CN109134648A - 一种抗体纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种抗体纯化方法，用M1重组蛋白免疫的动物，对重组蛋白质反应度优于天然蛋白质，能够产生性能稳定、抗原效价高的单抗，采用CA‑AS法进行抗体纯化，抗体回收率、抗体活性、抗体纯度等方面存在较大优势，且此法操作简便，可重复使用，生产成本较低。
Description
技术领域
本发明实施例涉及生物制药技术领域，更具体地，涉及一种抗体纯化方法。
背景技术
当代抗体药物的工艺研发是基于基因工程、细胞工程和发酵工程基础之上的，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞作为主要的哺乳动物细胞表达宿主细胞具有遗传背景清晰、具备翻译后加工能力等特点，成为了蛋白质生产的标准工业化细胞株，同样也适合于抗体蛋白的表达。随着细胞悬浮培养技术的发展，使得大规模培养成为可能，而无血清培养基的应用则使得蛋白纯化工艺更为简便，这一切都大大加速了抗体药物的产业化进程，为制备价廉质优的抗体药物奠定了基础。
自首个单克隆抗体制备以来，在Koehler和Milstein的基础上经过近30年的蓬勃发展，单克隆抗体制备技术在生命科学研究以及医学实践方面做出了巨大的贡献，已成为了现代生物技术支柱产业之一。单克隆抗体药物因其靶向特异性，毒副作用低，治疗的高效性等明显优势在肿瘤自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等领域有重要的应用。抗体药物制造工艺从研发时期的细胞株构建、培养基优化、上游细胞培养、下游纯化到最后制剂这五个方面的任何一个环节都对抗体药物有很重要的影响，其中又以下游纯化工艺最为复杂繁琐，下游工艺含有多个步骤，目前常用的的是亲和层析、离子层析和疏水层析串联使用的方法。虽然目前都采用这种模式，但是每个工艺中细小参数的变化都有可能导致巨大的变异。下游层析工艺中除了要除去HCP、残留DNA和二聚体多聚体等杂质之外还要对上游可能引入的病毒进行去除。
抗体药物生产过程中，亲和层析通常用于抗体的捕获阶段，即第一个纯化工艺步骤，从发酵料液中选择性分离出所需抗体，接着用离子交换层析和/或疏水层析和/或混合模式层析，来进一步精纯亲和层析洗脱下来的抗体。就一般工艺而言，亲和层析洗脱得到的样品通常会进行低pH病毒孵育，并且进行下一步层析前都会对低pH孵育的样品进行处理，以达到不同层析方法需要的操作条件。
传统的阴离子层析前样品的处理，一般都是一步调pH，即直接将低pH孵育的样品回调到阴离子层析上样所需的pH范围。但是该方法可能会导致抗体不稳定，生成沉淀从而造成样品的损失，另外对抗体的杂质去除效果不理想，增加阴离子层析吸附杂质的量，对层析填料造成伤害，缩短其寿命。阴离子交换层析主要是去除细菌内毒素、宿主蛋白和DNA杂质等，常规的方法是采用流穿(flow-through)方式，抗体直接通过柱子，而污染物被吸收抗体药物中杂质的存在会导致药效降低，严重的会导致人体死亡。例如：含有内毒素或被内毒素污染的药物进入人体后会引起多种变态反应，如：高烧、休克、甚至死亡。许多抗体，包括IgG和IgM，均会形成聚集物，聚集物的存在会产生和主产品不同的药效，会造成抗药性抗体的形成。残留的宿主细胞蛋白有可能刺激机体发生免疫应答产生相应的抗体，同样会对人体造成伤害。
发明内容
本发明实施例提供了一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种抗体纯化方法。
本发明实施例提供了一种抗体纯化方法，包括：
步骤一、在M1基因SEQ NO.2中插入表达载体pet32a，得到M1重组蛋白，以所述M1重组蛋白为抗原，免疫动物，再进行细胞融合和亚克隆；将上述亚克隆后的细胞扩大培养并注射至小鼠腹腔，7-10日后抽取小鼠体内的腹水，将腹水在–20℃下保存；
步骤二、将腹水置于4℃解冻过夜，取出后4℃条件下，10000×g离心10min，取上清，4℃保存；取腹水，用0.06mol/LpH 4.4醋酸缓冲液稀释3倍，用1mol/L HCl调节pH至4.8；按每毫升稀释腹水加11μl辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h；取出后，4℃条件下，15000×g离心30min，取上清，加入1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调pH至7.2，在冰面操作加入饱和硫酸铵至45％饱和度，静置30min；取出后，10000×g离心30min，弃上清，将沉淀4℃保存；
