ES2965709T3 - Composición farmacéutica que incluye los antígenos de superficie y nucleocápside del virus de la hepatitis B - Google Patents
Composición farmacéutica que incluye los antígenos de superficie y nucleocápside del virus de la hepatitis B Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención revela una composición farmacéutica que comprende el antígeno de la superficie (HBsAg) del virus de la hepatitis B (VHB) y el antígeno de la nucleocápsida (o core, HBcAg) del propio virus. El HBcAg presente en dicha composición contiene ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45% del total de ácido ribonucleico (ARN) de dicho antígeno. Debido a cambios en la constitución de los antígenos que la componen, la composición de la invención es útil para la prevención o el tratamiento de la hepatitis B crónica. También contempla el uso de esa composición farmacéutica en la manufactura de un medicamento para la inmunoprofilaxis o la inmunoterapia contra la infección por VHB, y su uso para incrementar la respuesta inmune contra un antígeno adicional que se co-administra con la mezcla de dichos antígenos.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica que incluye los antígenos de superficie y nucleocápside del virus de la hepatitis B
Campo de la invención
Esta invención está relacionada con el campo de la medicina, particularmente con la rama de la vacunología, y específicamente con el desarrollo de composiciones de vacunas con mayor efectividad. Estas composiciones incluyen los antígenos del virus de la hepatitis B (HBV) que presenta modificaciones en su composición química, que aumentaron inesperadamente su inmunogenicidad. Los antígenos del HBV que fueron modificados en su composición química fueron el antígeno de superficie (HBsAg) y el antígeno central (HBcAg).
Estado de la técnica anterior
The World Health Organization (WHO) considera que casi la mitad de la población mundial ha sido infectada por el HBV, basándose en la presencia de marcadores serológicos de infección. Se ha estimado que aproximadamente del 5 al 10 % de los adultos y hasta el 90 % de los recién nacidos infectados por el HBV desarrollan hepatitis B crónica (CHB). En la actualidad, 350 millones de personas padecen infecciones persistentes o crónicas. La replicación sostenida del virus, durante un largo período de tiempo, conduce a un procedimiento inflamatorio hepático, que lleva a la muerte del 25 % de la población infectada como consecuencia de cirrosis, carcinoma hepatocelular o por otras complicaciones tales como la ascitis, hemorragia esofágica y esplenomegalia. A pesar de la vacunación universal de neonatos y niños en los últimos años y de la consiguiente reducción de la incidencia de nuevas infecciones por HBV, la CHB sigue siendo un problema de salud importante a escala mundial [Hilleman, M.R. Vaccine (2001), 19, 1837-48].
El tratamiento con interferón alfa (IFN-a), su variante pegilada (PegIFN) y los análogos de nucleótidos y nucleósidos, tales como Tenofovir, Entecavir, Lamivudina, Adefovir-dipivoxil y Telbivudina, son el estado de la técnica de los tratamientos para la CHB. En general, estos fármacos tienen poca eficacia en relación a la eliminación sostenida del HBV después del tratamiento, y su uso se asocia a importantes eventos adversos (AE), lo cual es ampliamente reconocido [Nash K. Adv Ther (2009), 26:155-169; Yang N, Hepatol Int. 2015 Sep 12. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 26363922].
El uso de formulaciones de vacunación, como estrategia inmunoterapéutica, en el tratamiento de la CHB, es un enfoque interesante. La persistencia viral se ha asociado a un defecto en el desarrollo de la inmunidad celular anti-HBV. Desde principios de los años 1980, las estrategias de vacunación se han centrado en aumentar y potenciar la débil respuesta de las células T de los pacientes con CHB. Estas estrategias inmunoterapéuticas usaron inicialmente vacunas comerciales anti-HBV con el objetivo de introducir respuestas CD4+ y CD8+ específicas contra el HBV, así como citocinas proinflamatorias para controlar la replicación viral. Por consiguiente, casi todas las vacunas preventivas comerciales se probaron solas o junto con terapias antivirales convencionales. En estudios anteriores de vacunación terapéutica, las vacunas se administraron con o sin otros tratamientos antivirales. Por otra parte, la inmunoterapia con vacunas comerciales también propuso programas con mayores cantidades de inoculaciones y se exploraron vías parenterales alternativas. Los principales estudios se resumen a continuación.
Un estudio piloto de vacunación en pacientes con CHB que usan Genhevac B® (Aventis Pasteur, Francia, producido en células de mamíferos -CHO) mostró una reducción en la replicación del HBV en aproximadamente el 50 % de los portadores crónicos carriers [Pol S, et al. C R Acad Sci III (1993), 316:688-91]. Otro estudio multicéntrico controlado con placebo también evaluó la vacuna Genhevac B® y la vacuna Recombivax® (Merck Sharp Dohme-Chibret, Francia) producida por levadura. Aquí se observó una diferencia significativa al sexto mes (3 %, 20 % y 22 %) entre los grupos inoculados con Genhevac® y recombivax®, respectivamente. La diferencia, sin embargo, desapareció en el mes 12 [Pol S, J Hepatol (2001); 34:917-21]. Se concluyó que no se observó ningún beneficio claro y que el antígeno pre-S2 encontrado en Genhevac® no pareció tener ningún efecto adicional.
Otros estudios donde la vacuna terapéutica Genhevac® se evaluó [Yalcin K, et al. Infection (2003), 31: 221-225; Dikici B, et al. J Gastroenterol Hepatol (2003), 18(2): 218-22] sólo mostró ligeros beneficios asociados al tratamiento.
La vacuna producida por CHO hepageno® (Medeva Ltd., Reino Unido) incluye las tres variantes de HBsAg (L, S y M), y sus resultados en voluntarios sanos y no respondedores demostraron altos niveles de inmunogenicidad [Page M, et al. Intervirology (2001), 44:88-97; Yap I, et al. Ann Acad Med Singapore (1996), 25: 120-122; Zuckerman JN, et al. BMJ (1997), 314: 329; Jones CD, et al. Vaccine (1999), 17(20-21): 2528-37]. Teniendo esto en cuenta, se llevó a cabo un estudio para evaluar su potencial terapéutico. Se administraron ocho dosificaciones de 20 |jg de la vacuna en dos ciclos de 4 inoculaciones, con un intervalo de 5 meses entre ellas [Carman WF, et al. J Hepatol (2001); 34:917-921]. Al final del programa, 8 de los 22 pacientes que completaron el programa tuvieron un aclaramiento sostenido del HBV y 7 pacientes eliminaron el HBeAg. A esta prueba limitada no controlada le siguió una prueba controlada con un mayor número de pacientes. En este segundo ensayo clínico con 103 pacientes crónicos HBeAg positivos, se administraron cuatro dosis de la vacuna o del placebo a intervalos de uno y 8 meses, y posteriormente todos los sujetos recibieron 8 dosificaciones adicionales a intervalos de un mes. Al finalizar el tratamiento no se obtuvieron beneficios clínicos significativos [Medeva PLC. http://www.investegate.co.uk/article.aspx?id=200001171532169093D (consultado el 20 de octubre de 2015)].
