WO2006024240A2 - Composición vacunal contra el virus de la hepatitis c. - Google Patents

Composición vacunal contra el virus de la hepatitis c. Download PDF

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Santiago DUEÑAS CARRERA
Liz ALVAREZ-LAJONCHERE PONCE DE LEÓN
Nelson Acosta Rivero
Gillian MARTÍNEZ DONATO
María Guirola Tsibulova
Gretel Sardiñas García
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    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention is related to the branch of immunology, particularly with a composition of vaccine antigens that are capable of inducing an enhanced and diverse immune response against Hepatitis C virus (HCV) and combined vaccines against pathogenic entities including this vaccine composition .
  • HCV Hepatitis C virus
  • State of the prior art There are several obstacles to obtaining an effective vaccine against HCV since being an RNA virus, it can quickly mutate in adaptation to the environment. This contributes to the high sequence diversity of the multiple viral isolates identified in the world. The greatest heterogeneity is concentrated in the hypervariable region of HCV E2 protein, where there is precisely a possible neutralizing epitope (Bukh et al. US 6,110,465).
  • HCV causes persistent infection in immunocompetent individuals despite the existence of an active immune response (Lechmann et al. (2000) Vaccine development for hepatitis C. Semin Liver Dis. 20: 211-226).
  • an active immune response Lechmann et al. (2000) Vaccine development for hepatitis C. Semin Liver Dis. 20: 211-226.
  • an animal model nor an efficient in vitro culture system that allows the virus to spread and evaluate the existence of neutralizing antibodies.
  • the immunological patterns associated with the progression of the disease or with the protection have not been defined. It is likely that a vigorous multispecific response, both humoral and long-lasting, will be required for the resolution of the infection (Lechmann et al. (2000) Vaccine development for hepatitis C. Semin Liver Dis. 20: 211-226).
  • Vaccination improved liver histology determined the disappearance of viral antigens from the liver and decreased alanine aminotransferase (ALT) levels.
  • serum viral RNA levels did not change during treatment, liver inflammation and viral antigens reappeared after the end of treatment.
  • An association was observed between the high levels of antibodies against E1 and the improvement of the disease (Maertens et al. (2000) Improvement of chronic active hepatitis C chronically infected chimpanzees after therapeutic vaccination with the HCV E1 protein. Acta Gastroenterol. BeIg 63: 203).
  • virus-like particles Liang et al.
  • peptides without helper function can be poor immunogens;
  • effectiveness of a vaccine is often based on the induction of a multivalent broad-spectrum response against different antigens.
  • HCV envelope proteins have also been targets of interest for this type of technology.
  • E2 the humoral response appears to be directed primarily at RHV-1 (Lee et al. (1998) Hepatitis C virus envelope DNA-based immunization elicits humoral and cellular immune responses. Mol. CeIIs 8: 444- 451).
  • RHV-1 Hepatitis C virus envelope DNA-based immunization elicits humoral and cellular immune responses.
  • Mol. CeIIs 8: 444- 451 When it has been immunized with vectors coding for secretable variants of the E1 and E2 proteins, no differences in the immune response have been obtained when compared with the secreted variants (Lee et al.
  • Non-structural proteins have also been evaluated by this technology.
  • the coding region for the C-terminal domain of the NS3 protein was included in a vector that allows simultaneous and independent expression of said domain and IL-2, obtaining good results (Papa et al. (1998) Development of multigenetic plasmid vector for HCV DNA immunization Res. Virol. 149: 315-319).
  • the NS4 and NS5 proteins also generate cytotoxic and Acs T lymphocyte responses in this way (Encke et al. (1998) Genetic immunization generates cellular and humoral Immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis C virus in murine model. J. Immunol. 161: 4917-4923).
  • the vaccine composition composed of the complex formed by the surface antigen, an antibody against this antigen, and a plasmid coding for this antigen has been evaluated (Wen et al. US 6,221, 664) .
  • This formulation allowed the antigen presentation by several pathways and a rapid induction of immune response that was superior to that generated by the individual variants.
  • the present invention describes a vaccine composition composed of the structural antigens of the Hepatitis C virus. Unlike the protein compositions described above where only the combined E1 and E2 proteins were used or alone, our protein also includes the protein of the virus capsid.
  • composition lies in the ranges of amounts of antigen to be used in the preparation which allows, in addition, to generate potent responses (humoral and cellular) against different antigens simultaneously and a protective response to the challenge in murine model with vaccinia virus recombinant
  • the present invention aims at providing a vaccine composition composed of the mixture of the structural antigens of the Hepatitis C virus.
  • the protein of the capsid, the structural protein E1 and the structural protein E2 are capable of inducing specific humoral and cellular immunity against HCV, even (but not only) in chronic HCV carriers.
  • the novelty of the invention is given by obtaining a range of antigen ratios and the protective effect that is obtained after the immunization of the mixtures under study.
  • the antigens under study are attractive vaccine targets through which an immune response against HCV can be generated.
  • the vaccine composition uses a range of ratios of the antigens present that is framed between [(1, 5-2.5) :( 1-2.5) :( 1-2)] for the protein of The capsid, E1 and E2 respectively, to generate an optimal humoral response.
  • the protein antigens are used in a ratio of (1, 5: 1,1: 1) for the Protein of the capsid, E1 and E2 respectively.
  • the vaccine composition uses a range of ratios of the antigens present which is framed between [(1:50) :( 120-180) :( 120-180)] for the protein of the capsid, E1 and E2 respectively, to generate a optimal cellular response
  • the protein antigens are used in a ratio of (1: 160: 160) for the protein of the capsid, E1 and E2 respectively.
  • the vaccine composition of the present invention can be administered as a solid, liquid or aerosol product, by any convenient method for the administration of vaccines including oral and parenteral injection (eg intravenous, subcutaneous or intramuscular), in addition this composition can be prepared by mixing the protein antigens and then adding them, or by adding the antigens separately and then mixing them.
  • the antigens according to this invention may be prepared naturally or by recombinant DNA techniques in any expression system as documented below.
  • the vaccine compositions comprising this invention can be administered in different immunization schedules.
  • the vaccine compositions comprise combinations of the antigens of the structural region of the Hepatitis C Virus, together with plasmids that code for antigens of infectious entities against viral and / or bacterial diseases.
  • the preferred vaccine compositions in this invention are preparations where the viral antigens used are the nucleocapsid antigen and / or the surface antigen of the Hepatits B virus and as bacterial antigens the outer membrane proteins of N. meningitidis as prepared vaccine or any of the proteins that make up the same, likewise, polysaccharide antigens conjugated or not to carrier proteins can be used as active principles of formulations against bacterial entities.
  • the vaccine compositions described herein can be administered in combination schemes with other vaccine candidates based on DNA vaccines, recombinant live vectors, peptides and proteins. They can also be used to induce immunity against HCV in patients with chronic hepatitis C, cirrhosis and liver cancer.
  • FIG. 1 Antibody response against the HCV structural proteins evaluated by ELISA, (A) against the HCV capsid antigen, (B) against the E1 protein, (C) against the E2 protein.
  • Figure 2 Lymphoproliferative response against the proteins of the structural region of HCV, from splenocytes of mice immunized with the combinations under study.
  • HCcAg, HCV capsid antigen, E2-coli, E2 produced in
  • Figure 3 Functional response of the preparations under study evaluated against the challenge with recombinant vaccinia virus.
  • Figure 4 Analysis of the influence on (A) Antibody response, (B)
  • Lymphoproliferative response (C) Challenge with recombinant vaccinia virus, of the components present in the vaccine preparation.
  • Figure: 5 Evaluation of the influence of the range of relationships to be used in the vaccine vaccine preparation against HCV, for antibody response (A) against the HCV capsid antigen, (B) against protein E1, (C) against The protein
  • Figure: 6 Evaluation of the influence of the range of relationships to be used in the vaccine preparation on the lymphoproliferative response against the proteins of the structural region of HCV, from splenocytes of immunized mice.
  • HCcAg HCV capsid antigen
  • E2-coli E2 produced in Escherichia coli
  • E2-lev E2 produced in the yeast Pichia pastoris, E1-coli, E1 produced in
  • Figure: 7 Influence of the range of relationships to be used in the vaccine preparation on the functional response evaluated against the challenge with recombinant vaccinia virus in immunized mice.
  • Figure: 8 Antibody response against HCV structural proteins evaluated by ELISA, (A) against HCV capsid antigen, (B) against Ia protein E1, (C) against protein E2, after immunization at different time intervals (different immunization schedules).
  • Figure: 9 Lymphoproliferative response against proteins in the structural region of HCV, from splenocytes of mice immunized with different schemes. HCcAg, HCV capsid antigen, E2-coli, E2 produced in
  • Figure: 10 Functional response to the challenge with recombinant vaccinia virus after
  • Figure: 11 Antibody response against the HCV structural proteins evaluated by ELISA, (A) against the HCV capsid antigen, (B) against the E1 protein, (C) against Ia E2 protein, after immunization with the vaccine against HCV by different routes.
  • Figure: 12 Lymphoproliferative response against proteins of the HCV structural region, from splenocytes of mice immunized with HCV protein vaccine preparations, supplied by different routes.
  • HCcAg HCV capsid antigen, E2-coli, E2 produced in Escherichia coli, E2-lev,
  • Figure: 14 Antibody response against the HCV structural proteins evaluated by ELISA, (A) against the HCV capsid antigen, (B) against the EI 1 (C) protein against the E2 protein, to analyze the influence of different adjuvants in the humoral response.
  • Figure: 15 Lymphoproliferative response against the proteins of the structural region of HCV, from splenocytes of mice immunized for the evaluation of different adjuvants.
