ES2264273T3 - Preparaciones que contienen particulas similares a virus como inmunopotenciadores administrados a traves de mucosas. - Google Patents
Preparaciones que contienen particulas similares a virus como inmunopotenciadores administrados a traves de mucosas.Info
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Abstract
Una formulación de vacuna para administración nasal, que comprende una mezcla de (a) antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y (b) al menos un antígeno de nucleocápside viral, y que comprende opcionalmente conservantes y/o estabilizantes, en la que dicho HBsAg y dicho antígeno de nucleocápside viral tienen la forma de partículas similares a virus, y en la que la formulación de vacuna no tiene adyuvantes distintos de (a) y (b).
Description
Preparaciones que contienen partículas similares
a virus como inmunopotenciadores administrados a través de
mucosas.
La presente invención está relacionada con la
rama de la medicina, en particular con el uso de nuevas estrategias
de inmunopotenciación de vacunas. En este caso, el adyuvante es una
partícula similar a virus (VLP), que al mismo tiempo constituye un
antígeno de interés en la formulación. El mecanismo adyuvante se
basa en el efecto positivo de un antígeno sobre otros o en la
interacción sinérgica entre los antígenos de la formulación.
El objetivo técnico perseguido con la presente
invención es, precisamente, el desarrollo de formulaciones capaces
de potenciar la respuesta inmunitaria a antígenos administrados a
través de vías mucosas, lo que minimiza el número de componentes en
la formulación. La actividad de potenciación se basa en la
interacción entre partículas a nivel mucoso, lo que genera
inmunidad sistémica y mucosa. Además, el desarrollo de vacunas
combinadas para la vía mucosa que tienen como antígeno central
HBsAg incrementa la respuesta inmunitaria a uno o más antígenos
coadministrados. La ventaja obvia es la eliminación de todos los
demás elementos o compuestos distintos del antígeno de interés, y el
uso de una vía diferente. Se considera que esta es la base o el
núcleo para desarrollar vacunas combinadas para uso mucoso.
HBcAg es un antígeno extremadamente inmunógeno
durante la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) o después
de la inmunización. En muchos pacientes crónicos de VHB, este es el
único antígeno capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Puede
inducir una respuesta inmunitaria en ratones incluso con cantidades
de nanogramos. Recientemente, varios estudios estructurales han
demostrado ciertas características importantes que explican su
potente inmunogenicidad. HBcAg se une específicamente a receptores
de inmunoglobulinas de membrana en un gran número de células B en
reposo, lo cual es suficiente para inducir moléculas coestimuladoras
B7-1 y B7-2. De esta manera, las
células B sin sensibilizar, específicas para HBcAg, pueden captar,
procesar y presentar péptidos de HBcAg a células T sin exposición
previa in vivo y a hibridoma de células T in vitro, de
forma aproximadamente 10^{5} veces más eficaz que los macrófagos
y las células dendríticas. Esta relación
estructura-función explica la gran inmunogenicidad
de HBcAg (Milich, D.R. et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA,
23 de Dic.; 94(26): 14648-53).
Los estudios serológicos y bioquímicos indican
que la resolución de la infección aguda por VHB ocurre en el
contexto de una respuesta inmunitaria eficaz mediada por células,
mientras la infección crónica se caracteriza por una respuesta
inmunitaria mediada por células pobre e indetectable, y una
respuesta humoral "relativamente eficaz".
La inmunidad humoral y la inmunidad mediada por
células están reguladas por grupos diferentes de células T
cooperadoras. Un estudio de los factores que influyen en la
inducción en ratones de una respuesta Th1 o Th2 a los antígenos de
VHB (HBcAg/HBeAg) reveló que este equilibrio estaba influido por (1)
la estructura del antígeno (HBcAg tiene una estructura particulada
y HBeAg no); (2) el complejo principal de histocompatibilidad (MHC)
del hospedador y los antígenos de células T que se reconocen; (3) la
regulación cruzada entre células Th1 y Th2; (4) la tolerancia de
células T, que es más completa para células Th1 que para células
Th2; (5) la actividad de HBeAg secretado, que elimina
preferentemente las células Th1; y (6) el tratamiento con citocinas,
usadas para modular in vivo la respuesta hacia células Th1 o
Th2. Este equilibrio Th1/Th2 es relevante para el curso agudo o
crónico de la infección por VHB. Las células Th2 evitan la inducción
de tolerancia comparado con Th1. Ya que HBeAg actúa como un
tolerógeno durante la transmisión vertical de VHB, eliminando
células Th1, la predominancia de células Th2 específicas para HBeAg
podría influir en la iniciación y el mantenimiento de un estado de
portador crónico. En este caso, la terapia con citocinas dirigida a
modular la respuesta hacia Th1 podría ser beneficiosa en el
tratamiento de la infección crónica por VHB (Milich, D.R. 1997 J.