Para favorecer el desarrollo de una respuesta inmunitaria antiviral, los tratamientos han combinado la vacunación terapéutica con terapias antivirales convencionales. Esta estrategia toma en consideración el hallazgo relacionado con el efecto de la lamivudina, que aumenta la frecuencia de células T-HBV específicas en la sangre periférica, como resultado de la inhibición de la replicación viral [Bertoletti A et al. Expert Rev Gastroenterol Hepatol (2009), 3(5): 561 9].
La estrategia de vacunación antiviral combinada debería favorecer una mayor reactividad de la respuesta de las células T frente al HBV, pero también puede considerarse más segura, ya que debería evitar el daño hepático, como consecuencia de la activación del sistema inmunitario. Sin embargo, no hay evidencia que demuestre que la activación de la respuesta inmunitaria específica por la vacuna en pacientes con CHB pueda producir hepatitis fulminante.
Un estudio publicado en 2002 evaluó la administración intradérmica (ID) de la vacuna Engerix B® (GlaxoSmithKline) con lamivudina [Dahmen A, et al. J Med Virol 2002; 66:452-60], en pacientes con CHB. Se usaron seis dosificaciones de Engerix B®, una vez al mes, combinadas con la administración diaria de lamivudina. Un grupo adicional recibió el mismo tratamiento junto con la administración diaria subcutánea (SC) de interleucina 2 (IL-2). Después de completar la terapia, 7 de 9 pacientes del primer grupo y 2 de 5 pacientes del segundo grupo habían reducido su carga viral a niveles indetectables. Cuatro respondedores eliminaron el virus y normalizaron las transaminasas. En otro ensayo clínico se evaluó la combinación de vacunación terapéutica por vía ID, usando una vacuna que contiene HbsAg en alumbre, con la administración diaria de lamivudina durante un año [Horiike N, et al. J Clin Virol (2005), 32: 156-161]. Estos estudios demostraron que la terapia combinada es eficaz y con pocas complicaciones para los pacientes con CHB. Sin embargo, en ambos casos se usó la vía ID y esto podría favorecer la inmunogenicidad de la vacuna.
El mismo antígeno de superficie, formulado en un potente adyuvante, no fue eficaz en una terapia combinada con lamivudina, lo que sugiere que no se debe ignorar el efecto de la vía de inmunización, y que éste es posiblemente un elemento crucial para el futuro de la vacunación.
El estudio que cierra el largo período de evaluación clínica de los candidatos de vacunación para las condiciones de supresión de la carga viral es el informe de Vandepapeliere et al. [Vandepapeliere P, et al. Vaccine (2007) Dec 12; 25(51):8585-97]. Se trata de un estudio de evaluación clínica de un candidato vacunal basado en una formulación de HBsAg adsorbido, inyectado por vía intramuscular (IM) en 100 |jg de HBsAg junto con un adyuvante oleoso y con potentes inmunomoduladores, tales como los lípidos monofosforilo A y saponina QS21. Diez administraciones en condiciones de carga viral reducida no mostraron ventajas en relación con la respuesta virológica, en comparación con el grupo de control que fue tratado solo con el agente antiviral.
Los conocimientos sobre las características de la respuesta inmunitaria del hospedador y sobre el uso terapéutico de las vacunas convencionales sugieren que las estrategias dirigidas a la inducción de una reactividad fuerte y sostenida de las células T contra los antígenos del HBV son factibles y representan una esperanza para el tratamiento satisfactorio de los pacientes con CHB.
La ausencia de estimulación inmunitaria contra los antígenos de la nucleocápside es probablemente un marcador inmunológico principal del fracaso de la vacunación terapéutica basada en HBsAg. De hecho, el objetivo de la vacunación terapéutica en la CHB es activar los mismos mecanismos inmunes naturales que prevalecen durante la hepatitis B aguda y que se autocontrolan, o en la CHB que pasa por seroconversión. Si una inmunoterapia no logra estimular estas respuestas inmunes, probablemente no logrará inducir la seroconversión.
La mejora de las formulaciones, en términos de selección antigénica y estrategia de vacunación, podría ser una forma de superar estas dificultades. Las características de las proteínas de la envoltura justifican su inclusión en una vacuna terapéutica. En realidad, las proteínas de la envoltura contienen numerosos epítopos de las células B y T [Penna A, et al. J Virol (1992), 66(2):1193-6; Nayersina R, et al. J Immunol (1993), 150:4659-71], y se estima que los anticuerpos anti-envoltura juegan un papel crítico en la supresión viral, al eliminar las partículas virales libres de la circulación y prevenir la reinfección de las células susceptibles. Por otro lado, en el suero de los pacientes con CHB circulan niveles elevados de HBsAg; este hecho podría desempeñar un papel principal en el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria, mediante el agotamiento de las células T y la supresión de la producción de anticuerpos anti-HBs [Nagaraju K, et al. J Viral Hepat (1997), 4-221-30].
En este sentido, se ha sugerido que el HBcAg es el principal candidato antigénico que debería incluirse en una vacuna terapéutica para la CHB. Durante la hepatitis aguda que se resuelve espontáneamente, la respuesta epitópica de las células T se ve fuertemente favorecida y predomina durante la seroconversión en la CHB espontánea o inducida por el tratamiento [Ferrari C, et al. J Clin Invest (1991), 88:214-22; Marinos G, et al. Hepatology (1995), 22:1040-9; Tsai SL, et al. Clin Invest (1992), 89:87-96].
Hasta el momento, ninguna vacuna comercial contra la hepatitis B ha demostrado suficientes resultados clínicos que le permitan competir con el tratamiento actual, o que simplemente avalen su introducción en la práctica médica. Sin embargo, estas vacunas han creado grandes expectativas en el campo del tratamiento, no sólo en el ámbito de la inmunoterapia contra la hepatitis B, sino en el de otras enfermedades como la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y el cáncer, entre otras enfermedades crónicas, ya sea contraíbles o no. Por consiguiente, esta estrategia exige que haya una evaluación clínica de nuevos conceptos de vacunas y la optimización de todos los factores relacionados. En este sentido, un candidato vacunal terapéutico que incluya HBcAg, además de HBsAg, es el resultado del desarrollo de estas estrategias de inmunoterapia.
El Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) produce HBsAg, como proteína recombinante, obtenida en la levadura hospedadoraPichia pastoris.Este antígeno ha sido incluido en la vacuna preventiva Heberbiovac HB® desde principios de los años 1990 [Muzio V, et al. Biotecnologia Aplicada (2001) 18; 103-104; ul-Haq N, et al. Vaccine (2003) 21:3179-85].
