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Diese
Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung nicht-kovalent komplexierter
multivalenter Proteosom-Impfstoffe für eine Verabreichung an Schleimhäute und
eine parenterale Verabreichung, sowie Zusammensetzungen dafür.
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Um
zu ermöglichen,
dass multivalente Untereinheiten-Impfstoffe für jede der Komponenten eine
optimale Immunantwort stimulieren, sollten die geeigneten Komponenten
zweckmäßig assoziiert
und jeweils für das
Immunsystem verfügbar
sein, so dass sie von Zellen des Immunsystems effizient erkannt
und verarbeitet werden können.
Wichtige Beispiele solcher nicht-kovalent komplexierter Impfstoffe
umfassen Proteosom-Impfstoffe, die aus äußeren Membranprotein-Proteosomen
von Neisseria bestehen können,
die nicht-kovalent an viele verschiedene Antigene komplexiert sein
können,
einschließlich
Peptide, Lipopeptide, Transmembranproteine oder Toxoidproteine,
Polysaccharide oder Lipopolysaccharide (LPS) (Patentanmeldungen
Nr. 07/065,440, eingereicht am 23. Juni 1987, "Immunogenic peptide vaccines and methods
of preparation"; 07/336,952,
eingereicht am 12. April 1989, "Immunopotentiating
system for large proteins and polypeptides"; 07/958,426, eingereicht am 8. Oktober
1992, "Oral or Intranasal
Vaccines Using Hydrophobic Complexes Having Proteosomes and Lipopolysaccharides"; 08/029,666, eingereicht
am 11. März
1993, "Immunopotentiating Systems
for Preparation of Immunogenic Materials"; 08/143,365, eingereicht am 29. Oktober
1993, "Immunopotentiating
Systems for Preparation of Immunogenic Materials"; 93/10,402, eingereicht am 29. Oktober
1993, "Submicron
Emulsions as Vaccine Adjuvants";
08/063,613, eingereicht am 18. Mai 1994, "Solid Fat Nanoemulsions as Vehicles
for Vaccine Delivery" und
die Veröffentlichungen
N. Orr, G. Robin, D. Cohen, R. Arnon und G.H. Lowell, "Immunogenicity and
Efficacy of Oral or Intranasal Shigella flexneri 2a and Shigella
sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal Models", Infect. Immun.
61, 2390 (1993); C.P. Mallett, T.L. Hale, R. Kaminski, T. Larsen,
N. Orr, D. Cohen und G.H. Lowell, "Intranasal or intragastric immunization
with proteosome-Shigella lipopolysaccharide vaccines protect against
lethal pneumonia in a murine model of shigellosis", Infect. Immun.
63, 2382–2386
(1995); G.H. Lowell, R.W. Kaminski, S. Grate et al., "Intranasal and intramuscular
proteosome-staphylococcal enterotoxin B (SEB) toxoid vaccines: immunogenicity
and efficacy against lethal SEB intoxication in mice", Infec. Immun. 64,
1706–1713
(1996); G.H. Lowell, "Proteosomes,
Hydrophobic Anchors, Iscoms and Liposomes for Improved Presentation
of Peptide and Protein Vaccines",
in New Generation Vaccines: G.C. Woodrow und M.M. Levine, Hrsg. (Marcel
Decker, NY), Kapitel 12 (Seiten 141–160) (1990) und G.H. Lowell,
W.R. Ballou, L.F. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger und W.T. Hockmeyer, "Proteosome-lipopeptide
vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides", Science 240, 800
(1988).
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C.L.
Ruegg et al. (Journal of Immunological Methods, Band 135, 101–109 (1990))
beschreiben die Herstellung von Impfstoffen auf Proteosombasis.
G.H. Lowell et al. (Science 240, 800–802 (1988)) beschreiben Proteosom-Lipopeptid-Impfstoffe
und die Verstärkung
der Immunogenität
für Malaria-CS-Peptide.
G.H. Lowell et al. (Journal of Experimental Medicine, Band 167,
658–663
(1988)) beschreiben, dass Peptide, die mittels hydrophober Gruppen
an Proteosome gebunden sind, ohne Zusätze stark immunogen werden.
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Für die praktische
Anwendung bei der Verabreichung von Impfstoffen zum Schutz gegen
Krankheiten ist es aufgrund der Empfindlichkeit von Personen gegen
das Zuziehen von Erkrankungen, die durch verschiedene Organismen
verursacht werden, häufig
erforderlich, mehrere solcher Antigene gleichzeitig zu verabreichen.
Darüber
hinaus sind mehrere Organismen ungeachtet davon, ob sie miteinander
verwandt sind oder nicht, häufig
an der gleichen Stelle endemisch, und daher kann für Personen,
die eines Schutzes bedürfen, eine
Impfung mit mehreren Arten von Impfstoffen erforderlich sein.
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In
der Vergangenheit wurde die Herstellung von Impfstoffen, die eine
nicht-kovalente Komplexierung erforderten, unter Verwendung einer
einfachen Dialyse erreicht, bei der die Komponenten in der Gegenwart eines
dialysierbaren Detergenses in einen Dialyseschlauch eingebracht
werden und das Gemisch in einem Versuch, das Detergens zu entfernen,
7 bis 10 Tage dialysiert wird. Die praktischen Nachteile dieses
Systems können
dazu führen,
die fortgeschrittene Entwicklung und Kommerzialisierung dieser Technologie
aus mehreren Gründen
auszuschließen,
einschließlich:
1) Zeit: Die Zeit, die für
das Verfahren erforderlich ist: Das Erfordernis, GMP-Resourcen über Wochen
hinweg zu verwenden, während
der Impfstoff dialysiert, ist sowohl aufgrund der dadurch entstehenden übermäßigen Kosten
als auch aufgrund einer verstärkten
Möglichkeit
für einen
Defekt oder eine Kontaminierung mechanischer oder biologischer Komponenten
während
dieses langen Zeitraums nicht praktikabel; 2) Kontaminierung: Verstärkte Möglichkeit
einer Kontaminierung: Ein Dialyseschlauch ist nur schwer zu sterilisieren
und Dialyseschläuche
erfordern ein manuelles Öffnen
und Schließen des
Systems, wodurch die Komponenten sowohl während des Befüllungs-
als auch während
des Entleerungsprozesses einer Kontamination ausgesetzt sind. Da
zwischen dem Befüllen
und Entleeren der Schläuche
viele Tage vergehen, kann das Risiko einer geringen Kontamination
in den ersten Tagen des Verfahrens während der vielen Tage einer
Dialyse verstärkt
werden, was dieses Verfahren für
die praktische Impfstoffherstellung ungeeignet macht. Das Risiko
eines Durchstoßens
des Beutels kann zu einem Produktverlust führen; 3) Temperatur: Das Erfordernis,
die Dialyse aufgrund der übermäßig langen
Zeit bei 4°C
durchzuführen;
4) Volumen der dialysierenden Fluide: Um einen Impfstoff mit dem
Verfahren im größeren Maßstab zu
erzeugen, wäre
die Verwendung sehr großer
Mengen an Dialysefluid erforderlich, da typischerweise ein Verhältnis der
Flüssigkeit außerhalb
des Dialyseschlauchs zu der Flüssigkeit
innerhalb des Dialyseschlauchs von 200:1 erforderlich ist. Daher
würde beispielsweise
die Herstellung eines Pilotansatzes von 2 Liter eines Impfstoffs
400 Liter Fluid außerhalb
des Schlauchs pro Tag – 4000
Liter in 10 Tagen – erfordern
und die Herstellung einer Produktionscharge von 20 bis 200 Liter
würde 40000
bis 4000000 Liter erfordern. Diese Mengen stellen eine Verschwendung dar
und sind im Vergleich zu dem in der vorliegenden Erfindung eingesetzten
Verfahren nicht praktikabel; der Dialyseschlauch kann nicht vergrößert werden,
da große
Produktmengen problematisch sind; und 5) Unvermögen zur einfachen Messung der
Vollständigkeit
der Detergensentferung, um so die Wirksamkeit des Impfstoffs zu
maximieren. Da der Dialysebeutel in einem Behälter mit 200 Volumina des Puffers
eingebracht ist, ist die laufende Messung der Detergensentfernung
weder praktisch noch möglich;
und 6) darüber
hinaus wurde kein Verfahren zur Messung der Gegenwart des Detergenses
beschrieben, das in der bevorzugten Ausführungsform verwendet wird,
nämlich
Empigen BB.