Viral. Hepat.; 4 supl. 2: 48-59).
Se examinó el efecto de la circulación de HBeAg
sobre las células Th1 específicas de HBcAg mediante la transferencia
de células T específicas de HBeAg/HBcAg a ratones transgénicos
dobles (HBeAg y HBcAg). La presencia de HBeAg sérico eliminó la
respuesta mediada por Th1 contra HBcAg y cambió el equilibrio al
fenotipo Th2. Este resultado sugiere que, en el contexto de la
infección por hepatitis B, el HBeAg circulante tiene potencial para
eliminar preferentemente las células Th1 específicas inflamatorias
necesarias para la eliminación viral, lo que promueve la
persistencia de VHB (Milich, DR et al. 1998 J. Immunol. 15 de
Feb.; 160(4): 2013-21).
Se sabe que hay presentes anticuerpos contra
HBcAg desde el comienzo de la infección, y que alcanzan
concentraciones elevadas en los sueros de pacientes infectados de
forma crónica por VHB, pero estos anticuerpos no son protectores.
Los anticuerpos transmitidos de forma pasiva a recién nacidos de
madres portadoras crónicas no protegen a los niños de la infección
(Beasley et al., 1977, American Journal of Epidemiology 105:
914-918). Sin embargo, se ha demostrado que la
inmunización de chimpancés con HBcAg los protegió parcial o
completamente de la infección por VHB (Iwarson, S. et al.
1985 Gastroenterology 88: 763-767; Murray, K. et
al. 1987 Journal of Medical Virology 23:
101-107). En el estudio de Iwarson, tres chimpancés
estaban completamente protegidos. Tras exposición a VHB, las
concentraciones de anticuerpo contra HBcAg y HBeAg se incrementaron,
pero solamente se seroconvirtió un chimpancé contra HBsAg. En el
estudio de Murray, 2 de 4 chimpancés inmunizados mostraron un nivel
bajo de replicación viral tras la exposición, HBsAg fue detectable
en los sueros durante 2 ó 3 semanas, y después desarrollaron una
respuesta de anticuerpos anti-HBsAg. Se realizó la
hipótesis de que la protección incompleta se podría deber a la baja
respuesta inmunitaria en los animales vacunados sin adyuvante.
Después de inmunizar con antígeno de la
nucleocápside de hepatitis de marmotas (WHcAg) en adyuvante completo
de Freund (ACF), fue posible proteger marmotas de la exposición al
virus (WHV) sin signos de infección o anticuerpos detectables
contra la proteína de superficie (WHsAg). Aunque no se puede
descartar la hipótesis de que la respuesta inmunitaria Th
anti-nucleocápside podría potenciar anticuerpos
indetectables contra el antígeno de superficie, se consideró la
actividad citotóxica como la responsable principal de la protección
(Roos, S. et al. 1989 J. Gen. Virol. 70,
2087-2095). En un segundo estudio con marmotas se
determinó el papel de HBcAg y WHcAg en la protección, así como el
posible mecanismo. Se inmunizó a los animales con WHcAg y HBcAg, y
después se les expuso mediante el uso de una dosis elevada de WHV.
