KR900002651B1

KR900002651B1 - 면역성이 높은 신규한 형상의 간염 b 표면항원-함유 입자의 제조방법

Info

Publication number: KR900002651B1
Application number: KR1019860002396A
Authority: KR
Inventors: 메이어 프린스 알프레드; 광수김
Original assignee: 뉴요오크 블루드 쎈터, 인코오퍼레이티드; 아론 겔르너; 유진테크인터내셔널, 인코오퍼레이티드; 신승일
Priority date: 1985-04-01
Filing date: 1986-03-29
Publication date: 1990-04-21
Also published as: KR860007928A; US4695454A; JPS61289882A; ZA861767B; EP0198299A2; CA1265448A; EP0198299A3; CN86102113A; AU589413B2; AU5529686A

Abstract

내용 없음.

Description

면역성이 높은 신규한 형상의 간염 B 표면항원-함유 입자의 제조방법

제 1 도는 순간 가열에 의하여 소구형(小球形)입자로부터 생성된 사상체(絲狀體)형상의 개략도로서, a는 선형사상체 ; b는 밀폐원형 즉 지환형 사상체 ; c는 분지된 사상체 ; d는 개환형 사상체 ; e는 분지원형 사상체 ; f는 다분지 (多分枝) 사상체이다.

제 2 도는 본 발명에 따르는 왁찐 제조방법의 공정도,

제 3 도는 단계 A-C에 따라 얻어졌으며, 본 발명의 순간 가열처리를 받지 않고, 대부분이 18 내지 24nm의 구형 입자형태인 HBsAg 입자를 함유하는, 인텅그스텐산으로 허성염색(虛性染色) 시킨 HBsAg 함유 입자의 전자현미경 사진,

제 4 도는 열처리를 받을때와 HBsAg 함유 입자의 형성을 나타내는 것으로, 선형, 분지형 및 원형 사상체 형상을 나타내는, 제 1 도에 유사한 전자현미경사진

제 5 도는 제 4 도에 나타낸 용액을 20 분간 8000g에서 원심분리하고, 생성된 상징액을 여과한 후 얻어진 상징액 부분에 대한 제 3 도 및 4 도에 유사한 전자현미경사진,

제 6 도는 20 분간 8000g에서 원심분리하여 얻은 침강물을 등장성 염수에 재현탁시킨 것의, 제 3 도 내지 5 도에 유사한 전자현미경사진,

제 7 도는 본 발명에 의하여 제조된 HBsAg 함유 입자를 나타내는 것으로, 이때 HBsAg 입자는 3㎎/㎖의 카프릴산 나트륨으로 처리된 혈청 알부민의 존재하에 순간 가열처리된 제 3 도 내지 6 도에 유사한 전자현미경 사진인 바, 동일한 형태학적 구조가 얻어졌으나, 카프릴산 나트륨 처리된 혈청 알부민이 동시에 존재하기 때문에 전자현미경사진으로는 용이하게 볼수 없는 것이다.

제 8 도는 형태학적 형상을 제 3 도 내지 제 6 도에 도시한 제제에 의하여, 새앙쥐에 있어서 정제된 HBsAg의 면역성에 대한 가열 비활성화 효과를 나타내는 그래프.

본 발명은 왁찐이나 왁찐 중간제로서 유용한 입자의 용액 또는 현탁액에 관한 것이다. 더욱 상세히 말하면 본 발명은 면역성이 높은 신규한 형태의 간염 B표면항원(HBsAg)보유입자의 제조방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 고도로 농축된 항원물질에 열을 이용함으로써 비활성화를 수행하는 항원 함유물질을 비활성화하는 방법과, 알부민과 같은 단백질을 가하여 희석된 위트(wit)에 관한 것이다. 본 발명은 이와같은 항원 조성물의 제조방법과, 이를 동물, 특히 인간에게 사용하는 방법에 관한 것이다.

종래 기술을 살펴 보면 다음과 같다.

간염 B표면항원(HBsAg)이 나타내는 바와 간염 B비루스가 나타내는바 사이의 상관성은 수년전 알프레드엠 프린스(Alfred M, Prince, Pro. Nat. Acid. Sci. U.S.60 ; 814-821, 1968)가 단정적으로 정의된 바 있다. 이 항원은 주로 입도가 대략 18 내지 24nm인 지방 단백입자의 박막과, 이에 유사한 직경의 사상체(絲狀體)에 매몰된 단백질에 위치한다. 이들은 현재 "데인"(Dane)입자라고도 알려져 있는 HBV의 비리온(Virion)을 포위하고 있는 것에 유사한 막의 단편을 나타내는 것으로 공지되어 있다.

그후 이와같은 입자를 함유하는 왁찐은 블럼버어그(Blumberg)씨등에 의하여 미국특허 제 3,636,191 호에 개시되었다. 프린스씨와 그외의 사람들은 그후 데인입자와 사상체로부터 유도된 막단백질을 함유하는 기타의 간염 B비루스성 왁찐을 발표하였다. 이들 데인입자와 사상체는 간염 B비루스의 다수 만성 보유자에서 발견되는 간염 B항원을 함유하거나 또는 이와 관련되어 있다.

