DE69631835T2 - Verbesserte verfahren zur herstellung von nichtkovalent komplexierten und multivalenten impfstoffen gegen proteasomen-untereinheiten - Google Patents

Verbesserte verfahren zur herstellung von nichtkovalent komplexierten und multivalenten impfstoffen gegen proteasomen-untereinheiten Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung nicht-kovalent komplexierter multivalenter Proteosom-Impfstoffe für eine Verabreichung an Schleimhäute und eine parenterale Verabreichung, sowie Zusammensetzungen dafür.
  • Um zu ermöglichen, dass multivalente Untereinheiten-Impfstoffe für jede der Komponenten eine optimale Immunantwort stimulieren, sollten die geeigneten Komponenten zweckmäßig assoziiert und jeweils für das Immunsystem verfügbar sein, so dass sie von Zellen des Immunsystems effizient erkannt und verarbeitet werden können. Wichtige Beispiele solcher nicht-kovalent komplexierter Impfstoffe umfassen Proteosom-Impfstoffe, die aus äußeren Membranprotein-Proteosomen von Neisseria bestehen können, die nicht-kovalent an viele verschiedene Antigene komplexiert sein können, einschließlich Peptide, Lipopeptide, Transmembranproteine oder Toxoidproteine, Polysaccharide oder Lipopolysaccharide (LPS) (Patentanmeldungen Nr. 07/065,440, eingereicht am 23. Juni 1987, "Immunogenic peptide vaccines and methods of preparation"; 07/336,952, eingereicht am 12. April 1989, "Immunopotentiating system for large proteins and polypeptides"; 07/958,426, eingereicht am 8. Oktober 1992, "Oral or Intranasal Vaccines Using Hydrophobic Complexes Having Proteosomes and Lipopolysaccharides"; 08/029,666, eingereicht am 11. März 1993, "Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic Materials"; 08/143,365, eingereicht am 29. Oktober 1993, "Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic Materials"; 93/10,402, eingereicht am 29. Oktober 1993, "Submicron Emulsions as Vaccine Adjuvants"; 08/063,613, eingereicht am 18. Mai 1994, "Solid Fat Nanoemulsions as Vehicles for Vaccine Delivery" und die Veröffentlichungen N. Orr, G. Robin, D. Cohen, R. Arnon und G.H. Lowell, "Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal Models", Infect. Immun. 61, 2390 (1993); C.P. Mallett, T.L. Hale, R. Kaminski, T. Larsen, N. Orr, D. Cohen und G.H. Lowell, "Intranasal or intragastric immunization with proteosome-Shigella lipopolysaccharide vaccines protect against lethal pneumonia in a murine model of shigellosis", Infect. Immun. 63, 2382–2386 (1995); G.H. Lowell, R.W. Kaminski, S. Grate et al., "Intranasal and intramuscular proteosome-staphylococcal enterotoxin B (SEB) toxoid vaccines: immunogenicity and efficacy against lethal SEB intoxication in mice", Infec. Immun. 64, 1706–1713 (1996); G.H. Lowell, "Proteosomes, Hydrophobic Anchors, Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide and Protein Vaccines", in New Generation Vaccines: G.C. Woodrow und M.M. Levine, Hrsg. (Marcel Decker, NY), Kapitel 12 (Seiten 141–160) (1990) und G.H. Lowell, W.R. Ballou, L.F. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger und W.T. Hockmeyer, "Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides", Science 240, 800 (1988).
  • C.L. Ruegg et al. (Journal of Immunological Methods, Band 135, 101–109 (1990)) beschreiben die Herstellung von Impfstoffen auf Proteosombasis. G.H. Lowell et al. (Science 240, 800–802 (1988)) beschreiben Proteosom-Lipopeptid-Impfstoffe und die Verstärkung der Immunogenität für Malaria-CS-Peptide. G.H. Lowell et al. (Journal of Experimental Medicine, Band 167, 658–663 (1988)) beschreiben, dass Peptide, die mittels hydrophober Gruppen an Proteosome gebunden sind, ohne Zusätze stark immunogen werden.
  • Für die praktische Anwendung bei der Verabreichung von Impfstoffen zum Schutz gegen Krankheiten ist es aufgrund der Empfindlichkeit von Personen gegen das Zuziehen von Erkrankungen, die durch verschiedene Organismen verursacht werden, häufig erforderlich, mehrere solcher Antigene gleichzeitig zu verabreichen. Darüber hinaus sind mehrere Organismen ungeachtet davon, ob sie miteinander verwandt sind oder nicht, häufig an der gleichen Stelle endemisch, und daher kann für Personen, die eines Schutzes bedürfen, eine Impfung mit mehreren Arten von Impfstoffen erforderlich sein.
  • In der Vergangenheit wurde die Herstellung von Impfstoffen, die eine nicht-kovalente Komplexierung erforderten, unter Verwendung einer einfachen Dialyse erreicht, bei der die Komponenten in der Gegenwart eines dialysierbaren Detergenses in einen Dialyseschlauch eingebracht werden und das Gemisch in einem Versuch, das Detergens zu entfernen, 7 bis 10 Tage dialysiert wird. Die praktischen Nachteile dieses Systems können dazu führen, die fortgeschrittene Entwicklung und Kommerzialisierung dieser Technologie aus mehreren Gründen auszuschließen, einschließlich: 1) Zeit: Die Zeit, die für das Verfahren erforderlich ist: Das Erfordernis, GMP-Resourcen über Wochen hinweg zu verwenden, während der Impfstoff dialysiert, ist sowohl aufgrund der dadurch entstehenden übermäßigen Kosten als auch aufgrund einer verstärkten Möglichkeit für einen Defekt oder eine Kontaminierung mechanischer oder biologischer Komponenten während dieses langen Zeitraums nicht praktikabel; 2) Kontaminierung: Verstärkte Möglichkeit einer Kontaminierung: Ein Dialyseschlauch ist nur schwer zu sterilisieren und Dialyseschläuche erfordern ein manuelles Öffnen und Schließen des Systems, wodurch die Komponenten sowohl während des Befüllungs- als auch während des Entleerungsprozesses einer Kontamination ausgesetzt sind. Da zwischen dem Befüllen und Entleeren der Schläuche viele Tage vergehen, kann das Risiko einer geringen Kontamination in den ersten Tagen des Verfahrens während der vielen Tage einer Dialyse verstärkt werden, was dieses Verfahren für die praktische Impfstoffherstellung ungeeignet macht. Das Risiko eines Durchstoßens des Beutels kann zu einem Produktverlust führen; 3) Temperatur: Das Erfordernis, die Dialyse aufgrund der übermäßig langen Zeit bei 4°C durchzuführen; 4) Volumen der dialysierenden Fluide: Um einen Impfstoff mit dem Verfahren im größeren Maßstab zu erzeugen, wäre die Verwendung sehr großer Mengen an Dialysefluid erforderlich, da typischerweise ein Verhältnis der Flüssigkeit außerhalb des Dialyseschlauchs zu der Flüssigkeit innerhalb des Dialyseschlauchs von 200:1 erforderlich ist. Daher würde beispielsweise die Herstellung eines Pilotansatzes von 2 Liter eines Impfstoffs 400 Liter Fluid außerhalb des Schlauchs pro Tag – 4000 Liter in 10 Tagen – erfordern und die Herstellung einer Produktionscharge von 20 bis 200 Liter würde 40000 bis 4000000 Liter erfordern. Diese Mengen stellen eine Verschwendung dar und sind im Vergleich zu dem in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Verfahren nicht praktikabel; der Dialyseschlauch kann nicht vergrößert werden, da große Produktmengen problematisch sind; und 5) Unvermögen zur einfachen Messung der Vollständigkeit der Detergensentferung, um so die Wirksamkeit des Impfstoffs zu maximieren. Da der Dialysebeutel in einem Behälter mit 200 Volumina des Puffers eingebracht ist, ist die laufende Messung der Detergensentfernung weder praktisch noch möglich; und 6) darüber hinaus wurde kein Verfahren zur Messung der Gegenwart des Detergenses beschrieben, das in der bevorzugten Ausführungsform verwendet wird, nämlich Empigen BB.
