CN115710317A - 一种二抗血清免疫方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二抗血清免疫方法，采用免疫球蛋白与完全佐剂乳化，对绵羊进行初免；免疫球蛋白与不完全佐剂乳化，对绵羊进行二免和三免；免疫8~10天后采血测定效价，血清效价达到2^19后，进行静脉或动脉采血，若未达到2^19，可进行后续加强免疫；采用免疫亲和层析柱对抗体进行纯化。该方法中添加了基础免疫步骤，使动物处于炎症反应状态，提高吞噬细胞聚集密度，增强免疫应答强度。使用自制佐剂，其中不完全佐剂配方中提高了乳化剂的比例，增强抗原与佐剂的“油包水”乳化效果，延长抗原在动物皮下存在时间，给与动物长时间的缓慢刺激，增强免疫反应，获得效价为传统免疫方案2倍的高效价抗血清，免疫亲和法进行抗血清纯化，抗体得率为95%以上。
Description
技术领域
本发明属于免疫方法领域，具体涉及一种二抗血清免疫方法。
背景技术
二抗用于检测细胞或组织样本中的蛋白表达，它与抗原特异性一抗结合，二抗可检测目标蛋白中的高度特异性氨基酸序列。二抗对一抗的指定区域或区域的特异性允许多个二抗与单一一抗结合，放大信号并增加检测敏感性。
常规二抗免疫获得的抗血清效价较低，活性较差，多使用弗氏佐剂进行动物的抗血清免疫制备。将抗血清纯化成抗体的方法较为复杂，步骤较多，分离纯化得到的二抗抗体纯度不高，且对二抗抗体的结构有一定的破坏。现有方法得率不高，不利于大规模生产。例如的常规二抗免疫方案——动物：山羊，初免剂量1mg/只，加强免疫剂量0.5mg/只，免疫间隔14天，免疫位点：背部皮下，弗氏佐剂乳化。该免疫方案的缺点为：效价低，较长周期才获得高效价血清(6次免疫后)，难以长期维持高效价水平。
[1]蔡燕刚,谢正旸,杨绍金,周正芳,吴清璇.高效价羊抗兔IgG免疫血清制备方法的研究[J].第二军医大学学报,1984(01):45-46.DOI:10.16781/j.0258-879x.1984.01.013.
[2]李钟铎,孙东连,胥照平,宋光昌,何锦芳.抗鼠IgG和IgM免疫血清的制备研究[J].军事医学科学院院刊,1984(04):415-418.
[3]张明杰,汪美先,姜绍谆,马文煜,于碧云.抗猴IgM和IgG免疫血清的制备研究[J].免疫学杂志,1989(02):40-42.
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，本发明提供一种二抗血清免疫方法，该方法中添加了基础免疫步骤，使动物处于炎症反应状态，提高吞噬细胞聚集密度，增强免疫应答强度。使用自制佐剂，其中不完全佐剂配方中提高了乳化剂的比例，增强抗原与佐剂的“油包水”乳化效果，延长抗原在动物皮下存在时间，给与动物长时间的缓慢刺激，增强免疫反应。
本发明采用的技术方案为：一种二抗血清免疫方法，包括如下步骤：
S1、采用免疫球蛋白与完全佐剂乳化，对绵羊进行初免；
S2、免疫球蛋白与不完全佐剂乳化，对绵羊进行二免和三免；
S3、免疫8-10天后采血测定效价，血清效价达到2^18-19后，进行静脉或动脉采血，若未达到2^18-19，可进行后续加强免疫，方法同三免；
S4、在柱中填装偶联好的免疫亲和层析柱填料，清洗，平衡；
S5、上样：确定血清体积后，加入一倍血清体积的平衡缓冲液和0.1倍血清体积的100mM PBS，搅拌混匀，作为上清上样，上样速度为4-6mL/min，蛋白紫外检测仪显示值大于0.2时开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.2时停止收集流穿液，将第一遍收集的流穿液再循环上样一次，使抗体充分结合；
S6、上样结束后用5-10倍柱体积的平衡缓冲液10mM PBS(pH 7.4)洗杂至蛋白紫外检测值A280显示值为0；
S7、解离：使用0.1M Gly(pH 2.7)+5％甘油洗脱抗体，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白，收集管中预先加入0.1倍收集体积的2M Tris(pH 8.0)+3M NaCl，解离速度为6-10mL/min，可分管收集抗体；
