WO2017167317A1 - Composición farmacéutica que comprende los antígenos de la superficie y de la nucleocápsida del virus de la hepatitis b - Google Patents

Composición farmacéutica que comprende los antígenos de la superficie y de la nucleocápsida del virus de la hepatitis b Download PDF

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Yadira Lobaina Mato
Enrique Iglesias Perez
Eduardo Penton Arias
Gerardo Enrique Guillen Nieto
Jorge Agustin AGUIAR SANTIAGO
Sonia Gonzalez Blanco
Jorge VALDES HERNANDEZ
Mariela Vazquez Castillo
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    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine, in particular with the branch of vaccinology, specifically with the development of more effective vaccine compositions.
  • These compositions comprise hepatitis B virus (HBV) antigens that have modifications in their chemical composition, which unexpectedly increased their immunogenicity.
  • HBV antigens modified in their chemical composition were the surface antigen (HBsAg) and the core antigen (HBcAg).
  • HBC chronic hepatitis B
  • interferon (IFN) alpha IFN- ⁇
  • PegIFN pegylated variant
  • nucleotide and nucleoside analogues such as Tenofovir, Entecavir, Lamivudine, Adefovir-dipivoxil and Telbivudine
  • AD adverse events
  • vaccine formulations as an immunotherapeutic strategy, in the treatment of HBC is an interesting approach. Viral persistence has been associated with a defect in the development of anti-HBV cellular immunity. Since the beginning of the 1980s, vaccine strategies have been developed aimed at expanding and enhancing the weak T-cell response of HBC patients. These immunotherapeutic strategies initially used commercial anti-HBV vaccines, with the aim of inducing specific CD4 + and CD8 + responses against HBV, and pro-inflammatory cytokines capable of controlling viral replication. Thus, almost all commercial preventive vaccines were tested alone, or in conjunction with conventional antiviral therapies. In previous studies of therapeutic vaccination, vaccines were administered with or without other antiviral treatments. In addition, immunotherapy with commercial vaccines also proposed schemes with a greater number of inoculations and alternative parenteral routes were explored. The main studies are summarized below.
  • Genhevac B ® A pilot vaccination study in patients with HBC using Genhevac B ® (Aventis Pasteur, France, produced in mammalian cells -CHO) showed a reduction in HBV replication, of about 50% of chronic carriers [Pol S, e ⁇ to the. CR Acad Sci III (1993), 316: 688-91].
  • Genhevac ® vaccine was evaluated for therapeutic purposes [Yalcin K, e ⁇ al. Infection (2003), 31: 221-225; Dikici B, et al. J Gastroenterol Hepatol (2003), 18 (2): 218-22] showed only very slight benefits associated with treatment.
  • the Hepagene ® vaccine (Medeva Ltd., United Kingdom, produced in CHO), includes the three variants of HBsAg (L, S and M), and its results in healthy volunteers and non-responders demonstrated high levels of immunogenicity [Page M, e ⁇ to the. Intervirology (2001), 44: 88-97; Yap I, et al. Ann Acad Med Singapore (1996), 25: 120-122; Zuckerman JN, et al. BMJ (1997), 314: 329; Jones CD, et al. Vaccine (1999), 17 (20-21): 2528-37]. Taking this into consideration, a study was carried out where its therapeutic potential was evaluated.
  • the combined antiviral vaccination strategy should favor a greater reactivity of the T-cell response to HBV, but it can also be considered safer, since it must avoid great liver damage, as a consequence of the activation of the immune system.
  • the activation of the specific immune response, by the vaccine, in HBC patients causes fulminant hepatitis.
  • envelope proteins have characteristics that justify their inclusion in a therapeutic vaccine.
  • envelope proteins contain numerous B and T cell epitopes [Penna A, et al. J Virol (1992), 66 (2): 1 193-6; Nayersina R, et al. J Immunol (1993), 150: 4659-71], and it is estimated that anti-envelope antibodies play a critical role in viral suppression, by removing free viral particles from the circulation and preventing the re-infection of susceptible cells.
  • HBcAg has been suggested as the main antigenic candidate to be included in a therapeutic vaccine for HBC.
  • the epitopic T-cell response is strongly favored, and is predominant during seroconversion in spontaneous or treatment-induced HBC [Ferrari C, et al. J Clin Invest (1991), 88: 214-22; Marinos G, et al. Hepatology (1995), 22: 1040-9; Tsai SL, et al. Clin Invest (1992), 89: 87-96].
  • HBsAg The Center for Genetic Engineering and Biotechnology (CIGB) produces HBsAg, as a recombinant protein, obtained in Pichia pastoris yeast as a host. This antigen has been included in the Heberbiovac HB ® preventive vaccine since early 90s of the last century [Muzio V, et al. Applied Biotechnology (2001) 18; 103-104; ul-Haq N, et al. Vaccine (2003) 21: 3179-85].
  • the CIGB developed a formulation where the anti-hepatitis B immune response is extended, said formulation comprising as main components HBsAg and HBcAg, the antigens are administered mucosally, to generate systemic and mucosal response [European Patent No. EP 1 136077].
  • the generation of aggregate antigenic structures, which form particles is described. This document reveals that aggregation, delipitation or oxidation, as well as the selection of particles of 30-500 nm, and the formulation of these suitably adjuvant aggregates favor the immunogenicity of the resulting antigenic preparation [European Patent No. EP 1346727].
  • NASVAC anti-vacuna Y, et al. Mol Immunol (2015), 63: 320-327
  • NASVAC a therapeutic vaccine candidate administered by combining immunization routes.
  • the clinical results of the vaccine formulation are very attractive; however, the effectiveness of the product must be increased with the use of more potent immunogens.
  • Vaccine strategies that include the main HBV antigens, such as HBsAg and HBcAg, have resulted in formulations with some antiviral effectiveness. However, its improvement is required to increase the number of patients with sustained antiviral response, as well as the number of patients who achieve seroconversion of HBsAg to anti-HBsAg.
  • the invention contributes to solving the aforementioned problem, by providing a pharmaceutical composition characterized in that it comprises: 1) the HBcAg antigen comprising messenger ribonucleic acid (mRNA) in a proportion greater than 45% of the total ribonucleic acid (RNA) of said antigen and 2) the HBsAg antigen of HBV.
  • the pharmaceutical composition contains HBsAg comprising phosphatidylserine, in a proportion greater than 5% of the total phospholipids possessed by said antigen.
  • HBsAg and HBcAg antigens modified in their chemical constitution in that particular way, favors the immunological and antiviral properties of that composition for immunotherapy.
  • the aforementioned modifications do not affect the protein composition of the HBsAg and HBcAg antigens of the invention, since their primary, secondary and tertiary structure remains identical, compared to their unmodified variants.
  • modifications lead to unexpected characteristics of said antigens, which result in more potent immunogens.
  • the combination of said modified antigens led to a formulation with superior antiviral and therapeutic effectiveness for the treatment of HBC.
  • HBcAg was obtained with an mRNA level exceeding 45%.
  • this modified antigen was obtained due to the combination of changes in parameters of the fermentation process thereof.
  • the use of a chemically defined medium and the low specific growth rate resulted in obtaining a variant of the HBcAg where the proportion of mRNA increased compared to the rest of the RNAs present therein.
  • HBcAg containing a level of mRNA that exceeds 45%, within total RNA had a higher immunogenicity compared to HBcAg obtained without modification in its mRNA content.
  • Said increase in immunogenicity comprised a significant increase in Th1 cytokines, and a superior ability to eliminate circulating HBsAg after immunizing transgenic mice and HBC patients.
  • HBsAg containing phosphatidylserine was evaluated in a percentage greater than 5% of the total phospholipids that are present in this lipoprotein antigen.
  • the increase in the proportion of phosphatidylserine, above 5% of the total phospholipids was demonstrated after the variation of parameters such as the increase in concentrations of calcium and magnesium in the fermentation medium, the low specific growth rate and the low pH.
  • the invention is not restricted to the HBsAg obtained under those conditions.
  • the increase in the proportion of phosphatidylserine above 5% was correlated with the increase in the immunogenicity of the resulting antigen, when compared with HBsAg with a lower content of said phospholipid.
  • HBsAg and HBcAg antigens modified have been selected on the basis of the higher intensity of the immune and antiviral responses, as compared to formulations in which the unmodified antigens were employed.
  • the formulation containing the two antigens was able to produce seroconversion of HBsAg to anti-HBsAg in a larger number of individuals, when compared with the antigens administered separately, demonstrating the importance and functionality of the modifications detected in the antigens that are part of the composition object of the present invention, as well as the superiority of the combined formulations, in comparison with the individual antigens.
  • the present invention represents a novel solution to the problem prevailing in the state of the art, on the need for new formulations that allow the potentiation of the anti-HBsAg and anti-HBcAg immune response, to achieve more effective antiviral treatments for the control of chronic HBV infection.
  • the matter referred to in the present invention cannot be considered as obvious, or derived from the state of the art by versed persons, since it is the result of the identification of new characteristics in the described antigens.
  • modified antigens keep their protein composition intact, they are different in terms of the chemical composition of other molecules associated with them.
  • modified HBcAg is considered to be that preparation of HBcAg comprising mRNA in a proportion greater than 45% of the total RNA of said antigen.
  • modified HBsAg is considered to be that preparation of HBsAg comprising phosphatidylserine in a proportion greater than 5% of the total phospholipids of said antigen.
  • the composition comprising the HBcAg antigen comprising mRNA in a proportion greater than 45% of the total RNA of said antigen and the HBsAg HBV antigen is characterized in that it is formulated for administration by parenteral routes and mucosal To administer the composition of the invention by the mucosal route, and in particular by the nasal route, attachments that have been developed and / or marketed for the administration of pharmaceutical formulations by that route can be employed.
  • said composition is characterized in that it additionally comprises a vaccine adjuvant.
  • vaccine adjuvants that may be present in the composition of the invention are, for example, those that are well known to those skilled in this branch of the art, such as aluminum salts, water-in-oil emulsions developed for its use in humans, immune system stimulators, etc.
  • the invention provides the use of the HBcAg antigen comprising mRNA in a proportion greater than 45% of the total RNA of said antigen and the HBsAg antigen in the manufacture of a medicament for immunoprophylaxis or immunotherapy against HBV infection.
  • the HBsAg that is part of said medicament comprises phosphatidylserine in a proportion greater than 5% of the total phospholipids of said antigen.
  • said medicament is formulated for administration by the parenteral and mucosal routes.
  • the medicament comprising HBcAg comprising mRNA in a proportion greater than 45% of the total RNA of said antigen and the HBsAg antigen is used in the treatment of HBC patients or patients with coinfections where one of the viruses Infectious is HBV. Additionally, when treating HBC patients with this medication, it is used in the prevention of hepatocellular cancer derived from HBV infection.
