无菌水、12.5mL 4%agarose gel,轻轻混匀,得到上层琼脂,放入37℃水浴锅备用;
(6)弃6孔板内上清,快速加2mL上层琼脂,以防菌层干燥,静置10~20min使其凝固;将6孔板放入27℃培养箱,培养5天;
(7)配制1mg/mL中性红溶液,在Grace完全培养基中,无菌过滤。
(8)将1.5mL的中性红溶液、16.5mL Grace完全培养基、6mL 4%的琼脂配制成中性红上层琼脂;
(9)在病毒感染4天后,加1mL中性红上层琼脂;
(10)继续放到培养箱中,4~5天后即可观察噬菌斑,计数噬菌斑的数量,求得病毒滴度。注:病毒滴度(pfu/mL)=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积
4、利用步骤3得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒,然后进行纯化:
通过上述步骤1-3得到了三种杆状病毒,将三种杆状病毒共同感染昆虫细胞Sf9,包装获得重组rAAV病毒,然后采用CsCl密度梯度离心的方法纯化,得到高浓度的重组rAAV病毒;
采用荧光定量PCR检测重组rAAV病毒的滴度;
采用SDS-PAGE检测重组rAAV病毒的纯度,检测结果如图1所示,其中,A为:rAAV6-CMV-EGFP;B为:rAAV6-S663L-CMV-EGFP;C为:rAAV6-S663L-GFAP-EGFP。
5、在染料木黄铜的促进作用下,利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞:先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育,然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。
具体包括:
5-1)配制染料木黄铜(Genistein)试剂:称取25mg染料木黄铜溶于92ul的DMSO中,保存备用;
5-2)采用PBMC分离方法制备PBMC细胞;
本实施例中,具体方法为:
取新鲜抗凝全血(EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可)或者去纤维蛋白血液,用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血;
在离心管中加入适量分离液(当稀释后血液体积小于3mL时,加入3mL分离液;当稀释后血液体积大于等于3mL,加入等体积分离液,但二者的总体积不能超过离心管的三分之二,否则会影响分离效果),将稀释后的血液平铺到分离液液面上方,注意保持两液面界面清晰(可以使用巴氏德吸管吸取血液,然后将血液小心的平铺于分离液上,因为两者的密度差异,将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长,在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象);
室温,水平转子500~1000g,离心20~30min(血液的体积越大所需的离心力越大,离心时间越长,离心转速最大不超过1200g);离心后将出现明显的分层:最上层是稀释的血浆层,中间是透明的分离液层,血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层,离心管底部是红细胞与粒细胞;
小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中,用10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞;250g,离心10min;弃上清,用5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞,250g,离心10min;弃上清,细胞重悬,得到PBMC细胞,备用。
5-3)T淋巴细胞培养:
将步骤5-2)制得的PBMC细胞用RPMI-1640细胞培养基重悬于T25培养瓶中,置于37℃5%CO2恒温培养箱,隔48h全量换液,培养得到T淋巴细胞,备用;
其中,RPMI-1640细胞培养基中包括质量分数为10%胎牛血清、质量分数1%的青霉素和链霉素双抗,以及浓度为50ng/ml的OKT3、50ng/ml的CD28、300u/ml的IL-2;
5-4)将步骤5-1)得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3)得到的T淋巴细胞共孵育2h,然后用完全培养基洗涤两次,最后用步骤4)得到的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞,培养72h。
72h后利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达情况。
利用流式细胞仪分析EGFP荧光表达百分比和强度:流式细胞分析时细胞处理方法如下:
1)直接吸取细胞,250g离心5min,收集细胞;
2)用PBS洗涤两次,去上清;
3)EP管中加入500ul PBS,轻轻贴壁吹打润洗细胞后将细胞液转入流式管中,准备上机分析。