  • HCcAg HCV capsid antigen, E2-coli, E2 produced in Escherichia coli, E2-lev, E2 produced in Pichia pastor ⁇ s yeast,
  • E1-coli E1 produced in Escherichia coli.
  • Figure: 16 Functional response to the challenge with recombinant vaccinia virus after immunization of mice for the study of different adjuvants.
  • Figure: 17 Antibody response, (A) against the HCV capsid antigen, (B) against E1 protein, (C) against E2 protein, against (D) HBsAg and (E) HBcAg evaluated by ELISA, after immunization with The mixture of the vaccine preparation against HCV and viral antigens.
  • Figure: 18 Lymphoproliferative response against the proteins of the structural region of HCV (capsid protein, E1, E2), HBsAg and HBcAg, from splenocytes of mice immunized with combinations of the vaccine preparation against HCV and viral antigens.
  • HCV capsid antigen E2-coli, E2 produced in Escherichia coli, E2-lev, E2 produced in the yeast Pichia pastoris, E1-coli, E1 produced in Escherichia coli.
  • Figure: 19 Functional response to the challenge with recombinant vaccinia virus after immunization of mice with a combination of the vaccine against HCV and viral antigens.
  • Figure: 20 Antibody response, (A) against the HCV capsid antigen, (B) against E1 protein, (C) against E2 protein and (D) against proteins of the outer membrane of N. meningitidis, evaluated by ELISA, after immunization with the mixture of the vaccine preparation against HCV and bacterial antigens (proteins of the outer membrane of Neisseria meningitidis).
  • Figure: 21 Lymphoproliferative response against proteins of the HCV structural region (capsid protein, E1, E2) and proteins of the outer membrane of N.
  • HCV bacterial antigens
  • PME proteins of the outer membrane of Neisseria meningitidis
  • HCcAg HCV capsid antigen
  • E2-coli E2 produced in Escherichia coli
  • E2-lev E2 produced in the yeast Pichia pastoris
  • E1-coli E1 produced in Escherichia coli.
  • Figure: 22 Functional response to the challenge with recombinant vaccinia virus after immunization of mice with a combination of the vaccine preparation against HCV and bacterial antigens (proteins of the outer membrane of Neisseria meningitidis).
  • Figure: 23 Antibody response, (A) against the HCV capsid antigen, (B) against E1 protein, (C) against E2 protein and (D) against capsular polysaccharide of serogroup C of N. meningitidis , evaluated by ELISA, after mixing the vaccine preparation against HCV and a conjugated capsular polysaccharide.
  • Figure: 24 Lymphoproliferative response against HCV structural region proteins (capsid protein, E1, E2) from splenocytes of mice immunized with the mixture of the vaccine against HCV and a conjugated capsular polysaccharide.
  • HCcAg HCV capsid antigen, E2-coli, E2 produced in Escher ⁇ chia coli, E2-lev, E2 produced in Pichia pastoris yeast, E1-coli, E1 produced in Escher ⁇ chia coli.
  • Figure: 25 Functional response to the challenge with recombinant vaccinia virus after immunization of mice with the mixture of the vaccine against HCV and a conjugated capsular polysaccharide.
  • Figure: 26 Antibody response, (A) against the HCV capsid antigen, (B) against E1 protein, (C) against E2 protein, (D) against HBsAg, and (E) against HBcAg, after The mixture of the vaccine preparation against HCV and plasmids coding for HBsAg and HBcAg.
  • Figure: 27 Lymphoproliferative response against the proteins of the structural region of HCV (capsid protein, E1, E2), HBsAg and HBcAg, from splenocytes of mice immunized with combinations of the vaccine preparation against HCV and plasmids encoding HBsAg and HBcAg.
  • HCcAg HCV capsid antigen, E2-coli, E2 produced in Escher ⁇ chia coli, E2-lev, E2 produced in Pichia pastoris yeast, E1-coli, E1 produced in Escher ⁇ chia coli.
  • Figure: 28 Functional response to the challenge with recombinant vaccinia virus after immunization of mice with a combination of the vaccine against HCV and plasmids encoding HBsAg and HBcAg.
  • FIG. 29 Antibody response, (A) against the HCV capsid antigen, (B) against E1 protein, (C) against E2 protein, after immunization of mice with combinations of DNA and booster dose with preparation HCV protein.
  • Figure: 30 Lymphoproliferative response against proteins in the structure region! HCV (capsid protein, E1, E2), from splenocytes of mice immunized with combinations of DNA and booster doses with HCV protein preparation.
  • HCV capsid protein
  • HCcAg HCV 1 capsule antigen E2-coli, E2 produced in Escher ⁇ chia coli, E2-lev, E2 produced in the yeast Pichia pastoris, E1-coli, E1 produced in Escher ⁇ chia coli.
  • Figure: 31 Functional response to the challenge with recombinant vaccinia virus after immunization of mice with combinations of DNA and booster doses with HCV protein preparation.
  • Figure: 32 Antibody response against HCV structural proteins (capsid protein, E1, E2), after the immunization of mice with different ways of shaping the vaccine preparation.
  • Figure: 33 Iinfoproliferative response against the proteins of the structural region of HCV (capsid protein, E1, E2), from splenocytes of mice immunized with different ways of forming the vaccine preparation against HCV.
  • HCV capsid antigen E2-coIi
  • E2 produced in Escherichia coli
  • E2-lev E2 produced in Pichia pastoris yeast
  • E1-coli E1 produced in Escherichia coli.
  • Figure: 34 Functional response to the challenge with recombinant vaccinia virus after immunization of mice with different ways of shaping the vaccine preparation.
  • Example 1 Antibody response, inflammatory and challenge against recombinant vaccinia virus in mice immunized with HCV protein vaccine preparation.
  • the antigens of the capsid, E1 and E2 of HCV, after being mixed and adjuvant in alumina were inoculated intraperitoneally to female BALB / c mice (10 per group).
  • the scheme included 3 inoculations on days 0, 7, 14.
  • the study of the humoral and cellular response (lymphoproliferative response), as well as protection against challenge against recombinant vaccinia virus vRE (which contains the proteins of the structural region of HCV) was performed 15 days after the last immunization.
  • the relationship of the groups under study is shown in Table 1.
  • Table 1 Preparation of the immunogens to be used in the assay.
  • the antibody response was determined by an immuno-enzymatic assay (ELISA) against the proteins of the HCV structural region.
  • ELISA immuno-enzymatic assay
  • the multiple range variance analysis and the Kruskal-Wallis post-test was used to statistically analyze the results, p ⁇ 0.05 was considered a statistically significant difference.
  • Figure 1 shows that it is possible to obtain an antibody response against the three antigens of the HCV structural region when they are administered in certain ratios.
  • mice were immunized ip, in the same regime described in example 1, with the proportions of the capsid antigens , E1 and E2 of HCV as shown in Table 2.
  • the amounts used for each antigen were the result of the analysis of the response surface graphs of example 1.
  • the antibody response against the HCV structural proteins is shown in Figure 5 indicating that the relationships under study generate an antibody response against the capsid antigen, E1 and E2 of HCV. Despite the variations in the antibody response observed for each antigen, no statistically significant difference was found between them for each of the variants (optimal variant of cellular response and optimal variant for the humoral response, respectively).
  • the experimental groups represented in Figure 5 correspond to those shown in Table 2.
  • the study of the lymphoproliferative response was evaluated by the incorporation of thymidite- 3 H, after stimulation of the spleen cells of immunized mice. Immunized mice showed generating a lymphoproliferative response against the antigens under study, as shown in Figure 6.
  • the experimental groups represented in Figure 6 correspond to those shown in Table 2, adding another corresponding negative control (group 17) to non-immunized mice. No statistically significant differences were observed between the stimulation indices obtained for each of the variants under study (optimal variant of cellular response and optimal variant for humoral response, respectively).
  • FIG. 7 shows the levels of protection achieved, where the reduction in viral load is significant in mice immunized with protein mixtures in the ranges under study (approximately 2.5 Log of viral titer), mainly in the optimal variant for response mobile.
  • the experimental groups represented in Figure 7 correspond to those shown in Table 2, adding another negative control (group 17) corresponding to non-immunized mice.
  • Example 3 Evaluation of the immune response in BALB / c mice after immunization with HCV protein preparations provided in different immunization schedules.
  • mice Female BALB / c mice were immunized i.p. at different time intervals, with the preparation to generate the optimal cellular response, as referred to in example 1.
  • the immunization scheme for group 1 was at weeks 0, 1, 2.
  • the immunization scheme for group 2 It was 0, 2, 4 weeks.
  • the immunization schedule for group 3 was 0, 3, 6 weeks and for group 4 it was 0, 4, 8 weeks.
  • Antibody titers against HCV capsid proteins, E1 and E2 were evaluated by ELISA and are reported in Figure 8. As it is observed there were no statistically significant differences in the titer of immunized mice when they were evaluated 15 days later. of the last immunization against E1 and E2. against the capsid antigen, statistically significant differences were found when the immunization regimens were compared 0, 1, 2 weeks (group 1) and the remaining employees.
  • mice Female BALB / c mice were immunized with preparations to generate optimal cellular and humoral responses by route: Group 1: Optimal preparation for humoral response subcutaneously (sc), Group 2: Optimal preparation for humoral response via Lp., Group 3: Optimal preparation for humoral response by intramuscular route (Lm.), Group 4: Optimal preparation for humoral response by intra-nasal route (Ln.), Group 5: Optimal preparation for cellular response by sc route, Group 6: Optimal preparation for cellular response via Lp., Group 7: Optimal preparation for cellular response via Lm., Group 8: Optimal preparation for cellular response via in.