步骤三、将步骤二中的沉淀淀以0.01mol/LpH 7.2PB溶液A重溶，经Sepharose G-25除盐后，过DEAE阴离子层析柱；以含0.5mol/LNaCl的0.01mol/LpH 7.2PB为洗脱液B，A、B液混合进行线性梯度洗脱，收集蛋白峰；提纯样品保存于–20℃环境中。
进一步的，还包括：
步骤四、采用间接ELISA法检测纯化后抗体效价。
进一步的，在步骤一中，免疫动物在初次免疫后至少加强注射3次。
进一步的，所述载体pet32a为SEQ NO.3。
进一步的，在步骤一中，细胞融合后还包括：
吸取细胞上清100ul/孔进行间接ELISA检测；根据ELISA结果，判断阳性孔；用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。
进一步的，在步骤一种，亚克隆方法包括：
对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆，第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加HT DMEM培养基培养，7天后在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，获取阳性细胞株作为最终制备的单抗细胞，并扩大培养。
本发明实施例提供的一种抗体纯化方法，用M1重组蛋白免疫的动物，对重组蛋白质反应度优于天然蛋白质，能够产生性能稳定、抗原效价高的单抗，采用CA-AS法进行抗体纯化，抗体回收率、抗体活性、抗体纯度等方面存在较大优势，且此法操作简便，可重复使用，生产成本较低。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
流感病毒是一种重要的季节性传染性疾病，历史上的几次大爆发给人类健康和经济造成了巨大的危害和损失。自流感病毒被发现以来，人们就致力于流感病毒的诊断和防控。甲型流感病毒具有高度变异、亚型众多等特点，给其防控带来一定的困难。快速、准确诊断流感可以为正确治疗和防控流感提供时间。准确诊断流感病毒是否感染的的胶体金试纸条，以及检测A型流病毒的抗原ELISA试剂盒，都离不开性能稳定、抗原效价高的流感单抗，国内生物制药公司，就是因为没有好的单抗，所以不能生产好用的流感病毒诊断试剂。
M1由252个氨基酸残基组成，分子量约26KDa,它是病毒的主要结构蛋白，占流感病毒蛋白总量的30％～40％。该蛋白具有型特异性，其抗原性差异是流感病毒分型的依据之一；单克隆抗体被广泛应用于免疫学、药理学、细胞生物学、微生物学、临床疾病的预防、诊断和治疗及畜牧产品违禁限制药物的检测等。其生产方式主要有小鼠体内诱生腹水和杂交瘤细胞体外培养；前者生产成本低，是目前用于体外应用的主要生产方式。但无论哪种方式生产的单抗，均含有大量的杂蛋白，主要包括白蛋白、转铁蛋白、血清白蛋白、α-巨球蛋白、脂类蛋白以及其他宿主蛋白等，不能直接应用于体外。因此需对单抗进行后续的纯化，以达到使用要求。但目前尚没有一种方法能满足不同目的需要，尤其是在规模化制备单克隆抗体问题上显得更为突出。
针对现有技术中的上述缺陷，本发明实施例提供了一种抗体纯化方法，包括：
步骤一、在M1基因SEQ NO.2中插入表达载体pet32a，得到M1重组蛋白，以所述M1重组蛋白为抗原，免疫动物，再进行细胞融合和亚克隆；将上述亚克隆后的细胞扩大培养并注射至小鼠腹腔，7-10日后抽取小鼠体内的腹水，将腹水在–20℃下保存；
步骤二、将腹水置于4℃解冻过夜，取出后4℃条件下，10000×g离心10min，取上清，4℃保存；取腹水，用0.06mol/LpH 4.4醋酸缓冲液稀释3倍，用1mol/L HCl调节pH至4.8；按每毫升稀释腹水加11μl辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h；取出后，4℃条件下，15000×g离心30min，取上清，加入1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调pH至7.2，在冰面操作加入饱和硫酸铵至45％饱和度，静置30min；取出后，10000×g离心30min，弃上清，将沉淀4℃保存；
