JPS6345645B2 - - Google Patents
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Description
本発明は肝炎Ｂに関するものであり、更に詳細
には肝炎Ｂ抗原およびワクチンとして使用される
肝炎Ｂ抗原の精製方法に関するものである。 肝炎Ｂはウイルス性肝炎の二つのタイプの一種
であり肝臓において発生する主な病理学的変化で
全身系感染を生じるものである。この病気は主に
成人を冒し、ウイルスの長期間担体からの感染の
伝播により多く維持される。蔓延の通常の方法は
輸血切り傷または掻き傷で破られた皮膚を通して
汚染された針および注射針、未消毒の歯科用器械
並びに噴霧注入された感染血液への唾液、性病接
触または露出による。 タイプＢ肝炎の潜伏期は比較的長く即ち６週間
から６ケ月が感染と臨床症状の初期との間に経過
する。病気は、通常疲労および食欲欠乏で始まり
しばしば筋通および腹部不快を伴う。後に黄疽、
黒色尿白色便および弱い肝腫が出現する。ある場
合には、開始期が熱、悪寒および白血球増多に関
連して早い黄疽の出現で迅速となる。他の場合に
は、黄疽は認められず患者は“インフルエンザ様
（flulike）”病気とだけ気付いている。大多数の
肝炎感染は軽い無黄疽病を生じることが推定され
る。 質的にウイルス性肝炎Ａに類似しているけれど
も病気は、血液または他の臨床標本（唾液、尿、
胆汁、便）中のオーストラリア抗原粒子〔現在
HBsAg（表面抗原）と呼称される〕の出現で容易
に診断される。感染された固体の血液中に球形粒
子の比較的大きな集団（1014−1015／ml）を生じ
る。粒子は直径18−22nｍであり、肝炎Ｂ（現在
HBVと呼称される）のウイルスである42nｍデ
イン（Dane）粒子の表面と同様の抗原決定因子
を有する。 米国特許第3735004号には、煮沸感染性血清が
子供にワクチンを接種するために使用され
HBsAgに対する抗体（抗HBs）を生じかかる血
清が攻撃に対して保護を提供したことが示されて
いる。使用された煮沸血清の用量は１×1012HBs
粒子に相当している。かかる血清の受血者は臨床
または生化学的の病気に発展しなかつた。しかし
かかる血清はその不純な性質再現性の欠如および
非定量のためワクチンとしての使用に適しない。 従つて肝炎Ｂに対するワクチンを供することが
本発明の目的である。第二の目的は異質の望まし
くない蛋白質および／または抗原を除去すること
によつて肝炎Ｂ抗原を精製することにある。更に
目的としては肝炎Ｂ抗原から異質の望ましくない
蛋白質または抗原を除去する方法を提供すること
にある。なお更に別の目的はワクチンとして精製
肝炎Ｂ抗原を服用するための製薬剤の調製を提供
することにある。本発明のこれらのおよび他の目
的は次の説明から明白となる。 肝炎Ｂ抗原を含有する清澄血漿からの部分精製
濃縮物は次の操作順序をうけしめる。即ち (1) 濃縮物はペプシンが活性な範囲のPHでペプシ
ンで処理される。 (2) 濃縮物は尿素で処理される。そして (3) 必要があれば濃縮物はホルムアルデヒドで処
理される。 得られた生成物の異質の望ましくない蛋白質お
よび／または抗原から分離された高精製、再現性
のある特性化された肝炎Ｂ抗原はワクチンとして
有用である。 本発明の精製肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）とし
ての出発物質は供与体から例えば血漿泳動法によ
つて得られた血漿である。抗原のレベルはラジオ
インムノアツセイ法、受動血球凝集素反応または
補体結合反応による公知の方法で測定される。血
漿は冷却され生成する寒性析出物は軽い遠心分離
によつて除去される。HBgAgを含有する残存清
澄血漿は同密度帯（isopycnio banding）、レー
トゾナルバンデイング（rate zonal banding）、
または例えばポリエチレングリコール、硫酸アン
モニウム、硫酸ナトリウム等による沈殿などの技
術の１種またはそれ以上によつて濃縮される。こ
の部分精製濃縮物は本発明の出発物質である。 同密度帯において部分精製濃縮物は、必要とさ
れる特異抗原密度を包含する密度勾配を持つ液状
媒質と接触される。液状媒質は次いで個々の密度
に従つて密度勾配により血清成分の平衡分配を得
るために超遠心分離に供される。次いで媒質の連
続フラクシヨンは置換されそれから希望する抗原