S8、抗体透析：将解离后的抗体浓度调为5～7mg/mL，透析至20mM Tris(pH 8.5)+150mM NaCl+5％甘油中，透析比为1:30-50，透析一次，透析时间控制在12-24小时之间。
S9、层析柱处理：柱保存于10mM PBS(7.4)中，2-8℃保存，长期不用则保存于10mMPBS(7.4)+0.1％P300中。
S10抗体处理：将透析后的抗体浓度调至5mg/mL，加海藻糖至终浓度为3％，0.22μm滤膜过滤，加防腐剂P300至终浓度为0.1％，分装保存。
S1中所述完全佐剂为石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后，添加卡介苗至终浓度为5mg/ml的试剂。完全佐剂中将卡介苗的浓度提高至5mg/ml，提高注射位点的吞噬细胞聚集密度，增强免疫应答强度。
S2中所述不完全佐剂是石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后的试剂。不完全佐剂配方中提高了乳化剂的比例，增强抗原与佐剂的“油包水”乳化效果，延长抗原在动物皮下存在时间，给与动物长时间的缓慢刺激，增强免疫反应。
S4中所述偶联好的免疫亲和层析柱为CNBr-免疫原偶联填料。
S5中所述免疫亲和层析柱的偶联方法为：
使用偶联缓冲液对免疫球蛋白进行透析置换缓冲液，透析两次，测蛋白浓度及体积；称取CNBr琼脂糖冻干粉，溶胀为琼脂糖凝胶，活化，装柱，平衡；将平衡好的琼脂糖凝胶柱料和透析好的免疫球蛋白于20-25℃条件下在旋转混合仪上充分混合3小时进行偶联；将偶联后的柱料填充到层析柱内，使用5倍柱体积的偶联缓冲液漂洗；收集流出，测蛋白浓度及其体积；
将柱料转移到0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中静置两个小时，用于终止偶联。
一种二抗免疫完全佐剂，所述完全佐剂为石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后，添加卡介苗至终浓度为5mg/ml的试剂。进一步优选地，还可以添加聚肌胞干粉至终浓度为5mg/ml。
一种二抗免疫不完全佐剂，所述不完全佐剂是石蜡油与Span80按照3：1比例混合后的试剂。
本发明中，添加了基础免疫步骤，使动物处于炎症反应状态，提高吞噬细胞聚集密度，增强免疫应答强度。使用自制佐剂，其中不完全佐剂配方中提高了乳化剂的比例，增强抗原与佐剂的“油包水”乳化效果，延长抗原在动物皮下存在时间，给与动物长时间的缓慢刺激，增强免疫反应。完全佐剂中将卡介苗的浓度提高至5mg/ml，提高注射位点的吞噬细胞聚集密度，增强免疫应答强度。
有益效果：
1、使用自制完全佐剂和不完全佐剂及上述免疫方案进行动物免疫，获得效价为传统免疫方案2倍的高效价抗血清。
2、使用偶联缓冲液(0.2M NaHCO3+300mM NaCl,pH 8.3)对免疫球蛋白进行透析置换，可提高抗体偶联率至90％以上。
3、将免疫原偶联至亲和填料上，进行抗血清纯化，可捕捉高特异性的目的蛋白，消除下游应用中的杂蛋白干扰。
4、免疫亲和法进行抗血清纯化，抗体得率为95％以上。
附图说明
图1免疫亲和法纯化——羊抗鼠IgG；M：Marker，1：羊抗鼠IgG，图中1#泳道蛋白大小约150KD，符合羊IgG蛋白大小特征，且1#泳道仅有一条蛋白，目的蛋白(羊抗鼠蛋白)纯度约95％。
图2硫酸铵沉淀法纯化——羊抗鼠IgG；图中1#泳道存在2条蛋白，蛋白大小约150KD和66KD，符合羊IgG蛋白和白蛋白理化特征，目的蛋白(羊抗鼠蛋白)纯度约60％。
具体实施方式
所述完全佐剂为石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后，添加卡介苗至终浓度为5mg/ml,添加聚肌胞干粉至终浓度为5mg/ml的试剂。
所述不完全佐剂是石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后的试剂。
完全佐剂的制备：
