JPS58180432A - 肝炎ｂワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 詳細には肝炎Ｂ抗原およびワクチンとして使用される肝
炎Ｂ抗原の精製方法に関するものである。

肝炎Ｂはウィルス性肝炎の二つのタイプの一種であり肝
臓において発生する主な病理学的変化で全身系感染？生
じるものである。この病気は主に成人を冒し、ウィルス
の長期間（１） 担体からの感染の伝播により多く維持される。

蔓延の通常の方法は輸血切り傷または掻き傷で破られた
皮膚７通して汚染された針および注射針、未消毒の歯科
用器械並びに噴霧注入された感染血液への唾液、性病接
触または露出による。

タイプＢ肝炎の潜伏期は比較的長く即ち６週間から６力
月間が感染と臨床症状の初期との間に経過する。病気は
、通常疲労および食欲欠乏で始まりしばしば筋痛および
腹部不快を伴う。後に黄痕、黒色尿白色匝および弱い肝
１ｊ７１が出現する。ある場合には、開始期が熱、悪寒
および白血球増多に関連して早い黄疼の出現で迅速とな
る。他の場合には、黄府は認められず患者は°°インフ
ルエンザ様（　ｆｌｕ　−１ｉｋｅ）”　病気とだけ気
付いている。大多数の肝炎感染は軽い無黄痢病乞生じる
ことが推定される。

質的にウィルス性肝炎Ａに類似しているけれども病気は
、血液または他の臨床標本（唾（２） 液、尿、胆汁、便）中のオーストラリア抗原粒子〔現在
ＨＩ３ｓＡｇ（表面抗原）と呼称される〕の出現で容易
に診断される。感染された固体の血液中に球形粒子の比
較的大きな集団（１０１４］、０１５／’ｆｎｅ）Ｙ生
じる。粒子は直径１８２２ｎｍであり、肝炎Ｂ（現在Ｈ
Ｂ　Ｖと呼称される）のウィルスである４２ｎｍディン
（Ｄａｎｅ　）粒子の表面と同様の抗原決定因子７有す
る。

米国特許第３．’７３５，００４ｊ号には、煮沸感染性
血清が子供にワクチンケ接種するために使用され）（Ｂ
ｓＡｇに対する抗体（抗ＨＢ　ｓ　）を生じかかる血清
が攻撃に対して保護乞提供したことが示されている。使
用された煮沸血２ 清の用量は］、　Ｘ　１−　ＯＨＢ　ｓ粒子に相当して
いる。かかる血清の受血者は臨床または生化学的の病気
に発展しなかった。しかしかかる血清はその不純な性質
再現性の欠如および非定量のためワクチンとしての使用
に適しない。

（３） 従って肝炎Ｂに対するワクチンを供することが本発明の
目的である。第二の目的は異質の望ましくない蛋白質お
よび／または抗原ケ除去することによって肝炎Ｂ抗原馨
精製することにある。更に目的としては肝炎Ｂ抗原から
異質の望ましくない蛋白質または抗原を除去する方法ン
提供することにある。なお更に別の目的はワクチンとし
て精製肝炎Ｂ抗原ビ服用するための製薬剤の調製乞提供
することにある。本発明のこれらのおよび他の目的は次
の説明から明白となる。

肝炎Ｂ抗原乞含有する清澄血漿からの部分精製濃縮物は
次の操作順序乞うけしめる。即ち ］）濃縮物はペプシンが活性な範囲のｐｌ−１でペプシ
ンで処理される。

２）濃縮物は尿素で処理される。そして３）必要があれ
ば濃縮物はホルムアルデヒドで処理される。

得られた生成物の異質の望ましくない蛋白（４・） 質および／または抗原から分離された高精製、再現性の
ある特性化された肝炎Ｂ抗原はワクチンとして有用であ
る。

本発明の精製肝炎８表面抗原（ＨＴ３ｓＡｇ）としての
出発物質は供与体から例えば血漿泳動法によって得られ
た血漿である。抗原のレベルはラジオインムクアッセイ
法、受動血球凝集素反応または補体結合反応による公知
の方法で測定される。血漿は冷却され生成する塵性析出
物は軽い遠心分離によって除去される。　ＨＢｓＡｇ　
　Ｙ含有する残存清澄血漿は同密度帯（１ｓｏｐｙｃｎ
ｉｏ　ｂａｎｄｉｎｇ　）、レートゾナルバンデイング
（ｒａｔｅ　ｚｏｎａｌ　ｂａｎｄｉｎｇ　）、または
例えばポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、硫
酸ナトリウム等による沈殿などの技術の］種またはそれ
以上によって濃縮される。この部分精製濃縮物は本発明
の出発物質である。

