JPS63246335A - 肝炎b抗原 - Google Patents
肝炎b抗原Info
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- JPS63246335A JPS63246335A JP23122587A JP23122587A JPS63246335A JP S63246335 A JPS63246335 A JP S63246335A JP 23122587 A JP23122587 A JP 23122587A JP 23122587 A JP23122587 A JP 23122587A JP S63246335 A JPS63246335 A JP S63246335A
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
明細θの浄書(1イ容に変更なし) 1↓Ii ” l
、 l、h@3、発明の詳細な説明 本発明は肝炎Bに関するものである。より具体的には肝
炎Bのワクチンに関するものであり、かつ肝炎Bの抗原
をワクチンとして用いるために精製する方法に関するも
のである。
、 l、h@3、発明の詳細な説明 本発明は肝炎Bに関するものである。より具体的には肝
炎Bのワクチンに関するものであり、かつ肝炎Bの抗原
をワクチンとして用いるために精製する方法に関するも
のである。
肝炎Bはウィルス性の肝炎の一種であって、全身性の感
染をうけるが、主たる病変は肝臓に現われる。この病気
は主に成人のものであって、主としてウィルスの長期保
有者からの感染の伝達によって維持されている。普通の
伝播経路は、輸血、感染された注射針や注射筒、切り傷
やひっかき傷のある皮膚、滅菌していない一科用器具、
唾液、性交、エアゾル化した感染血液との接触等である
。
染をうけるが、主たる病変は肝臓に現われる。この病気
は主に成人のものであって、主としてウィルスの長期保
有者からの感染の伝達によって維持されている。普通の
伝播経路は、輸血、感染された注射針や注射筒、切り傷
やひっかき傷のある皮膚、滅菌していない一科用器具、
唾液、性交、エアゾル化した感染血液との接触等である
。
肝炎Bの潜伏期は比較的長く、感染から臨床的発症まで
に6週間から6個月かかることもある。病気は普通疲労
と食欲不振から始まり、筋肉痛と腹部の不快を伴うこと
もある。
に6週間から6個月かかることもある。病気は普通疲労
と食欲不振から始まり、筋肉痛と腹部の不快を伴うこと
もある。
後に黄痘、黒い尿、軽い便、及び軽度の肝臓腫張が起る
こともある。ある場合には1発現は急激で1発熱、悪感
、白血球の増加を伴って開直が現れることもある。ある
場合には開直は決して現れず、患者はインフルエンザ様
の症状を感じるだけである。肝炎感染の多くは軽度の、
開直を伴わない症状になると考えられている。
こともある。ある場合には1発現は急激で1発熱、悪感
、白血球の増加を伴って開直が現れることもある。ある
場合には開直は決して現れず、患者はインフルエンザ様
の症状を感じるだけである。肝炎感染の多くは軽度の、
開直を伴わない症状になると考えられている。
本発明により精製された肝炎Bの表面抗原(HBs抗原
)の出発物質は肝炎Bをもつ供与者から血漿搬出法(p
lasmaphoresis)等によって得られた血漿
である。抗原の力価の測定は、ラジオイムノアッセイ、
受動的凝血反応、あるいは補体結合反応等の既知の方法
で行うことができる。血漿を冷却し、それによって生ず
る寒性沈殿(cryoprecipitate)を軽度
の遠心分離て除く、清澄血漿中のHBs抗原は等密度バ
ンド化法(isopycnic bandingste
p)とそれに統〈速度ゾーンバンド化法(rate z
onal banding 5tep)によって単離さ
れる。
)の出発物質は肝炎Bをもつ供与者から血漿搬出法(p
lasmaphoresis)等によって得られた血漿
である。抗原の力価の測定は、ラジオイムノアッセイ、
受動的凝血反応、あるいは補体結合反応等の既知の方法
で行うことができる。血漿を冷却し、それによって生ず
る寒性沈殿(cryoprecipitate)を軽度
の遠心分離て除く、清澄血漿中のHBs抗原は等密度バ
ンド化法(isopycnic bandingste
p)とそれに統〈速度ゾーンバンド化法(rate z
onal banding 5tep)によって単離さ
れる。
等密度ハント化法においては、部分精製した濃縮液を単
離される抗原と同じ密度を含む密度勾配を作った液体媒
体と接触せしめる。
離される抗原と同じ密度を含む密度勾配を作った液体媒
体と接触せしめる。
ついで液体媒体を超遠心分離にかけることによって、血
清成分をそれぞれの密度によって密度勾配中に平衡な分
布に達せしめる。液体媒体の連続する分画を分離し、希
望する抗原を含む分画、即ろ、密度が約1.21から約
1.24g/ccである分画を分取する。この方法なH
Bs抗原の精製に応用することはドイツ特許明細帯温2
,049,515号及び合衆国特許t53,636,1
91号に述べである。密度勾配を作る溶液の濃度は密度
範囲が約1.0から約1.41g/ccになるように選
ぶ、液体媒体は直線勾配であっても、段階的勾配であっ
てもよい、より好ましくは5分画に対するその固有のよ
り高い能力のため、段階的勾配の形式で用いられる。
清成分をそれぞれの密度によって密度勾配中に平衡な分
布に達せしめる。液体媒体の連続する分画を分離し、希