を含むフラクシヨンが分離される。オーストラリ
ア抗原の精製に対するこの技術はドイツ明細書第
2049515号および米国特許第3636191号に記載され
ている。 レートゾナルバンデイングにおいて、部分精製
濃縮物は密度勾配を有する液状媒質と接触して超
遠心分離に供されるが、この時は、平衡が得られ
ないような速度および期間でレートゾナル技術が
使用される。そしてHBsAgおよび他の残留血清
成分は媒質における沈降係数に従つて媒質に分布
される。 該処理方法において使用される液状物質は適当
な範囲のいかなる密度勾配であつてもよい。かか
る溶液の好適な溶質は例えばシヨ糖、臭化カリウ
ム、塩化セシウム、臭化ナトリウム、酒石酸カリ
ウム等を包含する。同密度帯段階は通常遠心分離
機例えばエレクトロヌクレオニクス−Ｋ
（Electronucleonics−Ｋ）中で固定回転子を生理
食塩水で充たし、次いで段階勾配が形成するまで
上昇する密度の液状媒質溶液の部分標本
（aliqnots）で上向きに生理食塩水を置換するこ
とによつて行なわれる。 血漿は底部から最も密度の高い溶液を置換する
回転子の頭部に導入される。遠心分離機は最初の
再定位置（initial reorientation phase）の間撹
拌することを妨げる速度にプログラムされた速度
制御系により導かれる。平衡が得られ生成物が固
有の密度位にある時回転子はともの配置に再定位
する撹拌を妨げるために同一系で速力が減じられ
る。次いで勾配が下から排出され固有密度カツト
が収集される。同様な技術がレートゾナルバンデ
イングで使用される。この帯からの固有密度カツ
トが肝炎Ｂ抗原の部分精製濃縮物である。 部分精製濃縮物の蛋白質濃度はそれから無菌の
発熱物質のないリン酸塩緩衝食塩（PBS）の添
加でml当り約40〜200ミクログラムに調節される。
次いで溶液は約PH２〜４に好ましくはHClで約25
℃で酸性化される。 精製ペプシン水溶液好ましくは結晶性ペプシン
から調製された溶液が蛋白質約40〜500ミクログ
ラム当りペプシン約１ミクログラム含有するよう
に添加される。溶液はペプシンによる異質の蛋白
質の消化が完結するまで代表的には約30〜38℃の
表面で約８〜24時間培誉される。次いで溶液は塩
基例らばNaOHの添加で約PH７に導かれる。ペ
プシン消化物質は約５℃で限外過によつて濃縮
され尿素は最終濃度が蛋白質性物質を解離するの
に有効になるまで代表的には約4M〜8M、（好ま
しくは高精製結晶性グレード）添加される。次に
混合物はさらに精製するために上昇温度で代表的
には約30〜38℃で約16〜24時間培養される。 培養混合液は過で清澄化され尿素、ペプシン
およびペプシン消化残遺物を除去するためにカラ
ムでクロマトグラフ処理される。カラムはカラム
と相溶する無菌の発熱物質のない生理学的に認め
られる緩衝液例えばPBS、NaH2PO4と
Na2HPO4の混合液あるいは三つのもので溶離さ
れる。公知の方法例えばラジオインムノアツセイ
法、補体結合反応および紫外線分光測定で
HBsAgを含有することが同定されたフラクシヨ
ンはプールされ無菌の発熱物質のない生理学的に
認められる緩衝液（そのいくつかの具体例は上記
に示した）でmlにつき約20ミクログラムHBsAg
のレベルに希釈される。希釈プールされたフラク
シヨンは殺菌過される。過されたバツチに必
要があればホルムアルデヒドが不活性化ウイルス
に公知の濃度例えばmlにつき約50〜200ミクログ
ラムで添加される。次いで混合液は約30〜38℃で
約50〜100時間培養される。生理学的に使用でき
る中和剤例えばHaHSO4の無菌溶液はホルムア
ルデヒドを実質的に中和するために添加される。
材料は無菌的にガラスバイアルに調合され将来の
使用のために貯蔵される。 本発明の精製肝炎Ｂ表面抗原は高精製再現性生
成物であり、粒子サイズ直径約18〜22nｍ、Ｅ１％ 278nm代表的には約52〜54図に示される通りのUV
スペクトルを有する特性を与えるものである。 次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の
実施例に制約されるものではない。 実施例 １ 遠心分離機エレクトロヌレオニクスＫの回転子
をリン酸緩衝液8400mlで充填した。系を脱ガスす
るために回転子を10000rpmまで回転させた後、
下記の段階勾配（step gradient）を静止回転子
