CN105061594A - 一种抗人Oct4单克隆抗体及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学生物工程技术领域，本发明提供了抗人Oct4单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的重组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在用于western？blot和免疫组化检测样本中Oct4的表达和在用于制备肝癌的预后评估制剂中的应用。

Description

一种抗人Oct4单克隆抗体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及医学生物工程技术领域，具体涉及一种抗人Oct4单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的重组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在用于检测样本中Oct4的表达和在用于制备肝癌的预后评估制剂中的应用。

背景技术

Oct4(Octamer-BindingProtein4，又称POU5F1)是维持干细胞多能性与自我更新的重要的转录因子，主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎源性肿瘤中，通过与靶基因的调控区结合，选择性抑制分化基因或促进多能性基因的表达。Oct-4由Pou5F1基因(GeneID：5460)编码，由于差异剪切有多个不同的亚型，分别称为Oct4A(360个氨基酸残基，分子量39kD)、Oct4B(190个氨基酸残基，分子量19kD)和Oct4B1(265个氨基酸残基，分子量30kD)。只有Oct4A可以入核与Oct4调控基因的启动子结合，调控一系列维持干细胞多能性与自我更新的基因的表达。

肿瘤起始细胞(肿瘤干细胞)具有自我更新的能力，对放疗或化疗有更强的耐受能力，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。肝癌中也存在肿瘤起始细胞，并且肿瘤起始细胞的数目与肝癌的化疗抵抗相关(参见文献：YangWetal.OV6+tumor-initiatingcellscontributetotumorprogressionandinvasioninhumanhepatocellularcarcinoma.JHepatol.2012(57):613–620)。但调控肝癌起始细胞的信号通路还不明确。Oct4表达于肝癌起始细胞内，对这些细胞的“干性”具有重要作用，并且癌基因PSMD10可通过WWP2抑制Oct4的降解(参见文献QianY,etal.p28^GANKPreventsDegradationofOct4andPromotesExpansionofTumor-InitiatingCellsinHepatocarcinogenesis.Gastroenterology2012；142:1547-1558)

曾有报道影响肝癌预后的因素主要是肿瘤大小和血管侵犯，并通常伴随肿瘤多发性。目前，越来越多的研究表明预判肝癌的复发尚需发掘其他更为有效的预后因素。以往研究提示肝癌起始细胞在肝癌发生发展中可能发挥了重要作用，但是它如何调控肝癌进程尚不明确，至今未见肝癌干细胞及Oct4的表达水平可直接作为肝癌复发转移的预后判断因素，以及用于肝癌个性化治疗的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人Oct4单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的重组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体的应用。

本发明人根据肝癌起始细胞中Oct4高表达及肝癌中p28^GANK高表达现象，研究了肝癌起始细胞中p28^GANK对Oct4调控的机制，通过实验发现，蛋白p28^GANK能够通过调控Oct4降解酶WWP2的降解促进Oct4在肝癌起始细胞中的积累，并且发现肝癌患者样本中p28^GANK与Oct4的表达与肝癌患者的预后呈明显负相关(参见文献QianY,etal.p28^GANKPreventsDegradationofOct4andPromotesExpansionofTumor-InitiatingCellsinHepatocarcinogenesis.Gastroenterology2012；142:1547-1558)。如果应用Oct4的单克隆抗体检测肝癌患者组织样本中Oct4的表达水平，依据Oct4的表达水平就能对患者的预后作出预判分析；本发明进一步设想，如果用相应单克隆抗体抑制Oct4功能，阻断Oct4的促癌作用，就有可能对那些自身肝脏中Oct4本底表达水平较高的患者起到个性化的治疗效果。进而Oct4的单克隆抗体可以用于肝癌的预后判别以及个性化治疗。

本发明的第一方面，提供了一种用于制备抗人Oct4单克隆抗体的多肽(重组蛋白)，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的。

本发明按照上述氨基酸序列构建了原核表达质粒，在BL21(DE3)中进行表达，纯化后得到了重组蛋白，用于制备Oct4的单克隆抗体。

本发明的第二方面，提供了一种抗人Oct4单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCCNo：C2014205的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCCNo：C2014205。

