CN1211192A - 生产非共价复合的多价蛋白体亚基疫苗的改进方法 - Google Patents

生产非共价复合的多价蛋白体亚基疫苗的改进方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1211192A
CN1211192A CN96197616A CN96197616A CN1211192A CN 1211192 A CN1211192 A CN 1211192A CN 96197616 A CN96197616 A CN 96197616A CN 96197616 A CN96197616 A CN 96197616A CN 1211192 A CN1211192 A CN 1211192A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vaccine
albuminous body
amphiphilic
albuminous
prepare
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN96197616A
Other languages
English (en)
Inventor
G·H·洛厄尔
W·D·佐林格
J·F·伍德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
US Army Medical Research and Materiel Command USAMRMC
Original Assignee
US Army Medical Research and Materiel Command USAMRMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21707938&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1211192(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by US Army Medical Research and Materiel Command USAMRMC filed Critical US Army Medical Research and Materiel Command USAMRMC
Publication of CN1211192A publication Critical patent/CN1211192A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/008—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1275—Lipoproteins; Chylomicrons; Artificial HDL, LDL, VLDL, protein-free species thereof; Precursors thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用渗滤或超滤技术制备适用于非肠胃或粘膜给药的多价蛋白体－两亲决定基疫苗的方法,这样的两亲决定基包括来自革兰氏阴性菌,例如弗莱克斯纳氏志贺氏菌、类志贺邻单胞菌和宋内氏志贺氏菌的脂多糖。其中的蛋白体来自B族2b型脑膜炎球菌。利用去除除垢剂的渗滤或超滤来形成疫苗中的活性蛋白体－两亲决定基复合体(非共价复合体)。使用渗滤或超滤技术减少了处理时间和污染的可能性,进而允许使用环境温度和进行有效的规模放大。此外,该方法能够对透析液进行可靠而连续的监测,由此提高了整个过程的效率。生产一批疫苗的透析时间由7至10天以上减少至72小时以下,通常在48或24小时以内。使用该方法使得各种抗原性组分以最优的形式存在于多价疫苗制剂中。

Description

生产非共价复合的 多价蛋白体亚基疫苗的改进方法
发明领域
本发明涉及用于粘膜和非肠胃给药的，非共价复合的多价蛋白体疫苗的生产方法及其组合物。
发明背景
为了使多价亚基疫苗能够激发针对每个组成部分的最佳免疫应答，相应的组成部分必须适当结合并使每一个都能与免疫系统接触，从而使得它们能够被免疫系统中的细胞有效地识别和加工。早先的这类非共价复合疫苗的实例包括蛋白体疫苗，它们由奈瑟氏菌属外膜蛋白体非共价地与多种抗原复合而成，抗原包括肽、脂肽、跨膜或类毒素蛋白、多糖或脂多糖(LPS)(1987年7月23日的专利申请07/065,440，“免疫原性肽疫苗及其制备方法”(“Immunogenic peptide vaccinesand methods of preparation”)；1989年4月12日的专利申请07/336,952，“用于大蛋白质和多肽的免疫增强系统”(Immunopotentiaing system for large protiansand polypeptides”)；1992年10月8日申请的07-958,426，“利用了包含蛋白体和脂多糖的疏水性复合物的口用或鼻用疫苗”(Oral or Intranasal Vaccines UsingHydrophobic Complexes Having Proteosomes and Lipopolysaccharides)；1993年3月11日申请的08/029,666，“用于制备免疫原性物质的免疫增强系统”(Immunopotentiaing system for Preparation ofImmunogenic Materials)；1993年10月29日申请的08/143,365，“用于制备免疫原性物质的免疫增强系统”(Immunopotentiaing system for Preparation of Immunogenic Materials)；1993年10月29日申请的93/10,402，“亚微米乳剂用于疫苗佐剂”(Submicron Emulsions asVaccine Adjuvants”)；1994年5月18日申请的08/063,613，“固体脂肪纳米乳液用作疫苗传递的载体”(Solid Fat Nanoemulsions as Vehicles for Vaccine Delivery)和出版物，Orr,N.,Robin,G.,Cohen,D.,Arnon,R.和Lowell,G.H.(1993).“口用或鼻用弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a和宋内志贺氏菌蛋白体-脂多糖疫苗在动物模型中的免疫原性和效力”(Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigellaflexneri 2a and Shigella sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in AnimalModels)。