JPH0585526B2

JPH0585526B2 -

Info

Publication number: JPH0585526B2
Application number: JP57210240A
Authority: JP
Inventors: Takao Oomura; Terufumi Fujiwara; Akimasa Oomizu; Satoru Funakoshi
Original assignee: GREEN CROSS CORP
Current assignee: GREEN CROSS CORP
Priority date: 1982-11-29
Filing date: 1982-11-29
Publication date: 1993-12-07
Also published as: EP0112506B1; EP0112506A3; ES527588A0; US4565697A; DE3377972D1; ES8505820A1; JPS59101426A; EP0112506A2; CA1217138A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）を主
成分とするＢ型肝炎感染予防用ワクチンの製造方
法に関し、さらに詳しくは、加熱処理後の精製過
程において硫安分画法、コロイド珪酸塩による吸
着、そしてポリエチレングリコール分画法を有効
に組み入れ、副作用の原因となるヒト血漿成分及
びＢ型肝炎感染性成分を除去し、さらに抗原性を
損うことなく感染性不活化処理を行うことからな
るHBsAgを主成分とするＢ型肝炎感染予防用ワ
クチン製造方法に関する。

HBsAgは、Ｂ型肝炎を起すウイルス（HBV）
の構成成分として知られているが、その大部分は
感染性のない小型粒子として存在しており、ヒト
やチンパンジーの血漿中に見出される。HBsAg
は電気泳動的には、ヒトの血漿のグロブリン蛋白
に属している。

HBVによる感染の予防としては、HBs抗体を
含むグロブリン製剤を投与して受身免疫を獲得さ
せる方法もあるが、その効果は短期間であり一般
のウイルス感染の予防にみられるようにワクチン
による能動免疫が最も優れていることはいうまで
もない。

論理的にはＢ型肝炎に対するワクチンは、まず
Ｂ型肝炎ウイルス物質を単離し、それを適当な方
法で不活性化させるか、またはHBsAgから未変
化ウイルスを分離し、補充的に不活化処理するこ
とにより提供される。このワクチンは、生体に投
与された時、Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体の産
生がもたらされる結果、Ｂ型肝炎の感染を予防す
ることができる。

HBsAgワクチンの製造には、これまで数多く
の方法が試みられてきた。ウイルスの感染性を不
活化する方法としては、60℃、10時間或は100℃、
２分間の加熱処理を行う方法があるが、加熱処理
では、HBVに含まれる核酸（DNA）を十分に破
壊するという保障はない。そのため今日広く採用
されつつある技術は、ホルマリン処理による
HBVの不活化処理である。

ところで、僅に混在しているヒト血漿蛋白でも
ワクチン製造時などにホルマリン処理で変性を受
けたものは、これがヒトに投与された時、副作用
の原因となるため、それらはできるだけ完全に除
去されていなければならない。この微量に混在し
てくるヒト血漿成分は、いくら超遠心分離やアフ
イニテイークロマトグラフイーを繰り返しても除
去し得ず、一部はHBsAgと結合して存在してい
るものであるとの見方をする研究者もあつた。

又、HBsAgの単離精製法として、最も一般に
採用されているのは超遠心分離法とアフイニテイ
クロマトグラフイー法である。これらの方法を採
用すると殆んど純粋なHBsAg粒子を得ることが
できる。しかし、既知の単離方法は全て複雑であ
り、かつ工業的に利用することが困難である。

本発明の目的は、HBsAg粒子の抗原性を残存
させたまま副作用の原因となる血漿成分、特にそ
の蛋白成分を除去し、HBsAgを回収し、さらに
混在する恐れのあるHBVすなわちデーン粒子を
不活化し、HBsAg粒子を主成分とするＢ型肝炎
感染予防用ワクチンの工業的製造方法を提供する
ことにある。

本発明者らは、HBsAgの精製に、硫安分画工
程、コロイド珪酸塩による吸着工程、ポリエチレ
ングリコール分画工程を組合せ、かつこれら各工
程における処理条件について検討を重ねて本発明
を完成した。