同密度帯において部分精製濃縮物は、必要とされる特異
抗原密度乞包含する密度勾配を（５） 持つ液状媒質と接触される。液状媒質は次いで個々の密
度に従って密度勾配により血清成分の平衡分配ビ得るた
めに超遠心分離に供される。次いで媒質の連続フラクシ
ョンは置換されそれから希望する抗原を含むフラクショ
ンが分離される。オーストラリア抗原の精製に対するこ
の技術の応用はドイツ明細書簡２．０４９，５１５号お
よび米国特許第３，６３６，１９１号に記載されている
。

レートゾナルバンデイングにおいて、部分精製濃縮物は
密度勾配を有する液状媒質と接触して超遠心分離に供さ
れるが、この時は、平衡が得られないような速度および
期間でレートソナル技術が使用される。そしてＨＢｓＡ
ｇおよび他の残留血清成分は媒質における沈降係数に従
って媒質に分布される。

該処理方法において使用される液状媒質は適当な範囲の
いかなる密度勾配であってもよい。かかる溶液の好適な
溶質は例えばショ糖、臭化カリウム、塩化セシウム、臭
化ナトリウ（６） ム、酒石酸カリウム等を包含する。同密度帯段階は通常
遠心分離機例えばエレクトロヌクレオニクスーＫ　（Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｎｌｃｌｃｏｎｉｃｓ−Ｋ　）中で固定回
転子を生理食塩水で充たし、次いで段階勾配が形成する
まで上昇する密度の液状媒質溶液の部分標本（ａｌｉｑ
ｎｏｔｓ　）　　で土向きに生理食塩水乞置換すること
によって行なわれる。

血漿は底部から最も密度の高い溶液を置換する回転子の
頭部に導入される。遠心分離機は最初の再定位置（１ｎ
ｉｔｉａｌ　ｒｅｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｐｈａｓｅ　
）の間攪拌することを妨げる速度にプログラムされた速
ＩＷ制御系により導かれる。

平衡が得られ生成物が固有の密度位にある時回転子はも
との配置に再定位する攪拌を妨げる文めに同一系で速力
が減じられる。次いで勾配が下から排出され固有密度カ
ットが収集される。同様な技術がレートゾナルバンディ
ングで使用される。この帯からの固有密度カットが肝炎
Ｂ抗原の部分精製濃縮物である。

（ワ） 部分精製濃縮物の蛋白質濃度はそれから無菌の発熱物質
のないリン酸塩緩衝食塩（ＰＢＳ）の添加でｍｌ当り約
４０〜２００ミクログラムに調節される。次いで溶液は
約ｐｉ（２〜４に好ましくはＨＣｌで約２５Ｃで酸性化
される。

精製ペプシン水溶液好ましくは結晶性ペプシンから調１
μｓされた溶液が蛋白質約４０〜５００ミクログラム邑
りペプシン約１ミクログラム含有するように添加される
。溶液はペプシンによる異質の蛋白質の消化が完結する
まで代表的には約３０〜３８Ｕの温度で約８〜２４時間
培誉される。次いで溶液は塩基例らハＮａＯＨの添加で
約［）Ｈ７に導かれる。ペプシン消化物質は約５Ｃで限
外沢過によって濃縮され尿素は最終ａ度が蛋白質准物質
乞解離するのに有効になるまで代表的には約４Ｍ〜８Ｍ
１　（好ましくは高精製結晶性グレード）添加される。

