JPS63239234A - ワクチン製剤 - Google Patents
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- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は肝炎ワクチン製剤に川する。
B型肝炎ウィルス(HBV)はヒトの血清肝炎を起すウ
ィルスとして知られ、輸血を要する患者や臨床検査、血
漿製剤に従事する者にしばしば感染し、誠にやっかいな
問題を引き起す。今日HBVはコア抗原(H13CA
Q )と表面抗原(HBSAg)及びe抗原とから成り
立ちコアの中にDNAポリメラーぜを持つ直径約4Qn
mの大型粒子であることが知られておる( W HOテ
クニカルリポートシリーズナンバー570、パイラルへ
パテイテイス(W HOTechnical Repo
rtSeries k570. viral hep
atitis ) 1 9 75〕、又アンチ−HBs
(八nti−l−I B S )がコノHBVの感染
を予防し得ることも既に明らかにされている。
ィルスとして知られ、輸血を要する患者や臨床検査、血
漿製剤に従事する者にしばしば感染し、誠にやっかいな
問題を引き起す。今日HBVはコア抗原(H13CA
Q )と表面抗原(HBSAg)及びe抗原とから成り
立ちコアの中にDNAポリメラーぜを持つ直径約4Qn
mの大型粒子であることが知られておる( W HOテ
クニカルリポートシリーズナンバー570、パイラルへ
パテイテイス(W HOTechnical Repo
rtSeries k570. viral hep
atitis ) 1 9 75〕、又アンチ−HBs
(八nti−l−I B S )がコノHBVの感染
を予防し得ることも既に明らかにされている。
従来HBSAQは、これを含む血漿又は血漿画分を密度
勾配超遠心分離法によって、密度1.20−1.23の
分画を得る方法(J、 L、グリシ、p、 v、ホラン
ド及びR,11,パーセル(J。
勾配超遠心分離法によって、密度1.20−1.23の
分画を得る方法(J、 L、グリシ、p、 v、ホラン
ド及びR,11,パーセル(J。
L、 Gerin、 P、 V、 1lolland
and R,ll’、 Purccll ) :ジャー
ナル オブ バイロロジイ(Journal orVi
rology)第7巻、第569−576ページ(19
71年)及びN、スケノ、R,シラチ、J、ヤマグチ及
びN、イシダ(N、 5ukeno、 R。
and R,ll’、 Purccll ) :ジャー
ナル オブ バイロロジイ(Journal orVi
rology)第7巻、第569−576ページ(19
71年)及びN、スケノ、R,シラチ、J、ヤマグチ及
びN、イシダ(N、 5ukeno、 R。
5hirachi、 J、 Yamaguchi an
d N、 l5hida) :同誌、第9巻、第18
2−183ページ(1972年)〕によって比較的純粋
に得られていた。
d N、 l5hida) :同誌、第9巻、第18
2−183ページ(1972年)〕によって比較的純粋
に得られていた。
更に新しくはアフィニティークロマトグラフィー法が提
案されている(白石仏性、石田名香雄、助野典fa:日
本ウィルス学会抄録昭和48年11月4.5.6日発表
、東京において)。この方法の概要は次の通りである。
案されている(白石仏性、石田名香雄、助野典fa:日
本ウィルス学会抄録昭和48年11月4.5.6日発表
、東京において)。この方法の概要は次の通りである。
精製HBSAGを動物、例えば山羊に免疫して得た山羊
抗HBs血清にHBsAqを含まないヒトの血清を加え
て混在するヒト血清成分に対する抗体を吸収沈澱させ、
上清をl/を酸アンしニウム沈澱分画法によってγ−グ
ロブリン抗HBs(antiHBs)を得る。臭化シア
ンで活性化したセフ70−ス−48(Sepharos
e−4B)とこのan目HBsとをカップリングさせ、
この生成物のカラムを準備する。トIBs/lを含むヒ
ト血漿、又はこれから常法によって分画されたα−及び
β−グロブリン画分を0.01Mリン酸緩衝液に懸濁し
、遠心分離し、得られる上清について上記のカラムを用
いてクロマトグラフィーを行う。カラムに結合したHB
SAGを0.4M−グリシン−HCj! (11H2,
5>!衝液で溶出し、溶出液を0.01Mリン酸緩衝液
に対して透析し、HBSAQ溶液を得る。この溶液を、
前記のカラムと同様に、但し、山羊抗HBs血清を用い
る代りに、動物、例えば馬に免疫して得た周波ヒト血漿
血清を用いる以外は同様にvA製したカラムを用いてク
ロマトグラフィーにかけ、微量に混在する血漿成分をカ
ラムにとどめ精製1−I B SΔQ溶液を通過部分と
して集める。
抗HBs血清にHBsAqを含まないヒトの血清を加え
て混在するヒト血清成分に対する抗体を吸収沈澱させ、
上清をl/を酸アンしニウム沈澱分画法によってγ−グ
ロブリン抗HBs(antiHBs)を得る。臭化シア
ンで活性化したセフ70−ス−48(Sepharos
