JP4974441B2 - 抗原性凝集物を得る方法と製剤におけるその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、医学分野に関し、特に、新しいワクチン製剤の使用に関する。
【0002】
本発明の技術的な目的は、全身性または粘膜経路で投与される現存する抗原の免疫原性を増強することができる、凝集した抗原性構造体、及びその製剤の製造法を開発することにある。
【0003】
本発明における方法は、顆粒抗原の抗原性凝集構造、他の抗原、及び凝集性、脱脂性または酸化性の特性を有する成分の添加、30〜500nmの凝集粒子の後選択、並びに生じた抗原性組成物の免疫原性を促進する、適当にアジュバントされたこれらの凝集物の製剤化を、生じる。
【0004】
HBsAgは、有効な免疫原であるため、ヒトにおいて広範に使用可能な最初のワクチン候補物質となり、初めて認可された一般向け抗B型肝炎組換えワクチンである。HBsAgタンパク質は、自己集合性の22nmの粒子である(ヘアマン(Heerman KH)、ゲーリッヒ(Gerlich WH)、1991、B型肝炎ウイルスの表面タンパク質(Surface protein of Hepatitis B virus)、マクラクラン(A. McLachlan)編、シーアールシー・プレス(CRC Press)、ボカラートン(Boca Raton)、アンハーバー(Ann Harbor)、ボストン、ロンドン、109頁)。HBsAgに対する免疫応答の分子的、細胞的および遺伝子的基礎は、ハツカネズミのモデルで広範に研究されている(ミリチ(Milich, DR)、1987,B型肝炎ウイルス抗原のT細胞およびB細胞認識の遺伝的および分子的基礎、Immunol Rev. 99:71)。従来は、表面抗原の種々の物理化学的性質が、MHCクラスIで特定されるT細胞の免疫原性に、いかに影響を与えるかが研究されていた。MHCクラスIで特定される細胞障害性Tリンパ球の有効な応答は、アジュバントを用いることなく、22nmの粒子化された天然抗原のたった一度の低量注入、または界面活性剤変性モノマーで生じることが証明されている(シャームベック(Schirmbeck, R)ら、1994,Eur. J. Immunol. 24:1088)。また、直径約1μmの粒子を産生する、熱変性により得られるHBV表面抗原の凝集物からなる製剤の免疫原性も、研究されている。
【0005】
生体内における抗原処理の種類は、主なT細胞応答能及び関与するT細胞のサブクラス範囲に重要な影響を及ぼす。MHCへのペプチドの提示において、MHCクラスIICD4+制限T細胞と、MHCクラスICD8+制限T細胞について、明らかに別のプロセスが作用している(ジャーメイン(Germain, RN)ら、1993, Annu Rev. Immunol. 11:403)。MHCクラスI制限エピトープを提示するための、外因性HBsAg粒子処理の新しいエンドソーム経路が、記載されている。この熱変性した直径1μmの外因性HBsAg粒子の処理は、マクロファージでは起きるが、他の種類の細胞では起きず、処理マクロファージからの抗原性ペプチドの逆流を伴う。この外因性抗原MHCクラスI制限ペプチドの生成プロセスは、仮に食作用経路と呼ばれている。天然の22nmのHBsAg粒子は、主にエンドサイトーシス経路により処理され、1μm凝集物は食作用経路により処理される。これら2つのHBsAg外因性調製物は、異なるインビトロ処理に加え、これらがアジュバントなしで送られた場合には、クラスI細胞障害性Tリンパ球(CTL)に対する生体内での免疫原性が顕著に異なっていた。天然のHBsAg粒子は、免疫原性が高いが、変性した表面抗原凝集物は、免疫原性が低かった(シャームベック(Schirmbeck, R)ら、1995, J. Immunol. 155:4676-4684)。
【0006】
蛍光偏光を使用して行われた他の研究は、HBsAg粒子が、タンパク質凝集物と相互作用する脂質二重層として構成されることを示唆している(ソンボー(Sonveaux N.)、1985 Res Virol 146(1):43-51)。
【0007】
