WO2002043756A2

WO2002043756A2 - Método de obtención de agregados antigénicos y su uso en formulaciones

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Publication number: WO2002043756A2
Application number: PCT/CU2001/000009
Authority: WO
Inventors: Julio César AGUILAR RUBIDO; Eduardo PENTÓN ARIAS; Dina Tleugabulova; Minerva Sewer Mensies; Verena Lucila MUZIO GONZÁLEZ; Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO; Iloki Assanga Simon Bernard; Luis Javier Cruz Ricondo; Viviana FALCÓN CAMA; Yanet TÁMBARA HERNÁNDEZ
Original assignee: Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2002-06-06
Also published as: RU2266754C2; ZA200303948B; EP1346727A2; ES2342150T3; KR100873675B1; AR031437A1; US20040202676A1; CN1477972A; AU2151802A; WO2002043756A3; KR20030068161A; EP1346727B1; BRPI0115859B1; CN1253206C; DE60141978D1; ATE465752T1; PT1346727E; CA2429543A1; US20090104223A1; BR0115859A

Abstract

Esta invención se relaciona con un método de obtención de estructuras antigénicas agregadas, capaces de potenciar la respuesta inmune a antígenos agregados administrados por vía sistémica y/o mucosal, así como con las estructuras químicas, formulaciones de dichas estructuras y su uso. A partir del uso de agentes o compuestos agregantes, delipidantes u oxidantes, se permite la liberación de lípidos de las partículas y la agregación de las mismas. El estado de agregación se puede provocar en el interior de la levadura variando las condiciones de incubación. Las estructuras resultantes pueden utilizarse adyuvadas y/o con varios antígenos, produciéndose sinergismo entre los componentes con respecto a la respuesta inmunogénica , pudiendo contener estabilizadores y preservos. Estas nuevas estructuras antigénicas son aplicables en la industria como formulaciones vacunales, preventivas o terapéuticas, para uso humano, veterinario y /o diagnóstico.

Description

MEMORIA DESCRIPTIVA

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE AGREGADOS ANTIGÉNICOS Y SU USO EN FORMULACIONES.

Sector Técnico

La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el uso de nuevas formulaciones vacunales.

El objetivo técnico que se persigue con la invención propuesta es el desarrollo de un método de obtención de estructuras antigénicas agregadas y sus formulaciones, capaces de potenciar la inmunogenicidad de los antígenos contenidos a partir de la inmunización sistémica y/o mucosal de los mismos. El método descrito en la presente invención genera estructuras antigénicas de naturaleza agregada de antígenos particulados, la adición de otros antígenos, compuestos con características agregantes, delipidantes u oxidantes, la selección posterior de partículas agregadas entre 30 y 500 nm de tamaño, y la formulación de dichos agregados convenientemente adyuvados favorecen la inmunogenicidad de la composición antigénica resultante.

Técnica Anterior

Dado que el HBsAg es un inmunógeno eficiente, se convirtió en el primer candidato vacunal de amplio uso en humanos y en la primera vacuna anti hepatitis B recombinante licenciada para uso universal. Las proteínas del HBsAg se autoensamblan en partículas de 22 nm (Heerman KH, Gerlich WH,

1991 Surface protein of Hepatitis B virus. A. McLachlan, ed. CRC Press, Boca Ratón, Ann Harbor, Boston, London, p.109). Las bases moleculares, celulares y genéticas de la respuesta inmune al HBsAg han sido estudiadas extensivamente usando el modelo murino (Milich, DR. 1987. Genetic and molecular basis for T- and B- cell recognition of hepatitis B viral antigens.

Immunol Rev. 99: 71 ). Con anterioridad se había estudiado cómo los cambios en las propiedades fisicoquímicas del antígeno de superficie afectan su inmunogenicidad para células T restringidas al MHC clase I. Se evidenció que con una sola inyección de una dosis baja de antígeno particulado de 22 nm (nativo) o con monómeros de antígeno desnaturalizado por detergentes, sin adyuvantes, se genera una respuesta primaria CTL eficiente, restringida a MHC clase 1 (Schirmbeck, R. et al. 1994. Eur J Immunol. 24: 1088). También se ha investigado la inmunogenicidad de una preparación de agregados del antígeno de superficie, obtenidos por desnaturalización con calor hasta producir partículas de aproximadamente 1 μm de diámetro. El tipo de procesamiento antígénico in vivo tiene una influencia fundamental en la eficiencia de la respuesta primaria de células T así como en el espectro de subclases de células T involucradas. En la presentación de péptidos en el