《传染与免疫》(Infect.Immun.)61:2390；Mallett,C.P.,T.L.Hale,R.Kaminski,T.Larsen,N.Orr.,D.Chohen，和G.H.Lowell.1995.“在患志贺氏菌病的鼠模型中用蛋白体-志贺氏菌脂多糖疫苗经鼻腔或肠胃道免疫来抵抗致死性肺炎”(Intranasal or intragastric immunization with proteosome-Shigellalipopolysaccharide vaccines protect against lethal pneumonia in a murine model ofshigellosis)《传染与免疫》(Infect.Immun.)63:2382-2386；Lowell GH,KaminskiRW,Grate S等(1996)“鼻内和肌内蛋白体-葡萄球菌肠毒素B(SEB)类毒素免疫：在小鼠体内的抗致死性SEB中毒的免疫原性和效力(Intranasal and intramuscularproteosome-staphylococcal enterotoxin B(SEB)toxoid vaccines:immunogenicity andefficacy against lethal SEB intoxication in mice)《传染与免疫》(Infect.Immun.)64:1706-1713；Lowell,G.H.(1990)“用于肽和蛋白质疫苗的改良制备方法的蛋白体、疏水性锚结构、Iscoms和脂质体”(Proteosomes,HydrophobicAnchors,Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide and ProteinVaccines)《新一代疫苗》(New Generation Vaccines):G.C.Woodrow和M.M.Levine编，(Marcel Dekker,NY)第12章(pp.141-160)和Lowell,G.H.,W.R.Ballou,L.F.Smith,R.A.Wirtz,W.D.Zollinger和W.T.Hockmeyer.1988.“蛋白体-脂肽疫苗：对疟疾CS肽免疫原性的加强”(Proteosome-lipopeptide vaccine:enhancement ofimmunogenicity for malaria CS peptides)《科学》(Science)240:800)。
本文全面引用参考了以上文献。
为了在实践中将疫苗用于抵抗疾病，经常因为个体易于受多种生物引起的疾病感染而需要同时使用多种这样的抗原。而且，这多种生物无论它们是否彼此相关通常具有地域流行性，所以，需要保护的个体就可能需要多种疫苗。
至今，利用简单的透析已经生产出了需要将组成部分非共价复合的疫苗，在该方法中，组成部分与可透析性除垢剂被置于透析管中，混合物透析7至10天以去除除垢剂。由于以下原因，该系统实际存在的缺点使得该技术不能进一步发展和工业化：1)时间：过程的时间长：由于过高的成本和因时间长而增加了机械或生物组成部分降解或污染的可能性，在透析疫苗时需要连续数周的使用GMP原料很不实际；2)污染：污染机会增加：透析管很难灭菌，透析管需要手工开启和关闭系统，因而会在加料和放料时使组分受到污染。由于在加料和放料之间有许多天的时间，所以，在过程前几天的可能有的少量污染会在透析的许多天内放大，使得该方法无法生产出疫苗。透析袋穿孔的危险性会导致产品流失。3)温度：由于时间很长，透析必须在4℃进行；4)透析液的体积：为了制备出用于将过程放大的疫苗，必须使用大量的透析液，因为通常需要透析管外的液体与管内液体之比为200∶1。所以，例如少量生产2升的疫苗需要每天400升的管外液体-每10天4,000升-而生产20至200升就需要40,000至4,000,000升。与本发明的方法相比，这样的用量十分浪费和不实际；由于大量生产成问题，所以透析管不能放大；5)不能方便地监测除垢剂是否完全去除，因而不能达到最大疫苗效率。由于透析袋被放在有200体积缓冲液的容器中，测定除垢剂的去除不仅是不实际的而且是不可行的；6)此外，至今还没有方法测定在优选实施例中使用的除垢剂Empigen BB的存在。
本发明解决的第二个问题是证明该方法能够生产和传递多价疫苗。组成部分可以被制造在一起，也可以单独产生然后在给药前混合在一起。本发明展示了制备此类疫苗的最佳途径。
发明概述
本发明的主题广义地说涉及蛋白体-两亲决定基疫苗的生产和制造，这些疫苗被设计成经非肠胃道使用或特别用于粘膜给药来诱导系统性(血清)和粘膜(包括呼吸道和肠道)抗体应答，给药途径包括但不限于呼吸道(例如鼻内、咽内和肺内)、胃肠道(例如口腔或直肠)或局部使用(例如结膜或眼内)。两亲决定基是具有疏水性和亲水性区域的分子，将它适当地与蛋白体配制在一起时，它会与蛋白体成一直线而形成一种复合体，该复合体能够在接受体中激发免疫应答。典型的两亲决定基包括糖脂，脂糖(包括脱毒脂多糖)，脂肽，跨膜、包被或类毒素蛋白质，或者具有固有疏水性氨基酸锚结构的蛋白质或肽。可以由革兰氏阴性菌获取这类决定基，其中包括埃希氏杆菌、克雷伯氏杆菌、假单胞菌、嗜血杆菌(hemphilusbrucella)、和奈瑟氏菌。更具体地说，本发明涉及如下蛋白体疫苗，在该疫苗中，脑膜炎球菌外膜蛋白蛋白体制剂(由脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏菌或其它奈瑟氏菌种的任何菌株来制备)与天然或脱毒的志贺氏菌或奈瑟氏菌脂多糖或脂寡糖非共价复合成疫苗，该疫苗被设计成抵抗包含该复合体任一组成部分的革兰氏阴性菌引起的疾病，其中包括由脑膜炎球和奈瑟氏菌引起的。更具体地说，本发明涉及包含LPS的蛋白体疫苗，LPS诱导抗体应答，识别志贺氏菌脂多糖的类型特异性体细胞多糖O抗原，由此提供对志贺氏菌病的同源性保护。更具体地说，与蛋白体复合后诱导抗志贺氏菌保护性免疫应答的脂多糖从宋内氏志贺氏菌或类志贺邻单胞菌制备并纯化以得到抗宋内氏志贺氏菌病的免疫性，从弗莱克斯纳志贺氏菌2a制得以得到抗弗莱克斯纳志贺氏菌2a病的免疫性，并依此类推，使用来自同源或抗原交叉反应性生物的LPS提供对由弗莱克斯纳志贺氏菌2a(或3a)、鲍伊德氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌等引起的志贺氏菌病的同源免疫性。更具体地说，本发明描述了多价蛋白体-志贺氏菌疫苗的成功给药，即分别使用来自弗莱克斯纳志贺氏菌2a(用于弗莱克斯纳志贺氏菌2a病)和类志贺邻单胞菌或宋内氏志贺氏菌(用于宋内氏志贺氏菌病)的LPS制备的两种蛋白体疫苗一起给药，由此诱导产生识别两种微生物的抗体，继而提供对这两种疾病的保护。最具体地说，本发明涉及如下蛋白体-志贺氏菌LPS疫苗，其中使用中空纤维渗滤技术将来自B族2b型脑膜炎球菌的蛋白体与类志贺邻单胞菌的LPS复合，形成经呼吸道粘膜和/或胃肠道给药的疫苗，以诱导识别宋内氏志贺氏菌的体细胞O抗原LPS的抗体，由此抵抗由该微生物引起的志贺氏菌病。可以使用其它常规超滤/渗滤法，例如平面式滤膜或滤膜滤柱。