即ち、本発明は、HBsAgを含有するヒト血漿
タンパクの水溶液に、50〜70℃、８〜12時間の加
熱処理を施し、処理水溶液から硫安の10〜20％飽
和によつて沈殿するタンパク質を除去し、次いで
硫安の40〜50％飽和によつて沈殿するタンパク質
を集め、その水溶液をコロイド珪酸塩に接触させ
て、このコロイド珪酸塩にHBsAgを吸着させ、
吸着されたHBsAgを0.1〜1.0％デオキシコール酸
塩を含有するPH8.5〜9.5の緩衝液で溶出し、得ら
れた溶出液を中性付近に調整し、これにポリエチ
レングリコールを３〜７％（ｗ／ｖ）加えて、
HBVと免疫複合体とを沈殿として除去し、次い
で上清のポリエチレングリコール濃度を15〜20％
（ｗ／ｖ）とし、HBsAgを沈殿として集め、これ
をPH６〜８の緩衝液で平衡化した分子量数十万〜
数百万の高分子物質に適用できるゲル過担体を
用いてゲル過を行ないHBsAg画分を回収し、
次いで超遠心分離により粒子の大きさ18〜24nm、
比重1.18〜1.22g／cm³である一定値のHBsAgを回
収し、更にホルマリン濃度1/1500〜1/2500で、35
〜40℃、94〜98時間の不活化処理を行ない、次い
で２〜６℃で６〜10日間放置し、得られた不活化
HBsAgをPH６〜８の緩衝液に対して透析後、賦
形剤を１〜５％ｗ／ｖ添加凍結乾燥し、Ｂ型肝炎
の感染性がなく、人血漿成分を含まないHBsAg
を主成分とするＢ型肝炎感染予防用ワクチンを製
造する方法からなる。

本発明において用いられる人の血漿タンパク質
は、HBsAgを含むもの、すなわち、実際に人に
肝炎を起させ得るものはもとより、HBsAg抗原
が検出されるものであれば、いかなるものであつ
てもよい。すなわち、血漿、血清及び公知の血漿
タンパク分画法によつて得られる種々のタンパク
画分が用いられるが、本発明において用いられる
原料の内、最も好ましいものは、HBsAg抗原の
分布量が比較的多いα−及びβ−グロブリン画分
である。この画分は他の有用な血漿タンパク画分
を分取する際の副産物であることも原料として用
いるのに都合がよい。また、かかる蛋白質の水溶
液としては、血漿自体、あるいは上記の血漿タン
白質を水、たとえば蒸留水などに溶解したものな
どが用いられる。

このHBsAgを含有するヒト血漿タンパク質を
出発原料として以下の製造工程を経てＢ型肝炎感
染予防用ワクチンを製造する。

(1) 加熱処理（５〜70℃、８〜12時間）工程：出発原料のHBsAgを含有するヒト血漿タンパ
ク質水溶液に、所望によりアジ化ナトリウムを、
たとえば当該水溶液1l当り0.1〜0.3ｇ添加し溶解
させる。溶解後、Ｂ型肝炎の感染性は失わせる
が、抗原性は失わせない50〜70℃、８〜12時間の
加熱処理を施す。なお、所望により既知の安定剤
を添加して処理をおこなうこともできる。

(2) 硫安（10〜20％飽和）分画工程：前記加熱処理工程後の当該水溶液を硫安10〜20
％飽和分画することによつて沈殿するタンパク質
を除去する。当該分画は、たとえば加熱処理後の
当該水溶液をPH４〜６（好ましくは塩酸、硫酸等
にて調整する）に調整し、硫安を10〜20％飽和に
なるように添加し、たとえば３〜５℃にて30〜
120分間撹拌することによつて行われる。かくし
て沈澱したタンパク質は、たとえば30〜120分間
静置して生成した沈澱を遠心分離（通常、6000〜
8000r.p.m.、10〜30分間）に付して除去し、遠心
上清を回収することによつて分離除去される。

(3) 硫安（40〜50％飽和）分画工程：上記遠心上清から硫安40〜50％飽和分画によつ
て沈澱するタンパク質を回収する。当該分画は、
通常PH６〜８にて行われ、PHの調整には通常水酸
化アルカリ金属（例、水酸化ナトリウム）が使用
される。また、温度条件は３〜５℃であることが
好ましく、また分画は30〜120分間撹拌すること
よつて行うことが好ましい。撹拌終了後、たとえ
ば30〜120分間静置することによつて沈澱が生成
する。この沈澱の回収は、好ましくは遠心分離
（通常、6000〜8000r.p.m.、10〜30分間）にて行
われる。

(4) コロイド珪酸塩による吸着処理工程：コロイド珪酸塩としてはシリカゲル、ケイ酸ア
ルミン酸マグネシウム、ケイソウ土、酸性白土、
カオリンなどが用いられる。当該工程は、たとえ
ば次の如くして行われる。

まず、前記硫安分画工程にて得られた沈澱タン
パク質を、PH６〜８の緩衝液（たとえば、リン酸
緩衝液）に溶解し、要すれば透析、清澄、除菌
過を行つた後コロイド珪酸塩を、好ましくは１〜
４％（ｗ／ｖ）となるように添加して撹拌する。
撹拌温度は36〜38℃、撹拌時間は２〜４時間が好
ましい。