MHC operan aparentemente procesos alternativos para las células T CD4+ restringidas a MHC clase II y para células T CD8+ restringidas a MHC clase I (Germain, RN. et al. 1993. Annu Rev Immunσl. 11 : 403). Se ha descrito una nueva vía endosomal para el procesamiento de partículas de HBsAg exógenas para la presentación de epítopes restringidos al MHC clase I. Este procesamiento de HBsAg exógeno, desnaturalizado por calor y de 1 μm de diámetro, ocurre en macrófagos, pero no en otros tipos de células y está acompañado de regurgitación de péptidos antigénicos desde el macrófago procesador. Este proceso de generación de péptidos de antígenos exógenos para presentación restringida a MHC clase I se ha designado tentativamente como la vía fagocítica. Las partículas de HBsAg nativas de 22 nm son procesadas fundamentalmente por vía endocítica y los agregados de 1 μm por vía fagocítica. Además del diferente procesamiento in vitro de estas dos preparaciones exógenas del HBsAg, su inmunogenicidad in vivo para CTL clase I fue marcadamente diferente cuando se enviaron sin adyuvantes. La partícula de HBsAg nativa fue de alta inmunogenicidad mientras que los agregados desnaturalizados del antígeno de superficie fueron de baja inmunogenicidad (Schirmbeck, R. et al. 1995. J Immunol 155: 4676-4684). Otros estudios realizados utilizando la polarización de la fluorescencia sugieren que la partícula de HBsAg está organizada como una bicapa lipídica que interactúa con agregados de proteínas (Sonveaux N. 1995 Res Virol 146 (1 ):43-51). El tratamiento del HBsAg con cloroformo-metanol (2:1 , v/v) o con 50% 1 ,1',3,3'-tetrametilurea no afectó la integridad morfológica de las partículas (mantuvieron su diámetro promedio), aunque una porción mayoritaria de sus lípidos fue liberada. La antigenicidad y composición polipeptídica del HBsAg no se alteró por la delipidación (Neurath AR et al 1978 Intervirology 10(5):

265-75).

Teniendo en cuenta que las agregaciones de partículas no se producen en las condiciones de estrés en que se desenvuelve el proceso de producción, como la presencia de agentes caotrópicos, temperaturas moderadas y soluciones altamente concentradas, la fuente de agregación de las partículas del antígeno de superficie de hepatitis B recombinante ha sido estudiada usando una combinación de técnicas de inmunoafinidad y cromatografía de exclusión molecular. La investigación de los factores que conducen a un incremento en la base del pico correspondiente al HBsAg en cromatografía de exclusión molecular arrojó como resultado que existen agregados de partículas, además de la variabilidad en tamaño de la partícula del HbsAg (Tleugabulova D. 1998 J Chromatogr B Biomed Sci Appl 707(1 -2):267-73, Tleugabulova D. 1997 Chromatographia 45: 317-320). Como resultado se obtuvo el antígeno agregado de la fracción correspondiente a los grandes agregados de partículas, y no en la fracción donde se encontraba la proteína

HBsAg nativa, otro resultado de este trabajo corrobora que los agregados están formados por partículas de 22 nm que migran como monómeros y dímeros en SDS-PAGE como el antígeno de superficie correctamente plegado (Tleugabulova D, et al. 1998 J Chromatogr B Biomed Sci Appl 25;716(1 -2): 209-19).

Descripción detallada de la invención

Uno de los objetos de la presente invención es un método de obtención de estructuras antigénicas agregadas de mayor inmunogenicidad que los antígenos que les dieron origen. Dicho método comprende los siguientes pasos: A) Selección de los antígenos de interés; B) Adición de uno o varios antígenos de la mezcla en un medio que favorece el proceso de agregación, dicho medio puede consistir en agentes químicos, agentes oxidantes u otros componentes con capacidad agregante

C) Incubación de la mezcla D) Selección de los agregados de partículas de tamaño entre 30 y 500 nm por un proceso que permita la retención de dichas tallas moleculares como cromatografías de exclusión molecular, diafiltración y diálisis. E) Obtención de las formulaciones a partir de la mezcla de las estructuras antigénicas seleccionadas en el paso (C) mediante la adición del adyuvante de elección, y además, la potencial adición de otros antígenos, estabilizadores y preservos.

En el método de la presente invención se pueden obtener agregados que contienen solamente al antígeno de superficie del VHB, también a combinaciones del antígeno de superficie y otros antígenos homólogos o heterólogos de naturaleza lipoproteica, lipopeptídica o lipídica, de cualquier patógeno viral, bacteriano, unicelular o multicelular.

En el método de la invención, los antígenos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) pueden agregarse al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B por interacciones hidrofóbicas, electrostáticas o covalentes, generando agregados de diversos tamaños.

El método de obtención de estructuras antigénicas permite la agregación del antígeno de la nucleocápsida del virus de la Hepatitis B, C, o HIV y el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B, también pueden agregarse antígenos procedentes de virus y bacterias como los virus inactivados y las proteínas de membrana externa de patógenos bacterianos como Neisseria meningitidis.