  • the drug comprising HBcAg comprising mRNA in a proportion greater than 45% of the total RNA of said antigen and the HBsAg antigen is used in the treatment of HBC patients by immunotherapy, it can be performed in an active way ( by immunizing patients with said medication) or passively, by cellular stimulation. Due to its components, the pharmaceutical formulation of the invention can be used in the stimulation of autologous or heterologous cells. That way, The invention constitutes a method of cellular stimulation with said formulation, and the subsequent passive immunization of patients with HBC, based on the maximum stimulation, in vivo or in vitro, of autologous or heterologous cells, which include dendritic cells, B cells and macrophages
  • the present invention discloses a method for immunoprophylaxis or immunotherapy against HBV infection that is characterized in that an effective amount of a pharmaceutical composition comprising the HBcAg antigen, which comprises mRNA, is administered to an individual in need thereof. a proportion greater than 45% of the total RNA of said antigen, and HBsAg HBV antigen.
  • the HBsAg comprises phosphatidylserine in a proportion greater than 5% of the total phospholipids of said antigen.
  • said pharmaceutical composition is administered parenterally and mucosally.
  • the individual receiving immunotherapy is an HBC patient. In that case, the application of the method of the invention to the immunotherapy of HBC patients results in the prevention of hepatocellular cancer derived from HBV infection.
  • the HBsAg that is part of the antigen mixture comprises phosphatidylserine in a proportion greater than 5% of the total phospholipids of said antigen.
  • the mixture of referred antigens can be used in potentiating the immune response against HBC (in a therapeutic setting) or in preventive vaccination strategies, where the vaccine is multivalent. This is because, in addition to the increased immunogenicity of the HBsAg and HBcAg antigens modified in particular, it was possible to verify that they are capable of inducing a potentiating effect of the immunogenicity of heterologous antigens. The results of the experimental evaluations showed that these antigens present in multivalent formulations may be useful for prophylactic or therapeutic use.
  • FIG. 1 Proliferative response of CD8 + CR3 (HIV-1) -specific T cells.
  • Example 1 Obtaining the HBcAg protein with various proportions of the RNA variants
  • HBcAg was obtained from a strain of E. coli genetically transformed with a plasmid carrying the gene that codes for said antigen [Aguilar JC, et al. Immunol Cell Biol (2004) 82: 539-46].
  • mice Once different variants of HBcAg with different percentages of mRNA incorporated inside the particle were obtained (Table 1), the immunological evaluation of these preparations was carried out in Balb / c mice. For this study female mice, between 8 and 12 weeks of age, were used that received two immunizations, on days 0 and 15, by the SC route, with a dose of ⁇ g of HBcAg in phosphate buffered saline (PBS), administering a final volume of 100 ⁇ _. The detailed description of the scheme is shown in Table 2.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 2 Obtaining HBsAg virus-like particles (PSV) with different proportions of phosphatidylserine
  • HBsAg Recombinant HBsAg was obtained from a strain of P. pastoris genetically transformed with the gene encoding said antigen [European Patent No. EP 480525]. It is known that HBsAg expressed in this species of yeast, contains phosphatidylserine within its structural lipids [Lobaina Y, et al. Applied Biotechnology (2008), 25: 325-331]. However, until the present invention, the influence of the presence of this lipid on the immunogenicity of said antigen had not been studied.
  • Phosphatidylserine was associated with the PSV of HBsAg, of recognized lipid nature.
  • the results shown in Table 3 represent the average values of five different repetitions. Purification was similar for all HBsAg preparations produced under different experimental conditions. As can be seen in the table, there was no detection of phosphatidylserine in the samples obtained when the fermentation was carried out with a culture medium containing a Mg (2+) concentration below 1.2%. The phosphatidylserine levels found in the preparation obtained with culture medium containing 2.0% Mg (2+) were significantly higher than those found in the preparation obtained with culture medium containing 1.4% Mg (2+) ( Variant C).
  • Mg ( '(%): concentration of the Mg ion (in percent) present in the saline additives of the culture medium.
  • FS (%): percentage of phosphatidylserine within the total phospholipids, determined after the extraction of purified HBsAg.
  • * Significant differences ⁇ p ⁇ 0.05),
  • ** Very significant differences ⁇ p ⁇ 0.01).
  • the HBsAg preparations represented in Table 3 were identical in their protein composition, according to the characterization made to study their primary, secondary and tertiary structure, comparable to their original variant. Importantly, the ratio of lipid concentration / protein concentration It did not change, for any of the variables under study. The same finding took place with the proportion of total phospholipids vs. total protein content. There was no other significant change during the analysis of impurities of HBsAg or other minor compounds, as a result of the analysis of its composition by mass spectrometry.
  • mice expressing serum HBsAg were used.
  • the first six study groups each received 5 ⁇ g of the different variants of HBsAg described in Table 3 with Freund's adjuvant.
  • the seventh group was used as a control group, and received 1 X PBS.
  • All treatment groups received 10 doses of immunogen, which were administered every 14 days. Blood extractions were carried out before the initial immunization and 10 days after each dose, from the third dose administered. Table 4 shows the levels of HBsAg in the serum of transgenic mice, as well as cytokine levels (IFN gamma (IFN- ⁇ ), tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), and IL-2 induced in supernatants of splenocyte culture, isolated after the 10 doses were administered. The evaluations were performed using the ELISA technique.
  • HBsAg variants of 5% or more of phosphatidylserine induced significantly higher levels of IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and IL-2, compared to variants with low (variant C) or undetectable levels of phosphatidylserine, which suggests a dose dependent effect. All this can be seen in Table 4.
  • a - F HBsAg variants produced with increasing levels of phosphatidylserine in its composition, shown in Table 3.
  • Example 1 an increase in the immunogenicity of HBcAg was evidenced in mice with the increase in the proportion of mRNA within the total encapsulated RNA. Taking these results into account, the in vivo immunological and antiviral response behavior of formulations that include both HBcAg and HBsAg were characterized, with modifications in their mRNA and phosphatidylserine content, respectively.
  • a randomized, phase-blind, phase II clinical study was carried out in chronic patients with hepatitis B. Patients with a viral load above 10,000 copies / mL and positive HBeAg at the start of the study were selected. . The patients were divided into 6 groups, of 15 patients each, to whom the treatments described in Table 5 were administered. A total of 10 doses were administered, divided into two cycles of 5 doses each, separated by a month of break. The first 5 doses were administered only by the IN route, and the remaining 5 by simultaneous co-administration IN / SC. In both cycles of administrations the doses were set at intervals of 14 days.
  • mHBcAg HBcAg containing mRNA in a proportion of 50% of the total RNA of said antigen
  • mHBsAg HBsAg containing 7% phosphatidylserine within the lipid components of PSV.
  • significantly higher levels of seroconversion to HBeAg and HBsAg were found in the group of patients treated with the formulation containing both modified antigens (i.e. the formulation containing HBsAg with phosphatidylserine levels greater than 5%, and HBcAg with mRNA by above 45%), when compared with the groups of patients treated with formulations without these characteristics (see Table 6). This demonstrates the relevance of such modifications in increasing the quality of the antiviral response that was generated in patients.
  • HBV per mL more than 1 year after the end of treatment.
  • formulations containing the modified HBcAg and HBsAg variants developed a more potent Th1 immunogenicity in transgenic mice for HBV and in patients, compared to the response obtained with formulations containing unmodified antigens, or formulations that They contained only one of these modified antigens.
  • Example 5 Adjuvant effect of HBcAg and HBsAg antigens that have modifications in their mRNA and phosphatidylserine content, respectively, in multivalent formulations
  • the adjuvant capacity that is, the increase in the immune response to co-administered antigens, of the mixture of recombinant HBcAg and HBcAg proteins that have modifications in their mRNA and phosphatidylserine content, respectively.
  • the recombinant chimeric protein CR3 was selected, which is a multiepitopic HIV-1 antigen [Iglesias E et al. J Biochem Mol Biol & Biophys (2001) 1: 109-122].
  • the dose used was 5 ⁇ g of each antigen per route, and the immunogens were administered on days 0, 7 and 21 of the immunization schedule.
  • SC immunization the Proteins were dissolved in PBS and adsorbed in 1.4 mg / mL of aluminum hydroxide (Superfos Biosector A / S, Vedbaek, Denmark).
  • IP intraperitoneal
  • the animals were anesthetized by intraperitoneal (IP) administration of 30 ⁇ _ of ketamine (10 mg / mL), placed supine, and immunogens were slowly dispensed in 50 ⁇ (25 ⁇ / per nostril) with a pipette tip.
  • IP intraperitoneal
  • the serum IgG response was evaluated by an indirect ELISA where the plates were coated with the CR3 protein.
  • the methodology for the quantification of IFN- ⁇ secretion in supernatants of cultures stimulated with CR3 has been previously reported [Garc ⁇ a Diaz D et al. Immunol Lett (2013) 149: 77-84].
  • the Gaussian distribution of the data was evaluated with the Kolmogorov-Smirnov test and the equality of variance with the Bartlett test. Samples with normal distribution (or those that are inferred by the Gaussian distribution) and with equal variance were compared with parametric tests. Otherwise, an alternative non-parametric test was selected. All IgG titles were transformed to log 10, to achieve a normal distribution of values. Serums from animals that did not reach seroconversion were assigned an arbitrary 1: 10 title for statistical processing. A value of p ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • Example 6 Passive immunization by adoptive transfer of cells from Balb / c mice immunized with HBcAg and HBsAg antigen formulations with modifications in their mRNA and phosphatidylserine content, respectively, to transgenic Balb / c mice expressing HBsAg
  • the present invention it is desired to enhance the immune response anti-HBsAg and anti-HBcAg in donors, from the active immunization of individuals with a formulation containing the HBsAg and HBcAg antigens, which comprise modifications in their phosphatidylserine and mRNA content, respectively and, additionally, the cells to be transferred would be activated in vitro, prior to transfer, so that the response against these antigens is maximal when the cells are inoculated into the recipient organism. In this way, a type of non-existent response is obtained artificially in people, allowing to broaden the donor margin to people with similar haplotypes, regardless of whether they have been infected or not by HBV.
  • the effect of the immune response generated by vaccination with a formulation composed of the HBsAg and HBcAg antigens with modifications in their phosphatidylserine and mRNA content, respectively, is evaluated by means of adoptive cell transfer. along the IN / parenteral routes, in the context of a transgenic mouse that expresses HBsAg, a model of persistent HBV infection.