e−4B)とこのan目HBsとをカップリングさせ、
この生成物のカラムを準備する。トIBs/lを含むヒ
ト血漿、又はこれから常法によって分画されたα−及び
β−グロブリン画分を0.01Mリン酸緩衝液に懸濁し
、遠心分離し、得られる上清について上記のカラムを用
いてクロマトグラフィーを行う。カラムに結合したHB
SAGを0.4M−グリシン−HCj! (11H2,
5>!衝液で溶出し、溶出液を0.01Mリン酸緩衝液
に対して透析し、HBSAQ溶液を得る。この溶液を、
前記のカラムと同様に、但し、山羊抗HBs血清を用い
る代りに、動物、例えば馬に免疫して得た周波ヒト血漿
血清を用いる以外は同様にvA製したカラムを用いてク
ロマトグラフィーにかけ、微量に混在する血漿成分をカ
ラムにとどめ精製1−I B SΔQ溶液を通過部分と
して集める。
HB S A Qを構成するサブユニットについては、
H85Aaをドデシル硫酸ナトリウムおよび2−メルカ
ブトエタノールの存在下加熱し、ゲル濾過分析によって
見い出されるペプチドを検索し、サブユニットは種々の
分子量のポリペプチドを含むことが多くの報告者によっ
て報告されている。すなわち、グリシ(前出)はHBs
Aaは、分子量26.000.32.000及び40,
000のポリペプチドからなることを報告している。そ
の外、それが、25,000及び32.000の分子量
のポリペプチド(G、N、ビャス、[、■、ウィリアム
ス、GGBクラウス及びH,E、ボンド(G。
H85Aaをドデシル硫酸ナトリウムおよび2−メルカ
ブトエタノールの存在下加熱し、ゲル濾過分析によって
見い出されるペプチドを検索し、サブユニットは種々の
分子量のポリペプチドを含むことが多くの報告者によっ
て報告されている。すなわち、グリシ(前出)はHBs
Aaは、分子量26.000.32.000及び40,
000のポリペプチドからなることを報告している。そ
の外、それが、25,000及び32.000の分子量
のポリペプチド(G、N、ビャス、[、■、ウィリアム
ス、GGBクラウス及びH,E、ボンド(G。
N、 Vyas、 E、 W、 WillialS、
GGB にIaus and II。
GGB にIaus and II。
E、 Bond ) : Ifジャーナル オブ イム
ノロシイ(The Journal of Ilmun
olooy )第108巻、第1114−1118ペー
ジ(1972年)〕、39.000.32,000,2
7.000及び22.000のポリペプチド並びに微量
の16,000及びio、oooのもの(G、 R、ド
レスマン、F、 B、ホリンガー、J、 K、スリアノ
、11.s、フジ才力、J、 P、ブルンシュウツヒ及
びJ、 L、メルニク(G、 R,Dressmann
、 F、 B、 1lollinoer、J、 R。
ノロシイ(The Journal of Ilmun
olooy )第108巻、第1114−1118ペー
ジ(1972年)〕、39.000.32,000,2
7.000及び22.000のポリペプチド並びに微量
の16,000及びio、oooのもの(G、 R、ド
レスマン、F、 B、ホリンガー、J、 K、スリアノ
、11.s、フジ才力、J、 P、ブルンシュウツヒ及
びJ、 L、メルニク(G、 R,Dressmann
、 F、 B、 1lollinoer、J、 R。
5uriano、 R,S、 Fujioka、 J、
P、 Brunschwig andJ、 L、 H
e1nik) :ジャーナル オブ パイロ[1シイ、
第10巻、第469−476ページ(1972年)〕及
び分子t!1ioo、oooのポリペプチドを主成分と
し、65,000,36.000及び20,000のも
の(C,R,ハワード及びA。
P、 Brunschwig andJ、 L、 H
e1nik) :ジャーナル オブ パイロ[1シイ、
第10巻、第469−476ページ(1972年)〕及
び分子t!1ioo、oooのポリペプチドを主成分と
し、65,000,36.000及び20,000のも
の(C,R,ハワード及びA。
J、ラッカーマン(C,R,tloward and
A、 J。
A、 J。
丁uckerman ) :ヘバタイテイス メモラン
ダ(tlcpatitis Memoranda
) 、 ト1−576 、 1973年10
月、U、S、A、)のサブユニットから構成されること
が報告されている。又N、スケノ、S。
ダ(tlcpatitis Memoranda
) 、 ト1−576 、 1973年10
月、U、S、A、)のサブユニットから構成されること
が報告されている。又N、スケノ、S。
アイカワ及びN、イシダ(N、 5ukeno、 S、
Aikawaand N、 l5hida )
:同誌、H−292,1972年4月、υ、S、A、’
)は、I−I B s A aを尿素の存在においてド
デシル硫酸す(・リウムによって切断するドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動簡易分子
(至)分析法〔コロウィック−カブラン(Colowi