  • sc subcutaneously
  • Group 3 Optimal preparation for humoral response by intramuscular route (Lm.)
  • Group 4 Optimal preparation for humoral response by intra-nasal route (Ln.)
  • Group 5 Optimal preparation for cellular response by sc route
  • Group 6 Optimal preparation for cellular
  • the antibody response was studied 15 days after the completion of the immunization schedule ( 0, 1, 2 weeks) against the 3 antigens that are part of the structural region of HCV (capsid antigen, E1 and E2 of HCV).
  • the results obtained show that despite there being differences between the levels of Ac, a specific response was generated against the antigens used. These differences are due to the immunization scheme used, where the generation of antibody response is favored for some immunization variants by the kinetics of generating the immune response. No statistically significant differences were observed between the groups when the sc, ip and im routes were used. However, the results were higher when using the ip route, and lower with statistically significant differences when using the Ln route. The results obtained are shown in Figure 11.
  • mice immunized in the scheme was evaluated against viral antigens, 15 days after the end of the scheme. immunization.
  • the differences in the stimulation indices between the groups under study are attributed to the amount of antigen used, for the route in, and the kinetics of generation of the immune response in general for all immunization routes
  • a specific lymphoproliferative immune response was generated for each antigen, however the stimulation rates for the in pathway were statistically lower compared to the other pathways.
  • Figure 12 shows the results obtained.
  • Example 5 Evaluation of the immune response in BALB / c mice after immunization with HCV protein preparations using different adjuvants.
  • mice were immunized Lp. with preparations to generate the optimal cellular and humoral responses adjuvant with: Group 1: Optimal variant for humoral response adjuvant with aluminum hydroxide (Alumina (AIOH 3 )), group 2: Optimal variant for humoral response adjuvant with aluminum phosphate, group 3: Optimal variant for humoral response adjuvant with Freund's adjuvant, group 4: Optimal variant for humoral response adjuvant with oily adjuvant (Montanide ISA 51), group 5: Optimal variant for humoral response without adjuvant, group 6: Optimal variant for response cell adjuvant with aluminum hydroxide (Alumina (AIOH 3 )), group 7: Optimal variant for cellular response adjuvant with aluminum phosphate, group 8: Optimal variant for cellular response adjuvant with Freund's adjuvant, group 9: Optimal variant
  • the antibody response was studied 15 days after the end of the immunization schedule (0, 1, 2 weeks) against the 3 antigens that form the structural region of HCV (capsid antigen, E1 and E2 of HCV). The results obtained show that despite there being differences between the levels of antibodies generated, a specific response was obtained against the antigens used.
  • Antibody levels were similar when the variants were adjuvated with both aluminum hydroxide and aluminum phosphate.
  • the highest levels of antibodies were obtained by using Freund's adjuvant in vaccine preparations and subsequently to a lesser extent those adjuvants with Montanide ISA-51.
  • the lowest levels of antibodies obtained were when no adjuvant was used in vaccine preparations, although a specific antigen response was generated.
  • the results obtained are shown in Figure 14.
  • the lymphoproliferative response in the spleen cells of the immunized mice was evaluated against the viral antigens of the structural region, 15 days after the completion of the immunization schedule.
  • the highest lymphoproliferation rates were obtained for the cell variant adjuvant with Freund and Montanide ISA-51, respectively.
  • the lymphoproliferation rates for the variants where both aluminum hydroxide and aluminum phosphate were used were similar.
  • the lowest levels of cellular response were obtained when the vaccine preparation was given to the mice in the absence of adjuvant.
  • Figure 15 shows the results obtained, also including another negative control group (Group 11), corresponding to non-immunized mice.
  • This figure shows a reduction of 1, 7 (optimal variant for humoral response) and 2.4 (optimal variant for cellular response) of the viral titer log in mice immunized with Freund's adjuvant, as well as 1.9 ( optimal variant for humoral response) and 2.5 (optimal variant for cellular response) of the Title Log for those immunized with Montanide ISA-51, respectively.
  • both hydroxide and phosphate Ia reduction in the Log of the viral titer in the ovaries of immunized and challenged mice was 1.4 (optimal variant for humoral response) and 2.1 (optimal variant for cellular response) orders of magnitude.
  • a small reduction in viral titer was observed in those mice immunized without adjuvant and then challenged with the vRE.
  • Example 6 Evaluation of the immune response in BALB / c mice after immunization with HCV protein preparations mixed with other viral antigens.
  • the potentiation or generation of the immune response by other viral antigens surface antigen of the Hepatitis B-HBsAg virus, antigen of the capsid of the Hepatitis B-HBcAg virus) mixed with the vaccine preparation against HCV (vaccine preparation that generates optimal cellular response) under study was evaluated after immunization of mice.
  • BALB / c mice were immunized i.p. with: group 1- HBsAg-vaccine preparation, group 2- HBcAg-vaccine preparation, group 3-vaccine preparation, group 4- HBsAg, group 5- HBcAg.
  • the immunization schedule used was 0, 2, 4 weeks and the immune response studied 15 days after the end of the immunization schedule.
  • the antibody response was evaluated against the 3 antigens that form the structural region of HCV (capsid antigen, E1 and E2 of HCV), as well as against HBsAg and HBcAg. A generation of the specific antigen immune response was observed.
  • Antibodies against the viral antigens HBsAg and HBcAg were generated. Although the levels of antibodies against HBcAg in group 2 (HBcAg-HCV vaccine preparation) were slightly lower compared to the control (group 5- HBcAg), the differences obtained were not statistically significant.
  • the lymphoproliferative response in the spleen cells of the immunized mice was evaluated against viral antigens of the structural region of HCV, as well as against HBsAg and HBcAg, 15 days after the end of the immunization schedule. As shown in Figure 18, there was no variation in the stimulation indices when the vaccine preparation mixed with the viral antigens (HBsAg or HBcAg) and their respective controls was compared. An antigen-specific response was generated in each case. The differences in the stimulation indexes detected were not statistically significant, when the study groups were compared. Another negative control group (Group 6), corresponding to non-immunized mice, was included in the experiment.
  • mice The potentiation or generation of the immune response generated by the combination of the vaccine preparation with bacterial antigens (outer membrane proteins (PME) of Neisseria meningitidis) mixed with the vaccine preparation (vaccine preparation that generates optimal cellular response) under study was evaluated after immunization of mice.
  • BALB / c mice were immunized ip with: group 1- PME-HCV vaccine preparation, group 2- HCV vaccine preparation, group 3- PME adjuvated with aluminum hydroxide.
  • the immunization scheme used was 0, 2, 4 weeks and the immune response was studied 15 days after the end of the immunization scheme.
  • the antibody response was evaluated against the 3 antigens that make up the structural region of HCV (capsid antigen, E1 and E2 of HCV), as well as against a protein preparation of the outer membrane of N. meningitidis corresponding to the Cuban strain CU 385/83.
  • Figure 20 shows that the levels of antibodies generated by the combination of the vaccine preparation with the PME generated higher levels of antibodies when these were compared both against those generated by the group of mice immunized with PME as well as with the HCV preparation related to the independent antigens as to PME. These differences had no statistical significance.
  • the lymphoproliferative response in the spleen cells of the immunized mice was evaluated against the viral antigens of the structural region of the HCV, as well as against the PME of the Cuban strain CU385 of N. meningitidis, 15 days after the end of the immunization schedule.
  • FIG 21 there was an increase in the stimulation indexes when the spleen cells of the mice immunized with the combination PME-HCV vaccine preparation were stimulated with the antigens of the structural region of the HCV as well as with the PME, in comparison to the control groups. This stimulation was specific antigen.
  • the functional activity of the antibodies generated with respect to the bacterial entity from which the PMEs were purified was evaluated by the bactericidal assay. In this test the property of the antibodies to kill the bacterium in vitro in the presence of exogenous complement is measured. In this sense, the results shown in Table 3, indicate that the mixture of vaccine preparation against HCV with PME, did not inhibit or potentiate the generation of specific-functional antibodies against N. meningitidis, since the bactericidal titres of groups 1 and 3 were similar.
  • Bactericidal titres are expressed as Log 2 of the last dilution of the serum capable of killing 50% of the initial inoculum of bacteria used in the assay.
  • Example 8 Evaluation of the immune response in BALB / c mice after immunization with HCV protein preparations mixed with polysaccharides.
  • capsular polysaccharides capsule polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup C-conjugated with a P64k carrier protein
  • vaccine preparation that generates optimal cellular response
  • group 1- Conjugate MenC-P64k
  • group 2- vaccine preparation against HCV group 3- Conjugate
  • MenC-P64k group 1- Conjugate
  • the immunization scheme used was 0, 2, 4 weeks and the immune response was studied 15 days after the end of the immunization scheme.
  • the antibody response was evaluated against the 3 antigens that make up the structural region of HCV (capsid antigen, E1 and E2 of HCV), as well as against the capsular polysaccharide of N. meningitidis serogroup C.
  • Figure 23 shows that the levels of antibodies generated by the combination of the vaccine preparation with the conjugate were similar when they were evaluated both against the HCV structural proteins, as well as against the capsular polysaccharide of serogroup C of N. meningitidis.
  • the lymphoproliferative response in the spleen cells of the immunized mice was evaluated against viral antigens of the HCV structural region. As shown in Figure 24, there was a variation in the stimulation rates when The spleen cells of mice immunized with the conjugate combination (MenC-P64k) -VHC vaccine preparation were stimulated with the antigens of the structural region of HCV compared to the control group of mice immunized only with the vaccine vaccine against HCV. Another negative control group (Group 4), corresponding to non-immunized mice, was included in this experiment.
