CN115124060B - 一种氢氧化铝佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种氢氧化铝佐剂及其制备方法和应用，涉及疫苗免疫佐剂领域，包括：设置计量泵A与B的流速比，泵A添加氯化铝溶液，泵B添加氨水或氢氧化钠溶液，剪切泵开度10‑60％，58‑70℃条件下在静态混合器中完成混合反应，经搅拌后进入陈化阶段，初始反应温度62‑65℃反应10‑20min，以升温速度为5℃/10min‑5℃/20min升温，最终反应温度为80‑90℃反应10‑20min；经过滤、透析、搅拌、灭菌和分装得氢氧化铝佐剂成品。该佐剂质量指标良好、稳定且均一，提高了佐剂免疫吸附效果及疫苗质量、有效性及安全性。本发明采用连续化控制方式，有利于生产规模扩大及突发应急时佐剂产量的保障。

Description

一种氢氧化铝佐剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及疫苗免疫佐剂技术领域，具体涉及一种氢氧化铝佐剂及其制备方法和应用。
背景技术
铝佐剂是目前应用最广的一种疫苗免疫佐剂，主要有氢氧化铝和磷酸铝两种，其中氢氧化铝佐剂是使用最为广泛的疫苗免疫佐剂。
氢氧化铝佐剂通过各种物理或化学相互作用对抗原进行吸附，包括静电引力、疏水作用、范德华力、氢键及表面羟基与磷酸基团之间的配体交换，所涉及的作用机制较复杂（张林焱，综述，周旭，审校.疫苗用氢氧化铝佐剂的研究现状［J］.中国生物制品学杂志，2020，33（2）：213-215，221.）。氢氧化铝佐剂的作用机理可能是佐剂吸附抗原后，增加了抗原的表面积，充分暴露抗原表面结合位点，缓慢释放抗原，提高抗原应答，增强抗体的免疫原性，刺激抗体呈递，促进细胞因子分泌，加强T细胞和B细胞的协同作用，增强体液免疫应答（O’Hagan DT.Vaccine Adjuvants［M］.New Jersey:Humana Press Totowa，2000:1-49.）。另外，在用于抗原吸附的过程中，佐剂颗粒越小，比表面积越大，表面反应活性越高，表面活性中心越多，黏附能力越强，对抗原的吸附率越高。因此，在氢氧化铝佐剂使用过程中，疫苗抗原性质及结构，缓冲体系及添加剂，氢氧化铝佐剂性质特征在一定程度上会对氢氧化铝吸附抗原的免疫吸附效果及免疫效果产生影响。因此，加强氢氧化铝佐剂的生产质量控制，开展新型、高效、稳定的连续化氢氧化铝佐剂制备工艺，对确保佐剂免疫吸附效果及疫苗的安全性、有效性和质量均具有非常重要的意义。
目前，现有的氢氧化铝佐剂制备方法采用的是滴定反应，将氨水或氢氧化钠溶液逐滴加入氯化铝中，此过程需要控制反应温度、滴加速度、搅拌速度与反应终点pH值；同时，氢氧化铝佐剂溶液在灭菌及储存过程中容易出现结块、聚沉等现象，氢氧化铝佐剂溶液很不稳定，且需要重新制备，增加了制备成本。
发明内容
为了解决现有氢氧化铝佐剂制备方法存在的不足，本发明提供一种氢氧化铝佐剂及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种氢氧化铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：
将计量泵A与B的流速比设为(0.26-0.30):0.1或(0.65-0.71):0.1，计量泵A添加氯化铝溶液，计量泵B添加氨水溶液或氢氧化钠溶液，将剪切泵开度设为10-60%，58-70℃条件下在静态混合器中完成混合反应，搅拌时间为30-60min，搅拌速度为150-500 rpm；进入陈化阶段，初始反应温度为62-65℃、反应时间为10-20min，以升温速度为5℃/10min-5℃/20min进行升温，最终反应温度为80-90℃、反应时间为10-20min；经过滤、透析、搅拌、灭菌和分装，得到氢氧化铝佐剂成品。
作为优选的实施方式，所述氯化铝溶液的浓度为0.25-0.32mol/L；所述氯化铝溶液中含有终浓度为0.5-2.0mol/L的氯化钠；所述氨水溶液的浓度为3-4mol/L；所述氢氧化钠溶液的浓度为0.2-1.2mol/L。
作为优选的实施方式，所述剪切泵开度设为50%。