  • One of the objectives of the study was the evaluation of the effect of the transferred immune response on the concentration of HBsAg (antigenemia) in the serum of the transgenic mouse.
  • mice Female Balb / c mice, 8 to 12 weeks old.
  • the mice were immunized with a vaccine preparation containing the modified antigens HBsAg (with phosphatidylserine content greater than 5%) and HBcAg (with mRNA content greater than 45%), simultaneously by the IN and parenteral routes. Within the parenteral route, in this case the IM, SC and ID routes were tested.
  • the doses (in volume of 100 ⁇ ) were administered on days 0 and 14, and a booster dose was administered on day 100, prior to transfer. Blood extractions were performed by the retrorbital plexus on days -2, 10 and 25.
  • Table 8 shows the design of the immunization scheme, including the treatment received by each group. Table 8. Immunization scheme in non-transgenic Balb / c mice.
  • mHBcAg HBcAg containing mRNA in a proportion of 50% of the total RNA of said antigen; mHBsAg: HBsAg containing 7% phosphatidylserine within the lipid components of PSV.
  • the evaluation of the humoral immune response generated by these treatments was carried out by measuring the IgG response and the subclasses of anti-HBsAg IgG, after each inoculation, using the ELISA technique.
  • an ELISPOT type test was performed 10 days after the first administration to measure the secretion of specific IFN- ⁇ against HBsAg by CD8 + lymphocytes from the spleen.
  • the results of these evaluations indicate that Group 5 generates the highest cellular response and a humoral response that does not differ from the rest of the groups studied. Based on this, two animals from this group were selected as splenocyte donors for adoptive transfer. Immunogen selection was performed in a 1: 1 ratio (HBsAg: HBcAg)
  • mice of Group 5 Fifteen days after receiving the booster dose the two mice of Group 5, and three mice of Group 7 (placebo) were sacrificed and the spleen was removed. The spleens of Group 5 and those of Group 7 were grouped, respectively. The spleens were processed until splenocytes were obtained. Aliquots of 30 x 10 6 cells in 100 ⁇ of 1 X PBS were separated for transfer to recipient mice.
  • mice that express HBsAg between 16-20 weeks of age and both sexes, were used as receptors. They were assigned to the different treatment groups as shown in Table 9. Prior to the transfer of splenocytes, a partial blood extraction was performed to check serum HBsAg levels. Subsequently, they were inoculated (via the IP route) 30 x10 6 splenocytes in a volume of 100 ⁇ of 1 X PBS. Blood extractions, to assess the effect of the adoptive transfer of immunity, were carried out through the plexus. retrorbital, weekly, for 5 weeks. In week 8 post-transfer, the animals were bled and slaughtered.
  • Serum HBsAg levels were determined by ELISA.
  • the plates were coated with the anti-HBsAg monoclonal antibody named Hep4 (produced by the CIGB). All mice that received cells with immunity prior to HBsAg showed, from the evaluation at the post-transfer week, a marked decrease in serum HBsAg, finding significant differences between time zero and the 2nd and 3rd week ⁇ p ⁇ 0.05). From the fourth week (day 35) it is observed that serum HBsAg concentrations begin to increase, which indicates that the control of antigenemia by transferred immunity is disappearing. From this point, and until week 8 (day 63), there is no difference in antigenemia with that reported for the zero time of the trial.
  • mice that received the transfer of splenocytes with specific immunity against HBsAg a marked decrease in serum HBsAg was detected, which was most noticeable between days 7 and 28.
  • mice that received the transfer of placebo splenocytes, or PBS although fluctuations in serum HBsAg concentration are detected, it never significantly differs from zero time, and values below 5 ⁇ g / ml are never detected.

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Abstract

La presente invención revela una composición farmacéutica que comprende el antígeno de la superficie (HBsAg) del virus de la hepatitis B (VHB) y el antígeno de la nucleocápsida (o core, HBcAg) del propio virus. El HBcAg presente en dicha composición contiene ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45% del total de ácido ribonucleico (ARN) de dicho antígeno. Debido a cambios en la constitución de los antígenos que la componen, la composición de la invención es útil para la prevención o el tratamiento de la hepatitis B crónica. También contempla el uso de esa composición farmacéutica en la manufactura de un medicamento para la inmunoprofilaxis o la inmunoterapia contra la infección por VHB, y su uso para incrementar la respuesta inmune contra un antígeno adicional que se co-administra con la mezcla de dichos antígenos.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE COMPRENDE LOS ANTÍGENOS DE LA SUPERFICIE Y DE LA NUCLEOCÁPSIDA DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con el campo de la medicina, en particular con la rama de la vaccinología, específicamente con el desarrollo de composiciones vacunales de mayor efectividad. Estas composiciones comprenden antígenos del virus de la hepatitis B (VHB) que poseen modificaciones en su composición química, lo que inesperadamente aumentó la inmunogenicidad de los mismos. Los antígenos del VHB modificados en su composición química fueron el antígeno de la superficie (HBsAg) y el antígeno del core (HBcAg).
Estado de la técnica anterior
La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera que cerca de un tercio de la población mundial ha sido infectada por VHB, basados en la presencia de marcadores serológicos de infección. Se ha estimado que, aproximadamente, del 5 al 10% de los adultos y hasta el 90% de los recién nacidos infectados por VHB desarrollan hepatitis B crónica (HBC). En la actualidad, 350 millones de personas tienen infección persistente o crónica. La replicación sostenida del virus, por largo plazo, conduce a un proceso inflamatorio del hígado, que lleva a la muerte al 25% de la población infectada, como consecuencia de cirrosis, carcinoma hepatocelular, o debido a otras complicaciones como ascitis; sangramiento esofágico y esplenomegalia. A pesar de la vacunación universal de los neonatos e infantes durante los últimos años, y de la reducción subsecuente de la incidencia de nuevas infecciones por VHB, la HBC se mantiene como un problema de salud significativo, en escala mundial [Hilleman, M.R. Vaccine (2001 ), 19, 1837-48].
El tratamiento con interferón (IFN) alfa (IFN-α), su variante pegilada (PegIFN) y los análogos de nucleótidos y nucleósidos, como el Tenofovir, Entecavir, Lamivudina, Adefovir-dipivoxil y Telbivudina, constituyen el estado del arte de los tratamientos de la HBC. En general, estos fármacos tienen pobre eficacia con relación a la eliminación sostenida del VHB después del tratamiento, y su uso se asocia a importantes eventos adversos (EA), lo cual es ampliamente reconocido [Nash K. Adv Ther (2009), 26:155-169; Yang N, Hepatol Int. 2015 Sep 12. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 26363922].
El uso de formulaciones vacunales, como estrategia inmunoterapéutica, en el tratamiento de la HBC constituye un enfoque interesante. La persistencia viral se ha asociado con un defecto en el desarrollo de la inmunidad celular anti-HBV. Desde el comienzo de los años 1980, se han desarrollado estrategias de vacunas dirigidas a ampliar y potenciar la débil respuesta de células T de los pacientes de HBC. Estas estrategias inmunoterapéuticas utilizaban inicialmente vacunas comerciales anti- HBV, con el objetivo de inducir respuestas específicas CD4+ y CD8+ contra el VHB, y citoquinas pro-inflamatorias capaces de controlar la replicación viral. Así, casi todas las vacunas preventivas comerciales se probaron solas, o conjuntamente con terapias antivirales convencionales. En los estudios precedentes de vacunación terapéutica, las vacunas se administraron con o sin otros tratamientos antivirales. Además, la inmunoterapia con vacunas comerciales también proponía esquemas con mayor número de inoculaciones y se exploraron rutas parenterales alternativas. Los principales estudios se resumen a continuación.
Un estudio piloto de vacunación en pacientes con HBC empleando Genhevac B® (Aventis Pasteur, Francia, producida en células de mamíferos -CHO) evidenció una reducción en la replicación del VHB, de alrededor del 50% de los portadores crónicos [Pol S, eí al. C R Acad Sci III (1993), 316:688-91 ]. Otro estudio multicéntrico, controlado con placebo, evaluó además de la vacuna Genhevac B®, la vacuna Recombivax® (Merck Sharp Dohme-Chibret, Francia, producida en levadura). En este se observó una diferencia significativa al sexto mes (3%, 20% y 22%) entre los grupos inoculados con placebo, Genhevac® y Recombivax®, respectivamente. Sin embargo, al mes 12 desapareció la diferencia [Pol S, J Hepatol (2001 ); 34:917-21 ]. En conclusión, no fue posible observar un claro beneficio clínico y el antígeno pre-S2 presente en la vacuna Genhevac® no pareció tener ningún efecto adicional.
Otros estudios donde se evaluó la vacuna Genhevac® con fines terapéuticos [Yalcin K, eí al. Infection (2003), 31 : 221 -225; Dikici B, et al. J Gastroenterol Hepatol (2003), 18(2): 218-22] mostraron solo beneficios muy ligeros asociados al tratamiento.
La vacuna Hepagene® (Medeva Ltd., Reino Unido, producida en CHO), incluye las tres variantes del HBsAg (L, S y M), y sus resultados en voluntarios sanos y no respondedores demostraban altos niveles de inmunogenicidad [Page M, eí al. Intervirology (2001 ), 44:88-97; Yap I, et al. Ann Acad Med Singapore (1996), 25: 120-122; Zuckerman JN, et al. BMJ (1997), 314: 329; Jones CD, et al. Vaccine (1999), 17(20-21 ): 2528-37]. Teniendo esto en consideración se llevó a cabo un estudio donde se evaluó su potencial terapéutico. Se administraron 8 dosis de 20 g de la vacuna, en dos ciclos de 4 inoculaciones, separadas entre sí por 5 meses [Carman WF, et al. J Hepatol (2001 ); 34:917-921 ]. Al final del esquema, 8 de los 22 pacientes que completaron el esquema tenían una respuesta de remoción sostenida del VHB, y 7 pacientes eliminaron el HBeAg. Esta prueba limitada no controlada fue seguida por una prueba controlada con un número mayor de pacientes. En este segundo ensayo clínico con 103 pacientes crónicos, HBeAg positivos, se administraron 4 dosis de vacuna o placebo a intervalos de un mes, y 8 meses después todos los sujetos recibieron 8 dosis adicionales a intervalos de un mes. Al final del tratamiento no se obtuvieron beneficios clínicos significativos [Medeva PLC. http://www.investegate.co. uk/article.aspx?id=200001 171532169093D (consultado Oct 20, 2015)].