ck −Kaplan ) :メソード インエンチモ
ロジイ(Method in Enzymology)
第26巻、第3ページ(1972年)〕によってそれが
分子量25,000.28.000及び33.000の
ポリペプチドのサブユニットからなることを報告してい
る。
Aikawaand N、 l5hida )
:同誌、H−292,1972年4月、υ、S、A、’
)は、I−I B s A aを尿素の存在においてド
デシル硫酸す(・リウムによって切断するドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動簡易分子
(至)分析法〔コロウィック−カブラン(Colowi
ck −Kaplan ) :メソード インエンチモ
ロジイ(Method in Enzymology)
第26巻、第3ページ(1972年)〕によってそれが
分子量25,000.28.000及び33.000の
ポリペプチドのサブユニットからなることを報告してい
る。
このようなHBSAgのサブユニットの探索は、そのサ
ブユニツ1−と抗原性の関係を明らかにし、より抗原性
の特異部位を取り出すεとを目的としており、ひいては
効率的なワクチン、試薬の原料としての利用、H8S
A Qの抗原基の研究への利用を図ろうとするものであ
る。
ブユニツ1−と抗原性の関係を明らかにし、より抗原性
の特異部位を取り出すεとを目的としており、ひいては
効率的なワクチン、試薬の原料としての利用、H8S
A Qの抗原基の研究への利用を図ろうとするものであ
る。
本発明の共同研究者等も先に、このHB S A Qの
抗原性をもつサブユニットの回収法として、HBsAq
を脱すビド化(delipidation)することの
できるある種の界面活性剤の存在下で加熱処理すること
によって、)(BSAQとしての抗原性を保持した分子
量約55.000の単一のポリペブタイドのみのサブユ
ニットからなる大きさが約118−20nの均一な球形
粒子 (HaAg55)に変換することができることをt71
示している(特開昭5O−160420)。
抗原性をもつサブユニットの回収法として、HBsAq
を脱すビド化(delipidation)することの
できるある種の界面活性剤の存在下で加熱処理すること
によって、)(BSAQとしての抗原性を保持した分子
量約55.000の単一のポリペブタイドのみのサブユ
ニットからなる大きさが約118−20nの均一な球形
粒子 (HaAg55)に変換することができることをt71
示している(特開昭5O−160420)。
本発明者らはまたHBsAgの抗原性を持つ粒子の回収
法として新たな方法を発明し、その方法によって新規性
状を有する、すなわち等電点pH5,5−6,5、分子
量2−4百万、比重1.80〜1.24、直径180〜
220への球形粒子の高い抗原性を保持した均一な変性
1−I B S A C7粒子を提供することにも成功
している(特開昭53−104724)。
法として新たな方法を発明し、その方法によって新規性
状を有する、すなわち等電点pH5,5−6,5、分子
量2−4百万、比重1.80〜1.24、直径180〜
220への球形粒子の高い抗原性を保持した均一な変性
1−I B S A C7粒子を提供することにも成功
している(特開昭53−104724)。
本発明者らは、これらの成功に引続き、実際にワクチン
として用い得るペプタイドを得るための研究を続けてき
た。
として用い得るペプタイドを得るための研究を続けてき
た。
ワクチンとしては精製して得たHBSAG粒子をそのま
ま用いることもできるが、その場合感染性を有したHB
ウィルスを完全に除去することは殆んど不可能であり、
混入が予測されるHBウィルスをフォルマリンや加熱処
理によって不活性化させる方法が検討されている。しか
し、不活性化したかどううかを証明する方法として、現
在HBウィルスに感染する動物として知られているのは
チンパンジーのみであることから、チンパンジーを用い
たテストが必要となるが、現状では世界中のチンパンジ
ーの数も限られ、経済的にも高価なテストで将来継続し
て不都合なくテストが行えるという保障もない。またH
BSI)粒子のままでは、ヒト血清蛋白の完全な除去も
極めて困難で、これら蛋白が不活性化処理を通じて変性
すればa作用の原因にもなる恐れがある。
ま用いることもできるが、その場合感染性を有したHB
ウィルスを完全に除去することは殆んど不可能であり、
混入が予測されるHBウィルスをフォルマリンや加熱処
理によって不活性化させる方法が検討されている。しか
し、不活性化したかどううかを証明する方法として、現
在HBウィルスに感染する動物として知られているのは
チンパンジーのみであることから、チンパンジーを用い
たテストが必要となるが、現状では世界中のチンパンジ
ーの数も限られ、経済的にも高価なテストで将来継続し
て不都合なくテストが行えるという保障もない。またH
BSI)粒子のままでは、ヒト血清蛋白の完全な除去も
極めて困難で、これら蛋白が不活性化処理を通じて変性
すればa作用の原因にもなる恐れがある。