の底部にポンプで注入した。 １ 10％NaBf 2400ml ρ＝1.08 ２ 20％NaBr 1000ml ρ＝1.17 ３ 30％NaBr 1500ml ρ＝1.28 ４ 40％NaBr 3500ml ρ＝1.41 オーストラリア抗原を含有する血漿1750mlを回
転子の底部から40％NaBr1750mlを置換しながら
静止回転子の頭部にポンプで注入した。回転子を
30000rpmに加速しこの速度で４時間行なつた。
次いで回転子を止め40％NaBr1750mlを回転子の
底部に血漿を頭部に押出しながら注入した。オー
ストラリア抗原を含有する追加の新鮮な血漿1750
mlを回転子の頭部に40％NaBrの等量を回転子の
底部から置換しながら注入した。次いで回転子を
30000rpmで18時間回転させた。回転子を停止し
た後、密度域1.21〜1.24のHBsAgに富む物質1000
mlを収集し脱ガスしたリン酸塩緩衝液に対して透
析した。次いで回転子を上記の脱ガスしたリン酸
塩緩衝液で充填し下記の段階勾配を静止回転子の
底部に注入した。 １ ５％シヨ糖 2400ml ρ＝1.02 ２ 10％シヨ糖 1750ml ρ＝1.06 ３ 25％シヨ糖 1750ml ρ＝1.10 ４ 50％シヨ糖 2500ml ρ＝1.23 NaBr同密度の帯状段階からHBsAgに富む物
質1000mlを回転子の底部から50％シヨ糖1000mlを
置換しながら回転子頭部に注入した。次いで回転
子を28000rpmで18時間回転させた。回転子を停
止した後密度域1135〜1165のHBsAgに富む物質
を収集した。次いでこの生成物を物質56リツトル
を生じるようにミリリツトル当り40ミクログラム
蛋白質に希釈した。希釈剤はリン酸塩緩衝食塩で
ある。40μｇ／mlに肝炎Ｂ抗原（HBsAg）を部
分精製した帯状遠心分離機（Zonal centrifuge）
の56リツトルバツチを室温で1N塩酸を撹拌しな
がら添加してPH２に酸化した。１mg／ml結晶ペプ
シンの蒸留水水溶液56mlを添加した。ペプシンの
最終濃度は1μｇ／mlであつた。HBsAgバツチを
37℃で16時間培養し1N水酸化ナトリウムの添加
でPH７に添加した。 ペプシン消化バツチをXM100A膜を備えたア
ミコン（Amicon）装置を用いて限外過で295
倍に濃縮した。ペプシン減成非抗原プロテインは
限外液中に通過したがHBsAg粒子は保持され
た。固形尿素を濃縮物に添加し４〜８モル尿素溶
液を生成し次いで37℃で更に16時間培溶した。尿
素処理HBsAg濃縮物をフアイバグラスフイルタ
ーを通す過によつて清澄しセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−150クロマトグラフ処理した。
抗原を空隙容積（void volume）で溶離し尿素、
ペプシンおよび他の蛋白質不純物を遊離せしめ
た。精製HBsAgを含有するフラクシヨンを使用
レベルに希釈し無菌過した。ホルマリンを36℃
で72時間90〜100μｇ／mlの濃度に添加し、更に
伝染性ビールス存在の可能性に対して確実にし
た。ホルマリン処理の終りに過剰のホルムアルデ
ヒドを重亜硫酸ナトリウムで中和した。精製した
生成物は帯状遠心分離開始物質に対してE1％23.8
に比較してE1％52.3を有している。精製した生成
物は直径18〜22nｍおよび添付の図面に示される
通りUVスペクトルを有する球状粒子からなるも
のである。 精製、生物学的物理学的特性の要旨は次表に示
される。
には肝炎Ｂ抗原およびワクチンとして使用される
肝炎Ｂ抗原の精製方法に関するものである。 肝炎Ｂはウイルス性肝炎の二つのタイプの一種
であり肝臓において発生する主な病理学的変化で
全身系感染を生じるものである。この病気は主に
成人を冒し、ウイルスの長期間担体からの感染の
伝播により多く維持される。蔓延の通常の方法は
輸血切り傷または掻き傷で破られた皮膚を通して
汚染された針および注射針、未消毒の歯科用器械
並びに噴霧注入された感染血液への唾液、性病接
触または露出による。 タイプＢ肝炎の潜伏期は比較的長く即ち６週間
から６ケ月が感染と臨床症状の初期との間に経過
する。病気は、通常疲労および食欲欠乏で始まり
しばしば筋通および腹部不快を伴う。後に黄疽、
黒色尿白色便および弱い肝腫が出現する。ある場
合には、開始期が熱、悪寒および白血球増多に関
連して早い黄疽の出現で迅速となる。他の場合に
は、黄疽は認められず患者は“インフルエンザ様
（flulike）”病気とだけ気付いている。大多数の
