CN113861289A - 一种羊抗人IgM抗体的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊抗人IgM抗体的纯化方法，包括以下步骤：将过滤后的羊抗人IgM血清及其吸收源混合，搅拌，过滤去除杂质，加入PBS，搅拌混匀；在搅拌状态下，样品中加入饱和硫酸铵溶液搅拌，静置；离心，弃上清，沉淀用PBS复溶；将复溶后的抗体透析至PB＋NaCl中，透析完成后再次离心，弃沉淀，上清过滤，保留滤液；本发明中将羊抗人IgM血清与吸收源按照体积比5：1的比例混合，获得只与人IgM结合的专一特异性血清原料。硫酸铵沉淀法和DEAE纯化法结合使用，抗体得率为90%，且消除了羊抗人IgM抗体的基质效应干扰。

Description

一种羊抗人IgM抗体的纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种羊抗人IgM抗体的纯化方法。

背景技术

现有羊抗人IgM抗体开发免疫方案获得的抗血清特异性较低，活性较差，多使用弗氏佐剂进行动物免疫制备抗血清。

将羊抗人IgM抗血清纯化成抗体的方法较为复杂，步骤较多，分离纯化得到的羊抗人IgM抗体纯度不高，且对羊抗人IgM抗体的结构有一定的破坏。

现有方法得率不高，不利于大规模生产。

发明内容

本发明提供了一种羊抗人IgM抗体的纯化方法，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种羊抗人IgM抗体的制备及其纯化方法，包括以下步骤：

A、抗血清的制备方法

A1、准备工作：40-50kg健康绵羊。

（1）、卡介苗液：10ml生理盐水溶解50mg卡介苗；

（2）、初免试剂：1ml抗原（3mg/ml）+ 1ml自制完全佐剂乳化；

（3）、加强免疫试剂：0.5ml抗原（3mg/ml）+ 0.5ml生理盐水+ 1ml自制不完全佐剂乳化；

A2、基础免疫：绵羊颈部两侧和双腹股沟淋巴结内注射50mg卡介苗液；

A3、初免（基础免疫10天后）：在肿胀的淋巴结内注入自制完全佐剂乳化的抗原3mg；

A4、二免（初免后3周）：在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的抗原1.5mg；

A5、三免（二免后3周）：在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的抗原1.5mg；

A6、采血：免疫10天后采血测定效价。达到血清效价质量标准后，可进行静脉或动脉采血。若免疫至6免后，血清效价未达到2^19，建议处死。

A7、采血时使用单采浆机采血得到羊血浆，在羊血浆中加入CaCl₂使其终浓度为0.3%，200rpm/min、37℃搅拌4h以上，滤纸过滤去除析出的纤维蛋白，滤液即为羊抗人IgM血清。

进一步的，所述羊抗人IgM血清吸收源为无人IgM的人血清。

进一步的，所述羊抗人IgM血清吸收源的制备方法包括以下步骤：

B1、原料制备：将冷冻保存的人阴性血清在20-25℃流水融化，滤纸过滤去除杂质；

B2、在层析柱中填装鼠抗人IgM（M2910）-CNBr免疫亲和层析填料，使用5-10倍柱体积的10mM PBS(pH 7.4)清洗填料；

B3、平衡：使用5倍柱体积的平衡缓冲液10mM PBS(pH 7.4)平衡层析柱，平衡结束后调整蛋白紫外检测仪A₂₈₀显示值为0，准备上样；

B4、上样：每mL填料处理10mL人血清，上样速度为4-6mL/min，蛋白紫外检测仪显示值大于0.5时，开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.5时，停止收集流穿液，将第一遍收集的流穿液再循环上样一次，使抗体充分结合，所得第二遍流穿液即为羊抗人IgM血清吸收源。

进一步的，C、羊抗人IgM抗体的纯化方法，包括以下步骤：

C1、将冷冻保存的羊抗人IgM血清和羊抗人IgM血清吸收源在20-25℃流水融化，脱脂棉过滤去除杂质；

C2、将过滤后的羊抗人IgM血清及其吸收源按体积比5：1的比例混合，100rpm/min搅拌3h，脱脂棉过滤去除杂质；

C3、向步骤C2过滤后的血清中加入等体积的10mM PBS(pH 7.4)，搅拌混匀；

C4、在搅拌状态下，每毫升样品中匀速加入1ml的100%饱和硫酸铵溶液(pH 7.0)，流速20ml/min；100rpm/min的搅拌速度搅拌10min，静置30min；

C5、9000rpm 4℃离心10min，弃上清，沉淀用10mM PBS(pH 7.4)复溶，复溶后的体积为步骤C2中加入的羊抗人IgM血清体积的1/4倍；

C6、将复溶后的抗体透析至10mM PB＋50mM NaCl(pH 7.4)中，透析比为1:50，透析2次，透析时间控制在12-24h之间，透析完成后再次离心，9000rpm 4℃离心10min，弃沉淀，上清用0.22um滤器过滤，保留滤液，弃滤渣；