En el método de obtención de las estructuras antigénicas agregadas puede utilizarse a las β-ciclodextrinas como un agente químico que favorece la delipidación, asociación de membranas y agregación entre las partículas presentes, otros agentes químicos son las sales de amonio a concentraciones entre 10 y 50 mM, potenciadas por sales metálicas de cobre y hierro, u otras que permiten la agregación. Otros elementos del método que presentan actividad agregante espontánea, que pueden usarse de conjunto o solos con esta finalidad son los antígenos homólogos o heterólogos que evidenciaron actividad agregante sobre el HBsAg, entre ellos los antígenos de nucleocápsidas virales y también derivados de membranas externas de bacterias o cubiertas virales de naturaleza lipoproteica o hidrofóbica. También, se encontró qure adyuvantes de igual naturaleza favorecieron la agregación del HBsAg y del HBsAg con ellos mismos. En general el método de la presente invención permite la agregación del HBsAg o del HBsAg con otros antígenos o adyuvantes a partir del desarrollo de interacciones hidrofóbicas, uniones electrostáticas o covalentes, en períodos de incubación en un rango de entre 10 minutos y una semana en dependencia de los constituyentes seleccionados. La separación de los agregados se realiza por un método de tamizaje de acuerdo a la talla molecular, entre ellos forman parte del método la cromatografía de exclusión molecular, la diálisis, la diafiltración u otro método que permita la retención de las tallas moleculares entre 30 y 500 nm. Hemos demostrado además que, no obstante que es posible generar por métodos no desnaturalizantes (temperatura máxima 28°C), agregados de tallas que se encuentran en la proximidad del micrómetro, similar a los obtenidos por Schirmbeck (Schirmbeck, R. et al. 1995. J Immunol 155: 4676- 4684), éstos siguen siendo menos inmunogénicos al evaluar la respuesta humoral y DTH. Solo los agregados de partículas de una talla entre 30 y 500 nm, adyuvados en alúmina, han demostrado generar niveles de IgG significativamente superiores al control de antígeno nativo, además de un incremento significativo en la respuesta DTH, y de un efecto significativo en el incremento de la respuesta lgG2a. Todo esto evidencia la importancia de la ulterior selección del antígeno por cromatografía de exclusión molecular. La causa de este comportamiento pudiera estar dada por la diferente presentación y/o procesamiento por el sistema inmune del o los antígenos de interés.

Posteriormente el método de la presente invención prevee la adyuvanción de las estructuras resultantes a adyuvantes como las sales de aluminio, calcio, oleosos, u otro adyuvante comercialmente utilizado, además pueden adicionarse otros antígenos, estabilizadores y preservos a la formulación final.

Otro objeto de la presente invención es la estructura antigénica agregada obtenida de acuerdo al método anteriormente descrito, la que favorece un incremento en la inmunogenicidad de la formulación resultante y un reconocimiento diferencial por el sistema inmunológico de los epítopes involucrados. Dichas estructuras antigénicas agregadas se caracterizan porque contienen al antígeno superficie del Virus de la Hepatitis B, solo o en combinación con otros antígenos formando el agregado. Estos otros antígenos son lipóproteicos o de carácter hidrofóbico, entre ellos el HBcAg, y poseen además la propiedad intrínseca de favorecer el estado agregado entre ellos por uniones hidrofóbicas. Otros antígenos de cápsida viral y lipoproteicos o de naturaleza hidrofóbica han demostrado poseer esta capacidad, entre ellos los antígenos de nucleocápsida del Virus de la

Hepatitis C, del papiloma humano y de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 2, además antígenos de membrana externa de Neisseria meningitidis en vesículas proteoliposomales y algunos antígenos de cubiertas virales. Entre las estructuras antigéncas objeto de la presente invención se encuentran las asociaciones del HBsAg con adyuvantes de naturaleza hidrofóbica los cuales pueden formar parte del agregado por el mismo método previamente descrito. En general las estructuras antigénicas objeto de la presente invención pueden obtenerse a partir de la agregación por el método anteriormente descrito de una, dos o más partículas de naturaleza hidrofóbica y al menos una de carácter particulado y son visibles por microscopía electrónica como se describe en los ejemplos. La agregación de estas estructuras favorecen la modulación inmunológica, el reconocimiento diferencial y el incremento de la inmunogenicidad de manera general. Teniendo en cuenta estas características de las estructuras antigénicas objeto de la presente invención, es posible el uso de las mismas para el diseño racional de vacunas humanas y veterinarias, tanto preventivas como terapéuticas, a través de rutas sistémicas y mucosales y su uso en sistemas diagnósticos. Entre las ventajas de los nuevos preparados resultantes por la utilización del método de obtención de este tipo de antígenos se encuentran: el incremento en la inmunogenicidad, la posibilidad de coatrapamiento de nuevos adyuvantes, inmunomoduladores y antígenos durante la agregación. Los preparados resultantes del método objeto de esta invención pueden presentar, en dependencia de la ruta de inoculación y las especies a inmunizar, volúmenes de 0.01 hasta 10 mL y la dosis de antígeno puede variar entre 0.001 a 1 mg en la formulación vacunal final.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

Ejemplo 1. Obtención de formulaciones vacunales de agregados del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B obtenidos con el uso de ciclodextrinas.