クロロホルム−メタノール(2:1、v/v)50% 1,1’、3,3’−テトラメチル尿素によるHBsAg処理は、その脂質の大部分が放出されたにも拘らず、粒子の形態に影響を与えなかった(平均直径を維持した)。脱脂により、抗原性とHBsAgポリペプチドの組成は、変化しなかった(ニューラス(Neurath AR)ら、1978 Intervirology 10(5):265-75)。粒子凝集物が、例えば、カオトロピック剤の存在、適度な温度、かつ高濃度溶液といった、ストレス条件下でのプロセスにおいて産生されないことを考慮して、組換えB型肝炎表面抗原の粒子凝集物の供給源が、免疫親和性と分子サイズ排除クロマトグラフィー法の組合せにより研究されている。分子排除クロマトグラフィーでHBsAgに対応するピークのベースの上昇を引き起こす要因の研究は、HBsAg粒子のサイズ変動性に加え、粒子凝集物の存在を証明した(トレウガブロバ(Tleugabulova D.) 1998 J Chromatogr B Biomed Sci Appl 707(1-2):267-73、トレウガブロバ(Tleugabulova D.) 1997 Chromatographia 45:317-320)。その結果、大きな粒子凝集物に対応する画分で凝集抗原が得られたが、天然のHBsAgタンパク質は見つからず、この文献の他の結果は、凝集物が、SDS−PAGEにおけるモノマーやダイマーとしてのみならず、正確に折り畳まれた表面抗原として泳動する、22nm粒子により形成されることを証明している(トレウガブロバ(Tleugabulova D.) 1998 J Chromatogr B Biomed Sci Appl 716(1-2):209-19)。
【0008】
発明の開示
本発明の対象の1つは、起源である抗原より高い免疫原性を有する凝集した抗原性構造体を得るための方法である。該方法は、以下の工程を含む:
A)目的の抗原を選択する工程、
B)凝集プロセスを促進する媒体中への混合物の1の抗原または数種の抗原を添加する工程(該媒体は、凝集能力を有する、化学物質、酸化剤、または他の成分を含有してもよい。)、
C)混合物をインキュベーションする工程、
D)例えば、分子排除クロマトグラフィー、透析ろ過、および透析といった、これら混合物の分子サイズを保持できる方法により、30〜500nmのサイズの粒子凝集物を選択する工程、
E)選択されたアジュバントの添加、並びに他の抗原、安定剤および保存剤の有効な添加により、工程(C)において選択された抗原性構造体を混合することにより製剤を調製する工程。
【0009】
本発明の方法により、HBVの表面抗原のみを含有するいくつかの凝集物を、得ることができるが、本発明の方法により得られる凝集物は、表面抗原と、ウイルス性、細菌性、単一細胞性または多細胞性の病原体由来の他のリポタンパク質、リポペプチドまたは脂質の同族または異種の抗原との組合せをも含む。
【0010】
本発明の方法において、工程(B)で得られる構造体の一部をなす抗原は、疎水性、静電性または共有結合性による相互作用により、B型肝炎ウイルスの表面抗原に付加し、異なるサイズの凝集物を生成することができる。
【0011】
抗原性構造体を得る方法は、B型肝炎ウイルス表面抗原への、B型肝炎、C型肝炎、またはHIVのヌクレオカプシド抗原の凝集を可能とし、また不活性化ウイルスまたは髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)のような細菌病原体の外膜タンパク質といった、ウイルスや細菌からの抗原も凝集することができる。
【0012】
凝集した抗原性構造体を得るために、本粒子の脱脂、膜結合および凝集を促進する化学物質として、β−シクロデキストリンを使用することができ、他の化学物質としては、銅及び鉄の金属塩並びに他の凝集を可能にする物質により強化された、10〜50nMのアンモニア塩がある。
【0013】
自発的に凝集活性をもたらす目的のために、その方法で、一緒にまたは単独で使用される他の成分は、HBsAgに対する凝集活性を示す同種または異種抗原であり、それらには、ウイルスヌクレオカプシド抗原、更には細菌外膜誘導体またはリポタンパク質若しくは疎水性物質からなるウイルスエンベロープがある。同じ性質のアジュバントは、HBsAg凝集と、HBsAgとアジュバント自体との凝集を促進することも見出された。