作为优选的实施方式，所述初始反应温度为65℃、反应时间为15min；所述升温速度为5℃/15min；所述最终反应温度为85℃、反应时间为15min。
作为优选的实施方式，所述混合反应中，搅拌时间为60min，搅拌速度为150 rpm。
作为优选的实施方式，经过滤18小时以上、透析3-5天后进行搅拌。
作为优选的实施方式，所述搅拌时间为30-60min，搅拌速度为300-500rpm。
作为优选的实施方式，所述灭菌和分装的具体操作过程如下：
将氢氧化铝溶液分装至容器内，121℃、30-60min湿热灭菌，在B/A级环境下，组装好灭菌封闭系统，将灭菌后的氢氧化铝溶液抽取到瓶内，将瓶子置于振荡器上，设置振荡器振荡速度为30-40 rpm，振荡时间为3-5 min，使瓶内的氢氧化铝佐剂充分混匀后，分装至容器内，得到氢氧化铝佐剂成品。
本发明的一种氢氧化铝佐剂的制备方法制备的氢氧化铝佐剂。
本发明的氢氧化铝佐剂作为疫苗免疫佐剂的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的一种新型氢氧化铝佐剂制备工艺，首先进行氨水溶液配制、氯化铝溶液配制及氢氧化钠溶液配制，利用计量泵、剪切泵及静态混合器的精确流量控制及高效混合剪切作用，使氨水溶液或氢氧化钠溶液与含氯化钠的氯化铝溶液在剪切泵腔体及静态混合器内完成反应，设置A泵与B泵的流速比例（A泵为含氯化钠的氯化铝溶液，B泵为氨水溶液或氢氧化钠溶液），控制剪切泵开度，在一定温度条件下完成混合反应，搅拌一定时间，进入陈化阶段，设置陈化阶段的初始反应温度，升温速度、最终反应温度、陈化总时间及搅拌时间，随后进入过滤、透析、搅拌、灭菌及分装阶段，摸索最佳的条件进而制备氢氧化铝佐剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明所制备的氢氧化铝佐剂的各项质量指标，除药典规定16项检测指标外，粒径大小及分布、电镜结构、对抗原的吸附能力、等电点等均良好、稳定且均一，氢氧化铝佐剂溶液在灭菌及储存过程中不会出现结块、聚沉等现象，氢氧化铝佐剂的质量控制得到了良好保障，有利于氢氧化铝佐剂生产的连续性和成本控制。
2、本发明提高了佐剂免疫吸附效果，提高了疫苗的质量、有效性及安全性。
3、本发明充分利用现代设备的功能性，采用连续化控制方式，生产过程无需控制反应温度、滴加速度、搅拌速度与反应终点pH值等，有利于生产规模扩大及突发应急时产量的保障，为开展新型、高效、稳定的连续化氢氧化铝佐剂生产提供了新途径。
4、本发明增加陈化阶段，有利于实现对氢氧化铝佐剂勃姆石的晶型结构有序化的控制。
5、本发明可以配制不同粒径且粒径均一的氢氧化铝佐剂，可以解决针对不同的抗原需要配制不同粒径大小的氢氧化铝佐剂的问题。
附图说明
图1为实施例1中所制备的氢氧化铝佐剂的电镜扫描结果。图中，a、b、c分别为陈化后、透析后、灭菌后的氢氧化铝佐剂的电镜扫描结果。
图2为实施例2中所制备的氢氧化铝佐剂的电镜扫描结果。图中，a、b、c分别为陈化后、透析后、灭菌后的氢氧化铝佐剂的电镜扫描结果。
图3为实施例3中所制备的氢氧化铝佐剂的电镜扫描结果。图中，a、b、c分别为陈化后、透析后、灭菌后的氢氧化铝佐剂的电镜扫描结果。
图4为实施例1中所制备的氢氧化铝佐剂粒径大小结果。
图5为实施例2中所制备的氢氧化铝佐剂粒径大小结果。
图6为实施例3中所制备的氢氧化铝佐剂粒径大小结果。
图7为实施例1中所制备的氢氧化铝佐剂X-射线衍射结果。
图8为实施例2中所制备的氢氧化铝佐剂X-射线衍射结果。
图9为实施例3中所制备的氢氧化铝佐剂X-射线衍射结果。
图10为实施例3中所制备的氢氧化铝佐剂的等电点。
图11为实施例3中所制备的氢氧化铝佐剂的等电点。
图12为实施例3中所制备的氢氧化铝佐剂的等电点。
图13为试验例2中I型和Ⅱ型出血热病毒中和抗体滴度测定结果。图中，a为阴性对照，b为病毒对照，c为免疫28天抗体滴度为1:40，d为免疫28天抗体滴度为1:20，e为免疫28天抗体滴度为1:10，A：中和用出血热病毒为76-118株，B中和用出血热病毒为：UR株。
具体实施方式