准确分别量取2g冻干卡介苗和2g冻干聚肌胞干粉于研钵中研磨，直至无颗粒状固体；使用量筒量取300ml石蜡油和100ml Span 80倒入烧杯中，快速搅拌混匀1h，搅拌时避免产生气泡。4℃静置12h，如无分层，0.22μm滤膜过滤后，加入上述研磨后冻干粉，搅拌混匀30min，分装入库，分装时需持续搅拌，分装。
不完全佐剂的制备：使用量筒量取300ml石蜡油和100ml Span 80倒入烧杯中，快速搅拌混匀1h，搅拌时避免产生气泡。4℃静置12h，如无分层，0.22μm滤膜过滤后分装入库，分装时需持续搅拌。
免疫球蛋白为鼠IgG、兔IgG、鸡IgY等物种免疫球蛋白。
实施例1
(一)抗血清制备方案
1、准备工作：40-50kg健康绵羊。
①卡介苗液：10ml生理盐水溶解100mg卡介苗；
②初免试剂：1ml鼠IgG免疫球蛋白(3mg/ml)+1ml自制完全佐剂乳化；
③加强免疫试剂：0.5ml鼠IgG免疫球蛋白(3mg/ml)+0.5ml生理盐水+1ml自制不完全佐剂乳化；
2、基础免疫：绵羊颈部两侧、双腋窝、双腹股沟淋巴结内注射100mg卡介苗液；
3、初免(基础免疫10天后)：在肿胀的淋巴结内注入自制完全佐剂乳化的免疫球蛋白3mg；
4、二免(初免后8周)：在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的免疫球蛋白1.5mg；
5、三免(二免后2周)：在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的免疫球蛋白1.5mg；
6、采血：免疫8天后采血测定效价，血清效价达到2^18，进行后续加强免疫，方法同三免，血清效价达到2^19后，进行静脉或动脉采血。
(二)抗体纯化填料制备方案
1使用偶联缓冲液(0.2M NaHCO3+300mM NaCl,pH 8.3)对免疫球蛋白进行透析置换缓冲液，1:40透析两次，测蛋白浓度及体积，计算蛋白含量；
2按琼脂糖凝胶柱体积：免疫球蛋白＝1ml:8mg(V/W)的比例称取相应质量的CNBr琼脂糖冻干粉，1g冻干粉可溶胀为3.5mL的琼脂糖凝胶；
3使用适量的1mM HCl将琼脂糖干粉重悬溶胀后，放置4℃活化10小时；
4将活化好的CNBr填料装进层析柱中，用1mM HCl冲洗至少5倍填料体积，再用去离子水冲洗(5-10倍填料体积)将柱内HCl完全置换，然后使用偶联缓冲液(0.2M NaHCO3+300mM NaCl,pH 8.3)平衡5倍填料体积；
5将平衡好的琼脂糖凝胶柱料和透析好的免疫球蛋白按照步骤2的比例于20-25℃条件下在旋转混合仪上充分混合3小时进行偶联，旋转速度20rpm；
6漂洗：将偶联后的柱料填充到层析柱内，使用5倍柱体积的偶联缓冲液(0.2MNaHCO3+300mM NaCl,pH 8.3)漂洗；收集流出，测蛋白浓度及其体积，用于评价偶联效果；
7将柱料转移到0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中静置两个小时，用于终止偶联；
8漂洗：使用至少5倍柱料体积的0.1M醋酸钠/醋酸缓冲液(pH 4.0)和0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)交替漂洗，至少漂洗三次；
9将柱料保存在0.01M PBS(pH 7.4)中，保存于4℃。
(三)抗体纯化方案
1将冷冻保存的二抗血清在20-25℃流水融化，滤纸过滤去除杂质；
2在柱中填装偶联好的免疫亲和层析柱填料，使用5-10倍柱体积的10mM PBS(pH7.4)清洗柱；
3平衡：使用5倍柱体积的平衡缓冲液10mM PBS(pH 7.4)平衡层析柱，平衡结束后调整蛋白紫外检测仪A280显示值为0，准备上样；
4按照血清体积：层析柱填料体积＝2：1比例，量取抗血清进行上样；
5上样：确定血清体积后，加入一倍血清体积的平衡缓冲液10mM PBS(pH 7.4)和0.1倍血清体积的100mM PBS(pH 7.4)，搅拌混匀，作为上清上样，上样速度为4-6mL/min，蛋白紫外检测仪显示值大于0.2时开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.2时停止收集流穿液，将第一遍收集的流穿液再循环上样一次，使抗体充分结合；