상기 연구가 이루어진 이래 간염 B비루스에 대한 왁찐이 HBsAg 입자를 갖고 있는 미국에 도입되었다. 이 왁찐은 만성 감염된 HBV 보유자의 혈장으로부터 유도된 HBsAg 함유 입자의 효소소화에 의하여 생성되며, 이의 다소는 앞의 U.S. 3,636,191 에 기술되어 있다. 이 왁찐은 면역성이 실질적으로 손실되게 되는 고가의 정제 공정에 의하여 제조된다. 그 결과, 적당한 면역응답을 확보하기 위하여는 생성항원(HBsAg)을 비교적 큰 사용량으로 투여하여야 한다. 이와같은 원인으로 이 왁찐은 투여량당 약 10.00$이상으로만 구입할 수 있다. 최초의 주사와 2 회의 보강이 필요함으로 미국에서 간염 B비루스에 대하여 면역되는 데는 약 100.00$이 필요한 바, 이 비용은 이 왁찐의 수요가 가장 큰 세계도에서는 감당할 수 없는 비용이다.

따라서 적은 투여량으로 저렴한 값으로 이용할 수 있도록 면역성이 증강된 실질적으로 순수한 형태로 간염 B표면항원을 함유하는 간염 B왁찐을 제공할 필요가 있게 되었다. 물론 감염의 위험이 없도록 출발 혈장에 존재하는 감염성 비루스를 완전히 비활성화 시키는것도 역시 필수적임은 물론이다.

간염 B감염은 대부분 공중보건 조처에 제한된 자금이 쓰이고 있는 아시아와 아프리카의 개발도상국 주민에게 영향을 주고 있다. 현 20세기에 있어서는 간염 B비루스 감염 위험에 있고, 그 결과 후차적인 간경변증과 간암발병의 위험을 안고 있는 수백만의 사람을 보호하기 위하여 상기의 왁찐을 공급하고 이 왁찐을 감당할만한 비용으로 제공하는 것은 의무적인 일이다. 개발도상의 세계도처에서 이점은 왁찐이 이용되는 경우 1 인당 1.00$ 이하의 가격으로 면역이 이루어질 것을 요구한다.

본원인이 출원한 출원계류중의 것 제656,833호에는 천연적으로는 발견된 바 없는 새로운 형태학적 형상으로 대량 전이된 입자를 함유하는 것을 특징으로 왁찐이나 왁찐 중간체와 제조방법이 개시되어 있다. 이들 형상은 의외의 향상된 면역성을 갖는다.

상기의 보고된 실험에 따르면 농축된 HBsAg 함유물질은 다음의 단계에 의하여 얻어진다.

A. 혈장, 예컨대 HBsAg를 함유하는 인간혈장을 폴리에틸렌글리콜과 접촉시켜서 그에 함유된 기타 혈장 단백으로부터 HBsAg를 분리하는 단계.

B. 상기의 분리된 HBsAg를 히드록실아파타이트에 부흡착시켜서 대부분의 혈청단백을 분리하는 단계.

C. 이와같이 흡수된 HBsAg를 등밀도 원심분리시켜서 잔류하는 본래의 데인입자를 분리시키고, 잔류하는 흔적량의 오염혈청단백을 더욱 제거하는 단계.

D. 원심분리로 분리된 입자를 0.5 내지 10㎎/㎖의 농도로 101 내지 104℃의 온도에서 2 내지 5분간 가열함으로써 가열 비활성화 시킨 다음, 가열된 입자를 예컨대 빙수욕에 도입시킴으로써 냉각시키는 단계.

그러나 전술한 단계 D의 가열비활성화 단계는 입자의 변성을 피하기 위하여 안정화 농도의 단백질 존재하에서 수행될 필요가 있다.

본 발명을 요약하면 다음과 같다.

의외에도, 상기한 단계 C로부터 대부분의 결과는, HBsAg의 안정제를 전혀 가하지 않고, 즉 알부민과 같은 물질로 HBsAg 함유 입자를 희석시키지 않고도 가열비활성화 할 수 있다는 것이 발견 되었다. 또한 가열비 활성화는 알부민 비함유 조성물을 제공할 뿐만 아니라, 생성 조성물은 HBsAg의 새로운 형태학적 형상이 전자 현미경으로 더욱 용이하게 관찰될 수 있는 조성물이라는 것이 발견 되었다.

혈청, 즉 인간혈청에 존재하는 기타 비루스도 유사하게 비활성화 될 수 있으며, 그 결과 기타의 병원체, 특히 비루스의 농축된 항원조성물을, 병원체가 본 발명에 따라 가열 비활성화 되는 경우, 즉 카프릴사나트륨 안정화 알부민과 같은 안정화제를 가하지 않고 안정화 되는 경우, 왁찐이나 왁찐 중간체로서 사용할 수 있다. 가능한한 순수한 왁찐, 즉 알부민과 같은 외래단백을 가능한한 적게 함유하는 왁찐을 제공하는 것이 유리하다는 것을 유의하여야 한다.

