JPS6112894B2 - - Google Patents
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- JPS6112894B2 JPS6112894B2 JP51054486A JP5448676A JPS6112894B2 JP S6112894 B2 JPS6112894 B2 JP S6112894B2 JP 51054486 A JP51054486 A JP 51054486A JP 5448676 A JP5448676 A JP 5448676A JP S6112894 B2 JPS6112894 B2 JP S6112894B2
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Description
本発明は肝炎Ｂに関するものであり、更に詳細
には肝炎Ｂ抗原およびワクチンとして使用される
肝炎Ｂ抗原の精製方法に関するものである。 肝炎Ｂはウイルス性肝炎の二つのタイプの一種
であり肝臓において発生する主な病理学的変化で
全身系感染を生じるものである。この病気は主に
成人を冒し、ウイルスの長期間担体からの感染の
伝播により多く維持される。蔓延の通常の方法は
輪血切り傷または掻き傷で破られた皮膚を通して
汚染された針および注射針、未消毒の歯科用器械
並びに噴霧注入された感染血液への唾液、性病接
触または露出による。 タイプＢ肝炎の潜伏期は比較的長く即ち６週間
から６カ月間が感染と臨床症状の初期との間に経
過する。病気は、通常疲労および食欲欠乏で始ま
りしばしば筋痛および腹部不快を伴う。後に黄
疽、黒色尿白色便および弱い肝腫が出現する。あ
る場合には、開始期が熱、悪寒および白血球増多
に関連して早い黄疽の出現で迅速となる。他の場
合には、黄疽は認められず患者は“インフルエン
ザ様（flu−like）”病気とだけ気付いている。大
多数の肝炎感染は軽い無黄疽病を生じることが推
定される。 質的にウイルス性肝炎Ａに類似しているけれど
も病気は、血液または他の臨床標本（唾液、尿、
胆汁、便）中のオーストラリア抗原粒子〔現在
HBs Ag（表面抗原）と呼称される〕の出現で容
易に診断される。感染された固体の血液中に球形
粒子の比較的大きな集団（1014−1015／ml）を生
じる。粒子は直径18−22nｍであり、肝炎Ｂ（現
在HBVと呼称される）のウイルスである42nｍデ
イン（Dane）粒子の表面と同様の抗原決定因子
を有する。 米国特許第3735004号には、煮沸感染性血清が
子供にワクチンを接種するために使用され
HBsAgに対する抗体（抗HBs）を生じかかる血
清が攻撃に対して保護を提供したことが示されて
いる。使用された煮沸血清の用量は約１×
1012HBs粒子に相当している。かかる血清の受血
者は臨床または生化学的の病気に発展しなかつ
た。しかしかかる血清はその不純な性質再現性の
欠如および非定量のためワクチンとしての使用に
適しない。 従つて肝炎Ｂに対するワクチンを供することが
本発明の目的である。第二の目的は異質の望まし
くない蛋白質および／または抗原を除去すること
によつて肝炎Ｂ抗原を精製することにある。更に
目的としては肝炎Ｂ抗原から異質の望ましくない
蛋白質または抗原を除去する方法を提供すること
にある。なお更に別の目的はワクチンとして精製
肝炎Ｂ抗原を服用するための製薬剤の調製を提供
することにある。本発明のこれらのおよび他の目
的は次の説明から明白となる。 肝炎Ｂ抗原を含有する清澄血漿からの部分精製
濃縮物は次の操作順序をうけしめる。即ち (1) 濃縮物はペプシンが活性な範囲のPHでペプシ
ンで処理される。 (2) 濃縮物は尿素で処理される。そして (3) 必要があれば濃縮物はホルムアルデヒドで処
理される。 得られた生成物の異質の望ましくない蛋白質お
よび／または抗原から分離された高精製、再現性
のある特性化された肝炎Ｂ抗原はワクチンとして
有用である。 本発明の精製肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）とし
ての出発物質は供与体から例えば血漿泳動法によ
つて得られた血漿である。抗原のレベルはラジオ
イムノアツセイ法、受動血球凝集素反応または補
体結合反応による公知の方法で測定される。血漿