本发明提供了一种生产非共价复合疫苗的方法：1)减少了所需的时间，2)减少了污染可能性，3)将生产此类疫苗的温度提高至常温，4)能够有效地将该生产过程放大，从而只需要少量的反应剂，5)能够安全而有效的取样透析液，从而能够重复测定除垢剂的去除速度，由此使得操作的效率最优化。这直接提高了疫苗的复合效率，从而提供在低剂量时具有可测得的较高免疫原性的疫苗。在该方法中，产品的总体质量显著提高。6)此外，本发明描述了一种测定优选实施例中使用的除垢剂Empigen BB的存在的方法。可以用其它可透析除垢剂来代替Empigen BB。此外，使用本发明的方法还被证明能够将疫苗以一定的方式冷冻干燥然后重新水合，该方式保留了据疫苗免疫原性测定的疫苗最佳效力。
本发明方法使用中空纤维超滤/或渗滤柱来去除除垢剂以进行复合。通过改变滤柱的容积，生产一批疫苗的透析时间可从7至10天以上减少至72小时以下，通常在48或24小时以下。由于使用的时间很短，反应温度可以由4℃提高至常温，但不损害生产过程或产品的品质。虽然生产过程在约20℃进行，但也可考虑0℃至40℃。由于系统是封闭的，所以大大减少了污染的可能性。此外，通过加大容积可以在较短的时间内处理大量的物质，从而能够有效和可重复地将该方法放大以进行工业化发展。而且，使用本发明的方法测定优选实施例中使用的除垢剂Empigen BB可以对透过液重复取样来测定除垢剂是否被去除。本方法的独特性需要实验验证，因为，使用待复合组成部分在其中以较之静态透析管快得多的速度通过透析管的中空纤维技术相当于或改进了利用静态透析袋缓慢透析7至10天而完成的将疫苗结构复合成免疫原性物质，这并不是显而易见的。
因为根据待非共价复合的组成部分的大小，所用滤膜的公称分子量截留值可选自1,000,3,000,5,000,10,000,30,000,50,000或更大，该系统可以方便地改用于将天然或脱毒的脂多糖、脂质体、肽、脂肽、脂糖、多糖、神经节苷脂或跨膜、包被或天然或脱毒蛋白质相互复合或与脑膜炎球菌外膜蛋白的蛋白体制剂复合。
生成的产品可以用作非肠胃道给药或粘膜给药的疫苗，即通过呼吸道或胃肠道，例如鼻腔、口腔，通过咽吸入、局部或直肠给药。在所给的实施例中，蛋白体被证明与类志贺邻单胞菌LPS非共价复合形成疫苗，该疫苗诱导对抵抗宋内氏志贺氏菌病所必需的抗送内氏志贺氏菌LPS应答。
该方法分三阶段：预备操作；将蛋白体与两亲决定基例如类志贺邻单胞菌LPS复合；然后进行无菌过滤。
为了最好地传递多价疫苗，本发明证明最好的方法是单独制备特定的疫苗，然后在同一天用两种单独制备的疫苗各自以其最佳浓度进行免疫。也实践或预见了其它可能性，例如在形成非共价复合体的过程中制备杂合体疫苗。
附图说明
图1：用蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗进行的鼻内免疫：剂量递减的几种制剂引发的血清IgG应答。
图2：用蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗进行的鼻内免疫：剂量递减的几种制剂引发的血清IgA应答。
图3：蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS(抗宋内氏志贺氏菌病)和蛋白体-弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a疫苗在同一天一起给药或分开数周给药产生了对宋内氏志贺氏菌和弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a两者的良好免疫原性。
图4：蛋白体-志贺氏菌LPS疫苗的免疫金标记电子显微照片显示志贺氏菌LPS与蛋白体载体的结合。
图5：蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗在志贺氏菌病动物模型中抵抗致死性宋内氏志贺氏菌性肺炎。
图6：用蛋白体-弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a LPS疫苗经鼻腔或口腔免疫诱导产生了血清中的抗志贺氏菌LPS IgG和IgA，和在肠洗液和肺洗液中的IgA，它们可在免疫后持续30至60天。
图7：用一剂或两剂抗宋内氏志贺氏菌的蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗，使用不同的疫苗量对人进行鼻腔或口腔免疫：诱导了抗志贺氏菌LPS IgA、IgG和IgM外周血ASC应答，和血清、唾液和尿液抗体应答。
图8：以非复合类志贺邻单胞菌LPS上样后HPLC流份中的LPS，以及通过上样蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗后LPS与蛋白质在HPLC流份中的共洗脱证明LPS与蛋白体蛋白质的非共价复合。
图9：小鼠对脑膜炎球菌外膜蛋白-脱毒脂寡糖疫苗的杀菌抗体应答，抗脑膜炎球菌株9162的几何平均对数效价。
详细说明
                 实施例1
该实施例详细说明了蛋白体-类志贺邻单胞菌疫苗的生成方法，其中包含约2至3克蛋白质。通过适当放大滤膜柱的容积和适当增加处理量，该方法可相应放大至使用多10至100倍的物质量。通过使用具有截留待复合抗原的适当分子量截留值的适当大小的滤膜，本方法可以相应地适用于将蛋白体与其它天然或脱毒脂多糖、脂质体、肽、脂肽、脂糖、多糖、神经节苷脂或跨膜、包被或天然或脱毒蛋白质相互复合或与脑膜炎球菌外膜蛋白的蛋白体制剂复合。本方法使用的除垢剂之一为Empigen BB；该方法也可使用能够溶解组成部分任何可透析除垢剂。该方法使用A/G Technology的滤柱，但也可使用任何其它品牌的柱式超滤/渗滤系统。
5.0.0.1预备操作
5.0.0.1无菌过滤本方法中使用的30％Empigen BB除垢剂储备液
5.0.0.2制备2X TEEN/2％Empigen(0.1M Tris,0.02M EDTA二钠，0.3M氯化钠，WFI和2％Empigen,pH8.0)
5.0.0.3为了透析去除除垢剂，制备150升(L)TNS溶液(Tris Normal Saline)，其中含有0.05M Tris,0.15M氯化钠，pH8.0。
5.0.0.4制备用于UF滤柱清洗的10L氢氧化钠。
5.0.0.5解冻所需量的类志贺邻单胞菌2a脂多糖(LPS)。
5.0.1蛋白体与弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a LPS复合
5.0.1.6在LPS中加入等体积的2X TEEN缓冲液，充分混合。
5.0.1.7解冻和称量蛋白体总量，以毫克(mg)为单位，使之等于在步骤5中解冻的LPS量)。
5.0.1.8在每升蛋白体中加入30毫升经无菌过滤的Empigen。充分混合并与步骤5中制备的LPS混合。
5.0.1.9将两种组分充分混合。通常，在搅拌板和搅拌棒上15分钟即可。