C7、在层析柱中填装DEAE阴离子交换层析填料，使用5-10倍柱体积的0.1M NaOH过柱，对填料进行活化；

C8、平衡：使用5倍柱体积的10mM PB＋50mM NaCl(pH 7.4)平衡层析柱，平衡结束后调整，准备上样；

C9、上样：取与层析柱等体积的步骤C6中得到的滤液上样，蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时，开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时，停止收集流穿液，流穿即为羊抗人IgM抗体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、使用自制佐剂及免疫方法进行动物免疫，获得效价为传统免疫方案2倍的高效价抗血清。

2、将羊抗人IgM血清与吸收源按照体积比5：1的比例混合，获得只与人IgM结合的专一特异性血清原料。

3、硫酸铵沉淀法和DEAE纯化法结合使用，抗体得率为90%，且消除了羊抗人IgM抗体的基质效应干扰。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1

A、抗血清的制备方法，包括以下步骤：

A1、准备工作：40-50kg健康绵羊。

（1）、卡介苗液：10ml生理盐水溶解50mg卡介苗；

（2）、初免试剂：1ml抗原（3mg/ml）+ 1ml自制完全佐剂乳化；

（3）、加强免疫试剂：0.5ml抗原（3mg/ml）+ 0.5ml生理盐水+ 1ml自制不完全佐剂乳化；

A2、基础免疫：绵羊颈部两侧和双腹股沟淋巴结内注射50mg卡介苗液；

A3、初免（基础免疫10天后）：在肿胀的淋巴结内注入自制完全佐剂乳化的抗原3mg；

A4、二免（初免后3周）：在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的抗原1.5mg；

A5、三免（二免后3周）：在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的抗原1.5mg；

A6、采血：免疫10天后采血测定效价。达到血清效价质量标准后，可进行静脉或动脉采血。若免疫至6免后，血清效价未达到2^19，建议处死。

A7、采血时使用单采浆机采血得到羊血浆，在羊血浆中加入CaCl₂使其终浓度为0.3%，200rpm/min、37℃搅拌4h以上，滤纸过滤去除析出的纤维蛋白，滤液即为羊抗人IgM血清。

具体地讲，其中：不完全佐剂的制备方法，包括以下步骤：

a1、准备工作：选取合适体积的烧杯和量筒，清洗干净后，完全擦除水分，

a2、搅拌：使用量筒按照3:1的体积比，分别量取石蜡油和乳化剂 Span 80倒入烧杯中，快速（200rpm/min）搅拌混匀1h，搅拌时避免产生气泡，为了避免产生气泡，搅拌时，漩涡不要见容器底部；

a3、 4℃静置12h后如无分层，0.22μm滤膜过滤后，将滤液分装保存，保存温度为2-8℃。

4℃静置12h后若出现分层，其原因为石蜡油和乳化剂 Span 80未能混合均一，将其搅拌混合均一即可。

具体地讲，其中：完全佐剂的制备方法，包括以下步骤：

b1、准备工作：选取合适体积的烧杯、量筒、研钵，清洗干净后，使用厨房用纸将水分完全擦除，

b2、研磨：准确分别量取2g冻干卡介苗和冻干聚肌胞干粉，于研钵中研磨，直至无颗粒状固体，

b3、搅拌：使用量筒量取300ml石蜡油和100ml 乳化剂 Span 80倒入烧杯中，快速（200rpm/min）搅拌混匀1h，搅拌时避免产生气泡，为了避免产生气泡，搅拌时，漩涡不要见容器底部；然后4℃静置12h，如无分层，0.22μm滤膜过滤后，在滤液中加入上述研磨后冻干粉，搅拌（200rpm/min）混匀30min，分装入库，分装时需持续搅拌。

4℃静置12h后若出现分层，其原因为石蜡油和乳化剂 Span 80未能混合均一，将其搅拌混合均一即可。

作为一个优选方案，所述羊抗人IgM血清吸收源为无人IgM的人血清，所述羊抗人IgM血清吸收源的制备方法包括以下步骤：

B1、原料制备：将冷冻保存的人阴性血清在20-25℃流水融化，滤纸过滤去除杂质；

B2、在层析柱中填装鼠抗人IgM（M2910）-CNBr免疫亲和层析填料，使用5-10倍柱体积的10mM PBS(pH 7.4)清洗填料；

B3、平衡：使用5倍柱体积的平衡缓冲液10mM PBS(pH 7.4)平衡层析柱，平衡结束后调整蛋白紫外检测仪A₂₈₀显示值为0，准备上样；

B4、上样：每mL填料处理10mL人血清，上样速度为4-6mL/min，蛋白紫外检测仪显示值大于0.5时，开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.5时，停止收集流穿液，将第一遍收集的流穿液再循环上样一次，使抗体充分结合，所得第二遍流穿液即为羊抗人IgM血清吸收源。