次に混合液はさらに精製するために土昇幌度で代表的に
は約３０〜３８Ｃで約１６〜２４時間培養される。

（８） 培養混合液は１過で清澄化され尿素、ペプシンおよびペ
プシン消化残遺物乞除去するためにカラムでクロマトグ
ラフ処理される。カラムはカラムと相溶する無菌の発熱
物質のない生理学的に認められる緩衝液例えばＰＢＳ、
Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４とＮａ２ＨＰＯ４の混合液あるい
は三つのもので溶離される。公知の方法例えばラジオイ
ンムラアッセイ法、補体結合反応および紫外線分光測定
でＨＢｓＡｇＹ含有することが同定されたフラクション
はプールされ無菌の発熱物質のない生理学的に認められ
る緩衝液（そのいくつかの具体例は下記に示した）でｍ
ｌにつき約２０ミクログラムＨＢｓＡｇのレベルに希釈
される。希釈プールされたフラクションは殺菌沢過され
る。ｒ過されたバッチに必要があればホルムアルデヒド
が不活性化ウィルスに公知の濃度例えば−につき約５０
〜２００ミクログラムで添加される。次いで混合液は約
３０〜３８′Ｃで約５０〜１００時間培養される。生理
学的に使用できる中和剤（９） 例えばＮ　ａ　ＨＳ　Ｏ４の無菌溶液はホルムアルデヒ
ドを実質的に中和するために添加される。

材料は無菌的にカラスバイアル１で調合さ九将米の使用
のために貯蔵される。

本発明の精製肝炎８表面抗原は高精製再現性生成物であ
り、粒子サイズ直径約１８〜図に示される通りのＵＶス
ペクトルを有する特性ケ与えるものである。

次に実施例をあげて本発明に更に具体的に説明するが、
本発明はその要旨ケ超えない限り以下の実施例に制約さ
れるものではない。

実施例１ 遠心分離機エレクトロヌレオニクスにの回転子をリン酸
塩緩衝液８．４００ｍ／！で充填した。

系を脱カスするために回転子’＆１０．ＯＯＯｒｐｍま
で回転させた後、下記の段階勾配（５ｔｅｐ　ｇｒａｄ
ｉｅｎｔ　）　Ｙ静ｊＩ−、回転子の底部にポンプで注
入した。

１　１０％Ｎａ　Ｂ　ｒ　　２．４００ｍｌ　　／ｌ＝
］−，０８（■０） ２　２０％ＮａＢｒ　　１．０００ｍ１！　　　ρ＝１
．１７３　３０％Ｎａ　Ｂ　ｒ　　］、、５００ｍｌ　
　　ρ＝１．．２８４　４０％Ｎａ　Ｂ　ｒ　　３．５
００ｍｅ　　　ρ＝１．４　］オーストラリア抗原を含
有する血漿１．７５０−を回転子の底部がら４ｏ％Ｎａ
Ｂｒ　　１．７５０ｍｌ’！Ｊ置換しながら静止回転子
の頭部にポンプで注入しｆＣ８回転子ｋ　３０．０００
　ｒｐｍ　［７）ｎ速しこの速度で４時間行なった。次
いで回転子を市め４０％ＮａＢｒ　　１．７５０ｍｅＹ
回転子の底部に血漿を頭部に押出しながら注入した。

オーストラリア抗原を含有する追加の新鮮な血漿１．７
５０ｍ１！Ｙ回転子の頭部に４０％Ｎ　ａ　Ｂ　ｒの等
ｊｔＹ回転子の底部から置換しながら注入した。次いで
回転子ン３０．０００　ｒｐｒｎで１８時間回転させた
。回転子を停止した後、密度域１．２１〜１．２４　（
７）　ＨＢ　ｓＡｇ　Ｋ富む物質１．０００ｍｌ’４収
集し脱カスしたリン酸塩緩衝液に対して透析した。次い
で回転子ケ上記の脱カスしたリン酸塩緩衝液で充填し下
記の段階勾配を静止回転子の底部に注入した。