  • Das zweite in dieser Erfindung gelöste Problem ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung und Verabreichung bzw. Abgabe multivalenter Impfstoffe. Die Komponenten können entweder zusammen oder einzeln hergestellt und vor der Verabreichung gemischt werden. Die vorliegende Erfindung zeigt den optimalen Weg zur Herstellung solcher multivalenter Impfstoffe.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im weiteren Sinn die Herstellung von Proteosomamphiphile Determinante-Impfstoffen, die entweder für eine parenterale Verabreichung oder insbesondere für eine Verabreichung an Schleimhäute gestaltet sind, und zwar unter anderem einschließlich für eine Atemwegsverabreichung (z.B. einschließlich intranasal, intrapharyngeal und intrapulmonal), eine gastrointestinale Verabreichung (z.B. einschließlich oral oder rektal) oder eine topische Verabreichung (z.B. konjunktival oder in das Ohr), um sowohl eine systemische Antikörperreaktion (Serum) als auch eine Schleimhaut-Antikörperreaktion (einschließlich in den Atemwegen und intestinal) zu induzieren. Eine amphiphile Determinante ist ein Molekül mit hydrophoben und hydrophilen Regionen, das sich, wenn es in geeigneter Weise mit Proteosomen formuliert ist, unter Bildung eines Komplexes mit den Proteosomen ausrichtet, der in einem Lebewesen eine Immunreaktion induziert. Typische amphiphile Determinanten umfassen Glycolipide, Liposaccharide (einschließlich entgiftete Lipopolysaccharide), Lipopeptide, Transmembran-, Hüll- oder Toxoidproteine, oder Proteine oder Peptide mit intrinsisch hydrophoben Aminosäureankern. Diese Determinantenmaterialien können aus gramnegativen Bakterien erhalten werden, einschließlich Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Hemophilus brucella, Shigella und Neisseria. Insbesondere betrifft die Erfindung Proteosom-Impfstoffe, bei denen äußere Membranproteinproteosom-Zubereitungen von Meningokokken (aus einem beliebigen Stamm von N. meningitidis oder N. gonorrhea oder anderen Neisseria-Arten hergestellt) nicht-kovalent an native oder entgiftete Shigella- oder Neisseria-Lipopolysaccharide oder Lipooligosaccharide zur Bildung von Impfstoffen komplexiert werden, die so gestaltet sind, dass, sie gegen Krankheiten schützen, die durch gramnegative Organismen verursacht werden, die beliebige Komponententeile des Komplexes enthalten, einschließlich Meningokokken oder Shigellen. Insbesondere betrifft die Erfindung Proteosom-Impfstoffe, die LPS enthalten, das Antikörperreaktionen induziert, die typspezifische somatische Polysaccharid-O-Antigene von Shigella-Lipopolysacchariden erkennen und dadurch einen homologen Schutz gegen eine Shigellose bereitstellen. Insbesondere werden die Lipopolysaccharide, die dann, wenn sie mit Proteosomen komplexiert werden, solche anti-Shigella-Schutzimmunreaktionen induzieren, für eine Immunität gegen eine Shigella sonnei-Erkrankung entweder aus Shigella sonnei oder Plesiomonas shigelloides, für eine Immunität gegen eine Shigella flexneri 2a-Erkrankung aus Shigella flexneri 2a, usw., hergestellt, und zwar unter Verwendung von LPS, das von homologen oder antigenisch kreuzreagierenden Organismen abgeleitet ist, um eine homologe Immunität gegen eine Shigellose zu verleihen, die durch S. flexneri 2a (oder 3a, usw.), S. boydii, S. sonnei, usw., verursacht wird. Ferner beschreibt die vorliegende Erfindung die erfolgreiche Verabreichung von Proteosom-Shigella-Impfstoffen, die dahingehend multivalent sind, dass zwei unabhängig unter Verwendung von Shigella-LPS, abgeleitet von S. flexneri 2a (für eine S. flexneri 2a-Erkrankung) und von P. shigelloides oder S. sonnei (für eine S. sonnei-Erkrankung), hergestellte Proteosom-Impfstoffe zusammen verabreicht werden, wodurch Antikörper . induziert werden, welche die beiden Organismen erkennen und dabei einen Schutz gegen die beiden Erkrankungsarten bereitstellen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Proteosom-Shigella-LPS-Impfstoff, bei dem Proteosomen von Gruppe B-Typ 2-Meningokokken unter Verwendung einer Hohlfaserdiafiltrationstechnologie mit P. shigelloides-LPS komplexiert werden, um einen Impfstoff zu erzeugen, der über den Atemwegsschleimhautweg und/oder den gastrointestinalen Schleimhautweg verabreicht wird, um Antikörper zu induzieren, die das somatische O-Antigen-LPS von S. sonnei erkennen und dadurch gegen eine durch diesen Organismus verursachte Shigellose schützen. Es sind auch andere herkömmliche Ultrafiltrations/Diafiltrationsverfahren vorgesehen, wie z.B. eine Plattformmembran und eine Membrankartusche.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung nicht-kovalent komplexierter Impfstoffe in einer Weise bereit, dass 1) die erforderliche Zeit vermindert wird, 2) die Möglichkeiten einer Kontamination vermindert werden, 3) die Temperatur, bei der solche Impfstoffe hergestellt werden können, auf Raumtemperatur erhöht wird, 4) eine effiziente Vergrößerung des Maßstabs des Herstellungsverfahrens derart ermöglicht wird, dass eine minimale Reagenzienverwendung erforderlich ist, und 5) eine zuverlässige und effiziente Probenahme eines Dialysats ermöglicht wird, so dass die Entfernungsrate des Detergenses wiederholt gemessen werden kann, um die Betriebseffizienz zu optimieren. Dies führt direkt zu einer Zunahme der Komplexierungseffizienz des Impfstoffs, so dass ein Impfstoff mit einer messbar höheren Immunogenität bei niedrigeren Dosierungen erzeugt wird. Auf diese Weise wird die Gesamtqualität des Produkts auf signifikante Weise erhöht. 6) Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Messung der Gegenwart des Detergenses beschrieben, das in der bevorzugten Ausführungsform verwendet wird, nämlich Empigen BB. Anstelle von Empigen BB können auch andere dialysierbare Detergenzien verwendet werden. Ferner wurde unter Verwendung der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass der Impfstoff derart lyophilisiert und rehydratisiert werden kann, dass die optimale Impfstoffwirksamkeit, wie sie durch die Impfstoffimmunogenität gemessen wird, bewahrt werden kann.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Verwendung einer Hohlfaser-Ultrafiltrations/Diafiltrationskartusche, um eine Komplexierung durch Entfernung des Detergenses zu bewirken. Durch Variieren der Größe des Gehäuses der Kartusche kann die Dialysezeit zur Herstellung einer Impfstoffcharge von >7–10 Tagen bis auf weniger als 72 Stunden und gewöhnlich weniger als 48 oder 24 Stunden vermindert werden. Da eine solche kurze Zeit eingesetzt wird, kann die Reaktionstemperatur von 4°C auf normale Raumtemperatur erhöht werden, ohne das Verfahren oder die Integrität des Produkts zu gefährden. Während das Verfahren bei etwa 20°C durchgeführt wurde, sind Temperaturen zwischen 0°C und 40°C vorgesehen. Da es sich um ein geschlossenes System handelt, besteht ein stark vermindertes Kontaminationspotenzial. Darüber hinaus kann durch die Vergrößerung des Gehäuses eine sehr große Materialmenge in einem relativ kurzen Zeitraum verarbeitet werden, wodurch eine effiziente und reproduzierbare Vergrößerung des Verfahrensmaßstabs für eine kommerzielle Entwicklung möglich ist. Ferner können von der durchgedrungenen Flüssigkeit wiederholt Proben entnommen werden, um die Entfernung des Detergenzes zu messen, wie dies unter Verwendung des Tests der vorliegenden Erfindung zur Messung des Detergenses Empigen BB erreicht werden kann, bei dem es sich um das in der bevorzugten Ausführungsform verwendete Detergens handelt. Der einzigartige Charakter dieses Verfahrens erforderte eine experimentelle Verifizierung, da es nicht nahe liegend war, dass die Komplexierung und die Struktur des Impfstoffs zu immunogenen Materialien führen, die durch langsames Dialysieren während 7 bis 10 Tagen unter Verwendung eines stationären Dialysebeutels durch die Verwendung der Hohlfasertechnologie erreicht oder verbessert werden können, bei der sich die zu komplexierenden Reste verglichen mit dem stationären Dialyseschlauch mit sehr hohen Strömungsgeschwindigkeiten durch Schläuche bewegen.
  • Da die Nenn-Molekulargewichtsgrenze der verwendeten Membran so ausgewählt werden kann, dass sie abhängig von der Größe der nicht-kovalent zu komplexierenden Komponenten bei 1000, 3000, 5000, 10000, 30000, 50000 oder mehr liegt, ist dieses System einfach auf das Komplexieren nativer oder entgifteter Lipopolysaccharide, Lipide, Peptide, Lipopeptide, Liposaccharide, Polysaccharide, Ganglioside oder Transmembran-, Hüll-, nativer oder Toxoidproteine oder auf äußere Membranproteinzubereitungen von Proteosomen von Meningokokken anpassbar.