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Das
zweite in dieser Erfindung gelöste
Problem ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung und
Verabreichung bzw. Abgabe multivalenter Impfstoffe. Die Komponenten
können
entweder zusammen oder einzeln hergestellt und vor der Verabreichung
gemischt werden. Die vorliegende Erfindung zeigt den optimalen Weg
zur Herstellung solcher multivalenter Impfstoffe.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im weiteren Sinn die Herstellung
von Proteosomamphiphile Determinante-Impfstoffen, die entweder für eine parenterale
Verabreichung oder insbesondere für eine Verabreichung an Schleimhäute gestaltet
sind, und zwar unter anderem einschließlich für eine Atemwegsverabreichung
(z.B. einschließlich
intranasal, intrapharyngeal und intrapulmonal), eine gastrointestinale
Verabreichung (z.B. einschließlich
oral oder rektal) oder eine topische Verabreichung (z.B. konjunktival
oder in das Ohr), um sowohl eine systemische Antikörperreaktion
(Serum) als auch eine Schleimhaut-Antikörperreaktion (einschließlich in den
Atemwegen und intestinal) zu induzieren. Eine amphiphile Determinante
ist ein Molekül
mit hydrophoben und hydrophilen Regionen, das sich, wenn es in geeigneter
Weise mit Proteosomen formuliert ist, unter Bildung eines Komplexes
mit den Proteosomen ausrichtet, der in einem Lebewesen eine Immunreaktion induziert.
Typische amphiphile Determinanten umfassen Glycolipide, Liposaccharide
(einschließlich
entgiftete Lipopolysaccharide), Lipopeptide, Transmembran-, Hüll- oder
Toxoidproteine, oder Proteine oder Peptide mit intrinsisch hydrophoben
Aminosäureankern.
Diese Determinantenmaterialien können
aus gramnegativen Bakterien erhalten werden, einschließlich Escherichia,
Klebsiella, Pseudomonas, Hemophilus brucella, Shigella und Neisseria.
Insbesondere betrifft die Erfindung Proteosom-Impfstoffe, bei denen äußere Membranproteinproteosom-Zubereitungen
von Meningokokken (aus einem beliebigen Stamm von N. meningitidis
oder N. gonorrhea oder anderen Neisseria-Arten hergestellt) nicht-kovalent
an native oder entgiftete Shigella- oder Neisseria-Lipopolysaccharide
oder Lipooligosaccharide zur Bildung von Impfstoffen komplexiert
werden, die so gestaltet sind, dass, sie gegen Krankheiten schützen, die
durch gramnegative Organismen verursacht werden, die beliebige Komponententeile
des Komplexes enthalten, einschließlich Meningokokken oder Shigellen.
Insbesondere betrifft die Erfindung Proteosom-Impfstoffe, die LPS
enthalten, das Antikörperreaktionen
induziert, die typspezifische somatische Polysaccharid-O-Antigene
von Shigella-Lipopolysacchariden erkennen und dadurch einen homologen
Schutz gegen eine Shigellose bereitstellen. Insbesondere werden
die Lipopolysaccharide, die dann, wenn sie mit Proteosomen komplexiert
werden, solche anti-Shigella-Schutzimmunreaktionen induzieren,
für eine
Immunität
gegen eine Shigella sonnei-Erkrankung
entweder aus Shigella sonnei oder Plesiomonas shigelloides, für eine Immunität gegen
eine Shigella flexneri 2a-Erkrankung aus Shigella flexneri 2a, usw.,
hergestellt, und zwar unter Verwendung von LPS, das von homologen
oder antigenisch kreuzreagierenden Organismen abgeleitet ist, um
eine homologe Immunität
gegen eine Shigellose zu verleihen, die durch S. flexneri 2a (oder
3a, usw.), S. boydii, S. sonnei, usw., verursacht wird. Ferner beschreibt
die vorliegende Erfindung die erfolgreiche Verabreichung von Proteosom-Shigella-Impfstoffen,
die dahingehend multivalent sind, dass zwei unabhängig unter
Verwendung von Shigella-LPS, abgeleitet von S. flexneri 2a (für eine S.
flexneri 2a-Erkrankung)
und von P. shigelloides oder S. sonnei (für eine S. sonnei-Erkrankung),
hergestellte Proteosom-Impfstoffe zusammen verabreicht werden, wodurch
Antikörper
. induziert werden, welche die beiden Organismen erkennen und dabei
einen Schutz gegen die beiden Erkrankungsarten bereitstellen. Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung einen Proteosom-Shigella-LPS-Impfstoff,
bei dem Proteosomen von Gruppe B-Typ 2-Meningokokken unter Verwendung
einer Hohlfaserdiafiltrationstechnologie mit P. shigelloides-LPS
komplexiert werden, um einen Impfstoff zu erzeugen, der über den
Atemwegsschleimhautweg und/oder den gastrointestinalen Schleimhautweg
verabreicht wird, um Antikörper
zu induzieren, die das somatische O-Antigen-LPS von S. sonnei erkennen
und dadurch gegen eine durch diesen Organismus verursachte Shigellose schützen. Es
sind auch andere herkömmliche
Ultrafiltrations/Diafiltrationsverfahren vorgesehen, wie z.B. eine Plattformmembran
und eine Membrankartusche.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung nicht-kovalent
komplexierter Impfstoffe in einer Weise bereit, dass 1) die erforderliche
Zeit vermindert wird, 2) die Möglichkeiten
einer Kontamination vermindert werden, 3) die Temperatur, bei der
solche Impfstoffe hergestellt werden können, auf Raumtemperatur erhöht wird,
4) eine effiziente Vergrößerung des
Maßstabs
des Herstellungsverfahrens derart ermöglicht wird, dass eine minimale
Reagenzienverwendung erforderlich ist, und 5) eine zuverlässige und
effiziente Probenahme eines Dialysats ermöglicht wird, so dass die Entfernungsrate
des Detergenses wiederholt gemessen werden kann, um die Betriebseffizienz
zu optimieren. Dies führt
direkt zu einer Zunahme der Komplexierungseffizienz des Impfstoffs,
so dass ein Impfstoff mit einer messbar höheren Immunogenität bei niedrigeren
Dosierungen erzeugt wird. Auf diese Weise wird die Gesamtqualität des Produkts
auf signifikante Weise erhöht. 6)
Darüber
hinaus wird ein Verfahren zur Messung der Gegenwart des Detergenses
beschrieben, das in der bevorzugten Ausführungsform verwendet wird,
nämlich
Empigen BB. Anstelle von Empigen BB können auch andere dialysierbare
Detergenzien verwendet werden. Ferner wurde unter Verwendung der
vorliegenden Erfindung gezeigt, dass der Impfstoff derart lyophilisiert
und rehydratisiert werden kann, dass die optimale Impfstoffwirksamkeit,
wie sie durch die Impfstoffimmunogenität gemessen wird, bewahrt werden
kann.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst die Verwendung einer Hohlfaser-Ultrafiltrations/Diafiltrationskartusche,
um eine Komplexierung durch Entfernung des Detergenses zu bewirken.
Durch Variieren der Größe des Gehäuses der
Kartusche kann die Dialysezeit zur Herstellung einer Impfstoffcharge
von >7–10 Tagen
bis auf weniger als 72 Stunden und gewöhnlich weniger als 48 oder
24 Stunden vermindert werden. Da eine solche kurze Zeit eingesetzt
wird, kann die Reaktionstemperatur von 4°C auf normale Raumtemperatur erhöht werden,
ohne das Verfahren oder die Integrität des Produkts zu gefährden. Während das
Verfahren bei etwa 20°C
durchgeführt
wurde, sind Temperaturen zwischen 0°C und 40°C vorgesehen. Da es sich um
ein geschlossenes System handelt, besteht ein stark vermindertes
Kontaminationspotenzial. Darüber
hinaus kann durch die Vergrößerung des
Gehäuses
eine sehr große
Materialmenge in einem relativ kurzen Zeitraum verarbeitet werden,
wodurch eine effiziente und reproduzierbare Vergrößerung des
Verfahrensmaßstabs
für eine kommerzielle
Entwicklung möglich
ist. Ferner können
von der durchgedrungenen Flüssigkeit
wiederholt Proben entnommen werden, um die Entfernung des Detergenzes
zu messen, wie dies unter Verwendung des Tests der vorliegenden
Erfindung zur Messung des Detergenses Empigen BB erreicht werden
kann, bei dem es sich um das in der bevorzugten Ausführungsform
verwendete Detergens handelt. Der einzigartige Charakter dieses
Verfahrens erforderte eine experimentelle Verifizierung, da es nicht
nahe liegend war, dass die Komplexierung und die Struktur des Impfstoffs
zu immunogenen Materialien führen,
die durch langsames Dialysieren während 7 bis 10 Tagen unter
Verwendung eines stationären
Dialysebeutels durch die Verwendung der Hohlfasertechnologie erreicht
oder verbessert werden können,
bei der sich die zu komplexierenden Reste verglichen mit dem stationären Dialyseschlauch
mit sehr hohen Strömungsgeschwindigkeiten
durch Schläuche bewegen.