En este experimento se descubrió que WHcAg es un antígeno protector
y que existe una protección cruzada, ya que 4 de 6 marmotas
inmunizadas con HBcAg se protegieron de la exposición. Ambos
antígenos generaron un título de anticuerpos elevado con una
reactividad cruzada inferior al 1%, lo que confirma los informes
previos de protección mediante el uso de antígenos internos de
virus de hepatitis B. Como los epítopos B dominantes de ambos
antígenos no parecen estar conservados, este resultado también
demostró que los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de la
nucleocápside no son importantes para la protección. Las marmotas
inmunizadas con WHcAg/HBcAg reaccionaron con una respuesta rápida
de anticuerpos séricos contra las proteínas de superficie después de
la exposición a WHV, lo que indica una respuesta incrementada de
células T cooperadoras como mecanismo potencial de protección tras
la inmunización con un antígeno interno de VHB/WHV (Schodel, F.
et al. Vaccine. 1993; 11(6):
624-8).
La transfección de líneas celulares establecidas
de hepatocitos de ratones BALB/c con ADN dimérico de VHB (líneas
ML) dio como resultado la expresión de antígenos de VHB en estas
líneas. La transferencia adoptiva de células de bazo de ratones
BALB/c inmunizados con células ML-1.1 que expresan
HBsAg así como HBcAg, provocó una regresión de las células
tumorales que expresan los antígenos correspondientes en ratones
atímicos. Además, la transferencia de células de bazo de ratones
BALB/c inmunizados con HBsAg o HBcAg también provocó la regresión
tumoral. Estos resultados demostraron que los antígenos de
superficie y de nucleocápside podrían inducir una inmunidad capaz
de rechazar el carcinoma hepatocelular in vivo (Chen, S.H.
et al. 1993 Cancer-Res. 1 de Oct.; 53 (19):
4648-51).
Se están ensayando vacunas terapéuticas basadas
en epítopos específicos de nucleocápside para HLA humano en
estudios de fase II/III (Liaw, Y.F. 1997 J. Gastroenterol. Hepatol.
12 de Oct., (9-10): S227-35).
Se ha demostrado que HBcAg es un portador muy
bueno. HBcAg representa un antígeno sumamente inmunógeno en humanos
y en modelos animales. HBcAg activa directamente células B y genera
respuestas intensas de células T, y, además, el procesamiento y la
presentación eficaces de HBcAg por las células presentadoras de
antígenos lo convierten en la molécula portadora ideal. Por lo
tanto, se han unido químicamente o fusionado genéticamente un gran
número de epítopos a la molécula de HBcAg para incrementar con éxito
su inmunogenicidad. Se han diseñado vectores de expresión en
bacterias para permitir la inserción de epítopos de células B
heterólogas en diferentes posiciones dentro de las partículas de
HBcAg y la purificación eficaz de las partículas híbridas.
Los estudios de posición de epítopos de células
B demostraron que las inserciones internas cerca del aminoácido 80
continúan siendo inmunodominantes, lo que permite un incremento en
la producción de anticuerpos comparado con otras proteínas de
fusión.
Se han realizado estudios de inmunogenicidad con
exposiciones experimentales en diferentes sistemas. Por ejemplo, se
insertó un péptido procedente de circunsporozoito Plasmodium
berghei en ese sitio y la partícula híbrida purificada HBcAg/CS
fue sumamente inmunógena, y protegió al 100% de los ratones
expuestos a malaria. Con el objetivo de desarrollar vacunas orales,
se han usado cepas de Salmonella avirulentas atenuadas para
introducir genes que codifican partículas híbridas de HBcAg
(Milich, D.R. et al. 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci., 31 de Mayo;
754: 187-201).
En conclusión, aparte de la relación entre HBcAg
y protección, evidenciada total o parcialmente en chimpancés o
referida indirectamente por los experimentos con WHcAg, esta
proteína tiene varias propiedades que la hacen única. HBcAg se
comporta como un antígeno dependiente de T, y como un antígeno
independiente de T (Milich, D.R. et al. 1986 Science 234,
1398-1401), es muy inmunógeno, incluso sin la ayuda
de adyuvantes, y su inoculación sensibiliza preferentemente células
Th1 (Milich, D.R. et al. 1997, J. Virol. 71,
2192-2201). HBcAg es una proteína portadora muy
eficaz (Schodel, F. et al. 1992 J. Virol. 66:
106-114; Milich, DR et al. 1995 Ann. N.Y.