望する抗原を含む分画、即ろ、密度が約1.21から約
1.24g/ccである分画を分取する。この方法なH
Bs抗原の精製に応用することはドイツ特許明細帯温2
,049,515号及び合衆国特許t53,636,1
91号に述べである。密度勾配を作る溶液の濃度は密度
範囲が約1.0から約1.41g/ccになるように選
ぶ、液体媒体は直線勾配であっても、段階的勾配であっ
てもよい、より好ましくは5分画に対するその固有のよ
り高い能力のため、段階的勾配の形式で用いられる。
速度ゾーンバント化法においては、部分精製した濃縮液
を密度勾配をもつ液体媒体と接触せしめ超遠心分離を行
うが、今回は速度ゾーン法を用いる。即ち、平衡には達
しないような速度と時間で行い、)IBs抗原及び他の
血清成分が媒体中での沈降定数によって媒体中に分布す
るようにする。勾配を作る溶液の濃度は密度範囲が約1
.0から約1.28g/ccにわたるように選ぶ、速度
ゾーン法はHBs抗原が1.13から1.16の密度範
囲にくるまで行う、この時点で、HBs抗原は粗血漿蛋
白の大部分から分離され、最も重要なことには、血漿中
のマクログロブリン補体から分離される。速度ゾーン法
工程を希望するHBs抗原が平衡の位置、すなわち、密
度にして約1.18から1.20g/ccに達するまで
行うと、血漿中のマクログロブリン分画が、希望するH
Bs抗原の分画中に不純物として混ってくることがわか
った。
を密度勾配をもつ液体媒体と接触せしめ超遠心分離を行
うが、今回は速度ゾーン法を用いる。即ち、平衡には達
しないような速度と時間で行い、)IBs抗原及び他の
血清成分が媒体中での沈降定数によって媒体中に分布す
るようにする。勾配を作る溶液の濃度は密度範囲が約1
.0から約1.28g/ccにわたるように選ぶ、速度
ゾーン法はHBs抗原が1.13から1.16の密度範
囲にくるまで行う、この時点で、HBs抗原は粗血漿蛋
白の大部分から分離され、最も重要なことには、血漿中
のマクログロブリン補体から分離される。速度ゾーン法
工程を希望するHBs抗原が平衡の位置、すなわち、密
度にして約1.18から1.20g/ccに達するまで
行うと、血漿中のマクログロブリン分画が、希望するH
Bs抗原の分画中に不純物として混ってくることがわか
った。
等密度バンド化法及び速度ゾーン法工程において用いる
液体媒体は適当なる範囲の密度勾配なら何でもよい、v
e来の技術ではそのような溶液の溶質には地動、臭化カ
リウム、塩化セシウム、酒石酸カリウム等が含まれてい
た。
液体媒体は適当なる範囲の密度勾配なら何でもよい、v
e来の技術ではそのような溶液の溶質には地動、臭化カ
リウム、塩化セシウム、酒石酸カリウム等が含まれてい
た。
等密度バンド化法工程を簡便に行うには、エレクトロヌ
クレオニクスに等の遠心分離機を用い、動いていないロ
ーター中に塩溶液(saline 5olution)
を満たし、ついで一定量(aliquots)の順次密
度の大きくなる液体媒体溶液て塩溶液を押し上げて段階
的勾配を形成する。血漿は、底から最高密度の溶液を一
部分除くことによって、ローターの上から導入する。典
型的には、血漿の体積は段階勾配の体積の15%から4
0%である。遠心分離機は、最初のりオリエンテーショ
ンフェース間に混ざるのを防ぐようにプログラムされた
速度制御システムによって速度をあげる。平衡に到達し
て生成物が適当なる密度の位置にある時に、元の配置に
リオリエンテーションする際に混ることがないように、
同じ速度制御システムによってローターの速度をおとす
。次いて勾配を下からぬいていき、適当なカットした密
度範囲を集める。同様の方法を速度ゾーン法においても
用いる。速度ゾーンバンド化法による適当なる密度範囲
の分画が所望の肝炎Bの抗原の濃縮液である。HBs抗
原のサイズが20n、と小さいため1導布度バンド化工
程は時間がかかり、18時間もの遠心分離処理を必要と
する。その結果、毎日24時間、毎週7日間運転しても
、遠心分離機一台当り4バツチの清澄血漿な処理しつる
のみである。遠心分離機の台数を増やせば生産性は上が
るが、遠心分S機一台は約lO万トルもするので、厖大
な資本投資が必要となる。
クレオニクスに等の遠心分離機を用い、動いていないロ
ーター中に塩溶液(saline 5olution)
を満たし、ついで一定量(aliquots)の順次密
度の大きくなる液体媒体溶液て塩溶液を押し上げて段階
的勾配を形成する。血漿は、底から最高密度の溶液を一
部分除くことによって、ローターの上から導入する。典
型的には、血漿の体積は段階勾配の体積の15%から4
0%である。遠心分離機は、最初のりオリエンテーショ
ンフェース間に混ざるのを防ぐようにプログラムされた
速度制御システムによって速度をあげる。平衡に到達し
て生成物が適当なる密度の位置にある時に、元の配置に
リオリエンテーションする際に混ることがないように、
同じ速度制御システムによってローターの速度をおとす
。次いて勾配を下からぬいていき、適当なカットした密
度範囲を集める。同様の方法を速度ゾーン法においても
用いる。速度ゾーンバンド化法による適当なる密度範囲
の分画が所望の肝炎Bの抗原の濃縮液である。HBs抗
原のサイズが20n、と小さいため1導布度バンド化工
程は時間がかかり、18時間もの遠心分離処理を必要と
する。その結果、毎日24時間、毎週7日間運転しても
、遠心分離機一台当り4バツチの清澄血漿な処理しつる
のみである。遠心分離機の台数を増やせば生産性は上が