Las partículas fueron obtenidas a partir del antígeno nativo de 22 nm por tratamiento controlado del antígeno con compuestos químicos de actividad sustractora de lípidos de la partícula, en este caso se utilizaron las ciclodextrinas a concentraciones superiores a 1 mg/mL y, en dependencia de la concentración de las mismas el tiempo de incubación varió, de 24 horas a 7 días. La temperatura de incubación utilizada en este ensayo fue de 28 °C aunque hemos visto que a temperaturas mayores y menores, es posible obtener a los agregados. La temperatura es un factor que favoreció el proceso de delipidación parcial a través de la oxidación y sustracción de lípidos. Posteriormente se analizaron por gel filtración y microscopía electrónica los diferentes agregados, encontrándose tallas que variaron desde las decenas de nanómetros hasta partículas que precipitaron por su tamaño. Luego de la centrifugación para eliminar todos los restos precipitados, el antígeno se seleccionó en dependencia de su tamaño para análisis desde el punto de vista inmuno-químicos. Estos análisis demostraron una disminución en el nivel de lípidos con respecto al nivel de proteínas. Se ha demostrado por HPLC que estos agregados tienen una elevada estabilidad en el transcurso del tiempo. El tratamiento controlado del antígeno con β-ciclodextrinas, entre 5 - 100 mg/mL durante 1 - 240 horas a temperaturas que oscilan entre 20 - 37 °C permitió obtener un rango de tallas que posibilitó la elección posterior de los tiempos de elución para análisis inmunoquímicos.

Con posterioridad el antígeno agregado se adsorbió a la alúmina a concentración final entre 0.002 mg/mL y 0.1 mg/mL y se utilizó en ensayos de inmunogenicidad.

Una variante de incubación con ciclodextrinas a diferentes tiempos y temperaturas involucró la adición a la muestra de compuestos inmunomoduladores como los lipopolisacáridos y saponinas, los cuales formaron parte del agregado final que se adsorbió a la alúmina para formar la formulación vacunal final.

Ejemplo 2. Obtención de formulaciones vacunales de agregados del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B utilizando agentes oxidantes.

Con la adición al antígeno normal de sustancias químicas oxidantes se posibilitó la delipidación de manera controlada por tiempo, concentración y temperatura del mismo modo que las ciclodextrinas. Sales como peroxidisulfato de amonio entre 9 y 44 mM, permitieron la generación de los antígenos delipidados a partir del antígeno de 22 nm, posibilitando un incremento en la talla por fusión de partículas. Las tallas óptimas se seleccionaron por gel filtración. La adyuvación se realizó sobre alúmina.

Al igual que en el ejemplo 1 , se logró ocluir en el agregado diferentes cantidades de otros adyuvantes e inmunomoduladores durante la incubación. Ejemplo 3. Obtención de formulaciones vacunales de estructuras químicas sobreparticuladas, obtenidas por modificación de las condiciones de incubación de la levadura.

Las partículas fueron obtenidas naturalmente de la levadura Picchia pastorís, se seleccionó al antígeno durante el proceso de purificación por sus características físico-químicas. El proceso de producción del antígeno es sometido a largos tiempos de cultivo, superiores a las 100 horas, y a condiciones de stress oxidativo. Este proceso posibilita que una parte del antígeno se mantenga en su estado nativo de 22 nm pero una parte importante, por incremento de las condiciones ¡ntracelulares de oxidación, se agrega y se delipida, como fue demostrado por los análisis de lípidos y proteínas efectuados a las muestras de los diferentes picos obtenidos en la gel filtración. Ulteriormente es separada la fracción por HPLC gel filtración en columnas TSK G5000. Este material llega a constituir un 10% de todo el antígeno, y en la actualidad se desecha. La adyuvación se produce por adsorción a la alúmina en similares condiciones a las del antígeno normal. El análisis de ambos antígenos demostró que el HBsAg se agrega en un proceso en el cual se pierde una cantidad significativa de lípidos de todos los tipos, en la tabla a continuación se analizan los fosfolípidos de ambos antígenos.

Composición de fosfolípidos (FL) del HBsAg separados por sílica-gel ng FL/μg de proteína HBsAg (50-500 nm) HBsAg 22 nm

Fosfolípidos Totales 285.6 + 81.9 1225.3 + 256.8 (**)

Fosfatidilcolina 109.4 + 47.6 779.3 + 168.3 (**)

Lisofosfatidilcolina 20.0 + 127 73.5 + 26.1 (**)

Fosfatidiletanolamina 52.8 + 13.3 183.7 + 54.3 (**)

Fosfatidilserina 28.8 + 11.1 78.4 + 26.0 (**)

Fosfatidilinositol 25.3 + 10.1 74.7 + 18.8 (**)

Fosfolípidos unidos a HBsAg 48.8 + 10.7 41.1 + 7.7 (NS)