따라서 포괄적으로 말하면 본 발명은 상기한것과 같은 비루스와 그의 항원성분을 함유하는 농축된 물질의 비루스를 가열 비활성화에 의하여 비활성화 시키는 개량된 방법에 관한 것으로, 이때 농축된 물질을 실질적인 양의 혈청단백이 제거된 상기 비루스를 함유하는 혈청으로부터 얻은 것이며, 농축된 물질은 안정화, 예컨대 단백성 희석제로의 희석단계가 없이 가열 비활성화 된다. 전체공정은 항원성분의 농축중이나 비루스의 가열 비활성화중 어느때에도 단백질이 첨가되지 않도록 수행 되는 것이 바람직하다. 그후 요구에 따라서는 농축된 물질을 단백질, 예컨대 혈청알부민으로, 또는 보조제로 희석할 수 있다. 이것은 또한 식염수와 같은 것으로 희석하여 투여나 또는 차후공정에 사용가능한 물질로 형성시킬수 있다. 비루스의 가열 비활성화는 항원성분, 예컨대 HBsAg 입자를 함유하는 농축된 물질을 0.5 내지 10㎎/㎖의 농도로, 101 내지 104℃의 온도에서, 2 내지 5분간 가열한 다음 가열된 입자를 빙욕에 도입시키는 방법등으로 냉각시킴으로써 수행된다.

총괄적으로 말하면 간염 B왁찐은 다음의 단계에 의하여 본 발명에 따라 제조된다.

A. 그에 함유된 기타 혈청단백질로부터 HBsAg를 분리시키기 위하여 인간 혈장을 폴리에틸렌글리콜과 접촉시킴으로써 HBsAg를 함유하는 인간혈장으로부터 HBsAg를 침전시키는 단계.

B. 대부분의 혈청단백질을 더 제거하기 위하여 이와같이 분리된 HBsAg를 히드록 실애퍼타이트상에 부흡착시키는 단계.

C. 잔류하는 본래의 데인입자를 분리시키고, 잔류하는 흔적량의 오염 혈청단백질을 제거하기 위하여, 상기 흡착된 HBsAg를 등밀도 원심분리시키는 단계.

D. 이와같이 원심분리에 의하여 분리된 입자를 0.5 내지 10㎎/㎖의 농도에서 101 내지 104℃의 온도로, 2 내지 5분간 가열함으로써, 단백질로 희석시키지 않고 가열 비활성화 시킨다음, 가열된 입자를 예컨대 방수욕에 도입시켜 냉각하는 단계.

본 발명에 따르면 단게 A-C는 처리될 물질이 단백질 총중량을 기준으로 적어도 95%, 바람직하게는 99중량%의 HBsAg 함유 입자를 함유 하도록 수행한다. 가열 비활성화중 조성물을 안정화 시키기 위하여 카프릴산 나트륨으로 처리된 알부민과 같은 희석제를 조성물에 가하지 않는다. 따라서 가열 비활성화 공정은 안정제의 부존재하에, 특히 다른 기타 혈청단백의 부존재하에 수행된다.

가열 비활성화단계는 C로부터 얻은 미희석된 정제 입자요액을 101 내지 104℃로 가열된 매제(예컨대 유욕)에 침지된 2mm직경의 관(예를들면 황동이나 스테인레스 강철등)에 전체 체류시간이 1.5 내지 6.0분되게 통과시킴으로써 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명 공정을 수행함에 있어서, 관내 용액을 101 내지 104℃까지 가열함에는 어느정도 시간이 필요하며, 따라서 "총체류시간"은 용액이 101 내지 104℃로 실제로 가열되는 시간보다 길다. 그 차이는 물론 유동속도에 의한다.

용액이 100℃ 이상의 온도에 오게되는 경우 용액의 증발을 방지하기 위하여는 연속 유동순간가열을 상승된 고온에서 수행하여야 한다는 것을 이해하여햐 한다. 이것은 고압 액상 크로마토그라피 펌프와, 수납용기로부터 나오는 수압헤드를 이용함으로써 용이하게 이루어진다.

선택적으로는, 틘 80(Tween 80) 과 같은 청정제로 단계 C로부터 나오는 정제된 항원을 처리함으로써, 즉 동일용적의 Tween 80 2% 수용액을 가함으로써 부가적인 비활성화를 수행할 수 있다. 이와같은 처리는 왁찐의 안정성을 더욱 증진 시킨다. 그러나 비활성화 과정이 청정제 처리를 하지 않고 수행되는 경우에는 생성체의 면역성이 더욱 큼으로 청정제 처리를 배제하는 것이 바람직하다.

순간가열 비활성화 단계후, 회수정제되고 비루스 비활성화된 입자용액은 요구에 따라 인산알루미늄이나 수산화알루미늄에 흡수시킴으로써 보조제를 가할 수 있다. 열대지방국에서 사용하기 위해서는 명반겔을 가하기 전에 동결건조하고 필요에 따라 재탈수후 상기의 겔을 가하는 것이 적당하다.

그 다음 0.15몰 NaCl과 같은 약학적으로 적당한 매제로 희석시킴으로써 최종왁찐으로 사용한다.

최종 왁찐에서 HBsAg 함유 단백질 농도는 0.1 내지 10microgram/㎖이다. 적당한 주사 투여량은 수령인의 연령에 의한다. 남자성인에 대한 전형적인 투여량은 1 내지 10microgram 의 HBsAg이며, 근육내, 피하에 또는 피부내에 주사할 수 있다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다 ; 간염 B표면 항원은 폴리에틸렌글리콜 침전단계, 히드록실앱타이트 흡수단계 및 브롬화칼륨 그래디언트 내에서의 등밀도 원심분리단계의 연속적인 단계에 의하여, 다음에 기술하는 바와같이 혈장으로부터 정제한다.