本发明的杂交瘤细胞株，命名为Hyb-hOct4-138。

本发明的第三方面，提供了一种如上所述的抗人Oct4单克隆抗体(鼠抗人Oct4单克隆抗体)的制备方法，该方法的步骤如下：

a)重组表达如SEQIDNO：1所示的蛋白；

b)将上述蛋白作为免疫原免疫小鼠；

c)取免疫鼠的脾细胞融合；

d)经多轮筛选出合成多肽反应阳性的细胞克隆，作为抗人Oct4单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人Oct4的单克隆抗体。

所述的步骤a)，针对Oct4A的编码框氨基酸全序列设计并合成引物进行PCR克隆，获得Oct4A的全长序列，序列SEQIDNO：2所示。

将上述PCR得到的cDNA片段导入pET21a(+)重组载体中，将该载体转化BL21(DE3)经诱导、裂解、纯化后得到重组Oct4蛋白。

所述的步骤b)，将上述重组蛋白与弗氏佐剂混合，作为免疫原免疫小鼠。

所述的步骤c)，取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；与小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合，经筛选后即可获得杂交瘤细胞。

本发明的杂交瘤细胞株，也称杂交瘤细胞系Hyb-hOct4-138(即保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2015年1月24日，保藏编号CCTCCNo：C2014205)，所制备的单克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性结合人Oct4蛋白。

本发明的第四方面，提供了一种如上所述的用于制备抗人Oct4单克隆抗体的多肽(重组蛋白)、抗人Oct4单克隆抗体、分泌抗人Oct4单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒中的应用。

所述的检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒，优选WesternBlot或免疫组化试剂或试剂盒。

所述的检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒，优选本发明抗人Oct4单克隆抗体和抗人p28^GANK的单克隆抗体联用。

所述的肝癌患者的预后判别，是应用免疫组化的方法应用人Oct4单克隆抗体检测肝癌患者样本中Oct4的表达情况，通过计算得出每位患者癌及癌旁组织中相应分子的平均表达强度。利用统计软件分析Oct4的表达与肝癌患者各种临床特征及预后参数(总生存率、无瘤生存率、总生存时间、无瘤生存时间等)的关系，制成曲线图。

本发明为肝癌患者的预后判别提供了新的检测方法，也为Oct4的临床个性化治疗应用提供了新的思路。

附图说明

图1是单克隆抗体WesternBlot检测人Oct4蛋白的扫描图；其中，泳道1为蛋白Marker(对应分子量写在左侧)，泳道2为293T细胞裂解液(30μg)，泳道3为转染pcDNA3.1之293T细胞裂解液(30μg)，泳道4为转染pcDNA3.1A-hOct4之293T细胞裂解液(30μg)，泳道5为空白泳道，泳道6,7,8上样顺序同泳道2,3,4，但上样量为15μg。

图2是单克隆抗体Oct4免疫组化检测人Oct4蛋白的组织切片图；其中，A为单克隆抗体免疫组化检测的人精原细胞瘤组织(200×)；B为单克隆抗体免疫组化检测正常肝组织(200×)。

图3是抗人Oct4单克隆抗体免疫组化检测人肝癌样本中Oct4表达水平

本发明的杂交瘤细胞株，命名为Hyb-hOct4-138，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2015年1月24日，保藏编号CCTCCNo：C2014205。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1.抗人Oct4的单克隆抗体的重组蛋白的制备

1.原核表达载体的构建

Oct4A有360个氨基酸，根据其cDNA序列信息委托百奇生物科技(上海)有限公司设计了PCR引物SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示：

上游引物:CCGGAATTCATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATT(SEQIDNO：3所示)

下游引物:ATAAGAATGCGGCCGCGTTTGAATGCATGGGAG(SEQIDNO：4所示)

PCR获得Oct4的cDNA如SEQIDNO：2所示，通过分子克隆的方式克隆到表达载体pET21a(+)，方法可参见J·萨姆布鲁克等著，金冬雁等译《分子克隆实验指南(第二版)》工具书。