Con este ejemplo se evidencia que puede ser obtenido un nuevo antígeno sobreparticulado luego de un proceso de oxidación y delipidación natural. La estabilidad de estos agregados estaría basada en procesos de agregación que pueden ocurrir durante la eliminación de lípidos de las partículas que pudiera exponer regiones hidrofóbicas y por procesos de polimerizaciones de proteínas entre partículas al quedar expuestos grupos sulfhidrilos. Ejemplo 4. Evaluación de la ínmunogenicidad del HBsAg agregado. Con el objetivo de evaluar la inmunogenicidad del HBsAg agregado resultante del ejemplo 3, adsorbido en alúmina o en PBS para la ruta mucosal, se realizó un esquema de inmunización con inoculaciones los días 0, 14 y 28 y se extrajo el suero por vía retroorbital el día 42. Se inmunizaron ratones Balb/c hembras de 10 a 15 semanas de edad por rutas intranasal e intramuscular. Las dosis por ratón se presentan en la tabla al final del ejemplo y los resultados en la figura 1A, la figura 1 B presenta una muestra de los agrregados del HBsAg. El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa.

De este experimento se demostró que se puede generar una respuesta de IgG anti HBsAg superior cuando se inmunizó por vía mucosal como por vía sistémica, con respecto al antígeno normal, en igualdad de condiciones. En la misma figura se representa la comparación de este efecto a nivel de respuesta DTH (barras), la que también resultó significativamente superior para la variante agregada. Los grupos de inmunización se muestran en la siguiente tabla: A- 5 μg HBsAg delipidado (50-500 nm)/ PBS 1X IN

B- 10 μg HBsAg delipidado (50-500 nm)/ PBS 1X IN

C- 5 μg HBsAg normal (22 nm)/ PBS 1X IN

D- 5 μg HBsAg delipidado (50-500 nm)/ Alúmina 0.5 mg/mL IM

E- 5 μg HBsAg normal (22 nm)/ Alúmina 0.5 mg/mL IM

Ejemplo 5. Cinética de la respuesta de IgG anti-HBsAg.

Con el objetivo de estudiar la cinética de la respuesta de anticuerpos IgG anti-HBsAg, se inmunizaron 10 grupos de ratones Balb/c hembras de 10-15 semanas de edad. El esquema que se siguió fue: inoculación las semanas 0, 2 y 18 y extracciones preinmune y a las 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 20 semanas.

Los grupos ensayados se correspondieron con los que se describen en la siguiente tabla:

1- 5 μg HBsAg normal (22 nm)/ Alúmina IM

2- 5 μg HBsAg normal (22 nm)/ PBS 1X IM 3- 5 μg HBsAg delipidado (ejemplo 3)/ Alúmina 0.5 mg/mL IM

4- 5 μg HBsAg delipidado (ejemplo 3)/ PBS 1X IM

5- 5 μg HBsAg delipidado (ejemplo 1 )/ Alúmina 0.5 mg/mL IM

6- 5 μg HBsAg delipidado (ejemplo 1 )/ PBS 1X IM

7- 5 μg HBsAg delipidado (ejemplo 1 )/ Alúmina 0.5 mg/mL IM 8- 5 μg HBsAg delipidado (ejemplo 1 )/ PBS 1X IM

9- 5 μg HBsAg delipidado (ejemplo 1)/ Alúmina 0.5 mg/mL IM

10- 5 μg HBsAg delipidado (ejemplo 1 )/ PBS 1X IM

Los antígenos de los grupos 5 y 6, 7 y 8 y 9 y 10 se obtuvieron incubando a diferentes tiempos y concentraciones de ciclodextrina obteniendo diferentes grados de agregación.

Para el experimento de DTH, las mediciones se realizaron los días: 1 (1 , 3), 2(1', 3'), 3(1", 3") y 5(1'", 3'") El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa.

En este experimento se corroboró que el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B delipidado, con distintos grados de agregación, posee características inmunológicas que los diferencian entre sí. La mayor inmunogenicidad y respuesta DTH no se presentó en el antígeno de mayor talla sino para tallas aunque de acuerdo al comportamiento de la cinética de aparición de los anticuerpos, la mayor inmunogenicidad al final del experimento se correspondió con la variante de mayor grado de agregación. Aunque se observó un incremento significativo de la respuesta DTH en los grupos inmunizados con alúmina como adyuvante en comparación con sus correspondientes inmunizados en PBS, el grupo del antígeno agregado de tamaño intermedio generó los mayores incrementos, que llegaron a ser significativos el día 56. En la figura 2a se representan los títulos individuales el día 56 para todos los grupos inmunizados. También se representan en esta figura los resultados del experimento de DTH que se realizó durante 5 días en la semana 22, usando 20 μg de HBsAg en la pata derecha y PBS en la pata izquierda en un volumen de inoculación de 20 μL. Todos los demás grupos tuvieron también una respuesta significativamente inferior en cuanto a diferencias de diámetro entre la pata derecha y la pata izquierda con respecto al grupo 3, aquel en el que se inoculó al HBsAg con un nivel intermedio de agregación adyuvado en alúmina, como se describe su obtención en el ejemplo 3. Es bueno tener en cuenta que en ejemplos ulteriores se demuestra que el reconocimiento en el caso de las estructuras sobreparticuladas es más amplio con respecto a los epítopes que se reconocen en el HBsAg, por lo que este aspecto brinda superioridad a este tipo de estructuras ya que aunque del grupo 5 al 10 la reactividad anti HBsAg nativo es similar a la obtenida inmunizando con el HBsAg nativo durante gran parte del tiempo, también se obtiene una fuerte respuesta contra otros epítopes presentes en el antígeno agregado, ver ejemplo 8, figura 4.