Además, el CIGB desarrolló una formulación donde se amplía la respuesta inmunitaria contra la hepatitis B; esta formulación incluye HBsAg y HBcAg, como componentes principales; los antígenos se administran a través de la vía mucosa para generar una respuesta sistémica y mucosa [Patente Europea No. EP 1136077]. En otro documento de patente de este mismo centro se describe la generación de estructuras antigénicas agregadas formando partículas. Este documento revela que la agregación, deslipidación u oxidación, así como la selección de partículas de 30-500 nm, y la formulación de estos agregados, convenientemente adyuvantes, favorecen la inmunogenicidad de la preparación antigénica resultante [Patente Europea No. EP1346727]. Combinando las estrategias expuestas en ambos documentos de patente, el CIGB desarrolló la vacuna candidata terapéutica denominada NASVAC [Lobaina Y, et al. Mol Immunol (2015), 63:320-327], que se administra mediante la combinación de vías de inmunización. Los resultados clínicos de la formulación vacunal son muy atractivos; sin embargo, la eficacia del producto debería aumentarse con el uso de inmunógenos más potentes.
Las estrategias de vacunación que incluyen los principales antígenos del HBV, tales como el HBsAg y el HBcAg, han producido formulaciones que tienen determinada eficacia antiviral. Sin embargo, se requiere su mejora para aumentar el número de pacientes con respuesta antiviral sostenida, así como el número de pacientes que alcanzan la seroconversión de HBsAg a anti-HBsAg.
Explicación de la invención
La invención ayuda a resolver el problema mencionado anteriormente proporcionando una composición farmacéutica que comprende partículas similares a virus (VLP) del antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg) y VLP del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), en la que las VLP de HBcAg comprenden ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45 % de la cantidad total de ácido ribonucleico (ARN) en dichas VLP de HBcAg, y las VLP de HBcAg incluyen fosfatidilserina en una proporción superior al 5 % de la cantidad total de fosfolípidos de dichas VLP de HBsAg.
La inclusión de los antígenos HBsAg y HBcAg que han sido modificados en su constitución química de esta manera particular, favorece las propiedades inmunológicas y antivirales de esta composición para la inmunoterapia. Sin embargo, las modificaciones mencionadas anteriormente no afectan la composición proteica de los antígenos HBsAg y HBcAg de la invención, ya que sus estructuras primaria, secundaria y terciaria permanecen idénticas, en comparación con sus variantes no modificadas. No obstante, estas modificaciones conducen a características inesperadas de estos antígenos, lo que da como resultado inmunógenos más potentes. Además, la combinación de estos antígenos modificados conduce a una formulación con mayor eficacia terapéutica antiviral para el tratamiento de la CHB.
En la invención el HBcAg se obtuvo con ARNm a un nivel superior al 45 %. En un caso particular, este antígeno modificado se obtuvo debido a la combinación de cambios en los parámetros de su procedimiento de fermentación. En ese caso, el uso de un medio químicamente definido y la baja tasa de crecimiento específico, dieron paso a una variante del HBcAg donde la proporción de ARNm aumentaba, en comparación con el resto de ARN presente en este.
Aunque se ha descrito la alta inmunogenicidad del HBcAg obtenido enEscherichia coli,así como la participación de un componente de los ácidos nucleicos en la inmunogenicidad de los antígenos particulados completos (de 183 aminoácidos), hasta la presente invención se desconocía el efecto relativo de cada variante de ARN en relación a su contribución específica a la inmunogenicidad final del HBcAg. Fue sorprendente descubrir que el HBcAg con un nivel de ARNm superior al 45 % era más inmunogénico y desarrollaba una respuesta Th1 más fuerte, en comparación con el HBcAg no modificado.
Los cambios en la proporción del ARNm detectado, no afectaron el contenido de ARN total presente en la partícula, en relación al contenido de proteína. Inesperadamente, se encontró que el HBcAg que contenía más del 45 % de ARNm dentro del ARN total, tenía una inmunogenicidad mayor en comparación con el HBcAg obtenido sin ninguna modificación en su contenido de ARNm. Este aumento en la inmunogenicidad incluyó un aumento significativo en las citocinas Th1 y una capacidad potenciada para la eliminación del HBsAg circulante después de inmunizar ratones y pacientes transgénicos con CHB.
Por otro lado, en esta invención se evalúa el HBsAg que contiene fosfatidilserina en un nivel superior al 5 % de la cantidad total de fosfolípidos presentes en este antígeno lipoproteico. Particularmente, el aumento en la proporción de fosfatidilserina por encima del 5 % de la cantidad total de fosfolípidos se demostró en relación con la variación de parámetros, como el aumento de las concentraciones de calcio y magnesio en el medio de fermentación, la baja tasa de crecimiento específico y el bajo pH. Sin embargo, la invención no se limitó al HBsAg obtenido en estas condiciones. El aumento de la proporción de fosfatidilserina por encima del 5 % se correlacionó con el aumento de la inmunogenicidad del antígeno resultante, al compararlo con el HBsAg con menor contenido de este fosfolípido. Se observó un aumento significativo de las citocinas Th1, así como una mayor capacidad de eliminación del HBsAg circulante tras la inmunización de los ratones transgénicos HBsAg y de los pacientes con CHB con el HBsAg que contenía más del 5 % de fosfatidilserina, en relación al % total de fosfolípidos.
En la presente invención, los antígenos HBsAg y HBcAg particularmente modificados se han seleccionado en base a una mayor intensidad de la respuesta inmunitaria y antiviral, en comparación con las formulaciones en las que se usaron los antígenos no modificados.
Por otra parte, la formulación que contiene ambos antígenos fue capaz de producir la seroconversión del HBsAg a anti-HBsAg en un mayor número de individuos, al compararlos con los antígenos administrados por separado, demostrando la importancia y funcionalidad de las modificaciones detectadas en los antígenos que forman parte de la composición de esta invención, así como la superioridad de las formulaciones combinadas, en comparación con los antígenos individuales.
Esta invención representa una nueva solución al problema predominante en el estado de la técnica sobre la necesidad de nuevas formulaciones que permitan potenciar la respuesta inmunitaria anti-HBsAg y anti-HBcAg, para conseguir tratamientos más eficaces para el control de la Infección crónica por HBV. El objeto de esta invención no puede ser considerado obvio, ni derivado del estado de la técnica por personas conocedoras, ya que es el resultado de la identificación de nuevas características de los antígenos descritos. Aunque estos antígenos modificados mantienen intacta su composición proteica, son diferentes en relación a la composición química de las moléculas asociadas a ellos.
Para efectos de la invención, el HBcAg modificado es una preparación a partir del HBcAg que incluye ARNm en una proporción superior al 45 % del ARN total de ese antígeno. A su vez, el HBsAg modificado es el preparado de HBsAg que contiene fosfatidilserina en una proporción superior al 5 % de la cantidad total de fosfolípidos de este antígeno.
En una realización de la invención, la composición se formula para la administración por vía parenteral y mucosa. Para administrar la composición de la invención por vía mucosa, y particularmente por vía nasal, se pueden usar dispositivos que hayan sido desarrollados y/o comercializados para la administración de formulaciones farmacéuticas por esa vía.