  • Das resultierende Produkt kann als Impfstoff verwendet werden, der entweder parenteral oder über die Schleimhäute verabreicht wird, d.h. über die Atemwege oder den Gastrointestinaltrakt, wie z.B. intranasal, oral, durch ein oropharyngeales Inhalationsmittel, topisch oder rektal. In dem angegebenen Beispiel ist gezeigt, dass Proteosomen nichtkovalent an P. shigelloides-LPS komplexiert sind, um einen Impfstoff zu bilden, der die anti-S. sonnei-LPS-Reaktionen induziert, die für einen Schutz gegen S. sonnei-Shigellose erforderlich ist.
  • Das Verfahren hat drei Stufen: Einen vorbereitenden Vorgang, die Komplexierung des Proteosoms mit einer amphiphilen Determinante, wie z.B. P. Shigelloides-LPS und anschließend eine Sterilfiltration.
  • Bezüglich der optimalen Abgabe multivalenter Impfstoffe zeigt die vorliegende Erfindung, dass das beste Verfahren darin besteht, die spezifischen Impfstoffe einzeln herzustellen und dann am gleichen Tag mit den beiden einzeln hergestellten Impfstoffen eine Immunisierung durchzuführen, und zwar jeweils bei der optimalen Konzentration. Andere Möglichkeiten, wie z.B. die Herstellung von Hybridimpfstoffen während der Bildung der nicht-kovalenten Komplexe wurden ebenfalls erreicht oder sind vorgesehen.
  • 1: Immunogenität verschiedener Zubereitungen des Proteosom-Plesiomonas shigelloides-LPS-Impfstoffs: anti-Shigella sonnei-LPS-IgG-Titer in Mausseren nach zwei intranasalen Immunisierungen mit einem Impfstoff, der 10, 1,0 oder 0,1 μg Protein enthält. DT-1 und DT-2 – Dialyseschlauch. HF-1 und HF-2 – Hohlfaserkartusche. HF-2L – Hohlfaserkartusche und lyophilisiert. GMP-gute Herstellungspraxis.
  • 2: Immunogenität verschiedener Zubereitungen des Proteosom-Plesiomonas shigelloides-LPS-Impfstoffs: anti-Shigella sonnei-LPS-IgA-Titer in Mausseren nach zwei intranasalen Immunisierungen mit einem Impfstoff, der 10, 1,0 oder 0,1 μg Protein enthält.
  • 3: Mausserum-IgG-Titer nach der intranasalen Immunisierung mit den Proteosom-Shigella-LPS-Impfstoffen: gleichzeitige und/oder aufeinander folgende Verabreichung von Impfstoffen für S. sonnei und S. flexneri 2a. Das Schema 1 bestand aus fünf Mäusen, die an den Tagen 0 und 21 mit dem Proteosom-S. sonnei-LPS-Impfstoff intranasal immunisiert worden sind (jeweils 10 μg Proteosom und LPS). Den Mäusen wurde vier Wochen nach der letzten Immunisierung Blut entnommen. Das Schema 2 bestand aus fünf Mäusen, die an den Tagen 0 und 21 mit dem Proteosom-S. flexneri 2a-LPS-Impfstoff intranasal immunisiert worden sind (jeweils 10 μg Proteosom und LPS). Den Mäusen wurde vier Wochen nach der letzten Immunisierung Blut entnommen. Das Schema 3 bestand aus fünf Mäusen, die an den Tagen 0 und 21 mit dem Proteosom-S. sonnei-LPS-Impfstoff (jeweils 10 μg Proteosom und LPS) und dem Proteosom-S. flexneri 2a-LPS-Impfstoff (jeweils 10 μg Proteosom und LPS) intranasal immunisiert worden sind. Den Mäusen wurde vier Wochen nach der letzten Immunisierung Blut entnommen. Das Schema 4 bestand aus vier Mäusen, die an den Tagen 0 und 21 mit dem Proteosom-S. sonnei-LPS-Impfstoff (jeweils 10 μg Proteosom und LPS) und dann an den Tagen 49 und 70 mit dem S. flexneri 2a-LPS-Impfstoff (jeweils 10 μg Proteosom und LPS) intranasal immunisiert worden sind. Den Mäusen wurde vier Wochen nach der letzten S. flexneri 2a-Immunisierung Blut entnommen. Die gemeinsame Verabreichung der Proteosom-P. shigelloides-LPS- (für S. sonnei-Shigellose) und der Proteosom-S. flexneri 2a-Impfstoffe am gleichen Tag oder um Wochen getrennt führte zu einer guten Immunogenität gegenüber sowohl der S. sonnei-LPS-Komponente als auch gegenüber der S. flexneri 2a-LPS-Komponente.
  • 4: Elektronenmikrographie eines Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs, die Goldmarkiertes anti-Shigella sonnei-LPS zeigt, das mit Proteosomen assoziiert ist. In dieser Mikrographie identifizieren Gold-markierte sekundäre Antikörper (als lichtundurchlässige schwarze Punkte sichtbar) primäre Antikörper, die gegen Shigella-LPS gerichtet sind. Es ist ersichtlich, dass das LPS klar mit den Proteosomvesikeln assoziiert ist.
  • 5: Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff schützt in einem Shigellose-Tiermodell gegen eine letale Shigella sonnei-Pneumonie. Gruppen ausgezüchteter Mäuse (14 bis 15 pro Gruppe) wurden in den Wochen 0 und 3 mit dem Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff intranasal immunisiert (jeweils 10 μg Proteosom und LPS pro 20 μl). Kontrollgruppen wurden mit dem gleichen Schema Kochsalzlösungen verabreicht. Alle Mäuse wurden in der siebten Woche intranasal mit 5 bis 10 Millionen koloniebildenden Einheiten von S. Sonnei gereizt. Die Mäuse wurden für 2 Wochen nach der Reizung täglich untersucht und die Sterblichkeit, die aus der nachfolgenden Lungenerkrankung resultierte, wurde aufgezeichnet. Wie es vorstehend gezeigt worden ist, sterben 86 bis 100 % der Kontrollmäuse innerhalb von 4 Tagen nach der Reizung. In beiden Experimenten überlebten 93 % der Mäuse, die mit dem Impfstoff immunisiert worden sind, die Reizung (P < 0,001, exakter Test nach Fisher).
  • 6: Eine intranasale oder orale Immunisierung mit Proteosom-Shigella flexneri 2a-LPS-Impfstoffen induziert anti-Shigella-LPS-IgG und -IgA im Serum und -IgA in Darm- und Lungenspülfluiden, die 30 bis 60 Tage nach der Immunisierung anhalten können.
  • 7: Eine intranasale oder orale Immunisierung von Menschen mit einer oder zwei Dosen an Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffen für Shigella sonnei unter Verwendung verschiedener Impfstoffmengen: Induktion von anti-Shigella-LPS-IgA-, -IgG- und IgM-ASC-Reaktionen in peripherem Blut, und Antikörperreaktionen im Serum, Speichel und Harn.
  • 8: LPS in HPLC-Fraktionen nach der Anwendung von unkomplexierten P. shigelloides-LPS und Demonstration einer nicht-kovalenten Komplexierung von LPS und Proteosomproteinen durch gemeinsame Elution von LPS und Proteinen in HPLC-Fraktionen nach der Anwendung eines Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs.
  • 9: Bakterizide Antikörperreaktion von Mäusen auf einen Meningokokken-äußeres Membranprotein-entgiftetes Lipooligosaccharid-Impfstoff, geometrischer Mittelwert des reziproken Titers gegen den Meningokokkenstamm 9162.
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Proteosom-P. shigelloides-Impfstoffs, der etwa 2 bis 3 g Protein enthält. Das Verfahren ist bei einer geeigneten Maßstabsvergrößerung der Gehäusegröße der Membrankartusche und geeigneter Volumenerhöhung gleichermaßen auf eine Maßstabsvergrößerung mit 10- bis 1000-fach mehr Material anwendbar. Unter Verwendung von Membranen mit einer geeigneten Größe und mit einer geeigneten Molekulargewichtsgrenze, um die zu komplexierenden Antigene zurückzuhalten, kann dieses Verfahren gleichermaßen auf die Komplexierung von Proteosomen mit anderen nativen oder entgifteten Lipopolysacchariden, Lipiden, Peptiden, Lipopeptiden, Liposacchariden, Polysacchariden, Gangliosiden oder Transmembran-, Hüll- oder nativen oder Toxoidproteinen oder mit äußeren Membranproteinzubereitungen oder Proteosomen von Meningokokken angewandt werden. Empigen BB ist das Detergens, das in diesem Verfahren als Beispiel verwendet wird. Das Verfahren ist jedoch mit einem beliebigen dialysierbaren Detergens anwendbar, das die Komponenten solubilisiert. Bei diesem Verfahren werden A/G Technology-Kartuschen verwendet. In diesem Verfahren kann jedoch auch ein Ultrafiltrations/Diafiltrationssystem mit Kartuschen einer beliebigen Marke verwendet werden.