これに対し、精製HBsAaより分子量の小さいサブユ
ニットを分離してペプタイドを得これをワクチンとする
ことができれば、粒子の大きいHBウィルスの混入して
くる恐れもなく、HB s A a粒子においては何ら
かの親和性でこれより分離が困難であった血清蛋白成分
の分離除去す容易である。
ニットを分離してペプタイドを得これをワクチンとする
ことができれば、粒子の大きいHBウィルスの混入して
くる恐れもなく、HB s A a粒子においては何ら
かの親和性でこれより分離が困難であった血清蛋白成分
の分離除去す容易である。
HBワクチンとして用いられるペプタイドは、HBSA
gの抗原性を有していることが必須である。既に説明し
たように、HBSAにJ粒子はこれに対する化学処理の
僅かな相異によって各種分子量のサブユニットに分離さ
れるが、ワクチンとして用いる場合にはその安全性と有
効性が変動してはならず、またワクチン製剤としての安
定性が確保されなければならないいから一定のポリペブ
タイドであることが最も望ましい。
gの抗原性を有していることが必須である。既に説明し
たように、HBSAにJ粒子はこれに対する化学処理の
僅かな相異によって各種分子量のサブユニットに分離さ
れるが、ワクチンとして用いる場合にはその安全性と有
効性が変動してはならず、またワクチン製剤としての安
定性が確保されなければならないいから一定のポリペブ
タイドであることが最も望ましい。
本発明はこのような事柄を背景としてなされたものであ
り、本発明者らは、HBSI)の抗原性を有する、分子
績18.000〜23,000のベプタイドを得る方法
を発明し、安全且つ有効で安定なるHBワクチン製剤を
提供することに成功した。
り、本発明者らは、HBSI)の抗原性を有する、分子
績18.000〜23,000のベプタイドを得る方法
を発明し、安全且つ有効で安定なるHBワクチン製剤を
提供することに成功した。
本発明は、ヒト血漿より精製して得られるHBsAqを
用い、界面活性剤および還元剤を存在さゼて加熱するこ
とにより、HBSAGをサブユニットのペプタイドに切
断し、これが再重合することのないように、界面活性剤
および還元剤を存在させてゲル濾過法により分画し、分
子量18゜000〜23,000のペプタイドから成る
分画を分別し、用いた界面活性剤を除去するための吸着
補助剤とペプタイドの溶解性を維持するための溶解補助
剤とを用いながら透析して、生理的に受入れられる中性
付近の溶液として回収したペプタイドからなるトIBワ
クチン製剤である。
用い、界面活性剤および還元剤を存在さゼて加熱するこ
とにより、HBSAGをサブユニットのペプタイドに切
断し、これが再重合することのないように、界面活性剤
および還元剤を存在させてゲル濾過法により分画し、分
子量18゜000〜23,000のペプタイドから成る
分画を分別し、用いた界面活性剤を除去するための吸着
補助剤とペプタイドの溶解性を維持するための溶解補助
剤とを用いながら透析して、生理的に受入れられる中性
付近の溶液として回収したペプタイドからなるトIBワ
クチン製剤である。
本発明において用いられるHB87MJとして公知の方
法によって血漿又は血清から純粋に得たちのを用いるこ
とができる。また血漿または血清の代りに、α−及びβ
−グロブリンを含む血漿画分、例えばコーンのアルコー
ル分画法におけるN−1画分もまた原料として好ましい
。
法によって血漿又は血清から純粋に得たちのを用いるこ
とができる。また血漿または血清の代りに、α−及びβ
−グロブリンを含む血漿画分、例えばコーンのアルコー
ル分画法におけるN−1画分もまた原料として好ましい
。
本発明に用いられる界面活性剤としてはドデシル硫酸ナ
トリウムなどのアルキル硫酸エステル塩あるいはアルキ
ルamエステル塩などから選ばれるアニオン界面活性剤
があげられる。界面活性剤の添加量は0.1〜10%、
好ましくは0.5〜2.0%である。アニオン界面活性
剤の添加量は多くてら差しつかえないが濃度が高いと固
体化し易り、シたがって温度を高く保つ゛必要があるの
で好ましくない。
トリウムなどのアルキル硫酸エステル塩あるいはアルキ
ルamエステル塩などから選ばれるアニオン界面活性剤
があげられる。界面活性剤の添加量は0.1〜10%、
好ましくは0.5〜2.0%である。アニオン界面活性
剤の添加量は多くてら差しつかえないが濃度が高いと固
体化し易り、シたがって温度を高く保つ゛必要があるの
で好ましくない。
本発明に用いられる還元剤としては、2−メルカプトエ
タノール、ジチオスレイトール、グリタデオンなどから
選ばれるチオール型還元剤があげられる。還元剤の添加
量は0.1〜10%、好ましくは0.5〜2.0%であ
る。
タノール、ジチオスレイトール、グリタデオンなどから
選ばれるチオール型還元剤があげられる。還元剤の添加
量は0.1〜10%、好ましくは0.5〜2.0%であ
る。
加熱は中性付近の緩衝液中100〜40℃で2〜60分
間、好ましくは100〜90℃で1〜5分間あるいは7
0〜50℃で20〜40分間行う。
間、好ましくは100〜90℃で1〜5分間あるいは7