  • FIG. 25 shows the results obtained, where there was no difference in the viral titer determined in the ovaries of the mice immunized with the vaccine vaccine against HCV with or without the conjugate (MenC-P64k) and subsequently challenged with the recombinant vaccinia virus .
  • results shown in Table 4 indicate that the mixture of the vaccine preparation against HCV with and the MenC-P64K conjugate had no influence on the generation of specific-functional antibodies against the N. meningitidis bacteria, generated at from the MenC-P64K conjugate itself.
  • Bactericidal titres are expressed as Log 2 of the last dilution of the serum capable of killing 50% of the initial inoculum of bacteria used in the assay.
  • Example 9 Evaluation of the immune response in BALB / c mice after immunization with HCV protein preparations mixed with plasmids encoding viral antigens.
  • mice were immunized with: group 1- pAEC-M7, group 2- pAEC-M7-vaccine prepared against HCV, group 3- pAEC-M7-HBsAg, group 4- pAEC-M7-H BsAg- vaccine prepared against HCV, group 5- pAEC-M7-HBcAg, group 6- pAEC-M7- HBcAg-vaccine prepared against HCV, group 7- vaccine prepared against HCV.
  • the immunization scheme used was 0, 2, 4, 6 weeks, by im route.
  • the antibody response was evaluated against the 3 antigens that make up the structural region of HCV (capsid antigen, E1 and E2 of HCV), as well as against the surface antigens (HBsAg) and the capsid (HBcAg) of the Hepatitis B virus.
  • the results obtained are shown in Figure 26, where the generation of specific response for each of the evaluated antigens is observed.
  • Higher antibody titres against HCV structural proteins are generally appreciated when plasmids were mixed with the HCV vaccine preparation compared to the vaccine preparation alone. Although this was the trend, the differences observed were not statistically significant. Both against HBsAg and HBcAg, the antibody levels detected were similar, when immunized with plasmids coding for these antigens, alone or in admixture with the vaccine against HCV.
  • the lymphoproliferative response in the spleen cells of the immunized mice was evaluated against viral antigens of the structural region of HCV, as well as against HBsAg and HBcAg, 15 days after the end of the immunization schedule. As shown in Figure 27, there was no statistically significant variation in the stimulation indices when the mixed vaccine preparation was compared with the plasmids encoding viral antigens (HBsAg or HBcAg) and their respective controls. Another negative control group (Group 8), corresponding to non-immunized mice, was included in this experiment. An antigen-specific response was generated in each case. The differences in the stimulation indexes detected were not statistically significant, when the study groups were compared. Nor was there a statistically significant difference between the groups of mice immunized with the vaccine preparation, in the presence or absence of plasmids, when spleen cells were pulsed in the presence of the HCV structural region antigens.
  • Example 10 Evaluation of the immune response in BALB / c mice after immunization with DNA preparations coding for antigens of the structural region of HCV and dose boosters with the HCV protein preparations under study.
  • the combination of the immunization with DNA with booster dose using the vaccine preparation against HCV was studied in BALB / c mice.
  • the immunization scheme is the one shown in Table 5.
  • mice were immunized with the preparation of plasmid DNA (Due ⁇ as-Carrera, et al. (2002) Enhancement of the immune response generated against the hepatitis C virus envelope proteins after DNA vaccination with polyprotein-encoding plasmids. Biotechnol Appl Biochem, 35 , 205-212) by im route and subsequently the booster dose was administered by ip route.
  • the antibody response was evaluated against the 3 antigens that make up the structural region of HCV (capsid antigen, E1 and E2 of HCV). The results obtained are shown in Figure 29. No potentiation of the antibody response against the HCV capsid antigen was evidenced.
  • Antibody levels detected were higher for protein variants compared to groups immunized with DNA, although the differences were not statistically significant.
  • the antibody response against E1 was enhanced by administering the booster dose with the vaccine preparation. In this case, the highest levels of antibodies were detected in the groups of animals immunized with protein compared to those immunized with DNA. The differences observed in the levels of antibodies against E1, after the booster dose, had no statistical significance.
  • the levels of antibodies detected in this immunization regime against E2 showed higher levels of antibodies for animals immunized with protein variants compared to the response obtained in animals immunized with DNA. After the booster dose, the antibody levels were not modified.
  • lymphoproliferative response in the spleen cells of the immunized mice was evaluated against the viral antigens of the HCV structural region, 15 days after the end of the immunization schedule. As shown in Figure 30, although there was an increase in lymphoproliferation rates in the case of protein variants with reinforcement, the differences were not statistically significant. Similarly, in the case of mice immunized with DNA and with booster doses with protein, there was an increase in the lymphoproliferative response for all cases against all antigens and marked mainly against the protein. The differences observed were not statistically significant.
  • Example 11 Evaluation of the immune response in BALB / c mice after immunization with HCV protein preparations taking into account different forms of preparation.
  • the generation of the immune response against the recombinant proteins of the structural region of HCV 1 were studied after the preparation of the immunogen of different ways. The following variants were studied: (1) The three antigens were mixed and subsequently adjuvated with the aluminum hydroxide gel, (2) Each antigen separately was adjuvated with the aluminum hydroxide gel and subsequently mixed to form the final preparation. BALB / c mice were immunized with both preparations. The optimal vaccine preparation was used for the generation of a cellular response in BALB / c mice. The immunization scheme used was 0, 2, 4 weeks and the immune response was studied 15 days after the end of the immunization scheme.
  • the antibody response was evaluated against the 3 antigens that form the vaccine preparation (capsid antigen, E1 and E2 of HCV).
  • Figure 32 shows that the levels of antibodies generated for each antigen under analysis were similar, with no statistically significant differences between those studied.
  • the lymphoproliferative response in the spleen cells of the immunized mice was evaluated against viral antigens of the HCV structural region.
  • the immunogen preparation form had no influence on the specific antigen lymphoproliferative response obtained. No statistically significant differences were detected between the groups under study.
  • Another negative control group (Group 3), corresponding to non-immunized mice, was included in this experiment.

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Abstract

Composición vacunal para el tratamiento terapéutico y profiláctico de la hepatitis C, la cual contiene como componentes las proteínas estructurales del virus de la Hepatitis C en proporciones adecuadas y que ejercen un efecto potenciador en el desarrollo de la respuesta inmune contra virus de la Hepatitis C. Vacunas combinadas contra entidades patógenas incluyendo esta composición vacunal son también descritas.

Description

COMPOSICIÓN VACUNAL CONTRA EL VIRUS DE LA HEPATITIS C.
Campo de Ia técnica
La presente invención está relacionada con Ia rama de Ia inmunología, particularmente con una composición de antígenos vacunales que son capaces de inducir una respuesta inmune potenciada y diversa contra el virus de Ia Hepatitis C (VHC) y vacunas combinadas contra entidades patógenas incluyendo esta composición vacunal. Estado de Ia técnica anterior Existen varios obstáculos para Ia obtención de una vacuna efectiva contra el VHC ya que al ser un virus de ARN, puede mutar rápidamente en adaptación al ambiente. Esto contribuye a Ia elevada diversidad de secuencias de los múltiples aislamientos virales identificados en el mundo. La mayor heterogeneidad se concentra en Ia región hipervariable de Ia proteína E2 del VHC, donde precisamente existe un posible epitopo neutralizante (Bukh et al. US 6,110,465). El VHC causa infección persistente en individuos inmunocompetentes a pesar de la existencia de una respuesta inmune activa (Lechmann et al. (2000) Vaccine development for hepatitis C. Semin Liver Dis. 20:211-226). Tampoco existe un modelo animal, ni un sistema de cultivo in vitro eficiente que permita propagar el virus y evaluar Ia existencia de anticuerpos neutralizantes. Los patrones inmunológicos asociados con Ia progresión de Ia enfermedad o con Ia protección no han sido definidos. Es probable que se requiera una respuesta multiespecífica vigorosa tanto humoral como celular de larga duración para Ia resolución de Ia infección (Lechmann et al. (2000) Vaccine development for hepatitis C. Semin Liver Dis. 20:211-226). Varios enfoques han sido usados para desarrollar una vacuna contra el VHC; entre estos se destacan el empleo de: proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, partículas semejantes a virus, ADN desnudo y virus recombinantes (Depla et al. US 6,635,257; Liang et al. US 6,387,662; Pachuk et al. US 6,235,888; Berzofsky et al. US 6,685,944). El desarrollo de una vacuna basada en subunidades proteicas fue una de las primeras estrategias evaluadas para el VHC (Min et al. US 5,985,609), debido a que para varios flavivirus los anticuerpos dirigidos contra proteínas de Ia envoltura pueden conferir protección. Algunas de las propuestas basadas en antígenos de Ia región