るが、遠心分S機一台は約lO万トルもするので、厖大
な資本投資が必要となる。
等密度バンド化用勾配を多数回負荷(mult−ipl
c loading)することによって生産性が大きく
向上し、操作の費用が大幅に減少することかわかった。
c loading)することによって生産性が大きく
向上し、操作の費用が大幅に減少することかわかった。
多数回負荷とはHBs抗原を含む清澄血漿のサンプルを
、等密度バンド化の条件で、HBs抗原の実質的に全部
が勾配の中に入るのには効果的であるか、平衡に到達す
るのには非効果的な時間たけ処理し、この工程をHBS
vL原を含む清澄血漿の別のサンプルを用いて少くとも
もう1回くり返した後、等密度バンド化処理を平衡に連
するのに充分な時間だけ行う、望ましい場合には、同一
の勾配を清澄血漿で6回まで負荷できる。
、等密度バンド化の条件で、HBs抗原の実質的に全部
が勾配の中に入るのには効果的であるか、平衡に到達す
るのには非効果的な時間たけ処理し、この工程をHBS
vL原を含む清澄血漿の別のサンプルを用いて少くとも
もう1回くり返した後、等密度バンド化処理を平衡に連
するのに充分な時間だけ行う、望ましい場合には、同一
の勾配を清澄血漿で6回まで負荷できる。
清澄血漿中の)IBs抗原が勾配中に入るのに要する時
間は平衡に達するのに要する時間のごく一部であるから
、そしてまた、その後の平衡に達するのに要する時間は
、勾配を1回だけ負荷しても多数回負荷しても同じだか
ら時間が大幅に短縮でき、単位処理費用が安くなる。
間は平衡に達するのに要する時間のごく一部であるから
、そしてまた、その後の平衡に達するのに要する時間は
、勾配を1回だけ負荷しても多数回負荷しても同じだか
ら時間が大幅に短縮でき、単位処理費用が安くなる。
本発明による多数回バント化法による生産性の向上と費
用の削減は、適龜なる勾配のいずれを用いても行いうる
が、望ましくは勾配は臭化ナトリウムによるものである
。
用の削減は、適龜なる勾配のいずれを用いても行いうる
が、望ましくは勾配は臭化ナトリウムによるものである
。
等密度バンド化法は約40,000gから約80.00
0gで約10時間以上遠心分離して平衡に達するまで行
う、しかしながら、血漿を約4時間遠心分離するとほと
んど全てのHBs抗原か等密度バンド他用勾配中に入る
がわかっている1次いで用いた血漿のサンプルを除き、
最初に用いたのと同じ体積の血漿標品な勾配の上に重層
する。その後前と同様の条件で約10時間以上遠心分離
して両方の標品中のHBs抗原が勾配中の平衡密度領域
(約1.21から約1.24g/cc) ニ入りバンド
形成を完了させることができる。あるいは別法として、
遠心分離を4時間行い、用いた血漿を除き、3#目の新
しい血漿を勾配上に重層することができる。この多数回
負荷法を6回あるいはそれ以上行ってから約18時間遠
心分離してからバンド形成を完了してもよい。
0gで約10時間以上遠心分離して平衡に達するまで行
う、しかしながら、血漿を約4時間遠心分離するとほと
んど全てのHBs抗原か等密度バンド他用勾配中に入る
がわかっている1次いで用いた血漿のサンプルを除き、
最初に用いたのと同じ体積の血漿標品な勾配の上に重層
する。その後前と同様の条件で約10時間以上遠心分離
して両方の標品中のHBs抗原が勾配中の平衡密度領域
(約1.21から約1.24g/cc) ニ入りバンド
形成を完了させることができる。あるいは別法として、
遠心分離を4時間行い、用いた血漿を除き、3#目の新
しい血漿を勾配上に重層することができる。この多数回
負荷法を6回あるいはそれ以上行ってから約18時間遠
心分離してからバンド形成を完了してもよい。
チャージする血漿の体積と勾配の体積の比は約1.3か
ら約1.6である。血漿を1回たけ勾配にチャージして
等密度バンド形成条件下で遠心分離すると(例えば、K
=■遠心遠心分離筒分:10,000回転、約16時間
から約20時間遠心分離処理)、最初の血漿中の蛋白看
によるが、生成物は普通1.0文の容量中に約4−10
−g/mlの蛋白質含有量となる。
ら約1.6である。血漿を1回たけ勾配にチャージして
等密度バンド形成条件下で遠心分離すると(例えば、K
=■遠心遠心分離筒分:10,000回転、約16時間
から約20時間遠心分離処理)、最初の血漿中の蛋白看
によるが、生成物は普通1.0文の容量中に約4−10
−g/mlの蛋白質含有量となる。
血漿を2回勾配にチャージし、等密度バンド形成条件下
で遠心分離すると(毎分30,000回転で約16時間
から約20時間)、最初の血漿中の蛋白質量によるが、
生成物中の蛋白質量は行ったチャージ回数について加算
的になり、典型的には1.0文の容量中に約88−20
v/mlとなる。蛋白質量はこのように勾配に血漿をチ
ャージする毎に増大する。
で遠心分離すると(毎分30,000回転で約16時間
から約20時間)、最初の血漿中の蛋白質量によるが、
生成物中の蛋白質量は行ったチャージ回数について加算
的になり、典型的には1.0文の容量中に約88−20
v/mlとなる。蛋白質量はこのように勾配に血漿をチ
ャージする毎に増大する。
生成物は次いで速度ゾーンバンド化法を行う、速度ゾー
ンバンド化はHBs抗原が約1.13から1.16g/
ccの密度領域にくるまで行う、典型的にはこれは約1
6時間から約20時間を要し、より好ましくは、約30
,0口Ogから約60,000gで約17箸間ないし、
約18時間である。
ンバンド化はHBs抗原が約1.13から1.16g/