그 다음 0.22미크론의 여과기로 여과하고 안정제나 단백질 희석제를 가하지 않고 상기한 압력하에 102 내지 105℃에 유지한 유욕에 잠겨있는 0.1 내지 10mm, 선택적으로는 1 내지 3mm 직경의 스테인레스강철관에 통과시키면서 101 내지 104℃에서 1 내지 15분간, 선택적으로는 2 내지 5분간 가열하여 가열비활성화 시킨다. 압력은 비등을 방지하기에 충분 하여야 하며, 즉 800 내지 1000mmHg, 특히 900 내지 1000mmHg 이어야 한다.

다음에 이와같이 가열된 물질은 가열된 용액을 빙수욕에 유지된 용기에 수집하는 방법등으로 하여 냉각시킨다. 일반적으로 2 내지 4℃ 까지의 냉각은 가열처리 중단후 5분내에 이루어진다. 그러나 최적의 결과를 얻기 위하여는 용액을 20 내지 100℃, 특히 75 내지 90℃ 사이에서 선택된 온도에 조정된 욕내의 제 2 코일에 통과시키는 것이 바람직하다.

정제되고 순간 가열 비활성화된 HBsAg 함유 물질은 다음에 인산 알루미늄 보조제를 사용하여 적당히 보조제 첨가를 한다. 일반적으로는 희석된 항원 1㎖당 0.3 내지 0.6㎎의 인산 알루미늄을 제공하기 위하여는 무균 조건하에서, 비활성된 희석항원에 예비-살균된 인산 알루미늄을 가한다. 그다음 보조제가 가해진 조성물을 적당한 용기에 무균 충전한다. 이 최종용기는 최종 생성물의 안정성을 더욱 확보하기 위하여 부가적인 살균단계로서 10 시간 동안 65℃에 더 유지(저온 살균)할 수 있다. 이 왁찐은 면역에 사용하기전 3년까지의 기간동안 2 내지 6℃의 온도에 유지한다.

상기한 방법으로 HBsAg를 정제하고 미희석된 HBsAg 함유 입자를 상기한 가열처리를 받게함으로써 일련 제 656,833 호에 따라 형성된 종류의, 일상적이 아닌 형상의 HBsAg 함유 입자가 역시 이루어졌으나, 안정제가 공존하지 않음은 물론이다. 이와같은 방법은 안정제/희석제를 가할때에 수반되는 비용을 절감시킬뿐만 아니라, 본 발명 방법에 따르면 새로운 형태학적 형상이 전자현미경하에서 더욱 용이하게 관찰될 수 있기 때문에 이들 새로운 형태학적 형상의 생성을 확실히 하도록 시스템을 더욱 용이하게 감시할 수 있게 한다. 최초의 HBsAg 함유 입자는 대체로 구형이며, 대부분이 18 내지 24nm의 크기이기 때문에(제 3 도) 본 발명 방법으로 유도된 입자는 제 1, 4 및 6 도에 특히 도시된 바와같이 다형성 사상체로 전이된다. 제 4 도 내지 7 도, 특히 제 5 도에 도시된 바와같이 다형성 사상체로 전이된다. 제 4 도 내지 7도, 특히 제 5 도에 도시된 바와 같이 현재까지 볼 수 없었던 사상체가 특히 현저하다. HBsAg 항원성을 갖는 이와같은 사상체의 특징은 분지를 갖거나 또는 지환형이라는 점이다. 대체로 말하면 사상체는 적어도 50nm의 길이를 가지며, 일반적으로 100 내지 1000nm의 범위에 있다. 사상구조체가 분지되는 경우 이것은 적어도 50nm의 길이, 빈번하게는 100 내지 300nm의 길이를 갖는 구조체로 분지된다. 본 발명 방법으로 얻은 몇몇의 사상체는 1개 사상체 구조당 적어도 3개의 분지를 가지며, 불규칙한 형상을 하고 있으며 그의 최소길이는 적어도 100nm으로서 20 내지 1000nm인것이 바람직하다.

제 4 도 내지 7 도의 전자현미경사진을 참조하면, 본 발명의 HBsAg 함유 입자는 구형의 16 내지 25nm HBsAg 입자는 물론 환형의 입자, 분지된 사상체 및 선형 사상체 입자를 포함하고 있다.

형태학적 형상에는 돌출하는 사상체 부분을 갖는 환형 입자가 포함된다. 이들 사상체 입자는 흔히 적어도 50nm의 길이를 가지며, 일반적으로 그 길이는 100 내지 300nm이다.

세정제 처리가 이용되는 경우 비-분지 사상체의 특징은 20℃ 에서의 밀도가 1,210 내지 1,230Gm/cc (평균치 1,224Gm/cc)일 수 있으며, 따라서 소위 데인입자 그리고/또는 관련사상체를 갖고 있는 만성 HBsAg 보유자의 혈장에서 관찰되는 비-분지 사상체와 구별된다. 후자의 평균밀도는 1,200 이다.

"환형상" 입자에는 실질적으로 완전한 원이나 환은 물론 실질적으로 한 영역을 포위하는 기타의 것도 포함된다. 포위하는 HBsAg 함유 물질로 정의되는 영역이란 타원형 및 도오닛-형을 포함하는 모든 형상일 수 있으며, 즉 규칙적이거나 불규칙적인 형상을 가질 수 있다.