步骤三、将步骤二中的沉淀淀以0.01mol/LpH 7.2PB溶液A重溶，经Sepharose G-25除盐后，过DEAE阴离子层析柱；以含0.5mol/LNaCl的0.01mol/LpH 7.2PB为洗脱液B，A、B液混合进行线性梯度洗脱，收集蛋白峰；提纯样品保存于–20℃环境中。
进一步的，还包括：
步骤四、采用间接ELISA法检测纯化后抗体效价。
进一步的，在步骤一中，免疫动物在初次免疫后至少加强注射3次。
进一步的，所述载体pet32a为SEQ NO.3。
进一步的，在步骤一中，细胞融合后还包括：
吸取细胞上清100ul/孔进行间接ELISA检测；根据ELISA结果，判断阳性孔；用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。
进一步的，在步骤一种，亚克隆方法包括：
对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆，第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加HT DMEM培养基培养，7天后在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，获取阳性细胞株作为最终制备的单抗细胞，并扩大培养。
本发明实施例提供的一种抗体纯化方法，用M1重组蛋白免疫的动物，对重组蛋白质反应度优于天然蛋白质，能够产生性能稳定、抗原效价高的单抗，采用CA-AS法进行抗体纯化，抗体回收率、抗体活性、抗体纯度等方面存在较大优势，且此法操作简便，可重复使用，生产成本较低。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.一种抗体纯化方法，其特征在于，包括：
步骤一、在M1基因SEQ NO.2中插入表达载体pet32a，得到M1重组蛋白，以所述M1重组蛋白为抗原，免疫动物，再进行细胞融合和亚克隆；将上述亚克隆后的细胞扩大培养并注射至小鼠腹腔，7-10日后抽取小鼠体内的腹水，将腹水在–20℃下保存；
步骤二、将腹水置于4℃解冻过夜，取出后4℃条件下，10000×g离心10min，取上清，4℃保存；取腹水，用0.06mol/LpH4.4醋酸缓冲液稀释3倍，用1mol/L HCl调节pH至4.8；按每毫升稀释腹水加11μl辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h；取出后，4℃条件下，15000×g离心30min，取上清，加入1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调pH至7.2，在冰面操作加入饱和硫酸铵至45％饱和度，静置30min；取出后，10000×g离心30min，弃上清，将沉淀4℃保存；
步骤三、将步骤二中的沉淀淀以0.01mol/L pH 7.2PB溶液A重溶，经Sepharose G-25除盐后，过DEAE阴离子层析柱；以含0.5mol/L NaCl的0.01mol/L pH 7.2PB为洗脱液B，A、B液混合进行线性梯度洗脱，收集蛋白峰；提纯样品保存于–20℃环境中。
2.根据权利要求1中所述抗体纯化方法，其特征在于，还包括：
步骤四、采用间接ELISA法检测纯化后抗体效价。
3.根据权利要求1中所述抗体纯化方法，其特征在于，在步骤一中，免疫动物在初次免疫后至少加强注射3次。
4.根据权利要求1中所述抗体纯化方法，其特征在于，所述载体pet32a为SEQ NO.3。
5.根据权利要求1中所述抗体纯化方法，其特征在于，在步骤一中，细胞融合后还包括：
吸取细胞上清100ul/孔进行间接ELISA检测；根据ELISA结果，判断阳性孔；用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。
6.根据权利要求5中所述抗体纯化方法，其特征在于，在步骤一种，亚克隆方法包括：
对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆，第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加HT DMEM培养基培养，7天后在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，获取阳性细胞株作为最终制备的单抗细胞，并扩大培养。
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