C、羊抗人IgM抗体的纯化方法，包括以下步骤：

C1、将冷冻保存的羊抗人IgM血清和羊抗人IgM血清吸收源在20-25℃流水融化，脱脂棉过滤去除杂质；

C2、将过滤后的羊抗人IgM血清及其吸收源按体积比5：1的比例混合，100rpm/min搅拌3h，脱脂棉过滤去除杂质；

C3、向步骤C2过滤后的血清中加入等体积的10mM PBS(pH 7.4)，搅拌混匀；

C4、在搅拌状态下，每毫升样品中匀速加入1ml的100%饱和硫酸铵溶液(pH 7.0)，流速20ml/min；100rpm/min的搅拌速度搅拌10min，静置30min；

C5、9000rpm 4℃离心10min，弃上清，沉淀用10mM PBS(pH 7.4)复溶，复溶后的体积为步骤C2中加入的羊抗人IgM血清体积的1/4倍；

C6、将复溶后的抗体透析至10mM PB＋50mM NaCl(pH 7.4)中，透析比为1:50，透析2次，透析时间控制在12-24h之间，透析完成后再次离心，9000rpm 4℃离心10min，弃沉淀，上清用0.22um滤器过滤，保留滤液，弃滤渣；

C7、在层析柱中填装DEAE阴离子交换层析填料，使用5-10倍柱体积的0.1M NaOH过柱，对填料进行活化；

C8、平衡：使用5倍柱体积的10mM PB＋50mM NaCl(pH 7.4)平衡层析柱，平衡结束后调整，准备上样；

C9、上样：取与层析柱等体积的步骤C6中得到的滤液上样，蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时，开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时，停止收集流穿液，流穿即为羊抗人IgM抗体。

本发明的关键保护点：

1、抗血清制备方案；

2、抗体纯化方案中吸收源成分：无人IgM的人血清。

3、纯化方案中DEAE纯化方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种羊抗人IgM抗体的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

C1、将冷冻保存的羊抗人IgM血清和羊抗人IgM血清吸收源在20-25℃流水融化，脱脂棉过滤去除杂质；

C2、将过滤后的羊抗人IgM血清及其吸收源按体积比5：1的比例混合，100rpm/min搅拌3h，脱脂棉过滤去除杂质；

C3、向步骤C2过滤后的血清中加入等体积的10mM PBS，搅拌混匀；

C4、在搅拌状态下，每毫升样品中匀速加入1ml的100%饱和硫酸铵溶液，流速20ml/min；100rpm/min的搅拌速度搅拌10min，静置30min；

C5、9000rpm 4℃离心10min，弃上清，沉淀用10mM PBS复溶，复溶后的体积为步骤C2中加入的羊抗人IgM血清体积的1/4倍；

C6、将复溶后的抗体透析至10mM PB＋50mM NaCl中，透析比为1:50，透析2次，透析时间控制在12-24h之间，透析完成后再次离心，在9000rpm 4℃离心10min，弃沉淀，上清用0.22um滤器过滤，保留滤液，弃滤渣；

C7、在层析柱中填装DEAE阴离子交换层析填料，使用5-10倍柱体积的0.1M NaOH过柱，对填料进行活化；

C8、平衡：使用5倍柱体积的10mM PB＋50mM NaCl平衡层析柱，平衡结束后调整，准备上样；

C9、上样：取与层析柱等体积的步骤C6中得到的滤液上样，蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时，开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时，停止收集流穿液，流穿即为羊抗人IgM抗体。

2.根据权利要求1所述的羊抗人IgM抗体的纯化方法，其特征在于，所述羊抗人IgM血清吸收源为无人IgM的人血清。

3.根据权利要求2所述的羊抗人IgM抗体的纯化方法，其特征在于，所述羊抗人IgM血清吸收源的制备方法包括以下步骤：

B1、原料制备：将冷冻保存的人阴性血清在20-25℃流水融化，滤纸过滤去除杂质；

B2、在层析柱中填装鼠抗人IgM（M2910）-CNBr免疫亲和层析填料，使用5-10倍柱体积的10mM PBS清洗填料；

B3、平衡：使用5倍柱体积的平衡缓冲液10mM PBS平衡层析柱，平衡结束后调整蛋白紫外检测仪A₂₈₀显示值为0，准备上样；

B4、上样：每mL填料处理10mL人血清，上样速度为4-6mL/min，蛋白紫外检测仪显示值大于0.5时，开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.5时，停止收集流穿液，将第一遍收集的流穿液再循环上样一次，使抗体充分结合，所得第二遍流穿液即为羊抗人IgM血清吸收源。

4.根据权利要求3所述的羊抗人IgM抗体的纯化方法，其特征在于，所述PBS的pH均为7.4。

5.根据权利要求1所述的羊抗人IgM抗体的纯化方法，其特征在于，所述步骤C4中，100%饱和硫酸铵溶液的pH= 7.0。

6.根据权利要求1所述的羊抗人IgM抗体的纯化方法，其特征在于，所述步骤C6和C8中，PB和NaCl的pH= 7.4。