は冷却され生成する寒性析出物は軽い遠心分離に
よつて除去される。HBsAgを含有する残存清澄
血漿は同密度帯（isopycnic banding）、レートゾ
ナルバンデイング（rate zonal banding）、また
は例えばポリエチレングリコール、硫酸アンモニ
ウム、硫酸ナトリウム等による沈殿などの技術の
１種またはそれ以上によつて濃縮される。この部
分精製濃縮物は本発明の出発物質である。 同密度帯において、部分精製濃縮物は、必要と
される特異抗原密度を包含する密度勾配を持つ液
状媒質と接触される。液状媒質は次いで個々の密
度に従つて密度勾配により血清成分の平衡分配を
得るために超遠心分離に供される。次いで媒質の
連続フラクシヨンは置換されそれから希望する抗
原を含むフラクシヨンが分離される。オーストラ
リア抗原の精製に対するこの技術の応用はドイツ
明細書第2049515号および米国特許第3636191号に
記載されている。 レートゾナルバンデイングにおいて、部分精製
濃縮物は密度勾配を有する液状媒質と接触して超
遠心分離に供されるが、この時は、平衡が得られ
ないような速度および期間でレートゾナル技術が
使用される。そしてHBsAgおよび他の残留血清
成分は媒質における沈降係数に従つて媒質に分布
される。 該処理方法において使用される液状媒質は適当
な範囲のいかなる密度勾配であつてもよい。かか
る溶液の好適な溶質は例えばシヨ糖、臭化カリウ
ム、塩化セシウム、臭化ナトリウム、酒石酸カリ
ウム等を包含する。同密度帯段階は通常遠心分離
機例えばエレクトロヌクレオニクス−Ｋ
（Electronucleonics−Ｋ）中で固定ローターを生
理食塩水で充たし、次いで段階勾配が形成するま
で上昇する密度の液状媒質溶液の部分標本
（aliquots）で上向きに生理食塩水を置換するこ
とによつて行なわれる。 血漿は底部から最も密度の高い溶液を置換する
ローターの頭部に導入される。遠心分離は、初期
再配向期の際の混合を防ぐために、その遠心速度
がプログラムされた制御系において行なわれる。
平衡に達し、生成物が固有の密度位になつた時、
ローターを減速させていくのであるが、上記と同
一系によりその速度を制御することにより、もと
の状態に再配向するときの混ざり合いを防ぐこと
ができる。次いで勾配が下から排出され固有密度
断面が収集される。同様な技術がレートゾナルバ
ンデイングで使用される。この帯からの固有密度
断面が肝炎Ｂ抗原の部分精製濃縮物である。 部分精製濃縮物の蛋白質濃度はそれから無菌の
発熱分質のないリン酸塩緩衝食塩（PBS）の添加
でml当り約40〜200ミクログラムに調節される。
次いで溶液は約PH２〜４に好ましくはHClで約25
℃で酸性化される。 精製ペプシン水溶液好ましくは結晶性ペプシン
から調製された溶液が蛋白質約40〜500ミクログ
ラム当りペプシン約１ミクログラム含有するよう
に添加される。溶液はペプシンによる異質の蛋白
質の消化が完結するまで代表的には約30〜38℃の
温度で約８〜24時間培養される。次いで溶液は塩
基例えばNaOHの添加で約PH７に導かれる。ペプ
シン消化物質は約５℃で限外濾過によつて濃縮さ
れ尿素は最終濃度が蛋白質性物質を解離するのに
有効になるまで代表的には約4M〜8M、（好まし
くは高精製結晶性グレード）添加される。次に混
合液はさらに精製するために上昇温度で代表的に
は約30〜38℃で約16〜24時間保たれる。 その反応混合液は濾過で清澄化され尿素、ペプ
シンおよびペプシン消化残遺物を除去するために
カラムでクロマトグラフ処理される。カラムはカ
ラムと相溶する無菌の発熱物質のない生理学的に
認められる緩衝液例えばPBS、NaH2PO4と
Na2PO4の混合液あるいは三つのもので溶離され
る。公知の方法例えばラジオイムノアツセイ法、
補体結合反応および紫外線分光測定でHBsAgを
含有することが同定されたフラクシヨンはプール
され無菌の発熱物質のない生理学的に認められる
緩衝液（そのいくつかの具体例は上記に示した）
でmlにつき約20ミクログラムHBsAgのレベルに
希釈される。希釈プールされたフラクシヨンは除
菌濾過される。濾過されたバツチに必要があれば
ホルムアルデヒドが不活性化ウイルスに公知の濃
度例えばmlにつき約50〜200ミクログラムで添加
される。次いで混合液は約30〜38℃で約50〜100