HBsAgを吸着したコロイド珪酸塩は、たとえ
ば遠心分離（通常、2000〜4000r.p.m.、10〜20分
間）によつて回収される。回収された当該コロイ
ド珪酸塩は、PH７〜８の緩衝液（たとえば0.1〜
0.2Mのエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、
0.1〜0.2Mの塩化ナトリウム等の無機塩等からな
るPH７〜８の緩衝液等にて洗浄することが好まし
い。

(5) デオキシコール酸塩含有緩衝液（PH8.5〜
9.5）による溶出：本工程は、上記工程で吸着されたHBsAgを溶
出する工程であり、デオキシコール酸塩としては
アルカリ金属塩（たとえば、ナトリウム塩）など
の塩が用いられる。本工程の具体例は、前工程に
て得られた吸着物を、0.1〜１％デオキシコール
酸塩を含有するPH8.5〜9.5の緩衝液を用いて溶出
することによつて行われる。次いで、遠心分離
（例、2000〜4000r.p.m.、10〜20分間）を行い、
HBsAgの溶出液を回収する。

(6) ポリエチレングリコール分画工程： (i) ポリエチレングリコール分画（３〜７％
（ｗ／ｖ）工程：コロイド珪酸塩による吸着処理工程で得られた
粗製HBsAgは、ポリエチレングリコール（通常
量2000〜10000）による分画によつてHB_sA_g及び
免疫複合体等の微量夾雑物が沈殿として除去され
る。このポリエチレングリコール分画工程はコロ
イド珪酸塩によるHB_sA_g吸着、溶出液にポリエ
チレングリコールを３〜７（ｗ／ｖ）、好ましくは
５〜６％（ｗ／ｖ）になるように添加することに
よつて行われ、その際のPHは中性付近（６〜８）
であり、２〜10℃の温度下にて10〜60分間撹拌
し、次いで３〜７時間そのまま静置することによ
つて実施される。かくして生じた沈殿物は夾雑物
として遠心分離（例、1000〜5000r.p.m.、20〜40
分間）によつて除去して、上清を回収する。

(ii) ポリエチレングリコール分画工程（15〜20
％（ｗ／ｖ））：得られた遠心上清に上記と同様の条件下ポリエ
チレングリコール（通常、分子量2000〜10000）
を15〜20％（ｗ／ｖ）になるように添加して沈殿
を回収する。通常、ポリエチレングリコール添加
後２〜10℃の温度下にて10〜60分間撹拌し、次い
で16〜20時間静置することによつて実施され、生
じたHB_sA_gを含有する沈殿タンパク質を遠心分
離（例、8000〜12000r.p.m.、40〜50分間）によ
り回収する。回収した沈殿タンパク質はPH６〜８
のリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解する。

(7) ゲル過工程：ゲル過法としては、分子量数十万〜数百万の
間の物質に適用できる分子ふるい担体例えばアガ
ロース（Sepharose 4B、6B）、架橋デキストラ
ン等の高分子多糖体顆粒を利用する。

ポリエチレングリコール分画工程から得られた
HBsAgを含む沈殿タンパク質水溶液を分子ふる
い担体にアプライし、PH６〜８のリン酸緩衝液等
の緩衝液で溶出し、HBsAg画分を回収する。な
お、HBsAg画分の回収は、HBsAg陽性画分を免
疫学的方法によつて検定し、おこなう。

(8) 超遠心分離工程：本工程での超遠心分離方法としては、塩化セシ
ウム直線密度勾配（1.05〜1.35g／cm³）ゾーナル
遠心分離法が好ましく、この方法は具体的には次
の通りである。

まず、密度1.05〜1.35g／cm³の塩化セシウム液
を用いて容量1700mlのゾーナルローター内に密度
勾配を作製する。作製後、前のゲル過工程で得
たHBsAg画分を注入し、次いで前のゲル過工
程で使用したPH６〜８のリン酸緩衝液等の緩衝液
を50〜100ml注入し、30000〜34000r.p.m.、で35
〜40時間超遠心分離を行なう。

HBsAgの回収は、粒子の大きさ18〜24nm、就
中約22nm、1.18〜1.22g／cm³の密度領域より行な
う。

(9) ホルマリンによる不活化処理工程：かくして精製されたHBsAgの濃度を要すれば
300〜500μg／mlになるように調整する。次いで
ホルマリンを終濃度で1/1500〜1/2500になるよう
に加え、たとえば、35〜40℃、94〜98時間置き、
更に２〜10℃で６〜10日間放置する。