Acad. Sci. 31 de Mayo; 754: 187-20) y las células Th
específicas de HBcAg median la respuesta de anticuerpos contra
HBcAg así como contra HBsAg (Milich, D.R. et al. 1987 Nature
(Londres) 329: 547-549). Estas características
inmunológicas son únicas para HBcAg particulado, y no se aplican a
la forma no particulada del antígeno, HBeAg (Milich, D.R. et
al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 23 de Dic.; 94 (26):
14648-53).
El documento EP-A 0 835 663
describe composiciones de vacunas multivalentes que comprenden HBsAg
y otros antígenos. Las composiciones de vacuna contienen sales de
aluminio como adyuvantes en los que se adsorben los antígenos. La
administración de las composiciones de vacuna es mediante
inyección.
El documento WO 94/12617 describe formulaciones
de vacuna de virus de hepatitis B que contienen diversos virus
vaccinia recombinantes activos. Juntos, estos virus recombinantes
activos expresan una diversidad de epítopos de virus de hepatitis B
que comprenden epítopos de antígeno de la nucleocápside, epítopos de
antígeno de superficie o sus combinaciones. Se mencionan diversas
vías de administración.
El documento EP-A 0 271 302
describe un conjugado de polipéptido inmunógeno que comprende HBcAg
unido de forma operativa por medio de una cadena lateral de un
residuo de aminoácido a un inmunógeno polipeptídico. Dicho
inmunógeno polipeptídico puede ser, por ejemplo, HBsAg. La parte de
HBcAg del conjugado funciona como un vehículo para el inmunógeno
polipeptídico. Las composiciones de vacuna que contienen el
conjugado pueden comprender otros componentes que incluyen, por
ejemplo, adyuvantes. Se mencionan las vías de administración
parenteral, rectal y oral.
La Patente de EE.UU. nº 5.840.303 y el documento
EP-A 0 534 615 describen péptidos para inducir
respuestas de linfocitos T citotóxicos a virus de hepatitis B y
formulaciones de vacuna que contienen los mismos. Los péptidos
contienen al menos un epítopo de LTC y son relativamente cortos, tal
como de 8 a 17 aminoácidos o de 6 a 19 aminoácidos. Las
composiciones de vacuna que contienen los péptidos pueden comprender
otros componentes que incluyen, por ejemplo, adyuvantes. Se
mencionan diversas vías de administración.
En la presente invención, se informa por primera
vez de una formulación de vacuna que tiene como compuestos
principales: HBsAg y HBcAg en proporciones adecuadas. Se pueden
introducir otros compuestos como estabilizantes y conservantes.
La novedad de la formulación de HBsAg/HBcAg está
relacionada con el efecto potenciador de anti-HBsAg
generado cuando se mezcla HBsAg con HBcAg. Ambos antígenos son
compuestos de VHB y, por lo tanto, el papel de adyuvante lo toma
otro antígeno viral atractivo per se como antígeno de vacuna,
por lo que se convierte en una formulación de vacuna con un
espectro de respuesta inmunitaria anti-hepatitis B
más amplio. Otras formulaciones de antígenos de nucleocápside
combinados con antígenos de superficie, por ejemplo la formulación
HBsAg/partícula similar a virus de papilomavirus humano y por
extensión con otros antígenos virales, da como resultado un
incremento en los títulos contra ambos antígenos. Después de
mezclar HBsAg con otros antígenos, se pudo demostrar un incremento
de la inmunogenicidad sobre otros antígenos coinoculados, lo que
pone de manifiesto un efecto sinérgico producido por la combinación
de X + HBsAg por vía nasal. En general, estos resultados permiten la
generación de vacunas combinadas mucosas de HBsAg, y permiten el
uso de las interacciones positivas entre VLP, considerando VLP
estructuras organizadas proteicas o lipoproteicas, parecidas a
virus, con un tamaño de nanometros.