  • 5.0.0.1 Vorbereitende Vorgänge
  • 5.0.0.1 Sterilfiltrieren einer Vorratslösung von 30 %igem Empigen BB, bei dem es sich um das in diesem Verfahren verwendete Detergens handelt.
  • 5.0.0.2 Herstellen von 2X TEEN/2 % Empigen (0,1 M Tris, 0,02 M Dinatrium-EDTA, 0,3 M Natriumchlorid, WFI und 2 % Empigen, pH 8,0).
  • 5.0.0.3 Herstellen von 150 Liter einer TNS-Lösung (Tris-normale Kochsalzlösung) zum Herausdialysieren des Detergenses, die 0,05 M Tris, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,0, enthält.
  • 5.0.0.4 Herstellen von 10 Liter Natriumhydroxidlösung zur Reinigung der OF Kartusche.
  • 5.0.0.5 Auftauen der erforderlichen Menge an Shigella flexneri 2a-Lipopolysaccharid (LPS).
  • 5.0.1 Komplexieren von Proteosomen mit S. flexneri 2a-LPS.
  • 5.0.1.6 Zugeben eines gleichen Volumens 2X TEEN-Puffer zu dem LPS-Volumen und gründlich Mischen.
  • 5.0.1.7 Auftauen und Abmessen einer Menge an Proteosomenmasse in mg, die der Menge des im Schritt 5 aufgetauten LPS entspricht.
  • 5.0.1.8 Zusetzen von 30 ml sterilfiltriertem Empigen pro Liter zu den Proteosomen. Gründlich Mischen und mit dem LPS von Schritt 5 vereinigen.
  • 5.0.1.9 Gründliches Mischen beider Komponenten. Gewöhnlich sind 15 min mit einer Kombination aus Rührplatte und Rührstab ausreichend.
  • 5.0.1.10 Zum Herausdialysieren des Detergenses, so dass sich Proteosomkomplexe bilden können, wird ein Ultrafiltrationssystem (auf der Basis der Tangentialströmungstechnologie) unter Verwendung einer Hohlfaserkartusche mit einer Nenn-Molekulargewichtsgrenze-Porengröße (NMWC-Porengröße) von 10000 aufgebaut, die von A/G Technology, Inc., hergestellt und mit einem sterilisierten Silikonschlauch und einer peristaltischen Pumpe verbunden wird. Desinfizierte Druckmesser werden an der Einlass- und Auslassseite der Kartusche angeordnet, um den Druck während des Durchlaufs zu überwachen. Ein Rückschlagventil wird auf der Auslassseite der Kartusche angeordnet, um den Gegendruck einzustellen.
  • 5.0.1.11 Das Ultrafiltrationssystem wird mit WFI und 0,5 N NaOH bei 50°C für mehr als 60 min gereinigt und desinfiziert. Dieses System wird mit WFI gespült und vor der Verwendung mit TNS-Puffer äquilibriert.
  • 5.0.1.12 Ein steriler Vorratsbehälter wird mit der Anlage verbunden, so dass die Einlassflüssigkeit aus dem Behälter gezogen und die zurückgeführte zurückgehaltene Flüssigkeit dem gleichen Vorrat zugeführt wird. Wenn eine Flüssigkeit durch die Kartuschenmembran durchdringt (durchgedrungene Flüssigkeit oder Filtrat), wird sie entweder durch eine direkte Zugabe oder durch ein kontinuierliches Zuführungssystem mit TNS-Puffer ergänzt. Ein kontinuierliches Zuführungssystem wird durch Verbinden eines Silikonschlauchs mit einem Behälter, der TNS-Puffer enthält, und mit dem Probenvorratsbehälter aufgebaut, der dann luftdicht ist. Wenn die Flüssigkeit durch Filtration aus dem Probenvorratsbehälter entfernt wird, wird ein Vakuum erzeugt, das dazu führt, dass „TNS"-Puffer aus seinem Behälter in den Probenvorratsbehälter gezogen wird. Wenn das System luftdicht bleibt, bleibt das Probenniveau in dem Behälter konstant.
  • 5.0.1.13 Starten der Umwälzpumpe, um mit der Diafiltration zu beginnen. Einstellen der Pumpengeschwindigkeit und des Rückschlagventils derart, dass ein Gegendruck von 15 ± 4 psi erhalten wird.
  • 5.0.1.14 Verifizieren der fortschreitenden Entfernung von Empigen BB durch Testen von Proben der durchgedrungenen Flüssigkeit, die alle 10 bis 15 Liter unter Verwendung des Empigen-Precipitin-Tests entnommen werden. Dieser Test besteht aus der Herstellung von Reihenverdünnungen der durchgedrungenen Flüssigkeit und einer Standardlösung, die eine bekannte Menge an Empigen BB enthält, dem Zusetzen von HCl zum Ansäuern der Lösungen und dann dem Zusetzen von Reihenverdünnungen von SDS (Natriumdodecylsulfat) zur Bildung eines schachbrettartigen Tests. Ein maximaler Niederschlag wird gebildet, wenn äquivalente Mengen an Empigen und SDS vorliegen. Auf diese Weise kann die Menge des vorhandenen Empigens durch Aufzeichnen der Verdünnung des SDS, der durchgedrungenen Flüssigkeiten und der Standards quantifiziert werden, bei denen der maximale Niederschlag gebildet wird. Mit fortschreitender Diafiltration wird die Empigenmenge geringer und das Röhrchen, das weniger SDS enthält, wird das Röhrchen mit dem maximalen Niederschlag sein. Die Gegenwart des Niederschlags wird durch Messen der OD bei 600 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers quantifiziert.
  • 5.0.1.15 Bei der in diesem Beispiel verwendeten Menge an Komponenten wird die Diafiltration fortgesetzt, bis mindestens 120 Liter durchgedrungene Flüssigkeit verarbeitet worden sind und bis in dem Empigen-Precipitin-Test ein Mangel an signifikantem Niederschlag auftritt (die maximale OD bei 600 nm beträgt weniger als 0,05).
  • 5.0.1.16 Konzentrieren des Produkts nach der vollständigen Dialyse auf ein Endvolumen, das derart ist, dass ein OD280-Wert von etwa 6,0 erhalten wird. Spülen des Systems und Waschen mit 300 bis 400 ml "TNS"-Puffer. Erneutes Spülen des Systems und Vereinigen beider Lösungen. Reinigen der Kartusche durch Umwälzen großer Mengen an WFI und dann 0,5 N NaOH bei 50°C für >60 min. Herausspülen des NaOH mit WFI und Lagern des Systems in 0,01 N NaOH.
  • 5.0.2 Sterilfiltration
  • 5.0.2.17 Die Komplexe können gegebenenfalls sterilfiltriert werden. Die Proteosomkonzentration kann vor oder nach der 0,22 μ-Filtration eingestellt werden. Die Sterilfiltration wird gewöhnlich mit Filtereinheiten von Millipore Corp. durchgeführt. Diese Einheiten werden als Millipaks bezeichnet und sind in verschiedenen Größen erhältlich. Das filtrierte Volumen wird bis zum Abfüllvorgang bei 4°C gelagert und auf Sterilität getestet.
  • 5.0.3.0 Spezifischer Zweck: Kombinieren von GMP-Massezubereitungen von äußeren Membranproteinproteosomen von Meningokokken und S. flexneri 2a-Lipopolysaccharid zu nicht-kovalenten Komplexen durch Entfernung des Detergens.
  • 5.0.3.1 Anwendungen: Mit diesem GMP-Verfahren wird eine Zubereitungsmasse aus nichtkovalenten Komplexen von Proteosomen mit S. flexneri 2a-Lipopolysaccharid zur Verwendung als Impfstoff gegen eine S. flexneri 2a-Infektion hergestellt.
  • Beispiel 2
  • Nicht-kovalentes Komplexieren einer Masse gereinigter äußerer Membranproteine (Proteosomen) des Neisseria meningitidis-Stamms 9162 und alkalisch entgiftetem N. meningitidis L8-Lipooligosaccharid, das vom Stamm 8532 isoliert worden ist.