本发明的一种氢氧化铝佐剂的制备方法，利用计量泵、剪切泵及静态混合器的精确流量控制及高效混合剪切作用，使氨水溶液或氢氧化钠溶液与氯化铝溶液在剪切泵腔体及静态混合器内完成反应。
本发明的一种氢氧化铝佐剂的制备方法，主要包括以下步骤：
将计量泵A与B的流速比设为(0.26-0.30):0.1或(0.65-0.71):0.1，计量泵A添加氯化铝溶液，计量泵B添加氨水溶液或氢氧化钠溶液，将剪切泵开度设为10-60%，58-70℃条件下在静态混合器中完成混合反应，搅拌时间为30-60min，搅拌速度为150-500 rpm；进入陈化阶段，初始反应温度为62-65℃、反应时间为10-20min，以升温速度为5℃/10min-5℃/20min进行升温，最终反应温度为80-90℃、反应时间为10-20min；经过滤、透析、搅拌、灭菌和分装，得到氢氧化铝佐剂成品。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1氢氧化铝佐剂的制备
1、溶液配制：
氯化铝溶液的配制：按照氯化铝与水的质量比为1:24的比例将氯化铝与水混合均匀，即得氯化铝溶液，浓度为0.312mol/L；向氯化铝溶液中加入氯化钠，使氯化钠的终浓度为0.5M。
氨水溶液的配制：按照浓氨水与水的质量比为1:3的比例将浓氨水与水混合均匀，即得氨水溶液，浓度为3.314mol/L。
氢氧化钠溶液的配制：以1L为例，将40g氢氧化钠粉末用注射用水定容至1L，浓度为1mol/L。
2、将计量泵A与B的流速比设为(0.65-0.71):0.1，计量泵A添加含终浓度0.5mol/L氯化钠的氯化铝溶液0.32mol/L，计量泵B添加氨水溶液4mol/L，将剪切泵开度设为50%，62℃条件下在静态混合器中完成混合反应，搅拌时间为60min，搅拌速度为150rpm；随后停止搅拌进入陈化阶段，初始反应温度为65℃、反应时间为15min，以升温速度为5℃/15min（每间隔15min升温5℃）进行升温，最终反应温度为85℃、反应时间为15min；将上述反应的收获液注入覆盖有无毛过滤布的不锈钢滤槽中，进行过滤18小时以上；将氢氧化铝沉淀用不锈钢铲子收到不锈钢桶和不锈钢盆中，用透析纸包袋，每袋300g左右，用纯化水流水透析，透析过程中每日揉和透析袋3次，混匀袋中的氢氧化铝，进行透析4天；以搅拌速度为400rpm条件下搅拌50min，搅拌后进入灭菌和分装阶段，将氢氧化铝溶液分装至容器内，121℃、30min湿热灭菌，在B/A级环境下，组装好灭菌封闭系统，将灭菌后的氢氧化铝溶液抽取到瓶内，将瓶子置于振荡器上，设置振荡器振荡速度为35rpm，振荡时间为4min，保证分装过程样品的均一性；使瓶内的氢氧化铝佐剂充分混匀后，分装至容器内，得到氢氧化铝佐剂成品。
实施例2氢氧化铝佐剂的制备
1、溶液配制：
同实施例1。
2、将计量泵A与B的流速比设为(0.26-0.30):0.1，计量泵A添加含终浓度2.0mol/L氯化钠的氯化铝溶液（0.25mol/L），计量泵B添加氢氧化钠溶液（1.2mol/L），将剪切泵开度设为10%，58℃条件下在静态混合器中完成混合反应，搅拌时间为30min，搅拌速度为500rpm；随后停止搅拌进入陈化阶段，初始反应温度为62℃、反应时间为20min，以升温速度为5℃/20min（每间隔20min升温5℃）进行升温，最终反应温度为90℃、反应时间为10min；将上述反应的收获液注入覆盖有无毛过滤布的不锈钢滤槽中，进行过滤18小时以上；将氢氧化铝沉淀用不锈钢铲子收到不锈钢桶和不锈钢盆中，用透析纸包袋，每袋300g左右，用纯化水流水透析，透析过程中每日揉和透析袋3次，混匀袋中的氢氧化铝，进行透析3天；以搅拌速度为300rpm条件下搅拌30min，搅拌后进入灭菌和分装阶段，将氢氧化铝溶液分装至容器内，121℃、60min湿热灭菌，在B/A级环境下，组装好灭菌封闭系统，将灭菌后的氢氧化铝溶液抽取到瓶内，将瓶子置于振荡器上，设置振荡器振荡速度为40rpm，振荡时间为5min，保证分装过程样品的均一性；使瓶内的氢氧化铝佐剂充分混匀后，分装至容器内，得到氢氧化铝佐剂成品。
实施例3氢氧化铝佐剂的制备