estructural del VHC han logrado protección limitada frente al virus en modelos animales. Tal es el caso de los chimpancés inmunizados con un oligómero formado por las proteínas E1 y E2. Se vacunaron siete chimpancés, de los cuales cinco fueron protegidos y dos contrajeron Ia enfermedad pero se curaron sin avanzar a Ia fase crónica (Choo et al. (1994) Vaccination of chimpanzees against infection by hepatitis C virus. PNAS USA, 91:1294-98). Dicha protección ha estado correlacionada con Ia presencia de anticuerpos (Acs) capaces de inhibir Ia unión de E2 a células humanas (Rosa et al. (1996) A quantitative test to estímate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: Cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. PNAS USA, 93:1759-63). La proteína recombinante E1 proveniente de un aislamiento del genotipo 1b fue purificada como homodímeros que se asociaban en partículas de 9 nm de diámetro aproximadamente (Maertens et al. (2000) Improvement of chronic active hepatitis C in chronically infected chimpanzees after therapeutic vaccination with the HCV E1 protein. Acta Gastroenterol BeIg. 63:203). Dos chimpancés infectados crónicamente con VHC recibieron 9 dosis de 50 μg de proteína E1 recombinante. La vacunación mejoró Ia histología hepática, determinó Ia desaparición de los antígenos virales del hígado y disminuyó los niveles de alanina aminotransferasa (ALT). Aunque los niveles de ARN viral en suero no cambiaron durante el tratamiento, reaparecieron Ia inflamación hepática y los antígenos virales después de concluir el tratamiento. Se observó una asociación entre los altos niveles de anticuerpos contra E1 y el mejoramiento de Ia enfermedad (Maertens et al. (2000) Improvement of chronic active hepatitis C ¡n chronically infected chimpanzees after therapeutic vaccination with the HCV E1 protein. Acta Gastroenterol. BeIg. 63:203). Particularmente, Ia formación de partículas semejantes a virus (Liang et al. US 6,387,662) a partir de proteínas recombinantes y su empleo como vacunas resulta muy atractiva porque estas formaciones simulan con frecuencia propiedades de los virus. Partículas de esta naturaleza, obtenidas a partir de células de insecto infectadas con un baculovirus recombinante conteniendo Ia secuencia de los antígenos de Ia región estructural del VHC, han sido capaces de generar una respuesta inmune tanto humoral como celular contra estos antígenos (Baumert et al. (1999) Hepatitis C virus-like partióles synthesized in insect cells as a potential vaccine candidate. Gastroenterology 117:1397-407; Lechmann et al. (1999) Induction of humoral and cellular immune responses in mice by immunization with insect-cell derived HCV-like particles. Hepatology 30:423-29). Por otra parte, diferentes vectores virales recombinantes han sido evaluados en el desarrollo de una vacuna recombinante contra el VHC. Particularmente los adenovirus recombinantes defectivos son candidatos atractivos debido a su hepatotropismo, su potencia para inducir inmunidad tanto humoral como celular y Ia posibilidad de ser administrados tanto parenteral como oralmente. Adenovirus recombinantes conteniendo los genes codificantes para las proteínas estructurales del VHC inducen una respuesta de anticuerpos contra cada una de estas proteínas (Makimura et al. (1996) Induction of antibodies against structural proteins of hepatitis C virus in mice using recombinant adenovirus. Vaccine 14:28-36). Además, después de inmunizar ratones con adenovirus recombinantes para el antígeno de Ia cápsida y E1, se detecta una respuesta de tipo T citotóxica específica contra estos antígenos (Bruña-Romero et al. (1997) Induction of cytotoxic T-cell response against hepatitis C virus structural antigens using a defective recombinant adenovirus. Hepatology 25:470-77). Aunque estos resultados han sido alentadores, los problemas recientes con el uso de adenovirus recombinantes en terapia génica han creado incógnitas sobre su uso en humanos. El empleo de otros virus recombinantes de tipo vaccinia, conteniendo diferentes genes del VHC han inducido fuertes respuestas de tipo T citotóxicas y auxiliadoras en ratones (Shirai et al. (1994) An epitope in hepatitis C virus core región recognized by cytotoxic T cells in mice and humans. J. Virol. 68:3334-42; Large et al. (1999) Suppression of host immune response by the core protein of hepatitis C virus: possible implications for hepatitis C virus persistence. J. Immunol. 162:931-38). Sin embargo, estos virus recombinantes, así como otras variantes de alfa virus como el Semliki Forest Virus (Vidalin et al. (2000) Use of conventional or replicating nucleic acid-based vaccines and recombinant Semliki forest virus-derived particles for the induction of immune responses against hepatitis C virus core and E2 antigens. Vaccine 276:259-270) se ven afectadas por las cuestiones regulatorias y de seguridad relacionadas con su aplicación. La identificación de varios epitopos para células T CD4+ y CD8+ en Ia poliproteína viral del VHC que pudieran ser importantes en Ia clarificación viral, apoyan Ia estrategia de usar péptidos sintéticos como candidatos vacunales contra este patógeno (Berzofsky et al. US 5,980,899). Diferentes péptidos solos o lipidados, conteniendo epitopos del antígeno de Ia cápsida, NS4 y NS5, han inducido una fuerte respuesta de tipo T citotóxica en ratones (Shirai et al. (1996) Use of intrinsic and extrinsic helper epitopes for in vivo induction of anti-hepatitis C virus cytotoxic T lymphocytes (CTL) with CTL epitope peptide vaccines. J. Infecí Dis. 173:24-31; Hiranuma et al. (1999) Helper T cell determinant peptide contributes to induction of cellular immune responses by peptide vaccines against hepatitis C virus. J. Gen. Virol. 80:187-193; Oseroff et al. (1998) Pools of lipidated HTL-CTL constructs prime for múltiple HBV and HCV CTL epitope responses. Vaccine, 16:823-833).
Otra estrategia usada para desarrollar una vacuna contra el VHC se fundamenta en Ia posibilidad de generar Ac contra epitopos lineales. Esta alternativa ha sido evaluada fundamentalmente para generar Acs contra Ia región hipervariable 1 (RHV-1) del VHC, con algunos resultados alentadores en conejos y chimpancés (Esumi et al. (1999) Experimental vaccine activities of recombinant E1 and E2 glycoproteins and hypervariable región 1 peptides of hepatitis C virus in chimpanzees. Arch Virol. 144:973-980; Shang et al. (1999) Broadly cross-reactive, high-affinity antibody to hypervariable región 1 of the hepatitis C virus in rabbits. Virology 258:396-405). El principal problema de seleccionar Ia RHV como el blanco para una vacuna contra el VHC está en Ia existencia de quasi-species en esta región del genoma.
El principal obstáculo para el enfoque de vacunas peptídicas radica en que aquellos péptidos sin función auxiliadora pueden ser pobres inmunógenos; además con frecuencia Ia efectividad de una vacuna se basa en Ia inducción de una respuesta multivalente de amplio espectro contra diferentes antígenos. Estas limitaciones representan debilidades de esta estrategia.
La inmunización con ADN ha sido ampliamente estudiada en el desarrollo de vacunas contra el VHC (Donnelly et al. US 6,653,125). La proteína de Ia cápsida ha sido incluida en diferentes vectores de expresión para variantes totales o truncadas de Ia misma (Lagging et al. (1995) Immune responses to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus core protein. J. Virol. 69:5859-5863; Chen et al. (1995) Genetic immunization of mice with plasmid containing hepatitis C virus core protein-encoding DNA. Vaccine Res. 4:135-144). Otras construcciones incluyen además Ia región 5' no traducida (Tokushige et al. (1996) Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs. Hepatology 24:14-20). Se han probado variantes fusionadas al antígeno de superficie del VHB y a otros antígenos de Ia envoltura del virus (Major et al. (1995) DNA-based immunization with chimeric vectors for the induction of the immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid. J. Virol. 69:5798-805). La inmunización con estos vectores generalmente ha inducido respuestas linfoproliferativas y de linfocitos T citotóxicos detectables.
Las proteínas de Ia envoltura del VHC han constituido también blancos de interés para este tipo de tecnología. En el caso de Ia E2, Ia respuesta humoral parece estar dirigida principalmente a Ia RHV-1 (Lee et al. (1998) Hepatitis C virus envelope DNA-based ¡mmunization elicits humoral and cellular immune responses. Mol. CeIIs 8:444-451). Cuando se ha inmunizado con vectores codificantes para variantes secretables de las proteínas E1 y E2 no se han obtenido diferencias en Ia respuesta inmune al comparar con las variantes secretadas (Lee et al. (1998) Optimal induction of hepatitis C virus envelope-specific immunity by bicictronic plasmid DNA inoculation with the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene. J. Virol. 72:8430-8436). La inoculación con plasmidios bicistrónicos que expresan independientemente los genes del GM-CSF y de las proteínas E1 y E2 generan respuesta inmune tanto humoral como celular incrementada. Recientemente se investigó el efecto inmunogénico de estas proteínas cuando se incluían ambas en vectores bicistrónicos en los cuales se potenciaba o eliminaba Ia posibilidad de que ellas expresadas In vivo formaran heterodímeros. Se comprobó que cuando se formaban dichos complejos no se obtenía respuesta de anticuerpos. En agudo contraste, altos títulos de anticuerpos dirigidos a determinantes tanto conformacionales como lineales se obtuvieron cuando se inmunizó usando plasmidios expresando variantes truncadas de ambas proteínas estructurales. Por tanto, parece necesario evitar Ia formación de los heterodímeros para obtener una buena respuesta de anticuerpos cuando se inmuniza con construcciones que incluyan dichos antígenos (Fournillier et al. (1999) Expression of noncovalent hepatitis C virus envelope E1-E2 complexes is not required for the induction of antibodies with neutralizing properties following DNA immunization. J. Virol. 73:497- 504).