  • 5.1.0 Eine Masse von äußerem Membranprotein (Proteosomen) 9162, Charge 0136, und eine Masse von entgiftetem Meningokokken-L8-Lipooligosaccharid (LOS), Charge 0203, wurden aus dem Lager entnommen und bei Raumtemperatur aufgetaut. Ein Volumen (182 ml) der LOS-Masse, die 500 mg LOS in sterilem destilliertem Wasser enthielt, wurde mit einem Volumen (306 ml) der Proteosomenmasse vereinigt, das 400 mg Protein in einem Puffer enthielt, der 0,05 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA und 0,1 % Empigen BB enthielt.
  • 5.1.2 Empigen BB (30 %ige Lösung) wurde durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilfiltriert und 1/60-Volumen wurde der vereinigten Proteosomen-LOS-Lösung zugesetzt und es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
  • 5.1.3 Die Detergens-Puffer-Lösung wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationskartusche UFP-3-C-6 von A/G Technology mit einer Molekulargewichtsgrenze-Porengröße von 3000 aus der Proteosomen-LOS-Lösung entfernt und durch steriles destilliertes Wasser ersetzt.
  • 5.1.4 Das Verfahren des Aufbaus, der Desinfektion, des Waschens, Waschens und Reinigens der Vorrichtung war mit dem Verfahren von Beispiel 1 identisch. Der Einlassdruck betrug 15 ± 4 psi und die Strömungsgeschwindigkeit der durchgedrungenen Flüssigkeit betrug 175 ml/min.
  • 5.1.5 Die durchgedrungene Flüssigkeit wurde alle 3 bis 4 Liter mit dem im Beispiel 1 beschriebenen Niederschlagsverfahren bezüglich der Gegenwart von Empigen BB- Detergens getestet. Die Ultrafiltration wurde fortgesetzt, bis in dem Test plus zusätzliche 5 Liter kein Niederschlag mehr festgestellt wurde. Insgesamt wurden 37 Liter an durchgedrungener Flüssigkeit gewonnen.
  • 5.1.6 Die zurückgehaltene Flüssigkeit war klar und wurde durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilfiltriert, der bezüglich Protein und LOS getestet worden ist, und als Produktmasse bei 4°C gelagert.
  • 5.1.7 Die Produktmasse wurde auf eine Konzentration von 0,2 mg Protein pro ml verdünnt und die Konzentration von NaCl wurde auf 0,15 M eingestellt. Als Konservierungsmittel wurde Thimerasol in einer Konzentration von 0,01 % zugesetzt und die resultierende Masse wurde schließlich unter sterilen Bedingungen in Fläschen eingebracht, etikettiert und bei –70°C gelagert.
  • 5.1.8 Dieses Produkt wurde in Mäusen bezüglich der Immunogenität getestet, wenn es als Kochsalzlösung und an ein Aluminiumhydroxidgel als Zusatz absorbiert verabreicht wurde. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben und zeigen, dass die Impfstoffkomplexe immunogen waren, wenn sie i.p. an Mäuse verabreicht wurden.
  • Tabelle 1. Bakterizide Antikörperreaktion von Mäusen auf einen Meningokokken-äußeres Membranprotein-entgiftetes Lipooligosaccharid-Impfstoff, geometrischer Mittelwert des reziproken Titers gegen den Meningokokkenstamm 9162.
  • Figure 00130001
  • 5.1.9 Die Komplexierung von Proteosomen und LOS wurde mittels Säulenchromatographie der Proteosomen- und LOS-Komponenten vor und nach dem Komplexieren verifiziert ( 9). Die chromatographische Analyse der Meningokokken-L8-LOS-Masse und der schließlich erhaltenen Proteosomen/LOS-Komplexe wurde mit einer Sephacryl S300-Niederdrucksäule durchgeführt. Die Säule wurde mit einem Puffer aus 0,05 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,15 M NaCl betrieben. Der Proteintest wurde durch die Extinktion bei 280 nm durchgeführt und der LOS-Test wurde durch die Hemmung eines ELISA (= enzyme linked immunosorbant assay) durchgeführt, bei dem ein monoklonaler L8-Antikörper, der an gereinigtes L8-LOS bindet, das an der Kunststoffplatte adsorbiert war, durch Reihenverdünnungen der Fraktionen aus der Sephacrylsäule gehemmt wurde. Vor dem Komplexieren lief das LOS in Form eines breiten Peaks bei der Fraktion 39 von der Säule ab. Nach dem Komplexieren eluierte das LOS zusammen mit den Proteosomen in einem Peak etwa bei der Fraktion 33.
  • 5.1.10 Spezifischer Zweck: Kombinieren von GMP-Massezubereitungen von äußeren Membranproteinproteosomen von Meningokokken und entgiftetem Meningokokken-Lipopolysaccharid zu nicht-kovalenten Komplexen durch Entfernung des Detergens.
  • 5.1.11 Anwendungen: Mit diesem GMP-Verfahren wird eine Zubereitungsmasse aus nichtkovalenten Komplexen von Proteosomen mit entgiftetem Meningokokken-Lipopolysaccharid zur Verwendung als Impfstoff gegen eine N. meningitidis-Infektion (Meningokokken-Infektion) hergestellt.
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel betrifft auch die Herstellung eines Proteosom-P. shigelloides-Impfstoffs. Das Verfahren ist gleichermaßen für eine Maßstabsvergrößerung unter Verwendung von 10- bis 1000-mal mehr Material zusammen mit einer Maßstabsvergrößerung der Gehäusegröße der Membrankartusche und geeigneten Volumenvergrößerungen geeignet.
  • 5.8.1 Herstellen von 25 ml sterilfiltriertem Empigen BB (30 %ige Lösung).
  • 5.8.1.1 Verwenden einer 100 ml-Einmalfiltereinheit von Nalgene mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μ, um etwa 25 ml Empigen BB (30 %ige Lösung) steril zu filtrieren.
  • 5.8.2 Herstellen von 4 Liter TEEN 2× mit 2 % Empigen BB (bestehend aus 0,1 M Tris, 0,02 M Dinatrium-EDTA, 0,3 M Natriumchlorid, WFI und einer 2 %igen Lösung von Empigen BB).
  • 5.8.3 Fünfzehnmaliges Herstellen von 10 Liter einer Lösung von "TNS", so dass insgesamt 150 Liter erhalten werden: TNS besteht aus 0,15 M Natriumchlorid und 0,05 M Tris-Puffer pH 8,0 ± 0,2.
  • 5.8.4 Herstellen von 10 Liter einer 0,5 N Natriumhydroxidlösung.
  • 5.8.6 Gegebenenfalls Auftauen einer P. shigelloides-Lipopolysaccharid-Masse (LPS-Masse) zur Vorbereitung der Komplexierung mit Proteosomen und Aufzeichnen der Chargennummer, der Konzentration des LPS, der erforderlichen Menge an LPS in mg und des berechneten LPS-Volumens, das entfernt werden soll.
  • 5.9.0 Komplexieren von Proteosomen mit P. shigelloides-LPS
  • 5.9.1 Herstellen von LPS für die Komplexierung
  • 5.9.1.2 Vereinigen der Aliquots der LPS-Masse in einer sauberen, sterilen kalibrierten 5 Liter-Flasche. Messen des Gesamtvolumens und Bestimmen der Gesamtmenge an LPS.
  • 5.9.1.3 Zugeben eines Volumens von 2× TEEN-Puffer in einem Volumen, das gleich dem Volumen des in dem Schritt 5.9.1.2 verwendeten LPS ist, Messen des vereinigten Gesamtvolumens und anschließend Zusetzen eines Rührstabs und Mischen mit einer Kombination aus Rührplatte und Rührstab für 15 ± 2 min.
  • 5.9.2 Herstellung von Proteosomen für die Komplexierung
  • 5.9.2.1 Aufzeichnen der Gesamtzeit, für welche die Proteosomen auftauen gelassen wurden, falls eine solche Gesamtzeit vorliegt.
  • 5.9.2.2 Vereinigen der Aliquots der Proteosomenmasse in einem sauberen, sterilen graduierten 1 Liter-Zylinder. Messen des Gesamtvolumens und Bestimmen der Proteosomen-Gesamtmenge.
  • 5.9.2.3 Überführen eines Proteosomenvolumens aus dem Zylinder im Schritt 5.9.2.2, das die Menge in mg enthält, die der mg-Menge des im Schritt 5.9.2.1 verwendeten LPS entspricht, in einen anderen sauberen, sterilen graduierten 1 Liter-Zylinder.
