CN113876944A - 一种免疫佐剂制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免疫佐剂制备方法，取冻干卡介苗和冻干聚肌胞干粉，于研钵中研磨，直至无颗粒状固体，取石蜡油和Span 80倒入容器中，搅拌混匀，然后静置后过滤，在滤液中加入上述研磨后的无颗粒状固体，搅拌混匀、分装入库。本发明中使用Span 80替代羊毛脂，外观透亮，稳定性增加。提高Span 80的体积比，乳化时间缩短，乳化后免疫试剂可长时间保持油包水状态。将灭活结核分枝杆菌替换为更为安全的卡介苗，提高完全佐剂的生物安全性。卡介苗终浓度为5mg/ml，可提高免疫试剂在动物体内的免疫反应。新增5mg/ml聚肌胞，与卡介苗在动物体内形成协同作用，可提高免疫试剂在动物体内的免疫反应。

Description

一种免疫佐剂制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种免疫佐剂制备方法。
背景技术
免疫佐剂是动物抗血清免疫制备过程中的关键辅助原材料。世界范围内常用弗氏佐剂，1ml弗氏不完全佐剂主要成分为0.85ml石蜡油和0.15ml羊毛脂，1ml弗氏完全佐剂主要成分为0.85ml石蜡油、0.15ml羊毛脂和1mg灭菌结核分枝杆菌。
使用弗氏佐剂乳化免疫原性较低的抗原制成免疫试剂，动物免疫反应较低，无法获得高效价抗血清。
将弗氏佐剂和抗原乳化成油包水状态的免疫试剂，该乳化过程大约需要20min以上；抗原性质不同时，需要更长时间乳化，增加了实验人员的时间成本。
发明内容
本发明提供了一种免疫佐剂制备方法，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种免疫佐剂制备方法，免疫佐剂包括不完全佐剂和完全佐剂，
所述不完全佐剂的制备方法，包括以下步骤：
按照3:1的体积比分别量取石蜡油和乳化剂 Span 80，并将其倒入容器中，搅拌混匀；
然后4℃静置12h，滤膜过滤，将滤液分装保存；
所述完全佐剂的制备方法，包括以下步骤：
按照1:1的质量比分别称取冻干卡介苗和冻干聚肌胞干粉，按照3:1的体积比分别量取石蜡油和乳化剂 Span 80，其中：冻干卡介苗的质量与石蜡油和乳化剂 Span 80的总体积比为5mg/ml；
将冻干卡介苗和冻干聚肌胞干粉于研钵中研磨，直至为无颗粒状固体，
将石蜡油和乳化剂 Span 80倒入容器中，搅拌混匀，然后4℃静置12h，滤膜过滤，在滤液中加入研磨后的无颗粒状固体，搅拌混匀30min，分装入库。
进一步的，在不完全佐剂的制备过程中使用的容器有烧杯和量筒，故在制备之前的准备工作是选取合适体积的烧杯和量筒，并将烧杯和量筒清洗干净后，完全擦除烧杯和量筒上的水分。
进一步的，在完全佐剂的制备过程中使用的容器有烧杯、量筒和研钵，故在制备之前的准备工作是选取合适体积的烧杯、量筒和研钵，并将烧杯、量筒和研钵清洗干净后，使用厨房用纸将水分完全擦除。
进一步的，所述不完全佐剂的制备方法中，滤液分装后于2-8℃保存。
进一步的，所述完全佐剂的制备方法中，分装时需持续搅拌。
进一步的，所述搅拌的速率均为200rpm/min。
进一步的，所述滤膜均采用0.22μm滤膜。
进一步的，所述卡介苗的成分为低毒结核分枝杆菌菌株。
进一步的，所述聚肌胞的成分为多聚poly I（次黄嘌呤）和poly C(胞嘧啶)双链。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、不完全佐剂中使用乳化剂 Span 80替代羊毛脂，外观透亮，稳定性增加。
2、由于完全佐剂中添加了卡介苗和聚肌胞，二者不溶于石蜡油，故液体中有可见粉末状物质。
3、提高乳化剂 Span 80的体积比，乳化时间缩短，乳化后免疫试剂可长时间保持油包水状态。
4、将灭活结核分枝杆菌替换为更为安全的卡介苗，提高完全佐剂的生物安全性。
5、卡介苗终浓度为5mg/ml，可提高免疫试剂在动物体内的免疫反应。其中：石蜡油和乳化剂Span 80混合后总体积为400ml，2g冻干粉均匀分布于油状液体内，可得卡介苗冻干粉的浓度为5mg/ml。
6、新增5mg/ml聚肌胞，与卡介苗在动物体内形成协同作用，可提高免疫试剂在动物体内的免疫反应。其中：石蜡油和乳化剂Span 80混合后总体积为400ml，2g冻干粉均匀分布于油状液体内，可得聚肌胞冻干粉的浓度为5mg/ml。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
本发明中的免疫佐剂包括不完全佐剂和完全佐剂。
实施例1