肝炎感染は軽い無黄疽病を生じることが推定され
る。 質的にウイルス性肝炎Ａに類似しているけれど
も病気は、血液または他の臨床標本（唾液、尿、
胆汁、便）中のオーストラリア抗原粒子〔現在
HBsAg（表面抗原）と呼称される〕の出現で容易
に診断される。感染された固体の血液中に球形粒
子の比較的大きな集団（1014−1015／ml）を生じ
る。粒子は直径18−22nｍであり、肝炎Ｂ（現在
HBVと呼称される）のウイルスである42nｍデ
イン（Dane）粒子の表面と同様の抗原決定因子
を有する。 米国特許第3735004号には、煮沸感染性血清が
子供にワクチンを接種するために使用され
HBsAgに対する抗体（抗HBs）を生じかかる血
清が攻撃に対して保護を提供したことが示されて
いる。使用された煮沸血清の用量は１×1012HBs
粒子に相当している。かかる血清の受血者は臨床
または生化学的の病気に発展しなかつた。しかし
かかる血清はその不純な性質再現性の欠如および
非定量のためワクチンとしての使用に適しない。 従つて肝炎Ｂに対するワクチンを供することが
本発明の目的である。第二の目的は異質の望まし
くない蛋白質および／または抗原を除去すること
によつて肝炎Ｂ抗原を精製することにある。更に
目的としては肝炎Ｂ抗原から異質の望ましくない
蛋白質または抗原を除去する方法を提供すること
にある。なお更に別の目的はワクチンとして精製
肝炎Ｂ抗原を服用するための製薬剤の調製を提供
することにある。本発明のこれらのおよび他の目
的は次の説明から明白となる。 肝炎Ｂ抗原を含有する清澄血漿からの部分精製
濃縮物は次の操作順序をうけしめる。即ち (1) 濃縮物はペプシンが活性な範囲のPHでペプシ
ンで処理される。 (2) 濃縮物は尿素で処理される。そして (3) 必要があれば濃縮物はホルムアルデヒドで処
理される。 得られた生成物の異質の望ましくない蛋白質お
よび／または抗原から分離された高精製、再現性
のある特性化された肝炎Ｂ抗原はワクチンとして
有用である。 本発明の精製肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）とし
ての出発物質は供与体から例えば血漿泳動法によ
つて得られた血漿である。抗原のレベルはラジオ
インムノアツセイ法、受動血球凝集素反応または
補体結合反応による公知の方法で測定される。血
漿は冷却され生成する寒性析出物は軽い遠心分離
によつて除去される。HBgAgを含有する残存清
澄血漿は同密度帯（isopycnio banding）、レー
トゾナルバンデイング（rate zonal banding）、
または例えばポリエチレングリコール、硫酸アン
モニウム、硫酸ナトリウム等による沈殿などの技
術の１種またはそれ以上によつて濃縮される。こ
の部分精製濃縮物は本発明の出発物質である。 同密度帯において部分精製濃縮物は、必要とさ
れる特異抗原密度を包含する密度勾配を持つ液状
媒質と接触される。液状媒質は次いで個々の密度
に従つて密度勾配により血清成分の平衡分配を得
るために超遠心分離に供される。次いで媒質の連
続フラクシヨンは置換されそれから希望する抗原
を含むフラクシヨンが分離される。オーストラリ
ア抗原の精製に対するこの技術はドイツ明細書第
2049515号および米国特許第3636191号に記載され
ている。 レートゾナルバンデイングにおいて、部分精製
濃縮物は密度勾配を有する液状媒質と接触して超
遠心分離に供されるが、この時は、平衡が得られ
ないような速度および期間でレートゾナル技術が
使用される。そしてHBsAgおよび他の残留血清
成分は媒質における沈降係数に従つて媒質に分布
される。 該処理方法において使用される液状物質は適当
な範囲のいかなる密度勾配であつてもよい。かか
る溶液の好適な溶質は例えばシヨ糖、臭化カリウ
ム、塩化セシウム、臭化ナトリウム、酒石酸カリ
ウム等を包含する。同密度帯段階は通常遠心分離
機例えばエレクトロヌクレオニクス−Ｋ
（Electronucleonics−Ｋ）中で固定回転子を生理
食塩水で充たし、次いで段階勾配が形成するまで
上昇する密度の液状媒質溶液の部分標本
（aliqnots）で上向きに生理食塩水を置換するこ
とによつて行なわれる。 血漿は底部から最も密度の高い溶液を置換する
回転子の頭部に導入される。遠心分離機は最初の
再定位置（initial reorientation phase）の間撹
拌することを妨げる速度にプログラムされた速度
制御系により導かれる。平衡が得られ生成物が固