  • 5.9.2.4 Einbringen von 0,22 μ-filtriertem 30 %igen Empigen Bb in den die Proteosomen enthaltenden Zylinder unter Verwendung von 30 ml Empigen pro Liter der Proteosomen. Mischen mit einem Rührstab für 15 ± 2 min.
  • 5.9.3 Vereinigen von Proteosomen mit dem P. shigelloides-LPS
  • 5.9.3.1 Einbringen der Proteosomen von Schritt 5.9.3.2 in die graduierte 5 Liter-Flasche mit dem LPS unter gelindem Rühren mit einem Rührstab und Rühren für 15 ± 2 min.
  • 5.9.3.3 Entnehmen von vier 1 ml-Proben und Lagern derselben bei –75°C für eine spätere Messung der Proteinkonzentration mit dem Lowry-Verfahren und der LPS-Konzentration mit dem KDO-Test.
  • 5.9.4 Entfernung des Detergenses mittels Ultrafiltration/Diafiltration
  • 5.9.4.1 Details des Ultrafiltrationssystems: A/G Technology, Inc., Hohlfaserkartusche, NMWC-Porengröße 10000, Gehäusegröße 6, Ultrafiltrationskartusche. Anmerkung: Es ist erforderlich, neue Kartuschen zu konditionieren, um Glycerin auszuwaschen. Dies kann durch Spülen von 6 Liter WFI oder weniger durch die 6 sq/ft-Kartuschen ohne Gegendruck durchgeführt werden. Die durchgedrungene Lösung sollte nicht in den Zuführungsvorratsbehälter zurückgeführt werden. Anmerkung: Auf alle Ultrafiltrationsschritte folgen Reinigungs-, Desinfektions- und Lagerschritte. Neue Kartuschen müssen vor der Verwendung gereinigt und desinfiziert werden.
  • 5.9.4.2 Aufbauen und Desinfizieren des A/G-Ultrafiltrationssystems. Reinigen und Desinfizieren des Systems durch Umwälzen von 2 bis 3 Liter einer 0,5 N Natriumhydroxidlösung bei einer Anfangstemperatur von 50 ± 5°C für mindestens 60 min. Spülen des Systems mit 4 bis 5 Liter WFI und anschließend Umwälzen von 2 bis 3 Liter "TNS" (0,05 M Tris/normale Kochsalzlösung-Puffer, pH 8,0 ± 0,2) für mindestens 20 ±5 min.
  • 5.9.4.3 Messen des Füllvolumens in dem UF-System (einschließlich der Schläuche) durch Überführen von Einlass- und Auslassleitungen, die mit Flüssigkeit gefüllt sind, aus dem Vorratsbehälter heraus in einen graduierten 1 Liter-Zylinder und anschließend Pumpen, bis das UF-System leer ist.
  • 5.9.4.4 Anordnen eines 2 Liter-Behälters mit Seitenansätzen in einer Pfanne und Einpacken des Behälters mit nassem Eis während der Dauer des Diafiltrationsverfahrens.
  • 5.9.4.5 Überführen von 1,7 bis 1,9 Liter der Proteosom-LPS-Gemischmasse vom Schritt 5.9.3.3 in den 2 Liter-Behälter mit Seitenansätzen. Platzieren eines mit zwei Löchern ausgestatteten Stopfens, der mit zwei 10 ml-Pipetten versehen ist, auf dem Behälter und Verbinden des Einlass- und Auslassschlauchs des Diafiltrationssystems mit den Behälterpipetten.
  • 5.9.4.6 Einschalten der Umwälzpumpe und Einstellen der Pumpe auf 4 bis 6. Einstellen der Gegendruckklemme, so dass ein Einlassdruck von 15 ± 4 psi erhalten wird. Konzentrieren auf ein Gesamtvolumen von 1,0 ± 0,1 Liter, einschließlich des Füllvolumens.
  • 5.9.4.7 Überführen von 1 ± 0,1 Liter des Gemischs von Schritt 5.9.3.3 in den 2 Liter-Behälter mit Seitenansätzen und Wiederholen des Schritts 5.9.4.6
  • 5.9.4.8 Fortsetzen der Überführung wie im Schritt 5.9.4.7 und des Konzentrierens wie im Schritt 5.9.4.9, bis das gesamte Proteosom-LPS-Gemisch von Schritt 5.9.3.3 in den 2 Liter-Behälter mit Seitenansätzen überführt worden ist und das Volumen der zurückgehaltenen Flüssigkeit 1,4 ± 0,2 Liter ist, einschließlich des Füllvolumens.
  • 5.9.4.10 Einstellen der Ultrafiltrationsvorrichtung für eine kontinuierliche Zuführung von TNS (0,05 M Tris, normale Kochsalzlösung) in den 2 Liter-Behälter mit Seitenansätzen, wenn Flüssigkeit durch die Membran entfernt wird. Aufbauen eines Vorratsbehälters unter Verwendung einer 10 Liter-Flasche, die TNS enthält und mit einem Schlauch ausgestattet ist, der sich zum Boden der Flasche erstreckt. Verbinden der Einlass- und Auslassleitungen des Ultrafiltrationssystems. Einschalten der Umwälzpumpe und Einstellen der Pumpe auf 4 bis 6. Einstellen der Gegendruckklemme, so dass ein Einlassdruck von 15 ± 4 psi erhalten wird.
  • 5.9.4.11 Messen der Strömungsgeschwindigkeit der durchgedrungenen Flüssigkeit an der UF-Einheit und Aufzeichnen des Einlassdrucks, wenn die Messung vorgenommen wird.
  • 5.9.4.12 Entnehmen einer 15 bis 20 ml-Probe der durchgedrungenen Flüssigkeit alle 12 ± 0,5 Liter, die verarbeitet worden sind, Anbringen eines Etiketts zum Gebrauch im Hause ("Durchgedrungene Flüssigkeit Nr. P1, P2, P3, usw.") und Aufzeichnen der Zeit, des verarbeiteten Volumens und des maximalen OD600-Werts der Probe. Verifizieren der fortschreitenden Entfernung von Empigen durch Testen der Proben bezüglich der Gegenwart von Empigen BB unter Verwendung des Empigen-Precipitin-Tests. Dieser Test besteht aus der Herstellung von Reihenverdünnungen der durchgedrungenen Flüssigkeit und getrennt davon einer Lösung, die eine bekannte Menge an Empigen BB enthält, dem Zusetzen von HCl zum Ansäuern der Lösungen und dann dem Zusetzen von Reihenverdünnungen von SDS (Natriumdodecylsulfat) zur Bildung eines schachbrettartigen Tests. Ein maximaler Niederschlag wird gebildet, wenn äquivalente Mengen an Empigen und SDS vorliegen. Auf diese Weise kann die Menge des vorhandenen Empigens durch Aufzeichnen der Verdünnungen der durchgedrungenen Flüssigkeiten und des SDS, in welchen der Niederschlag gebildet wird, und Vergleichen dieser Verdünnungen mit denjenigen der Standards quantifiziert werden. Mit fortschreitender Diafiltration wird die Empigenmenge geringer und das Röhrchen, das weniger SDS enthält, wird das Röhrchen mit dem maximalen Niederschlag sein. Die Gegenwart des Niederschlags wird durch Messen der OD bei 600 nm unter Verwendung eines Spektrometers quantifiziert. Bei der in diesem Beispiel verwendeten Menge an Komponenten wird die Diafiltration fortgesetzt, bis mindestens 120 Liter durchgedrungene Flüssigkeit verarbeitet worden sind und bis in dem Empigen-Precipitin-Test ein Mangel an signifikantem Niederschlag auftritt (die maximale OD bei 600 nm beträgt weniger als 0,05).
  • 5.9.4.13 Konzentrieren des Produkts auf ein Endvolumen der zurückgehaltenen Flüssigkeit von 500 ± 50 ml, einschließlich des Füllvolumens (Schritt 9.4.3). Entnehmen einer 0,5 ml-Probe, Verdünnen der Probe im Verhältnis 1:10 und Messen der OD280.
  • 5.9.4.14 Die gewünschte minimale OD der konzentrierten zurückgehaltenen Flüssigkeit beträgt 5,7. Wenn die OD weniger als 5,7 beträgt, wird die Konzentrierung auf 400 ± 50 ml einschließlich des Füllvolumens fortgesetzt (Schritt 5.9.4.3) und die OD280-Messung wird wiederholt.
  • 5.9.4.15 Mit aus der Lösung der zurückgehaltenen Flüssigkeit herausgenommenen Leitungen für die zurückgehaltene Flüssigkeit und geschlossenen Filtratauslassleitungen wird langsam in der umgekehrten Richtung gepumpt, bis die Kartusche und die Leitungen leer sind. Überführen der Zuführungsleitung und der Leitungen für die zurückgehaltene Flüssigkeit aus der Flasche für die zurückgehaltene Flüssigkeit in einen neuen sauberen Behälter mit 350 ± 50 ml TNS. Umkehren der Pumprichtung und langsames Umwälzen des TNS für 2 bis 3 min.