ccの密度領域にくるまで行う、典型的にはこれは約1
6時間から約20時間を要し、より好ましくは、約30
,0口Ogから約60,000gで約17箸間ないし、
約18時間である。
本発明の一面によると、多数回負荷法を用いるか否かは
別として、勾配は臭化ナトリウムを用いて作る。これま
で用いられている材料に比して臭化ナトリウムには明白
な利点かある。臭化ナトリウムの溶解度は冷蔵温度(2
〜6℃)で勾配を作る際に高密度溶液を使うのに適して
いる。塩化セシウムのような塩を使う場合に比して、残
存のあるいはHBs抗原に結合したセシウムイオンによ
る人体への毒性の問題を解決する必要がないのみならず
、経済的にも明らかに有利である。
別として、勾配は臭化ナトリウムを用いて作る。これま
で用いられている材料に比して臭化ナトリウムには明白
な利点かある。臭化ナトリウムの溶解度は冷蔵温度(2
〜6℃)で勾配を作る際に高密度溶液を使うのに適して
いる。塩化セシウムのような塩を使う場合に比して、残
存のあるいはHBs抗原に結合したセシウムイオンによ
る人体への毒性の問題を解決する必要がないのみならず
、経済的にも明らかに有利である。
臭化ナトリウムの勾配中では、生成物物理学的性質によ
ってHBs抗原に結合するイオンは全てナトリウムイオ
ンであり1人体の生物学的系には充分受容可能であり、
毒性の問題を起さない。
ってHBs抗原に結合するイオンは全てナトリウムイオ
ンであり1人体の生物学的系には充分受容可能であり、
毒性の問題を起さない。
HBs抗原の生物物理学的性質については既に充分な報
告かあり(臨床研究雑誌 (J、Cl1nical Investigatio
n)第524.1176頁(1973年)ウィルス学雑
誌、(、of Virology)第1θ巻、469
頁(1972年))、vi電荷をもった粒子である
。陽電荷をもつナトリウムイオンか高濃度に存在すると
、ナトリウム−HBs抗原の塩分子か形成される。従前
の技術によって得られる製品に比して、本発明を実施す
るのに好ましい方法で得られるHBs抗原は他の陽イオ
ン、殊に外から加えたセシウムとカリウムイオンを実質
的に含まない。
告かあり(臨床研究雑誌 (J、Cl1nical Investigatio
n)第524.1176頁(1973年)ウィルス学雑
誌、(、of Virology)第1θ巻、469
頁(1972年))、vi電荷をもった粒子である
。陽電荷をもつナトリウムイオンか高濃度に存在すると
、ナトリウム−HBs抗原の塩分子か形成される。従前
の技術によって得られる製品に比して、本発明を実施す
るのに好ましい方法で得られるHBs抗原は他の陽イオ
ン、殊に外から加えたセシウムとカリウムイオンを実質
的に含まない。
臭化カリウムに比して、臭化ナトリウムの低温での溶解
度が大きいので生体物質の安定性のために助けになる低
温を用いることか可能であ委0段階的勾配を用いる方が
線形勾配に比して1段階の界面に不純物が集まり、1つ
の勾配でより大量の血漿を処理できるので望ましい。
度が大きいので生体物質の安定性のために助けになる低
温を用いることか可能であ委0段階的勾配を用いる方が
線形勾配に比して1段階の界面に不純物が集まり、1つ
の勾配でより大量の血漿を処理できるので望ましい。
本発明の抗原はそのままで肝炎Bの抗原として用いるこ
とかでき1会衆国特許第 :l、636,191号に述べであるように使用できる
1本発明によるHBs抗原は高度に精製されたものであ
る0等密度バンド化によりてHBs抗原は正常血漿蛋白
質に比して約100倍精製される。速度ゾーン工程でH
Bs抗原は正常血漿蛋白質に関し更に20倍精製される
。2つの工程を組合せることによってHBsvLj;(
は正常血漿蛋白質について2000倍生成される。得ら
れる生成物は、血清学や電気泳動の方法では血液層物質
A及びBを実質的に含まないことが示された。更に、本
発明の抗原は1975年5月14日出願の同時係属中の
特許出願第577.483号の肝炎B抗原の出発物質と
して使用できる。
とかでき1会衆国特許第 :l、636,191号に述べであるように使用できる
1本発明によるHBs抗原は高度に精製されたものであ
る0等密度バンド化によりてHBs抗原は正常血漿蛋白
質に比して約100倍精製される。速度ゾーン工程でH
Bs抗原は正常血漿蛋白質に関し更に20倍精製される
。2つの工程を組合せることによってHBsvLj;(
は正常血漿蛋白質について2000倍生成される。得ら
れる生成物は、血清学や電気泳動の方法では血液層物質
A及びBを実質的に含まないことが示された。更に、本
発明の抗原は1975年5月14日出願の同時係属中の
特許出願第577.483号の肝炎B抗原の出発物質と
して使用できる。
以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1
遠心機、エレクトロヌクレオニクスに、のローターを8
400m1の燐酸バッファーで充たす、脱気のためにロ
ーターを毎分10,000回転まで回転させた後、下記
の段階的勾配をとまっているローターの底部に注入する
。
400m1の燐酸バッファーで充たす、脱気のためにロ
ーターを毎分10,000回転まで回転させた後、下記
の段階的勾配をとまっているローターの底部に注入する
。
1、 10%臭化ナトリウム ρ= 1.08 240
0s+12.20%臭化ナトリウム ρ= 1.17
1000g+13.30%臭化ナトリウム ρ= 1.