時間培養される。生理学的に使用できる中和剤例
えばNaHSO4の無菌溶液はホルムアルデヒドを実
質的に中和するために添加される。材料は無菌的
にガラスバイアルに調合され将来の使用のために
貯蔵される。 本発明の精製肝炎Ｂ表面抗原は高精製再現性生
成物であり、粒子サイズ直径約18〜22nｍ、Ｅ
１％２７８ｏｍ代表的には約52〜54であり、図に示され
る
通りのUVスペクトルを有する特性を与えるもの
である。 次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の
実施例に制約されるものではない。 実施例 １ 遠心分離機エレクトロヌレオニクスＫのロータ
ーをリン酸塩緩衝液8400mlに充填した。系を脱ガ
スするためにローターを10000rpmまで回転させ
た後、下記の段階勾配を密度が小さいものから順
に、静止ローターの底部にポンプで注入した。 １ 10％NaBr 2400ml ρ＝1.08 ２ 20％NaBr 1000ml ρ＝1.17 ３ 30％NaBr 1500ml ρ＝1.28 ４ 40％NaBr 3500ml ρ＝1.41 オーストラリア抗原を含有する血漿1750mlをロ
ーターの底部から40％NaBr1750mlを置換しなが
ら静止ローターの頭部にポンプで注入した。ロー
ターを30000rpmに加速しこの速度で４時間行な
つた。次いでローターを止め40％NaBr1750mlを
ローターの底部に血漿を頭部に押出しながら注入
した。オーストラリア抗原を含有する追加の新鮮
な血漿1750mlをローターの頭部に40％NaBrの等
量をローターの底部から置換しながら注入した。
次いでローターを30000rpmで18時間回転させ
た。ローターを停止した後、密度域1.21〜1.24の
HBsAgに富む物質1000mlを収集し脱ガスしたリ
ン酸塩緩衝液に対して透析した。次いでローター
を上記の脱ガスしたリン酸塩緩衝液で充填し下記
の段階勾配を静止ローターの底部に注入した。 １ ５％シヨ糖 2400ml ρ＝1.02 ２ 15％シヨ糖 1750ml ρ＝1.06 ３ 25％シヨ糖 1750ml ρ＝1.10 ４ 50％シヨ糖 2500ml ρ＝1.23 NaBr同密度の帯状段階からHBsAgに富む物質
1000mlをローターの底部から50％シヨ糖1000mlを
置換しながらローター頭部に注入した。次いでロ
ーターを28000rpmで18時間回転させた。ロータ
ーを停止した後密度域1.135〜1.165のHBsAgに富
む物質を収集した。次いでこの生成物を物質56リ
ツトルを生じるようにミリリツトル当り40ミクロ
グラム蛋白質に希釈した。希釈剤はリン酸塩緩衝
食塩である。ゾーン遠心分離により部分精製され
た肝炎Ｂ抗原（HBsAg）の56リツトルバツチ
（40μｇ/ml）を室温でIN塩酸を撹拌しながら添
加してPH２に酸性化した。１mg/ml結晶ペプシン
の蒸留水水溶液56mlを添加した。ペプシンの最終
濃度は１μｇ/mlであつた。HBsAgバツチを37℃
で16時間培養し1N水酸化ナトリウムの添加でPH
７に添加した。 ペプシン消化バツチをXM100A膜を備えたアミ
コン（Amicon）装置を用いて限外濾過で295倍に
濃縮した。ペプシン減成非抗原プロテインは限外
濾液中に膜を通過したがHBsAg粒子は保持され
た。固形尿素を濃縮物に添加し４〜８モル尿素溶
液を生成し次いで37℃で更に16時間培養した。尿
素処理HBsAg濃縮物をフアイバグラスフイルタ
ーを通す濾過によつて清澄しセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−150でクロマトグラフ処理し
た。抗原を空隙容積（voidvolume）で溶離し尿
素、ペプシンおよび他の蛋白質不純物を遊離せし
めた。精製HBsAgを含有するフラクシヨンを使
用レベルに希釈し無菌濾過した。ホルマリンを36
℃で72時間90〜100μｇ/mlの濃度に添加し、更に
伝染性ビールス存在の可能性に対して確実にし
た。ホルマリン処理の終りに過剰のホルムアルデ
ヒドを重亜硫酸ナトリウムで中和した。精製した
生成物は帯状遠心分離開始物質に対してE1％23.8
に比較してE1％52.3を有している。精製した生成
物は直径18〜22nｍおよび添付の図面に示される