관찰된 형태학적 형상은 이미 기술된 미셀형(micellar)입자와는 극적으로 상이하다. 후자는 폴리팹티드 고리의 소수성 단부로 구성된 중추에 의하여 특징 지어지며, 이 고리의 친수성 부분은 대체로 구형인 입자의 표면으로 향하여 연장되고, 다라서 본 발명에 따라 제조된 사상체는 중추에 연결되어 있지 않다. 어떤 사상체는 그 자체가 돌출사상체를 가질 수 있는 불규칙한 환의 형상이다. 그러나 일반적으로 이와같은 돌출사상체는 셋 미만으로, 흔히는 둘이나 단지 하나가 있게 된다. 물론 본 발명의 입자는 외향 돌출하는 사상체를 갖는 농밀한 심부를 갖지 않는다.

본 발명을 간염 B왁찐 도중의 비활성화 HBV를 특별시 참조하여 설명하겠다. 그러나 이 과정은 생 비루스를 함유하는 농축된 물질내의 기타 비루스와, 특수 지질피복비루스, 리트로비루스, 아데노비루스, 헤드페스비루스, 폭스(pox)비루스, 레오비루스, 미옥소비루스, 마진 및 이하선염 비루스 그리고 류코미루스를 포함하는 상기 비루스의 항원성분을 비활성화 시키는것에 대하여 기술한 방법에도 유용하다. 본 발명에 따르는 왁찐 제제 도중의 항원물질중에서 비활성화 될 수 있는 특수 비루스에는 균주 X-31 및 재팬균주, 엡슈타인-바르(Epstein-Barr)등과 같은 여러 가지 균주를 포함하는 인플루엔자 비루스, 폴리오, 디프테리아, 조류육종, 가금페스트(家禽 pest), 발과 입의 질병, 콜레라, 간염 A, HTLV-3, 광견병 및 천연두가 포함된다.

본 발명과 이의 실시방법을 더욱 충분히 설명하기 위하여 다음의 실시예를 기술하는 바이다.

[실시예 1]

만성 HBsAg 보유자로부터 얻은 HBsAg와 HBsAg를 함유하는 혼주(混注)된 혈장을 pH4.6 으로 조정하고, 웨스트팔리아(Westphalia) 연속 유동 원심분리기에서 10,000RPM으로 청징시켰다. 맑게된 상징액의 최종농도를 4℃에서 4% PEG 6000으로 조정하고, 20분간 교반하였다. 원심분리하지 않고 2시간동안 침강법으로 침전물을 회수하고, pH를 7.5 내지 8.0으로 조정함으로써 증류수로 원래 용적의 1/5에서 가용화 시킨다. 다음에 pH를 5.0으로 낮추고, 원심분리에 의하여 생성침전을 회수한다. 다음에 상징액의 pH를 4.6으로 조정하고, 최종농도 3%가지 PEG를 가한다.

4℃에서 하룻밤 침강시킨 후 중화에 의하여 침전을 재용해시키고, 전번과 같이 pH를 5.0으로 하강시킨 후 현탁액을 청정시킨다. 이 물질의 pH를 6.8로 조정하고, 0.5M 인산염 완충액을 가한다음 동일용적의 충전된 히드록실 아파타이트로 2 내지 3회 연속 흡착시킴으로써 더욱 정제한다.

그다음 히드록실아파타이트 침강물을 0.02M 및 0.05M 인산염 완충액으로 세척한다. 마지막으로 최초의 상징액과 히드록실아파타이트 침강물의 세척물을 모아 원심분리로 청징시키고, 아마콘(Amicon)중공섬유 카트리지에 의하여 출발 혈장용적의 약 0.3%가지 농축시켰다. 다음에 농축된 HBsAg를 고체 KBr로 1.25g/㎖의 밀도가지 조정하고 벡크만 Ti-14로우터내에 1.3g/㎖의 쿳션에 걸쳐 1.05 내지 1.2g/㎖의 선상구배로 동적으로 부하시켰다.

이 구배물을 18 시간동안 28,000r.p.m에서 원심 분리하고 로우터의 중앙로 펌핑수에 의하여 분별시켰다. 1.17 내지 1.22g/㎖ 범위의 밀도에 상응하는 분별물을 수집하였다.

정제된 항원의 농도를 1㎎/㎖

가지 조정하고 0.22 미크론 밀리포어(Millipore) 여과기를 통하여 여과하였다. 그후 정제된 항원은 이 물질이 102℃에서 2분간 유지 되도록 하는 비율로 102℃의 온도에 유지된 유욕에 현수된 2mm 직경의 스테인레스 강철코일을 통하게 950mmHg 압력에서 통과시켰다. 이것은 총 체류시간이 2분 40초일 것을 요구한다. 희석 후 생성 조성물은 무균의 인산알루미늄 보조제를 가한다. 최종의 명반-흡수된 왁찐은 10 시간동앙 65℃에서 부가적인 비활성 단계로서 처리할 수 있다.

[실시예 2]

실시예 1의 과정을 반복하되, 단 102℃에서의 비 활성 단계와 다음의 단계를 제외시킨다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이 1.18㎎/㎖의 단백농도를 갖는 HBsAg 함유물질이 얻어진다.