28 1500m14.40%臭化ナトリウム ρ=
1.41 コラ001オーストラリア抗原(HBs抗
原)を含む血漿1750gelを、ローターの底部から
40%臭化ナトリウム17511mlを除きつつ、静I
Fシているローターの上部に加える。ローターを毎分3
0,000回転に加速し、この速度で18時間運転する
。ローターをとめた後、1.21−1.24の密度領域
のHBs抗原に富んだ部分500 mlを集め、燐酸バ
ッファーに対して透析する。
0s+12.20%臭化ナトリウム ρ= 1.17
1000g+13.30%臭化ナトリウム ρ= 1.
28 1500m14.40%臭化ナトリウム ρ=
1.41 コラ001オーストラリア抗原(HBs抗
原)を含む血漿1750gelを、ローターの底部から
40%臭化ナトリウム17511mlを除きつつ、静I
Fシているローターの上部に加える。ローターを毎分3
0,000回転に加速し、この速度で18時間運転する
。ローターをとめた後、1.21−1.24の密度領域
のHBs抗原に富んだ部分500 mlを集め、燐酸バ
ッファーに対して透析する。
次いでローターを燐酸バッファーて充たし、上述と同様
に脱気し、下記の段階的勾配を静止したローターの底部
に注入する。
に脱気し、下記の段階的勾配を静止したローターの底部
に注入する。
1、 5%庶地動ρ= 1.02 2400m12.1
5%庶糖地動= 1.06 1750s+13.25%
庶糖地動= 1.10 1750m14.50%庶糖地
動= 1.23 2500ml臭化ナトリウム中てのバ
ンド化工程で得られたHBs抗原に富む分画500 m
lを、50%庶糖地動0 mlをローターの底部から除
去しつつ、ローターの上部に加える。その後ローターは
毎分za、ooo回転で18時間運転する。ローターを
とめてから、 1.135〜1.1[i5密度領域にあ
るHBs抗原に富む分画5001を集める。
5%庶糖地動= 1.06 1750s+13.25%
庶糖地動= 1.10 1750m14.50%庶糖地
動= 1.23 2500ml臭化ナトリウム中てのバ
ンド化工程で得られたHBs抗原に富む分画500 m
lを、50%庶糖地動0 mlをローターの底部から除
去しつつ、ローターの上部に加える。その後ローターは
毎分za、ooo回転で18時間運転する。ローターを
とめてから、 1.135〜1.1[i5密度領域にあ
るHBs抗原に富む分画5001を集める。
実施例2
遠心機、エレクトロヌクレオニクスk、のローターを燐
酸バッファー、8400m1で充たす、脱気するために
、最高毎分to、oo。
酸バッファー、8400m1で充たす、脱気するために
、最高毎分to、oo。
回転でローターを回転させてから、下記の段階的勾配を
静止したローターの底部に注入する。
静止したローターの底部に注入する。
1、 10%臭化ナトリウム ρミ1.08 2400
+*12.20%臭化ナトリウム ρ冨1.17 10
00m13、30%臭化ナトリウム ρ暑1.28 1
500m14.40%臭化ナトリウム ρ±1.41
3SOOmlHBs抗原を含む血漿1750m1を、
40%臭化ナトリウム1750m1をローターの底部か
ら除きつつ、静止したローターの上部に加える。ロータ
ーは毎分30,000回転に加速し、この速度で4時間
運転する0次いでローターをとめ、40%臭化ナトリウ
ム1750讃1をローターの底部に注入することによつ
て血漿を上から押し出す、更に1750層lのHBs抗
原を含む新しい血漿を、ローターの底部から同型の40
%臭化ナトリウムを除きつつ、ローターの上に加える。
+*12.20%臭化ナトリウム ρ冨1.17 10
00m13、30%臭化ナトリウム ρ暑1.28 1
500m14.40%臭化ナトリウム ρ±1.41
3SOOmlHBs抗原を含む血漿1750m1を、
40%臭化ナトリウム1750m1をローターの底部か
ら除きつつ、静止したローターの上部に加える。ロータ
ーは毎分30,000回転に加速し、この速度で4時間
運転する0次いでローターをとめ、40%臭化ナトリウ
ム1750讃1をローターの底部に注入することによつ
て血漿を上から押し出す、更に1750層lのHBs抗
原を含む新しい血漿を、ローターの底部から同型の40
%臭化ナトリウムを除きつつ、ローターの上に加える。
その後ローターは毎分30,000回転で18時間回す
、ローターを止めてから、1.21−1.24の密度領
域にあるHBs抗原に富む分画100G+slを集め、
燐酸バッファーに対して透析する。
、ローターを止めてから、1.21−1.24の密度領
域にあるHBs抗原に富む分画100G+slを集め、
燐酸バッファーに対して透析する。
ローターを燐酸バッファーで充たし、上述と同様に脱気
し、下記の段階的勾配を静止したローターの底部に注入
する。
し、下記の段階的勾配を静止したローターの底部に注入
する。
1、 S%庶地動ρ=1.02 2400謙12.1
5%庶糖地動−1,061750寵13.2s%庶糖
ρ= 1.1(1175(1*14.50%庶糖地動
= 1.23 2500m1臭化ナトリウム中での等密
度バンド化工程で得られたHBs抗原に富む分画101
00Oを、50%庶糖地動100Oをローターの底部か
ら除きつつ、ローターの上部に注入する。
5%庶糖地動−1,061750寵13.2s%庶糖
ρ= 1.1(1175(1*14.50%庶糖地動
= 1.23 2500m1臭化ナトリウム中での等密