0〜50℃で20〜40分間行う。
この処理で生成したペプタイドは、界面活性剤および還
元剤が存在しない上限では再結合するのでアニオン界面
活性剤およびチオール基を有した還元剤が存在している
条件においてゲル濾過し、各種の生成したベプタイドを
分子量の大きざによって分画する。
元剤が存在しない上限では再結合するのでアニオン界面
活性剤およびチオール基を有した還元剤が存在している
条件においてゲル濾過し、各種の生成したベプタイドを
分子量の大きざによって分画する。
ゲル濾過は、界面活性剤として例えばドデシル硫酸すト
リウムを0.05〜2%、好ましくは0.1〜0.5%
、および還元剤として例えば2−メルカプトエタノール
0.05〜2%、好ましくは0.1〜0,5%存在せし
めた中性付近の緩衝液を用いて、10〜45℃、好まし
くは15〜25℃にて行なう。
リウムを0.05〜2%、好ましくは0.1〜0.5%
、および還元剤として例えば2−メルカプトエタノール
0.05〜2%、好ましくは0.1〜0,5%存在せし
めた中性付近の緩衝液を用いて、10〜45℃、好まし
くは15〜25℃にて行なう。
ゲル濾過剤としては、セルロース、アガロース、交差結
合デキストランなどの高分子多糖体顆粒あるいは交差結
合ポリアクリルアミドがあげられ、商品名としてはセフ
ァクリル■、セファデック■ ■
■ 。
合デキストランなどの高分子多糖体顆粒あるいは交差結
合ポリアクリルアミドがあげられ、商品名としてはセフ
ァクリル■、セファデック■ ■
■ 。
ス 、セファロース 、Bio−Get P 、 B
+o−GOI A ’等であるが、分子あるい作用を有
する担体であれば、これらに限定されることはない。
+o−GOI A ’等であるが、分子あるい作用を有
する担体であれば、これらに限定されることはない。
ゲル濾過の結果、分子量が約68,000、約27.0
OOJ3よび約22 、0−OC1(7)他カラ成る幾
つかの分画が得られるが、これらのうち分子屋約18,
000〜23,000から成る分画を分取する。
OOJ3よび約22 、0−OC1(7)他カラ成る幾
つかの分画が得られるが、これらのうち分子屋約18,
000〜23,000から成る分画を分取する。
このようにして得られた分画は適当な濃度になるよう濃
縮し、分画に含まれていたアニオン界面活性剤およびチ
オール基を有した還元剤を除去して、生理的に受は入れ
られる溶液とするのであるが、界面活性剤および還元剤
を共に完全に除去してしまうとペプタイドの溶解性が低
下し、その溶液を長期間保管したいような場合沈澱を析
出する恐れがあるので、プルロニックF68、TWQe
n 80などの非イオン界面活性剤から選ばれた溶解補
助剤を溶液中に含有させるようにするのがよい。
縮し、分画に含まれていたアニオン界面活性剤およびチ
オール基を有した還元剤を除去して、生理的に受は入れ
られる溶液とするのであるが、界面活性剤および還元剤
を共に完全に除去してしまうとペプタイドの溶解性が低
下し、その溶液を長期間保管したいような場合沈澱を析
出する恐れがあるので、プルロニックF68、TWQe
n 80などの非イオン界面活性剤から選ばれた溶解補
助剤を溶液中に含有させるようにするのがよい。
濃縮したのちの溶液は、中性付近の緩衝液に対して透析
することにより、加熱反応に用いた界面活性剤と還元剤
とを除去するが、この際完全な除去はかなり困難である
。
することにより、加熱反応に用いた界面活性剤と還元剤
とを除去するが、この際完全な除去はかなり困難である
。
そこで透析外液にプルロニックF 6 B 、Twee
n80などの非イオン性界面活性剤から選ばれた溶解補
助剤を0.01〜0.1%含有し、アニオン界面活性剤
及び還元剤を吸着除去するための吸着剤としてBio−
Rad A G −2<商品名)などの塩基性陰イオン
交換吸着剤を加えたものを用いる。
n80などの非イオン性界面活性剤から選ばれた溶解補
助剤を0.01〜0.1%含有し、アニオン界面活性剤
及び還元剤を吸着除去するための吸着剤としてBio−
Rad A G −2<商品名)などの塩基性陰イオン
交換吸着剤を加えたものを用いる。
このようにして得た溶液は、中性付近の生理的に等張で
、一定量のベプタイド濃度となるように調製し、除菌濾
過したのち、容器に分注してHBワクチン製剤の製造を
完了する。
、一定量のベプタイド濃度となるように調製し、除菌濾
過したのち、容器に分注してHBワクチン製剤の製造を
完了する。
Haワクチン製剤の有効性は、これの
HBSAg抗原力価と共に、これをウサギ、モルモット
等の実験動物に注射してHB S A C2に対する抗
体の産生をみることによって求めることができる。
等の実験動物に注射してHB S A C2に対する抗
体の産生をみることによって求めることができる。
本発明のペプタイドの理化学的特徴は、実施例1で得ら
れたちのを用いて求めた。。
れたちのを用いて求めた。。
(1) 分子量
本発明のペプタイドを、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により分子量を測定した