En una realización particular, esta composición se caracteriza adicionalmente por tener un adyuvante para vacunas. Dentro de los adyuvantes para vacunas que pueden estar presentes en la composición de la invención, por ejemplo, se encuentran aquellos que son bien conocidos por los conocedores de este campo técnico, tales como las sales de aluminio, las emulsiones de agua en aceite, desarrolladas para su uso humano, estimuladores del sistema inmunitario, etc. Por otra parte, la invención proporciona la composición farmacéutica que comprende partículas similares a virus (VLP) del antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg) y VLP del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), en la que las VLP de HBcAg comprenden ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45 % de la cantidad total de ácido ribonucleico (ARN) en dichas VLP de HBcAg, y las VLP de HBcAg incluyen fosfatidilserina en una proporción superior al 5 % de la cantidad total de fosfolípidos de dichas VLP de HBsAg para su uso en la inmunoprofilaxis o inmunoterapia contra la infección por HBV. Puede formularse para administración por vía parenteral y mucosa. En una realización preferida, la composición es para su uso en el tratamiento de pacientes con CHB o pacientes con coinfecciones, donde uno de los virus infectantes es el HBV. Además, al tratar a los pacientes con CHB con este fármaco, su uso conduce a la prevención del cáncer hepatocelular derivado de la infección por HBV. Cuando la composición se utiliza en el tratamiento de pacientes con CHB mediante inmunoterapia, esto se puede hacer de forma activa (mediante la inmunización de los pacientes con este fármaco) o de forma pasiva, mediante estimulación celular. Debido a sus componentes, la composición farmacéutica de la invención puede usarse en la estimulación de células autólogas o heterólogas. Por consiguiente, la invención da como resultado una estimulación celular tras el uso de esta formulación, y la posterior inmunización pasiva de los pacientes con CHB, basada en la estimulación máximain vivooin vitro,de células autólogas o heterólogas que incluyen células dendríticas, células B y macrófagos.
En una realización preferida, el individuo que recibe la inmunoterapia es un paciente con CHB. En este caso, la aplicación de la invención para su uso en la inmunoterapia de los pacientes con CHB produce la prevención del cáncer hepatocelular derivado de la infección por HBV.
También es el objetivo de esta invención proporcionar la composición farmacéutica para su uso en el aumento de la respuesta inmunitaria contra un antígeno adicional que se coadministra con la mezcla de estos antígenos.
La mezcla de antígenos mencionada anteriormente puede resultar en la potenciación de la respuesta inmunitaria contra la CHB (en un escenario terapéutico) o bajo estrategias de vacunación preventiva donde la vacuna es multivalente. Esto es así porque además del aumento de la inmunogenicidad de los antígenos HBsAg y HBcAg modificados de una forma particular, se pudo comprobar que son capaces de inducir un efecto potenciador de la inmunogenicidad de los antígenos heterólogos. Los resultados de las evaluaciones experimentales demuestran que estos antígenos encontrados en formulaciones multivalentes pueden ser útiles para su uso profiláctico o terapéutico.
Aunque en relación con las formulaciones de la presente invención se puede evitar el uso de adyuvantes, estabilizantes u otros aditivos, esto no limita la introducción de aditivos, excipientes, diluyentes que no reduzcan la inmunogenicidad de la formulación ni del producto final resultante, o la eficacia antiviral de la formulación administrada.
Con la composición farmacéutica y su uso para la inmunoprofilaxis o la inmunoterapia de la invención, se consigue una respuesta antiviral sostenida y se incrementa el número de pacientes que alcanzan la seroconversión del HBsAg a anti-HBsAg, en comparación con la composición y métodos conocidos en este campo técnico.
Breve descripción de las figuras.
Figura 1. Respuesta de anticuerpos IgG anti-HBcAg tras la administración de dos dosis.
Figura 2. Anticuerpos IgG anti-CR3.
Figura 3. Respuesta proliferativa de células T CD8+ CR3 (HIV-1) específicas.
Relación detallada de los modos de realización / Ejemplos de realización
Ejemplo 1. Obtención de la proteína HBcAg con diferentes proporciones de las variantes de ARN
El HBcAg se obtuvo de una cepa deE. colique fue transformado genéticamente con un plásmido que portaba el gen que codifica este antígeno [Aguilar JC, et al. Immunol Cell Biol (2004) 82:539-46].
Al caracterizar las partículas de HBcAg, provenientes del procedimiento fermentativo realizado durante diferentes períodos de tiempo, se observó que hubo un aumento en la proporción de ARNm incorporado en las preparaciones de HBcAg producidas con períodos de fermentación más prolongados. Luego de 20 horas de fermentación, los niveles de ARNm en el antígeno aumentaron más de un 20 %, en comparación con el HBcAg obtenido en procesos de hasta 14 horas, como se observa en la tabla 1. No se detectaron cambios significativos en la cantidad total de ARN en la partícula, ya que no se encontraron diferencias significativas en los niveles de ARN total, ni en la relación contenido de ARN/contenido de proteínas. Sin embargo, hubo un aumento significativo en el nivel de ARNm en comparación con otras variantes, específicamente el ARN ribosómico (ARNr), que mostró una reducción en su presencia con el aumento del ARNm. No se encontraron otros cambios relevantes en los componentes menores asociados al HBcAg ni en contaminantes específicos, al llevar a cabo ensayos por espectrometría de masas u otros estudios químicos y físicos.
Tabla 1. Variación del porcentaje en relación a los principales tipos de ARN en el HBcAg según la duración del procedimiento de fermentación
Los resultados representan los valores promedio de las cinco determinaciones. En la columna titulada "Variante" se indica entre paréntesis el tiempo de duración de la fermentación. ARNt: ARN de transferencia, ARNr: ARN ribosómico y ARNm: ARN mensajero. (*): Diferencias significativas(p<0.05).
Evaluación en ratones Balb/c de la inmunogenicidad de las variantes de HBcAg con diferentes porcentajes de ARNm incorporado
Después de obtener las diferentes variantes de HBcAg con diferentes porcentajes del ARNm incorporado en el interior de la partícula (Tabla 1), se llevaron a cabo las evaluaciones inmunológicas de estas preparaciones en ratones Balb/c. Para este estudio se usaron ratones hembra de entre 8 y 12 semanas de edad, que recibieron dos inmunizaciones los días 0 y 15, por vía SC, con una dosis de 1 |jg de HBcAg en solución salina regulada con fosfato (PBS), administrándoles un volumen final de 100 jl. La descripción detallada del programa se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Diseño del programa de vacunación para evaluar la influencia del porcentaje de ARNm incorporado en la partícula de HBcAg en la inmunogenicidad de este antígeno.
Las extracciones de sangre para la evaluación de la respuesta de anticuerpos específicos generada por la inmunización se realizaron 10 días después de la segunda dosis. La medición de la respuesta de anticuerpos anti-HBcAg se realizó mediante la técnica ELISA.