有の密度位にある時回転子はともの配置に再定位
する撹拌を妨げるために同一系で速力が減じられ
る。次いで勾配が下から排出され固有密度カツト
が収集される。同様な技術がレートゾナルバンデ
イングで使用される。この帯からの固有密度カツ
トが肝炎Ｂ抗原の部分精製濃縮物である。 部分精製濃縮物の蛋白質濃度はそれから無菌の
発熱物質のないリン酸塩緩衝食塩（PBS）の添
加でml当り約40〜200ミクログラムに調節される。
次いで溶液は約PH２〜４に好ましくはHClで約25
℃で酸性化される。 精製ペプシン水溶液好ましくは結晶性ペプシン
から調製された溶液が蛋白質約40〜500ミクログ
ラム当りペプシン約１ミクログラム含有するよう
に添加される。溶液はペプシンによる異質の蛋白
質の消化が完結するまで代表的には約30〜38℃の
表面で約８〜24時間培誉される。次いで溶液は塩
基例らばNaOHの添加で約PH７に導かれる。ペ
プシン消化物質は約５℃で限外過によつて濃縮
され尿素は最終濃度が蛋白質性物質を解離するの
に有効になるまで代表的には約4M〜8M、（好ま
しくは高精製結晶性グレード）添加される。次に
混合物はさらに精製するために上昇温度で代表的
には約30〜38℃で約16〜24時間培養される。 培養混合液は過で清澄化され尿素、ペプシン
およびペプシン消化残遺物を除去するためにカラ
ムでクロマトグラフ処理される。カラムはカラム
と相溶する無菌の発熱物質のない生理学的に認め
られる緩衝液例えばPBS、NaH2PO4と
Na2HPO4の混合液あるいは三つのもので溶離さ
れる。公知の方法例えばラジオインムノアツセイ
法、補体結合反応および紫外線分光測定で
HBsAgを含有することが同定されたフラクシヨ
ンはプールされ無菌の発熱物質のない生理学的に
認められる緩衝液（そのいくつかの具体例は上記
に示した）でmlにつき約20ミクログラムHBsAg
のレベルに希釈される。希釈プールされたフラク
シヨンは殺菌過される。過されたバツチに必
要があればホルムアルデヒドが不活性化ウイルス
に公知の濃度例えばmlにつき約50〜200ミクログ
ラムで添加される。次いで混合液は約30〜38℃で
約50〜100時間培養される。生理学的に使用でき
る中和剤例えばHaHSO4の無菌溶液はホルムア
ルデヒドを実質的に中和するために添加される。
材料は無菌的にガラスバイアルに調合され将来の
使用のために貯蔵される。 本発明の精製肝炎Ｂ表面抗原は高精製再現性生
成物であり、粒子サイズ直径約18〜22nｍ、Ｅ１％ 278nm代表的には約52〜54図に示される通りのUV
スペクトルを有する特性を与えるものである。 次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の
実施例に制約されるものではない。 実施例 １ 遠心分離機エレクトロヌレオニクスＫの回転子
をリン酸緩衝液8400mlで充填した。系を脱ガスす
るために回転子を10000rpmまで回転させた後、
下記の段階勾配（step gradient）を静止回転子
の底部にポンプで注入した。 １ 10％NaBf 2400ml ρ＝1.08 ２ 20％NaBr 1000ml ρ＝1.17 ３ 30％NaBr 1500ml ρ＝1.28 ４ 40％NaBr 3500ml ρ＝1.41 オーストラリア抗原を含有する血漿1750mlを回
転子の底部から40％NaBr1750mlを置換しながら
静止回転子の頭部にポンプで注入した。回転子を
30000rpmに加速しこの速度で４時間行なつた。
次いで回転子を止め40％NaBr1750mlを回転子の
底部に血漿を頭部に押出しながら注入した。オー
ストラリア抗原を含有する追加の新鮮な血漿1750
mlを回転子の頭部に40％NaBrの等量を回転子の
底部から置換しながら注入した。次いで回転子を
30000rpmで18時間回転させた。回転子を停止し
た後、密度域1.21〜1.24のHBsAgに富む物質1000
mlを収集し脱ガスしたリン酸塩緩衝液に対して透
析した。次いで回転子を上記の脱ガスしたリン酸
塩緩衝液で充填し下記の段階勾配を静止回転子の
底部に注入した。 １ ５％シヨ糖 2400ml ρ＝1.02 ２ 10％シヨ糖 1750ml ρ＝1.06 ３ 25％シヨ糖 1750ml ρ＝1.10 ４ 50％シヨ糖 2500ml ρ＝1.23 NaBr同密度の帯状段階からHBsAgに富む物
質1000mlを回転子の底部から50％シヨ糖1000mlを