【0014】
一般に、本発明の方法は、選択された成分に応じて、10分〜1週間のインキュベーションで、疎水性相互作用、静電的結合または共有結合を進展させることにより、HBsAgの凝集、またはHBsAgと他の抗原若しくはアジュバントとの凝集を可能にする。
【0015】
凝集物の分離は、分子サイズ排除法により行われ、そのような方法には、分子排除クロマトグラフィー、透析、透析ろ過、または30〜500nmの分子サイズの保持を可能にする他の方法がある。
【0016】
我々は、シャームベック(Schirmbeck)(シャームベック(Schirmbeck, R)ら、1995, J. Immunol. 155:4676-4684)により得られたものと同様に、非変性法(最高温度28℃)により約1μmのサイズの凝集物を生成することができたものの、体液性応答やDTHを評価すると、これら凝集物は、低い免疫原性のままであった。ミョウバンでアジュバントされた、30〜500nmの粒子凝集物のみが、天然の抗原による対照より、有意に高いIgGレベルの生成を証明し、更に、DTHやIgG2a応答の顕著な上昇を示した。これはすべて、分子排除クロマトグラフィーによる抗原の後選択の重要性を示している。このような性能は、目的の抗原における異なった提示および/または処理によって発揮させることができる。
【0017】
さらに本発明によれば、生じた構造体が、ミョウバンやカルシウム塩のようなアジュバント、または油性若しくは他の市販されているアジュバントへ吸着することが予測される。また、他の抗原、安定剤および保存剤を、最終製剤に加えることもできる。
【0018】
本発明の他の対象は、既に記載された方法に従って得られる凝集した抗原性構造体であり、これは、生じる製剤の免疫原性の増強と、関与するエピトープの免疫系による特異な認識を促進する。該凝集した抗原性構造体は、単独または凝集物を形成する他の抗原との組合せにおいて、B型肝炎ウイルス表面抗原が存在することを特徴とする。これらの他の抗原としては、リポタンパク質または疎水性物質があり、中でも、HBcAgは、更に、疎水性結合によりこれらの間の凝集物形成を促進するという固有の性質を有する。他の疎水性のウイルスカプシドとリポタンパク質抗原は、この性能を示し、それらには、プロテオリポソーム小胞中の髄膜炎菌(N. meningitidis)の外膜および一部のウイルスエンベロープ抗原に加え、C型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、並びにHIV1及び2のヌクレオカプシド抗原がある。
【0019】
本発明の抗原性構造体の中には、HBsAgと疎水性アジュバントとの会合が含まれ、これは、同じ前記の方法による凝集物の一部とすることができる。一般に、本発明の抗原性構造体は、記載の方法による少なくとも1つ、2つまたはそれ以上の疎水性粒子の凝集と少なくとも1つの粒子特性により得ることができ、実施例に記載のように電子顕微鏡により可視化することができる。これらの構造体の凝集は、一般的な方法で、免疫調節、特異的認識、および免疫原性増強を促進する。本発明の抗原性構造体におけるこれらの特徴によれば、全身および粘膜経路を通じて、予防および治療のためのヒト及び動物のワクチンを合理的に設計するために、それら構造体を使用することができ、更に、診断系においてそれら構造体を使用することができる。
【0020】
この種の抗原を得るための方法の使用で生じる新たな製剤の利点には、免疫原性、新規アジュバントに対する共同捕捉能、免疫モジュレーター、及び凝集中の抗原の増加がある。
【0021】
本発明の方法から得られる製剤は、接種経路と免疫される種に応じて、0.01〜10mlの容量で使用することができ、抗原量は、最終ワクチン製剤中0.001〜1mgで変動させることができる。
【0022】
【実施例】
実施例1
シクロデキストリンの使用により得られる凝集したB型肝炎ウイルスの表面抗原のワクチン製剤の調製
【0023】