  • 5.9.4.16 Stoppen der Pumpe nach dem Umwälzen des TNS, Spülen des Systems, Sammeln der Lösung der zurückgehaltenen Flüssigkeit in einem sauberen, sterilen graduierten 1 Liter-Zylinder und Messen des Volumens und der OD280.
  • 5.9.4.17 Vereinigen der ursprünglichen Lösung der zurückgehaltenen Flüssigkeit (Schritt 5.9.4.12 oder 5.9.4.13) mit der beim Waschen erhaltenen Lösung der zurückgehaltenen Flüssigkeit (Schritt 5.9.4.15) und Messen des Endvolumens der zurückgehaltenen Flüssigkeit. Lagern des Volumens der zurückgehaltenen Flüssigkeit bei 4°C ± 2°C bis zur aseptischen Filtration.
  • 5.9.4.18 Reinigen der Filtrationseinheit unter Verwendung von WFI und anschließend 0,5 N Natriumhydroxidlösung bei einer Anfangstemperatur von 50 ± 5°C für mindestens 60 min. Herausspülen des Reinigungsmittels mit WFI und dann Spülen mit 3 bis 4 Liter 0,1 N NaOH als Lagerungsmittel.
  • 5.9.5 Sterilfiltration
  • Die Komplexe können gegebenenfalls sterilfiltriert werden. Untersuchen der komplexierten Masse von Proteosomen und LPS bezüglich der Gegenwart eines Niederschlags oder einer Trübung. Wenn die Masse des komplexierten Produkts klar ist, wird sie unter Verwendung einer Millipak 40 0,22 μ-Filtrationseinheit in einen sterilen pyrogenfreien Behälter filtriert. Dieser Schritt muss in einem sterilen Raum durchgeführt werden.
  • 5.9.6 Spezifischer Zweck: Kombinieren von GMP-Massezubereitungen von äußeren Membranproteinproteosomen von Meningokokken und P. shigelloides-Lipopolysaccharid (für S. sonnei) zu nicht-kovalenten Komplexen durch Entfernung des Detergens.
  • 5.9.7 Anwendungen: Mit diesem GMP-Verfahren wird eine Zubereitungsmasse aus nichtkovalenten Komplexen von Proteosomen mit P. shigelloides 2a-Lipopolysaccharid zur Verwendung als Impfstoff gegen eine Shigella sonnei-Infektion hergestellt.
  • 5.10 Immunogenitätsstudien
  • 5.10.1 Immunogenität eines unter Verwendung einer Hohlfaser-Ultrafiltration/Diafiltration hergestellten Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs
  • Die 1 und 2 zeigen, dass drei verschiedene Proteosom-P. shigella-LPS-Impfstoff-Zubereitungen, die unter Verwendung der Hohlfaser-Diafiltrationstechnik (HF-Diafiltrationstechnik) hergestellt worden sind (HF-1, HF-2 und GMP/HF-3), um das Detergens zu entfernen und die Komplexierung zu erleichtern, bei der niedrigsten, am meisten stringenten getesteten Dosis wirksamer sind als Zubereitungen, die unter Verwendung einfacher Dialyseschläuche (DT) hergestellt worden sind. Mit anderen Worten: Mit Impfstoffen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind, wurden stärkere IgG- (1) und IgA-Immunreaktionen (2) ausgelöst, als dies bei der älteren, weniger effizienten Technologie der Fall war. Da eine stärkere Immunreaktion zu einem besseren Schutzniveau führt, zeigen diese Daten deutlich, dass die vorliegende Erfindung zu Impfstoffen führt, die nicht nur effizienter herzustellen, sondern auch stärker wirksam sind. Ferner werden die stärkeren Reaktionen durch den Impfstoff ausgelöst, wenn dieser bei der niedrigsten Dosis (0,1 μg pro Dosis) verabreicht wird, was zeigt, dass unter Verwendung der vorliegenden Erfindung weniger Impfstoff erforderlich ist, als dies bei der Verwendung der älteren Technologie der Fall ist. Da in der Formulierung multivalenter Impfstoffe viele verschiedene Antigene erforderlich sind, um die Gesamtmenge des verabreichten Impfstoffs zu minimieren, ist es sehr vorteilhaft, dass Impfstoffkomponenten verwendet werden können, die bei niedrigeren Dosierungen wirksam sind. Folglich beeinflusst und erleichtert die Technologie der vorliegenden Erfindung, Impfstoffe unter Verwendung der Hohlfasertechnologie herzustellen, direkt das Vermögen, multivalente Impfstoffe mit einem breiten Bereich von Spezifikationen zu formulieren. Da es für die kommerzielle Entwicklung von Impfstoffen vorteilhaft ist, Impfstoffe zu lyophilisieren, ist es sehr vorteilhaft, dass gefunden wurde, dass die Lyophilisierung der HF-Impfstoffkomplexe aus einer Wasserlösung überraschenderweise zu einem Impfstoff führte, der konsistent Reaktionen auslöste, die zu den stärksten aller getesteten Dosierungen gehörten. Folglich wurde eine höhere Immunogenität für anti-LPS-IgG (1) und -IgA (2) gefunden, wenn 0,1 μg des mit der HF-Technologie hergestellten Impfstoffs (mit oder ohne Lyophilisierung) verabreicht wurden. Diese Daten sind signifikant, da bei der Maßstabsvergrößerung und dem GMP-Verfahren der vorliegenden Erfindung die HF-Technologie verwendet wurde, wie es in den 1 und 2 durch den gepunkteten Balken angegeben ist, der GMP/HF-3 darstellt.
  • 5.10.2 Immunogenitätsstudien unter Verwendung eines multivalenten Impfstoffs Gemäß 3 führt die Verabreichung des Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs (für S. sonnei-Shigellose) und des Proteosom-S. flexneri 2a-Impfstoffs am gleichen Tag oder um Wochen getrennt zu einer guten Immunogenität für beide LPS-Komponenten: S. sonnei-LPS und S. flexneri 2a-LPS.
  • 5.11 Elektronenmikrographie des Proteosom-Shigella-Impfstoffs
  • Die Assoziation von Shigella-LPS mit Proteosomen ist deutlich und dramatisch in der in der 4 gezeigten Elektronenmikrographie gezeigt. In dieser Figur sind die Proteosomvesikel mit strahlenundurchlässigen schwarzen Punkten übersät. Diese Punkte sind Goldkügelchen, die mit sekundären Antikörpern verbunden sind, die spezifische anti-Shigella-LPS-Antikörper erkennen. Folglich zeigt die Gegenwart von Goldpunkten die Gegenwart von Shigella-LPS. Da, wie es ersichtlich ist, die Goldpunkte die Proteosomvesikel umgeben und auf diesen punktartig angeordnet sind, wird dadurch die Natur der Proteosom-Impfstoffe mit dem mit den Proteosomen nicht-kovalent verbundenen LPS bestätigt und visualisiert. Überraschenderweise wurde die konsistente Vesikelnatur der mit der HF-Technologie der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoffe nicht gefunden, wenn die DT-Zubereitungen unter Verwendung der älteren Technologie mittels Elektronenmikroskopie untersucht wurden (unveröffentlichte Ergebnisse).
  • 5.12 Der Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff schützt gegen letale Shigella sonnei-Pneumonie in einem Shigellose-Tiermodell Wie es in der 5 ersichtlich ist, verleiht der Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff konsistent einen starken signifikanten Schutz gegen eine letale Infektion mit P. shigelloides, der in einem Shigellose-Tiermodell gemessen worden ist, bei dem die Tiere mit lebenden Organismen zur Induktion einer letalen Pneumonie gereizt werden. Diese Daten zeigen auch, dass von dem Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoff nicht nur die richtigen und schützenden Antikörper erzeugt werden, sondern dass dieser intranasale Untereinheiten-Impfstoff auch gegen eine letale Pneumonie schützen kann.
  • 5.13 Die intranasale oder orale Immunisierung mit Proteosom-Shigella flexneri 2a-LPS-Impfstoffen induziert anti-Shigella-LPS-IgG und -IgA im Serum und -IgA in Darm- und Lungenspülfluiden, die 30 bis 60 Tage nach der Immunisierung andauern können.