置換しながら回転子頭部に注入した。次いで回転
子を28000rpmで18時間回転させた。回転子を停
止した後密度域1135〜1165のHBsAgに富む物質
を収集した。次いでこの生成物を物質56リツトル
を生じるようにミリリツトル当り40ミクログラム
蛋白質に希釈した。希釈剤はリン酸塩緩衝食塩で
ある。40μｇ／mlに肝炎Ｂ抗原（HBsAg）を部
分精製した帯状遠心分離機（Zonal centrifuge）
の56リツトルバツチを室温で1N塩酸を撹拌しな
がら添加してPH２に酸化した。１mg／ml結晶ペプ
シンの蒸留水水溶液56mlを添加した。ペプシンの
最終濃度は1μｇ／mlであつた。HBsAgバツチを
37℃で16時間培養し1N水酸化ナトリウムの添加
でPH７に添加した。 ペプシン消化バツチをXM100A膜を備えたア
ミコン（Amicon）装置を用いて限外過で295
倍に濃縮した。ペプシン減成非抗原プロテインは
限外液中に通過したがHBsAg粒子は保持され
た。固形尿素を濃縮物に添加し４〜８モル尿素溶
液を生成し次いで37℃で更に16時間培溶した。尿
素処理HBsAg濃縮物をフアイバグラスフイルタ
ーを通す過によつて清澄しセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−150クロマトグラフ処理した。
抗原を空隙容積（void volume）で溶離し尿素、
ペプシンおよび他の蛋白質不純物を遊離せしめ
た。精製HBsAgを含有するフラクシヨンを使用
レベルに希釈し無菌過した。ホルマリンを36℃
で72時間90〜100μｇ／mlの濃度に添加し、更に
伝染性ビールス存在の可能性に対して確実にし
た。ホルマリン処理の終りに過剰のホルムアルデ
ヒドを重亜硫酸ナトリウムで中和した。精製した
生成物は帯状遠心分離開始物質に対してE1％23.8
に比較してE1％52.3を有している。精製した生成
物は直径18〜22nｍおよび添付の図面に示される
通りUVスペクトルを有する球状粒子からなるも
のである。 精製、生物学的物理学的特性の要旨は次表に示
される。
【表】
【表】
実施例 ２
本発明の肝炎Ｂ表面抗原20ミクログラムを含有
する一回用量（1.0ml）を皮下注射した時６匹の
チンパンジーのグループから４匹が抗体を発現し
た。４週間隔で２回同種の追加量の後、６匹のチ
ンパンジーのうち５匹が抗体を発現した。 実施例 ３ 16匹のチンパンジーを３群に分配した。Ａ群
（６匹のチンパンジー）はBOB肝炎Ｂビールス
1.0mlを静脈接種した。Ｂ群（４匹のチンパンジ
ー）は本発明の肝炎Ｂ表面抗原1.0mlを静脈接種
した。Ｃ群（６匹のチンパンジー）はコントロー
ル群であり接触しなかつた。Ａ群の全チンパンジ
ーは40週以内で明らかな臨床肝炎Ｂ感染（アンテ
イグネミア（antignemia）、酵素高位（enzyme
elevation）および／または抗体反応のいずれか）
を有した。Ｂ群またはＣ群のチンパンジーはいず
れも同様の40週間を超えても明白な臨床肝炎Ｂ感
染を示さなかつた。 実施例 ４ グリベツトモンキー（grivet monkey）の三つ
のグループ（各グループに６匹のモンキー）を本
発明の抗原の変量を含有する1.0ml用量で４週間
隔で３回皮下注射した。次表は各々注射で各グル
ープに服用した投与量および全体のうちの動物の
数を示すものであり、そのうちのグループは次の
注射の前に抗体形成を示すか、４週以内で最後の
注射を行なうものである。
する一回用量（1.0ml）を皮下注射した時６匹の
チンパンジーのグループから４匹が抗体を発現し
た。４週間隔で２回同種の追加量の後、６匹のチ
ンパンジーのうち５匹が抗体を発現した。 実施例 ３ 16匹のチンパンジーを３群に分配した。Ａ群
（６匹のチンパンジー）はBOB肝炎Ｂビールス
1.0mlを静脈接種した。Ｂ群（４匹のチンパンジ
ー）は本発明の肝炎Ｂ表面抗原1.0mlを静脈接種
した。Ｃ群（６匹のチンパンジー）はコントロー
ル群であり接触しなかつた。Ａ群の全チンパンジ
ーは40週以内で明らかな臨床肝炎Ｂ感染（アンテ
イグネミア（antignemia）、酵素高位（enzyme
elevation）および／または抗体反応のいずれか）
を有した。Ｂ群またはＣ群のチンパンジーはいず
れも同様の40週間を超えても明白な臨床肝炎Ｂ感
染を示さなかつた。 実施例 ４ グリベツトモンキー（grivet monkey）の三つ
のグループ（各グループに６匹のモンキー）を本