Las proteínas no estructurales han sido también evaluadas por esta tecnología. La región codificante para el dominio C-terminal de Ia proteína NS3 se incluyó en un vector que permite Ia expresión simultánea e independiente de dicho dominio y Ia IL- 2, obteniéndose buenos resultados (Papa et al. (1998) Development of multigenetic plasmid vector for HCV DNA ¡mmunization. Res. Virol. 149:315-319). Las proteínas NS4 y NS5 también generan respuestas de linfocitos T citotóxicos y de Acs por esta vía (Encke et al. (1998) Genetic immunization generates cellular and humoral ¡mmune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis C virus in murine model. J. Immunol. 161:4917-4923). Recientemente se comprobó que Ia utilización de una construcción que codificaba para las proteínas no estructurales del virión (NS3, NS4 y NS5 incluyendo los genes codificantes para el GM-CSF) producía una respuesta de anticuerpos potente y además un incremento en Ia respuesta de tipo T proliferativa para cada proteína no estructural (Cho et al. (1999) Enhanced cellular immunity to hepatitis C virus nonstructural proteins by codelivery of granulocyte macrophage-colony stimulating factor gene ¡n intramuscular DNA immunization. Vaccine 17:1136-1144). En sentido general, se ha reportado Ia expresión efectiva, así como Ia generación de Acs contra los diferentes antígenos del VHC en niveles cuyo rango oscila entre 1:100 y 1:100 000 según Ia combinación en estudio (Inchauspe et al. (1997) DNA vaccination for the induction of immune responses against hepatitis C virus proteins. Vaccine 15:853-856). Ha sido comprobado adicionalmente el desarrollo de citotoxicidad y linfoproliferación específicas (Inchauspe et al. (1997) Plasmid DNA expresing a secreted or a nonsecreted form of hepatitis comparative studies of antibody and T-helper responses following genetic immunization. DNA and CeII Biology 16:185-195). Sin embargo, es necesario mejorar esta metodología con el fin de alcanzar respuestas inmunes verdaderamente fuertes tanto humorales como celulares contra diferentes proteínas del VHC. En este sentido, se han evaluado algunas variantes para incrementar Ia respuesta inmune inducidas después de Ia vacunación con ADN como son el empleo de liposomas (Gramzinski et al. (1998) Immune response to a hepatitis B DNA vaccine in Aotus Monkey: A comparison of vaccine formulation, route and method of administration. Mol. Medicine 4:109-118), de monofosforil lípido A y Ia saponina QS-21 (Sasaki et al. (1998) Induction of systemic and mucosal immune responses to human immunodeficieny virus type 1 by a DNA vaccine formulated with QS-21 saponin adjuvant via intramuscular and intranasal routes. J. Virol. 72:4931-4939) como adyuvantes. También se han estudiado las células dendríticas como adyuvantes biológicos en Ia inmunización con ADN. Se han utilizado vacunas consistentes en células dendríticas (CD) derivadas de médula de ratón modificadas genéticamente ex vivo, para expresar antígenos tumorales usando vectores virales (Specht et al. (1997) Dendritic cells retrovirally transduced with a model antigen gene are therapeutically effective against established pulmonary metastases. J. Exp. Med. 186:1213-1221; Brossart et al. (1997) Virus-mediated delivery of antigenic epitopes into dendritic cells as a means to induce CTL. J. Immunol. 158:3270-3276; Song et al. (1997) Dendritic cells genetically modified with an adenovirus vector encoding the cDNA for a model antigen induce protective and therapeutic antitumor immunity. J. Exp. Med. 186:1247-1256), o ARN (Boczkowski et al. (1996) Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo. J. Exp. Med. 184:465-472), y se ha comprobado su capacidad de promover respuestas de células T antígeno tumoral específica e inmunidad profiláctica mediada por células contra tumores en ratón. Actualmente, el mejoramiento de los vectores, incluyendo Ia inserción de motivos CpG para aumentar Ia respuesta inmune contra los antígenos expresados (Hasan et al. (1999) Nucleic acid inmunization: concepts and techniques associated with third generation vaccines. J. Immunol. Meth. 229:1-22), y de los sistemas de liberación del plasmidio son objetivos de estudio cruciales para vencer las limitaciones de esta tecnología.
Debido a los retos que plantea Ia infección por el VHC, y a Ia ausencia de una definición clara de los parámetros inmunológicos que correlacionan con Ia protección contra este patógeno, es posible que una vacuna efectiva contra el VHC requiera un enfoque multicompuesto que estimule varios aspectos de Ia respuesta inmune. Probablemente Ia solución de este problema radique en Ia combinación de varios de los enfoques vacunales explorados hasta el momento. En este sentido han sido evaluados esquemas que combinan dosis con una vacuna de ADN y dosis de refuerzo con proteínas o vectores virales recombinantes (Hu et al. (1999) Characterization of the humoral and cellular immune responses against hepatitis C virus core induced by DNA-based immunization. Vaccine 17:3160-3170; Pancholi et al. (2000) DNA prime-canarypox boost with polycistronic hepatitis C virus (HCV) genes generates potent immune responses to HCV structural and nonstructural proteins. J. Infecí Dis. 182:18-27) con resultados que aunque positivos requieren investigaciones adicionales para demostrar si Ia combinación de modalidades puede realmente inducir una inmunidad protectora contra el VHC.
Adicionalmente, para el modelo de hepatitis B, ha sido evaluada Ia composición vacunal integrada por el complejo formado por el antígeno de superficie, un anticuerpo contra este antígeno, y un plasmidio que codifica para este antígeno (Wen et al. US 6,221 ,664 ). Esta formulación permitió Ia presentación antigénica por varias vías y una rápida inducción de respuesta inmune que fue superior a Ia generada por las variantes individuales. Así el desarrollo de vacunas eficaces es crítico y, a pesar de éxitos notables, es todavía una tarea en curso. En Ia presente invención se describe una composición vacunal compuesta por los antígenos estructurales del virus de Ia Hepatitis C. A diferencia de las composiciones proteicas descritas anteriormente donde solo se utilizaban las proteínas E1 y E2 combinadas o solas, en nuestra composición también se incluye Ia proteína de Ia cápsida del virus. La flexibilidad de nuestra composición radica en los rangos de cantidades de antígeno a usar en Ia preparación Io cual permite, adicionalmente, generar respuestas (humoral y celular) potentes contra antígenos diferentes de forma simultánea y una respuesta protectora al reto en modelo murino con virus vaccinia recombinante.
Explicación de Ia invención Esta claro a partir de Ia literatura que hay una necesidad urgente de desarrollar vacunas confiables y agentes terapéuticos eficaces para VHC. Por Io tanto, Ia presente invención apunta al suministro de una composición vacunal compuesta por Ia mezcla de los antígenos estructurales del virus de Ia Hepatitis C. En este caso Ia proteína de Ia cápsida, Ia proteína estructural E1 y Ia proteína estructural E2, son capaces de inducir inmunidad humoral y celular específica contra el VHC, aún (pero no únicamente) en portadores crónicos del VHC.
La novedad de Ia invención está dada por Ia obtención de un rango de relaciones de antígenos y el efecto protector que se obtiene tras Ia inmunización de las mezclas en estudio. Los antígenos en estudio resultan blancos vacunales atractivos mediante los cuales puede generarse una respuesta inmune contra el VHC.
En una realización particular, Ia composición vacunal utiliza un rango de relaciones de los antigenos presentes que se enmarca entre [(1 ,5-2,5):(1-2,5):(1-2)] para Ia proteína de Ia cápsida, E1 y E2 respectivamente, para generar una respuesta humoral óptima. En otra realización, los antígenos proteicos se usan en una relación de (1 ,5:1,1:1) para Ia Proteína de Ia cápsida, E1 y E2 respectivamente.
En una materialización de Ia invención la composición vacunal utiliza un rango de relaciones de los antigenos presentes que se enmarca entre [(1:50):(120-180):(120- 180)] para Ia proteína de Ia cápsida, E1 y E2 respectivamente, para generar una respuesta celular óptima. En otra materialización, los antígenos proteicos se usan en una relación de (1:160:160) para Ia proteína de Ia cápsida, E1 y E2 respectivamente.
La composición vacunal de Ia presente invención puede ser administrada como un producto sólido, líquido o aerosol, por cualquier método conveniente para Ia administración de vacunas incluyendo oral y Ia inyección parenteral (ej. intravenoso, subcutáneo o intramuscular), además esta composición puede ser preparada por Ia mezcla de los antígenos proteicos y después adyuvarlos, o adyuvando los antígenos por separado y después mezclándolos. Los antígenos según esta invención pueden estar preparados de forma natural o mediante técnicas de ADN recombinante en cualquier sistema de expresión como esta documentado debajo.
En una materialización de Ia presente invención, las composiciones vacunales que comprenden esta invención pueden ser administradas en diferentes esquemas de inmunización.
De igual forma Ia inmunización con estas combinaciones antigénicas mezcladas con otros antígenos polisacarídicos (conjudagos o no) y/o virales y/o bacterianos generan una respuesta inmune resultante dirigida, por tanto, contra un amplio espectro de entidades infecciosas. En otra materialización de Ia presente invención, las composiciones vacunales comprenden combinaciones de los antígenos de Ia región estructural del Virus de Ia Hepatitis C, junto a plasmidios que codifiquen para antígenos de entidades infecciosas contra enfermedades virales y/o bacterianas. Las composiciones vacunales preferidas en esta invención, son preparaciones donde los antígenos virales empleados son el antígeno de Ia nucleocápsida y/o el antígeno de superficie del virus de Ia Hepatits B y como antígenos bacterianos las proteínas de Ia membrana externa de N. meningitidis como preparado vacunal o cualquiera de las proteínas que conformen Ia misma, así mismo se pueden emplear antígenos polisacarídicos conjugados o no a proteínas portadoras como principios activos de formulaciones contra entidades bacterianas.
Las composiciones vacunales descritas aquí pueden ser administradas en esquemas combinados con otros candidatos vacunales basados en vacunas de ADN, vectores vivos recombinantes, péptidos y proteínas. Además pueden ser utilizadas para inducir inmunidad contra el VHC en pacientes con hepatitis C crónica, cirrosis y cáncer de hígado.
Breve descripción de los dibujos Figura 1 : Respuesta de anticuerpos contra las proteínas estructurales del VHC evaluadas por ELISA, (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1, (C) contra Ia proteína E2.
Figura 2: Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC, a partir de esplenocitos de los ratones inmunizados con las combinaciones en estudio. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en
Escherichia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastoris, E1-coli, E1 producida en Escherichia coli.