1、溶液配制：
同实施例1。
2、将计量泵A与B的流速比设为(0.26-0.30):0.1，计量泵A添加含终浓度1.5mol/L氯化钠的氯化铝溶液（0.3mol/L），计量泵B添加氢氧化钠溶液（0.2mol/L），将剪切泵开度设为60%，70℃条件下在静态混合器中完成混合反应，搅拌时间为50min，搅拌速度为400rpm；随后停止搅拌进入陈化阶段，初始反应温度为62℃、反应时间为15min，以升温速度为5℃/15min（每间隔20min升温5℃）进行升温，最终反应温度为80℃、反应时间为20min；将上述反应的收获液注入覆盖有无毛过滤布的不锈钢滤槽中，进行过滤18小时以上；将氢氧化铝沉淀用不锈钢铲子收到不锈钢桶和不锈钢盆中，用透析纸包袋，每袋300g左右，用纯化水流水透析，透析过程中每日揉和透析袋3次，混匀袋中的氢氧化铝，进行透析5天；以搅拌速度为500rpm条件下搅拌60min，搅拌后进入灭菌和分装阶段，将氢氧化铝溶液分装至容器内，121℃、50min湿热灭菌，在B/A级环境下，组装好灭菌封闭系统，将灭菌后的氢氧化铝溶液抽取到瓶内，将瓶子置于振荡器上，设置振荡器振荡速度为30rpm，振荡时间为3min，保证分装过程样品的均一性；使瓶内的氢氧化铝佐剂充分混匀后，分装至容器内，得到氢氧化铝佐剂成品。
试验例1氢氧化铝佐剂理化参数检测
1、氢氧化铝佐剂粒径大小及分布：
采用马尔文粒径仪对粒径大小及分布进行测定，结果如图4-6所示，分别对应实施例1-3，实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂粒径大小分别为96.72nm、112.8nm和149.4nm（表3）。结果显示，本发明实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂产品粒径均一性较好。
2、氢氧化铝佐剂的电镜结构、晶体类型测定
电镜扫描结果如图1-3所示，分别对应实施例1-3。结果显示，本发明实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂产品形态相对较均匀。
利用X-射线衍射测定氢氧化铝佐剂的晶体形态，X-射线衍射结果如图7-9所示，分别对应实施例1-3，实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂晶体类型均为PCB（表3）。结果显示，本发明实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂产品符合PCB晶型特征。
3、氢氧化铝佐剂对抗原的吸附能力测定
用本发明实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂吸附出血热Ⅰ型和出血热Ⅱ型抗原，吸附2h后，析出上清液，用现有出血热抗原检测试剂盒（长春生物制品研究所有限责任公司）测定出血热抗原含量，以630nm为参考波长，在450nm波长读取各孔OD值，空白孔调零。
检定结果的解释：
（1）Cut-off=阴性对照平均OD值×2.1（阴性对照OD值小于0.05时按0.05计算）。
（2）样品OD值大于等于Cut-off值时，待测样品判定为阳性，样品OD值小于Cut-off值时，待测样品判定为阴性。
表1出血热I型抗原吸附情况
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表2出血热Ⅱ型抗原吸附情况
Figure DEST_PATH_IMAGE006
结果表明，吸附前，出血热原液抗原含量为1:256，吸附后，抗原检测结果均为阴性（表3），由此证明抗原被本发明实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂吸附效果良好。
2、氢氧化铝佐剂表面电荷的测定及等电点的计算
采用Zeta电位分析仪测定样品表面电荷，计算出氢氧化铝佐剂的等电点（表3），如图10-12所示，对应实施例1-3，实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂等电点分别为10.00、10.07和10.12。