通过荧光显微镜观察和流式分析发现,染料木黄铜(Genistein)促进了AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达。
实施例2
不同染料木黄铜(Genistein)试剂浓度下,AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达实验。
设置不同的染料木黄铜(Genistein)试剂浓度(0.03um,0.1um,,0.3um,0.5um),按上述所述转染方法将T淋巴细胞先用不同浓度的染料木黄铜(Genistein)试剂处理2h,然后用重组rAAV病毒转染细胞,72h后利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达情况,利用流式细胞仪分析EGFP荧光表达百分比,调控结果与单转染AAV的结果比较。
参照图2和图3,通过荧光显微镜观察和流式分析发现,在试剂低浓度时(0.03um),增强效果就已经很明显说明,在浓度达到0.1um时达到最高。说明染料木黄铜(Genistein)试剂可以促进AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达。超过0.1um时,表达受到抑制,主要是由于染料木黄铜具有一定的毒性。图2和图3中,AAV-EGFP为单转染AAV的结果(未采用染料木黄铜)。
实施例3
不同染料木黄铜(Genistein)试剂处理时间下,AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达实验。
设置不同的染料木黄铜(Genistein)试剂处理细胞的时间(0.5h,1h,2h),按上述所述转染方法将T淋巴细胞先用染料木黄铜(Genistein)试剂处理不同的时间,然后用重组rAAV病毒转染细胞,72h后利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达情况,利用流式细胞仪分析EGFP荧光表达百分比,调控结果与单转染AAV的结果比较。
参照图4和图5,通过荧光显微镜观察和流式分析发现,在处理时间为0.5h时(0.03um),增强效果不是很明显,在处理时间1h时增强效果最明显2h时略有下降。说明染料木黄铜(Genistein)试剂可以促进AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达。超过2h时,表达受到抑制,主要是由于染料木黄铜具有一定的毒性。图4和图5中AAV-EGFP/AAV-EGFP only为单转染AAV的结果(未采用染料木黄铜)。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节。
发明名称:利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法
申请人:中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
上游引物:5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’,
下游引物:5’-GCT CTA GAT TAC TTG TAC AGC TCG TCC AT-3’
Claims (8)
1.一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
1)制备重组质粒;
2)利用步骤1)得到的重组质粒制备重组Bacmid;
3)利用步骤2)得到的重组Bacmid制备杆状病毒;
4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒,然后进行纯化;
5)在染料木黄铜的促进作用下,利用步骤4)得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞:先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育,然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,其特征在于,所述步骤1)包括:分别制备pFastbacdual-ITR-inCap6质粒、pFastbacdual-ITR-EGFP质粒和pFastbacdual-inrep质粒。
3.根据权利要求2所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,其特征在于,所述步骤2)中,分别利用步骤1)得到的三种质粒,按以下步骤分别制备三种重组Bacmid:
2-1)在冰上缓慢融化100μL DH10Bac感受态细胞于容器中;
2-2)向上述容器中加入50ng步骤1)获得的三种质粒中的一种,轻轻混匀;
2-3)将容器在冰上放置30min,42℃热休克90s,立即转入冰上放置2min;
2-4)再向容器中加入900μL SOC培养基,37℃225rpm离心4h,取沉淀,重悬得到菌液;
2-5)在含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet的预制的90mm琼脂板中央滴加40μL浓度为20mg/mL的Blue-gal和7μL浓度为200mg/mL的IPTG,得到琼脂培养板;然后使用无菌涂布器将步骤2-4)获得的菌液分散涂布于琼脂培养板整个表面,于室温孵育直至全部液体消失;