En el caso de la formulación que contiene HBsAg
y HBcAg, se puede obtener un producto superior comparado con la
vacuna disponible comercialmente de HBsAg solamente, ya que:
- -
- Es posible obtener un espectro más amplio de respuesta inmunitaria generada mediante HBcAg, considerado como un antígeno importante per se en la protección anti-VHB. Además, las concentraciones séricas de IgG anti-HBsAg alcanzadas mediante inoculación mucosa son tan intensas como las obtenidas con la inoculación sistémica en alúmina.
- -
- La vía de inoculación ofrece ventajas especiales, tales como: inmunidad sistémica y mucosa al mismo tiempo, la eliminación de controles de calidad importantes, tales como esterilidad y pirógenos, así como de los precios elevados de las vacunas inyectadas y la toxicidad asociada.
- -
- El efecto tóxico generado por las vacunas basadas en alúmina y los efectos tóxicos de la inyección adyuvante se pueden evitar, debido a que el antígeno número 2 es, al mismo tiempo, el adyuvante.
- -
- Es posible usar la formulación HBsAg + HBcAg inicial como un núcleo de vacunas combinadas.
- -
- Es posible inmunizar a pacientes que no responden al antígeno de superficie y a pacientes inmunodeprimidos mediante el uso de esta preparación, debido a la vía de inoculación y a la introducción del antígeno de la nucleocápside, considerado como un antígeno protector per se.
- -
- Las características de esta formulación hacen de ella una formulación ideal para uso terapéutico.
En segundo lugar, los antígenos de la
nucleocápside favorecen el incremento de la inmunogenicidad de los
antígenos coinoculados. Se encontró una gran simplicidad de las
formulaciones resultantes y, al mismo tiempo, la valencia
incrementada de estas vacunas potenciales con un número mínimo de
antígenos debido a la posibilidad de evitar el uso de adyuvantes,
que son per se antígenos sin interés para la protección. De
esta manera se pueden obtener combinaciones muy reducidas si se
desea, para vacunas únicas o combinadas.
En tercer lugar, es posible generar vacunas
combinadas que tienen como núcleo el HBsAg, cuyo efecto
inmunopotenciador sobre otros antígenos coinoculados se demuestra
en el Ejemplo 4. Las ventajas de estas formulaciones se basan en la
asociación eficaz de HBsAg, como antígeno central de la vacuna
anti-VHB, con otros antígenos, con un efecto
sinérgico demostrado en la respuesta generada para ambos antígenos.
Este hecho no solamente es atractivo por las variantes descritas
previamente, sino que también hace que HBsAg, antígeno protector
para una enfermedad de distribución mundial amplia, sea el antígeno
central de formulaciones combinadas.
En términos generales, comparado con otras
vacunas mucosas, es posible destacar las siguientes ventajas:
- -
- El proceso de "adyuvación", mezclando antígenos, no necesita la adsorción de los antígenos, y la cantidad del antígeno HBcAg está a niveles similares a los de HBsAg.
- -
- Se puede usar la filtración como proceso de esterilización debido al pequeño tamaño de las partículas, mientras otras estrategias y adyuvantes por encima de 0,2 \mum no se pueden esterilizar de esta manera.
- -
- La simplicidad del proceso de producción para HBcAg hace de él un antígeno muy barato comparado con otros adyuvantes.
Las formulaciones objeto de la presente
invención pueden presentar volúmenes de 0,01 hasta 10 ml,
dependiendo de la vía de inoculación y de la especie a inmunizar.
Las dosis de antígeno varían en un intervalo de 0,001 a 1 mg.
Con el objetivo de evaluar la inmunogenicidad de
HBcAg por vía nasal, se inocularon 3 grupos de 8 ratones BALB/c
hembra con una dosis de 10 \mug de HBcAg en todos los casos. Al
primer grupo se le inoculó HBcAg en 3 mg/ml de acemanano (CIGB, La
Habana) (peso en seco), adyuvante usado previamente para incrementar
la inmunogenicidad de sistemas particulados por vía nasal. Al
segundo grupo se le inoculó HBcAg en solución salina tamponada con
fosfato (PBS). Al grupo 3 se le inyectó de forma subcutánea el
antígeno en alúmina, y se usó como grupo de control para
inoculación sistémica. Se siguió un calendario de inoculaciones en
los días 0, 14 y 28, y la extracción se realizó en el día 42. La
respuesta de anticuerpos se cuantificó mediante análisis
inmunoenzimático (ELISA) para determinar los anticuerpos IgG contra
HBcAg en los sueros.