１５％ショ糖　　２４００−　ρ＝１．０２２　１５係
シヨ糖　１７５０−　ρ＝］、、０６３２５チシヨ糖　
１．７５０−　ρ＝１．１０４５０％ショ糖　２．５０
０ゴ　ρ＝１．２３Ｎ　ａ　Ｂ　ｒ　　同密度の帯状段
階からＨＢｓＡｇに富む物質１．０００ｍ１’ｉ回転子
の底部から５０チショ糖１．ＯＯＯｍｅＹ置換しながら
回転子頭部に注入した。次いで回転子乞２８．００　Ｏ
ｒｐｍで１８時間回転させた。回転子乞停止した後密度
域１．１３５〜１．１６５のＨＢｓＡｇ　　に富む物質
を収集した。次いでこの生成物を物質５６リツトルビ生
じるようにミリリットル当り４０ミクログラム蛋白質に
希釈した。希釈剤はリン酸塩緩衝食塩である。４０μＰ
　／　ｍｅに肝炎Ｂ抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｙ部分精製した
帯状遠心分離機（Ｚｏｎａｌ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　
）の５６リツトルバツチ乞室温でＩＮ塩酸ケ攪拌しなが
ら添加してｐＨ２に酸化した。１■／ｍｅ結晶ペプシン
の蒸留水水溶液５６−を添加した。ペプシンの最終濃度
は１μ２／−であった。ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　　バッチ乞
３７Ｕで１６時間培養しＩＮ水酸化ナトリウムの添加で
ｐＨ７に添加した。

ペプシン消化ハツチｙ、＜ＸＭ１００Ａ膜を備えたアミ
コン（Ａｍ１ｃｏｎ　）　　装置を用いて限外濾過で２
９５倍に濃縮した。ペプシン減成非抗原プロティンは限
外沢液中に膜を通過したがＨＢｓＡｇ粒子は保持された
。固形尿素乞濃縮物に添加し４〜８モル尿素溶液を生成
し次いで３７Ｕで更に１６時間培養した。尿素処理ＨＢ
ｓＡｇ濃縮物をファイバグラスフィルター２通す濾過に
よって清澄しセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　
Ｇ　−１５０クロマトグラフ処理した。抗原を空隙容積
（ｖｏｉｄ　ｖｏ！ｕｒｎｅ　）で溶離し尿素、ペプシ
ンおよび他の蛋白質不純物乞遊離せしめた。精製Ｔ（Ｂ
ｓＡｇを含有するフラクション６使用レベルに希釈し無
菌沢過した。ホルマリン’（ｚ３６ｔＺ’で７２　時間
９０〜１００μｇ−／　ｍｅの濃度に添加し、更に伝染
性ビールス存在の可能性に対して確実にした。

（１３） ホルマリン処理の終りに過剰のホルムアルデヒド２重亜
硫酸ナトリウムで中和した。精製した生成物は帯状遠心
分離開始物質に対してＥｌ　％２３．８に比較してＥｌ
　　％５２．３乞有している。精製した生成物は直径１
８〜２２　ｎｍおよび添付の図面に示される通りＵＶス
ペクトルを有する球状粒子からなるものである。

精製、生物学的物理学的特性の要旨は次表に示される。

（１４） ＯＤ２８０ｎｍ ＯＤ２６０ｎｍ 容積（ｍｅ　） 総ＯＤ　２８０　ｎｍ ロウリイ蛋白質（Ｌｏｗｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　）　（
μＰ／ｍｌり総蛋白質（ｍｇ） 蛋白質除去係 ｍ１当りのＣＦ単位 ＼ 総ＣＦ単位 ＣＦ収率係 蛋白質μｆ　／　ｍｅ当りのＣＦ単位 ＲＩＡ単位／　ｍｅ 総ＲＩＡ単位 ＲＩＡ収率チ 蛋白質μｍ当りのＲＩＡ単位 （１５） 帯状遠心分離生成物　　　　　最終生成物０．０９５　
　　　　　　　０．１１５０．０８５　　　　　　　　
０．０８２５６．０００　　　　　　　２３，３００５
．３２０　　　　　　　　２，６８０４、０．０　　　
　　　　　２２．０ ２．２４０　　　　　　　　５１３ ７７ ６４　　　　　　　　１２８ ３．５８４，０００　　　　　　２，９８２，０００８
３ １、．６　　　　　　　　　５．８ ２．０００　　　　　　　　８，０００１１２．０００
，０００　　　　　１８０，０００，０００−　　　　
　　　　　　　　　　　１６０５０　　　　　　　　３
６４ 実施例２ 本発明の肝炎８表面抗原２０ミクログラムを含有する一
回用量（１，Ｏｍ／り’＆皮下注射した時６匹のチンパ
ンジーのグループから４匹が抗体を発現した。４週間隔
で２回同種の追加量の後、６匹のチンパンジーのうち５
匹が抗体を発現した。