ところ、約22.000であった。またセファデックス
G−100によるゲル濾過分析では分子mis、ooo
〜23゜OOOであった。従って分子量を18.000
〜23,000の範囲とすることが最も信頼痕が高いと
思われる。
アクリルアミドゲル電気泳動法により分子量を測定した
ところ、約22.000であった。またセファデックス
G−100によるゲル濾過分析では分子mis、ooo
〜23゜OOOであった。従って分子量を18.000
〜23,000の範囲とすることが最も信頼痕が高いと
思われる。
(2J 溶解性
本発明のベプタイドの水に対する溶解性は中性付近で約
5%以下であり、それ以上では蛋白乳濁色を呈するよう
になる。この溶解性は塩化ナトリウム溶液、リン酸塩緩
衝液、トリス−HC1緩衝液においても大差ないが、0
.01〜0.1%程度のプルロニックF68あるいはT
ween 80などの非イオン界面活性剤から選ばれた
溶解補助剤の存在で溶解性は高まる。
5%以下であり、それ以上では蛋白乳濁色を呈するよう
になる。この溶解性は塩化ナトリウム溶液、リン酸塩緩
衝液、トリス−HC1緩衝液においても大差ないが、0
.01〜0.1%程度のプルロニックF68あるいはT
ween 80などの非イオン界面活性剤から選ばれた
溶解補助剤の存在で溶解性は高まる。
(3) 紫外線吸収
本発明のペプタイドの水溶液の280 nn+におnm
は38であった。
は38であった。
(41W度安定性
本発明のベプタイドの0.05%のプルロニックF
68を含有するpH7,2のリン酸塩緩衝液を60℃±
0.5℃で1時冊加熱しても、そのH[3SAGの抗原
性は失われなかった。
68を含有するpH7,2のリン酸塩緩衝液を60℃±
0.5℃で1時冊加熱しても、そのH[3SAGの抗原
性は失われなかった。
(5) 呈色反応
本発明のペプタイドの水溶液につぎ、ローリ−・フォリ
ン法で試験した結果ペプタイド特有の青色を呈した。ま
た6規定塩M溶液中、110℃で22時閂加水分解した
のちニンヒドリン反応で試験した結果、α−アミノ酸に
よる紫青色を呈した。糖類試験のためのα−ナフトール
硫酸反応(Holish反応)およびフェノール硫酸反
応では共に陰性であった。
ン法で試験した結果ペプタイド特有の青色を呈した。ま
た6規定塩M溶液中、110℃で22時閂加水分解した
のちニンヒドリン反応で試験した結果、α−アミノ酸に
よる紫青色を呈した。糖類試験のためのα−ナフトール
硫酸反応(Holish反応)およびフェノール硫酸反
応では共に陰性であった。
(6) 構成アミノ酸
本発明のペプタイドを常法により加水分解して、アミノ
酸自動分析装置を用いて、アミノ酸組成を求めた。結果
は第1表のとおりである。
酸自動分析装置を用いて、アミノ酸組成を求めた。結果
は第1表のとおりである。
第1表
生成HBsAoのアミノ酸組成に対する分析結果も第1
表に含めて示しであるが、この結果と本発明のペプタイ
ドの結果と比べるとき大きな差異は認められない。この
ことからこのペプタイドはHBsAgの主たる部分を構
成していることが推察される。
表に含めて示しであるが、この結果と本発明のペプタイ
ドの結果と比べるとき大きな差異は認められない。この
ことからこのペプタイドはHBsAgの主たる部分を構
成していることが推察される。
(7) 色および形
本発明のペプタイドは、凍結乾燥させたときほぼ白色の
不定形粉末となった。
不定形粉末となった。
本発明を更に具体的に説明するために以下実施例を掲げ
るが、実施例の記載は本発明を何ら限定するものではな
い。
るが、実施例の記載は本発明を何ら限定するものではな
い。
実施例1
HBsAa陽性と判定されたヒト・プール血漿11を、
抗Has抗体グロブリン(ウサギ)結合セファロース4
B (anti−HB s globulinco
upled 5epharose 4 B >で作成し
たカラムを通過させ、HBsAqをカラムに吸着させる
。吸着カラムは0.15M塩化ナトリウム溶液を流して
洗浄後、0.4Mグリシン・H01!1衝液(pH2,
5)でHBsAgを溶出させる。
抗Has抗体グロブリン(ウサギ)結合セファロース4
B (anti−HB s globulinco
upled 5epharose 4 B >で作成し
たカラムを通過させ、HBsAqをカラムに吸着させる
。吸着カラムは0.15M塩化ナトリウム溶液を流して
洗浄後、0.4Mグリシン・H01!1衝液(pH2,
5)でHBsAgを溶出させる。
溶出液は0.15M塩化ナトリウム溶液で透析したのち
、抗ヒト血漿抗体グロブリン(ヤギ)結合セファロース
4Bで作成したカラムを通過させ、と1・血漿成分をカ
ラムに吸着させる。吸着せずに通過した溶液は濃縮した
のち、塩化セシウムによるリニア・グレデイエント超遠
心分離を行い、密度1.19〜1.23の分画を集め、
濃縮して2dとした。
、抗ヒト血漿抗体グロブリン(ヤギ)結合セファロース
4Bで作成したカラムを通過させ、と1・血漿成分をカ
ラムに吸着させる。吸着せずに通過した溶液は濃縮した