度バンド化工程で得られたHBs抗原に富む分画101
00Oを、50%庶糖地動100Oをローターの底部か
ら除きつつ、ローターの上部に注入する。
次いでローターを毎分28,000回転で18時間運転
する。ローターをとめてから。
する。ローターをとめてから。
1.135〜1.165密度領域にあるHBs抗原に富
む分画10100Oを集める。
む分画10100Oを集める。
実施例3
遠心機、エレクトロヌクレオニクスk、のローターを8
40(1m+の燐酸バッファーで充たす、脱気のため、
ローターを最高毎分to、ooo回転で回してから、下
記の段階的勾配を静止したローターの底部に注入する。
40(1m+の燐酸バッファーで充たす、脱気のため、
ローターを最高毎分to、ooo回転で回してから、下
記の段階的勾配を静止したローターの底部に注入する。
1、 10%臭化ナトリウム ρ−1,082400m
12.20%臭化ナトリウム ρ富1.17 1000
m13、 30%臭化ナト!J ’l A P ”
1.28 1500t14.40%臭化ナトリウム ρ
= 1.41 3500mlHBs抗原を含む血漿17
sOs+を、40%臭化ナトリウム1750m1をロー
ターの底部から除きつつ、静止したローターの上部に注
入する。ローターは毎分:lO,000回転に加速して
この速度で4時間運転する。ローターをとめ、40%臭
化ナトリウム1750m1をローターの底部に注入する
ことによって血漿をローターのを上部から押し出す、更
に1750m1のHBs抗原を含む新しい血漿を。
12.20%臭化ナトリウム ρ富1.17 1000
m13、 30%臭化ナト!J ’l A P ”
1.28 1500t14.40%臭化ナトリウム ρ
= 1.41 3500mlHBs抗原を含む血漿17
sOs+を、40%臭化ナトリウム1750m1をロー
ターの底部から除きつつ、静止したローターの上部に注
入する。ローターは毎分:lO,000回転に加速して
この速度で4時間運転する。ローターをとめ、40%臭
化ナトリウム1750m1をローターの底部に注入する
ことによって血漿をローターのを上部から押し出す、更
に1750m1のHBs抗原を含む新しい血漿を。
ローター底部から同量の40%臭化ナトリウムを除きつ
つ、ローターの上部に加える。ローターを毎分30,0
00回転に加速し、この速度で4時間運転する。ロータ
ーをとめ、更に3回目のHBs抗原を含む新しい血漿1
750m1を、ローターの底部から同量の40%臭化ナ
トリウムを除きつつ、ローターの上部に注入する。ロー
ターは毎分30,000回転で18時間回す、ローター
をとめてから、1.21〜1.24の密度領域にあるH
Bs抗原に富む分画1sOOs+を集め、燐酸バッファ
ーに対して透析する。
つ、ローターの上部に加える。ローターを毎分30,0
00回転に加速し、この速度で4時間運転する。ロータ
ーをとめ、更に3回目のHBs抗原を含む新しい血漿1
750m1を、ローターの底部から同量の40%臭化ナ
トリウムを除きつつ、ローターの上部に注入する。ロー
ターは毎分30,000回転で18時間回す、ローター
をとめてから、1.21〜1.24の密度領域にあるH
Bs抗原に富む分画1sOOs+を集め、燐酸バッファ
ーに対して透析する。
次いでローターを燐酸バッファーで充たし、上述と同様
に脱気し、下記の段階的勾配を静止したローターの底部
に注入する。
に脱気し、下記の段階的勾配を静止したローターの底部
に注入する。
1、 S%庶地動ρ=1.02 240012.15
%庶糖地動= 1.06 1750m13.25%庶糖
地動= 1.10 1750m14.50%庶糖地動
= 1.23 25QOm1等密度ハント化工程で得ら
れたHBs抗原に富む分画1500mlを、50%庶糖
地動0011をローター底部から除きつつ、ローター上
部に注入する0次いでローターを毎分28,000回転
で18時間運転する。ローターをとめてから、1.1:
15〜1.165の密度領域にあるHBs抗原に富む分
画l5OO*Iを集める。
%庶糖地動= 1.06 1750m13.25%庶糖
地動= 1.10 1750m14.50%庶糖地動
= 1.23 25QOm1等密度ハント化工程で得ら
れたHBs抗原に富む分画1500mlを、50%庶糖
地動0011をローター底部から除きつつ、ローター上
部に注入する0次いでローターを毎分28,000回転
で18時間運転する。ローターをとめてから、1.1:
15〜1.165の密度領域にあるHBs抗原に富む分
画l5OO*Iを集める。
実施例4
下記の表は、本発明による多数回負荷法を用いた場合(
実施例2及び3)、唯1回負荷した場合(実施例1)に
比して、単位時間当りの収量がずっとよくなることを示
している。
実施例2及び3)、唯1回負荷した場合(実施例1)に
比して、単位時間当りの収量がずっとよくなることを示
している。
2 1000 40 11
.1% 100%3 1500
44 22.2 % 200 %
本発明の態様は例えば次のとおりである。
.1% 100%3 1500
44 22.2 % 200 %
本発明の態様は例えば次のとおりである。
1、人間の肝炎B供給者の清澄血漿からHBs抗原を濃
縮する方法において、清澄血漿を臭化ナトリウム密度勾
配中で等密度バンド化させて、HBs抗原に富む分画を
得ることを特徴とする方法。
縮する方法において、清澄血漿を臭化ナトリウム密度勾
配中で等密度バンド化させて、HBs抗原に富む分画を