粒子は、粒子から脂質を低下させる活性の有る化合物を用いて、抗原を調節処理することにより、22nmの未変性の抗原から得、この際、1mg/mlより高濃度のシクロデキストリンが使用された。その濃度に応じて、インキュベーション時間は、24時間〜7日間で変化させた。この測定法で使用されるインキュベーション温度は28℃であったが、より高温およびより低温でも凝集物を得ることが可能であることが観察されている。温度は、酸化及び脂質低下による部分的脱脂プロセスを促進する要因である。後に、ゲルろ過と電子顕微鏡により異なる凝集物を分析し、0.1nmから沈降する程巨大なサイズまでの粒子を見出した。沈降した残渣を遠心分離して除去した後、抗原を、そのサイズにより選択して免疫化学分析を行い、これにより、タンパク質レベルに関連して脂質レベルが減少することが実証された。これらの凝集物は、保存期間中、高い安定性を有することが、HPLCにより示された。抗原を、5〜100μg/mlのβ−シクロデキストリンを用いて1〜240時間、20〜37℃の温度で調製処理すると、免疫化学分析のための、溶出時間からなる後選択を可能にするサイズ範囲を得ることができた。
【0024】
次に、凝集抗原を、最終濃度0.002〜0.1mg/mlのミョウバンに吸着させ、免疫原性分析に使用した。
異なる時間と温度でのシクロデキストリンとのインキュベーションには、リポ多糖およびサポニンといった免疫調節化合物を添加し、これは、ミョウバンに吸着された最終凝集物の一部となり、最終ワクチン製剤を産生した。
【0025】
実施例2
酸化剤を使用するB型肝炎ウイルス表面積凝集物のワクチン製剤の調製
【0026】
正常の抗原に酸化化学物質を加えると、シクロデキストリンを用いる方法と同様の、制御時間、温度および濃度の条件下で、脱脂が可能であった。9〜44mMの過酸化2硫酸アンモニウムのような塩は、22nm抗原粒子から始まる脱脂抗原の生成を可能とし、粒子の融合によりサイズを上昇させることができた。最適粒子サイズは、ゲルろ過により選択した。Laアジュバントの吸着は、ミョウバンで達成された。
【0027】
実施例1と同様にして、インキュベーション中に異なる量の他のアジュバントと免疫モジュレーターを凝集物中に含めることができた。
【0028】
実施例3
酵母のインキュベーション条件の変更により得られる、過剰粒子化学構造体からなるワクチン製剤の調製
【0029】
粒子を、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)酵母株から自然に得、その化学的特性によって精製プロセスの間に、抗原を選択した。抗原産生プロセスは、100時間より長い永続的な培養時間で、酸ストレス条件で行なった。このプロセスは、抗原の一部を22nmの未変性状態で維持することを可能にするが、ゲルろ過から得られる異なるピークの試料に対してされた脂質とタンパク質の分析が示すように、細胞内酸化条件の増強により、重要な部分が凝集及び脱脂された。最後に、画分を、TSKG5000カラムでHPLCゲルろ過により分離した。この物質は、実際に廃棄される総抗原の10%まで達する。ミョウバンアジュバント吸着は、正常の抗原と同様の条件下で達成される。
【0030】
両抗原の分析により、以下の表において、両抗原のリン脂質に対して示される全種の脂質の大幅な喪失を伴うプロセスで、HBsAgが凝集されることが証明された。
【0031】
【0032】
この実施例は、自然酸化プロセスや脱脂プロセスの後に、新たな過剰粒子化抗原が得られることを証明する。これらの凝集物の安定性は、疎水性領域を露出する粒子から脂質の除去する間、及びスルフヒドリル基が露出した時の粒子間のタンパク質重合により、生じると考えられる凝集プロセスに基づくであろう。
【0033】
実施例4
凝集HBsAg免疫原性の評価
【0034】
粘膜経路のためにミョウバンに吸着されたかPBS中にある、実施例3で生じた凝集HBsAgの免疫原性を評価するために、0、14および28日目に接種し、42日目に眼窩後方から採血する免疫スケジュールを実施し、10〜15週令のメスのBalb/cマウスを、鼻腔内経路および筋肉内経路で免疫した。マウス1匹当たりの投与量をこの実施例の最後で表に示し、結果を図1Aに示し、HBsAg凝集物を図1Bに示す。
【0035】
結果の統計解析は、スチューデント検定により行い、p<0.05を有意差とみなした。
【0036】