HBsAg의 순도는 다가(多價) 및 1 가의 항-인간 혈청단백질 항-혈청에 의한 겔 확산 연구를 기준으로 95% 이거나 그보다 높다. 따라서 이 조성물은 검지 가능한 양의 인간혈청 단백질을 대부분 함유하지 않는다. 시료의 일부는 2% 인텅그스텐산으로 허성염색 시킨 후 195000X 확대의 전자현미경으로 관찰한다. 이 시료의 전자현미경 사진이 제 3 도에 도시되어 있다.

[실시예 3]

실시예 2에 기술한 시료의 일부를 총 체류시간 2분 40초간 102℃의 유욕에 침전시킨 2mm 직경의 스테인 레스 강철관에 통과시켜 102℃에 노출시킴으로써 열처리한다. 102℃의 온도에 달하는데는 40초가 소요된다. 따라서 단백질 조성물은 약 2분간 102℃로 가열된다. 이 시료는 약간 유백광을 나타내게 되었는 바, 이것은 다소의 응집을 나타내는 것이다. 시료의 일부를 허성염색새키고, 그의 전자현미경 사진을 찍는다. 제 4 도에 나타낸 바와 같이 가열 후 선형, 분지된 대체로 원형인 사상체형의 표면항원입자가 나타난다. 이들 입자는, 초음파에 30분 노출시켜도 그의 형태에 영향을 끼치지 않는 것으로 미루어볼 때 단순히 응집되기 보다는 실제 막융합으로부터 생성된 것이다.

사상체 및 구형입자의 상대적 면역성을 측정하기 위하여 이들을 원심분리에 의하여 서로 부분 분리시킨다.

[실시예 4]

실시예 3의 가열된 제제를 800g에서 20분간 원심분리하고, 상징액 분별물로 분리시키고, 이것을 여과에 기인하는 손실을 감소시키기 위하여 50㎕/㎖의 틘 20을 가한 후 0.22미크론 밀리포어 막을 통하여 더 여과 시킨다. 이 상징액 분별물을 허성염색시키고 전자현미경 사진을 찍었는 바, 제 5 도의 전자현미경 사진을 얻었다.

[실시예 5]

실시예 4를 여과하여 얻은 침강물을 최초의 용적까지 등장성 식염수에 재현탁시키고, 허성염색시킨 후 전자현미경사진을 얻었는바, 제 5 도의 것과 같다.

[실시예 6]

알부민 존재하에서의 순간 가열 비활성화

제제를 실시예 3 에 기술한 바와 같이 카프릴산 나트륨으로 안정화 시킨 인간 혈청 알부민 3㎎/㎖의 존재하에 순간 가열시켰다. 다형상의 사상체 형상이 또 다시 얻어졌다(제 7 도)

[실시예 7]

보조제를 가한 단백질성 조성물의 제조

실시예 2와 3의 조성물 30microl와, 실시예 4의 조성물 40microl와, 실시예 5의 조성물 90microl를 각각 10㎖의 무균 규정 식염수에 가하여 OD₂₈₀를 기준으로 약 4micro gm/l가 되게 한다.

이것은 가열공정에 기인하는 단백광에 따른는 단백질 농도로 대략 평가된다.

이들 시료의 더욱 정확한 단백질 함량은 BIORAD 단백질 분석법으로 얻는다. 이 용액은 리즈크스연구소(RIJKS Inst. voor de Volksgesundheid of Bilthoven, Holland)에서 제조한 동일용적의 인산알루미늄겔(1.2㎎/㎖)로 조정하여 0.3㎎ 명반 인산염 겔에 흡수된 대략 1micro gr/0.5㎖의 투여량이 되게 한다.

각개 항원의 양

을 함유하는 식염수에 희석시킨 것을 상기와 같이 명반 보조제에 유사하게 흡수시켜 대략 0.25 및 0.6micro gr의 투여량이 되게 한다. 항원 용액 대신에 식염수에 의하여 대조표준도 제조한다.

생쥐의 접종

20-22 체중을 갖는 암컷의 ICR 스위스 생쥐 20 마리 군을 복강내에 0.5cc의 여러 가지 제제로 접종시킨다. 이와 같이 하여 60마리 생쥐에게 각개 시료를 접종시키되, 20마리는 각 시료의 3희석액을 받게 한다. 10 마리에게는 대조표준 보조제를 받게 한다. 모든 쥐를 심장 출혈 시킨다. 혈액을 각 시험관에 수집하고, 실온에서 엉기게 방치하고, 원심 분리된(3000r.p.m 15분) 응집체로부터 혈청을 회수하기 전에서 하룻밤 방침한다.

각개 혈청은, 100 국제단위(IU)/㎖를 함유하는 WHO 국제 HBIG 표준과 비교하여 AUSAB

시험키트(Abbott Laboratories, Chicago, Illinois)를 사용하는 정량 평행선 방사면역 측정법으로 시험한다.

선형곡선 관련 희석액내의 것보다 큰 방사능을 나타내는 시료와, 분당의 수(CPM) 마이너스 음성 대조표준 평균 CPM은 1:10과 1 : 100 희석액에서 재시험 하였다. 시료의 HBsAg 항원성은 U.S.F.D.A 가 마련한 잠정적 HBsAg/ad 표준과 비교하여 AUSRIA

시험키드(Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois)를 사용하여 평행선 방사면역 측정법으로 평가하였다. 이와 같은 표준으로 얻은 결과는 독입 국립 HBsAg/ad 표준을 독립적으로 얻은 것과 동일하다.