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Da
die Nenn-Molekulargewichtsgrenze der verwendeten Membran so ausgewählt werden
kann, dass sie abhängig
von der Größe der nicht-kovalent
zu komplexierenden Komponenten bei 1000, 3000, 5000, 10000, 30000,
50000 oder mehr liegt, ist dieses System einfach auf das Komplexieren
nativer oder entgifteter Lipopolysaccharide, Lipide, Peptide, Lipopeptide,
Liposaccharide, Polysaccharide, Ganglioside oder Transmembran-,
Hüll-,
nativer oder Toxoidproteine oder auf äußere Membranproteinzubereitungen
von Proteosomen von Meningokokken anpassbar.
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Das
resultierende Produkt kann als Impfstoff verwendet werden, der entweder
parenteral oder über die
Schleimhäute
verabreicht wird, d.h. über
die Atemwege oder den Gastrointestinaltrakt, wie z.B. intranasal, oral,
durch ein oropharyngeales Inhalationsmittel, topisch oder rektal.
In dem angegebenen Beispiel ist gezeigt, dass Proteosomen nichtkovalent
an P. shigelloides-LPS komplexiert sind, um einen Impfstoff zu bilden, der
die anti-S. sonnei-LPS-Reaktionen
induziert, die für
einen Schutz gegen S. sonnei-Shigellose erforderlich ist.
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Das
Verfahren hat drei Stufen: Einen vorbereitenden Vorgang, die Komplexierung
des Proteosoms mit einer amphiphilen Determinante, wie z.B. P. Shigelloides-LPS
und anschließend
eine Sterilfiltration.
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Bezüglich der
optimalen Abgabe multivalenter Impfstoffe zeigt die vorliegende
Erfindung, dass das beste Verfahren darin besteht, die spezifischen
Impfstoffe einzeln herzustellen und dann am gleichen Tag mit den
beiden einzeln hergestellten Impfstoffen eine Immunisierung durchzuführen, und
zwar jeweils bei der optimalen Konzentration. Andere Möglichkeiten,
wie z.B. die Herstellung von Hybridimpfstoffen während der Bildung der nicht-kovalenten
Komplexe wurden ebenfalls erreicht oder sind vorgesehen.
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1: Immunogenität verschiedener
Zubereitungen des Proteosom-Plesiomonas shigelloides-LPS-Impfstoffs:
anti-Shigella sonnei-LPS-IgG-Titer in Mausseren nach zwei intranasalen
Immunisierungen mit einem Impfstoff, der 10, 1,0 oder 0,1 μg Protein
enthält.
DT-1 und DT-2 – Dialyseschlauch.
HF-1 und HF-2 – Hohlfaserkartusche.
HF-2L – Hohlfaserkartusche
und lyophilisiert. GMP-gute Herstellungspraxis.
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2: Immunogenität verschiedener
Zubereitungen des Proteosom-Plesiomonas shigelloides-LPS-Impfstoffs:
anti-Shigella sonnei-LPS-IgA-Titer in Mausseren nach zwei intranasalen
Immunisierungen mit einem Impfstoff, der 10, 1,0 oder 0,1 μg Protein
enthält.
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3: Mausserum-IgG-Titer nach
der intranasalen Immunisierung mit den Proteosom-Shigella-LPS-Impfstoffen: gleichzeitige
und/oder aufeinander folgende Verabreichung von Impfstoffen für S. sonnei und
S. flexneri 2a. Das Schema 1 bestand aus fünf Mäusen, die an den Tagen 0 und
21 mit dem Proteosom-S. sonnei-LPS-Impfstoff intranasal immunisiert
worden sind (jeweils 10 μg
Proteosom und LPS). Den Mäusen wurde
vier Wochen nach der letzten Immunisierung Blut entnommen. Das Schema
2 bestand aus fünf
Mäusen, die
an den Tagen 0 und 21 mit dem Proteosom-S. flexneri 2a-LPS-Impfstoff
intranasal immunisiert worden sind (jeweils 10 μg Proteosom und LPS). Den Mäusen wurde
vier Wochen nach der letzten Immunisierung Blut entnommen. Das Schema
3 bestand aus fünf
Mäusen,
die an den Tagen 0 und 21 mit dem Proteosom-S. sonnei-LPS-Impfstoff
(jeweils 10 μg
Proteosom und LPS) und dem Proteosom-S. flexneri 2a-LPS-Impfstoff
(jeweils 10 μg
Proteosom und LPS) intranasal immunisiert worden sind. Den Mäusen wurde
vier Wochen nach der letzten Immunisierung Blut entnommen. Das Schema
4 bestand aus vier Mäusen,
die an den Tagen 0 und 21 mit dem Proteosom-S. sonnei-LPS-Impfstoff
(jeweils 10 μg
Proteosom und LPS) und dann an den Tagen 49 und 70 mit dem S. flexneri
2a-LPS-Impfstoff (jeweils 10 μg
Proteosom und LPS) intranasal immunisiert worden sind. Den Mäusen wurde
vier Wochen nach der letzten S. flexneri 2a-Immunisierung Blut entnommen.
Die gemeinsame Verabreichung der Proteosom-P. shigelloides-LPS-
(für S.
sonnei-Shigellose) und der Proteosom-S. flexneri 2a-Impfstoffe am
gleichen Tag oder um Wochen getrennt führte zu einer guten Immunogenität gegenüber sowohl
der S. sonnei-LPS-Komponente als auch gegenüber der S. flexneri 2a-LPS-Komponente.
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4: Elektronenmikrographie
eines Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs, die Goldmarkiertes anti-Shigella
sonnei-LPS zeigt, das mit Proteosomen assoziiert ist. In dieser
Mikrographie identifizieren Gold-markierte sekundäre Antikörper (als
lichtundurchlässige
schwarze Punkte sichtbar) primäre
Antikörper, die
gegen Shigella-LPS gerichtet sind. Es ist ersichtlich, dass das
LPS klar mit den Proteosomvesikeln assoziiert ist.
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5: Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff
schützt
in einem Shigellose-Tiermodell gegen eine letale Shigella sonnei-Pneumonie.
Gruppen ausgezüchteter
Mäuse (14
bis 15 pro Gruppe) wurden in den Wochen 0 und 3 mit dem Proteosom-P.
shigelloides-LPS-Impfstoff intranasal immunisiert (jeweils 10 μg Proteosom
und LPS pro 20 μl).
Kontrollgruppen wurden mit dem gleichen Schema Kochsalzlösungen verabreicht. Alle
Mäuse wurden
in der siebten Woche intranasal mit 5 bis 10 Millionen koloniebildenden
Einheiten von S. Sonnei gereizt. Die Mäuse wurden für 2 Wochen
nach der Reizung täglich
untersucht und die Sterblichkeit, die aus der nachfolgenden Lungenerkrankung
resultierte, wurde aufgezeichnet. Wie es vorstehend gezeigt worden
ist, sterben 86 bis 100 % der Kontrollmäuse innerhalb von 4 Tagen nach
der Reizung. In beiden Experimenten überlebten 93 % der Mäuse, die
mit dem Impfstoff immunisiert worden sind, die Reizung (P < 0,001, exakter
Test nach Fisher).
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6: Eine intranasale oder
orale Immunisierung mit Proteosom-Shigella flexneri 2a-LPS-Impfstoffen induziert
anti-Shigella-LPS-IgG und -IgA im Serum und -IgA in Darm- und Lungenspülfluiden,
die 30 bis 60 Tage nach der Immunisierung anhalten können.