実施例３ １６匹のチンパンジー７３群に分配した。

Ａ群（６匹のチンパンジー）はＢＯＢ肝炎肝炎−ビール
ス１コ乞静脈接種した。Ｂ群（４匹のチンパンジー）は
本発明の肝炎８表面抗原１、Ｏｄｉ静脈接種した。６群
（６匹のチンパンジー）はコントロール群であり接種し
なかった。Ａ群の全チンパンジーは４０週以内で明らか
な臨床肝炎Ｂ感染（アンテイグネミア（ａｎｔＩｇｎｅ
ｍｉａ　）、酵素高位（ｅｎｚｙｍｅ　ｅｌｅｖａ−ｔ
ｉｏｎ　）および／または抗体反応のいずれか）７有し
た。Ｂ群または６群のチンパンジーはいずれも同様の４
０週間乞超克ても明白な臨（１６） 床肝炎Ｂ感染を示さなかった。

実施例手 グリベットモンキー（ｇｒｉｖｅｔ　ｍｏｎｋｅｙ　）
の三つのグループ（各グループに６匹のモンキー）ヲ本
発明の抗原の変量を含有する１、　０　ｍｌ用量で４週
間隔で３回皮下注射した。次表は各々注射で各グループ
に服用した投与量および全体のうちの動物の数を示すも
のであり、そのうちのグループは次の注射の前に抗体形
成ン示すか、４週以内で最後の注射を行なうものである
。

群　ワクチン量（μＦ／−）　　抗体反応を示す動物の
数０週　４週　８週 Ａ　　　　　２０　　　　　　２／６２／６　５／６Ｂ
　　　　　　２　　　　　　０／６　１／６　４／６Ｃ
Ｏ，５０／６　１／６２／６ 重要なことには、動物の５０％収十が２ミクログラムの
服用量レベルでワクチンの３口重の後抗体反応を示した
。

（１７） 実施例５ モルモット（ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　）の三群（各グル
ープ１４匹）を本発明の抗原の変量を含有する］、、　
Ｏｍｌ量で０．１４．および５６１日間隔で皮下注射し
た。次表は各りＪし一プに服用した投与量各注射薬およ
び全体のうちの動物数を示すものでありそのうち、グル
ープは０，２８゜５６および８４日に試験した時の抗体
形成を示すものである。

１→　　　　＋＋ 罰 ハ も も い 酩　　　　■　　菌　　Ｑ 重要なことは、モルモットの８０％以上が０５ミクロク
ラムの服用量レベルでワクチンの３回量の後抗体形成乞
示した。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の肝炎Ｂ抗原の紫外線スペクトルケ示すも
のである。 出願人：　　メルク　エンド　カムパニーインコーポレ
ーション （２０） 手続補正書 昭和５８年５　月２４日 特許庁長官若杉和夫殿 １、事件の表示昭和５８年　特許　願第２８６５２　　
号２　発明の名称 肝炎Ｂワクチン ３　補正をする者 氏名 銘称）　　メルク　エンド　九〜仁−インコｉボレーテ
ッド４代理人 ５、補正の対象　（１）［明細書ｊ（２＋「図　面」＆
補正の内容　別紙のとおり 明細書及び図面の浄書内容に変更なし く１）別紙のとおり、明細書１通を提出致しまず。 （２）別紙のとおり、正式図面１通を提出致します。 」二申：出願当初手書明細書を提出致しましたが、この
度タイプ印書明細書を提出致しますので御差替え願いま
す。 第１頁の続き ０発　明　者　ニージン・ブイナック アメリカ合衆国ペンシルヴアニ ア・ノース・ウェールズ・ギュ イネラド・ビュー・ロード（番 地なし） １８２−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 粒子サイズ直径約１８〜２２ｎｍ、Ｅ’％７８ｎｍ 約５２〜５４おＪ：び実質的に図に示される通りのＵＶ
   スペクトルを有する精製肝炎Ｂ表面抗原乞生理的に使用
   し得る無菌の発熱物質のない緩衝液中に含有することを
   特徴とする肝炎Ｂからの保護に有効なワクチン。