通りUVスペクトルを有する球状粒子からなるも
のである。 精製、生物学的物理学的特性の要旨は次表に示
される。
には肝炎Ｂ抗原およびワクチンとして使用される
肝炎Ｂ抗原の精製方法に関するものである。 肝炎Ｂはウイルス性肝炎の二つのタイプの一種
であり肝臓において発生する主な病理学的変化で
全身系感染を生じるものである。この病気は主に
成人を冒し、ウイルスの長期間担体からの感染の
伝播により多く維持される。蔓延の通常の方法は
輪血切り傷または掻き傷で破られた皮膚を通して
汚染された針および注射針、未消毒の歯科用器械
並びに噴霧注入された感染血液への唾液、性病接
触または露出による。 タイプＢ肝炎の潜伏期は比較的長く即ち６週間
から６カ月間が感染と臨床症状の初期との間に経
過する。病気は、通常疲労および食欲欠乏で始ま
りしばしば筋痛および腹部不快を伴う。後に黄
疽、黒色尿白色便および弱い肝腫が出現する。あ
る場合には、開始期が熱、悪寒および白血球増多
に関連して早い黄疽の出現で迅速となる。他の場
合には、黄疽は認められず患者は“インフルエン
ザ様（flu−like）”病気とだけ気付いている。大
多数の肝炎感染は軽い無黄疽病を生じることが推
定される。 質的にウイルス性肝炎Ａに類似しているけれど
も病気は、血液または他の臨床標本（唾液、尿、
胆汁、便）中のオーストラリア抗原粒子〔現在
HBs Ag（表面抗原）と呼称される〕の出現で容
易に診断される。感染された固体の血液中に球形
粒子の比較的大きな集団（1014−1015／ml）を生
じる。粒子は直径18−22nｍであり、肝炎Ｂ（現
在HBVと呼称される）のウイルスである42nｍデ
イン（Dane）粒子の表面と同様の抗原決定因子
を有する。 米国特許第3735004号には、煮沸感染性血清が
子供にワクチンを接種するために使用され
HBsAgに対する抗体（抗HBs）を生じかかる血
清が攻撃に対して保護を提供したことが示されて
いる。使用された煮沸血清の用量は約１×
1012HBs粒子に相当している。かかる血清の受血
者は臨床または生化学的の病気に発展しなかつ
た。しかしかかる血清はその不純な性質再現性の
欠如および非定量のためワクチンとしての使用に
適しない。 従つて肝炎Ｂに対するワクチンを供することが
本発明の目的である。第二の目的は異質の望まし
くない蛋白質および／または抗原を除去すること
によつて肝炎Ｂ抗原を精製することにある。更に
目的としては肝炎Ｂ抗原から異質の望ましくない
蛋白質または抗原を除去する方法を提供すること
にある。なお更に別の目的はワクチンとして精製
肝炎Ｂ抗原を服用するための製薬剤の調製を提供
することにある。本発明のこれらのおよび他の目
的は次の説明から明白となる。 肝炎Ｂ抗原を含有する清澄血漿からの部分精製
濃縮物は次の操作順序をうけしめる。即ち (1) 濃縮物はペプシンが活性な範囲のPHでペプシ
ンで処理される。 (2) 濃縮物は尿素で処理される。そして (3) 必要があれば濃縮物はホルムアルデヒドで処
理される。 得られた生成物の異質の望ましくない蛋白質お
よび／または抗原から分離された高精製、再現性
のある特性化された肝炎Ｂ抗原はワクチンとして
有用である。 本発明の精製肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）とし
ての出発物質は供与体から例えば血漿泳動法によ
つて得られた血漿である。抗原のレベルはラジオ
イムノアツセイ法、受動血球凝集素反応または補
体結合反応による公知の方法で測定される。血漿
は冷却され生成する寒性析出物は軽い遠心分離に
よつて除去される。HBsAgを含有する残存清澄
血漿は同密度帯（isopycnic banding）、レートゾ
ナルバンデイング（rate zonal banding）、また
は例えばポリエチレングリコール、硫酸アンモニ
ウム、硫酸ナトリウム等による沈殿などの技術の
１種またはそれ以上によつて濃縮される。この部
分精製濃縮物は本発明の出発物質である。 同密度帯において、部分精製濃縮物は、必要と
される特異抗原密度を包含する密度勾配を持つ液
状媒質と接触される。液状媒質は次いで個々の密
度に従つて密度勾配により血清成分の平衡分配を
得るために超遠心分離に供される。次いで媒質の
連続フラクシヨンは置換されそれから希望する抗