2-6)将步骤2-5)获得的细胞用SOC培养基按10倍梯度稀释细胞得到若干组细胞悬浮液,每个梯度取100μL涂布在新的琼脂培养板上,在37℃放置48h;
2-7)挑取若干个白斑,蘸取到新的琼脂培养板上,37℃过夜;接种到LB液体培养基中,LB液体培养基含50μg/mL Kan、7μg/mL Gen、10μg/mL Tet;
2-8)4℃放置过夜;
2-9)对白斑进行PCR鉴定,以判断是否为重组Bacmid菌种;
2-10)取出鉴定正确的重组Bacmid菌种,按照1:300的比例接种于3mL LB液体培养基中摇菌12h;再然后按照1:100的比例接种于150mL LB液体培养基中摇菌16h;然后采用质粒提取试剂盒抽提重组Bacmid,以备转染细胞制备杆状病毒。
4.根据权利要求3所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,其特征在于,所述步骤2-9)中,PCR鉴定重组Bacmid菌种采用的引物对为:
上游引物:5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’,
下游引物:5’-GCT CTA GAT TAC TTG TAC AGC TCG TCC AT-3’。
5.根据权利要求3所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,其特征在于,所述步骤3)具体包括:
3-1)培养Sf9细胞;
3-2)确保细胞密度在1.5~2.5×106cells/mL时,加2mL无抗生素和血清的Grace培养基到六孔板中,然后接种8×105cells/mL步骤1)得到中的Sf9细胞到该六孔板中,让细胞室温贴壁15min;
3-3)配制转染试剂:
a)将步骤2)得到的重组Bacmid在70℃水浴里面温浴20min,12000g离心10min取上清液;
b)取5μL步骤a)得到的上清液加入到95μL不含抗生素和血清的Grace培养基中,轻轻混匀;
c)混匀cellfectinⅡ,加入8μL cellfectinⅡ到92μL不含抗生素和血清的Grace培养基中,涡旋混匀;
d)将步骤b)和c)得到的两溶液混匀,室温孵育30min,得到DNA-Lipid混合物;
3-4)滴加上述步骤d)得到的DNA-Lipid混合物到步骤3-2)制备的铺有Sf9细胞的六孔板的孔中,27℃孵育细胞5h;
3-5)移去六孔板中的培养基,换2mL完全培养基;
3-6)在27℃孵育72h,观察杆状病毒感染迹象;
3-7)分离P1:证实细胞处于晚期感染阶段后,每孔收集2mL含杆状病毒的培养基到无菌的15mL离心管中,1000g离心5min去除细胞碎片;上清经0.22μm滤器过滤到无菌的15mL离心管中,得到P1,4℃避光保存;
3-8)利用P1扩增杆状病毒,备用。
6.根据权利要求5所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,其特征在于,所述步骤3-8)具体包括:
3-8-1)将Sf9细胞按2×106cells/孔铺六孔板中;
3-8-2)每孔加入适量的由步骤3-7)制得的P1,27℃培养48h~72h;
3-8-3)每孔收集2mL含杆状病毒的培养基于无菌的15mL离心管中,1000g离心5min;
3-8-4)转移上清到无菌的15mL离心管中,该病毒上清为扩增后得到的P2,4℃避光保存,备用。
7.根据权利要求6所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,其特征在于,所述步骤4)具体包括:
通过上述步骤1)-3)得到了三种杆状病毒,将三种杆状病毒共同感染昆虫细胞Sf9,包装获得重组rAAV病毒,然后采用CsCl密度梯度离心的方法纯化;
采用荧光定量PCR检测重组rAAV病毒的滴度,采用SDS-PAGE检测重组rAAV病毒的纯度。
8.根据权利要求7所述的利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法,其特征在于,所述步骤5)具体包括:
5-1)配制染料木黄铜试剂:称取25mg染料木黄铜溶于92ul的DMSO中,保存备用;
5-2)采用PBMC分离方法制备PBMC细胞;
5-3)T淋巴细胞培养:
将步骤5-2)制得的PBMC细胞用RPMI-1640细胞培养基重悬于T25培养瓶中,置于37℃5%CO2恒温培养箱,隔48h全量换液,培养得到T淋巴细胞,备用;
其中,RPMI-1640细胞培养基中包括质量分数为10%胎牛血清、质量分数1%的青霉素和链霉素双抗,以及浓度为50ng/ml的OKT3、50ng/ml的CD28、300u/ml的IL-2;
5-4)将步骤5-1)得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3)得到的T淋巴细胞共孵育2h,然后用完全培养基洗涤两次,最后用步骤4)得到的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞,培养72h。
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