Como se observa en la figura 1, que muestra los títulos de anticuerpos IgG anti-HBcAg obtenidos en cada grupo de estudio, la respuesta IgG anti-HBcAg generada fue significativamente mayor para los grupos que recibieron el HBcAg con ARNm incorporado por encima del 45 % (grupos de 3 a 6 de Tabla 2). Entre los grupos 3, 4, 5 y 6 no se detectaron diferencias significativas, aunque sí hay una ligera tendencia al aumento de la respuesta IgG asociada al aumento del porcentaje de ARNm incorporado. Los resultados indican que el aumento de la proporción de ARNm incorporado en el interior de la partícula de HBcAg a niveles superiores al 45 % respecto al ARN total incorporado confiere una mayor inmunogenicidad humoral a esta proteína. Los análisis preliminares del patrón de las subclases de IgG sugieren un comportamiento similar a nivel de la respuesta inmunitaria de tipo celular.
Ejemplo 2. Obtención de las partículas tipo virus (VLP) de HBsAg con diferentes proporciones de fosfatidilserina
El HBsAg recombinante se obtuvo a partir de una cepa deP. pastorisusando el gen que codifica este antígeno [Patente Europea No. EP 480525]. Se sabe que el HBsAg expresado en esta especie de levadura contiene fosfatidilserina dentro de sus lípidos estructurales [Lobaina Y, et al. Biotecnologia Aplicada (2008), 25:325-331]. Sin embargo, hasta esta invención no se había estudiado la influencia de la presencia de este lípido en la inmunogenicidad de este antígeno.
Para estudiar cómo la proporción de fosfatidilserina afecta la inmunogenicidad del HBsAg, obtuvimos las preparaciones de esta VLP en diferentes condiciones de fermentación. Durante el cultivo en fermentadores de levadura recombinantes aumentamos la concentración de Mg(2+) en el medio de cultivo, a porcentajes entre 1.0 y 2.0 %, lo que provocó el aumento de este fosfolípido asociado a las VLP del HBsAg. Esto se detectó mediante cromatografía en capa fina durante la caracterización del HBsAg obtenido en las diferentes condiciones de crecimiento.
La fosfatidilserina está asociada a las VLP del HBsAg, de conocida naturaleza lipídica. Los resultados mostrados en la tabla 3 representan los valores promedio de las cinco repeticiones diferentes. La purificación fue similar para todas las preparaciones de HBsAg producidas en diferentes condiciones experimentales. Como se observa en la tabla, no hubo detección de fosfatidilserina en las muestras obtenidas cuando la fermentación se realizó con un medio de cultivo que contenía una concentración de Mg.(2+> a menos del 1.2 %. Los niveles de fosfatidilserina encontrados en la preparación obtenida con medios de cultivo que contienen 2.0 % de Mg(2+> fueron significativamente superiores a los encontrados en la preparación obtenida con el medio de cultivo que contenía 1.4 % Mg(2+> (Variante C).
Tabla 3. Obtención de las variantes del HBsAg con cantidades crecientes de fosfatidilserina
Las preparaciones del HBsAg representadas en la tabla 3 fueron idénticas en su composición proteica, según la caracterización realizada para estudiar su estructura primaria, secundaria y terciaria, comparables a la variante original. Es importante señalar que la relación concentración de lípidos/concentración de proteínas no cambió para ninguna de las variantes del estudio. El mismo hallazgo se obtuvo con la proporción de fosfolípidos totales versus el contenido de proteínas totales. No se produjeron otros cambios significativos durante los análisis de impurezas del HBsAg o de otros compuestos menores, como resultado del análisis de su composición mediante espectrometría de masas.
Ejemplo 3. Evaluación inmunológica de las preparaciones de HBsAg mostrando diferentes porcentajes de fosfatidilserina.
Con el objetivo de evaluar si la presencia de fosfatidilserina afecta la respuesta inmunitaria contra el HBsAg, se llevó a cabo un estudio de inmunogenicidad en ratones transgénicos que expresaban el HBsAg en suero [Castro FO, et al. Interferón y Biotecnologia (1989) 6:251-257; Pérez A, et al. Acta Biotechnol (1993) 13: 373-383]. Se usaron siete grupos de seis ratones cada uno. Se trataba de ratones hembra de 8-12 semanas de edad que fueron inmunizados por vía intranasal (IN). Los primeros seis grupos del estudio recibieron 5 |jg de cada una de las diferentes variantes del HBsAg descritas en la tabla 3 con el adyuvante de Freund. El séptimo grupo se usó como grupo de control y recibió PBS 1X. Todos los grupos de tratamiento recibieron 10 dosis del inmunógeno, que se administraron cada 14 días. Las extracciones de sangre se realizaron antes de la inmunización inicial y 10 días después de cada dosis, a partir de la tercera dosis. En la tabla 4 se muestran los niveles de HBsAg en sangre de ratones transgénicos, así como los niveles de citocinas (IFN gamma (IFN-y), factor de necrosis tumoral (TNF-a), e IL-2 inducidas en sobrenadantes de esplenocitos. cultivos, aislados después de administrar las 10 dosis. Las evaluaciones se realizaron mediante la técnica ELISA.
Después de la administración de 5 jg de HBsAg, por vía intravenosa en 10 inmunizaciones sucesivas, la concentración de HBsAg en la sangre de ratones transgénicos para HBsAg se redujo significativamente, cuando el nivel de fosfatidilserina en este HBsAg era del 5 % o más (variantes D, E y F en la tabla 3, Ejemplo 2). De la misma manera, las variantes de HBsAg de 5 % o más de fosfatidilserina indujeron niveles significativamente superiores de IFN-y, TNF-a e IL-2, en comparación con las variantes con niveles bajos (variante C) o aquellas donde la fosfatidilserina era indetectable, lo que sugiere un efecto dosis-dependiente. Esto se observa en la tabla 4.
En comparación con el HBsAg que no contiene fosfatidilserina, hubo un aumento significativo de las citocinas Th1 y se encontró una mayor capacidad de eliminación del HBsAg circulante después de la inmunización de ratones transgénicos HBsAg con variantes de HBsAg que contenían niveles superiores al 5 % de fosfatidilserina (Tabla 4, variantes D a F). Los niveles de citocinas encontrados para las variantes D - F fueron significativamente más altos que los de las condiciones A - C. Las variantes D - F indujeron las reducciones más fuertes en la concentración de HBsAg, así como las secreciones más potentes de citocinas después de la estimulaciónin vitrode células del bazo en animales transgénicos inmunizados.
Tabla 4. Evaluación del HBsAg circulante y los niveles de citocinas tras la inmunización de ratones transgénicos con variantes de HBsAg con diferentes porcentajes de fosfatidilserina.
Como se observó, hubo un aumento significativo de las citocinas Th1 y una mayor capacidad de eliminación del HBsAg circulante, mediante la inmunización de los ratones que fueron transgénicos al HBsAg con las variantes de HBsAg que tenían mayor contenido de fosfatidilserina, demostrando así un aumento de la inmunogenicidad del antígeno con el aumento de la proporción de este componente lipídico dentro de los lípidos asociados a las VLP formadas por este antígeno.