Ejemplo 6. Evaluación de la razón lgG1/lgG2a.

Con el objetivo de estudiar si existió variación en la razón lgG1/lgG2a dada la relación existente con la respuesta TH1/TH2, a los sueros de los grupos D y E del esquema de inmunización del ejemplo 4, se determinaron los niveles de anticuerpos anti lgG1 y anti lgG2a generados. Este análisis se realizó para los sueros de la extracción del día 42. Los niveles de lgG2a se incrementaron significativamente en el grupo inmunizado con el antígeno sobreparticulado (50 - 500 nm) hasta alcanzar una razón lgG1/lgG2a mas cercana a 1 con respecto al HBsAg normal también adyuvado en alúmina (Figura 4).

La relación lgG1/2a para el grupo del HBsAg normal inmunizado con alúmina fue 6.2 veces superior a la encontrada para el grupo del HBsAg delipidado de tamaño intermedio. De este experimento se pudo concluir que la diferente presentación del antígeno de superficie no solo genera un cambio cuantitativo sino cualitativo, por el tipo de IgG que se potencia y por la correlación de estas variaciones en el patrón de subclases de IgG con incrementos en la respuesta celular, lo que corrobora los hallazgos en la evaluación de la respuesta DTH.

Ejemplo 7. Estudio de la reactividad anti -HBsAg nativo de los sueros de ratones inmunizados con diferentes variantes antigénicas. Luego de la inmunización de ratones con los antígenos delipidados obtenidos de acuerdo a los ejemplos 1 , 2 y 3 se comparó la reactividad de estos sueros con los sueros de ratones inmunizados con el antígeno normal. Como resultado de este experimento se observó que la respuesta inmune generada por sueros de ratones inmunizados con las diferentes variantes tuvieron una diferente reactividad contra el HBsAg normal (22 nm), la mayor reactividad la tuvieron los sueros de ratones inmunizados con antígeno normal, mientras que, a diferentes grados de delipidación, la reactividad contra el HBsAg varió.

Aun existiendo altos títulos contra los propios inmunógenos, sueros obtenidos a partir de inmunización con variantes de alto grado de oxidación no reconocieron al HBsAg, lo cual evidenció un diferente reconocimiento de los anticuerpos generados con los diferentes inmunógenos y demuestra la diferente naturaleza antigénica de las nuevas estructuras generadas. Por tanto los resultados del ejemplo 5 deben analizarse teniendo en cuenta que aunque para las últimas tres variantes de antígenos agregados se obtienen respuestas similares anti HBsAg nativo, en estas también está presente la respuesta contra otros epítopes que no se reconocen inmunizando con HBsAg nativo y que pertenecen a la proteína HBsAg.

Ejemplo 8. Reconocimiento de epítopos lineales de sueros de antígenos inmunizados con diferentes variantes. Con el objetivo de comparar el reconocimiento de los anticuerpos generados por un antígeno sobreparticulado del HBsAg obtenido por la variante de oxidación del método descrito en el ejemplo 2, se realizó un mapeo sobre membrana de celulosa conteniendo las secuencias lineales del HBsAg (región S). Se sintetizaron 37 péptidos de 12 aminoácidos sobrelapados cada uno en 6 hasta completar la secuencia de la proteína.

El mapeo epitópico sobre soporte de celulosa se realizó según fue descrito por Ronald Frank (Frank, R. 1992 Tetrahedron 48: 9217-9232) Las mezclas de sueros fueron ensayadas a una dilución de 1/100. El resultado de enfrentar los sueros de los ratones inoculados con el

ambos antígenos, lo que permite concluir que se produce una presentación diferente de los epítopes B presentes en la superficie del HBsAg y las variantes agregadas del mismo (figura 4). Ejemplo 9. Formación de agregados entre el HBsAg y antígenos de nucleocápsida. Evaluación inmunológica.

Se incubaron volúmenes iguales de 2 preparados conteniendo 0.1 mg/mL de HBsAg y HBcAg, ambos antígenos fueron incubados toda la noche a 4°C, posteriormente se obtuvieron los agregados por cromatografía de exclusión molecular HPLC TSK G6000. Una muestra de estos agregados fue procesada por técnicas para su visualización por microscopía electrónica, la otra muestra se utilizó para su evaluación inmunológica en un esquema de inmunización en que ratones Balb/C fueron inoculados por vía intranasal con ambos antígenos por separado y con el agregado cuya presencia se comprobó por microscopía electrónica (Fig. 5A).