Con el objetivo de favorecer el desarrollo de una respuesta inmune antiviral, se han utilizado tratamientos que combinan la vacunación terapéutica con las terapias convencionales antivirales. Esta estrategia toma en consideración el hallazgo relacionado con el efecto de la lamivudina, que incrementa la frecuencia de células T-VHB específicas en sangre periférica, como resultado de la inhibición de la replicación viral [Bertoletti A et al. Expert Rev Gastroenterol Hepatol (2009), 3(5): 561 -9].
La estrategia de vacunación antiviral combinada debe favorecer una mayor reactividad de la respuesta de células T para VHB, pero también se puede considerar más segura, ya que debe evitar un gran daño hepático, como consecuencia de la activación del sistema inmune. Sin embargo, no existe ninguna experiencia que demuestre que la activación de la respuesta inmune específica, por la vacuna, en pacientes de HBC provoque hepatitis fulminante.
Un estudio publicado en el año 2002 evaluó la administración intradérmica (ID) de la vacuna Engerix B® (GlaxoSmithKIine) con lamivudina [Dahmen A, et al. J Med Virol 2002; 66:452-60], en pacientes de HBC. Se administraron seis dosis de Engerix B®, una al mes, en combinación con la administración diaria de lamivudina. Un grupo adicional recibió el mismo tratamiento conjuntamente con la administración subcutánea (SC) diaria de interleuquina 2 (IL-2). Una vez que concluyó la terapia, 7 de 9 pacientes del primer grupo, y 2 de 5 pacientes del segundo grupo, habían reducido su carga viral hasta niveles indetectables. Cuatro respondedores eliminaron el virus y normalizaron las transaminasas. En otro estudio clínico, se evaluó la combinación de la vacunación terapéutica por la vía ID, con una vacuna conteniendo HBsAg en alúmina, con la administración diaria de lamivudina por un año [Horiike N, et al. J Clin Virol (2005), 32: 156-161 ]. Estos estudios evidenciaron que la terapia combinada es efectiva y con pocas complicaciones para los pacientes de HBC. Sin embargo, en ambos casos se utilizó la vía ID, aspecto que puede favorecer la inmunogenicidad de la vacuna.
El mismo antígeno de superficie, formulado en un potente adyuvante no fue efectivo en una terapia combinada con lamivudina, lo que sugiere que no se debe ignorar el efecto de la vía de inmunización, y que posiblemente este es un elemento de importancia crucial para el futuro de la vacunación.
El estudio que cerró el largo período de evaluación clínica de candidatos vacunales, para condiciones de supresión de la carga viral, es el informe de Vandepapeliere y colaboradores [Vandepapeliere P, et al. Vaccine (2007) Dec 12; 25(51 ):8585-97]. Este estudio presenta resultados de la evaluación clínica de un candidato vacunal que se basa en una formulación de HBsAg adsorbido, inyectado por vía intramuscular (IM), en dosis de 100 g de HBsAg, conjuntamente con un adyuvante oleoso y con potentes inmunomoduladores, tales como monofosforil lípido A y saponina QS21 . Diez administraciones en condiciones de carga viral reducida, no mostró ventajas con relación a la respuesta virológica, al compararla con el grupo control, que fue tratado solamente con el antiviral.
El conocimiento acumulado sobre las características de la respuesta inmune del hospedero, y el que se tiene producto del uso terapéutico de vacunas convencionales, sugieren que las estrategias dirigidas hacia la inducción de una fuerte y sostenida reactividad de células T contra antígenos del VHB son factibles, y representan una esperanza para el tratamiento satisfactorio de pacientes de HBC. La ausencia de estimulación inmune contra antígenos de la nucleocápsida es, probablemente, un marcador inmunológico principal del fallo de la vacunación terapéutica basada en el HBsAg. De hecho, el objetivo de la vacunación terapéutica en la HBC es desencadenar los mismos mecanismos inmunes naturales que prevalecen durante la hepatitis B aguda que se autocontrola, o en la HBC que cursa con seroconversión. Si una inmunoterapia falla en estimular estas respuestas inmunes, probablemente fallará en inducir la seroconversión.
El mejoramiento de las formulaciones, en términos de selección antigénica y estrategia de vacunación, podría ser una vía para superar las dificultades mencionadas. Las proteínas de la envoltura tienen características que justifican su inclusión en una vacuna terapéutica. En realidad, las proteínas de la envoltura contienen numerosos epítopes de células B y T [Penna A, et al. J Virol (1992), 66(2):1 193-6; Nayersina R, et al. J Immunol (1993), 150:4659-71 ], y se estima que los anticuerpos anti-envoltura juegan un papel crítico en la supresión viral, al remover las partículas virales libres de la circulación y prevenir la reinfección de células susceptibles. Por otra parte, altos niveles de HBsAg circulan en el suero de pacientes de HBC, este hecho podría jugar un rol en el mantenimiento de la tolerancia inmune, por el agotamiento de células T y la supresión de la producción de anticuerpos anti-HBs [Nagaraju K, et al. J Viral Hepat (1997), 4:221 -30].
En esta dirección, se ha sugerido al HBcAg como el principal candidato antigénico a incluir en una vacuna terapéutica para HBC. Durante la hepatitis aguda auto- resolutiva, la respuesta epitópica de células T está fuertemente favorecida, y es predominante durante la seroconversión en la HBC espontánea o inducida por tratamiento [Ferrari C, et al. J Clin Invest (1991 ), 88:214-22; Marinos G, et al. Hepatology (1995), 22:1040-9; Tsai SL, et al. Clin Invest (1992), 89:87-96].
Hasta el presente, ninguna de las vacunas comerciales anti-hepatitis B ha demostrado un nivel suficiente de resultados clínicos que les permita competir con los tratamientos actuales, o que simplemente avalen su introducción en la práctica médica. Sin embargo, estas vacunas han creado grandes expectativas en el campo del tratamiento, no sólo en escenarios de inmunoterapia anti-hepatitis B, sino para otras patologías como la infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y el cáncer, entre otras enfermedades crónicas, transmisibles o no. De este modo, esta estrategia demanda la evaluación clínica de nuevos conceptos vacunales y la optimización de todos los factores relacionados. En este sentido, un candidato de vacuna terapéutica que incluya HBcAg, además de HBsAg, es el resultado del desarrollo de tales estrategias inmunoterapéuticas.
El Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) produce el HBsAg, como proteína recombinante, obtenida en la levadura Pichia pastoris como hospedero. Este antígeno ha sido incluido en la vacuna preventiva Heberbiovac HB® desde principios de los años 90 del siglo pasado [Muzio V, et al. Biotecnología Aplicada (2001 ) 18; 103-104; ul-Haq N, et al. Vaccine (2003) 21 :3179-85].
Adicionalmente, el CIGB desarrolló una formulación donde se amplía la respuesta inmune anti-hepatitis B, dicha formulación comprende como componentes principales al HBsAg y al HBcAg, los antígenos se administran por vía mucosal, para generar respuesta sistémica y mucosal [Patente Europea No. EP 1 136077]. En otro documento de patente del propio centro, se describe la generación de estructuras antigénicas agregadas, que forman partículas. Este documento revela que la agregación, deslipidación u oxidación, así como la selección de partículas de 30-500 nm, y la formulación de estos agregados convenientemente adyuvados favorecen la inmunogenicidad de la preparación antigénica resultante [Patente Europea No. EP 1346727]. Combinando las estrategias planteadas en ambos documentos de patente, el CIGB desarrolló el candidato vacunal terapéutico llamado NASVAC [Lobaina Y, et al. Mol Immunol (2015), 63:320-327], que se administra mediante la combinación de rutas de inmunización. Los resultados clínicos de la formulación vacunal son muy atractivos; sin embargo, la efectividad del producto debe incrementarse con el uso de inmunógenos más potentes.
Las estrategias vacunales que incluyen los principales antígenos del VHB, tales como el HBsAg y el HBcAg, han dado lugar a formulaciones con cierta efectividad antiviral. Sin embargo, se requiere su mejora para incrementar el número de pacientes con respuesta antiviral sostenida, así como el número de pacientes que alcanzan la seroconversión de HBsAg a anti- HBsAg.
Explicación de la invención
La invención contribuye a resolver el problema antes mencionado, al proveer una composición farmacéutica que se caracteriza porque comprende: 1 ) el antígeno HBcAg que comprende ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45% del total de ácido ribonucleico (ARN) de dicho antígeno y 2) el antígeno HBsAg del VHB. En una realización de la invención, la composición farmacéutica contiene HBsAg que comprende fosfatidilserina, en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos que posee dicho antígeno.
La inclusión de los antígenos HBsAg y HBcAg, modificados en su constitución química de esa manera particular, favorece las propiedades inmunologicas y antivirales de esa composición para la inmunoterapia. Sin embargo, las modificaciones mencionadas no afectan la composición proteica de los antígenos HBsAg y HBcAg de la invención, ya que su estructura primaria, secundaria y terciaria se mantiene idéntica, en comparación con sus variantes sin modificar. No obstante, dichas modificaciones conducen a características inesperadas de dichos antígenos, que resultan en más potentes inmunógenos. De igual modo, la combinación de dichos antígenos modificados condujo a una formulación con superior efectividad antiviral y terapéutica para el tratamiento de la HBC.
En la invención se obtuvo el HBcAg con un nivel de ARNm que sobrepasa el 45%. En un caso particular, este antígeno modificado se obtuvo debido a la combinación de cambios en parámetros del proceso de fermentación del mismo. En ese caso, el uso de un medio químicamente definido y la baja tasa de crecimiento específico, dio lugar a la obtención de una variante del HBcAg donde aumentó la proporción de ARNm en comparación con el resto de los ARN presentes en el mismo.
Aunque se ha descrito previamente la alta inmunogenicidad del HBcAg obtenido en Escheríchia coli, y la participación de un componente de ácidos nucleicos en la inmunogenicidad de los antígenos particulados completos (de 183 aminoácidos), hasta la presente invención no se conocía el efecto relativo de cada variante de ARN, en cuanto a la contribución específica a la inmunogenicidad final del HBcAg. Fue sorprendente encontrar que el HBcAg con un nivel de ARNm que sobrepasa el 45% fue más inmunogénico, y desarrolló una respuesta Th1 más fuerte al compararlo con el HBcAg sin modificar.
Los cambios en la proporción de ARNm detectado no afectaron el contenido de ARN total presente en la partícula, con respecto al contenido de proteínas. Inesperadamente, se encontró que el HBcAg que contenía un nivel de ARNm que sobrepasa el 45%, dentro del ARN total, tuvo una inmunogenicidad mayor con relación al HBcAg obtenido sin modificación en su contenido de ARNm. Dicho incremento en la inmunogenicidad comprendió un aumento significativo en las citoquinas Th1 , y una superior capacidad para eliminar el HBsAg circulante después de inmunizar ratones transgénicos y pacientes de HBC.