原を含むフラクシヨンが分離される。オーストラ
リア抗原の精製に対するこの技術の応用はドイツ
明細書第2049515号および米国特許第3636191号に
記載されている。 レートゾナルバンデイングにおいて、部分精製
濃縮物は密度勾配を有する液状媒質と接触して超
遠心分離に供されるが、この時は、平衡が得られ
ないような速度および期間でレートゾナル技術が
使用される。そしてHBsAgおよび他の残留血清
成分は媒質における沈降係数に従つて媒質に分布
される。 該処理方法において使用される液状媒質は適当
な範囲のいかなる密度勾配であつてもよい。かか
る溶液の好適な溶質は例えばシヨ糖、臭化カリウ
ム、塩化セシウム、臭化ナトリウム、酒石酸カリ
ウム等を包含する。同密度帯段階は通常遠心分離
機例えばエレクトロヌクレオニクス−Ｋ
（Electronucleonics−Ｋ）中で固定ローターを生
理食塩水で充たし、次いで段階勾配が形成するま
で上昇する密度の液状媒質溶液の部分標本
（aliquots）で上向きに生理食塩水を置換するこ
とによつて行なわれる。 血漿は底部から最も密度の高い溶液を置換する
ローターの頭部に導入される。遠心分離は、初期
再配向期の際の混合を防ぐために、その遠心速度
がプログラムされた制御系において行なわれる。
平衡に達し、生成物が固有の密度位になつた時、
ローターを減速させていくのであるが、上記と同
一系によりその速度を制御することにより、もと
の状態に再配向するときの混ざり合いを防ぐこと
ができる。次いで勾配が下から排出され固有密度
断面が収集される。同様な技術がレートゾナルバ
ンデイングで使用される。この帯からの固有密度
断面が肝炎Ｂ抗原の部分精製濃縮物である。 部分精製濃縮物の蛋白質濃度はそれから無菌の
発熱分質のないリン酸塩緩衝食塩（PBS）の添加
でml当り約40〜200ミクログラムに調節される。
次いで溶液は約PH２〜４に好ましくはHClで約25
℃で酸性化される。 精製ペプシン水溶液好ましくは結晶性ペプシン
から調製された溶液が蛋白質約40〜500ミクログ
ラム当りペプシン約１ミクログラム含有するよう
に添加される。溶液はペプシンによる異質の蛋白
質の消化が完結するまで代表的には約30〜38℃の
温度で約８〜24時間培養される。次いで溶液は塩
基例えばNaOHの添加で約PH７に導かれる。ペプ
シン消化物質は約５℃で限外濾過によつて濃縮さ
れ尿素は最終濃度が蛋白質性物質を解離するのに
有効になるまで代表的には約4M〜8M、（好まし
くは高精製結晶性グレード）添加される。次に混
合液はさらに精製するために上昇温度で代表的に
は約30〜38℃で約16〜24時間保たれる。 その反応混合液は濾過で清澄化され尿素、ペプ
シンおよびペプシン消化残遺物を除去するために
カラムでクロマトグラフ処理される。カラムはカ
ラムと相溶する無菌の発熱物質のない生理学的に
認められる緩衝液例えばPBS、NaH2PO4と
Na2PO4の混合液あるいは三つのもので溶離され
る。公知の方法例えばラジオイムノアツセイ法、
補体結合反応および紫外線分光測定でHBsAgを
含有することが同定されたフラクシヨンはプール
され無菌の発熱物質のない生理学的に認められる
緩衝液（そのいくつかの具体例は上記に示した）
でmlにつき約20ミクログラムHBsAgのレベルに
希釈される。希釈プールされたフラクシヨンは除
菌濾過される。濾過されたバツチに必要があれば
ホルムアルデヒドが不活性化ウイルスに公知の濃
度例えばmlにつき約50〜200ミクログラムで添加
される。次いで混合液は約30〜38℃で約50〜100
時間培養される。生理学的に使用できる中和剤例
えばNaHSO4の無菌溶液はホルムアルデヒドを実
質的に中和するために添加される。材料は無菌的
にガラスバイアルに調合され将来の使用のために
貯蔵される。 本発明の精製肝炎Ｂ表面抗原は高精製再現性生
成物であり、粒子サイズ直径約18〜22nｍ、Ｅ
１％２７８ｏｍ代表的には約52〜54であり、図に示され
る
通りのUVスペクトルを有する特性を与えるもの
である。 次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の
実施例に制約されるものではない。 実施例 １ 遠心分離機エレクトロヌレオニクスＫのロータ
ーをリン酸塩緩衝液8400mlに充填した。系を脱ガ