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7: Eine intranasale oder
orale Immunisierung von Menschen mit einer oder zwei Dosen an Proteosom-P.
shigelloides-LPS-Impfstoffen für
Shigella sonnei unter Verwendung verschiedener Impfstoffmengen: Induktion
von anti-Shigella-LPS-IgA-, -IgG- und IgM-ASC-Reaktionen in peripherem Blut, und Antikörperreaktionen
im Serum, Speichel und Harn.
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8: LPS in HPLC-Fraktionen
nach der Anwendung von unkomplexierten P. shigelloides-LPS und Demonstration
einer nicht-kovalenten Komplexierung von LPS und Proteosomproteinen
durch gemeinsame Elution von LPS und Proteinen in HPLC-Fraktionen
nach der Anwendung eines Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs.
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9: Bakterizide Antikörperreaktion
von Mäusen
auf einen Meningokokken-äußeres Membranprotein-entgiftetes
Lipooligosaccharid-Impfstoff, geometrischer Mittelwert des reziproken
Titers gegen den Meningokokkenstamm 9162.
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Proteosom-P. shigelloides-Impfstoffs,
der etwa 2 bis 3 g Protein enthält.
Das Verfahren ist bei einer geeigneten Maßstabsvergrößerung der Gehäusegröße der Membrankartusche
und geeigneter Volumenerhöhung
gleichermaßen
auf eine Maßstabsvergrößerung mit 10-
bis 1000-fach mehr Material anwendbar. Unter Verwendung von Membranen
mit einer geeigneten Größe und mit
einer geeigneten Molekulargewichtsgrenze, um die zu komplexierenden
Antigene zurückzuhalten, kann
dieses Verfahren gleichermaßen
auf die Komplexierung von Proteosomen mit anderen nativen oder entgifteten
Lipopolysacchariden, Lipiden, Peptiden, Lipopeptiden, Liposacchariden,
Polysacchariden, Gangliosiden oder Transmembran-, Hüll- oder nativen oder
Toxoidproteinen oder mit äußeren Membranproteinzubereitungen
oder Proteosomen von Meningokokken angewandt werden. Empigen BB
ist das Detergens, das in diesem Verfahren als Beispiel verwendet
wird. Das Verfahren ist jedoch mit einem beliebigen dialysierbaren
Detergens anwendbar, das die Komponenten solubilisiert. Bei diesem
Verfahren werden A/G Technology-Kartuschen verwendet. In diesem
Verfahren kann jedoch auch ein Ultrafiltrations/Diafiltrationssystem
mit Kartuschen einer beliebigen Marke verwendet werden.
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5.0.0.1
Vorbereitende Vorgänge
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5.0.0.1
Sterilfiltrieren einer Vorratslösung
von 30 %igem Empigen BB, bei dem es sich um das in diesem Verfahren
verwendete Detergens handelt.
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5.0.0.2
Herstellen von 2X TEEN/2 % Empigen (0,1 M Tris, 0,02 M Dinatrium-EDTA,
0,3 M Natriumchlorid, WFI und 2 % Empigen, pH 8,0).
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5.0.0.3
Herstellen von 150 Liter einer TNS-Lösung (Tris-normale Kochsalzlösung) zum
Herausdialysieren des Detergenses, die 0,05 M Tris, 0,15 M Natriumchlorid,
pH 8,0, enthält.
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5.0.0.4
Herstellen von 10 Liter Natriumhydroxidlösung zur Reinigung der OF Kartusche.
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5.0.0.5
Auftauen der erforderlichen Menge an Shigella flexneri 2a-Lipopolysaccharid
(LPS).
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5.0.1
Komplexieren von Proteosomen mit S. flexneri 2a-LPS.
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5.0.1.6
Zugeben eines gleichen Volumens 2X TEEN-Puffer zu dem LPS-Volumen
und gründlich
Mischen.
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5.0.1.7
Auftauen und Abmessen einer Menge an Proteosomenmasse in mg, die
der Menge des im Schritt 5 aufgetauten LPS entspricht.
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5.0.1.8
Zusetzen von 30 ml sterilfiltriertem Empigen pro Liter zu den Proteosomen.
Gründlich
Mischen und mit dem LPS von Schritt 5 vereinigen.
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5.0.1.9
Gründliches
Mischen beider Komponenten. Gewöhnlich
sind 15 min mit einer Kombination aus Rührplatte und Rührstab ausreichend.
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5.0.1.10
Zum Herausdialysieren des Detergenses, so dass sich Proteosomkomplexe
bilden können, wird
ein Ultrafiltrationssystem (auf der Basis der Tangentialströmungstechnologie)
unter Verwendung einer Hohlfaserkartusche mit einer Nenn-Molekulargewichtsgrenze-Porengröße (NMWC-Porengröße) von
10000 aufgebaut, die von A/G Technology, Inc., hergestellt und mit
einem sterilisierten Silikonschlauch und einer peristaltischen Pumpe
verbunden wird. Desinfizierte Druckmesser werden an der Einlass-
und Auslassseite der Kartusche angeordnet, um den Druck während des
Durchlaufs zu überwachen.
Ein Rückschlagventil
wird auf der Auslassseite der Kartusche angeordnet, um den Gegendruck
einzustellen.
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5.0.1.11
Das Ultrafiltrationssystem wird mit WFI und 0,5 N NaOH bei 50°C für mehr als
60 min gereinigt und desinfiziert. Dieses System wird mit WFI gespült und vor
der Verwendung mit TNS-Puffer äquilibriert.
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5.0.1.12
Ein steriler Vorratsbehälter
wird mit der Anlage verbunden, so dass die Einlassflüssigkeit
aus dem Behälter
gezogen und die zurückgeführte zurückgehaltene
Flüssigkeit
dem gleichen Vorrat zugeführt wird.
Wenn eine Flüssigkeit
durch die Kartuschenmembran durchdringt (durchgedrungene Flüssigkeit
oder Filtrat), wird sie entweder durch eine direkte Zugabe oder
durch ein kontinuierliches Zuführungssystem
mit TNS-Puffer ergänzt.
Ein kontinuierliches Zuführungssystem
wird durch Verbinden eines Silikonschlauchs mit einem Behälter, der
TNS-Puffer enthält,
und mit dem Probenvorratsbehälter
aufgebaut, der dann luftdicht ist. Wenn die Flüssigkeit durch Filtration aus
dem Probenvorratsbehälter
entfernt wird, wird ein Vakuum erzeugt, das dazu führt, dass „TNS"-Puffer aus seinem
Behälter
in den Probenvorratsbehälter
gezogen wird. Wenn das System luftdicht bleibt, bleibt das Probenniveau
in dem Behälter
konstant.
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5.0.1.13
Starten der Umwälzpumpe,
um mit der Diafiltration zu beginnen. Einstellen der Pumpengeschwindigkeit
und des Rückschlagventils
derart, dass ein Gegendruck von 15 ± 4 psi erhalten wird.
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5.0.1.14
Verifizieren der fortschreitenden Entfernung von Empigen BB durch
Testen von Proben der durchgedrungenen Flüssigkeit, die alle 10 bis 15
Liter unter Verwendung des Empigen-Precipitin-Tests entnommen werden.
Dieser Test besteht aus der Herstellung von Reihenverdünnungen
der durchgedrungenen Flüssigkeit
und einer Standardlösung,
die eine bekannte Menge an Empigen BB enthält, dem Zusetzen von HCl zum
Ansäuern
der Lösungen
und dann dem Zusetzen von Reihenverdünnungen von SDS (Natriumdodecylsulfat)
zur Bildung eines schachbrettartigen Tests. Ein maximaler Niederschlag
wird gebildet, wenn äquivalente
Mengen an Empigen und SDS vorliegen. Auf diese Weise kann die Menge
des vorhandenen Empigens durch Aufzeichnen der Verdünnung des
SDS, der durchgedrungenen Flüssigkeiten
und der Standards quantifiziert werden, bei denen der maximale Niederschlag
gebildet wird. Mit fortschreitender Diafiltration wird die Empigenmenge
geringer und das Röhrchen,
das weniger SDS enthält,
wird das Röhrchen
mit dem maximalen Niederschlag sein. Die Gegenwart des Niederschlags
wird durch Messen der OD bei 600 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers
quantifiziert.