2.重组蛋白的表达与纯化

将序列100％匹配的质粒转化BL21(DE3)，取单菌落接种25mlLB培养基中并加入相应抗生素。37℃过夜培养，取过夜的菌液按1：100接种至1L的LB液体培养基中，37℃培养至OD值>0.6，然后加入0.5mM的IPTG诱导4h，收集菌液。将菌液用细菌裂解液裂解后离心。收集沉淀用含8M尿素的BindingBuffer溶解沉淀，离心取上清。上清用Ni-NTA柱子纯化，最后的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。

实施例2.抗人Oct4的单克隆抗体的制备和纯化

1.抗原的纯化

抗原采用原核重组蛋白，由百奇生物科技(上海)有限公司通过分子克隆、原核诱导表达、纯化后获得。

2.单克隆抗体的制备和纯化

将上述1中纯化的重组蛋白100μg以PBS稀释后与等体积完全弗氏佐剂(CFA)混匀乳化，免疫5－6周龄的雌性BALB/c小鼠5只，双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后双腿进行肌肉注射，每个区域大约用1/8的免疫原，将剩余免疫原的1/2进行腹腔注射。2周后加强免疫50μg，完全弗氏佐剂，腹腔注射。4周后加强免疫50μg，不完全弗氏佐剂(IFA)，腹腔注射。6周后加强免疫50μg，不完全弗氏佐剂(IFA)，腹腔注射。第7周时尾静脉采血，ELISA测定效价，应用多重组抗原1.25μg/ml包被，10％FCS封闭，将血清稀释后加入，应用羊抗小鼠IgG标记HRP作为二抗，OPD显色，使用酶标仪(Bio－Rad550型)在492nm读数。

采血的ELISA结果OD值均大于1.0。取传染了人Oct4蛋白的细胞系293T1×10⁶个，用细胞裂解液裂解后，常规WesternBlot检测。

在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(购自ATCC)。最后一次加强免疫3天后，取WesternBlot和免疫组化检测效果最好的小鼠的脾细胞，与SP2/0细胞比例5:1，在PEG1500的作用下进行融合反应，植入96孔板，37℃、5％CO₂条件下培养。培养14天后，镜下检测生长出克隆细孔为融合阳性孔，计算总融合率>95％。尽量选择单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测。ELISA阳性的克隆用WesternBlot和免疫组化检测，筛选出来的克隆亚克隆两次，每次WesternBlot和免疫组化检测效果最好的克隆。筛选得到3个克隆。

得到的杂交瘤细胞株，Hyb-hOct4-138，即保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2015年1月23日，保藏编号CCTCCNo：C2014205。

6－8周龄的雌性BALB/c小鼠用石蜡油腹腔注射10天后，取杂交瘤细胞以2×10⁶个细胞/只进行腹腔注射。7－14天后从小鼠腹腔抽出富含抗体的腹水进行检测和纯化。纯化采用ProteinG亲和层析法。ProteinG亲和层析柱用PBS平衡柱子后取腹水过柱，然后用PBS洗柱至OD值接近零，以50nmol/L的甘氨酸盐酸溶液洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，透析纯化。

实施例3.抗人Oct4的单克隆抗体的鉴定和检测应用

1.单克隆抗体的鉴定

(1)抗体效价鉴定

将抗原(4μg/ml)包被ELISA板，将纯化的抗人Oct4单克隆抗体按1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000进行稀释，加入酶标板孔内，选用商业化Oct4抗体(1mg/ml1：8000用牛奶稀释)作为系统操作的阳性对照，5％牛奶作为阴性对照。反应后加入羊抗鼠IgG-HRP，显色。阳性判定标准：样品检测孔OD450与阴性对照孔OD450之比(P/N)≥2.1，结果表明抗体效价大于64000(表1)。

表1抗体效价鉴定表

稀释度	1/1000	1/2000	1/4000	1/8000	1/16000	1/32000	1/64000	-	+
										OD值	4.144	4.2	3.827	4.2	3.369	2.256	1.979	0.125	2.638

(2)亚型鉴定

委托百奇生物科技(苏州)有限公司对本发明所得到的抗人Oct4单克隆抗体进行亚型鉴定，其亚型鉴定结果表明，单克隆抗体为IgG2b亚型，轻链为κ链，结果见表2。

表2抗体亚型鉴定表

亚型	Hyb-hOct4-138
		IgG1	0.106
IgG2a	0.087
		IgG2b	1.874
IgG3	0.068
		IgM	0.087
IgA	0.08
		Igκ	1.403
Igλ	0.062