スするためにローターを10000rpmまで回転させ
た後、下記の段階勾配を密度が小さいものから順
に、静止ローターの底部にポンプで注入した。 １ 10％NaBr 2400ml ρ＝1.08 ２ 20％NaBr 1000ml ρ＝1.17 ３ 30％NaBr 1500ml ρ＝1.28 ４ 40％NaBr 3500ml ρ＝1.41 オーストラリア抗原を含有する血漿1750mlをロ
ーターの底部から40％NaBr1750mlを置換しなが
ら静止ローターの頭部にポンプで注入した。ロー
ターを30000rpmに加速しこの速度で４時間行な
つた。次いでローターを止め40％NaBr1750mlを
ローターの底部に血漿を頭部に押出しながら注入
した。オーストラリア抗原を含有する追加の新鮮
な血漿1750mlをローターの頭部に40％NaBrの等
量をローターの底部から置換しながら注入した。
次いでローターを30000rpmで18時間回転させ
た。ローターを停止した後、密度域1.21〜1.24の
HBsAgに富む物質1000mlを収集し脱ガスしたリ
ン酸塩緩衝液に対して透析した。次いでローター
を上記の脱ガスしたリン酸塩緩衝液で充填し下記
の段階勾配を静止ローターの底部に注入した。 １ ５％シヨ糖 2400ml ρ＝1.02 ２ 15％シヨ糖 1750ml ρ＝1.06 ３ 25％シヨ糖 1750ml ρ＝1.10 ４ 50％シヨ糖 2500ml ρ＝1.23 NaBr同密度の帯状段階からHBsAgに富む物質
1000mlをローターの底部から50％シヨ糖1000mlを
置換しながらローター頭部に注入した。次いでロ
ーターを28000rpmで18時間回転させた。ロータ
ーを停止した後密度域1.135〜1.165のHBsAgに富
む物質を収集した。次いでこの生成物を物質56リ
ツトルを生じるようにミリリツトル当り40ミクロ
グラム蛋白質に希釈した。希釈剤はリン酸塩緩衝
食塩である。ゾーン遠心分離により部分精製され
た肝炎Ｂ抗原（HBsAg）の56リツトルバツチ
（40μｇ/ml）を室温でIN塩酸を撹拌しながら添
加してPH２に酸性化した。１mg/ml結晶ペプシン
の蒸留水水溶液56mlを添加した。ペプシンの最終
濃度は１μｇ/mlであつた。HBsAgバツチを37℃
で16時間培養し1N水酸化ナトリウムの添加でPH
７に添加した。 ペプシン消化バツチをXM100A膜を備えたアミ
コン（Amicon）装置を用いて限外濾過で295倍に
濃縮した。ペプシン減成非抗原プロテインは限外
濾液中に膜を通過したがHBsAg粒子は保持され
た。固形尿素を濃縮物に添加し４〜８モル尿素溶
液を生成し次いで37℃で更に16時間培養した。尿
素処理HBsAg濃縮物をフアイバグラスフイルタ
ーを通す濾過によつて清澄しセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−150でクロマトグラフ処理し
た。抗原を空隙容積（voidvolume）で溶離し尿
素、ペプシンおよび他の蛋白質不純物を遊離せし
めた。精製HBsAgを含有するフラクシヨンを使
用レベルに希釈し無菌濾過した。ホルマリンを36
℃で72時間90〜100μｇ/mlの濃度に添加し、更に
伝染性ビールス存在の可能性に対して確実にし
た。ホルマリン処理の終りに過剰のホルムアルデ
ヒドを重亜硫酸ナトリウムで中和した。精製した
生成物は帯状遠心分離開始物質に対してE1％23.8
に比較してE1％52.3を有している。精製した生成
物は直径18〜22nｍおよび添付の図面に示される
通りUVスペクトルを有する球状粒子からなるも
のである。 精製、生物学的物理学的特性の要旨は次表に示
される。
【表】
実施例 ２
本発明の肝炎Ｂ表面抗原20ミクログラムを含有
する一回用量（1.0ml）を皮下注射した時６匹の
チンパンジーのグループから４匹が抗体を発現し
た。４週間隔で２回同種の追加量の後、６匹のチ
ンパンジーのうち５匹が抗体を発現した。 実施例 ３ 本発明の肝炎Ｂ表面抗原の感染性の有無に関す
るテストを以下のように行なつた。 16匹のチンパンジーを３群に分配した。Ａ群
（６匹のチンパンジー）はBOB肝炎Ｂビールス1.0
mlを静脈接種した。Ｂ群（４匹のチンパンジー）
は本発明の肝炎Ｂ表面抗原1.0mlを静脈接種し
た。Ｃ群（６匹のチンパンジー）はコントロール