この実験から、正常の抗原では、同一条件において、粘膜経路または全身性経路で免疫した場合には、高いHBsAg IgG応答が得られることが証明された。同一の図において、DTH応答(棒グラフ)に対する抗原の効果の比較を示したが、これもまた、凝集した変異抗原で有意に高い結果となった。
【0037】
免疫群を以下の表に示す。
【0038】
【0039】
実施例5
抗HBsAg IgG応答の動態
抗HBsAg IgG応答の動態を調べるために、10〜15週令のメスのBalb/cマウスを免疫した。使用したスケジュールは以下の通りである:0、2および18週に接種し、免疫前採取を4、6、8、10、12、14、16および20週に行った。試験した群を以下の表に記載する:
【0040】
【0041】
第5群と6群、第7群と8群、および第9群と10群の抗原を、異なる時間及びシクロデキストリン濃度でインキュベートして得、異なる凝集度を得た。
【0042】
DTH実験では、測定を、1(1,3)、2(1’、3’)、3(1”、3”)、および5(1''',3''')日目に行った。
【0043】
結果の統計解析は、スチューデント検定により行い、p<0.05を有意差とみなした。
【0044】
この実験で、凝集度の異なる脱脂したHBsAgは、個々に異なる免疫学的特性を有することが証明された。抗体の発生動態によれば、実験の最後には、免疫原性の大きさは、より大きな凝集度を持つ変異体に対応していたが、より大きな免疫原性とDTH応答は、大きな抗原サイズではなく中間の抗原サイズに対応していた。しかし、PBS中の抗原で免疫したものと比較して、ミョウバンアジュバントで免疫した群でDTH応答の有意な上昇が認められ、中間サイズの凝集抗原の群は、より大きな上昇を引き起こし、これは56日目に有意になった。図2aでは、すべての免疫群について56日目の個々の力価を示す。また、この図は、20μlの接種量で右足に20μgのHBsAgそして左足にPBSを接種し、22週の5日間に行ったDTH実験の結果を示す。実施例3に記載のようにして得られた、中間凝集レベルのミョウバンアジュバントされたHBsAgを接種した第3群と比較して、すべての休止群は、右足と左足の直径の差に関して有意に低い応答を有した。実施例3において、過剰粒子構造体の場合の認識が、HBsAgで認識されるエピトープに関してより広く、この種類の構造体の良好な性能を示していることに注意されたい。第5群〜第10群で、抗未変性HBsAg反応性は、ほとんどの時間で未変性のHBsAgで免疫して得られたものと類似していたが、凝集抗原中に存在する他のエピトープに対しても強い応答が得られる。例8、図4を参照されたい。
【0045】
実施例6
IgG1/IgG2a比の評価
【0046】
TH1/TH2応答の関係のために、IgG1/IgG2a比の変動があるかどうかを調べるために、実施例4の免疫スケジュールのD群とE群の血清を、抗IgG1とIgG2a抗体レベルについて試験した。分析は42日目に採取した血清について行った。ミョウバンでアジュバント化した正常HBsAgと比較して、過剰粒子化抗原(50〜500nm)を免疫した群では、IgG2a抗体レベルが有意に上昇し、IgG1/IgG2a比はほとんど1になった(図4)。
【0047】
ミョウバンで免疫した正常HBsAg群のIgG1/IgG2a比は、中間サイズの脱脂HBsAg群のIgG1/IgG2a比より6.2倍高かった。この実験から、表面抗原の異なる提示は、増強されたIgG型に関して量的な変化ばかりでなく質的な変化をも引き起こし、IgGサブクラスパターンのこれらの変化と細胞応答の増強との相関性は、DTH評価結果を確認するものと、結論付けることができる。
【0048】
実施例7
異なる抗原変異体で免疫したマウス血清の抗未変性HBsAg反応性の試験
【0049】