4、氢氧化铝佐剂沉降率的测定
沉降率测定参照中国药典2020版。结果如表3所示。实施例1-3所制备的氢氧化铝佐剂沉降率分别为0.04、0.08和0.05。
表3
项目 实施例1 实施例2 实施例3
粒径大小（nm） 96.72 112.8 149.4
晶体类型 PCB PCB PCB
抗原吸附能力 吸附后抗原阴性 吸附后抗原阴性 吸附后抗原阴性
等电点 10.00 10.07 10.12
沉降率 0.04 0.08 0.05
综上所述，本发明所制备的氢氧化铝佐剂的质量指标（除药典规定16项检测指标外），如粒径大小及分布、电镜结构、对抗原的吸附能力、等电点等均良好、稳定且均一，氢氧化铝佐剂的质量控制得到了良好保障，能够有效保障所制备的疫苗的高质量、有效性及安全性。
试验例2氢氧化铝佐剂制备疫苗相关试验
（1）疫苗制备：用0.01mol/L PBS溶液稀释出血热I型和Ⅱ型抗原含量至1:128，I型和Ⅱ型单价原液1:1混合，振荡30分钟，据预计配制的液量加入终浓度为1.0mg/ml的氢氧化铝溶液振荡30分钟，制备成实验性双价出血热灭活疫苗。
（2）效价测定：接种2kg左右白色家兔4只，免疫2次，间隔14天，每只后肢肌肉注射1.0ml，第一次免疫后4周采血，分离血清，蚀斑减少中和试验测定中和抗体，中和用病毒为出血热76-118株和UR株（来源：中国食品药品检验研究院），同时用参考血清（正常兔子血清）做阴性对照，单独病毒组作为病毒对照。
（3）测定结果：4只家兔的I型和Ⅱ型出血热病毒中和抗体滴度均为1:20。
本发明公开了一种氢氧化铝佐剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (8)

1.一种氢氧化铝佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将计量泵A与B的流速比设为(0.26-0.30):0.1或(0.65-0.71):0.1，计量泵A添加氯化铝溶液，计量泵B添加氨水溶液或氢氧化钠溶液，将剪切泵开度设为10-60%，58-70℃条件下在静态混合器中完成混合反应，搅拌时间为30-60min，搅拌速度为150-500 rpm；进入陈化阶段，初始反应温度为62-65℃、反应时间为10-20min，以升温速度为5℃/10min-5℃/20min进行升温，最终反应温度为80-90℃、反应时间为10-20min；经过滤、透析、搅拌、灭菌和分装，得到氢氧化铝佐剂成品；
所述氯化铝溶液的浓度为0.25-0.32mol/L；所述氯化铝溶液中含有终浓度为0.5-2.0mol/L的氯化钠；所述氨水溶液的浓度为3-4mol/L；所述氢氧化钠溶液的浓度为0.2-1.2mol/L。
2.根据权利要求1所述的一种氢氧化铝佐剂的制备方法，其特征在于，所述剪切泵开度设为50%。
3.根据权利要求1所述的一种氢氧化铝佐剂的制备方法，其特征在于，所述初始反应温度为65℃、反应时间为15min；所述升温速度为5℃/15min；所述最终反应温度为85℃、反应时间为15min。
4.根据权利要求1所述的一种氢氧化铝佐剂的制备方法，其特征在于，所述混合反应中，搅拌时间为60min，搅拌速度为150 rpm。
5.根据权利要求1所述的一种氢氧化铝佐剂的制备方法，其特征在于，经过滤18小时以上、透析3-5天后进行搅拌。
6.根据权利要求1所述的一种氢氧化铝佐剂的制备方法，其特征在于，所述灭菌和分装的具体操作过程如下：
将氢氧化铝溶液分装至容器内，121℃、30-60min湿热灭菌，在B/A级环境下，组装好灭菌封闭系统，将灭菌后的氢氧化铝溶液抽取到瓶内，将瓶子置于振荡器上，设置振荡器振荡速度为30-40 rpm，振荡时间为3-5 min，使瓶内的氢氧化铝佐剂充分混匀后，分装至容器内，得到氢氧化铝佐剂成品。
7.如权利要求1所述的一种氢氧化铝佐剂的制备方法制备的氢氧化铝佐剂。
8.如权利要求7所述的氢氧化铝佐剂作为疫苗免疫佐剂的应用。
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