群であり接種しなかつた。Ａ群の全チンパンジー
は40週以内で明らかな臨床肝炎Ｂ感染（アンテイ
グネミア（antignemia）、酵素活性向上
（enzymeelevation）および／または抗体反応の
いずれか）を有した。Ｂ群またはＣ群のチンパン
ジーはいずれも同様の40週間を超えても明白な臨
床肝炎Ｂ感染を示さなかつた。 実施例 ４ グリベツトモンキー（grivet monkey）の三つ
のグリープ（各グループに６匹のモンキー）を本
発明の抗原の変量を含有する1.0ml用量で４週間
隔で３回皮下注射した。次表は各々注射で各グル
ープに服用した投与量および全体のうちの動物の
数を示すものであり、そのうちのグループは次の
注射の前に抗体形成を示すか、４週以内で最後の
注射を行なうものである。
する一回用量（1.0ml）を皮下注射した時６匹の
チンパンジーのグループから４匹が抗体を発現し
た。４週間隔で２回同種の追加量の後、６匹のチ
ンパンジーのうち５匹が抗体を発現した。 実施例 ３ 本発明の肝炎Ｂ表面抗原の感染性の有無に関す
るテストを以下のように行なつた。 16匹のチンパンジーを３群に分配した。Ａ群
（６匹のチンパンジー）はBOB肝炎Ｂビールス1.0
mlを静脈接種した。Ｂ群（４匹のチンパンジー）
は本発明の肝炎Ｂ表面抗原1.0mlを静脈接種し
た。Ｃ群（６匹のチンパンジー）はコントロール
群であり接種しなかつた。Ａ群の全チンパンジー
は40週以内で明らかな臨床肝炎Ｂ感染（アンテイ
グネミア（antignemia）、酵素活性向上
（enzymeelevation）および／または抗体反応の
いずれか）を有した。Ｂ群またはＣ群のチンパン
ジーはいずれも同様の40週間を超えても明白な臨
床肝炎Ｂ感染を示さなかつた。 実施例 ４ グリベツトモンキー（grivet monkey）の三つ
のグリープ（各グループに６匹のモンキー）を本
発明の抗原の変量を含有する1.0ml用量で４週間
隔で３回皮下注射した。次表は各々注射で各グル
ープに服用した投与量および全体のうちの動物の
数を示すものであり、そのうちのグループは次の
注射の前に抗体形成を示すか、４週以内で最後の
注射を行なうものである。
【表】
重要なことには、動物の50％以上が２ミクログ
ラムの服用量レベルでワクチンの３回量の後抗体
反応を示した。 実施例 ５ モルモツト（guinea pig）の三群（各グループ
14匹）を本発明の抗原の変量を含有する1.0ml量
で0.14および56日間隔で皮下注射した。次表は各
グルプに服用した投与量各注射薬および全体のう
ちの動物数を示すものでありそのうち、グループ
は０、28、56および84日に試験した時の抗体形成
を示すものである。
ラムの服用量レベルでワクチンの３回量の後抗体
反応を示した。 実施例 ５ モルモツト（guinea pig）の三群（各グループ
14匹）を本発明の抗原の変量を含有する1.0ml量
で0.14および56日間隔で皮下注射した。次表は各
グルプに服用した投与量各注射薬および全体のう
ちの動物数を示すものでありそのうち、グループ
は０、28、56および84日に試験した時の抗体形成
を示すものである。
【表】
重要なことは、モルモツトの80％以上が0.5ミ
クログラムの服用量レベルでワクチンの３回量の
後抗体形成した。
クログラムの服用量レベルでワクチンの３回量の
後抗体形成した。
図面は本発明の肝炎Ｂ抗原の紫外線スペクトル
を示すものである。
を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 濃縮物をペプシンが酵素的に活性なPHの範囲
内で蛋白質性物質を消化させるのに有効なペプシ
ン量で処理し、蛋白質性物質を解離させるのに有
効な尿素量で濃縮物を処理し、ペプシン、ペプシ
ン減成生成物および尿素を除去し、そして必要な
らばウイルスを不活性化させるのに有効な濃度に
ホルムアルデヒドを添加することを特徴とする肝
炎Ｂ抗原を含有する清澄血漿から得られた部分精
製濃縮物からの肝炎Ｂ抗原精製方法。 ２ 濃縮物のPHをHClで約２に調節する特許請求
の範囲第１項の方法。 ３ ペプシンを濃度が蛋白質約40〜500ミクログ
ラムにつき約１ミクログラム／mlになるまで添加
する特許請求の範囲第１項の方法。 ４ 尿素を濃度が約４〜8Mになるまで添加する