다음 표-1은 실시예 2 내지 5의 상이한 여러가지 시료의 단백함량과 항원성 및 이들간의 비율 즉 "비항원성"(比抗原性)을 기재한 것이다. 가열은 비항원성을 약 50% 감소시킨다는 것을 알 수 있다.

이것은 특히 제 6 도에 의하여 나타난것과 같이 사상체 형상을 많이갖고 있는 실시예 5에 대하여 특히 현저하다.

제 8 도는 4종의 제제를 희석하여 단일 주사한 후 28 내지 30일에 적어도 1mIU/㎖의 항-HBs에서 발병하는 쥐의 백분율을 나타낸다.

열처리된 제제는 이 기준에 의하면 면역성이 현저히 증진 된 것으로 나타났다. 생쥐의 50% 혈청 전환에 요구되는 투여량은 평가한 결과 열처리하면 다음 표 2의 실측치로 나타난 바와 같이 면역성의 1.4배 상승 작용이 일어난 다는 것이 나타났다. 사상체분획(실시예 5)이 29.5배 상승작용으로 가장 면역성이 높았다.

[표 1]

비항원성에 대한 가열 효과

① BIORAD 단백질 분석법에 의한걱

② FDA 잠정 HBaAg/ad 표준과 비교한, AUSRIA 시험법을 이용하는 평행선 방사면역측정법(RIA)에 의한 것.

③ 비항원성 : ㎍ HBsAg by RIA vs. HBsAG/ad 표준/㎍ HBsAG 단백질 by BIORAD 단백질 분석법

[표 2]

생쥐에 있어서 면역성에 대한 정제된 HBsAg의 가열 비활성화효과

(A) 50% 혈청전환에 요구되는 용량에 대한 효과(ED₅₀)

(B) 응답체에 있어서 평균 항-HBs 수준에 대한 효과

상기 실측치로부터, 위에 기술한 분리과정으로 얻은 실질적으로 순수한 HBsAg 입자는 실제로 HBsAg의 면역성을 증가 시키며, 따라서 보다 높은 항체수준이 얻어진다는 결론을 얻게 되었다. 1.5 Log₁₀mIU/㎖(32mIU)의 기하평균 항-HBs 수준을 나타내게 함에 요구되는 용량을 평가함으로써 정량적 매개변수가 유도 된다. 이 매개변수를 이용하건데 102℃에서 2 분간 가열하면 면역성을 6배 증가시키는 것으로 평가되었다.

이와 같이 본 발명의 단백질성 물질은 직경이 18 내지 24nm인 구형의 HBsAg 입자로 주로 구성되는 단백질성 물질의 면역성보다 4 내지 10배, 바람직하게는 6 내지 8배 높다는 특징을 가질 수 있다. 물론 구형의 18 내지 24nm 입자로부터 본 발명의 상체구조를 분리함으로써 생성 조성물은, 실시예 5의 조성물에 대한 상기 실측치로부터 명확한 것과 같이 20 내지 30배 정도로 더욱 증진된 면역성을 가질 수 있다.

이와 같이, 본 발명 방법에 의하여 정제된 HBsAg를 102℃에서 2 분간 비활성화 시키면 의도된 것과 같이 잔류 감염성이 하강될 뿐만 아니라, 면역성의 극적인 증가가 얻어진다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 이와 같이 증진된 면역성은 저단백 함량의 왁찐 제제화를 허용할 뿐만 아니라, 왁찐 제조원가를 전체적으로 절감시키며, 따라 현재 사용되는 왁찐의 원가보다 저렴하다.

[실시예 8]

또 다른 정제기술로 얻은 것과, 이와 유사하나 본 발명 단계로 얻은 정제된 항원 비활성화에 의한 가열 비활성화 기술로 얻은 가열 비활성화된 왁찐의 비교평가

HBsAg를 폴리에틸렌글리콜로 2회 침전시킨 다음 히드록실 애퍼타이트에 부흡착시켜서 정제하고 등밀도 원심분리로 정제함으로써 전술한 과정으로 정제하였다. 부분 정제된 이와 같은 물질은 시료 A로서 표시하였다.

또 다른 부분 정제된 HBsAg 조성물은 시료 B로서 표시하였으며, 브루멜후이스씨등의 방법(Brummelhuis et al, Preparation of Hepatitis B Vaccine by Heat Inactivation in Hepatitis B Vaccine, in Serum Symposium No. 18., Eds.p.Maupas and P. Guesry, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1981). 으로 제조하였다.

시료 A는 인산염으로 완충된 식염수로 1㎎/㎖, 2㎎/㎖, 4㎎/㎖ 및 6㎎/㎖로 희석하고, 다음에 기술하는 것과 같이 열처리 하였다. 시료 B는 브루멜후이스 과정으로 명시된 것과 같이 20㎍/HBsAg/㎖의 농도로 조정한, 재현탁 시킨 HBsAg 최종입자를 사용하여 열처리 하였다.

시료 A와 B를 내경 2nm인 금속관에 넣고, 짧은 길이의 실리콘 고무관을 꼽고, 금속 스크류클램프로 밀봉시켰다. 이관은 102℃로 가열된 항온 유욕에 담가서 가열 비활성화를 수행하였다. 시료 A와 B가 102℃의 온도에 체류하는 시간은 2분 이었다. 그 다음 냉각시키기 위하여 이것은 빙욕으로 옮겼다.