得ることを特徴とする方法。
2、密度勾配が段階的勾配である第1項による方法。
3、 臭化ナトリウム密度勾配中で等密度バンド化させ
た血漿からHBs抗原を精製する方法において、密度領
域が約1.21g/ccから約1.24g/ccの間で
ある等密度バンド分画を、HBs抗原が約1.13g/
ccから約1.16g/ccの密度領域にくるまで、速
度ゾーン分画にかけることを特徴とする改良法。
た血漿からHBs抗原を精製する方法において、密度領
域が約1.21g/ccから約1.24g/ccの間で
ある等密度バンド分画を、HBs抗原が約1.13g/
ccから約1.16g/ccの密度領域にくるまで、速
度ゾーン分画にかけることを特徴とする改良法。
4、人間肝炎B供給者の清澄血漿からHBs抗原を濃縮
する方法において、清澄血漿を臭化ナトリウム密度勾配
中で等密度バンド化せしめて得られた。HBs抗原に富
む生成物をHBs抗原が約1.13g/ccから約1.
16g/ccの密度領域にくるまで、速度ゾーン分画法
にかけることを特徴とする改良法。
する方法において、清澄血漿を臭化ナトリウム密度勾配
中で等密度バンド化せしめて得られた。HBs抗原に富
む生成物をHBs抗原が約1.13g/ccから約1.
16g/ccの密度領域にくるまで、速度ゾーン分画法
にかけることを特徴とする改良法。
5、 8Bs抗原を含む清澄血漿を、HBs抗原の実質
的に全部が清澄血漿から密度勾配に入るのには効果的で
あるが、HBs抗原の等密度バンド化を完成するには非
効果的な条件下で、密度勾配中での部分的等密度バンド
化法にかけ、HBs抗原の無くなった清澄血漿を取除き
、第一の工程を清澄血漿の新しいサンプルを用いて、少
くとももう一同くり返すことを特徴とする密度勾配を多
数回負荷する方法。
的に全部が清澄血漿から密度勾配に入るのには効果的で
あるが、HBs抗原の等密度バンド化を完成するには非
効果的な条件下で、密度勾配中での部分的等密度バンド
化法にかけ、HBs抗原の無くなった清澄血漿を取除き
、第一の工程を清澄血漿の新しいサンプルを用いて、少
くとももう一同くり返すことを特徴とする密度勾配を多
数回負荷する方法。
6、密度勾配が臭化ナトリウムからできている第5項に
よる方法。
よる方法。
7、 8Bs抗原を含む清澄血漿を、HBs抗原の実質
的に全部が清澄血清から密度勾配に入るのには効果的で
あるが、HBs抗原の等密度バンド化を完成するには非
効果的な条件下で、密度勾配中での部分的等密度バンド
化法にかけ、HBs抗原の無くなった清澄血漿を取除き
、第一の工程を清′Fei血漿の新しいサンプルを用い
て少なくとももう一回くり返すことを特徴とする密度勾
配を多数回負荷する方法により得られる密度勾配。
的に全部が清澄血清から密度勾配に入るのには効果的で
あるが、HBs抗原の等密度バンド化を完成するには非
効果的な条件下で、密度勾配中での部分的等密度バンド
化法にかけ、HBs抗原の無くなった清澄血漿を取除き
、第一の工程を清′Fei血漿の新しいサンプルを用い
て少なくとももう一回くり返すことを特徴とする密度勾
配を多数回負荷する方法により得られる密度勾配。
8、)IBs抗原を含む清澄血漿を、)IBs抗原の実
質的に全部が清澄血清から密度勾配に入るのには効果的
であるが、HBs抗原の等密度バンド化を完成するには
非効果的条件下で、密度勾配中での部分的等密度バンド
化法にかけ、HBs抗原の無くなった清澄血漿を取除き
、第1の工程を清澄血漿の新しいサンプルを用いて、少
くとももう一回くり返すことを特徴とする密度勾配を多
数回負荷し、ついで平衡に達するのに効果的な条件下で
等密度バンド化法を続けることを特徴とする清澄血漿か
らHBs抗原を等密度バンド化させる方法。
質的に全部が清澄血清から密度勾配に入るのには効果的
であるが、HBs抗原の等密度バンド化を完成するには
非効果的条件下で、密度勾配中での部分的等密度バンド
化法にかけ、HBs抗原の無くなった清澄血漿を取除き
、第1の工程を清澄血漿の新しいサンプルを用いて、少
くとももう一回くり返すことを特徴とする密度勾配を多
数回負荷し、ついで平衡に達するのに効果的な条件下で
等密度バンド化法を続けることを特徴とする清澄血漿か
らHBs抗原を等密度バンド化させる方法。
9、密度勾配が臭化ナトリウムである第8項による方法
。
。
]0.HBs抗原を含む清澄血漿を、HBs抗原の実質
的に全部か清澄血清から密度勾配に入るのには効果的で
あるが、HBs抗原の等密度バンド化を完成するには弊
効果的条件下で、密度勾配中での部分的等密度バンド化
法にかけ、HBs抗原の無くなった清澄血漿を取除き、
第一工程を清澄血漿の新しいサンプルを用いて、少くと
ももう一回くり返すことを特徴とする密度勾配を多数回
負荷し、ついで、平衡に達するのに効果的な条件下で等
密度バンド化法を続けることを特徴とする清澄血漿から
HBs抗原を等密度バンド化させる方法によって得られ
る密度勾配。
的に全部か清澄血清から密度勾配に入るのには効果的で
あるが、HBs抗原の等密度バンド化を完成するには弊
効果的条件下で、密度勾配中での部分的等密度バンド化
法にかけ、HBs抗原の無くなった清澄血漿を取除き、
第一工程を清澄血漿の新しいサンプルを用いて、少くと
ももう一回くり返すことを特徴とする密度勾配を多数回
負荷し、ついで、平衡に達するのに効果的な条件下で等
密度バンド化法を続けることを特徴とする清澄血漿から
HBs抗原を等密度バンド化させる方法によって得られ
る密度勾配。