La inserción de la fosfatidilserina en las partículas de HBsAg había sido reportada previamente en el estado de la técnica. Sin embargo, no se había estudiado la forma en que la proporción de este componente afecta la inmunogenicidad de estas partículas. Aunque en 2008 Lobaina et al. había especulado sobre el papel de la fosfatidilserina en el HBsAg superior producido enP. pastoris[Lobaina Y, et al. Biotecnología Aplicada (2008), 25:325-331], en este mismo informe se demostró que dos vacunas basadas en HBsAg producidas en el mismo hospedador diferían en términos de inmunogenicidad, aunque los niveles de fosfatidilserina presumiblemente eran los mismos, debido a las especies de levadura que la producían.
Ejemplo 4. Demostración del aumento de la inmunogenicidad en pacientes con CHB de variantes de HBcAg que tienen una mayor proporción de ARNm encapsulado
En el ejemplo 1 se demostró en ratones que hubo un aumento en la inmunogenicidad del HBcAg con el aumento en la proporción del ARNm dentro de la cantidad total de ARN encapsulado. Teniendo en cuenta estos resultados, se caracterizaron el comportamiento inmunológico y la respuesta antiviralin vivode las formulaciones que incluían tanto HBcAg como HBsAg, con modificaciones en su ARNm y fosfatidilserina, respectivamente.
Para ello se llevó a cabo un ensayo clínico de fase II, aleatorizado y doble ciego, en pacientes con hepatitis B crónica. Los pacientes seleccionados tenían cargas virales elevadas, superiores a 10.000 copias/mL y el HBeAg era positivo al inicio del estudio. Los pacientes fueron distribuidos en 6 grupos, de 15 pacientes cada uno, a los cuales se les administró los tratamientos descritos en la tabla 5. Se administraron un total de 10 dosificaciones, las cuales se dividieron en dos ciclos de 5 dosis cada uno, con un intervalo de un mes entre ellos. Las primeras 5 dosis se administraron únicamente por vía IN y las otras 5 se administraron IN/SC al mismo tiempo. En ambos ciclos de administración las dosis se administraron a intervalos de 14 días.
Tabla 5. Grupos de tratamiento en el ensayo clínico fase II donde se llevó a cabo la evaluación de los antígenos HBcAg y HBsAg con modificaciones en el contenido del ARNm y la fosfatidilserina, respectivamente.
Sorprendentemente, se encontraron niveles significativamente más altos de seroconversión a HBeAg y HBsAg en el grupo de pacientes tratados con la formulación que contenía ambos antígenos modificados (es decir, la formulación que contenía HBsAg con niveles de fosfatidilserina superiores al 5 % y HBcAg con ARNm superior a 45 %), en comparación con los grupos de pacientes tratados con formulaciones sin estas características (véase la tabla 6). Esto muestra la relevancia de estas modificaciones en el aumento de la calidad de la respuesta antiviral generada en los pacientes.
En seres humanos, los antígenos fueron evaluados en el intervalo de concentraciones desde 50 |jg por antígeno por dosis, hasta 1000 jg por antígeno por dosis, con evidencia de respuesta antiviral, en términos de seroconversión a HBsAg y HBeAg, control virológico y respuesta virológica sostenida de menos de 10000 copias de ADN del HBV por mL, más de 1 año después de finalizar el tratamiento.
Tabla 6. Frecuencia de pacientes con seroconversión a HBeAg y HBsAg al año de finalizar el tratamiento en el ensayo clínico de fase II con HBcAg y HBsAg con modificaciones en su contenido de ARNm y fosfatidilserina respectivamente.
Resultados similares también se encontraron en el modelo de ratones transgénicos a HBsAg, donde se llevó a cabo un ensayo para evaluar grupos de tratamiento similares a los descritos en la tabla 5, y se obtuvo una mayor disminución del HBsAg circulante, así como títulos de anticuerpos anti-HBsAg más elevados, y con aparición más temprana, para los grupos que recibieron las formulaciones que contenían los antígenos con las modificaciones descritas anteriormente.
Curiosamente, las formulaciones que contienen las variantes de HBcAg y HBsAg modificado desarrollaron una inmunogenicidad Th1 más potente en ratones transgénicos al HBV y en pacientes, en comparación con la respuesta obtenida con las formulaciones que contenían los antígenos no modificados, o las formulaciones que contenían solo uno de estos antígenos modificados.
Ejemplo 5. Efecto adyuvante de los antígenos HBcAg y HBsAg que tienen modificaciones en su contenido de ARNm y fosfatidilserina respectivamente en formulaciones multivalentes.
En este estudio se comparó la capacidad adyuvante, es decir, el aumento de la respuesta inmunitaria hacia antígenos que se coadministran, dentro de una mezcla de proteínas HBcAg y HBcAg recombinantes con modificaciones en su contenido de ARNm y fosfatidilserina, respectivamente, con la mezcla de HBcAg no modificado y HBsAg, por vía parenteral y mucosa. Para ello se seleccionó la proteína quimérica recombinante CR3; este es el antígeno multiepitópico del HIV-1 [Iglesias E et al. J Biochem Mol Biol & Biophys (2001) 1:109-122]. Ocho grupos de ocho hembras Balb/c (H-2d) ratones de 6 a 8 semanas de edad se inocularon con: 1) PBS (Placebo) mediante inmunización SC (que hasta ahora se denominará Placebo (SC); 2) Solución reguladora de acetato de sodio (NaAc), pH = 5.2, mediante inmunización IN (Placebo (IN)); 3) la mezcla de HBcAg (C) y HBsAg (S) por vía SC (C+S (SC)); 4) la mezcla de HBcAg que contiene ARNm en una proporción del 50 % del ARN total de este antígeno (mC) y HBsAg que contiene 7 % de fosfatidilserina dentro de sus componentes lipídicos (mS) por la vía SC (mC+mS (SC)); 5) C+S por la vía IN (C+S (IN)); 6) mC+mS por la vía IN (mC+mS (IN)); 7) mezcla de CR3 con HBcAg (C) y HBsAg (S) por vía SC (CR3+C+S (SC)); 8) CR3+mC+mS (SC); 9) CR3+C+S (IN) y 10) CR3+mC+mS (IN). La dosis usada fue de 5 jg de cada antígeno por cada vía; y los inmunógenos se administraron los días 0, 7 y 21 del programa de vacunación. Para las inmunizaciones SC, las proteínas se disolvieron en PBS y se adsorbieron en 1.4 mg/mL de hidróxido de aluminio (Superfos Biosector A/S, Vedbaek, Dinamarca). Para la vía IN, las proteínas se disolvieron en NaAc, pH = 5.2. Los animales fueron anestesiados mediante la administración intraperitoneal (IP) de 30 pL de ketamina (10 mg/mL), ubicada en posición supina, y los inmunógenos se dispensaron lentamente en 50 pL (25 pL/por fosa nasal) con una punta de pipeta. Diez días después de las inmunizaciones, se recolectaron los sueros de todos los animales y cinco animales fueron sacrificados (de manera aleatoria) al final del estudio, para obtener su bazo para los estudios de respuesta inmunitaria celular.