(3)单克隆抗体的WesternBlot检测应用

变性的蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳；通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Schleicher&Schell公司)；含5％BSA的TBST封闭1h，TBST洗一次，5min；含4％BSA的TBST稀释抗p28GANK单克隆抗体一抗(1μg/ml)，孵育2h，TBST洗三次，每次5min；含4％BSA的TBST稀释IR-800标记的抗小鼠二抗，孵育1h，TBST洗四次，每次5min；用红外线激光扫描仪Odyssey扫描。结果见图1。结果表明该单克隆抗体能较为特异地识别人Oct4分子。

(4)单克隆抗体的免疫组化检测应用

4μm石蜡切片置于60℃恒温箱中烘烤20分钟并脱蜡；3％H₂O₂(80％甲醇)室温10分钟灭活内源性过氧化物酶，PBS洗3次各5分钟。0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)高压修复抗原，PBS洗3次各5分钟；山羊血清封闭，室温20分钟，甩去多余液体；滴加以抗体稀释液稀释的抗人Oct4单克隆抗体一抗(10μg/ml)，室温孵育2h，PBS洗3次各5分钟；滴加HRP标记的二抗50μl，室温孵育1h，PBS洗3次各5分钟；DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度，PBS洗3次各5分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化，自来水冲洗10-15分钟；脱水、透明、封片、拍照。结果见图2。结果表明，在阳性对照组织(人精原细胞瘤)中该单克隆抗体能较为特异地识别人Oct4分子，定位准确(细胞核)，但在阴性对照组织(人正常肝组织)中，该单克隆抗体未检测到信号，说明该单克隆抗体的敏感性和特异性均较好。

应用该单克隆抗体免疫组化法检测人肝癌组织组织中的Oct4分子，结果见图3。结果表明，在人肝癌组织中部分癌细胞的胞核呈阳性，说明该单克隆抗体可以用于检测肝癌组织中的Oct4，从而对肝癌病人的预后进行评估。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (13)

1.一种用于制备抗人Oct4单克隆抗体的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的。

2.一种抗人Oct4单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCCNo：C2014205的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCCNo：C2014205。

4.一种如权利要求2所述的抗人Oct4单克隆抗体的制备方法，该方法的步骤如下：

a)重组表达如SEQIDNO：1所示的蛋白；

b)将上述蛋白作为免疫原免疫小鼠；

c)取免疫鼠的脾细胞融合；

d)经多轮筛选出与重组蛋白反应阳性的细胞克隆，作为抗人Oct4单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人Oct4的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的抗人Oct4单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的步骤a)，针对Oct4A的编码框氨基酸全序列设计并合成引物进行PCR克隆，获得Oct4的cDNA序列，cDNA序列如SEQIDNO：2所示；将cDNA序列导入pET21a(+)重组载体中；将该载体转化BL21(DE3)经诱导、裂解、纯化后得到重组蛋白。

6.根据权利要求4或5所述的抗人Oct4单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的所述的步骤b)，将上述重组蛋白与弗氏佐剂混合，作为免疫原免疫小鼠。

7.根据权利要求4或5所述的抗人Oct4单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的所述的步骤c)，取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合。

8.一种如权利要求1所述的用于制备抗人Oct4单克隆抗体的重组蛋白在制备WesternBlot或免疫组化检测试剂或试剂盒中的应用。

9.一种如权利要求2所述的抗人Oct4单克隆抗体在制备WesternBlot或免疫组化检测试剂或试剂盒中的应用。

10.一种如权利要求3所述的杂交瘤细胞株在制备WesternBlot或免疫组化检测试剂或试剂盒中。

11.一种如权利要求1所述的用于制备抗人Oct4单克隆抗体的重组蛋白在制备检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒中的应用。

12.一种如权利要求2所述的抗人Oct4单克隆抗体在制备检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒中的应用。

13.一种如权利要求3所述的杂交瘤细胞株在制备检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒中的应用。