6洗杂：上样结束后用5-10倍柱体积的平衡缓冲液10mM PBS(pH 7.4)洗杂至蛋白紫外检测值A280显示值为0；
7解离：使用0.1M Gly(pH 2.7)+5％甘油洗脱抗体，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白，收集管中预先加入0.1倍收集体积的2M Tris(pH 8.0)+3M NaCl，解离速度为6-10mL/min，可分管收集抗体。
8抗体透析：将解离后的抗体浓度调为6±1mg/mL，透析至20mM Tris(pH 8.5)+150mM NaCl+5％甘油中，透析比为1:50，透析一次，透析时间控制在12-24小时之间。
9层析柱处理：柱保存于10mM PBS(7.4)中，2-8℃保存，长期不用则保存于10mMPBS(7.4)+0.1％ P300中。
10抗体处理：将透析后的抗体浓度调至5mg/mL，加海藻糖至终浓度为3％，0.22μm滤膜过滤，加防腐剂P300至终浓度为0.1％，分装保存。
纯化方案中
第7步中2M Tris+3M NaCl，作用是保护抗体活性；
第8步中透析液配方为改进步骤，避免抗体出现沉淀，增强抗体稳定性。
免疫亲和纯化方案获得抗体纯度>95％，常规硫酸铵沉淀法获得蛋白纯度约60％。
实施例2采用本发明不完全佐剂与sigma佐剂组抗血清免疫结果
羊抗兔IgG项目
实验动物：绵羊；初免：3mg免疫原/只，1ml完全佐剂乳化，背部皮下、腋窝20点免疫；加强免疫：2mg免疫原/只，1ml不完全佐剂乳化，腋窝20点免疫，周期为21天，第三次免疫7天后采血检测效价。继续进行加强免疫，直至血清效价不再增加。
表1免疫方案
| 1组 | 2组 | |
| 初免佐剂(完全佐剂) | Sigma | Sigma |
| 加强佐剂(不完全佐剂) | 自制 | Sigma |
| 数量 | 50只 | 50只 |
表2免疫效价结果
结论：自制不完全佐剂组80％羊只效价高于2^18，外购sigma不完全佐剂组80％羊只效价高于2^17。
实施例3
羊抗鼠、羊抗兔、羊抗鸡IgY项目
实验动物：绵羊；初免：3mg免疫原/只，1ml完全佐剂乳化，背部皮下、腋窝20点免疫；加强免疫：2mg免疫原/只，1ml不完全佐剂乳化，腋窝20点免疫，免疫间隔周期为21天，第三次免疫7天后采血检测效价。继续进行加强免疫，直至血清效价不再增加。
表3：免疫方案
实验结果见表4-6。
表4羊抗鼠免疫结果
| 羊抗鼠 | 佐剂① | 佐剂② | 佐剂③ |
| 2^17 | 1 | ||
| 2^18 | 4 | 4 | 1 |
| 2^19 | 5 | 5 | 6 |
| 2^20 | 1 | 3 |
表5羊抗兔免疫结果
| 羊抗兔 | 佐剂① | 佐剂② | 佐剂③ |
| 2^15 | 1 | ||
| 2^16 | 2 | 1 | 1 |
| 2^17 | 2 | 1 | 1 |
| 2^18 | 3 | 6 | 4 |
| 2^19 | 2 | 2 | 2 |
| 2^20 | 2 |
表6羊抗鸡免疫结果
| 羊抗鸡 | 佐剂① | 佐剂② | 佐剂③ |
| 2^18 | 7 | ||
| 2^19 | 3 | 6 | 3 |
| 2^20 | 4 | 7 |
佐剂①：自制完全佐剂(其中含有1mg/ml卡介苗)
佐剂②：自制完全佐剂(其中含有5mg/ml卡介苗)
佐剂③：自制完全佐剂(其中含有5mg/ml卡介苗+5mg/ml聚肌胞)
结论：添加卡介苗、聚肌胞可提高血清效价，优选添加量5mg/ml。
实施例4亲和纯化法的蛋白纯度高于硫酸铵沉淀法抗体纯化
分别采用本发明的亲和纯化法与现有技术中硫酸铵沉淀法对抗体进行纯化，结果见图1和图2所示，从图中可以看出，图1免疫亲和法纯化，图中1#泳道蛋白大小约150KD，符合羊IgG蛋白大小特征，且1#泳道仅有一条蛋白，目的蛋白(羊抗鼠蛋白)纯度约95％。图2硫酸铵沉淀法纯化，图中1#泳道存在2条蛋白，蛋白大小约150KD和66KD，符合羊IgG蛋白和白蛋白理化特征，目的蛋白(羊抗鼠蛋白)纯度约60％。综上，亲和纯化法的蛋白纯度高于硫酸铵沉淀法。