-
5.0.1.15
Bei der in diesem Beispiel verwendeten Menge an Komponenten wird
die Diafiltration fortgesetzt, bis mindestens 120 Liter durchgedrungene
Flüssigkeit
verarbeitet worden sind und bis in dem Empigen-Precipitin-Test ein
Mangel an signifikantem Niederschlag auftritt (die maximale OD bei
600 nm beträgt
weniger als 0,05).
-
5.0.1.16
Konzentrieren des Produkts nach der vollständigen Dialyse auf ein Endvolumen,
das derart ist, dass ein OD280-Wert von
etwa 6,0 erhalten wird. Spülen
des Systems und Waschen mit 300 bis 400 ml "TNS"-Puffer.
Erneutes Spülen
des Systems und Vereinigen beider Lösungen. Reinigen der Kartusche
durch Umwälzen
großer
Mengen an WFI und dann 0,5 N NaOH bei 50°C für >60 min. Herausspülen des NaOH mit WFI und Lagern
des Systems in 0,01 N NaOH.
-
5.0.2
Sterilfiltration
-
5.0.2.17
Die Komplexe können
gegebenenfalls sterilfiltriert werden. Die Proteosomkonzentration
kann vor oder nach der 0,22 μ-Filtration
eingestellt werden. Die Sterilfiltration wird gewöhnlich mit
Filtereinheiten von Millipore Corp. durchgeführt. Diese Einheiten werden
als Millipaks bezeichnet und sind in verschiedenen Größen erhältlich.
Das filtrierte Volumen wird bis zum Abfüllvorgang bei 4°C gelagert
und auf Sterilität
getestet.
-
5.0.3.0
Spezifischer Zweck: Kombinieren von GMP-Massezubereitungen von äußeren Membranproteinproteosomen
von Meningokokken und S. flexneri 2a-Lipopolysaccharid zu nicht-kovalenten
Komplexen durch Entfernung des Detergens.
-
5.0.3.1
Anwendungen: Mit diesem GMP-Verfahren wird eine Zubereitungsmasse
aus nichtkovalenten Komplexen von Proteosomen mit S. flexneri 2a-Lipopolysaccharid
zur Verwendung als Impfstoff gegen eine S. flexneri 2a-Infektion
hergestellt.
-
Beispiel 2
-
Nicht-kovalentes
Komplexieren einer Masse gereinigter äußerer Membranproteine (Proteosomen) des
Neisseria meningitidis-Stamms 9162 und alkalisch entgiftetem N.
meningitidis L8-Lipooligosaccharid, das vom Stamm 8532 isoliert
worden ist.
-
5.1.0
Eine Masse von äußerem Membranprotein
(Proteosomen) 9162, Charge 0136, und eine Masse von entgiftetem
Meningokokken-L8-Lipooligosaccharid (LOS), Charge 0203, wurden aus
dem Lager entnommen und bei Raumtemperatur aufgetaut. Ein Volumen
(182 ml) der LOS-Masse, die 500 mg LOS in sterilem destilliertem
Wasser enthielt, wurde mit einem Volumen (306 ml) der Proteosomenmasse
vereinigt, das 400 mg Protein in einem Puffer enthielt, der 0,05
M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA und 0,1 % Empigen BB enthielt.
-
5.1.2
Empigen BB (30 %ige Lösung)
wurde durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilfiltriert
und 1/60-Volumen wurde der vereinigten Proteosomen-LOS-Lösung zugesetzt
und es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
-
5.1.3
Die Detergens-Puffer-Lösung
wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationskartusche UFP-3-C-6
von A/G Technology mit einer Molekulargewichtsgrenze-Porengröße von 3000
aus der Proteosomen-LOS-Lösung
entfernt und durch steriles destilliertes Wasser ersetzt.
-
5.1.4
Das Verfahren des Aufbaus, der Desinfektion, des Waschens, Waschens
und Reinigens der Vorrichtung war mit dem Verfahren von Beispiel
1 identisch. Der Einlassdruck betrug 15 ± 4 psi und die Strömungsgeschwindigkeit
der durchgedrungenen Flüssigkeit
betrug 175 ml/min.
-
5.1.5
Die durchgedrungene Flüssigkeit
wurde alle 3 bis 4 Liter mit dem im Beispiel 1 beschriebenen Niederschlagsverfahren
bezüglich
der Gegenwart von Empigen BB- Detergens
getestet. Die Ultrafiltration wurde fortgesetzt, bis in dem Test
plus zusätzliche
5 Liter kein Niederschlag mehr festgestellt wurde. Insgesamt wurden
37 Liter an durchgedrungener Flüssigkeit
gewonnen.
-
5.1.6
Die zurückgehaltene
Flüssigkeit
war klar und wurde durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilfiltriert,
der bezüglich
Protein und LOS getestet worden ist, und als Produktmasse bei 4°C gelagert.
-
5.1.7
Die Produktmasse wurde auf eine Konzentration von 0,2 mg Protein
pro ml verdünnt
und die Konzentration von NaCl wurde auf 0,15 M eingestellt. Als
Konservierungsmittel wurde Thimerasol in einer Konzentration von
0,01 % zugesetzt und die resultierende Masse wurde schließlich unter
sterilen Bedingungen in Fläschen
eingebracht, etikettiert und bei –70°C gelagert.
-
5.1.8
Dieses Produkt wurde in Mäusen
bezüglich
der Immunogenität
getestet, wenn es als Kochsalzlösung
und an ein Aluminiumhydroxidgel als Zusatz absorbiert verabreicht
wurde. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben
und zeigen, dass die Impfstoffkomplexe immunogen waren, wenn sie
i.p. an Mäuse
verabreicht wurden.
-
Tabelle
1. Bakterizide Antikörperreaktion
von Mäusen
auf einen Meningokokken-äußeres Membranprotein-entgiftetes
Lipooligosaccharid-Impfstoff, geometrischer Mittelwert des reziproken
Titers gegen den Meningokokkenstamm 9162.
-
-
5.1.9
Die Komplexierung von Proteosomen und LOS wurde mittels Säulenchromatographie
der Proteosomen- und LOS-Komponenten vor und nach dem Komplexieren
verifiziert ( 9). Die
chromatographische Analyse der Meningokokken-L8-LOS-Masse und der
schließlich
erhaltenen Proteosomen/LOS-Komplexe wurde mit einer Sephacryl S300-Niederdrucksäule durchgeführt. Die
Säule wurde
mit einem Puffer aus 0,05 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,15 M NaCl betrieben.
Der Proteintest wurde durch die Extinktion bei 280 nm durchgeführt und
der LOS-Test wurde durch die Hemmung eines ELISA (= enzyme linked
immunosorbant assay) durchgeführt,
bei dem ein monoklonaler L8-Antikörper, der an gereinigtes L8-LOS
bindet, das an der Kunststoffplatte adsorbiert war, durch Reihenverdünnungen
der Fraktionen aus der Sephacrylsäule gehemmt wurde. Vor dem
Komplexieren lief das LOS in Form eines breiten Peaks bei der Fraktion
39 von der Säule
ab. Nach dem Komplexieren eluierte das LOS zusammen mit den Proteosomen
in einem Peak etwa bei der Fraktion 33.
-
5.1.10
Spezifischer Zweck: Kombinieren von GMP-Massezubereitungen von äußeren Membranproteinproteosomen
von Meningokokken und entgiftetem Meningokokken-Lipopolysaccharid zu nicht-kovalenten Komplexen
durch Entfernung des Detergens.
-
5.1.11
Anwendungen: Mit diesem GMP-Verfahren wird eine Zubereitungsmasse
aus nichtkovalenten Komplexen von Proteosomen mit entgiftetem Meningokokken-Lipopolysaccharid
zur Verwendung als Impfstoff gegen eine N. meningitidis-Infektion
(Meningokokken-Infektion) hergestellt.
-
Beispiel 3
-
Dieses
Beispiel betrifft auch die Herstellung eines Proteosom-P. shigelloides-Impfstoffs.
Das Verfahren ist gleichermaßen
für eine
Maßstabsvergrößerung unter
Verwendung von 10- bis 1000-mal mehr Material zusammen mit einer
Maßstabsvergrößerung der
Gehäusegröße der Membrankartusche
und geeigneten Volumenvergrößerungen
geeignet.