かくして得られた不活化HBsAg溶液は、PH６
〜８の0.01〜0.05Mリン酸緩衝液等の緩衝液を用
いて、好ましくは30時間以上透析を行なう。透析
後、要すれば除菌過を行ない、同様の緩衝液に
て、濃度が60〜100μg／mlになるように調整し、
これにマンニツト、乳糖、グリシンなどこの技術
分野で既知の賦形剤を１〜５％ｗ／ｖ添加する。
添加後、小分け分注、凍結乾燥しＢ型肝炎感染予
防用ワクチンを得る。

本発明ワクチンは、その免疫能を高めるため
に、免疫補助剤に吸着させて使用することが好ま
しい。免疫補助剤としては水酸化アルミニウム、
硫酸アルミニウムなどが用いられる。

水酸化アルミニウムなどの免疫補助剤を加えた
ものを凍結乾燥した場合、水酸化アルミニウムゲ
ル粒子に変化がみられるので、本発明ワクチンを
免疫補助剤に吸着させて使用する場合、用時その
凍結乾燥品をまず溶媒（たとえば、1.6％塩化ナ
トリウム液）で溶解し、その後免疫補助剤水懸濁
液（たとえば、水酸化アルミニウム懸濁液）を加
えてHBsAgを吸着させ、注射剤として投与する
ことが好ましい。

従つて、本発明ワクチンは、ワクチン凍結乾燥
品、溶剤、免疫補助剤よりなるキツトの形態とし
ておくことが好ましい。

なお、HBsAgはその98％以上が水酸化アルミ
ニウム懸濁液添加後20秒以内に水酸化アルミニウ
ムに吸着される。

なお、本発明ワクチンは、筋肉、皮下等に（好
ましくは皮下）非経口投与される。

本発明のワクチンは、Ｂ型肝炎の感染性がな
く、また人血漿成分を含まないので極めて安全で
あると共に凍結乾燥品としたので、長期保存が可能であるチメロサール（水銀防腐剤）を含有しない水酸化アルミニウムで懸濁されていないの
で、保存中に析出した不溶性異物を確認できる濃度をかえて用いることができる HBsAg抗原価の測定が可能である（失活の
チエツク）などの特有の効果を有するものである。

実験例本発明ワクチンの安全性を確かめるために、
HBsAgがヒト以外に感染する唯一の動物として
知られているチンパンジーに投与した。投与量は
２頭に20μg（成人１回投与量）、別の２頭に２mg
（成人１回投与量の100倍量）で、いずれも静脈内
に投与した。投与後７カ月の観察期間中、４頭の
チンパンジーは肝機能検査、血液学的検査、肝生
検およびHBsAg検査において正常であり、特に
HBc抗体の発現を認めなかつたことから、安全
であることが証明された。

そこでこのワクチンを少数の健康人志願者に投
与し、臨床第１層試験を行つた。その結果、安全
性確認のための諸検査（副作用、肝機能検査、血
液学的検査）に異常は認められず、またHBsAg
およびHB_c抗体の発現がなかつたことから、この
ワクチンはヒトにおいても安全であることが証明
された。またワクチンの投与を受けた全員に
HBs抗体の産生がみられたことから、このワク
チンはHBsAg感染の予防に有効であることが示
唆された。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれ
らの実施例に限定されるものではない。実施例中
RPHA価は、試料のHB_sA_g抗原価を逆受身赤血
球凝集反応法（特開昭50−12227号）によつてア
ンテイヘブセル（ミドリ十字社製）を用いて測定
した数値である。