La respuesta de IgG en el suero se evaluó mediante un ELISA indirecto donde las placas se recubrieron con la proteína CR3. La metodología para la cuantificación de la secreción de IFN-y en los sobrenadantes de los cultivos estimulados con CR3 ha sido informada previamente [Garcia Diaz D et al. Immunol Lett (2013) 149:77-84].
Para el análisis estadístico de los datos se evaluó la distribución Gaussiana con la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la igualdad de varianzas con la prueba de Bartlett. Las muestras con distribución normal (o aquellas en las que se infiere la distribución gaussiana) y con igual varianza se compararon con pruebas paramétricas; en caso contrario, se usó la prueba no paramétrica alternativa. Todos los títulos de IgG se transformaron a log 10, para lograr una distribución normal de los valores. A los sueros de los animales que no alcanzaron la seroconversión se les asignó un título arbitrario de 1:10, para su procesamiento estadístico. Un valor de p<0.05 se consideró estadísticamente significativo.
Los resultados de la determinación de anticuerpos IgG anti-CR3 (HIV-1), observados en la figura 2, mostraron una mayor respuesta (p<0.05) después de administraciones por las vías SC e IN en los grupos de animales inmunizados con la mezcla de CR3+mC+mS (grupos 8 y 10) contra CR3+C+S (grupos 7 y 9), respectivamente. De acuerdo con los resultados anteriores, también se observó una mayor secreción de IFN-y en los sobrenadantes de los cultivos de ratones de los mismos grupos, como se observa en la tabla 7. Para este análisis, diez días después de la última inmunización (día 31), se cultivaron esplenocitos de cinco ratones por grupo. Se prepararon suspensiones de esplenocitos de animales individuales para el grupo de placebo. fueron estimuladosex-vivocon 2.5 pg/mL de la proteína CR3 durante cinco días. En los líquidos sobrenadantes se cuantificó el IFN-<y>específico de CR3 con un ELISA tipo sándwich. El límite de detección fue de 0.80 ng/mL.
Tabla 7. Secreción de IFN-<y>medida en los líquidos sobrenadantes de los cultivos.
Grupo inóculo Réplica (ratón) IFN-y (ng/ml)
1 Placebo (SC) Grupo < 0.80
2 Placebo (IN) Grupo < 0.80
1 < 0.80
2 < 0.80
3 C+S (SC) 3 < 0.80
4 < 0.80
5 < 0.80
1 < 0.80
2 < 0.80
4 mC+mS (SC) 3 < 0.80
4 < 0.80
5 < 0.80
1 < 0.80
5 C+S (IN)
2 < 0.80
3 < 0.80 4 < 0.80 5 < 0.80 1 < 0.80 2 < 0.80 mC+mS (IN) 3 < 0.80
4 < 0.80 5 < 0.80 1 6.35 2 7.86 CR3+C+S (SC) 3 3.32
4 4.45 5 3.54 1 10.35 2 9.86 CR3+mC+mS (SC) 3 8.62
4 9.05 5 11.24 1 < 0.80 2 2.03 CR3+C+S (IN) 3 1.68
4 0.97 5 2.25 1 4.55 2 5.36 CR3+mC+mS (IN) 3 3.87
4 2.54 5 3.98 Finalmente, se comparó la frecuencia de las células CD8+ específicas de CR3 (HIV-1) tras la estimulaciónex-vivoen los grupos inmunizados por vía SC. Se obtuvo una mayor frecuencia de células CD8+ en el grupo estimulado en CR3+mC+mS (SC) vs CR3+C+S (SC) (p<0.05), lo cual se observa en la figura 3. Estos resultados, en su conjunto, muestran que la mezcla de HBcAg con ARNm superior al 45 % (mC) y de HBsAg con niveles de fosfatidilserina superiores al 5 % (mS) tienen un mayor efecto adyuvante Th1, por vía parenteral y mucosa. Particularmente, para la vacunación contra el HIV, este resultado es de gran importancia, porque la respuesta antiviral Th1 se ha relacionado con la protección contra la infección y progresión al AIDS.
Aunque no era objetivo de este experimento medir la respuesta humoral frente a los antígenos HBsAg y HBcAg (abreviados en este ejemplo como C y S), se observaron respuestas de IgG anti-HBcAg y anti-HBsAg que fueron superiores y estadísticamente significativas, en los grupos de ratones inmunizados con la mezcla de los antígenos HBsAg y HBcAg modificados (mC+mS), en comparación con la mezcla de HBsAg y HBcAg no modificados (C+S, datos no mostrados). Esto confirmó los resultados anteriores.
Ejemplo 6. Inmunización pasiva mediante la transferencia adoptiva de células de ratones Balb/c inmunizados con formulaciones de HBcAg y HBsAg con modificaciones en su contenido de ARNm y de fosfatidilserina, respectivamente, a ratones Balb/c transgénicos que expresan HBsAg.
En esta invención se ha querido potenciar la respuesta inmunitaria anti-HBsAg y anti-HBcAg en donantes mediante la inmunización activa de individuos con una formulación que contiene los antígenos de HBsAg y HBcAg, que incluyen modificaciones en su contenido de fosfatidilserina y de ARNm, respectivamente y además, las células que se van a transferir se activaríanin vitroantes de la transferencia, de modo que la respuesta contra estos antígenos sería máxima cuando las células sean inoculadas en el organismo receptor. Por consiguiente, un tipo de respuesta que es inexistente en las personas, se obtendría de forma artificial, permitiendo aumentar el margen de donantes a personas con haplotipos similares, independientemente de si han sido infectadas o no por el HBV.
En el presente ejemplo se evalúa, mediante la transferencia adoptiva de células, el efecto de la respuesta inmunitaria generada por la vacunación con una formulación compuesta por los antígenos HBsAg y HBcAg con modificaciones en su contenido de fosfatidilserina y de ARNm, respectivamente, que se aplica por vía IN/parenteral, en el contexto de un ratón transgénico que expresa el HBsAg, un modelo de infección persistente del HBV. Uno de los objetivos del estudio fue evaluar el efecto de la respuesta inmunitaria transferida sobre la concentración de HBsAg (antigenemia) en el suero del ratón transgénico. Por otra parte, se compara el efecto de la respuesta inducida por la combinación de vías IN/parenteral para la administración de la formulación de los antígenos HBsAg y HBcAg en relación con el efecto generado por la transferencia de células estimuladas únicamente con HBsAg.in vivo e in vitro.Además, se estudió la cinética de respuesta del anticuerpo anti-HBsAg transferido en el contexto del ratón transgénico para este antígeno. Se usaron ratones Balb/c y ratones transgénicos HBsAg (+) (con antecedente genético de Balb/c, obtenidos en el CIGB).