-
5.8.1
Herstellen von 25 ml sterilfiltriertem Empigen BB (30 %ige Lösung).
-
5.8.1.1
Verwenden einer 100 ml-Einmalfiltereinheit von Nalgene mit einem
Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μ, um etwa
25 ml Empigen BB (30 %ige Lösung)
steril zu filtrieren.
-
5.8.2
Herstellen von 4 Liter TEEN 2× mit
2 % Empigen BB (bestehend aus 0,1 M Tris, 0,02 M Dinatrium-EDTA,
0,3 M Natriumchlorid, WFI und einer 2 %igen Lösung von Empigen BB).
-
5.8.3
Fünfzehnmaliges
Herstellen von 10 Liter einer Lösung
von "TNS", so dass insgesamt
150 Liter erhalten werden: TNS besteht aus 0,15 M Natriumchlorid
und 0,05 M Tris-Puffer pH 8,0 ± 0,2.
-
5.8.4
Herstellen von 10 Liter einer 0,5 N Natriumhydroxidlösung.
-
5.8.6
Gegebenenfalls Auftauen einer P. shigelloides-Lipopolysaccharid-Masse
(LPS-Masse) zur Vorbereitung der Komplexierung mit Proteosomen und
Aufzeichnen der Chargennummer, der Konzentration des LPS, der erforderlichen
Menge an LPS in mg und des berechneten LPS-Volumens, das entfernt
werden soll.
-
5.9.0
Komplexieren von Proteosomen mit P. shigelloides-LPS
-
5.9.1
Herstellen von LPS für
die Komplexierung
-
5.9.1.2
Vereinigen der Aliquots der LPS-Masse in einer sauberen, sterilen
kalibrierten 5 Liter-Flasche. Messen
des Gesamtvolumens und Bestimmen der Gesamtmenge an LPS.
-
5.9.1.3
Zugeben eines Volumens von 2× TEEN-Puffer
in einem Volumen, das gleich dem Volumen des in dem Schritt 5.9.1.2
verwendeten LPS ist, Messen des vereinigten Gesamtvolumens und anschließend Zusetzen
eines Rührstabs
und Mischen mit einer Kombination aus Rührplatte und Rührstab für 15 ± 2 min.
-
5.9.2
Herstellung von Proteosomen für
die Komplexierung
-
5.9.2.1
Aufzeichnen der Gesamtzeit, für
welche die Proteosomen auftauen gelassen wurden, falls eine solche
Gesamtzeit vorliegt.
-
5.9.2.2
Vereinigen der Aliquots der Proteosomenmasse in einem sauberen,
sterilen graduierten 1 Liter-Zylinder. Messen des Gesamtvolumens
und Bestimmen der Proteosomen-Gesamtmenge.
-
5.9.2.3 Überführen eines
Proteosomenvolumens aus dem Zylinder im Schritt 5.9.2.2, das die
Menge in mg enthält,
die der mg-Menge des im Schritt 5.9.2.1 verwendeten LPS entspricht,
in einen anderen sauberen, sterilen graduierten 1 Liter-Zylinder.
-
5.9.2.4
Einbringen von 0,22 μ-filtriertem
30 %igen Empigen Bb in den die Proteosomen enthaltenden Zylinder
unter Verwendung von 30 ml Empigen pro Liter der Proteosomen. Mischen
mit einem Rührstab
für 15 ± 2 min.
-
5.9.3
Vereinigen von Proteosomen mit dem P. shigelloides-LPS
-
5.9.3.1
Einbringen der Proteosomen von Schritt 5.9.3.2 in die graduierte
5 Liter-Flasche mit dem LPS unter gelindem Rühren mit einem Rührstab und
Rühren
für 15 ± 2 min.
-
5.9.3.3
Entnehmen von vier 1 ml-Proben und Lagern derselben bei –75°C für eine spätere Messung der
Proteinkonzentration mit dem Lowry-Verfahren und der LPS-Konzentration
mit dem KDO-Test.
-
5.9.4
Entfernung des Detergenses mittels Ultrafiltration/Diafiltration
-
5.9.4.1
Details des Ultrafiltrationssystems: A/G Technology, Inc., Hohlfaserkartusche,
NMWC-Porengröße 10000,
Gehäusegröße 6, Ultrafiltrationskartusche.
Anmerkung: Es ist erforderlich, neue Kartuschen zu konditionieren,
um Glycerin auszuwaschen. Dies kann durch Spülen von 6 Liter WFI oder weniger
durch die 6 sq/ft-Kartuschen ohne Gegendruck durchgeführt werden.
Die durchgedrungene Lösung
sollte nicht in den Zuführungsvorratsbehälter zurückgeführt werden.
Anmerkung: Auf alle Ultrafiltrationsschritte folgen Reinigungs-, Desinfektions-
und Lagerschritte. Neue Kartuschen müssen vor der Verwendung gereinigt
und desinfiziert werden.
-
5.9.4.2
Aufbauen und Desinfizieren des A/G-Ultrafiltrationssystems. Reinigen
und Desinfizieren des Systems durch Umwälzen von 2 bis 3 Liter einer
0,5 N Natriumhydroxidlösung
bei einer Anfangstemperatur von 50 ± 5°C für mindestens 60 min. Spülen des
Systems mit 4 bis 5 Liter WFI und anschließend Umwälzen von 2 bis 3 Liter "TNS" (0,05 M Tris/normale
Kochsalzlösung-Puffer,
pH 8,0 ± 0,2)
für mindestens
20 ±5
min.
-
5.9.4.3
Messen des Füllvolumens
in dem UF-System (einschließlich
der Schläuche)
durch Überführen von
Einlass- und Auslassleitungen, die mit Flüssigkeit gefüllt sind,
aus dem Vorratsbehälter
heraus in einen graduierten 1 Liter-Zylinder und anschließend Pumpen,
bis das UF-System leer ist.
-
5.9.4.4
Anordnen eines 2 Liter-Behälters
mit Seitenansätzen
in einer Pfanne und Einpacken des Behälters mit nassem Eis während der
Dauer des Diafiltrationsverfahrens.
-
5.9.4.5 Überführen von
1,7 bis 1,9 Liter der Proteosom-LPS-Gemischmasse vom Schritt 5.9.3.3
in den 2 Liter-Behälter
mit Seitenansätzen.
Platzieren eines mit zwei Löchern
ausgestatteten Stopfens, der mit zwei 10 ml-Pipetten versehen ist,
auf dem Behälter
und Verbinden des Einlass- und Auslassschlauchs des Diafiltrationssystems
mit den Behälterpipetten.
-
5.9.4.6
Einschalten der Umwälzpumpe
und Einstellen der Pumpe auf 4 bis 6. Einstellen der Gegendruckklemme,
so dass ein Einlassdruck von 15 ± 4 psi erhalten wird. Konzentrieren
auf ein Gesamtvolumen von 1,0 ± 0,1
Liter, einschließlich
des Füllvolumens.
-
5.9.4.7 Überführen von
1 ± 0,1
Liter des Gemischs von Schritt 5.9.3.3 in den 2 Liter-Behälter mit
Seitenansätzen
und Wiederholen des Schritts 5.9.4.6
-
5.9.4.8
Fortsetzen der Überführung wie
im Schritt 5.9.4.7 und des Konzentrierens wie im Schritt 5.9.4.9,
bis das gesamte Proteosom-LPS-Gemisch von Schritt 5.9.3.3 in den
2 Liter-Behälter mit
Seitenansätzen überführt worden
ist und das Volumen der zurückgehaltenen
Flüssigkeit
1,4 ± 0,2
Liter ist, einschließlich des
Füllvolumens.
-
5.9.4.10
Einstellen der Ultrafiltrationsvorrichtung für eine kontinuierliche Zuführung von
TNS (0,05 M Tris, normale Kochsalzlösung) in den 2 Liter-Behälter mit
Seitenansätzen,
wenn Flüssigkeit
durch die Membran entfernt wird. Aufbauen eines Vorratsbehälters unter
Verwendung einer 10 Liter-Flasche, die TNS enthält und mit einem Schlauch ausgestattet
ist, der sich zum Boden der Flasche erstreckt. Verbinden der Einlass- und
Auslassleitungen des Ultrafiltrationssystems. Einschalten der Umwälzpumpe
und Einstellen der Pumpe auf 4 bis 6. Einstellen der Gegendruckklemme,
so dass ein Einlassdruck von 15 ± 4 psi erhalten wird.