実施例１ RPHA法でHBsAg抗原価１：4000を示すプー
ル血漿50lを60℃で10時間加熱後、PHをIN塩酸で
５に調製し、これに硫安を15％飽和になるように
添加し、４℃で60分間撹拌する。次いで60分間静
置後、生成した沈殿を遠心分離（7000r.p.m.、20
分間）により除去し上清を得る。更にこの上清を
IN水酸化ナトリウムでPH７に調整し、これに硫
安を45％飽和になるように添加し、４℃で60分間
撹拌する。次いで、60分間静置した後、生じた沈
殿を遠心分離（7000r.p.m.、20分間）により回収
する。回収した沈殿タンパク質をPH７のリン酸緩
衝液に溶解し、溶解後、ケイ酸アルミン酸マグネ
シウム〔エアロジルR380、Degusa社製〕を2.5％
（ｗ／ｖ）になるように添加し、37℃で３時間撹
拌する。撹拌後、HBsAgを吸着したケイ酸アル
ミン酸マグネシウムを遠心分離（3000r.p.m.、15
分間）により回収する。回収したHB_sA_g吸着ケ
イ酸アルミン酸マグネシウムを0.15Mのエチレン
ジアミン四酢酸と0.15Mの塩化ナトリウムからな
るPH7.5の緩衝液にて洗浄する。洗浄後、0.5％デ
オキシコール酸ナトリウムを含有するPH9.0の緩
衝液で吸着されたHBsAgを溶出する。次いで、
遠心分離（3000r.p.m.、15分間）を行ない
HBsAgの溶出液を回収する。得られる溶出液は、
IN塩酸でPH７に調整し、ポリエチレングリコー
ル（分子量6000）を5.5％（ｗ／ｖ）になるよう
に添加し、４℃で30分間撹拌し、次いで５時間静
置する。静置後、遠心分離（3000r.p.m.、30分
間）し、上清を回収する。得た遠心上清にポリエ
チレングリコールを18％（ｗ／ｖ）になるように
添加し、４℃にて30分間撹拌し、次で18時間静置
する。生じた沈殿タンパク質を遠心分離
（10000r.p.m.、45分間）により回収する。回収し
た沈殿タンパク質をPH７のリン酸緩衝液に溶解す
る。このHBsAgを含有する沈殿タンパク質水溶
液をSepharose4Bを分子ふるい担体としてゲル
過し、PH７のリン酸緩衝液で展開してHBsAg画
分を得る。得られるHBsAg画分を塩化セシウム
直線密度勾配（1.05〜1.35g／cm³）ゾーナル遠心
分離（32000r.p.m.、37時間）により1.18〜
1.22g／cm³の密度領域よりHBsAg画分を回収す
る。回収したHBsAg画分は、400μg／mlの濃度
になるようにPH７のリン酸緩衝液で調整した後、
１／２０００のホルマリン濃度で、37℃に96時間置き、
次いで４℃に８日間放置する。放置後、PH７の
0.02Mリン酸緩衝液に対して透析し、残存するホ
ルマリンを除去して不活化HBsAg溶液を得た。

実施例２実地例１で得た不活化HBsAg溶液の濃度を
80μg／mlに調整し、２％（ｗ／ｖ）マンニツト
添加、除菌過後、10ml容バイアル瓶に2.5mlず
つ小分け分注、凍結乾燥することによりＢ型肝炎
感染予防用ワクチンを得た。

このようにして得られた乾燥Ｂ型肝炎感染予防
用ワクチンには溶剤と免疫補助剤が添付される
が、それらの製造は以下のようにして行つた。溶
剤は1.6％塩化ナトリウム液をアンプルに2.5ml分
注しオートクレーブ滅菌した。免疫補助剤は
「AluGel Ｓ，２％サスペンジヨン」（セルバ
社、西ドイツ）を注射用蒸留水で0.1％濃度とし、
アンプルに2.5ml分注しオートクレーブ滅菌した。

Claims

【特許請求の範囲】

１Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）を含有するヒ
ト血漿タンパク質の水溶液に、50〜70℃、８〜12
時間の加熱処理を施し、処理水溶液から硫安の10
〜20％飽和によつて沈澱するタンパク質を除去
し、次いで硫安の40〜50％飽和によつて沈澱する
タンパク質を集め、その水溶液をコロイド珪酸塩
に接触させて、このコロイド珪酸塩にHBsAgを
吸着させ、吸着されたHBsAgを0.1〜１％デオキ
シコール酸塩を含有するPH8.5〜9.5の緩衝液で溶
出し、得られた溶出液を中性付近に調整し、これ
にポリエチレングリコールを３〜７％（ｗ／ｖ）
加えて、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）と免疫複合
体とを沈澱として除去し、次いで上清のポリエチ
レングリコール濃度を15〜20％（ｗ／ｖ）とし、
HBsAgを沈澱として集め、これをPH６〜８の緩
衝液で平衡化した分子量数十万〜数百万の高分子
物質に適用できるゲル過担体を用いてゲル過
を行ないHBsAg画分を回収し、次いで超遠心分
離により粒子の大きさ18〜24nm、比重1.18〜1.22
ｇ／cm³である一定値のHBsAgを回収し、更にホ
ルマリン農度１／1500〜１／2500で、35〜40℃、
94〜98時間の不活化処理を行ない、次いで２〜６
℃で６〜10日間放置し、得られた不活化HBsAg
をPH６〜８の緩衝液に対して透析後、賦形剤を１
〜５％ｗ／ｖ添加、凍結乾燥し、Ｂ型肝炎の感染
性がなく、人血漿成分を含まないHBsAgを主成
分とするＢ型肝炎感染予防用ワクチンの製造法。