特許請求の範囲第１項の方法。 ５ アルムアルデヒドを添加し次いでペプシン、
ペプシン減成生成物および尿素を除去する特許請
求の範囲第１項の方法。 ６ ホルムアルデヒドを濃度が約50〜200ミクロ
グラム／mlになるまで添加する特許請求の範囲第
５項の方法。 ７ 除去を濾過およびクロマトグラフイで行なう
特許請求の範囲第５項の方法。 ８ 粒子サイズ直径約18〜22nｍ、Ｅ１％２７８ｏｍ約5
2
〜54および実質的に図に示される通りのUVスペ
クトルを有することを特徴とする精製肝炎Ｂ表面
抗原。 ９ Ｅ１％２７８ｏｍ約52を有する特許請求の範囲第８
項
の抗原。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/577,483 US4017360A (en) | 1975-05-14 | 1975-05-14 | Method for purifying hepatitis B antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS51139619A JPS51139619A (en) | 1976-12-02 |
| JPS6112894B2 true JPS6112894B2 (ja) | 1986-04-10 |
Family
ID=24308922
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51054486A Granted JPS51139619A (en) | 1975-05-14 | 1976-05-14 | Hepatisis b vaccine |
| JP58028652A Granted JPS58180432A (ja) | 1975-05-14 | 1983-02-24 | 肝炎ｂワクチン |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58028652A Granted JPS58180432A (ja) | 1975-05-14 | 1983-02-24 | 肝炎ｂワクチン |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4017360A (ja) |
| JP (2) | JPS51139619A (ja) |
| AU (1) | AU504454B2 (ja) |
| BE (1) | BE841811A (ja) |
| CA (1) | CA1066191A (ja) |
| CH (1) | CH629668A5 (ja) |
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| DE (1) | DE2621276A1 (ja) |
| DK (1) | DK145347C (ja) |
| ES (1) | ES447858A1 (ja) |
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| GB (1) | GB1488774A (ja) |
| HK (1) | HK86779A (ja) |
| NL (1) | NL188621C (ja) |
| SE (1) | SE431161B (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE437329B (sv) * | 1975-03-14 | 1985-02-25 | Community Blood Council | Sett att ur blodserum framstella vaccin mot virushepatit |
| US4129646A (en) * | 1976-11-02 | 1978-12-12 | Merck & Co., Inc. | Isolating hepatitis B Dane particles |
| GB1554811A (en) * | 1977-02-23 | 1979-10-31 | Merck & Co Inc | Purifying hepatitis b surface antigen |
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