Por otro lado, en la presente invención se evaluó el HBsAg que contiene fosfatidilserina en un porcentaje superior al 5% del total de fosfolípidos que están presentes en este antígeno lipoproteico. En particular, el incremento en la proporción de fosfatidilserina, por encima del 5% del total de fosfolípidos se demostró tras la variación de parámetros como el aumento de las concentraciones de calcio y magnesio en el medio de fermentación, la baja tasa de crecimiento específico y el bajo pH. Sin embargo, la invención no se restringe al HBsAg obtenido en esas condiciones. El incremento en la proporción de fosfatidilserina por encima del 5% se correlacionó con el aumento de la inmunogenicidad del antígeno resultante, al comparársele con el HBsAg con menor contenido de dicho fosfolípido. También se observó un incremento significativo de citoquinas Th1 , y mayor capacidad de eliminar al HBsAg circulante después de la inmunización de ratones transgénicos al HBsAg y de pacientes de HBC con el HBsAg conteniendo por encima del 5% de fosfatidilserina, en lo que se refiere al % de fosfolípidos totales. En la presente invención, los antígenos HBsAg y HBcAg modificados de modo particular se han seleccionado sobre la base de la superior intensidad de las respuestas inmune y antiviral, en comparación con formulaciones en las que se emplearon los antígenos sin modificar. Además, la formulación que contenía los dos antígenos fue capaz de producir seroconversión de HBsAg hacia anti-HBsAg en un mayor número de individuos, si se les compara con los antígenos administrados por separado, lo que demuestra la importancia y funcionalidad de las modificaciones detectadas en los antígenos que forman parte de la composición objeto de la presente invención, así como la superioridad de las formulaciones combinadas, en comparación con los antígenos individuales.
La presente invención representa una solución novedosa al problema que prevalece en el estado del arte, sobre la necesidad de nuevas formulaciones que permitan la potenciación de la respuesta inmune anti-HBsAg y anti-HBcAg, para lograr tratamientos antivirales más efectivos para el control de la infección crónica por VHB. La materia a la que se refiere la presente invención no puede considerarse como obvia, o derivada del estado del arte por personas versadas, ya que es el resultado de la identificación de características nuevas en los antígenos descritos. Aunque tales antígenos modificados mantienen intacta su composición proteica, son diferentes en cuanto a la composición química de otras moléculas asociadas a ellos. A los efectos de la invención se considera HBcAg modificado a aquella preparación de HBcAg que comprende ARNm en una proporción superior al 45% del total de ARN de dicho antígeno. Paralelamente, se considera HBsAg modificado a aquella preparación de HBsAg que comprende fosfatidilserina en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos de dicho antígeno. En una realización de la invención, la composición que comprende el antígeno HBcAg que comprende ARNm en una proporción superior al 45% del total de ARN de dicho antígeno y el antígeno HBsAg del VHB se caracteriza porque se formula para la administración por las rutas parenteral y mucosal. Para administrar la composición de la invención por la ruta mucosal, y en particular por la ruta nasal, se pueden emplear aditamentos que se han desarrollado y/o se comercializan para la administración de formulaciones farmacéuticas por esa ruta.
En una realización particular, dicha composición se caracteriza porque comprende adicionalmente un adyuvante vacunal. Dentro de los adyuvantes vacunales que pueden estar presente en la composición de la invención se encuentran, por ejemplo, aquellos que son bien conocidos por los versados en esta rama de la técnica, como las sales de aluminio, las emulsiones de agua en aceite desarrolladas para su uso en humanos, estimuladores del sistema inmune, etc.
En otro aspecto, la invención provee el uso del antígeno HBcAg que comprende ARNm en una proporción superior al 45% del total de ARN de dicho antígeno y el antígeno HBsAg en la manufactura de un medicamento para la inmunoprofilaxis o la inmunoterapia contra la infección por VHB. En una realización de la invención, el HBsAg que forma parte de dicho medicamento comprende fosfatidilserina en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos de dicho antígeno. En una realización particular, dicho medicamento es formulado para administración por las vías parenteral y mucosal. En una realización preferida, el medicamento que comprende HBcAg que comprende ARNm en una proporción superior al 45% del total de ARN de dicho antígeno y el antígeno HBsAg se emplea en el tratamiento de pacientes de HBC o de pacientes con coinfecciones donde uno de los virus infectantes es el VHB. Adicionalmente, al tratar a los pacientes de HBC con dicho medicamento, el mismo se emplea en la prevención del cáncer hepatocelular derivado de la infección por VHB.
Cuando el medicamento que comprende HBcAg que comprende ARNm en una proporción superior al 45% del total de ARN de dicho antígeno y el antígeno HBsAg se emplea en el tratamiento de los pacientes de HBC mediante la inmunoterapia, esta se pude realizar de una forma activa (mediante la inmunización de los pacientes con dicho medicamento) o de forma pasiva, mediante la estimulación celular. Debido a sus componentes, la formulación farmacéutica de la invención se puede emplear en la estimulación de células autólogas o heterólogas. De esa forma, la invención se constituye en un método de estimulación celular con dicha formulación, y la posterior inmunización pasiva de pacientes con HBC, basado en la máxima estimulación, in vivo o in vitro, de células autólogas o heterólogas, que incluyen células dendríticas, células B y macrófagos.
En otro aspecto, la presente invención revela un método para la inmunoprofilaxis o la inmunoterapia contra la infección por VHB que se caracteriza porque se administra a un individuo que lo necesita una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende el antígeno HBcAg, que comprende ARNm en una proporción superior al 45% del total de ARN de dicho antígeno, y el antígeno HBsAg del VHB. En una realización de la invención, el HBsAg comprende fosfatidilserina en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos de dicho antígeno. En una materialización de la invención, dicha composición farmacéutica se administra por ruta parenteral y mucosal. En una realización preferida, el individuo que recibe la inmunoterapia es un paciente de HBC. En ese caso, la aplicación del método de la invención a la inmunoterapia de los pacientes de HBC redunda en la prevención del cáncer hepatocelular derivado de la infección por VHB.
Es también objeto de la presente invención, el uso del antígeno del HBcAg que comprende ARNm en una proporción superior al 45% del total de ARN de dicho antígeno y el antígeno HBsAg para incrementar la respuesta inmune contra un antígeno adicional que se co-administra con la mezcla de dichos antígenos. En una realización de la invención, el HBsAg que forma parte de la mezcla de antígenos comprende fosfatidilserina en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos de dicho antígeno.
La mezcla de antígenos referidos se puede emplear en la potenciación de la respuesta inmune contra la HBC (en un escenario terapéutico) o en estrategias de vacunación preventiva, donde la vacuna sea multivalente. Esto se debe a que, en adición al incremento de inmunogenicidad de los antígenos HBsAg y HBcAg modificados de forma particular, fue posible verificar que los mismos son capaces de inducir un efecto potenciador de la inmunogenicidad de antígenos heterólogos. Los resultados de las evaluaciones experimentales demostraron que estos antígenos presentes en formulaciones multivalentes pueden ser útiles para uso profiláctico o terapéutico.
Aunque en materia de formulaciones en la presente invención se puede evitar el uso de adyuvantes, estabilizadores, preservantes u otros aditivos, ello no limita la introducción de aditivos, excipientes, diluentes que no reduzcan la inmunogenicidad de la formulación o del producto final resultante, o la eficacia antiviral de la formulación administrada.
Con la composición farmacéutica y con el método para la inmunoprofilaxis o la inmunoterapia de la invención se logra una respuesta antiviral sostenida, y se incrementa el número de pacientes que alcanzan la seroconversión de HBsAg a anti-HBsAg, respecto a las composiciones y métodos que son conocidos en esta rama de la técnica. Breve descripción de las figuras
Figura 1. Respuesta de anticuerpos IgG anti-HBcAg luego de administradas dos dosis.
Figura 2. Anticuerpos IgG anti-CR3.
Figura 3. Respuesta proliferativa de células T CD8+ CR3 (VIH-l )-específica.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización
Ejemplo 1. Obtención de la proteína HBcAg con diversas proporciones de las variantes del ARN
El HBcAg se obtuvo a partir de una cepa de E. coli transformada genéticamente con un plasmidio que porta el gen que codifica para dicho antígeno [Aguilar JC, et al. Immunol Cell Biol (2004) 82:539-46].
Al caracterizar las partículas de HBcAg, producto del proceso fermentativo realizado durante diferentes períodos de tiempo, se observó un incremento en la proporción de ARNm incorporado en las preparaciones de HBcAg producido con períodos de fermentación más prolongados. A las 20 horas de fermentación, los niveles de ARNm en el antígeno incrementaron más de 20%, en comparación con el HBcAg obtenido en procesos de hasta 14 horas, como se observa en la Tabla 1 . No se detectaron cambios significativos en el total de ARN en la partícula, ya que no se encontraron diferencias significativas en los niveles de ARN total, ni en la relación contenido de ARN/contenido de proteínas. Sin embargo, hubo incremento significativo en el nivel de ARNm cuando se comparó con otras variantes, específicamente el ARN ribosomal (ARNr), que redujo su presencia proporcionalmente con el incremento del ARNm. No se encontraron otros cambios relevantes en los componentes menores asociados al HBcAg o en contaminantes específicos, al realizarse ensayos por espectrometría de masa, u otros estudios químicos y físicos.
Tabla 1. Variación del porcentaje relativo de los tipos principales de ARN en el HBcAg según la duración del proceso de fermentación.
Figure imgf000014_0001
Los resultados representan los valores promedios de cinco determinaciones. En la columna "Variante" se indica entre paréntesis el tiempo de duración de la fermentación. ARNt: ARN de transferencia, ARNr: ARN ribosomal y ARNm: ARN mensajero. (*): Diferencias significativas {p<0.05).
Evaluación en ratones Balb/c de la inmunogenicidad de variantes de HBcAg con diferentes porcientos de ARNm incorporado
Una vez obtenidas distintas variantes de HBcAg con diferentes porcientos de ARNm incorporado en el interior de la partícula (Tabla 1 ), se procedió a la evaluación inmunológica de estas preparaciones en ratones Balb/c. Para este estudio se emplearon ratones hembras, de entre 8 y 12 semanas de vida, que recibieron dos inmunizaciones, los días 0 y 15, por la vía SC, con una dosis de ^g de HBcAg en salina tamponada con fosfato (PBS), administrándose un volumen final de 100 μΙ_. La descripción detallada del esquema se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Diseño del esquema de inmunización para evaluar la influencia del porciento de ARNm incorporado en la partícula de HBcAg en la inmunogenicidad de este antígeno.