発明の抗原の変量を含有する1.0ml用量で４週間
隔で３回皮下注射した。次表は各々注射で各グル
ープに服用した投与量および全体のうちの動物の
数を示すものであり、そのうちのグループは次の
注射の前に抗体形成を示すか、４週以内で最後の
注射を行なうものである。
【表】
重要なことには、動物の50％以上が２ミクログ
ラムの服用量レベルでワクチンの３回量の後抗体
反応を示した。 実施例 ５ モルモツト（guinea pig）の三群（各グループ
14匹）を本発明の抗原の変量を含有する1.0ml量
で0.14および56日間隔で皮下注射した。次表は各
グループに服用した投与量各注射薬および全体の
うちの動物数を示すものでありそのうち、グルー
プは０、28、56および84日に試験した時の抗体形
成を示すものである。
ラムの服用量レベルでワクチンの３回量の後抗体
反応を示した。 実施例 ５ モルモツト（guinea pig）の三群（各グループ
14匹）を本発明の抗原の変量を含有する1.0ml量
で0.14および56日間隔で皮下注射した。次表は各
グループに服用した投与量各注射薬および全体の
うちの動物数を示すものでありそのうち、グルー
プは０、28、56および84日に試験した時の抗体形
成を示すものである。
【表】
重要なことは、モルモツトの80％以上が0.5ミ
クログラムの服用量レベルでワクチンの３回量の
抗体形成を示した。
クログラムの服用量レベルでワクチンの３回量の
抗体形成を示した。
図面は本発明の肝炎Ｂ抗原の紫外線スペクトル
を示すものである。
を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 粒子サイズ直径約18〜22nｍ、Ｅ１％ 278nm約52
〜54および実質的に図に示される通りのUVスペ
クトルを有する精製肝炎Ｂ表面抗原を生理的に使
用し得る無菌の発熱物質のない緩衝液中に含有す
ることを特徴とする肝炎Ｂからの保護に有効なワ
クチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/577,483 US4017360A (en) | 1975-05-14 | 1975-05-14 | Method for purifying hepatitis B antigen |
| US577483 | 1990-09-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58180432A JPS58180432A (ja) | 1983-10-21 |
| JPS6345645B2 true JPS6345645B2 (ja) | 1988-09-12 |
Family
ID=24308922
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51054486A Granted JPS51139619A (en) | 1975-05-14 | 1976-05-14 | Hepatisis b vaccine |
| JP58028652A Granted JPS58180432A (ja) | 1975-05-14 | 1983-02-24 | 肝炎ｂワクチン |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51054486A Granted JPS51139619A (en) | 1975-05-14 | 1976-05-14 | Hepatisis b vaccine |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4017360A (ja) |
| JP (2) | JPS51139619A (ja) |
| AU (1) | AU504454B2 (ja) |
| BE (1) | BE841811A (ja) |
| CA (1) | CA1066191A (ja) |
| CH (1) | CH629668A5 (ja) |
| CY (1) | CY1034A (ja) |
| DE (1) | DE2621276A1 (ja) |
| DK (1) | DK145347C (ja) |
| ES (1) | ES447858A1 (ja) |
| FR (1) | FR2315947A1 (ja) |
| GB (1) | GB1488774A (ja) |
| HK (1) | HK86779A (ja) |