5.0.1.10为了透析去除除垢剂以形成蛋白体复合体，用公称分子量截留孔径为10,000的A/G Technology,Inc.制造的中空纤维滤柱与无菌二氧化硅管和一蠕动泵连接，构建成一超滤系统(根据切向流技术)。无菌压力表被置于滤柱的进料和出料侧以监测运行过程中的压力。在滤柱的出料侧安置一背压阀以调节背压。
5.0.1.11清洗超滤系统并用WFF和0.5N NaOH在50℃灭菌60分钟以上。该系统用WFI冲洗，在使用前用TNS缓冲液平衡。
5.0.1.12在线安置一无菌储器，流入液从该储器中抽入，返回的截留物返还到同一储器中。随着液体流经柱状滤膜(渗透或过滤)，通过直接添加和连续补料系统用TNS缓冲液将储器重新充满。将二氧化硅管与装有TNS缓冲液的储器和样品储器连通，然后密封，建立一连续进料系统。随着液体因过滤而流出样品储器，产生的真空将TNS缓冲液从其储器中吸入样品储器。如果该系统保持气密性，储器中的样品液位将保持恒定。
5.0.1.13启动循环泵以开始渗滤。调节泵速和背压阀，使得背压为15±4psi。
5.0.1.14每流过10至15升取样渗透液，利用Empigen沉淀素测试法进行测试，由此证实Empigen BB的逐步去除。该测试包括连续稀释渗透液和标准溶液，标准溶液中包含已知量的Empigen BB，在溶液中加入HCl进行酸化，然后加入连续稀释的SDS(十二烷基硫酸钠)形成测试板型测试。当Empigen与SDS等量时沉淀量最大。如此，记录形成最大沉淀的SDS、渗透液和标准物的稀释度就可确定Empigen的含量。随着渗滤的进行，Empigen含量越来越少，含有较少SDS的试管将成为沉淀最多的试管。沉淀可以通过用分光光度计在600纳米处测定OD值来定量。
5.0.1.15对于本实施例中的组分用量，需连续渗滤至至少120升渗透液接受了处理，并且在Empigen沉淀素测试法中没有明显的沉淀(600纳米处的最大OD值小于0.05)。
5.0.1.16渗滤之后需将产品成份浓缩至最终体积，使得OD280接近6.0。将系统排空，并用300至400毫升“TNS”缓冲液洗涤。将系统再次放空，将两次的排放液合并。先用大量的WFI然后用0.5N NaOH在50℃再循环60分钟以上，如此清洗滤柱。用WFI冲洗去NaOH，将该系统保存在0.01N NaOH中。
5.0.2无菌过滤
5.0.2.17根据需要可以对复合体进行无菌过滤。蛋白体浓度的调节可以在0.22微米的过滤之前或之后进行。无菌过滤通常使用Millipore Corp.的过滤单元进行。这类单元称为Millipaks，它们具有不同的大小。在包装操作之前将滤过液保存在4℃，并进行无菌测试。
5.0.3.0特殊目的：通过去除除垢剂将脑膜炎球菌外膜蛋白蛋白体的GMP制剂与弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a脂多糖组合成非共价复合体。
5.0.3.1应用：该GMP过程产生了大量蛋白体与弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a脂多糖的非共价复合体，可用作抗弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a感染的疫苗。
实施例2
脑膜炎奈瑟氏球菌9162菌株的纯化外膜蛋白(蛋白体)与碱脱毒的纯化自8532菌株的脑膜炎奈瑟氏球菌L8脂寡糖的非共价复合。
5.1.0取出保存的批号为0136的9162外膜蛋白(蛋白体)与批号为0203的脱毒脑膜炎球菌L8脂寡糖(LOS)在室温下解冻。将500毫克LOS溶解在无菌蒸馏水中形成的一定体积(182ml)的LOS液与400毫克蛋白质溶解在0.05M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.01M EDTA和0.1％Empigen BB中形成的一定体积的蛋白体溶液(306ml)混合。
5.1.2Empigen BB(30％溶液)经0.22微米孔径的滤膜进行无菌过滤，在混合后的蛋白体和LOS溶液中加入六十分之一体积的该溶液，在室温下搅拌1小时。
5.1.3使用A/G Technology分子量截留孔径为3000的超滤柱UFP-3-C-6进行超滤，由此去出蛋白体和LOS溶液中的除垢剂缓冲液，代之以无菌蒸馏水。
5.1.4装置的搭建、灭菌、洗涤与实施例1中所述的相同。进料压力为15±4psi，渗透液的流速为每分钟175毫升。
5.1.5每流过3至4升，用实施例1中所述的沉淀方法测试一次渗透液中的Empigen BB。超滤进行至试验中无沉淀生成后再流过5升。收集总共37升渗透液。
5.1.6截留物是澄清的，经0.22微米孔径的滤膜无菌过滤并对蛋白质和LOS进行测试后，作为产物保存在4℃。
5.1.7将产物稀释至每毫升0.2毫克蛋白质，将NaCl浓度调节至0.15M。加入0.01％的Thimerasol作为防腐剂，形成的溶液在无菌条件下分装到最终的小玻璃瓶中，贴上标签，保存于-70℃。
5.1.8以生理盐水溶液和吸附在作为佐剂的氢氧化铝上的形式给药，在小鼠中测试该产品的免疫原性。结果如表1所示，表1中结果显示，在通过腹膜内注射对小鼠给药时，疫苗复合体是免疫原性的。
表1．鼠对脑膜炎球菌外膜蛋白-脱毒脂寡糖疫苗的杀菌抗体应答，抗脑膜炎球菌9162菌株的几何平均对数效价
    疫苗 剂量    佐剂 第0天 第28天   第42天
蛋白体-dLOS批号0271蛋白体-dLOS批号0271 1微克3微克10微克1微克3微克10微克     无无无Al(OH)3Al(OH)3Al(OH)3     ＜8＜8＜8＜8＜8＜8     ＜8＜8＜8＜8＜864     161285125125122048
注：在第0天和第28天对每组十个放养CD-1小鼠经腹膜内注射给药。
5.1.9通过在复合前和复合后对蛋白体和LOS组分进行柱色谱来检验蛋白体与LOS的复合(图9)。在Sephacryl S300低压柱上对脑膜炎球菌L8 LOS和最终的蛋白体/LOS复合体进行色谱分析。在0.05M Tris-HCl、0.01M EDTA、0.15MNaCl缓冲液中进行柱色谱。对蛋白质的分析为测定280纳米处的吸光度，对LOS的分析是通过其对ELISA(酶联免疫吸附测定法)的抑制，该方法中，L8单克隆抗体与吸附在塑料测试板上纯化的L8 LOS的结合被来自Sephacryl柱的流份的连续稀释液所抑制。在复合前LOS集中在流份39以宽峰从柱上洗出。复合后，LOS以集中在约流份33的峰与蛋白体共洗脱。
5.1.10特殊目的：通过去除除垢剂将脑膜炎球菌外膜蛋白蛋白体的GMP制剂与脱毒脑膜炎球菌脂寡糖组合成非共价复合体。
5.1.11应用：该GMP过程产生了大量蛋白体与脱毒脑膜炎球菌脂寡糖的非共价复合体，可用作抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的疫苗。
                        实施例3
本实施例又涉及蛋白体-类志贺邻单胞菌疫苗的生产。该方法也可通过放大薄膜滤柱的容积和适当增加处理量相应地放大至使用10至1000倍物料。