Grupo Tratamiento No. de
animales
1 1 ug HBcAg (23% ARNm) 10
2 1 ug HBcAg (39% ARNm) 10
3 1 ug HBcAg (45% ARNm) 10 4 1 ug HBcAg (60% ARNm) 10
5 1 ug HBcAg (65% ARNm) 10
6 1 ug HBcAg (67% ARNm) 10
7 PBS 1X 10
La extracción de sangre para la evaluación de la respuesta de anticuerpos específicos, generados producto de la inmunización, se realizó 10 días después de administrada la segunda dosis. La medición de la respuesta de anticuerpos anti- HBcAg se llevó a cabo mediante la técnica de ELISA.
Como se observa en la Figura 1 , que muestra los títulos de anticuerpos IgG anti- HBcAg obtenidos para cada grupo del estudio, la respuesta de IgG anti-HBcAg generada resultó significativamente superior para los grupos que recibieron el HBcAg con ARNm incorporado por encima del 45% (grupos del 3 al 6 de la Tabla 2). Entre los grupos 3, 4, 5 y 6, no se detectaron diferencias significativas, aunque se observa una leve tendencia de aumento de la respuesta de IgG asociada al aumento del porciento de ARNm incorporado. Los resultados indican que el aumento en la proporción de ARNm incorporado en el interior de la partícula de HBcAg, a niveles por encima del 45% con respecto al ARN total incorporado, confiere una mayor inmunogenicidad humoral a esta proteína. Análisis preliminares del patrón de subclases de IgG sugieren un comportamiento similar a nivel de la respuesta inmune de tipo celular.
Ejemplo 2. Obtención de partículas semejantes a virus (PSV) de HBsAg con diferentes proporciones de fosfatidilserina
El HBsAg recombinante se obtuvo a partir de una cepa de P. pastoris transformada genéticamente con el gen que codifica dicho antígeno [Patente Europea No. EP 480525]. Se conoce que el HBsAg expresado en esta especie de levadura, contiene fosfatidilserina dentro de sus lípidos estructurales [Lobaina Y, et al. Biotecnología Aplicada (2008), 25:325-331 ]. Sin embargo, hasta la presente invención, no se había estudiado la influencia de la presencia de este lípido en la inmunogenicidad de dicho antígeno.
Con vistas a estudiar cómo influye la proporción de fosfatidilserina en la inmunogenicidad del HBsAg, se obtuvieron preparaciones de dicha PSV en diferentes condiciones de fermentación. Durante el cultivo en fermentadores de la levadura recombinante, se incrementó la concentración de Mg( ' en el medio de cultivo, a porcentajes entre el 1 .0 y 2.0%, lo que condujo al incremento de dicho fosfolípido asociado a las PSV de HBsAg. Este se detectó empleando cromatografía de capa fina, durante la caracterización del HBsAg obtenido en las diferentes condiciones de crecimiento.
La fosfatidilserina se asoció a las PSV del HBsAg, de reconocida naturaleza lipídica. Los resultados recogidos en la Tabla 3 representan los valores promedios de cinco repeticiones diferentes. La purificación fue similar para todas las preparaciones de HBsAg producidas bajo diferentes condiciones experimentales. Como se observa en la tabla, no hubo detección de fosfatidilserina en las muestras obtenidas cuando la fermentación se realizó con un medio de cultivo que contenía una concentración de Mg(2+) por debajo de 1 .2%. Los niveles de fosfatidilserina encontrados en la preparación obtenida con medio de cultivo que contenía 2.0% de Mg(2+) fueron significativamente superiores a los hallados en la preparación obtenida con medio de cultivo que contenía 1 .4 % de Mg(2+) (Variante C).
Tabla 3. Obtención de variantes del HBsAg con crecientes cantidades de fosfatidilserina.
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ND: No detectado. Mg( ' (%): concentración del ion Mg (en porciento) presente en los aditivos salinos del medio de cultivo. FS (%): porcentaje de fosfatidilserina dentro de los fosfolípidos totales, determinado después de la extracción del HBsAg purificado. (*): Diferencias significativas {p<0.05), (**) Diferencias muy significativas {p<0.01).
Las preparaciones del HBsAg representadas en la Tabla 3 fueron idénticas en su composición proteica, de acuerdo con la caracterización realizada para estudiar su estructura primaria, secundaria y terciaria, comparables con su variante original. Es importante destacar que la relación concentración lipídica / concentración proteínica no cambió, para ninguna de las variables bajo estudio. Igual hallazgo tuvo lugar con la proporción de fosfolípidos totales vs contenido total de proteínas. No hubo otro cambio significativo durante el análisis de las impurezas del HBsAg o de otros compuestos menores, como resultado del análisis de su composición por espectrometría de masas.
Ejemplo 3. Evaluación inmunológica de preparaciones de HBsAg que poseen diferentes porcientos de fosfatidilserina
Con el objetivo de evaluar si la presencia de fosfatidilserina influye en la respuesta inmune contra el HBsAg, se realizó un estudio de inmunogenicidad en ratones transgénicos que expresan al HBsAg en suero [Castro FO, et al. Interferon y Biotecnología (1989) 6:251 -257; Pérez A, et al. Acta Biotechnol (1993) 13: 373- 383]. Se emplearon 7 grupos de 6 ratones cada uno. Se usaron ratones hembras, de entre 8-12 semanas de vida, que se inmunizaron por la vía intranasal (IN). Los seis primeros grupos del estudio recibieron cada uno 5 μg de las diferentes variantes de HBsAg descritas en la Tabla 3 con adyuvante de Freund. El séptimo grupo se empleó como grupo control, y recibió PBS 1 X. Todos los grupos de tratamiento recibieron 10 dosis de inmunógeno, que se administraron cada 14 días. Las extracciones de sangre se llevaron a cabo antes de la inmunización inicial y 10 días después de cada dosis, a partir de la tercera dosis administrada. En la Tabla 4 se muestran los niveles de HBsAg en el suero de los ratones transgénicos, así como los niveles de citocinas (IFN gamma (IFN-γ), factor de necrosis tumoral (TNF-α), e IL-2 inducidas en sobrenadantes de cultivo de esplenocitos, aislados luego de administradas las 10 dosis. Las evaluaciones se realizaron mediante la técnica de ELISA.
Tras la administración de 5 μg de HBsAg, por ruta IN, en 10 inmunizaciones sucesivas, se redujo significativamente la concentración de HBsAg en la sangre de los ratones transgénicos para el HBsAg, cuando el nivel de fosfatidilserina en dicho HBsAg fue de 5% o más (variantes D, E y F de la Tabla 3, Ejemplo 2). De igual modo, variantes de HBsAg de 5% o más de fosfatidilserina indujeron niveles significativamente superiores de IFN-γ, TNF-α e IL-2, comparado con las variantes con niveles bajos (variante C) o no detectables de fosfatidilserina, lo que sugiere un efecto dosis dependiente. Todo esto se aprecia en la Tabla 4. En comparación con el HBsAg que no contiene fosfatidilserina, se produjo un incremento significativo de citoquinas Th1 y se encontró una mayor capacidad de eliminación del HBsAg circulante, después de la inmunización de ratones HBsAg transgénicos con variantes de HBsAg que contienen niveles superiores al 5% de fosfatidilserina (Tabla 4, variantes D a F). Los niveles de citoquinas que se encuentran para las variantes D - F fueron significativamente superiores a los de las condiciones A - C. Las variantes D - F indujeron las más fuertes reducciones en la concentración de HBsAg, así como las más potentes secreciones de citoquinas, después de estimulación in vitro de células del bazo de los animales transgénicos inmunizados.
Tabla 4. Evaluación del HBsAg circulante y de los niveles de citoquinas después de la inmunización de ratones transgénicos con variantes de HBsAg con diferente porciento de fosfatidilserina.
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A - F: Variantes de HBsAg producidas con niveles crecientes de fosfatidilserina en su composición, mostradas en la Tabla 3. (*): Diferencias significativas {p<0.05), ** Diferencias muy significativas {p<0.01).
Como se aprecia, hubo un incremento significativo de citoquinas Th1 , y una mayor capacidad de eliminación del HBsAg circulante, por inmunización de los ratones transgénicos al HBsAg con las variantes de HBsAg con mayor contenido de fosfatidilserina, lo que demuestra un incremento de la inmunogenicidad del antígeno con el aumento la proporción de este componente lipídico dentro de los lípidos asociados a las PSV formadas por este antígeno.
La inserción de fosfatidilserina en las partículas de HBsAg había sido informada previamente en el estado del arte. Sin embargo, no se había estudiado como la proporción de este componente influía en la inmunogenicidad de dichas partículas. Aunque en el 2008 Lobaina y colaboradores habían especulado sobre el papel que podría tener la fosfatidilserina en la superior inmunogenicidad del HBsAg producido en P. pastoris [Lobaina Y, et al. Biotecnología Aplicada (2008), 25:325-331 ], en el propio reporte se demostró que dos vacunas basadas en HBsAg producido en el mismo hospedero mostraron diferencias en términos de inmunogenicidad, a pesar de contar presumiblemente con los mismos niveles de fosfatidilserina, debido a la especie de levadura en la que se produjeron. Ejemplo 4. Demostración del incremento de la inmunogenicidad en pacientes de HBC de variantes de HBcAg con mayor proporción de ARNm encapsidado
En el Ejemplo 1 se evidenció en ratones un aumento de la inmunogenicidad del HBcAg con el incremento de la proporción de ARNm dentro del ARN encapsulado total. Teniendo en cuenta esos resultados, se caracterizó el comportamiento inmunológico y de respuesta antiviral in vivo de formulaciones que incluyen tanto al HBcAg como al HBsAg, con modificaciones en su contenido de ARNm y de fosfatidilserina, respectivamente.
Para ello, se llevó a cabo un estudio clínico fase II aleatorizado y a doble ciegas, en pacientes enfermos crónicos de hepatitis B. Se seleccionaron los pacientes que tuvieran la carga viral por encima de 10 000 copias/mL y el HBeAg positivo al inicio del estudio. Los pacientes se distribuyeron en 6 grupos, de 15 pacientes cada uno, a los que se administraron los tratamientos descritos en la Tabla 5. Se administraron un total de 10 dosis, divididas en dos ciclos de 5 dosis cada uno, separados por un mes de descanso. Las 5 primeras dosis se administraron solamente por la vía IN, y las 5 restantes mediante coadministración simultánea IN/SC. En ambos ciclos de administraciones las dosis se pusieron a intervalos de 14 días.
Tabla 5. Grupos de tratamiento en el estudio clínico fase II donde se evaluaron los antígenos HBcAg y HBsAg con modificaciones en su contenido de ARNm y de fosfatidilserina, respectivamente.