一种不完全佐剂的制备方法，包括以下步骤：
A1、准备工作：选取合适体积的烧杯和量筒，清洗干净后，完全擦除水分，
A2、搅拌：使用量筒按照3:1的体积比，分别量取石蜡油和乳化剂 Span 80倒入烧杯中，快速（200rpm/min）搅拌混匀1h，搅拌时避免产生气泡，为了避免产生气泡，搅拌时，漩涡不要见容器底部；
A3、 4℃静置12h后如无分层，0.22μm滤膜过滤后，将滤液分装保存，保存温度为2-8℃。
4℃静置12h后若出现分层，其原因为石蜡油和乳化剂 Span 80未能混合均一，将其搅拌混合均一即可。
实施例2
一种完全佐剂的制备方法，包括以下步骤：
B1、准备工作：选取合适体积的烧杯、量筒、研钵，清洗干净后，使用厨房用纸将水分完全擦除，
B2、研磨：准确分别量取2g冻干卡介苗和冻干聚肌胞干粉，于研钵中研磨，直至无颗粒状固体，
B3、搅拌：使用量筒量取300ml石蜡油和100ml 乳化剂 Span 80倒入烧杯中，快速（200rpm/min）搅拌混匀1h，搅拌时避免产生气泡，为了避免产生气泡，搅拌时，漩涡不要见容器底部；然后4℃静置12h，如无分层，0.22μm滤膜过滤后，在滤液中加入上述研磨后冻干粉，搅拌（200rpm/min）混匀30min，分装入库，分装时需持续搅拌。
4℃静置12h后若出现分层，其原因为石蜡油和乳化剂 Span80未能混合均一，将其搅拌混合均一即可。
本发明具有以下有点：
1、不完全佐剂中使用乳化剂 Span 80替代羊毛脂，外观透亮，稳定性增加。
2、由于完全佐剂中添加了卡介苗和聚肌胞，二者不溶于石蜡油，故液体中有可见粉末状物质。
3、提高乳化剂 Span 80的体积比，乳化时间缩短，乳化后免疫试剂可长时间保持油包水状态。
4、将灭活结核分枝杆菌替换为更为安全的卡介苗，提高完全佐剂的生物安全性。
5、卡介苗终浓度为5mg/ml，可提高免疫试剂在动物体内的免疫反应。其中：石蜡油和乳化剂Span 80混合后总体积为400ml，2g冻干粉均匀分布于油状液体内，可得卡介苗冻干粉的浓度为5mg/ml。
6、新增5mg/ml聚肌胞，与卡介苗在动物体内形成协同作用，可提高免疫试剂在动物体内的免疫反应。其中：石蜡油和乳化剂Span 80混合后总体积为400ml，2g冻干粉均匀分布于油状液体内，可得聚肌胞冻干粉的浓度为5mg/ml。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种免疫佐剂制备方法，其特征在于，免疫佐剂包括不完全佐剂和完全佐剂，
所述不完全佐剂的制备方法，包括以下步骤：
按照3:1的体积比分别量取石蜡油和乳化剂 Span 80，并将其倒入容器中，搅拌混匀；
然后4℃静置12h，滤膜过滤，将滤液分装保存；
所述完全佐剂的制备方法，包括以下步骤：
按照1:1的质量比分别称取冻干卡介苗和冻干聚肌胞干粉，按照3:1的体积比分别量取石蜡油和乳化剂 Span 80，其中：冻干卡介苗的质量与石蜡油和乳化剂 Span 80的总体积比为5mg/ml；
将冻干卡介苗和冻干聚肌胞干粉于研钵中研磨，直至为无颗粒状固体，
将石蜡油和乳化剂 Span 80倒入容器中，搅拌混匀，然后4℃静置12h，滤膜过滤，在滤液中加入研磨后的无颗粒状固体，搅拌混匀30min，分装入库。
2.根据权利要求1所述的免疫佐剂制备方法，其特征在于，在不完全佐剂的制备过程中使用的容器有烧杯和量筒，故在制备之前的准备工作是选取合适体积的烧杯和量筒，并将烧杯和量筒清洗干净后，完全擦除烧杯和量筒上的水分。
3.根据权利要求1所述的免疫佐剂制备方法，其特征在于，在完全佐剂的制备过程中使用的容器有烧杯、量筒和研钵，故在制备之前的准备工作是选取合适体积的烧杯、量筒和研钵，并将烧杯、量筒和研钵清洗干净后，使用厨房用纸将水分完全擦除。
4.根据权利要求1所述的免疫佐剂制备方法，其特征在于，所述不完全佐剂的制备方法中，滤液分装后于2-8℃保存。
5.根据权利要求1所述的免疫佐剂制备方法，其特征在于，所述完全佐剂的制备方法中，分装时需持续搅拌。
6.根据权利要求1或5所述的免疫佐剂制备方法，其特征在于，所述搅拌的速率均为200rpm/min。
7.根据权利要求1所述的免疫佐剂制备方法，其特征在于，所述滤膜均采用0.22μm滤膜。
8.根据权利要求1所述的免疫佐剂制备方法，其特征在于，所述卡介苗的成分为低毒结核分枝杆菌菌株。
9.根据权利要求1所述的免疫佐剂制备方法，其特征在于，所述聚肌胞的成分为多聚poly I和poly C双链。
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