Los resultados evidenciaron que la unión de ambos antígenos agregados por la ruta nasal permitió la potenciación de la respuesta contra el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B(Fig 5B). Los grupos de la figura son los representados en la siguiente tabla.

1-10 μg HBsAg/ PBS 1X IN

2-10 μg HBsAg/ acemanano 3 mg/mL IN 3-10 μg HBsAg/ 10 μg HBcAg / PBS 1X IN

4-10 μg HBsAg/ Alúmina 0.5 mg/mL SC

Resultados semejantes se obtuvieron cuando se utilizó para la preparación de la mezcla otros antígenos de cápsides virales como las de Hepatitis C y la del Virus de la Inmunodeficiencia Humana.

Breve descripción de las figuras Figura 1.

(A) Esquema de 3 dosis (0, 2 y 4 semanas). Las extracciones se realizaron la semana 6. Los tres primeros grupos fueron inocularon con 50 μL por vía intranasal. Los dos restantes grupos se inocularon por vía intramuscular en alúmina con 100 μL.

(B) HBsAg agregado (barra: 200 nm). Figura 2. Esquema de 3 dosis (0, 2 y 18 semanas). Todos los grupos fueron inoculados por vía intramuscular con un volumen de 100 μL. Los valores de anticuerpos se corresponden con la semana 8 (fig. 2a). Durante la semana 22 se realizó la prueba de DTH. La figura 2b representa el valor de la DTH para los grupos 1 y 3 durante 5 días. La figura 2c representa la cinética de incremento de los títulos durante el transcurso del esquema.

Figura 3.

El mismo esquema de 3 dosis (0, 2 y 4 semanas) de la figura 1. Análisis de los sueros de los grupos D y E de la extracción de la semana 6. Ambos grupos fueron inoculados por vía intramuscular en alúmina con 100 μL, el grupo D con HBsAg delipidado (50-500 nm) y el grupo E con HBsAg normal en iguales dosis. En el gráfico se representa la media geométrica e intervalo de la razón lgG1/lgG2a de cada ratón de ambos grupos. Figura 4.

Mapeo sobre membrana de celulosa conteniendo las secuencias lineales de péptidos sobrelapados de la región S del HBsAg. Se analizaron pooles de sueros a una dilución de 1/100: 1 , HBsAg (normal); 2, HBsAg (agregado); (3- 5: anticuerpos monoclonales obtenidos inmunizando con antígeno agregado;

3, clon6; 4, clon7; 5, clonδ); 6, suero no relacionado; 7, AcM (Hep 1 ). Cuatro intensidades de color representan la respuesta contra los péptidos. Blanco: respuesta negativa, gris claro: respuesta ligeramente positiva, gris oscuro: respuesta positiva, negro: respuesta muy positiva. Figura 5.

(A) Microscopía electrónica de agregados del HBsAg y el HBcAg, las partículas con mayor densidad electrónica en el centro se corresponden con el HBcAg, las otras son el HBsAg.

(B) Esquema de 2 dosis (0, 14 días). Análisis de los sueros día 26.

Claims

REIVINDICACIONES

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE AGREGADOS ANTIGÉNICOS Y SU USO EN FORMULACIONES. 1. Método de obtención de estructuras antigénicas agregadas de alta inmunogenicidad. Dicho método comprende los siguientes pasos:

A) Selección de los antígenos de interés.

B) Adición de uno o varios antígenos de la mezcla en un medio que favorece el proceso de agregación, como agentes químicos, agentes oxidantes u otros componentes con capacidad agregante.

C) Incubación de la mezcla.

D) Selección de los agregados de partículas de tamaño entre 30 y 500 nm por un proceso que permita la retención de dichas tallas moleculares como cromatografías de exclusión molecular, diafiltración y diálisis. E) Obtención de las formulaciones a partir de la mezcla de las estructuras antigénicas seleccionadas en el paso (C) mediante la adición del adyuvante de elección, y además, la potencial adición de otros antígenos, estabilizadores y preservos.

2. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los antígenos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) está un antígeno de naturaleza lipoproteica, lipopeptídica o lipídica de cualquier patógeno viral, bacteriano, unicelular o multicelular.

3. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque un antígeno que forma parte de la estructura obtenida en el paso (B) es el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B, formando un agregado constituido sólo por este antígeno.

4. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los antígenos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) están 2 o más antígenos homólogos o heterólogos capaces de agregarse al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B por interacciones hidrofóbicas o covalentes, generando agregados de diversos antígenos.

5. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los antígenos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) están el antígeno de la nucleocápsida del virus de la Hepatitis B y el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B.

6. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los antígenos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) está el antígeno de la nucleocápsida del virus de la Hepatitis C y el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B.

7. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los antígenos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) está el antígeno de la nucleocápsida del virus de la Inmunodeficiencia Humana tipos 1 o 2 y el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B.

8. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los antígenos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) están las proteínas de membrana externa de Neisseria meningitidis y el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B.

9. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los componentes que forman parte del medio en que se asocian los antígenos en el paso (B) se encuentran las β- ciclodextrinas.

10. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los componentes que forman parte del medio en que se asocian los antígenos en el paso (B) se encuentran las sales de amonio a concentraciones entre 10 y 50 mM, potenciadas por sales metálicas de cobre y hierro, u otras con igual finalidad agregante.

11. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los componentes que forman parte del medio en que se asocian los antígenos en el paso (B) se encuentran antígenos que evidenciaron capacidad agregante como el HBcAg, y otros antígenos de nucleocápsida viral con capacidad para promover una agregación espontánea.

12. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los componentes que forman parte del medio en que se asocian los antígenos en el paso (B) se encuentran antígenos de naturaleza hidrofóbica como derivados de antígenos de superficie virales, de membrana externa de bacterias o derivados lipidíeos con capacidad para promover una agregación espontánea al HBsAg.

13. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los componentes que forman parte del medio en que se asocian los antígenos en el paso (B) se encuentran adyuvantes de naturaleza hidrofóbica total o parcial con capacidad para promover la agregación espontánea al HBsAg.

14. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque entre los componentes que forman parte del medio en que se asocian los antígenos en el paso (B) se encuentran compuestos químicos de cualquier naturaleza capaces de favorecer la agregación del

HBsAg o de este a otras estructuras químicas por hidrofobicidad, uniones covalentes o uniones electrostáticas.

15. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque el tiempo de incubación del paso (C) se encuentra entre 10 minutos y una semana en dependencia del método de agregación seleccionado.

16. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque en el paso (D) la selección de los agregados de partículas de tamaño entre 30 y 500 nm se realiza por cromatografía de exclusión molecular, diálisis, diafiltración u otro método que permita la retención de dichas tallas moleculares entre 30 y 500 nm.

17. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque en el paso (E) se obtienen formulaciones a partir de la mezcla de las estructuras antigénicas seleccionadas en el paso (C) con un adyuvante de elección que puede ser una sal de aluminio, de calcio, un oleoso u otro adyuvante comercialmente utilizado, además pueden adicionarse otros antígenos, estabilizadores y preservos.

18. Estructura antigénica agregada obtenida de acuerdo a la reivindicación 1 , que favorece un incremento en la inmunogenicidad de la formulación resultante y un reconocimiento diferencial por el sistema inmunológico.

19. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 18 caracterizada porque el antígeno contenido en los agregados es el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B.

20. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 18 caracterizada porque pueden contener dos o más antígenos en agregación.

21. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 18 caracterizada porque los antígenos pueden ser mezclas del HBsAg y otros antígenos de carácter hidrofóbico, particulados.

22. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 21 caracterizada porque los antígenos pueden ser mezclas del HBsAg y el HBcAg.

23. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 21 caracterizada porque los antígenos pueden ser mezclas del HBsAg y el antígeno de la nucleocápsida del HCV.

24. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 21 . caracterizada porque los antígenos pueden ser mezclas del HBsAg y el antígeno de nucleocápsida del HPV, HCV y HIV 1 o 2.

25. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 21 caracterizada porque los antígenos pueden ser mezclas del HBsAg y otros antígenos de superficie virales.

26. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 21 caracterizada porque los antígenos pueden ser mezclas del HBsAg y adyuvantes de naturaleza hidrofóbica.

27. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 21 caracterizada porque los antígenos pueden ser mezclas del HBsAg y antígenos de naturaleza viral, bacteriana o sus derivados.

28. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 21 caracterizada porque los antígenos pueden ser mezclas del HBsAg y adyuvantes de naturaleza hidrofóbica.

29. Estructura antigénica agregada según la reivindicación 1 caracterizada por contener estructuras particuladas en agregación conteniendo una partícula viral o semejante a virus agregada a otra partícula, proteína o adyuvante.

30. Uso de la estructura antigénica de las reivinicaciones 18 a la 29 en un sistema de diagnóstico.

31. Uso de la estructura antigénica de las reivinicaciones 18 a la 29 en vacunas profilácticas y terapéuticas.

32. Formulación vacunal que comprende la estructura antigénica de cualquiera de las reivindicaciones de la 18 a la 29, así como un adyuvante, estabilizadores y preservos apropiados.

33. Formulación vacunal según la reivindicación 32 de aplicación sistémica o mucosal.

34. Uso de las formulaciones vacunales de las reivindicaciones 32 y 33 para la prevención de enfermedades infecciosas, autoinmunes y cáncer.

35. Uso de las formulaciones vacunales de las reivindicaciones 32 y 33 para la terapia de enfermedades infecciosas, autoinmunes y cáncer.