Figura 3: Respuesta funcional de las preparaciones en estudio evaluada frente al reto con virus vaccinia recombinante. Figura 4: Análisis de Ia influencia sobre (A) Respuesta de anticuerpos, (B)
Respuesta linfoproliferativa, (C) Reto con virus vaccinia recombinante, de los componentes presentes en Ia preparación vacunal.
Figura: 5: Evaluación de Ia influencia del rango de relaciones a utilizar en Ia preparación vacunal proteica contra VHC, para respuesta de anticuerpos (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1, (C) contra Ia proteína
E2.
Figura: 6: Evaluación de Ia influencia del rango de relaciones a utilizar en Ia preparación vacunal sobre Ia respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC, a partir de esplenocitos de los ratones inmunizados. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en Escherichia coli,
E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastoris, E1-coli, E1 producida en
Escherichia coli.
Figura: 7: Influencia del rango de relaciones a utilizar en Ia preparación vacunal sobre Ia respuesta funcional evaluada frente al reto con virus vaccinia recombinante en ratones inmunizados.
Figura: 8: Respuesta de anticuerpos contra las proteínas estructurales del VHC evaluadas por ELISA, (A) contra el antígeno de la cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1 , (C) contra Ia proteína E2, tras Ia inmunización a diferentes intervalos de tiempos (diferentes esquemas de inmunización).
Figura: 9: Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC, a partir de esplenocitos de los ratones inmunizados con diferentes esquemas. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en
Escherichia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastorís, E1-coli, E1 producida en Escherichia coli.
Figura: 10: Respuesta funcional frente al reto con virus vaccinia recombinante tras
Ia inmunización a diferentes intervalos de tiempo, Figura: 11 : Respuesta de anticuerpos contra las proteínas estructurales del VHC evaluadas por ELISA, (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1, (C) contra Ia proteína E2, tras Ia inmunización con el preparado vacunal contra VHC por diferentes rutas.
Figura: 12: Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC, a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con preparaciones vacunales proteicas contra VHC, suministradas por diferentes rutas. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en Escherichia coli, E2-lev,
E2 producida en Ia levadura Pichia pastorís, E1-coli, E1 producida en Escherichia coli. Figura: 13: Respuesta funcional de las preparaciones en estudio evaluada frente al reto con virus vaccinia recombinante en ratones inmunizados con preparaciones proteicas contra VHC suministradas por diferentes rutas.
Figura: 14: Respuesta de anticuerpos contra las proteínas estructurales del VHC evaluadas por ELISA, (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína EI1 (C) contra Ia proteína E2, para analizar Ia influencia de diferentes adyuvantes en Ia respuesta humoral.
Figura: 15: Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC, a partir de esplenocitos de ratones inmunizados para Ia evaluación de diferentes adyuvantes. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en Escherichia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastorís,
E1-coli, E1 producida en Escherichia coli.
Figura: 16: Respuesta funcional frente al reto con virus vaccinia recombinante tras Ia inmunización de ratones para el estudio de diferentes adyuvantes. Figura: 17; Respuesta de anticuerpos, (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1, (C) contra Ia proteína E2, contra (D) HBsAg y (E) HBcAg evaluadas por ELISA, tras Ia inmunización con Ia mezcla del preparado vacunal contra VHC y antígenos virales. Figura: 18: Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC (proteína de Ia cápsida, E1, E2), HBsAg y HBcAg, a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con combinaciones del preparado vacunal contra VHC y antígenos virales. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en Escherichia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastoris, E1-coli, E1 producida en Escherichia coli.
Figura: 19: Respuesta funcional frente al reto con virus vaccinia recombinante tras Ia inmunización de ratones con combinación del preparado vacunal contra VHC y antígenos virales. Figura: 20: Respuesta de anticuerpos, (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1, (C) contra Ia proteína E2 y (D) contra proteínas de Ia membrana externa de N. meningitidis, evaluadas por ELISA, tras Ia inmunización con Ia mezcla del preparado vacunal contra VHC y antígenos bacterianos (proteínas de Ia membrana externa de Neisseria meningitidis). Figura: 21 : Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC (proteína de Ia cápsida, E1, E2) y proteínas de Ia membrana externa de N. meningitidis, a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con combinaciones del preparado vacunal contra VHC y antígenos bacterianos (PME, proteínas de Ia membrana externa de Neisseria meningitidis). HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en Escherichia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastoris, E1-coli, E1 producida en Escherichia coli.
Figura: 22: Respuesta funcional frente al reto con virus vaccinia recombinante tras Ia inmunización de ratones con combinación del preparado vacunal contra VHC y antígenos bacterianos (proteínas de Ia membrana externa de Neisseria meningitidis). Figura: 23: Respuesta de anticuerpos, (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1, (C) contra Ia proteína E2 y (D) contra el polisacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis, evaluadas por ELISA, tras Ia mezcla del preparado vacunal contra VHC y un polisacárido capsular conjugado. Figura: 24: Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC (proteína de Ia cápsida, E1, E2) a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con Ia mezcla del preparado vacunal contra VHC y un polisacárido capsular conjugado. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en Escheríchia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastoris, E1-coli, E1 producida en Escheríchia coli.
Figura: 25: Respuesta funcional frente al reto con virus vaccinia recombinante tras Ia inmunización de ratones con Ia mezcla del preparado vacunal contra VHC y un polisacárido capsular conjugado. Figura: 26: Respuesta de anticuerpos, (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1 , (C) contra Ia proteína E2, (D) contra HBsAg, y (E) contra HBcAg, tras Ia mezcla del preparado vacunal contra VHC y plasmidios codificantes para HBsAg y HBcAg. Figura: 27: Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC (proteína de Ia cápsida, E1, E2), HBsAg y HBcAg, a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con combinaciones del preparado vacunal contra VHC y plasmidios codificantes para HBsAg y HBcAg. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coli, E2 producida en Escheríchia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastoris, E1-coli, E1 producida en Escheríchia coli. Figura: 28: Respuesta funcional frente al reto con virus vaccinia recombinante tras Ia inmunización de ratones con combinación del preparado vacunal contra VHC y plasmidios codificantes para HBsAg y HBcAg.
Figura: 29: Respuesta de anticuerpos, (A) contra el antígeno de Ia cápsida del VHC, (B) contra Ia proteína E1 , (C) contra Ia proteína E2, tras Ia inmunización de ratones con combinaciones de ADN y dosis refuerzo con preparación proteica del VHC.
Figura: 30: Respuesta linfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructura! del VHC (proteína de Ia cápsida, E1, E2), a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con combinaciones de ADN y dosis refuerzo con preparación proteica del VHC. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC1 E2-coli, E2 producida en Escheríchia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastoris, E1-coli, E1 producida en Escheríchia coli. Figura: 31: Respuesta funcional frente al reto con virus vaccinia recombinante tras Ia inmunización de ratones con combinaciones de ADN y dosis refuerzo con preparación proteica VHC. Figura: 32: Respuesta de anticuerpos contra las proteínas estructurales del VHC (proteína de Ia cápsida, E1, E2), tras Ia inmunización de ratones con diferentes formas de conformar Ia preparación vacunal.
Figura: 33: Respuesta Iinfoproliferativa contra las proteínas de Ia región estructural del VHC (proteína de Ia cápsida, E1, E2), a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con diferentes formas de conformar Ia preparación vacunal contra el VHC. HCcAg, antígeno de Ia cápsida del VHC, E2-coIi, E2 producida en Escherichia coli, E2-lev, E2 producida en Ia levadura Pichia pastoris, E1-coli, E1 producida en Escherichia coli.
Figura: 34: Respuesta funcional frente al reto con virus vaccinia recombinante tras Ia inmunización de ratones con diferentes formas de conformar Ia preparación vacunal.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos Ejemplo 1: Respuesta de anticuerpos, Iinfoproliferativa y frente al reto con virus vaccinia recombinante en ratones inmunizados con preparación vacunal proteica del VHC.
Con el objetivo de demostrar Ia generación de una respuesta inmune específica y funcional contra el VHC tras Ia administración del preparado vacunal, los antígenos de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC, después de ser mezclados y adyuvados en alúmina (AIOH3) fueron inoculados por vía intraperitoneal a ratones hembras BALB/c (10 por grupo). El esquema incluyó 3 inoculaciones en los días 0, 7, 14. El estudio de Ia respuesta humoral y celular (respuesta linfoproliferativa), así como protección contra reto contra virus vaccinia recombinante vRE (el cual contiene las proteínas de Ia región estructural del VHC), se realizó 15 días después de Ia última inmunización. La relación de los grupos en estudio se muestra en Ia Tabla 1. Tabla 1. Preparación de los inmunógenos a utilizar en el ensayo.
Figure imgf000016_0001
La respuesta de anticuerpos fue determinada mediante un ensayo inmuno- enzimático (ELISA) contra las proteínas de Ia región estructural del VHC. El análisis de varianza de rangos múltiples y el post-test Kruskal-Wallis fue empleado para analizar estadísticamente los resultados, p<0,05 fue considerada una diferencia estadísticamente significativa. En Ia Figura 1 se muestra que es posible obtener una respuesta de anticuerpos contra los tres antígenos de Ia región estructural de VHC cuando se administran en relaciones determinadas. Algunas combinaciones rindieron altos títulos de Ac contra las proteínas de Ia envoltura del VHC, E1 y E2, estadísticamente superiores a los obtenidos por los grupos controles, donde se emplearon las proteínas independientes y ratones inmunizados con adyuvante solamente. La determinación de respuesta linfoproliferativa contra los antígenos de Ia región estructural, E1 y E2 del VHC (Figura 2) mostró un comportamiento característico para cada combinación, los cuales fueron utilizados posteriormente para el cálculo de Ia variante óptima a emplear, para generar una respuesta celular. Los resultados se muestran como el índice de estimulación de células de bazo de animales inmunizados, calculado por Ia incorporación de Tim¡d¡ta-(H3). Los grupos experimentales representados en Ia Figura 2 corresponden con los que se muestran en la Tabla 1, adicionando otro control negativo (grupo 17) correspondiente a ratones no inmunizados.