5.8.1制备25毫升经无菌过滤的Empigen BB(30％溶液)
5.8.1.1用100毫升的、滤膜孔径为0.2微米的Nalgene一次性过滤单元过滤约25毫升经无菌过滤的Empigen BB(30％溶液)。
5.8.2制备4升含2％Empigen BB的TEEN 2X(包含0.1M Tris,0.02M EDTA二钠，0.3M氯化钠，WFI和2％Empigen BB溶液)。
5.8.3制备10升“TNS”溶液共15次，总体积达150升：TNS包含0.15M氯化钠，0.05M Tris缓冲液pH8.0±0.2。
5.8.4制备10升0.5N的氢氧化钠。
5.8.6如果必要，解冻类志贺邻单胞菌脂多糖(LPS)以备与蛋白体复合，记录批号、LPS浓度、以毫克为单位的LPS的需用量和取出的LPS的计算体积。
5.9.0将蛋白体与类志贺邻单胞菌脂多糖LPS复合
5.9.1制备用于复合的LPS
5.9.1.2将LPS等份汇集在洁净、无菌、有刻度的5升瓶中。测定总体积，确定LPS的总量。
5.9.1.3与实施例5.9.1.2.中使用的LPS体积相同的2X TEEN缓冲液，测定合并后的总体积，然后加入一搅拌棒，用配套的搅拌棒和搅拌板搅拌15±2分钟。
5.9.2制备用于复合的蛋白体
5.9.2.1视需要记录蛋白体自然解冻的总时间
5.9.2.2将蛋白体等份汇集在洁净、无菌的1升量筒中。测定总体积并确定蛋白体总量。
5.9.2.3将一定体积的蛋白体，其中以毫克计的含量与步骤5.9.1.2.中所用的相等，从步骤5.9.2.2.的量筒中转移到另一洁净、无菌、1升量筒中。
5.9.2.4在含有蛋白体的量筒中按每升蛋白体30毫升的量加入经0.22微米过滤的30％Empigen BB。用搅拌棒混合15±2分钟。
5.9.3蛋白体与类志贺邻单胞菌LPS的复合
5.9.3.1在缓慢搅拌的同时，将步骤5.9.3.2制备的蛋白体加入含有LPS的5升瓶中，然后搅拌15±2分钟。
5.9.3.3取出1毫升样品保存在-75℃，用于在以后利用Lowry法测定蛋白质浓度和利用KDO测试测定LPS浓度。
5.9.4通过超滤/渗滤去出除垢剂
5.9.4.1超滤系统的具体系统设置：A/G Technology,Inc.中空纤维滤柱，10,000NMWC孔径，容纳体积为6，超滤柱。
注：必需对新的滤柱进行调试，冲洗去甘油。这可以通过在无背压条件下用6升WFI冲洗6sq/ft或以下滤柱来进行。不要将渗透液循环到进料储器中。
注：各步超滤后都必需进行清洗、灭菌和保存。新的滤柱必需在使用前进行清洗和灭菌。
5.9.4.2搭建和灭菌A/G超滤系统。清洗和灭菌是通过用2-3升0.5N氢氧化钠在50±5℃再循环至少60分钟。用4至5升WFI冲洗系统，然后用2至3升TNS(0.05M Tris/普通生理盐水，pH8.0±0.2)冲洗至少20±5分钟。
5.9.4.3测定UF系统(包括试管)中的滞留体积，将充满了液体的进料管和出料管由储器转移到1升量筒中，然后将UF系统抽空。
5.9.4.4将一个侧面有把手的2升容器放在洗槽中，在超滤过程中用微融的冰包裹。
5.9.4.5将1.7-1.9升步骤5.9.3.3.制备的蛋白体-LPS混合物转移到该2升容器中。在容器上盖上配有两个10毫升滴管的两孔塞，将超滤系统的进料管和出料管与容器的滴管接通。
5.9.4.6开启循环泵，将泵的设定开关调节至4-6。调节背压夹，使进料压力为15±4psi。将总体积浓缩至1.0±0.1升，包括滞留体积。
5.9.4.7将1±0.1升步骤5.9.3.3.制备的混合物转移到一个2升带把手的容器中，重复步骤5.9.4.6。
5.9.4.8继续步骤5.9.4.7中的转移和步骤5.9.4.9中的浓缩，直至全部步骤5.9.3.3制备的蛋白体-LPS混合物被转移到2升带把手的容器中，而且包括滞留体积在内的滞留物体积为1.4±0.2升。
5.9.4.10搭建超滤装置，用于在液体透过滤膜流出时向2升带把手的容器中连续补加TNS(0.05M Tris，一般生理盐水)。用一10升瓶搭建一储器，其中含有TNS，并配有一延伸至瓶底的管子。将超滤系统的进料管和出料管接通。开启循环泵，将泵的设定开关调节至4-6。调节背压夹，使进料压力为15±4psi。
5.9.4.11测定UF单元的渗透液流速，并记录测定时的进料压力。
5.9.4.12每处理12±0.5升收集15至20毫升渗透液样品，贴上内定标签(“渗透液No.P1、P2、P3之类”)并记录时间、处理体积和样品的最大OD600。利用Empigen BB沉淀素测试检测样品中的Empigen BB，由此验证Empigen被逐步去除。该测试包括分别连续稀释渗透液和标准溶液，标准溶液中包含已知量的Empigen BB，在溶液中加入HCl进行酸化，然后加入连续稀释的SDS(十二烷基硫酸钠)形成测试板型测试。当Empigen与SDS等量时沉淀量最大。如此，记录形成最大沉淀的SDS、渗透液的稀释度并与标准物的稀释度进行比较就可确定Empigen的含量。随着渗滤的进行，Empigen含量越来越少，含有较少SDS的试管将成为沉淀最多的试管。沉淀可以通过用分光光度计在600纳米处测定OD值来定量。
对于本实施例用的组分用量，连续超滤直至处理至少120升渗透液，并且在Empigen沉淀素测试中没有明显的沉淀(600纳米处的最大OD值低于0.05)。
5.9.4.13将产物浓缩至500±50毫升的最终滞留物体积，其中包括滞留体积(步骤9.4.3)。取出0.5ml样品，按1∶10稀释样品，测定OD280。
5.9.4.14浓缩滞留物的要求最小OD是5.7。如果OD低于5.7，继续浓缩至400±50毫升，其中包括滞留体积(步骤5.9.4.3)，并再次测定OD280。
5.9.4.15当滞留物从滞留物溶液中滤出并关闭出料管后，缓慢地逆向抽吸，直至滤柱和管路变空。将送料管和滞留物管从滞留物瓶转移到一新的洁净的容器中，其中含有350±50毫升TNS。反转泵方向并缓慢地再循环TNS 2-3分钟。
5.9.4.16 TNS再循环后，停泵，放空系统，将滞留物洗液收集在一洁净、无菌的1升量筒中，测定体积和OD280。
5.9.4.17将原先的滞留物溶液(步骤5.9.4.12或5.9.4.13)与滞留物洗液(步骤5.9.4.15)合并，测定滞留物的最终体积。在无菌过滤前，一直将滞留物保存在4℃±2℃。
5.9.4.18用WFI，然后用0.5N氢氧化钠在50±5℃的起始温度清洗过滤单元至少60分钟。用WFI冲净清洗液，然后用3至4升作为保存剂的0.1NNaOH冲洗。
5.9.5无菌过滤
根据需要，可以对复合体继续无菌过滤。获取蛋白体和LPS复合体产物并检查是否有任何沉淀或浑浊。如果批量复合体产品是澄清的，用Millipak 40,0.22微米过滤单元将其过滤到一无菌、无热源容器中。该步骤需在无菌橱中进行。
5.9.6特殊目的：通过去除除垢剂将脑膜炎球菌外膜蛋白蛋白体的GMP制剂与类志贺邻单胞菌脂多糖组合成非共价复合体。
5.9.7应用：该GMP过程产生了大量蛋白体与类志贺邻单胞菌2a脂多糖的非共价复合体，可用作抗宋内氏志贺氏菌感染的疫苗。
5.10免疫原性研究