のち、塩化セシウムによるリニア・グレデイエント超遠
心分離を行い、密度1.19〜1.23の分画を集め、
濃縮して2dとした。
このものは抗ヒト血漿抗体グロブリン(ウサギ)に対し
て免疫電気泳動を行った結果、ヒト結成成分の存在を認
めず、電子顕微鏡観察で直径22nmの均一なHBSA
Qの小型球形粒子から成り立っており、大型粒子の存在
は認めず、RPHA法による測定で抗原価は1 :1,
280,000であった。回収率は52%であった。こ
の生成Has△9をHBペプタイドワクチンHBの材料
とした。
て免疫電気泳動を行った結果、ヒト結成成分の存在を認
めず、電子顕微鏡観察で直径22nmの均一なHBSA
Qの小型球形粒子から成り立っており、大型粒子の存在
は認めず、RPHA法による測定で抗原価は1 :1,
280,000であった。回収率は52%であった。こ
の生成Has△9をHBペプタイドワクチンHBの材料
とした。
生成HBSAQの溶液に、ドデシル硫酸ナトリウムおよ
び2−メルカプトエタノールをそれぞれ1W/V%濃度
となるように加え、100℃で2分間加熱処理したのち
、別にあらかじめ0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、0
.1% 2−メルカプトエタノールおよび0.15M塩
化ナトリウムを含有する17100 Mリン酸塩緩衝液
、pH7,2で平衡化したセファクリルS−200のカ
ラムを用いて37℃にてゲル濾過した。そのときの分画
像は第1図に示したとおりである。図中、F1〜F5は
それぞれ分画を示す。
び2−メルカプトエタノールをそれぞれ1W/V%濃度
となるように加え、100℃で2分間加熱処理したのち
、別にあらかじめ0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、0
.1% 2−メルカプトエタノールおよび0.15M塩
化ナトリウムを含有する17100 Mリン酸塩緩衝液
、pH7,2で平衡化したセファクリルS−200のカ
ラムを用いて37℃にてゲル濾過した。そのときの分画
像は第1図に示したとおりである。図中、F1〜F5は
それぞれ分画を示す。
第1図のF5分画を集め、1%のBio−Rad A
G2と0.05%のプルロニックF68を含有したリン
MMm液溶液で透析する。透析の終った液は0.05%
プルロニックF68含有0.15M塩化す1〜リウム溶
液を加えて希釈してペプタイドが50μg/dとなるよ
うに調製し、除菌濾過後、1dずつ容器に小分けしたH
Bワクチン製剤370本を得た。
G2と0.05%のプルロニックF68を含有したリン
MMm液溶液で透析する。透析の終った液は0.05%
プルロニックF68含有0.15M塩化す1〜リウム溶
液を加えて希釈してペプタイドが50μg/dとなるよ
うに調製し、除菌濾過後、1dずつ容器に小分けしたH
Bワクチン製剤370本を得た。
このようにして得たHBワクヂンを3匹のウサギに注射
した。注射は1回0.5dを背部皮下および皮肉に行い
2週間151陽で3回注射したのち2週間後に採血し、
その血漿につきP HΔ法でHBS抗体価を測定したと
ころ、それぞれ1:512.1 :2,048.1 :
16.000のHBS抗体産生を認めた。
した。注射は1回0.5dを背部皮下および皮肉に行い
2週間151陽で3回注射したのち2週間後に採血し、
その血漿につきP HΔ法でHBS抗体価を測定したと
ころ、それぞれ1:512.1 :2,048.1 :
16.000のHBS抗体産生を認めた。
実施例2
実施例1の精製HBsAgを用い、実施例1で用いた2
−メルカプトエタノールの代りにジチオスレイトールを
用いて60℃、30分間加熱処理したのち、別にあらか
じめ0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、0.1%ジチオ
スレイトールおよび0.15M塩化ナトリウムを含有す
る1/100IVIリンMj[衝液、pl+7.2で平
衡化したセファデックスG200のカラムを用いて37
℃にてゲル濾過した。実施例1と同様にしてF3分画を
集め、実施例1と同様に操作して1−IBワクチン製剤
245本を得た。
−メルカプトエタノールの代りにジチオスレイトールを
用いて60℃、30分間加熱処理したのち、別にあらか
じめ0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、0.1%ジチオ
スレイトールおよび0.15M塩化ナトリウムを含有す
る1/100IVIリンMj[衝液、pl+7.2で平
衡化したセファデックスG200のカラムを用いて37
℃にてゲル濾過した。実施例1と同様にしてF3分画を
集め、実施例1と同様に操作して1−IBワクチン製剤
245本を得た。
このものの2匹のウサギに対するH B s抗体産生は
、それぞれ1 :1.024であった。
、それぞれ1 :1.024であった。
実施例3
実施例1において、F5分画を集めに再ゲル濾過して混
在しているF4分画成分を完全に分離したものにつき0
.05%のTWOOn 80を含有した0、15M塩化