実施例1、2および3で得られた脱脂抗原でマウスを免疫後、これらの血清の反応性を、正常の抗原で免疫したマウスの血清と比較した。この実験の結果、異なる変異体で免疫したマウスの血清中に生じた免疫応答は、正常のHBsAg(22nm)に対して異なる反応性を有し、主要な反応性は、正常の抗原で免疫したマウスの血清で示され、その一方で、脱脂の程度が異なるものでは、HBsAgに対する反応性も異なっていた、ことが認められた。それら自体の免疫原性に対して高力価を有するものであっても、高度に酸化された変異体で免疫したマウスの血清は、HBsAgを認識せず、異なる免疫原で作成された抗体の異なる認識を示し、新たに作成された構造体の異なる抗原性を証明している。従って、実施例5の結果は、最後の3つの抗原変異体について、同様の抗未変性HBsAg応答が得られるが、未変性のHBsAgで免疫することによっては認識されない他のHBsAgタンパク質エピトープに対する応答も存在することを、考慮しなければならない。
【0050】
実施例8
異なる抗原変異体で免疫したマウス血清による線状エピトープの認識
【0051】
実施例2に記載の酸化変異体により得られた過剰粒子HBsAgにより示される抗体の認識を比較するために、線状のHBsAg配列(S領域)を含有するセルロース膜でマッピングを行い、それぞれが6つ重複して全タンパク質配列が完成する、12のアミノ酸からなる37のペプチドを合成した。
【0052】
セルロース膜でのエピトープマッピングは、ロナルド・フランク(Ronald Frank)(フランク(Frank, R.)、1992 Tetrahedron 48:9217-9232)に従って行った。血清試料は、1/100希釈で測定した。
【0053】
正常の抗原、及び同じ抗原の異なる凝集変異体を接種したマウスの血清で得られる結果は、両方の抗原の間に同様の線状エピトープ認識パターンが存在しないことを示し、そのことが、HBsAg及びその凝集変異体の表面に存在するBエピトープについて、異なる提示を生じている、ということを結論付けた(図4)。
【0054】
実施例9
HBsAgとヌクレオカプシド抗原との凝集物の形成。免疫学的評価
【0055】
0.1mg/mlのHBsAgとHBcAgを含有する等量の2つの調製物を、4℃で一晩インキュベートし、次いで、HPLC TSK G6000分子排除クロマトグラフィーにより、凝集物を得た。これら凝集物の一の試料を、電子顕微鏡可視化技術のために処理し、他の試料を、電子顕微鏡により確認された凝集物及び別々の両抗原とともに、鼻腔内接種による、Balb/cマウスおける一の免疫スケジュールでの、その免疫学的評価を行なうために使用した(図5A)。
【0056】
結果は、鼻腔内経路によって、両方の凝集抗原の混合物が、HBsAgに対する応答の増強を可能にすることを示した(図5B)。
【0057】
図の群を以下の表に示す:
【0058】
【0059】
他のカプシド抗原(例えば、C型肝炎およびHIV)を使用して混合物を調製した時も、同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図1】 (A)3つの投与スケジュール(0、2および4週)。採取は、第6週に行った。最初の3群に、50μlを鼻腔内接種した。残りの2つの群には、100μlのミョウバンを筋肉内経路で接種した。
(B)凝集したHBsAg(メートル;200nm)
【図2】 3つの投与スケジュール(0、2および8週)。すべての群に、100μlを筋肉内経路で接種した。抗体の値は、第8週に対応する(図2a)。第22週の間、DTH試験を行った。図2bは、5日間の第1群と3群のDTH値である。図2Cは、スケジュール中の力価上昇の動態を示す。
【図3】 図1の3つの投与スケジュール(0、2および4週)。第6週に採取したD群とE群の血清の分析。両方の群に、100μlのミョウバンを筋肉内経路で接種し、D群には脱脂HBsAg(50〜500nm)、E群には正常のHBsAgを同じ用量で投与した。グラフは、両群の各マウスのIgG1/IgG2a比の幾何平均値と間隔を示す。
【図4】 線状の配列を含有するセルロース膜でのHBsAgのS領域の重複ペプチドのマッピング。1/100希釈の血清プールを分析した:1、HBsAg(正常);2、HBsAg(凝集);(3〜5:凝集抗原で免疫して得られたモノクローナル抗体(MAb);3、クローン6;4、クローン7;5、クローン8);6、無関係の血清;7、MAb(Hep1)。4つのカラー強度は、ペプチドに対する応答を示す。ブランク:陰性応答、明るい灰色:わずかに陽性の応答、暗い灰色:陽性応答、黒:強い陽性の応答。