5.10.1用中空纤维超滤/渗滤制备的蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗的免疫原性
在测试所用的最低极限剂量，利用中空纤维(HF)超滤技术去除除垢剂并促进复合制备而成的三种不同的志贺氏菌LPS疫苗(HF-1、HF-2和GMP/HF-3)比简单的透析法制得的制剂(DT)更有效。换言之，与利用低效已有技术制备的疫苗相比，本发明方法制备的疫苗所激发的IgG(图1)和IgA(图2)免疫应答更强。因为更强的免疫应答将产生更好的保护作用，所以以上数据清楚地表明，本发明提供了不仅生产效率更高而且效力更强的疫苗。而且，较强的免疫应答是在最低剂量给药(每剂0.1微克)时激发的，由此表明，与已有技术相比，使用本发明所需的疫苗较少。由于在制备多价疫苗时需要多种不同的抗原，所以为了尽可能减少疫苗的给药总量，使用在低剂量时有效的疫苗组成成份具有极大的优越性。所以，本发明利用中空纤维技术生产疫苗的方法直接提高了配制具有广谱特异性的多价疫苗的能力。因为为了工业化地开发疫苗，最好能够将疫苗冷冻干燥，我们欣喜地发现，从水溶液中冷冻干燥HF疫苗生成的疫苗仍然能够激发属于所有被测剂量中最高水平的应答。所以，在使用0.1微克HF技术制备的疫苗(进行或不进行冷冻干燥)给药时，可观测到较强的抗LPS IgG(图1)和IgA(图2)免疫原性。以上数据十分重要，因为在图1和图2中用交差线立柱GMP/HF-3表示的本发明方法的放大和GMP过程使用了该HF技术。
5.10.2使用多价疫苗的免疫原性研究
如图3所示，在同一天或相隔数周给药蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS(抗宋内氏志贺氏菌病)疫苗和蛋白体-弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a疫苗均产生了对以上两种LPS组分，即宋内氏志贺氏菌LPS和弗莱克斯纳氏志贺氏菌2aLPS的良好的免疫原性。
5.11蛋白体-志贺氏菌疫苗的电子显微照片
图4的电子显微照片清楚地显示了志贺氏菌LPS与蛋白体的结合。图中，蛋白体载体为突出的不透射线的黑色斑点。这些斑点是与第二抗体连接的金颗粒，这些抗体识别特异性的抗志贺氏菌LPS抗体。所以，金颗粒斑点的存在表明有志贺氏菌LPS存在。可以看出，金颗粒斑点包围并标记了蛋白体载体，所以可以由此证实并看到由LPS与蛋白体非共价连接而成的蛋白体疫苗的图象。出人意料的是，在利用电子显微技术对用已有技术制备的DT制剂进行检测时，没有发现利用本发明HF技术制得的疫苗都有的泡性特征(非公开结果)。
5.12蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗在志贺氏菌病动物模型中保护动物抵抗致死性宋内氏志贺氏菌性肺炎。
从图5中可以看出，根据用活菌诱导致死性肺炎的志贺氏菌病动物模型中的测定结果，蛋白体-类志贺菌邻单胞菌LPS疫苗都为动物提供了极显著的抗致死性类志贺菌邻单胞菌感染保护。以上数据还证明，不仅是因蛋白体-类志贺菌邻单胞菌LPS疫苗而产生的相应保护性抗体，而且该鼻内使用的亚基疫苗也能够抵抗致死性肺炎。
5.13用蛋白体-弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a LPS疫苗经鼻腔或口腔免疫诱导血清中的抗志贺氏菌LPS IgG和IgA和肠及肺洗液中的IgA，它们均可在免疫后保持30至60天。
如图6所示，用蛋白体-弗莱克斯纳氏志贺氏菌2a LPS疫苗进行的两种免疫在血清和肺及肠分泌液中诱导的抗体均可在免疫后保持30至60天。以上数据表明，蛋白体疫苗可以刺激一般粘膜免疫系统产生特异性抗体，甚至是在远离免疫位点的地方。具体地说，鼻腔免疫可以诱导产生肠分泌液中的抗体，反过来也一样。这一能力将蛋白体疫苗的潜在用途推广到可用于抵抗病原体通过全身各种粘膜通道侵染宿主。
5.14图7显示，用不同的疫苗量，以抗宋内氏志贺氏菌的蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗对人志愿者进行1次或2次鼻腔或口腔免疫后诱导了抗志贺氏菌LPS IgA、IgG和IgM外周血ASC应答和血清、唾液及尿液中的IgA和IgG抗体应答。如图所示，最高剂量在全部6个志愿者中都激发了应答，即鼻腔免疫激发剂量依赖性应答。
疫苗在鼻腔组的每个志愿者中都激发了IgA、IgG和IgM血清应答。此外，强抗体分泌细胞ASC应答被诱导，表明粘膜免疫激发了抗体分泌细胞-尤其是IgA分泌细胞的转移。最重要的是，在唾液、尤其是尿液中也发现了IgA应答，这表明分泌性IgA是在粘膜表面产生的(因为，IgA不能透过肾，尿液中的IgA反映抗体的就地分泌，而且表明该鼻腔疫苗还产生局部性肠IgA，因而，鼻腔疫苗可用于抵抗革兰氏阴性菌引起的尿路感染。)。值得注意的是，在仅进行一次免疫后就可发现这些ASC和抗体应答的主反应，这表明可能没有必要加强免疫。在口腔免疫后也发现了IgA和IgG的ASC应答以及尿液IgA应答。口腔剂型的最有效用途可能是在必要时用作鼻腔初次免疫后的加强免疫。
5.15图8证明了多分子蛋白体蛋白与LPS的非共价复合。该图显示，在使用非复合类志贺邻单胞菌LPS后HPLC流份中的LPS在色谱柱洗脱曲线中出现在与使用蛋白体-LPS疫苗后的不同部分。对应于蛋白体最大蛋白质凝聚的峰可证明使用蛋白体-类志贺邻单胞菌LPS疫苗后LPS和蛋白质在HPLC流份中的共洗脱。对以上结果进行了测定，用ELISA抑制定量LPS，用A280处的OD值定量蛋白体蛋白。HPLC色谱柱是Tosohaas G50000Pwxl，箭头表示分子量标准物。

Claims (28)

1．一种制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，它包括：
a)制备蛋白体、可透析除垢剂和两亲决定基的混合物，
b)渗滤或超滤混合物以去除除垢剂，并由此形成两亲决定基-蛋白体复合体，
c)监测两亲决定基-蛋白体复合体的形成量，
d)回收两亲决定基-蛋白体复合体。
2．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的超滤采用切向流。
3．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的超滤在选自以下组的系统中进行：中空纤维滤柱、平面式滤膜和滤膜滤柱。
4．根据权利要求3所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的超滤系统是NMWC孔径为10,000的中空纤维滤柱。
5．根据权利要求3所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的超滤系统是NMWC孔径为3,000的中空纤维滤柱。
6．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中对可透析除垢剂的监测采用连续检测透析液样品。