Se realizó la prueba t de Student para analizar
estadísticamente los resultados, y p<0,05 se consideró una
diferencia significativa.
Se demostró que, con el uso de acemanano, fue
imposible incrementar la respuesta inmunitaria de anticuerpos
anti-HBcAg. El antígeno en PBS generó una respuesta
inmunitaria de una intensidad similar a la obtenida usando
acemanano (Fig. 1). Las respuestas después de la inoculación nasal,
en acemanano o en PBS, fueron similares a la respuesta obtenida
mediante el uso de alúmina de forma sistémica. En conclusión, se
puede usar HBcAg por vía nasal con una elevada inmunogenicidad.
Con el objetivo de demostrar la actividad
inmunopotenciadora de HBcAg sobre HBsAg cuando ambos se mezclan y
se inoculan por vía nasal, se ensayaron 4 grupos de 8 ratones BALB/c
hembra. Se llevó a cabo un calendario de dos inoculaciones. Las
inoculaciones tuvieron lugar en los días 0 y 14. La extracción tuvo
lugar en el día 21. Al grupo 1 se le inocularon 10 \mug de HBsAg
en PBS, al grupo 2 se le inocularon 10 \mug de HBsAg en 3 mg/ml
de acemanano (CIGB, La Habana) (peso en seco), y al grupo 3 se le
inocularon 10 \mug de HBsAg y 10 \mug de HBcAg. El grupo 4 se
usó como control sistémico, y se le inocularon de forma subcutánea
10 \mug de HBsAg en alúmina (Fig. 2).
Se realizó la prueba t de Student para analizar
estadísticamente los resultados, y p<0,05 se consideró una
diferencia significativa.
A partir de este experimento se concluyó que es
posible potenciar la respuesta inmunitaria
anti-HBsAg con la inoculación por vía nasal de
HBsAg y HBcAg. La respuesta anti-HBsAg fue
significativamente superior comparado con el grupo al que se
inoculó HBsAg en PBS, y similar a la alcanzada por el grupo al que
se inoculó en acemanano. La inoculación sistémica de HBsAg en
alúmina no difirió significativamente de los grupos a los que se
inoculó con acemanano por vía nasal.
Con el objetivo de estudiar el efecto
potenciador de HBcAg a diferentes dosis en un modelo murino, se
seleccionaron 6 grupos de 6 ratones BALB/c hembra. El calendario
tuvo tres inoculaciones (días 0, 14 y 28) y dos extracciones (días
26 y 42). Los grupos estudiados correspondieron a: (1) 5 \mug de
HBsAg en PBS; (2, 3 y 4) 5 \mug de HBsAg con 5, 10 y 20 \mug de
HBcAg, respectivamente, (5) 5 \mug de HBsAg en 3 mg/ml de
acemanano (peso en seco) y (6) 5 \mug de HBsAg en 0,5 mg/ml de
alúmina. Se inoculó de forma nasal a todos los grupos excepto al
grupo 6. El grupo 6 se inoculó de forma intramuscular.
\newpage
Se realizó la prueba t de Student para analizar
estadísticamente los resultados, y p<0,05 se consideró una
diferencia significativa.
En este experimento se concluyó de nuevo que es
posible potenciar la respuesta anti-HBsAg con la
coinoculación de HBsAg y HBcAg. La respuesta de IgG sérica para los
tres grupos inmunizados con ambos antígenos fue significativamente
superior que la obtenida mediante inoculación con HBsAg en PBS, y
similar a la alcanzada por el grupo al que se inoculó en acemanano.
Se ha demostrado previamente que acemanano incrementó los títulos a
niveles similares a los obtenidos mediante toxina de cólera en
ratones. Los títulos obtenidos mediante inoculación sistémica en
alúmina no difirieron de los de los grupos de acemanano y
HBcAg/HBsAg por vía nasal. Aunque la respuesta de anticuerpos
anti-HBsAg del grupo 4 disminuyó comparado con la
del grupo 3, la diferencia se debió a un incremento doble de la
dosis de HBcAg en el grupo 4. Este incremento podría reducir la
posibilidad de penetración de HBsAg en la mucosa.