ナトリウム溶液で透析したのち同じ液で希釈してベプタ
イドが50μび/dとなるように調製した。この液に0
.1%の水酸化アルミニウムを加え、除菌濾過後、1d
ずつ容器に小分(プしたHBワクチン製剤390本を得
た。
在しているF4分画成分を完全に分離したものにつき0
.05%のTWOOn 80を含有した0、15M塩化
ナトリウム溶液で透析したのち同じ液で希釈してベプタ
イドが50μび/dとなるように調製した。この液に0
.1%の水酸化アルミニウムを加え、除菌濾過後、1d
ずつ容器に小分(プしたHBワクチン製剤390本を得
た。
このようにして得たトIBワクチンを3匹のモルモット
に注射した。注射は実施例1と同様にして行った。結果
はそれぞれのモルモットに7:1゜024.1 :16
.000.1 :32,000のトIBs抗体産生を認
めた。
に注射した。注射は実施例1と同様にして行った。結果
はそれぞれのモルモットに7:1゜024.1 :16
.000.1 :32,000のトIBs抗体産生を認
めた。
第1図は私製1−I B Sへ〇のゲル濾過の分画像で
ある。
ある。
Claims (1)
- (1)HBsAg B型肝炎ウィルス表面抗原を界面活
性剤と還元剤とを存在させて加熱処理し、界面活性剤と
還元剤とを存在させてゲル濾過した後に、塩基性陰イオ
ン交換吸着剤と非イオン性界面活性剤を含有する中性付
近の緩衝液を外液として透析することにより得られる、
次の理化学的性質を有するペプタイドを含有するB型肝
炎ウィルス感染防止のためのワクチン製剤。 a)分子量:SDS−ポリアクリルアミドによる電気泳
動分析で、18,000〜2 3,000である。 b)溶解性:水に対する溶解性は、中性付近において約
5%以下であり、それ以上で は蛋白乳濁色を呈する。 c)紫外線吸収:280nmにおける分子吸光係数(E
^1^%_1_c_m)は、38である。 d)温度安定性:水溶液を60℃±0.5℃で1時間加
熱してもその抗原性は失われ ない。 e)呈色反応:ローリー・フオリン反応によりペプタイ
ドの、また加水分解後ニンヒ ドリン反応によりアミノ酸の呈色反 応を示す。 f)構成アミノ酸:アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、 グリシン、アラニン、システイン、 バリン、メチオニン、イソロイシン、 ロイシン、チロジン、フェニルアラ ニン、リジン、ヒスチジン、アルギ ニン g)色および形;ほぼ白色、不定形である。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP628688A JPS63239234A (ja) | 1988-01-14 | 1988-01-14 | ワクチン製剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP628688A JPS63239234A (ja) | 1988-01-14 | 1988-01-14 | ワクチン製剤 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4405879A Division JPS55136233A (en) | 1979-04-11 | 1979-04-11 | Hb peptide vaccine |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63239234A true JPS63239234A (ja) | 1988-10-05 |
Family
ID=11634148
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP628688A Pending JPS63239234A (ja) | 1988-01-14 | 1988-01-14 | ワクチン製剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63239234A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100339150B1 (ko) * | 2000-11-29 | 2002-06-01 | 성재갑 | 비형 간염 바이러스 게놈 디엔에이의 정제 방법 |
-
1988
- 1988-01-14 JP JP628688A patent/JPS63239234A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PROC.NATL ACAD.SCI U.S.A=1977 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100339150B1 (ko) * | 2000-11-29 | 2002-06-01 | 성재갑 | 비형 간염 바이러스 게놈 디엔에이의 정제 방법 |
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