7．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的监测包括测定透析液或滞留物样品的光密度。
8．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的监测涉及将透析液样品与已知量的SDS(十二烷基硫酸钠)混合，在有除垢剂存在时就会形成沉淀，并测定沉淀量。
9．根据权利要求8所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中在透析液中的除垢剂被基本清除后回收LPS-蛋白体复合体。
10．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的除垢剂是Empigen BB。
11．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的两亲决定基是脂多糖。
12．根据权利要求11所述的制备蛋白体-脂多糖疫苗的方法，其中的脂多糖来自革兰氏阴性菌。
13．根据权利要求12所述的制备蛋白体-脂多糖疫苗的方法，其中的革兰氏阴性菌是邻单胞菌。
14．根据权利要求13所述的制备蛋白体-脂多糖疫苗的方法，其中的邻单胞菌是类志贺邻单胞菌。
15．根据权利要求12所述的制备蛋白体-脂多糖疫苗的方法，其中的革兰氏阴性菌是志贺氏菌。
16．根据权利要求15所述的制备蛋白体-脂多糖疫苗的方法，其中的志贺氏菌是弗莱克斯纳氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌或鲍伊德氏志贺氏菌。
17．根据权利要求12所述的制备蛋白体-脂多糖疫苗的方法，其中的革兰氏阴性菌是奈瑟氏菌。
18．根据权利要求17所述的制备蛋白体-脂多糖疫苗的方法，其中的奈瑟氏菌是脑膜炎奈瑟氏球菌。
19．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的蛋白体来自脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏菌。
20．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中在经监测的除垢剂的清除速度降低或恒定后再回收LPS-蛋白体复合体。
21．根据权利要求1所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，它还包括：
e)将回收得到的蛋白体-两亲决定基复合体与药学上认可的载体混合，形成疫苗。
22．根据权利要求21所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，它还包括在回收前浓缩LPS-蛋白体复合体。
23．根据权利要求22所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，其中的浓缩持续至达到要求的最终浓度。
24．根据权利要求21所述的制备蛋白体-两亲决定基疫苗的方法，用不同的两亲决定基实施其中的方法，形成一系列的蛋白体-两亲决定基复合体，并在步骤e)中组装成多价疫苗。
25．利用权利要求24所述的方法制备的多价疫苗。
26．一种抵抗疾病的方法，它包括给受体使用有效量的权利要求25所述的疫苗。
27．一种抵抗疾病的方法，它包括给受体使用权利要求21所述的方法制备的疫苗。
28．利用权利要求21所述的方法制备的多价疫苗。
CN96197616A 1995-09-18 1996-09-18 生产非共价复合的多价蛋白体亚基疫苗的改进方法 Pending CN1211192A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US385995P 1995-09-18 1995-09-18
US60/003,859 1995-09-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1211192A true CN1211192A (zh) 1999-03-17

Family

ID=21707938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN96197616A Pending CN1211192A (zh) 1995-09-18 1996-09-18 生产非共价复合的多价蛋白体亚基疫苗的改进方法

Country Status (20)

Country Link
US (1) US6476201B1 (zh)
EP (1) EP0854729B2 (zh)
JP (2) JP4033489B2 (zh)
KR (1) KR19990045763A (zh)
CN (1) CN1211192A (zh)
AT (1) ATE261313T1 (zh)
BR (1) BR9610484A (zh)
CA (1) CA2232410C (zh)
CZ (1) CZ298460B6 (zh)
DE (1) DE69631835T3 (zh)
DK (1) DK0854729T3 (zh)
EA (1) EA199800208A1 (zh)
ES (1) ES2217325T5 (zh)
HU (1) HUP9901577A3 (zh)
IL (1) IL123720A (zh)
MX (1) MX9802128A (zh)
NO (1) NO320074B1 (zh)
PL (1) PL325604A1 (zh)
PT (1) PT854729E (zh)
WO (1) WO1997010844A1 (zh)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5961970A (en) * 1993-10-29 1999-10-05 Pharmos Corporation Submicron emulsions as vaccine adjuvants
ES2278446T3 (es) * 1998-05-29 2007-08-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Vacunas combinadas b/c contra la meningitis.
MXPA01010924A (es) 1999-04-30 2002-05-06 Chiron Spa Antigenos de neisseria conservados.
NZ545647A (en) * 1999-05-19 2008-02-29 Chiron Srl Combination neisserial compositions
ES2267724T3 (es) 2000-02-15 2007-03-16 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vacuna antigripal basada en proteosomas.