Claims (10)
1.一种二抗血清免疫方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用免疫球蛋白与完全佐剂乳化，对绵羊进行初免；
S2、免疫球蛋白与不完全佐剂乳化，对绵羊进行二免和三免；
S3、免疫8-10天后采血测定效价，血清效价达到2^(18~19)后，进行静脉或动脉采血，若未达到，可进行后续加强免疫，方法同三免；
S4、在柱中填装偶联好的免疫亲和层析柱填料，清洗，平衡；
S5、上样：确定血清体积后，加入一倍血清体积的平衡缓冲液和0.1倍血清体积的100mMPBS，搅拌混匀，作为上清上样，上样速度为4-6mL/min，蛋白紫外检测仪显示值大于0.2时开始收集流穿液，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.2时停止收集流穿液，将第一遍收集的流穿液再循环上样一次，使抗体充分结合；
S6、上样结束后用5-10倍柱体积的平衡缓冲液洗杂至蛋白紫外检测值A280显示值为0；
S7、解离：洗脱抗体，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白，收集管中预先加入0.1倍收集体积的2 M Tris (pH8.0) + 3 M NaCl，解离速度为6-10mL/min，可分管收集抗体；
S8、抗体透析：将解离后的抗体浓度调为5~7mg/mL，透析，透析时间控制在12-24小时之间；
S9、层析柱处理：柱保存于10mM PBS(7.4)中，2-8℃保存，长期不用则保存于10mM PBS(7.4)+0.1% P300中；
S10抗体处理：将透析后的抗体浓度调至5mg/mL，加海藻糖至终浓度为3%，0.22μm滤膜过滤，加防腐剂P300至终浓度为0.1%，分装保存。
2.根据权利要求1所述的二抗血清免疫方案，其特征在于，S1中所述完全佐剂为石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后，添加卡介苗至终浓度为5mg/ml的试剂。
3.根据权利要求1所述的二抗血清免疫方案，其特征在于，S2中所述不完全佐剂是石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后的试剂。
4.根据权利要求1所述的二抗血清免疫方案，其特征在于，S4中所述偶联好的免疫亲和层析柱为CNBr-免疫原偶联填料。
5.根据权利要求1所述的二抗血清免疫方案，其特征在于，S5中所述免疫亲和层析柱的偶联方法为：
使用偶联缓冲液对免疫球蛋白进行透析置换缓冲液，透析两次，测蛋白浓度及体积；称取CNBr琼脂糖冻干粉，溶胀为琼脂糖凝胶，活化，装柱，平衡；将平衡好的琼脂糖凝胶柱料和透析好的免疫球蛋白于20 - 25℃条件下在旋转混合仪上充分混合3小时进行偶联；将偶联后的柱料填充到层析柱内，使用5倍柱体积的偶联缓冲液漂洗；收集流出，测蛋白浓度及其体积；将柱料转移到0.1M Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中静置两个小时，用于终止偶联。
6.根据权利要求1所述的二抗血清免疫方案，其特征在于，S6中所述平衡缓冲液为10mMPBS，pH 7.4。
7.根据权利要求1所述的二抗血清免疫方案，其特征在于，S7中使用0.1M Gly(pH 2.7)+ 5%甘油洗脱抗体。
8.根据权利要求1所述的二抗血清免疫方案，其特征在于，S8中透析至20mM Tris (pH8.5) + 150 mM NaCl + 5%甘油中，透析比为1:30~50。
9.一种二抗免疫完全佐剂，其特征在于，所述完全佐剂为石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后，添加卡介苗至终浓度为5mg/ml的试剂。
10.一种二抗免疫不完全佐剂，其特征在于，所述不完全佐剂是石蜡油与Span 80按照3：1比例混合后的试剂。
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