-
5.9.4.11
Messen der Strömungsgeschwindigkeit
der durchgedrungenen Flüssigkeit
an der UF-Einheit und Aufzeichnen des Einlassdrucks, wenn die Messung
vorgenommen wird.
-
5.9.4.12
Entnehmen einer 15 bis 20 ml-Probe der durchgedrungenen Flüssigkeit
alle 12 ± 0,5
Liter, die verarbeitet worden sind, Anbringen eines Etiketts zum
Gebrauch im Hause ("Durchgedrungene
Flüssigkeit
Nr. P1, P2, P3, usw.")
und Aufzeichnen der Zeit, des verarbeiteten Volumens und des maximalen
OD600-Werts der Probe. Verifizieren der
fortschreitenden Entfernung von Empigen durch Testen der Proben
bezüglich
der Gegenwart von Empigen BB unter Verwendung des Empigen-Precipitin-Tests.
Dieser Test besteht aus der Herstellung von Reihenverdünnungen
der durchgedrungenen Flüssigkeit
und getrennt davon einer Lösung,
die eine bekannte Menge an Empigen BB enthält, dem Zusetzen von HCl zum
Ansäuern
der Lösungen
und dann dem Zusetzen von Reihenverdünnungen von SDS (Natriumdodecylsulfat)
zur Bildung eines schachbrettartigen Tests. Ein maximaler Niederschlag
wird gebildet, wenn äquivalente
Mengen an Empigen und SDS vorliegen. Auf diese Weise kann die Menge
des vorhandenen Empigens durch Aufzeichnen der Verdünnungen
der durchgedrungenen Flüssigkeiten
und des SDS, in welchen der Niederschlag gebildet wird, und Vergleichen dieser
Verdünnungen
mit denjenigen der Standards quantifiziert werden. Mit fortschreitender
Diafiltration wird die Empigenmenge geringer und das Röhrchen,
das weniger SDS enthält,
wird das Röhrchen
mit dem maximalen Niederschlag sein. Die Gegenwart des Niederschlags
wird durch Messen der OD bei 600 nm unter Verwendung eines Spektrometers
quantifiziert. Bei der in diesem Beispiel verwendeten Menge an Komponenten wird
die Diafiltration fortgesetzt, bis mindestens 120 Liter durchgedrungene
Flüssigkeit
verarbeitet worden sind und bis in dem Empigen-Precipitin-Test ein Mangel an signifikantem
Niederschlag auftritt (die maximale OD bei 600 nm beträgt weniger
als 0,05).
-
5.9.4.13
Konzentrieren des Produkts auf ein Endvolumen der zurückgehaltenen
Flüssigkeit
von 500 ± 50
ml, einschließlich
des Füllvolumens
(Schritt 9.4.3). Entnehmen einer 0,5 ml-Probe, Verdünnen der Probe im Verhältnis 1:10
und Messen der OD280.
-
5.9.4.14
Die gewünschte
minimale OD der konzentrierten zurückgehaltenen Flüssigkeit
beträgt
5,7. Wenn die OD weniger als 5,7 beträgt, wird die Konzentrierung
auf 400 ± 50
ml einschließlich
des Füllvolumens fortgesetzt
(Schritt 5.9.4.3) und die OD280-Messung
wird wiederholt.
-
5.9.4.15
Mit aus der Lösung
der zurückgehaltenen
Flüssigkeit
herausgenommenen Leitungen für
die zurückgehaltene
Flüssigkeit
und geschlossenen Filtratauslassleitungen wird langsam in der umgekehrten Richtung
gepumpt, bis die Kartusche und die Leitungen leer sind. Überführen der
Zuführungsleitung
und der Leitungen für
die zurückgehaltene
Flüssigkeit
aus der Flasche für
die zurückgehaltene
Flüssigkeit
in einen neuen sauberen Behälter
mit 350 ± 50
ml TNS. Umkehren der Pumprichtung und langsames Umwälzen des TNS
für 2 bis
3 min.
-
5.9.4.16
Stoppen der Pumpe nach dem Umwälzen
des TNS, Spülen
des Systems, Sammeln der Lösung
der zurückgehaltenen
Flüssigkeit
in einem sauberen, sterilen graduierten 1 Liter-Zylinder und Messen des Volumens und
der OD280.
-
5.9.4.17
Vereinigen der ursprünglichen
Lösung
der zurückgehaltenen
Flüssigkeit
(Schritt 5.9.4.12 oder 5.9.4.13) mit der beim Waschen erhaltenen
Lösung
der zurückgehaltenen
Flüssigkeit
(Schritt 5.9.4.15) und Messen des Endvolumens der zurückgehaltenen
Flüssigkeit.
Lagern des Volumens der zurückgehaltenen Flüssigkeit
bei 4°C ± 2°C bis zur
aseptischen Filtration.
-
5.9.4.18
Reinigen der Filtrationseinheit unter Verwendung von WFI und anschließend 0,5
N Natriumhydroxidlösung
bei einer Anfangstemperatur von 50 ± 5°C für mindestens 60 min. Herausspülen des
Reinigungsmittels mit WFI und dann Spülen mit 3 bis 4 Liter 0,1 N
NaOH als Lagerungsmittel.
-
5.9.5
Sterilfiltration
-
Die
Komplexe können
gegebenenfalls sterilfiltriert werden. Untersuchen der komplexierten
Masse von Proteosomen und LPS bezüglich der Gegenwart eines Niederschlags
oder einer Trübung.
Wenn die Masse des komplexierten Produkts klar ist, wird sie unter
Verwendung einer Millipak 40 0,22 μ-Filtrationseinheit in einen
sterilen pyrogenfreien Behälter
filtriert. Dieser Schritt muss in einem sterilen Raum durchgeführt werden.
-
5.9.6
Spezifischer Zweck: Kombinieren von GMP-Massezubereitungen von äußeren Membranproteinproteosomen
von Meningokokken und P. shigelloides-Lipopolysaccharid (für S. sonnei)
zu nicht-kovalenten Komplexen durch Entfernung des Detergens.
-
5.9.7
Anwendungen: Mit diesem GMP-Verfahren wird eine Zubereitungsmasse
aus nichtkovalenten Komplexen von Proteosomen mit P. shigelloides
2a-Lipopolysaccharid zur Verwendung als Impfstoff gegen eine Shigella
sonnei-Infektion hergestellt.
-
5.10
Immunogenitätsstudien
-
5.10.1
Immunogenität
eines unter Verwendung einer Hohlfaser-Ultrafiltration/Diafiltration
hergestellten Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs
-
Die 1 und 2 zeigen, dass drei verschiedene Proteosom-P.
shigella-LPS-Impfstoff-Zubereitungen, die
unter Verwendung der Hohlfaser-Diafiltrationstechnik (HF-Diafiltrationstechnik)
hergestellt worden sind (HF-1, HF-2 und GMP/HF-3), um das Detergens
zu entfernen und die Komplexierung zu erleichtern, bei der niedrigsten,
am meisten stringenten getesteten Dosis wirksamer sind als Zubereitungen,
die unter Verwendung einfacher Dialyseschläuche (DT) hergestellt worden
sind. Mit anderen Worten: Mit Impfstoffen, die unter Verwendung
der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind, wurden stärkere IgG-
(1) und IgA-Immunreaktionen
(2) ausgelöst, als
dies bei der älteren,
weniger effizienten Technologie der Fall war. Da eine stärkere Immunreaktion
zu einem besseren Schutzniveau führt,
zeigen diese Daten deutlich, dass die vorliegende Erfindung zu Impfstoffen
führt,
die nicht nur effizienter herzustellen, sondern auch stärker wirksam sind.