EP1721618A3 (en) * 2000-02-15 2007-01-10 ID Biomedical Corporation of Quebec Proteosome influenza vaccine composition
BR0108711A (pt) 2000-02-28 2004-06-22 Chiron Spa Expressão heteróloga de proteìnas de neisseria
AU2002245636B2 (en) * 2001-03-09 2004-10-14 Id Biomedical Corporation Of Quebec A novel proteosome-liposaccharide vaccine adjuvant
SI2255826T1 (sl) * 2002-08-02 2016-07-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Neisserijski vakcinski sestavki, ki obsegajo kombinacijo antigenov
SI1549338T1 (sl) 2002-10-11 2011-04-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Polipeptidna cepiva za ĺ iroko zaĺ äśito pred hipervirulentnimi miningokoknimi rodovi
US7255867B2 (en) * 2002-11-15 2007-08-14 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine
GB0316560D0 (en) * 2003-07-15 2003-08-20 Chiron Srl Vesicle filtration
US7368537B2 (en) * 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
JP2007505836A (ja) * 2003-09-15 2007-03-15 アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック 麻疹サブユニットワクチン
US8173140B2 (en) 2003-10-22 2012-05-08 Id Biomedical Corporation Of Quebec Compositions and methods for activating innate and allergic immunity
EP1761276B1 (en) 2004-06-25 2013-07-24 ID Biomedical Corporation of Quebec Compositions and methods for treating neurological disorders
AU2005319716A1 (en) * 2004-06-30 2006-06-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine compositions for treating coronavirus infection
US7552948B2 (en) 2006-03-29 2009-06-30 Tokai Rubber Industries, Ltd. Quick connector
ES2658851T3 (es) 2006-08-07 2018-03-12 President And Fellows Of Harvard College Vacunas de matriz de proteína y métodos de preparación y administración de tales vacunas
CN101553246B (zh) * 2006-08-07 2019-05-21 哈佛大学校长及研究员协会 蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法
US20100288029A1 (en) * 2006-08-30 2010-11-18 Ge Healthcar Bio-Sciences Corp. System and method for characterizing membranes and membrane filtration devices
AU2009262893B2 (en) * 2008-05-30 2015-05-21 The U.S.A., as represented by The Secretary of the Army, on behalf of Walter Reed Army Institute Of Research Meningococcal multivalent native outer membrane vesicle vaccine, methods of making and use thereof
CN102686238A (zh) * 2009-09-09 2012-09-19 马特里瓦克斯研究和开发公司 具有改善的免疫原性的蛋白质基质疫苗
CA2961883C (en) * 2014-09-24 2023-10-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Combined enterotoxigenic escherichia coli and campylobacter jejuni recombinant construct
AU2022208435A1 (en) 2021-01-18 2023-08-10 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4707543A (en) * 1985-09-17 1987-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Process for the preparation of detoxified polysaccharide-outer membrane protein complexes, and their use as antibacterial vaccines
RU1522494C (ru) * 1987-06-16 1994-11-15 Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" Способ получения инактивированной вакцины гриппа
RU2023448C1 (ru) * 1987-07-30 1994-11-30 Сентро Насьональ Де Биопрепарадос Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в
US5145702A (en) * 1988-09-19 1992-09-08 Opta Food Ingredients, Inc. Hydrophobic protein microparticles and preparation thereof
AU640118B2 (en) * 1988-12-19 1993-08-19 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
US5102989A (en) * 1991-03-15 1992-04-07 Merck & Co., Inc. Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells
AU4683093A (en) * 1992-07-20 1994-02-14 Merck & Co., Inc. Immunological conjugates of ompc and hiv-specific selected principal neutralization epitopes
US5576016A (en) * 1993-05-18 1996-11-19 Pharmos Corporation Solid fat nanoemulsions as drug delivery vehicles
WO1995011700A1 (en) * 1993-10-29 1995-05-04 Pharmos Corp. Submicron emulsions as vaccine adjuvants
ES2267724T3 (es) * 2000-02-15 2007-03-16 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vacuna antigripal basada en proteosomas.

Also Published As

Publication number Publication date
BR9610484A (pt) 2001-09-11
DK0854729T3 (da) 2004-07-12
CZ81998A3 (cs) 1998-10-14
JP4033489B2 (ja) 2008-01-16
ATE261313T1 (de) 2004-03-15
US6476201B1 (en) 2002-11-05
IL123720A (en) 2002-02-10
IL123720A0 (en) 1998-10-30
NO320074B1 (no) 2005-10-17
CA2232410A1 (en) 1997-03-27
ES2217325T5 (es) 2009-04-01
HUP9901577A3 (en) 2000-03-28
KR19990045763A (ko) 1999-06-25
DE69631835D1 (de) 2004-04-15
EA199800208A1 (ru) 1998-10-29
MX9802128A (es) 1998-11-29
US20020164357A1 (en) 2002-11-07
JP2004099619A (ja) 2004-04-02
DE69631835T2 (de) 2005-02-10
JP2000507913A (ja) 2000-06-27
CZ298460B6 (cs) 2007-10-10
WO1997010844A1 (en) 1997-03-27
HUP9901577A2 (hu) 1999-08-30
NO981189D0 (no) 1998-03-17
EP0854729B2 (en) 2008-10-22
EP0854729A4 (en) 2000-02-02
ES2217325T3 (es) 2004-11-01
NO981189L (no) 1998-05-14
PT854729E (pt) 2004-08-31
DE69631835T3 (de) 2009-03-05
PL325604A1 (en) 1998-08-03
CA2232410C (en) 2003-06-17
EP0854729A1 (en) 1998-07-29
EP0854729B1 (en) 2004-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1211192A (zh) 生产非共价复合的多价蛋白体亚基疫苗的改进方法
US6558677B2 (en) Vaccine against gram negative bacteria
AU2002218927B2 (en) Enterohemorrhagic Escherichia coli vaccine
CN1272062A (zh) 含有b组脑膜炎球菌膜孔蛋白和流感嗜血菌多糖的免疫偶联物
CN1638794A (zh) 用于免疫受损人群的糖结合物疫苗
CA2086510A1 (fr) Vecteur de delivrance d'arn
EP0171260A2 (en) Hepatitis B vaccine
CN1020857C (zh) 相应于轮状病毒的主要中和蛋白质的抗原和免疫决定子的肽
CN1054772A (zh) 合成多肽
Jiskoot et al. Immunogenic activity of gonococcal protein I in mice with three different lipoidal adjuvants delivered in liposomes and in complexes
CN1382735A (zh) 生长抑素卵黄抗体及其制备
CN1330552A (zh) 抗腹泻的口服疫苗
CN1173876A (zh) 新的幽门卷旋杆菌膜蛋白质p76
CN1209163C (zh) 脑膜炎球菌疫苗及其制备方法
Broos et al. Comparison of serum humoral responses induced by oral immunization with the hepatitis B virus core antigen and the cholera toxin B subunit
AU751063B2 (en) Improved methods for the production of non-covalently complexed and multivalent proteosome sub-unit vaccines
FR2809960A1 (fr) Composition adjuvante de la reponse immunitaire comprenant la proteine fha ou un fragment de la proteine fha sous forme libre, et composition immunogene ou vaccinale contenant une telle composition adjuvante
Gould-Fogerite et al. Cochleates for induction of mucosal and systemic immune responses
CN1090584A (zh) 合成多肽
JPH10511116A (ja) ヘリコバクター・ピロリの新規膜タンパク
CN1179181A (zh) GnRH－白细胞毒素嵌合体
CN1241940A (zh) 将物质经粘膜施用于哺乳动物的方法
Meqdam Studies of Synthetic Peptides Derived from the Glycoproteins of Measles Virus
BRPI0617407B1 (pt) Vírus influenza canino inativado, composição compreendendo o referido vírus inativado e uso da referida composição
BRPI0617407A2 (pt) vÍrus influenza canino, proteÍnas ha, nm, np, m1, ns1, pa, pb1 e pb2, Ácidos nucleicos que as codificam, composiÇÕes contendo as referidas proteÍnas, os referidos vÍrus ou os referidos Ácidos nucleicos, bem como usos

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C01 Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1043025

Country of ref document: HK