| NL (1) | NL188621C (ja) |
| SE (1) | SE431161B (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE437329B (sv) * | 1975-03-14 | 1985-02-25 | Community Blood Council | Sett att ur blodserum framstella vaccin mot virushepatit |
| US4129646A (en) * | 1976-11-02 | 1978-12-12 | Merck & Co., Inc. | Isolating hepatitis B Dane particles |
| GB1554811A (en) * | 1977-02-23 | 1979-10-31 | Merck & Co Inc | Purifying hepatitis b surface antigen |
| DE2964132D1 (en) * | 1978-05-08 | 1983-01-05 | Merck & Co Inc | A process for the direct extraction of small size particles of up to 50 nm from a protein aceous liquid |
| US4217418A (en) * | 1978-05-08 | 1980-08-12 | Merck & Co., Inc. | Recovery of small particles by flow centrifugation |
| ZA792485B (en) * | 1978-06-07 | 1980-06-25 | New York Blood Center Inc | Vaccine for active immunization containing hepatitis b surface and/or e-antigens |
| US4181713A (en) * | 1978-10-30 | 1980-01-01 | Merck & Co., Inc. | Isolation of HBs Ag |
| US4395395A (en) * | 1979-05-21 | 1983-07-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Detection of non-A, non-B hepatitis associated antigen |
| DE2935634C2 (de) * | 1979-09-04 | 1981-12-10 | Battelle-Institut E.V., 6000 Frankfurt | Tiermodell zur Prüfung der Inaktivierung von Impfstoffen gegen Virushepatitis Typ B und zur Prüfung von Chemotherapeutika gegen Virushepatitis Typ A |
| FR2470795A1 (fr) * | 1979-12-07 | 1981-06-12 | Pasteur Institut | Procede de purification de particules d'origine biologique, notamment de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b (aghbs) et les produits obtenus |
| US4349539A (en) * | 1980-08-15 | 1982-09-14 | Merck & Co., Inc. | Separation of hepatitis B surface antigen |
| PL133476B1 (en) * | 1981-06-10 | 1985-06-29 | Akad Medyczna | Method of obtaining pure antigen hba from human serum |
| AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
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