Se emplearon diferentes antígenos con el
objetivo de estudiar la interacción de partículas similares a virus
de papilomavirus humano 16 (VLP del PVH 16), HBsAg y HBcAg. Se
inmunizaron 8 grupos de 6 ratones BALB/c hembra con un calendario
basado en inoculaciones en los días 0 y 14, y la extracción 7 días
después de la segunda inoculación.
Al comparar los títulos de anticuerpo contra
HBsAg, la respuesta de la formulación de acemanano (grupo 6) tiene
la misma intensidad que la formulación de HBcAg/HBsAg (grupo 7),
respectivamente. Esta es la tercera vez que se demuestra el efecto
potenciador de HBcAg.
A partir de este experimento también se concluye
que ni acemanano ni HBcAg potenciaron las respuestas de anticuerpos
contra VLP de papilomavirus humano (PVH), representados por los
grupos 4, 5 y 8 en el tercer gráfico. El análisis estadístico
mediante el uso de la prueba t de Student (p<0,05 se consideró
una diferencia significativa) no mostró ninguna diferencia entre
estos grupos.
Al analizar la respuesta contra HBcAg en el
grupo 5, en el que se inocularon HBcAg y VLP de PVH, se pudo
demostrar la presencia de niveles bajos de títulos de anticuerpos
contra HBcAg comparado con el grupo 7, en el que se introdujo HBcAg
junto con HBsAg. Quizá la presencia de estas dos partículas resulta
antagónica a nivel mucoso. Sin embargo, en el grupo 2, se pudieron
alcanzar títulos elevados anti-HBcAg y
anti-VLP de PVH con la adición de HBsAg, y el
incremento en estas respuestas fue significativamente superior
comparado con el grupo 5, y no difirió de la respuesta
anti-HBcAg del grupo 7 (junto con HBsAg). Por lo
tanto, se puede presumir una interacción positiva entre HBsAg y
antígenos de la nucleocápside, y una interacción negativa entre VLPs
y HBcAg. El efecto potenciador a nivel mucoso puede ocurrir en
ambos sentidos, lo que permite el diseño de vacunas combinadas que
tienen como núcleo HBsAg o la combinación HBsAg/HBcAg.
El efecto de HBsAg sobre el grupo 2 no solamente
potenció la respuesta contra HBcAg, sino que también potenció la
respuesta de anticuerpos contra VLP de PVH. Se puede apreciar el
mismo efecto al comparar la respuesta contra VLP entre los grupos
1, 2 y 3 con el grupo 8, en el que se inoculó VLP en PBS. Los grupos
1, 2 y 3 tuvieron concentraciones de anticuerpos estadísticamente
similares, todas superiores a la concentración del grupo 8.
El grupo 1 (acemanano + HBsAg + VLPs de PVH) y
el grupo 3 (HBsAg y VLP) no difirieron en títulos de anticuerpos
anti-HBsAg. No hubo diferencia significativa entre
el grupo 3 y los grupos 6 y 7 (HBsAg/acemanano y HBsAg/HBcAg,
respectivamente). Este resultado puso de manifiesto el efecto
potenciador de VLP de PVH sobre la inmunogenicidad de HBsAg.
Estos resultados apoyan el uso de formulaciones
combinadas por vía nasal con HBsAg como antígeno inmunopotenciador
central. Por ejemplo, la mezcla simple de HBcAg y VLP de PVH es muy
atractiva y hace posible la introducción de más antígenos,
potenciados por la interacción con HBsAg.
La creación de formulaciones complejas es
posible sin la reducción de la respuesta de anticuerpos contra cada
componente, por ejemplo: VLP de PVH, HBcAg y HBsAg se pueden mezclar
sin afectar a la respuesta de IgG contra cada componente.