Ferner werden die stärkeren
Reaktionen durch den Impfstoff ausgelöst, wenn dieser bei der niedrigsten Dosis
(0,1 μg
pro Dosis) verabreicht wird, was zeigt, dass unter Verwendung der
vorliegenden Erfindung weniger Impfstoff erforderlich ist, als dies
bei der Verwendung der älteren
Technologie der Fall ist. Da in der Formulierung multivalenter Impfstoffe
viele verschiedene Antigene erforderlich sind, um die Gesamtmenge
des verabreichten Impfstoffs zu minimieren, ist es sehr vorteilhaft,
dass Impfstoffkomponenten verwendet werden können, die bei niedrigeren Dosierungen
wirksam sind. Folglich beeinflusst und erleichtert die Technologie
der vorliegenden Erfindung, Impfstoffe unter Verwendung der Hohlfasertechnologie
herzustellen, direkt das Vermögen,
multivalente Impfstoffe mit einem breiten Bereich von Spezifikationen
zu formulieren. Da es für
die kommerzielle Entwicklung von Impfstoffen vorteilhaft ist, Impfstoffe
zu lyophilisieren, ist es sehr vorteilhaft, dass gefunden wurde,
dass die Lyophilisierung der HF-Impfstoffkomplexe aus einer Wasserlösung überraschenderweise
zu einem Impfstoff führte,
der konsistent Reaktionen auslöste,
die zu den stärksten
aller getesteten Dosierungen gehörten.
Folglich wurde eine höhere
Immunogenität
für anti-LPS-IgG
(1) und -IgA (2) gefunden, wenn 0,1 μg des mit
der HF-Technologie hergestellten Impfstoffs (mit oder ohne Lyophilisierung)
verabreicht wurden. Diese Daten sind signifikant, da bei der Maßstabsvergrößerung und
dem GMP-Verfahren der vorliegenden Erfindung die HF-Technologie verwendet
wurde, wie es in den 1 und 2 durch den gepunkteten Balken
angegeben ist, der GMP/HF-3 darstellt.
-
5.10.2
Immunogenitätsstudien
unter Verwendung eines multivalenten Impfstoffs Gemäß 3 führt die Verabreichung des Proteosom-P.
shigelloides-LPS-Impfstoffs (für
S. sonnei-Shigellose) und des Proteosom-S. flexneri 2a-Impfstoffs
am gleichen Tag oder um Wochen getrennt zu einer guten Immunogenität für beide
LPS-Komponenten: S. sonnei-LPS und S. flexneri 2a-LPS.
-
5.11
Elektronenmikrographie des Proteosom-Shigella-Impfstoffs
-
Die
Assoziation von Shigella-LPS mit Proteosomen ist deutlich und dramatisch
in der in der 4 gezeigten
Elektronenmikrographie gezeigt. In dieser Figur sind die Proteosomvesikel
mit strahlenundurchlässigen
schwarzen Punkten übersät. Diese
Punkte sind Goldkügelchen,
die mit sekundären
Antikörpern
verbunden sind, die spezifische anti-Shigella-LPS-Antikörper erkennen.
Folglich zeigt die Gegenwart von Goldpunkten die Gegenwart von Shigella-LPS.
Da, wie es ersichtlich ist, die Goldpunkte die Proteosomvesikel
umgeben und auf diesen punktartig angeordnet sind, wird dadurch
die Natur der Proteosom-Impfstoffe mit dem mit den Proteosomen nicht-kovalent
verbundenen LPS bestätigt
und visualisiert. Überraschenderweise
wurde die konsistente Vesikelnatur der mit der HF-Technologie der
vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoffe nicht gefunden,
wenn die DT-Zubereitungen unter Verwendung der älteren Technologie mittels
Elektronenmikroskopie untersucht wurden (unveröffentlichte Ergebnisse).
-
5.12
Der Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff schützt gegen letale Shigella sonnei-Pneumonie in einem
Shigellose-Tiermodell Wie es in der 5 ersichtlich
ist, verleiht der Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff konsistent
einen starken signifikanten Schutz gegen eine letale Infektion mit
P. shigelloides, der in einem Shigellose-Tiermodell gemessen worden
ist, bei dem die Tiere mit lebenden Organismen zur Induktion einer
letalen Pneumonie gereizt werden. Diese Daten zeigen auch, dass
von dem Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff nicht nur die richtigen
und schützenden
Antikörper
erzeugt werden, sondern dass dieser intranasale Untereinheiten-Impfstoff auch gegen
eine letale Pneumonie schützen
kann.
-
5.13
Die intranasale oder orale Immunisierung mit Proteosom-Shigella
flexneri 2a-LPS-Impfstoffen
induziert anti-Shigella-LPS-IgG und -IgA im Serum und -IgA in Darm-
und Lungenspülfluiden,
die 30 bis 60 Tage nach der Immunisierung andauern können.
-
Wie
es in der 6 gezeigt
ist, induzieren zwei Immunisierungen mit Proteosom-Shigella flexneri 2a-LPS-Impfstoffen
Antikörper
in Seren und in Lungen- und Darmsekreten, die 30 bis 60 Tage nach
der Immunisierung andauern können.
Diese Daten zeigen, dass Proteosom-Impfstoffe das allgemeine Schleimhautimmunsystem
dahingehend stimulieren können,
dass spezifische Antikörper
selbst an Stellen sekretieren, die weit von der Immunisierungsstelle
entfernt sind. Insbesondere kann eine intranasale Immunisierung
Antikörper in
Darmsekreten induzieren und umgekehrt. Dieses Vermögen erweitert
den potenziellen Nutzen der Proteosom-Impfstoffe gegen Pathogene,
die durch die Schleimhautzugänge
des Körpers
in den Wirt eindringen.
-
5.14
Die 7 zeigt die Induktion
von anti-Shigella-LPS-IgA-, -IgG- und -IgM-ASC-Reaktionen in peripherem Blut, und IgA-
und IgG-Antikörperreaktionen
im Serum, Speichel und Harn nach einer intranasalen oder oralen
Immunisierung von freiwilligen Testpersonen mit einer oder zwei
Dosen an Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffen für Shigella
sonnei unter Verwendung verschiedener Impfstoffmengen. Es ist gezeigt worden,
dass eine intranasale Immunisierung Reaktionen in einer dosisabhängigen Weise
hervorrief, wobei die höchste
Dosis bei allen sechs Testpersonen Reaktionen hervorrief.
-
IgA-,
IgG- und IgM-Serumreaktionen wurden in jeder der intranasalen Gruppen
ausgelöst.
Darüber
hinaus wurden starke ASC-Reaktionen antikörpersekretierender Zellen induziert,
was zeigt, dass die Schleimhautimmunisierung die Verbreitung antikörpersekretierender
Zellen stimuliert, insbesondere von IgA-sekretierenden Zellen. Insbesondere
wurden IgA-Reaktionen
auch im Speichel und insbesondere in Urinproben gefunden, was zeigt,
dass das sekretorische IgA an Schleimhautgrenzflächen erzeugt wird (da IgA nicht
die Nieren passiert, gibt die IgA-Konzentration im Harn die lokale
Sekretion der Antikörper
wieder und legt nahe, dass solche intranasalen Impfstoffe auch lokal
Darm-IgA erzeugen und dass intranasale Impfstoffe verwendet werden
könnten,
um gegen Harnwegsinfektionen zu schützen, die durch gramnegative
Organismen verursacht werden). Es ist bemerkenswert, dass der Großteil dieser
ASC- und Antikörper-Reaktionen
nach nur einer Immunisierung gefunden wurden, was nahe legt, dass
eine Auffrischungsimmunisierung nicht erforderlich sein könnte. IgA-
und IgG-ASC's und
Harn-IgA wurden auch nach einer oralen Immunisierung gefunden. Die
effektivste Verwendung einer oralen Verabreichung könnte gegebenenfalls
eine Auffrischungsimmunisierung nach einer nasalen Anfangsimmunisierung
sein.
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5.15
Eine Demonstration einer nicht-kovalenten Komplexierung der multimolekularen
Proteosomproteine und LPS ist in der 8 gezeigt.
Der Graph zeigt LPS in HPLC-Fraktionen
nach der Anwendung von unkomplexiertem P. shigelloides-LPS, das
in einem anderen Teil des Säulenelutionsprofils
auftritt, wie in dem Fall, bei dem der Proteosom-LPS-Impfstoff angewandt
wird. Die gemeinsame Elution von LPS und Proteinen in HPLC-Fraktionen nach dem
Anwenden des Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs ist durch
Peaks gezeigt, die den größten Proteosomen-Proteinaggregaten
entsprechen. Die Daten wurden unter Verwendung eines Hemmungs-ELISA,
um die LPS zu quantifizieren, und unter Verwendung der OD280 gemessen, um die Proteosomproteine zu
quantifizieren. Die HPLC-Säule war
eine Tosohaas G50000Pwxl und die Molekulargewichtsstandards sind
durch die Pfeile angegeben.