  • Wie es in der 6 gezeigt ist, induzieren zwei Immunisierungen mit Proteosom-Shigella flexneri 2a-LPS-Impfstoffen Antikörper in Seren und in Lungen- und Darmsekreten, die 30 bis 60 Tage nach der Immunisierung andauern können. Diese Daten zeigen, dass Proteosom-Impfstoffe das allgemeine Schleimhautimmunsystem dahingehend stimulieren können, dass spezifische Antikörper selbst an Stellen sekretieren, die weit von der Immunisierungsstelle entfernt sind. Insbesondere kann eine intranasale Immunisierung Antikörper in Darmsekreten induzieren und umgekehrt. Dieses Vermögen erweitert den potenziellen Nutzen der Proteosom-Impfstoffe gegen Pathogene, die durch die Schleimhautzugänge des Körpers in den Wirt eindringen.
  • 5.14 Die 7 zeigt die Induktion von anti-Shigella-LPS-IgA-, -IgG- und -IgM-ASC-Reaktionen in peripherem Blut, und IgA- und IgG-Antikörperreaktionen im Serum, Speichel und Harn nach einer intranasalen oder oralen Immunisierung von freiwilligen Testpersonen mit einer oder zwei Dosen an Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffen für Shigella sonnei unter Verwendung verschiedener Impfstoffmengen. Es ist gezeigt worden, dass eine intranasale Immunisierung Reaktionen in einer dosisabhängigen Weise hervorrief, wobei die höchste Dosis bei allen sechs Testpersonen Reaktionen hervorrief.
  • IgA-, IgG- und IgM-Serumreaktionen wurden in jeder der intranasalen Gruppen ausgelöst. Darüber hinaus wurden starke ASC-Reaktionen antikörpersekretierender Zellen induziert, was zeigt, dass die Schleimhautimmunisierung die Verbreitung antikörpersekretierender Zellen stimuliert, insbesondere von IgA-sekretierenden Zellen. Insbesondere wurden IgA-Reaktionen auch im Speichel und insbesondere in Urinproben gefunden, was zeigt, dass das sekretorische IgA an Schleimhautgrenzflächen erzeugt wird (da IgA nicht die Nieren passiert, gibt die IgA-Konzentration im Harn die lokale Sekretion der Antikörper wieder und legt nahe, dass solche intranasalen Impfstoffe auch lokal Darm-IgA erzeugen und dass intranasale Impfstoffe verwendet werden könnten, um gegen Harnwegsinfektionen zu schützen, die durch gramnegative Organismen verursacht werden). Es ist bemerkenswert, dass der Großteil dieser ASC- und Antikörper-Reaktionen nach nur einer Immunisierung gefunden wurden, was nahe legt, dass eine Auffrischungsimmunisierung nicht erforderlich sein könnte. IgA- und IgG-ASC's und Harn-IgA wurden auch nach einer oralen Immunisierung gefunden. Die effektivste Verwendung einer oralen Verabreichung könnte gegebenenfalls eine Auffrischungsimmunisierung nach einer nasalen Anfangsimmunisierung sein.
  • 5.15 Eine Demonstration einer nicht-kovalenten Komplexierung der multimolekularen Proteosomproteine und LPS ist in der 8 gezeigt. Der Graph zeigt LPS in HPLC-Fraktionen nach der Anwendung von unkomplexiertem P. shigelloides-LPS, das in einem anderen Teil des Säulenelutionsprofils auftritt, wie in dem Fall, bei dem der Proteosom-LPS-Impfstoff angewandt wird. Die gemeinsame Elution von LPS und Proteinen in HPLC-Fraktionen nach dem Anwenden des Proteosom-P. shigelloides-LPS-Impfstoffs ist durch Peaks gezeigt, die den größten Proteosomen-Proteinaggregaten entsprechen. Die Daten wurden unter Verwendung eines Hemmungs-ELISA, um die LPS zu quantifizieren, und unter Verwendung der OD280 gemessen, um die Proteosomproteine zu quantifizieren. Die HPLC-Säule war eine Tosohaas G50000Pwxl und die Molekulargewichtsstandards sind durch die Pfeile angegeben.

Claims (25)

  1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs, wobei das Verfahren (a) das Bilden eines Gemischs aus Proteosom, einem dialysierbaren Detergens und einer amphiphilen Determinante, (b) das Diafiltrieren oder Ultrafiltrieren des Gemischs zur Entfernung des Detergens, wodurch ein amphiphile Determinante-Proteosom-Komplex gebildet wird, (c) das Überwachen des Ausmaßes der Bildung des amphiphile Determinante-Proteosom-Komplexes, und (d) das Gewinnen des amphiphile Determinante-Proteosom-Komplexes umfasst, wobei die Nenn-Molekulargewichtsgrenze des Systems 3000 oder größer ist.
  2. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, bei dem die Ultrafiltration eine tangentiale Strömung umfasst.
  3. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, bei dem die Ultrafiltration in einem System durchgeführt wird, das aus einer Hohlfaserkartusche, einer Plattformmembran und einer Membrankartusche ausgewählt ist.
  4. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 3, bei dem das Ultrafiltrationssystem eine Hohlfaserkartusche mit einer Nenn-Molekulargewichtsgrenze-Porengröße von 10000 ist.
  5. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 3, bei dem das Ultrafiltrationssystem eine Hohlfaserkartusche mit einer Nenn-Molekulargewichtsgrenze-Porengröße von 3000 ist.
  6. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, das ferner das Überwachen des dialysierbaren Detergens durch kontinuierliches Messen von durchgedrungenen Proben umfasst.
  7. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, bei dem das Überwachen die Messung der optischen Dichte der durchgedrungenen oder der zurückgehaltenen Probe umfasst.
  8. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, bei dem das Überwachen die Messung des Ausmaßes der Detergensentfernung durch Mischen einer durchgedrungenen Probe mit einer bekannten SDS-Menge (Natriumdodecylsulfat-Menge), wobei ein Niederschlag gebildet wird, wenn Detergens vorhanden ist, und die Bestimmung der Menge des Niederschlags umfasst.
  9. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 8, bei dem der Proteosom-amphiphile Determinante-Komplex gewonnen wird, wenn das Detergens in der durchgedrungenen Flüssigkeit im Wesentlichen entfernt worden ist.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, bei dem das Detergens Empigen BB ist.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, bei dem die amphiphile Determinante ein Lipopolysaccharid ist.
  12. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-Lipopolysaccharid-Impfstoffs nach Anspruch 11, bei dem das Lipopolysaccharid von einem gramnegativen Bakterium erhalten worden ist.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-Lipopolysaccharid-Impfstoffs nach Anspruch 12, bei dem das gramnegative Bakterium ein Plesiomonas ist.
  14. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-Lipopolysaccharid-Impfstoffs nach Anspruch 13, bei dem das Plesiomonas Plesiomonas shigelloides ist.
  15. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-Lipopolysaccharid-Impfstoffs nach Anspruch 12, bei dem das gramnegative Bakterium ein Shigella ist.
  16. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-Lipopolysaccharid-Impfstoffs nach Anspruch 15, bei dem das Shigella Shigella flexneri, Shigella sonnei oder Shigella boydii ist.
  17. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-Lipopolysaccharid-Impfstoffs nach Anspruch 12, bei dem das gramnegative Bakterium ein Neisseria ist.
  18. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-Lipopolysaccharid-Impfstoffs nach Anspruch 17, bei dem das Neisseria Neisseria meningitidis ist.
  19. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, bei dem das Proteosom von N. meningitidis oder N. gonorrhea abgeleitet ist.
  20. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, bei dem die Gewinnung von Proteosom-amphiphile Determinante bewirkt wird, wenn die überwachte Geschwindigkeit der Detergensentfernung abnimmt oder konstant ist.
  21. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 1, das ferner (e) das Mischen des gewonnenen Proteosom-amphiphile Determinante-Komplexes mit einem physiologisch verträglichen Träger zur Bildung eines Impfstoffs umfasst.
  22. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 21, das ferner die Konzentrierung des Proteosom-amphiphile Determinante-Komplexes vor der Gewinnung des Komplexes umfasst.
  23. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 22, bei dem die Konzentrierung bis zu einer gewünschten Endkonzentration fortgesetzt wird.
  24. Verfahren zur Herstellung eines Proteosom-amphiphile Determinante-Impfstoffs nach Anspruch 21, wobei das Verfahren mit verschiedenen amphiphilen Determinantentypen zur Bildung einer Reihe von Proteosom-amphiphile Determinante-Komplexen, die im Schritt (e) zusammengesetzt werden, zur Bildung eines multivalenten Impfstoffs durchgeführt wird.
  25. Ein multivalenter Impfstoff, der mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24 hergestellt wird, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des Menschen- oder Tierkörpers zur Verhinderung einer Erkrankung.
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