Generación de inmunidad anti-HBsAg en ratones Balb/c
Se realizó un programa de vacunación en ratones hembra Balb/c de 8 a 12 semanas de edad. Los ratones fueron inmunizados con una preparación de vacuna que contenía los antígenos modificados HBsAg (con un contenido de fosfatidilserina superior al 5 %) y HBcAg (con un contenido de ARNm superior al 45 %), simultáneamente por vía intravenosa y parenteral. Dentro de la vía parenteral, se probaron las vías IM, SC e ID. La dosificación (en un volumen de 100 |<j>L) se administró los días 0 y 14, y se administró una inyección de refuerzo el día 100, antes de la transferencia. Las extracciones de sangre se realizaron en el plexo retroorbitario los días 2, 10 y 25. En la Tabla 8 se muestra el diseño del programa de vacunación, incluyendo el tratamiento recibido por cada grupo.
Tabla 8. Programa de vacunación en ratones Balb/c no transgénicos
La evaluación de la respuesta inmunitaria humoral generada por estos tratamientos se llevó a cabo midiendo la respuesta IgG y las subclases de IgG anti-HBsAg, después de cada inoculación, mediante la técnica ELISA. Para evaluar la respuesta inmunitaria celular, a los 10 días de la primera administración, se llevó a cabo un ensayo tipo ELISPOT para medir la secreción de IFN-y específico contra el HBsAg por los linfocitos CD8+ del bazo. Los resultados de estas evaluaciones indican que el grupo 5 genera la mayor respuesta celular y una respuesta humoral que no difiere del resto de los grupos estudiados. En base a esto, se seleccionaron dos animales de este grupo como donantes de esplenocitos para su transferencia adoptiva. La selección del inmunógeno se llevó a cabo en una proporción de 1:1 (HBsAg:HBcAg)
Obtención de esplenocitos inmunitarios.
Quince días después de recibir la inyección de refuerzo, se sacrificaron los dos ratones del grupo 5 y los tres ratones del grupo 7 (placebo) y se les extrajo el bazo. Se agruparon los bazos del grupo 5 y los del grupo 7, respectivamente. Los bazos se procesaron hasta obtener los esplenocitos. Se separaron en alícuotas de 30 * l06 células en 100 pL de PBS 1X, para su transferencia a los ratones receptores.
Transferencia adoptiva de inmunidad
Los ratones transgénicos que expresaban el HBsAg que se usaron como receptores tenían entre 16-20 semanas de edad y eran de ambos sexos. Fueron asignados a los diferentes grupos de tratamiento como se muestra en la tabla 9. Antes de la transferencia de esplenocitos se realizó una extracción parcial de sangre para comprobar los niveles de HBsAg en suero. Posteriormente se inocularon (por vía IP) 30*106 esplenocitos en un volumen de 100 pL de PBS 1X. Las extracciones de sangre para evaluar el efecto de la transferencia adoptiva de inmunidad se realizaron a través del plexo retroorbitario, cada semana durante 5 semanas. En la semana 8 después de la transferencia, los animales fueron desangrados y sacrificados.
Tabla 9. Diseño del experimento de transferencia adoptiva de inmunidad.
Cuantificación del HBsAg en suero de ratones transgénicos para HBsAg
Los niveles de HBsAg en suero se determinaron mediante ELISA. Las placas fueron recubiertas con el anticuerpo monoclonal anti-HBsAg denominado Hep4 (producido por el CIGB). Todos los ratones que recibieron células con inmunidad previa al HBsAg mostraron, a partir de la evaluación de la semana posterior a la transferencia, una marcada disminución del HBsAg en el suero, con diferencias significativas entre el tiempo cero y la 2a y 3a semanas (p<0.05). A partir de la cuarta semana (día 35) se observó que las concentraciones de HBsAg en el suero comenzaron a aumentar, indicando así que el control de la antigenemia por la inmunidad transferida está disminuyendo. A partir de este momento, y hasta la semana 8 (día 63), no existen diferencias en la antigenemia, con la reportada para el tiempo cero del ensayo.
En el caso de los ratones que recibieron la transferencia de esplenocitos con inmunidad específica contra HBsAg, se detectaron marcados descensos del HBsAg en suero, que fueron más notables entre los días 7 y 28. Sin embargo, para los ratones que recibieron la transferencia de esplenocitos placebo, o PBS, aunque hay cambios en la concentración del HBsAg en el suero, nunca alcanzaron una diferencia significativa con el tiempo cero, y nunca se detectaron valores inferiores a 5 pg/ml.
Estos resultados indican que es posible, mediante la transferencia adoptiva de inmunidad, mediada por células, disminuir eficazmente los niveles de HBsAg circulantes en el suero de estos animales transgénicos de esta proteína. El control establecido sobre la antigenemia, mediante la respuesta inmunitaria transferida en este caso, fue eficaz y duró aproximadamente 3 semanas después de una transferencia de una sola célula.
Respuesta IgG anti-HBsAg en el suero
Se detectó una respuesta de anticuerpos IgG específicos contra HBsAg en todos los ratones que recibieron la transferencia de esplenocitos con inmunidad previa para este antígeno. Esto concuerda con los resultados de antigenemia obtenidos. En el caso de los animales con respuesta anti-HBsAg los títulos detectados fueron elevados (Título>104) y comenzó a disminuir a partir de la tercera semana, lo que puede estar relacionado con el aumento de la antigenemia que se observa en estos animales alrededor de las 4a semana (día 35). Los grupos que recibieron la transferencia de células placebo o PBS no mostraron anticuerpos específicos.
Claims (11)
1. Composición farmacéutica que comprende partículas similares a virus (VLPs) del antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg) y VLP del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), en la que las VLP de HBcAg comprenden ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45 % de la cantidad total de ácido ribonucleico (ARN) en dichas VLP de HBcAg, y las VLP de HBsAg incluyen fosfatidilserina en una proporción superior al 5 % de la cantidad total de fosfolípidos de dichas VLP de HBsAg.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha composición está formulada para administración por vía parenteral o mucosa.
3. La composición de la reivindicación 2, en la que dicha composición incluye adicionalmente un adyuvante de vacuna.
4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición es para su uso en la inmunoprofilaxis o inmunoterapia contra la infección por el virus de la hepatitis B (HBV).
5. La composición para su uso según la reivindicación 4, en la que dicho uso es en el tratamiento de pacientes con hepatitis B crónica (CHB) o pacientes con coinfecciones en las que uno de los virus infectantes es el h Bv .
6. La composición para su uso según la reivindicación 5, en la que el tratamiento de pacientes con CHB es en la prevención del cáncer hepatocelular derivado de la infección por HBV.
7. La composición para su uso según la reivindicación 4, dicha inmunoterapia implica una forma activa o pasiva a través de estimulación celular.
8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el aumento de la respuesta inmunitaria contra un antígeno adicional que se coadministra con la composición.
9. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en la que el antígeno adicional es un antígeno del HIV-1.
10. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 9, en la que el antígeno del HIV-1 es un antígeno del HIV-1 multiepítopo.
11. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 10, en la que el antígeno multiepítopo del HIV-1 es la proteína quimérica recombinante CR3.
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