생성체 시료는 제 3 내지 6 도에서와 동일한 방법으로 허성 염색시킨 후, 즉 인텅그스텐산으로 허성염색 시킨후 전자 현미경 검사를 하였다. 시료 A(1∼6㎎/㎖)의 전자현미경 사진은 제 4 도 내지 6 도에 도시한 동일한 다형성 사상체를 나타내었다. 네덜란드 적십자의 방법에 따라 제조한 비활성화된 시료, 즉 시료 B는 HBsAg에 부가하여 적어도 약 3㎎/㎖의 기타 혈청단백질을 함유하였다. 그의 전자현미경 사진은 실제로 HBsAg의 사상체입자를 나타내지 않았다.

실시예 6에서와 같이, 1 내지 3㎎/㎖의 카프릴산 나트륨으로 안정화된 알부민의 첨가는 다형성 형상(제 7 도)로의 전환이나 면역성 증진을 변화시키지 않는 것으로 나타났다. HBsAg를 정제하는 방법은 물론 이것이 가열되는 농도는 후차적인 순간 가열처리 방법 이하를 결정하며, HBsAg 입자는 제 4 도 내지 제 6 도에 도시된 신규하고 비상한 다형성 형상으로 전환된다는 결론이 얻어졌다. 이와 같이 가열 비활성화 자체는 다형성 효과의 결정원인은 아니며, 오히려 증진된 면역성에 기여하는 신규한 다형성 형상은 이용된 정제방법과 실제 가열 비활성화 과정의 조합으로부터 기인되는 것이다.

전술한 바는 본 발명을 수행하는 현재 가장 좋은 방법으로 생각되는 형태를 기술한 것이다. HBsAg의 비상한 다형성 형상을 생기게 하는 최초의 연구에서 정제된 HBsAg는 가열 비활성화가 HBsAg에 대하여 끼칠지도 모르는 유해한 효과에 대하여 방어하기 위하여, 즉 이를 변성되지 않게 보호하기 위하여 정제된 HBsAg를 혼화성 단백질, 즉 혈청 알부민으로 희석시켰다. 본 발명은 비활성화를 상기 희석 조작없이 수행할 수 있다는 발견에 근거를 둔 것이며, 따라서 본 발명을 수행하는 바람직한 형태는 비활성화를 정제되고 비희석된 HBsAg에 대하여 수행하는 것이다.

본 발명자는 본 발명의 원리, 즉 고농도의 정제된 박막제제의 순간가열 비활성화에 의한 지질 박막 면역원의 면역성 증진은 효과증진에 용이하게 이용할 수 있고, 그리고/또는 성숙핵세포에서 생성된 재결합 DNA 유도왁찐, 예컨대 효모나 또는 세포배양유도 재결합 DNA를 기본으로 하는 간염 B 및 기타 왁찐은 물론, 인플루엔자, 광견병, 마진, 헤르페스군 비루스, HTLV Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ와 같은 리트로비루스, 기생충 왁찐 및 기타 현재 시판되고 있거나 개발과정에 있는 것과 같은 현재 중화된 왁찐의 소요투여량을 감소시킴에도 용이하게 이용할 수 있다고 생각한다.

Claims

비루스와 그의 항원성분을 함유하는 농축된 물질에서 비루스를 가영 비활성화 시키는 공정에 있어서, 농축된 물질을 단백물지로 희석시키지 않고 101 내지 104℃의 온도에서 두엘시간 1 내지 15 분 동안 상기 가열 비활성화 공정을 밟게 함으로써 개량된 것을 특징으로 하는, 비루스의 가열 비활성화 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 농축된 물질이 어떤 안정화 물질로도 희석되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 농축된 물질이 기타의 혈청 단백질을 제거함으로써 상기 비루스를 함유하는 혈청으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 기타의 혈청단백질을 제거함으로써 상기 농축된 물질을 형성하는 단계가 비루스 함유 물질을 어떠한 단백질로도 희석시키지 않고 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 가렬 비활성화를 항원 함유 입자가 적어도 1㎎/㎖의 양으로 존재하는 농축된 물질에 대하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 열 비활성화 후, 농축물을 냉각시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, HBsAg 함유 입자는, A. 그에 함유된 기타의 혈청 단백질로부터 HBsAg를 분리시키기 위하여 혈장을 폴리에틸렌글리콜과 접촉시킴으로써 혈장으로부터 HBsAg를 침전시키는 단계. B. 분리된 HBsAg를 히드록실애퍼타이트에 부흡착 시키는 단계 C. 이와 같이 흡착된 HBsAg를 등밀도 원심분리 시키는 단계에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 입자가 1 내지 15분간 101 내지 104℃에 800 내지 1000mmHg의 압력하에 있는 가열 매체내에 현수된, 직경 0.1 내지 10mm의 관에서 가열되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 단백성 물질.
제 6 항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 단백성 물질.
제 7 항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 단백성 물질.
제 1 항에 있어서, 두엘시간이 2 내지 5분인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 항원 함유 입자가 HBsAg 입자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 항원 함유 입자가 0.5 내지 10㎎/㎖의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 물질이 적어도 95 중량%의 HBsAg 함유 입자를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 물질이 적어도 99 중량%의 HBsAg 함유 입자를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 가열비활성화를 8000 내지 1000mmHg의 압력에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 가열비활성화를 9000 내지 1000mmHg의 압력에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.