Grupos Tratamiento
1 50 μg m HBsAg + 50 μg m HBcAg
2 100 μg m HBsAg + 100 μg m HBcAg 3 1000 μg mHBsAg + 1000 μg mHBcAg
4 50 μg HBsAg + 50 μg HBcAg
5 100 μg HBsAg + 100 μg HBcAg
6 1000 μg HBsAg + 1000 μg HBcAg
mHBcAg: HBcAg que contiene ARNm en una proporción de 50% del total de ARN de dicho antígeno; mHBsAg: HBsAg que contiene 7% de fosfatidilserina dentro de los componentes lipidíeos de las PSV. Sorprendentemente, se encontraron niveles significativamente superiores de seroconversion al HBeAg y al HBsAg en el grupo de pacientes tratados con la formulación que contenía ambos antígenos modificados (o sea la formulación que contenía HBsAg con niveles de fosfatidilserina superiores al 5%, y HBcAg con ARNm por encima del 45%), cuando se les compara con los grupos de pacientes tratados con formulaciones sin estas características (ver Tabla 6). Esto demuestra la relevancia de tales modificaciones en el aumento de la calidad de la respuesta antiviral que se generó en los pacientes.
En humanos, los antígenos se evaluaron en el rango de concentraciones desde
50 μg por antígeno por dosis hasta 1 000 μg por antígeno por dosis, con evidencias de respuestas antivirales, en términos de seroconversion al HBsAg y HBeAg, control virológico y respuesta virológica sostenida por debajo de 1 0 000 copias de ADN del
VHB por mL, a más de 1 año después del fin del tratamiento.
Tabla 6. Frecuencia de pacientes con seroconversion al HBeAg y al HBsAg al año de terminado el tratamiento en el estudio clínico fase II con HBcAg y HBsAg que poseen modificaciones en su contenido de ARNm y de fosfatidilserina, respectivamente.
Grupos de tratamiento Seroconversion al HBeAg Seroconversion al HBsAg
1 6/15 2/15
2 7/15 3/15
3 12/15 6/15
4 3/15 0/15
5 3/15 0/15
6 4/15 0/15 Resultados similares se encontraron también en el modelo de ratones transgénicos al HBsAg, donde se llevó a cabo un ensayo evaluando grupos de tratamiento similares a los descritos en la Tabla 5, y se obtuvo mayor disminución del HBsAg circulante, y títulos de anticuerpos anti-HBsAg superiores, y de más temprana aparición, para los grupos que recibieron las formulaciones que contenían los antígenos con las modificaciones antes descritas.
De modo interesante, las formulaciones que contenían las variantes de HBcAg y HBsAg modificados desarrollaron una inmunogenicidad Th1 más potente en ratones transgénicos para VHB y en pacientes, en comparación con la respuesta obtenida con las formulaciones que contenían los antígenos sin modificar, o las formulaciones que contenían solamente uno de estos antígenos modificados.
Ejemplo 5. Efecto adyuvante de los antígenos HBcAg y HBsAg que poseen modificaciones en su contenido de ARNm y de fosfatidilserina, respectivamente, en formulaciones multivalentes
En este estudio se comparó la capacidad adyuvante, o sea el incremento de la respuesta inmune hacia antígenos co-administrados, de la mezcla de las proteínas recombinantes HBcAg y HBcAg que poseen modificaciones en su contenido de ARNm y de fosfatidilserina, respectivamente, con la de la mezcla de HBcAg y HBsAg sin modificar, por las vías parenteral y mucosal. Para este propósito, se seleccionó la proteína quimérica recombinante CR3, que es un antígeno multiepitopico del VIH-1 [Iglesias E et al. J Biochem Mol Biol & Biophys (2001 ) 1 :109-122]. Ocho grupos de ocho ratones hembra Balb/c (H-2d), de 6-8 semanas de edad, se inocularon con: 1 ) PBS (Placebo) mediante inmunización SC (a la que en lo sucesivo nos referiremos como Placebo (SC); 2) Buffer acetato de sodio (NaAc), pH = 5.2, mediante inmunización IN (Placebo (IN)); 3) la mezcla de HBcAg (C) y HBsAg (S) por la vía SC (C+S (SC)); 4) la mezcla de HBcAg que contiene ARNm en una proporción de 50% del total de ARN de dicho antígeno (mC) y HBsAg que contiene 7% de fosfatidilserina dentro de sus componentes lipidíeos (mS) por vía SC (mC+mS (SC)); 5) C+S por vía IN (C+S (IN)); 6) mC+mS por vía IN (mC+mS (IN)); 7) mezcla de CR3 con HBcAg (C) y HBsAg (S) por la vía SC (CR3+C+S (SC)); 8) CR3+mC+mS (SC); 9) CR3+C+S (IN) y 10) CR3+mC+mS (IN). La dosis utilizada fue de 5 μg de cada antígeno por cada vía, y los inmunógenos se administraron en los días 0, 7 y 21 del esquema de inmunización. Para la inmunización SC, las proteínas se disolvieron en PBS y se adsorbieron en 1 .4 mg/mL de hidróxido de aluminio (Superfos Biosector A/S, Vedbaek, Dinamarca). Para la vía IN, las proteínas se disolvieron en NaAc, pH = 5.2. Los animales fueron anestesiados por administración intraperitoneal (IP) de 30 μΙ_ de ketamina (10 mg/mL), situados en decúbito supino, y los inmunogenos se dispensaron lentamente en 50 μΐ (25 μΐ /por fosa nasal) con una punta de pipeta. Diez días después de las inmunizaciones, se recolectaron los sueros de todos los animales, y cinco animales se sacrificaron (de forma aleatoria) al final del estudio, para obtener sus bazos para los estudios de respuesta inmune celular.
La respuesta de IgG en suero se evaluó mediante un ELISA indirecto donde las placas se recubrieron con la proteína CR3. La metodología para la cuantificación de la secreción de IFN-γ en los sobrenadantes de cultivos estimulados con CR3 ha sido informada previamente [García Diaz D et al. Immunol Lett (2013) 149:77-84].
Para el análisis estadístico se evaluó la distribución Gaussiana de los datos con la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la igualdad de varianza con la prueba de Bartlett. Las muestras con distribución normal (o en las que se infiere por la distribución Gaussiana) y con igualdad de varianza se compararon con pruebas paramétricas. De otro modo, se seleccionó una prueba no paramétrica alternativa. Todos los títulos de IgG se transformaron a log 10, para lograr una distribución normal de los valores. A los sueros de los animales que no alcanzaron la seroconversion se les asignó un título arbitrario de 1 :10, para el procesamiento estadístico. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p <0.05.
Los resultados de la determinación de anticuerpos IgG anti-CR3 (VIH-1 ), que se aprecian en la Figura 2, evidenciaron una respuesta superior {p<0.05) después de administraciones por vía SC e IN en los grupos de animales inmunizados con la mezcla de CR3+mC+mS (grupos 8 y 10) vs CR3+C+S (grupos 7 y 9), respectivamente. En consonancia con los resultados anteriores, también se observó mayor secreción de IFN-γ en los sobrenadantes de los cultivos provenientes de ratones de los mismos grupos, tal como se observa en la Tabla 7. Para este análisis, diez días después de la última inmunización (día 31 ), se cultivaron esplenocitos de cinco ratones por grupo. Para el grupo placebo se prepararon suspensiones de esplenocitos de animales individuales. Se estimularon ex vivo con 2.5 μg/mL de la proteína CR3, durante cinco días. En los líquidos sobrenadantes se cuantifico el IFN-γ CR3-específico con un ELISA tipo "sandwich". El límite de detección fue 0.80 ng/mL.
Tabla 7. Secreción de IFN-γ medido en el líquido sobrenadante de cultivos.
Réplica
Grupo Inoculo
(ratón) IFN-γ (ng/mL)
1 Placebo (SC) Pool < 0.80
2 Placebo (IN) Pool < 0.80
1 < 0.80
2 < 0.80
3 C+S (SC) 3 < 0.80
4 < 0.80
5 < 0.80
1 < 0.80
2 < 0.80
4 mC+mS (SC) 3 < 0.80
4 < 0.80
5 < 0.80
1 < 0.80
2 < 0.80
5 C+S (IN) 3 < 0.80
4 < 0.80
5 < 0.80
1 < 0.80
2 < 0.80
6 mC+mS (IN) 3 < 0.80
4 < 0.80
5 < 0.80
1 6.35
2 7.86
7 CR3+C+S(SC) 3 3.32
4 4.45
5 3.54
1 10.35
2 9.86
8 CR3+mC+mS (SC) 3 8.62
9.05
1 1.24 1 < 0.80
2 2.03
9 CR3+C+S(IN) 3 1 .68
4 0.97
5 2.25
1 4.55
2 5.36
10 CR3+mC+mS (IN) 3 3.87
4 2.54
5 3.98
Finalmente, se comparó la frecuencia de células CD8+ específicas para CR3 (VIH- 1 ) después de estimulación ex vivo en los grupos inmunizados por la vía SC. Se obtuvo una mayor frecuencia de células CD8+ en el grupo estimulado en CR3+mC+mS (SC) vs CR3+C+S (SC) {p<0.05), lo que se observa en la Figura 3. Estos resultados, en conjunto, evidenciaron que la mezcla del HBcAg que posee ARNm por encima del 45% (mC) y del HBsAg con niveles de fosfatidilserina superiores al 5% (mS) tiene un efecto adyuvante Th1 superior, por las vías parenteral y mucosal. En particular, para la vacunación contra el VIH este resultado es de la mayor importancia, porque la respuesta antiviral Th1 se ha relacionado con la protección contra la infección y la progresión a SIDA.
Aunque no fue objetivo de este experimento medir la respuesta humoral contra los antígenos HBsAg y HBcAg (abreviado en este ejemplo como C y S), se observaron respuestas de IgG anti-HBcAg y anti-HBsAg superiores, con significación estadística, en los grupos de ratones inmunizados con la mezcla de los antígenos HBsAg y HBcAg modificados (mC+mS), al compararlos con la mezcla de HBsAg y HBcAg sin modificar (C+S, datos no presentados). Esto corroboró los resultados obtenidos previamente.