++、密度勾配に起因するセシウム及びカリウムイオン
を実質的に含まないHBs抗原のナトリウム塩分子。
を実質的に含まないHBs抗原のナトリウム塩分子。
+2.臭化ナトリウム溶液中に溶けた第11項の生成物
を含む組rIL物。
を含む組rIL物。
13、溶液か臭化ナトリウムの段階勾配である第12項
による組J&物。
による組J&物。
14、臭化ナトリウムの密度か約1.21に/ccから
約1.24g/ccである第12項による組成物。
約1.24g/ccである第12項による組成物。
15、臭化ナトリウムの密度が約1.13g/ccから
約1.16g/ccである第12項による組成物。
約1.16g/ccである第12項による組成物。
16、本質的に臭化ナトリウムの水溶液に溶けたHBs
抗原からなる組成物。
抗原からなる組成物。
手続補正書
昭和62年lO月16日
2、発明の名称 肝炎B抗原
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
4、代理人
(1)「特許請求の範囲」を別紙の通り訂正する。
(2)明細書第13頁第17行目の
「ない、」の次に
「実施例2−4は参考例である。」を加入する。
(3)同上第7頁第18行目の
「等密度バント」の前に
「なお参考のため述べると、」を加入する。
2、特許請求の範囲
1. 人間の肝炎B供給者の清澄血漿を臭化ナトリウム
密度勾配中で等密度ハント化せしめて得られた。 HB
s抗原に富む生成物を精製する方法におし)て、 該清澄血漿の1回負荷による等密度バンド化によって密
度領域が約1.21g/ccから約1.24g/ccの
間である等密度バンド分画を得、これをHBs抗原が約
1.13g/ccから約1.t6g/ccの密度領域に
くるまで、速度ゾーン分画にかけることを特徴とする方
法。
密度勾配中で等密度ハント化せしめて得られた。 HB
s抗原に富む生成物を精製する方法におし)て、 該清澄血漿の1回負荷による等密度バンド化によって密
度領域が約1.21g/ccから約1.24g/ccの
間である等密度バンド分画を得、これをHBs抗原が約
1.13g/ccから約1.t6g/ccの密度領域に
くるまで、速度ゾーン分画にかけることを特徴とする方
法。
2、 8度勾配が段階的勾配である特許請求の範囲M4
を項による方法。
を項による方法。
手続補正書(放)
昭和63年4月20日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、人間の肝炎B供給者の清澄血漿を臭化ナトリウム密
度勾配中で等密度バンド化せし めて得られた、HBs抗原に富む生成物を精製する方法
において、 密度領域が約1.21g/ccから約1.24g/cc
の間である等密度バンド分画を、HBs抗原が約1.1
3g/ccから約1.16g/ccの密度領域にくるま
で、速度ゾーン分画にかける ことを特徴とする方法。 2、密度勾配が段階的勾配である特許請求の範囲第1項
による方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23122587A JPS63246335A (ja) | 1987-09-17 | 1987-09-17 | 肝炎b抗原 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23122587A JPS63246335A (ja) | 1987-09-17 | 1987-09-17 | 肝炎b抗原 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63246335A true JPS63246335A (ja) | 1988-10-13 |
Family
ID=16920280
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23122587A Pending JPS63246335A (ja) | 1987-09-17 | 1987-09-17 | 肝炎b抗原 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63246335A (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
JPS5182720A (en) * | 1974-12-09 | 1976-07-20 | Merck & Co Inc | Kanen a kogen |
JPS51139619A (en) * | 1975-05-14 | 1976-12-02 | Merck & Co Inc | Hepatisis b vaccine |
-
1987
- 1987-09-17 JP JP23122587A patent/JPS63246335A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
JPS5182720A (en) * | 1974-12-09 | 1976-07-20 | Merck & Co Inc | Kanen a kogen |
JPS51139619A (en) * | 1975-05-14 | 1976-12-02 | Merck & Co Inc | Hepatisis b vaccine |
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