Con el objetivo de demostrar la actividad
inmunopotenciadora de la nucleocápside del virus de hepatitis C (NC
de VHC) sobre HBsAg cuando ambos se mezclan y se inoculan por vía
nasal, se estudiaron 3 grupos de 8 ratones BALB/c hembra. Se llevó
a cabo un calendario de dos inoculaciones. Las inoculaciones fueron
en los días 0, 14 y 28. La extracción fue en el día 42. Al grupo 1
se le inocularon 10 \mug de NC de VHC, al grupo 2 se le
inocularon 5 \mug de HBsAg en PBS y al grupo 3 se le inocularon 5
\mug de HBsAg y 10 \mug de NC de VHC en PBS (CIGB, La Habana)
(Fig. 5).
Se realizó la prueba t de Student para analizar
estadísticamente los resultados, y p<0,05 se consideró una
diferencia significativa.
A partir de este experimento se concluyó que es
posible potenciar la respuesta de IgG con la coadministración
mucosa (IN) de HBsAg y NC de VHC. La respuesta sérica de IgG fue
significativamente superior comparado con la del grupo inmunizado
con HBsAg en PBS.
Figura 1. Calendario de tres dosis (días 0, 14 y
28). La extracción se realizó en el día 42. A los grupos 1 y 2 se
les inocularon 50 \mul por vía nasal. Al grupo 3 se le inocularon
100 \mul de forma subcutánea.
Figura 2. Calendario de dos dosis (días 0 y 14).
La extracción se realizó en el día 21. A los grupos 1, 2 y 3 se les
inocularon 50 \mul por vía nasal. Al grupo 4 se le inocularon 100
\mul de forma subcutánea.
Figura 3. Calendario de tres dosis (días 0, 14 y
28). La extracción se realizó en el día 26. A los grupos 1, 2, 3, 4
y 5 se les inoculó por vía nasal. Al grupo 6 se le inocularon 100
\mul de forma intramuscular.
Figura 4. Calendario de dos dosis (días 0 y 14).
La extracción se realizó en el día 26. Se inocularon 50 \mul de
forma nasal a todos los grupos. La composición de los grupos
experimentales se muestra en la tabla añadida a la figura.
Figura 5. Calendario de tres dosis (días 0, 14 y
28). La extracción se realizó en el día 42. A los grupos 1, 2 y 3 se
les inocularon 50 \mul por vía nasal.
Claims (8)
1. Una formulación de vacuna para administración
nasal, que comprende una mezcla de (a) antígeno de superficie de
hepatitis B (HBsAg) y (b) al menos un antígeno de nucleocápside
viral, y que comprende opcionalmente conservantes y/o
estabilizantes, en la que dicho HBsAg y dicho antígeno de
nucleocápside viral tienen la forma de partículas similares a
virus, y en la que la formulación de vacuna no tiene adyuvantes
distintos de (a) y (b).
2. Una formulación de vacuna según la
reivindicación 1, en la que el componente (b) comprende una
partícula similar a virus inactiva del antígeno de la nucleocápside
del virus de la hepatitis B.
3. Una formulación de vacuna según la
reivindicación 1, en la que el componente (b) comprende una
partícula similar a virus inactiva del antígeno de la nucleocápside
del papilomavirus humano.
4. Una formulación de vacuna según la
reivindicación 1, en la que el componente (b) comprende una
partícula similar a virus inactiva del antígeno de la nucleocápside
del virus de la hepatitis C.
5. El uso de (a) el antígeno de superficie de la
hepatitis B y (b) al menos un antígeno de la nucleocápside viral,
para fabricar una formulación de vacuna para administración nasal
para tratar o prevenir la infección viral, en el que dicho HBsAg y
dicho antígeno de la nucleocápside viral tienen la forma de
partículas similares a virus, y ambas actúan como inmunógeno y como
adyuvante.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que
el componente (b) comprende una partícula similar a virus inactiva
del antígeno de la nucleocápside del virus de la hepatitis B.
7. El uso según la reivindicación 5, en el que
el componente (b) comprende una partícula similar a virus inactiva
del antígeno de la nucleocápside de papilomavirus humano.
8. El uso según la reivindicación 5, en el que
el componente (b) comprende una partícula similar a virus inactiva
del antígeno de la nucleocápside del virus de la hepatitis C.
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