Ejemplo 6. Inmunización pasiva mediante la transferencia adoptiva de células de ratones Balb/c inmunizados con formulaciones de los antígenos HBcAg y HBsAg con modificaciones en su contenido de ARNm y de fosfatidilserina, respectivamente, a ratones Balb/c transgénicos que expresan el HBsAg
En la presente invención se desea potenciar la respuesta inmune anti-HBsAg y anti- HBcAg en donantes, a partir de la inmunización activa de los individuos con una formulación que contiene a los antígenos HBsAg y al HBcAg, que comprenden modificaciones en su contenido de fosfatidilserina y de ARNm, respectivamente y, adicionalmente, se activarían in vitro las células a transferir, previo a la transferencia, de modo que la respuesta contra estos antígenos sea máxima cuando se inoculan las células en el organismo receptor. De este modo, se obtiene de modo artificial un tipo de respuesta inexistente en personas, permitiendo ampliar el margen de donantes a personas con haplotipos similares, independientemente de si han sido infectados o no por el VHB.
En el presente ejemplo se evalúa, mediante la transferencia adoptiva de células, el efecto de la respuesta inmune generada por la vacunación con una formulación compuesta por los antígenos HBsAg y HBcAg con modificaciones en su contenido de fosfatidilserina y de ARNm, respectivamente, que se aplica por las rutas IN/parenteral, en el contexto de un ratón transgénico que expresa el HBsAg, modelo de la infección persistente con el VHB. Uno de los objetivos del estudio fue la evaluación del efecto de la respuesta inmune transferida sobre la concentración de HBsAg (antigenemia) en el suero del ratón transgénico. Además, se comparó el efecto de la respuesta inducida por la combinación de rutas IN/parenteral para la administración de la formulación de los antígenos HBsAg y HBcAg, con respecto al efecto generado por la transferencia de células estimuladas solamente con el HBsAg in vivo e in vitro. Adicionalmente, se estudió la cinética de la respuesta de anticuerpos anti-HBsAg transferida en el contexto del ratón transgénico para este antígeno. Se emplearon ratones Balb/c y ratones transgénicos HBsAg (+) (fondo genético Balb/c, obtenidos en el CIGB).
Generación de inmunidad anti- HBsAg en ratones Balb/c
Se llevó a cabo un esquema de inmunización en ratones Balb/c, hembras, de 8 a 12 semanas de vida. Los ratones se inmunizaron con un preparado vacunal que contiene a los antígenos modificados HBsAg (con contenido de fosfatidilserina superior al 5%) y HBcAg (con contenido de ARNm superior al 45%), simultáneamente por las vías IN y parenteral. Dentro de la vía parenteral, en este caso se ensayaron las rutas IM, SC e ID. Las dosis (en volumen de 100 μΐ) se administraron los días 0 y 14, y se administró una dosis de refuerzo el día 100, previo a la transferencia. Las extracciones de sangre se realizaron por el plexo retrorbital los días -2, 10 y 25. En la Tabla 8 se refleja el diseño del esquema de inmunización, incluyendo el tratamiento recibido por cada grupo. Tabla 8. Esquema de inmunización en ratones Balb/c no transgénicos.
Figure imgf000026_0001
mHBcAg: HBcAg que contiene ARNm en una proporción de 50% del total de ARN de dicho antígeno; mHBsAg: HBsAg que contiene 7% de fosfatidilserina dentro de los componentes lipidíeos de las PSV.
La evaluación de la respuesta inmune humoral generada por estos tratamientos se llevó a cabo midiendo la respuesta de IgG y las subclases de IgG anti-HBsAg, después de cada inoculación, empleando la técnica de ELISA. Con el objetivo de evaluar la respuesta inmune celular, a los 10 días de la primera administración se realizó un ensayo tipo ELISPOT, para medir la secreción de IFN-γ específico contra el HBsAg por los linfocitos CD8+ provenientes del bazo. Los resultados de estas evaluaciones indican que el Grupo 5 genera la mayor respuesta celular y una respuesta humoral que no difiere del resto de los grupos estudiados. Basado en esto se seleccionaron dos animales de este grupo como donantes de esplenocitos para la transferencia adoptiva. La selección del inmunógeno se realizó en una proporción 1 :1 (HBsAg:HBcAg)
Obtención de esplenocitos inmunes Quince días después de recibir la dosis de refuerzo los dos ratones del Grupo 5, y tres ratones del Grupo 7 (placebo) fueron sacrificados y se les extrajo el bazo. Se agruparon los bazos del Grupo 5 y los del Grupo 7, respectivamente. Los bazos fueron procesados hasta la obtención de los esplenocitos. Se separaron en alícuotas de 30 x 106 células en 100 μΐ de PBS 1 X, para su transferencia a los ratones receptores.
Transferencia adoptiva de inmunidad
Como receptores se emplearon ratones transgénicos que expresan el HBsAg, de entre 16-20 semanas de vida y de ambos sexos. Los mismos fueron asignados a los diferentes grupos de tratamiento como se muestra en la Tabla 9. Previo a la transferencia de esplenocitos se les realizó una extracción parcial de sangre, para chequear los niveles de HBsAg en suero. Posteriormente, se les inocularon (por la vía IP) 30 x106 esplenocitos en un volumen de 100 μί de PBS 1 X. Las extracciones de sangre, para evaluar el efecto de la transferencia adoptiva de inmunidad, se llevaron a cabo a través del plexo retrorbital, semanalmente, durante 5 semanas. En la semana 8 post-transferencia, los animales fueron sangrados y sacrificados.
Tabla 9. Diseño del experimento de transferencia adoptiva de inmunidad.
Figure imgf000027_0001
Cuantificación de HBsAg en el suero de ratones transgénicos para el HBsAg
Los niveles de HBsAg en suero se determinaron por ELISA. Las placas se recubrieron con el anticuerpo monoclonal anti-HBsAg nombrado Hep4 (producido por el CIGB). Todos los ratones que recibieron células con inmunidad previa al HBsAg mostraron, desde la evaluación a la semana post-transferencia, una disminución marcada del HBsAg en suero, encontrándose diferencias significativas entre el tiempo cero y la 2da y 3ra semana {p<0.05). A partir de la cuarta semana (día 35) se observa que las concentraciones de HBsAg en suero comienzan a incrementarse, lo cual indica que el control de la antigenemia por la inmunidad transferida va desapareciendo. A partir de este punto, y hasta la semana 8 (día 63), no hay diferencias en la antigenemia con la reportada para el tiempo cero del ensayo.
En el caso de los ratones que recibieron la transferencia de esplenocitos con inmunidad específica contra el HBsAg se detecta una disminución marcada del HBsAg en suero, la cual fue más notable entre los días 7 y 28. Sin embargo, para los ratones que recibieron la transferencia de esplenocitos placebo, o PBS, aunque se detectan fluctuaciones en la concentración de HBsAg en suero, esta nunca llega a diferir significativamente del tiempo cero, y nunca se detectan valores por debajo de 5 μg/ml.
Estos resultados indican que es posible, a través de la transferencia adoptiva de inmunidad mediada por células, disminuir eficazmente los niveles de HBsAg circulantes en el suero de los animales transgénicos para esta proteína. El control establecido sobre la antigenemia por la respuesta inmune transferida en este caso fue efectivo, y duró alrededor de 3 semanas después de una única transferencia de células.
Respuesta de IgG anti-HBsAg en suero
Se detectó una respuesta de anticuerpos IgG específicos contra el HBsAg para todos los ratones que recibieron transferencia de esplenocitos con inmunidad previa a este antígeno. Esto concuerda con los resultados de antigenemia obtenidos. En el caso de los animales con respuesta anti-HBsAg, los títulos detectados fueron altos (Título>104) y comenzaron a disminuir a partir de la tercera semana, lo cual pudiera relacionarse con el incremento de la antigenemia que se observa para estos animales alrededor de la 4ta semana (día 35). Los grupos que recibieron transferencia de células placebo o PBS no presentan títulos de anticuerpos específicos.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Composición farmacéutica que se caracteriza porque comprende el antígeno del core del virus de la hepatitis B (HBcAg) que comprende ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45% del total de ácido ribonucleico (ARN) de dicho antígeno y el antígeno de la superficie (HBsAg) del virus de la hepatitis B (VHB).
2. La composición de la reivindicación 1 donde el HBsAg comprende fosfatidilserina en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos de dicho antígeno.
3. La composición de la reivindicación 2 que se caracteriza porque es formulada para la administración por ruta parenteral y mucosal.
4. La composición de la reivindicación 2 que se caracteriza porque comprende adicionalmente un adyuvante vacunal.
5. Uso del antígeno del core del virus de la hepatitis B (HBcAg) que comprende ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45% del total de ácido ribonucleico (ARN) de dicho antígeno y el antígeno de la superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) en la manufactura de un medicamento para la inmunoprofilaxis o la inmunoterapia contra la infección por virus de la hepatitis B (VHB).
6. El uso de la reivindicación 5 donde el HBsAg comprende fosfatidilserina en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos de dicho antígeno.
7. El uso de la reivindicación 6 donde el medicamento es formulado para administración por vía parenteral y mucosal.
8. El uso de la reivindicación 6 donde el medicamento se emplea en el tratamiento de los pacientes de hepatitis B crónica (HBC) o de pacientes con coinfecciones donde uno de los virus infectantes es el VHB.
9. El uso de la reivindicación 8 donde el tratamiento de los pacientes de HBC se emplea en la prevención del cáncer hepatocelular derivado de la infección por VHB.
10. El uso de la reivindicación 6 donde la inmunoterapia se realiza de forma activa, o pasiva mediante la estimulación celular.
1 1 . Método para la inmunoprofilaxis o inmunoterapia contra la infección por virus de la hepatitis B (VHB) que se caracteriza porque se administra a un individuo que lo necesita una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende el antígeno del core del virus de la hepatitis B (HBcAg) que comprende ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45% del total de ácido ribonucleico (ARN) de dicho antígeno y el antígeno de la superficie (HBsAg) del virus de la hepatitis B (VHB).
12. El método de la reivindicación 1 1 donde el HBsAg comprende fosfatidilserina en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos de dicho antígeno.
13. El método de la reivindicación 12 donde la composición farmacéutica se administra por la ruta parenteral y la ruta mucosal.
14. El método de la reivindicación 12 donde el individuo que recibe la inmunoterapia es un paciente de hepatitis B crónica (HBC).
15. El método de la reivindicación 14 donde la inmunoterapia de los pacientes de HBC se emplea para la prevención del cáncer hepatocelular derivado de la infección por VHB.
16. Uso del antígeno del core del virus de la hepatitis B (HBcAg) que comprende ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en una proporción superior al 45% del total de ácido ribonucleico (ARN) de dicho antígeno y el antígeno de la superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) para incrementar la respuesta inmune contra un antígeno adicional que se coadministra con la mezcla de dichos antígenos.
17. El uso de la reivindicación 16 donde el HBsAg comprende fosfatidilserina en una proporción superior al 5% del total de fosfolípidos de dicho antígeno.
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