【図5】 (A)HBsAg凝集物とHBcAgの電子顕微鏡。中央の高電子密度はHBcAgに対応し、他はHBsAgである。
(B)2つの投与スケジュール(0、14日)。第26日の血清の分析。
Claims (23)
- B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)粒子を、該抗原粒子の部分脱脂のための成分を含む媒体へ添加する工程と、
得られた混合物をインキュベーションして該抗原粒子の部分脱脂を促進し、それにより該抗原粒子の凝集物を形成する工程と、
50〜500nmのサイズの該粒子凝集物を選択する工程と、
該選択された粒子凝集物に、アジュバントを添加する工程と
を含む、抗原性構造体の製造方法。 - 抗原として、B型肝炎ウイルスヌクレオカプシド抗原(HBcAg)粒子を、前記B型肝炎ウイルス表面抗原粒子と共に、前記媒体中へ添加する、請求項1に記載の抗原性構造体の製造法。
- 前記媒体が、脱脂成分として、β−シクロデキストリンを含む、請求項1又は2に記載の抗原性構造体の製造法。
- 前記媒体が、脱脂成分として、10〜50nM濃度の過酸化2硫酸アンモニウムを含む、請求項1又は2に記載の抗原性構造体の製造法。
- 前記媒体が、B型肝炎ウイルス表面抗原粒子の自発的凝集を促進する能力を有する、部分的または完全に疎水性のアジュバントを含む、請求項1から4の何れか1項に記載の抗原性構造体の製造法。
- 前記媒体が、疎水性、共有結合性または静電結合性により、HBsAg粒子の、またはこれと他の抗原粒子との凝集を促進できる特性を有する化合物を含む、請求項1から4の何れか1項に記載の抗原性構造体の製造法。
- 前記インキュベーションの時間は、選択される凝集手段に応じて10分〜1週間である、請求項1に記載の抗原性構造体の製造法。
- 分子排除クロマトグラフィー、透析、透析ろ過、または50〜500nmの分子サイズを保持できる他の選択方法により、50〜500nmの粒子凝集物を選択する、請求項1記載の抗原性構造体の製造法。
- 前記アジュバントが、ミョウバン若しくはカルシウム塩、又は油性若しくは他の市販されているアジュバントである、請求項1に記載の抗原性構造体の製造法。
- 請求項1から9の何れか1項に記載の方法により得られた抗原性構造体に、アジュバンド、他の抗原、安定剤または保存剤を加える工程を含む、ワクチン製剤の製造法。
- 請求項1に記載の方法で得られる抗原性構造体。
- B型肝炎ウイルス表面抗原粒子及びアジュバントを含む50〜500nmの粒子凝集物からなる、抗原性構造体。
- 前記粒子凝集物が、B型肝炎ウイルス表面抗原粒子及びB型肝炎ウイルスヌクレオカプシド抗原粒子を含む、請求項12に記載の抗原性構造体。
- 前記アジュバントが、疎水性アジュバントである、請求項12に記載の凝集した抗原性構造体。
- 前記アジュバントが、ミョウバン又はカルシウム塩である、請求項12に記載の抗原性構造体。
- 前記粒子凝集物が、β−シクロデキストリンを含む、請求項12に記載の抗原性構造体。
- B型肝炎ウイルス表面抗原及びB型肝炎ウイルスヌクレオカプシド抗原を、これら抗原粒子の部分脱脂のための成分を含む媒体中へ添加する工程と、
得られた混合物をインキュベーションして該抗原粒子の部分脱脂を促進し、それにより該抗原粒子の凝集物を形成する工程と、
50〜500nmのサイズの該粒子凝集物を選択する工程と
を含む、抗原性構造体の製造方法。 - 請求項17に記載の方法により得られた抗原性構造体に、アジュバンド、他の抗原、安定剤または保存剤を加える工程を含む、ワクチン製剤の製造法。
- B型肝炎ウイルス表面抗原粒子及びB型肝炎ウイルスヌクレオカプシド抗原粒子を含む50〜500nmの粒子凝集物からなる、抗原性構造体。
- 請求項11から16及び19のいずれかに記載の抗原性構造体を含む、診断キット。
- 請求項11から16及び19のいずれか1項に記載の抗原性構造体を含む、ワクチン製剤。
- 請求項11から16及び19のいずれか1項に記載の抗原性構造体と、アジュバント、安定剤または保存剤とを含む、ワクチン製剤。
- 全身投与または粘膜投与のための、請求項21又は22に記載のワクチン製剤。
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