La respuesta funcional de las preparaciones en estudio se evalúo, frente al reto con vRE. Los animales fueron retados 15 días después de culminado el esquema de inmunización con 106 ufp del vRE, por vía i.p. y Ia presencia del virus en los ovarios de los ratones evaluada 5 días después de Ia inoculación viral. En Ia Figura 3 se muestran los resultados obtenidos, donde del grupo 13, mostró una reducción del título viral de 2 Log con relación al grupo control negativo. Los grupos experimentales representados en Ia Figura 3 corresponden con los que se muestran en Ia Tabla 1, ei control negativo (grupo 17) correspondió a ratones inmunizados con hidróxido de aluminio.
Haciendo un análisis de Ia superficie de respuesta generada tras Ia funcionalidad de las variables empleadas (respuesta de anticuerpos, respuesta linfoproliferativa, reto con virus vacciniá) (Figura 4), se seleccionaron relaciones óptimas de antígenos, para obtener el máximo de respuesta para cada una de las variables. Para Ia respuesta de anticuerpos Ia relación óptima de antígenos a utilizar se corresponde con (1 ,5:1, 1:1): (Proteína de ia cápsida:E1:E2), mientras que para obtener el máximo de respuesta celular Ia relación óptima de antígenos a utilizar es (1:160:160):(Proteína de Ia cápsida:E1:E2). Ejemplo 2: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC en diferentes rangos de relaciones.
Con el objetivo de evaluar el rango de antígenos a ser utilizados en el preparado vacunal para obtener una óptima respuesta inmune, ratones BALB/c fueron inmunizados i.p., en el mismo régimen descrito en el ejemplo 1 , con las proporciones de los antígenos de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC según se muestra en Ia Tabla 2. Las cantidades utilizadas para cada antígeno fueron el resultado del análisis de los gráficos de superficie de respuesta del ejemplo 1. Para respuesta humoral, los rangos de relaciones estudiados fueron: [(1 ,5-2,5):(1-2,5):(1- 2)]:[Proteína de Ia cápsida:E1:E2], mientras que para Ia respuesta celular los rangos de relaciones estudiados fueron: [(1:50):(120-180):(120-180)]: [Proteína de Ia cápsida:E1 :E2]. Tabla 2. Preparación de los inmunógenos a utilizar en el ensayo.
Figure imgf000018_0001
La respuesta de anticuerpos contra las proteínas estructurales del VHC se muestra en Ia Figura 5 indicando que las relaciones en estudio generan una respuesta de anticuerpos contra el antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC. A pesar de las variaciones en Ia respuesta de anticuerpos observadas para cada antígeno, no se encontró diferencia estadísticamente significativa entre las mismas para cada una de las variantes (variante óptima de respuesta celular y variante óptima para Ia respuesta humoral, respectivamente). Los grupos experimentales representados en Ia Figura 5 corresponden con los que se muestran en Ia Tabla 2.
El estudio de Ia respuesta linfoproliferativa, se evaluó por Ia incorporación de timidita-3H, después de Ia estimulación de las células del bazo de los ratones inmunizados. Los ratones inmunizados mostraron generar una respuesta linfoproliferativa contra los antígenos en estudio, según se muestra en Ia Figura 6. Los grupos experimentales representados en Ia Figura 6 corresponden con los que se muestran en Ia Tabla 2, adicionando otro control negativo (grupo 17) correspondiente a ratones no inmunizados. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los índices de estimulación obtenidos para cada una de las variantes en estudio (variante óptima de respuesta celular y variante óptima para Ia respuesta humoral, respectivamente). Los ratones inmunizados fueron retados con 106 ufp del virus vRE, por vía i.p. y Ia presencia del virus en los ovarios de los ratones evaluada 5 días después de Ia inoculación viral. La Figura 7 muestra los niveles de protección alcanzados, donde la reducción de carga viral es significativa en los ratones inmunizados con las mezclas de proteínas en los rangos en estudio (aproximadamente 2,5 Log de título viral), fundamentalmente en Ia variante óptima para respuesta celular. Los grupos experimentales representados en Ia Figura 7 corresponden con los que se muestran en la Tabla 2, adicionando otro control negativo (grupo 17) correspondiente a ratones no inmunizados. Ejemplo 3: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC suministradas en diferentes esquemas de inmunización.
Con el objetivo de analizar Ia influencia del tiempo entre las inmunizaciones en el desarrollo de Ia respuesta inmune, ratones hembras BALB/c fueron inmunizados i.p. a diferentes intervalos de tiempo, con Ia preparación para generar Ia respuesta celular óptima, según referido en el ejemplo 1. El esquema de inmunización para el grupo 1, fue en las semanas 0, 1, 2. El esquema de inmunización para el grupo 2 fue de 0, 2, 4 semanas. El esquema de inmunización para el grupo 3, fue de 0, 3, 6 semanas y para el grupo 4 fue de 0, 4, 8 semanas. Los títulos de anticuerpos contra las proteínas de Ia cápsida del VHC, E1 y E2 fueron evaluados por ELISA y se reportan en Ia Figura 8. Como se observa no hubo diferencias estadísticamente significativas en el título de los ratones inmunizados cuando estos fueron evaluados 15 días después de Ia última inmunización contra E1 y E2. Contra el antígeno de Ia cápsida se encontraron diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon los regímenes de inmunización 0, 1, 2 semanas (grupo 1) y los restantes empleados.
La respuesta linfoproliferativa de los ratones inmunizados fue evaluada 15 días después de terminado el esquema de inmunización para cada grupo. De igual forma, no hubo diferencias en los índices de estimulación entre los grupos en estudio para cada una de ías variantes. La Figura 9 muestra los resultados obtenidos, donde también se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 5), correspondiente a ratones no inmunizados.
La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó como se describe anteriormente en otros ejemplos. 106 ufp del vRE fueron administradas 15 días después de terminado cada grupo de inmunización y 5 días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La Figura 10, muestra los resultados obtenidos, donde se observó que no hubo diferencias estadísticamente significativas en los resultados obtenidos entre los diferentes esquemas de inmunización. En esta figura también se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 5), correspondiente a ratones no inmunizados. Ejemplo 4: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC administradas por diferentes rutas. La administración del preparado vacunal en estudio a través de diferentes rutas de inmunización fue uno de los aspectos también estudiados. Ratones hembras BALB/c fueron inmunizados con las preparaciones para generar las respuestas tanto celular como humoral óptimas por vía: Grupo 1 : Preparación óptima para respuesta humoral por vía subcutánea (s.c), Grupo 2: Preparación óptima para respuesta humoral por vía Lp., Grupo 3: Preparación óptima para respuesta humoral por vía intramuscular (Lm.), Grupo 4: Preparación óptima para respuesta humoral por vía ¡ntra-nasal (Ln.), Grupo 5: Preparación óptima para respuesta celular por vía s.c, Grupo 6: Preparación óptima para respuesta celular por vía Lp., Grupo 7: Preparación óptima para respuesta celular por vía Lm., Grupo 8: Preparación óptima para respuesta celular por vía i.n. La respuesta de anticuerpos se estudió 15 días después de terminado el esquema de inmunización (0, 1 , 2 semanas) contra los 3 antígenos que forman parte de Ia región estructural del VHC (antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC). Los resultados obtenidos muestran que a pesar de existir diferencias entre los niveles de Ac, se generó una respuesta específica contra los antígenos empleados. Estas diferencias son debido al esquema de inmunización empleado, donde se favorece Ia generación de respuesta de anticuerpos para algunas variantes de inmunización por Ia cinética de generación de Ia respuesta inmune. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos cuando se utilizó las vías s.c, i.p. e i.m. Sin embargo, los resultados fueron superiores al utilizar Ia ruta i.p., e inferiores con diferencias estadísticamente significativas al utilizar Ia ruta Ln. Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 11.
La respuesta linfoproliferativa de los ratones inmunizados en el esquema fue evaluada contra los antígenos virales, 15 días después de terminado el esquema de inmunización. De igual forma que para Ia respuesta de anticuerpos las diferencias en los índices de estimulación entre los grupos en estudio se adjudican a Ia cantidad de antígeno utilizado, para Ia ruta i.n., y Ia cinética de generación de Ia respuesta inmune de forma general para todas las rutas de inmunización. Se generó una respuesta inmune linfoproliferativa específica para cada antígeno, no obstante los índices de estimulación para Ia vía i.n. fueron estadísticamente inferiores en comparación con las otras vías. La Figura 12 muestra los resultados obtenidos. En este experimento también se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 9), correspondiente a ratones no inmunizados. La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó inoculando 106 ufp del vRE 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Cinco días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La Figura 13, muestra los resultados obtenidos, donde se observó que no hubo diferencias entre los diferentes esquemas de inmunización, aunque en Ia vía i.n. se observó Ia reducción de 1 Log del título viral. En este experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 9), correspondiente a ratones no inmunizados.
Ejemplo 5: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC empleando diferentes adyuvantes.
EL uso de adyuvantes para amplificar Ia respuesta inmune generada por Ia preparación vacunal fue uno de los aspectos también estudiados. Ratones hembras BALB/c fueron inmunizados Lp. con las preparaciones para generar las respuestas tanto celular como humoral óptimas adyuvados con: Grupo 1: Variante óptima para respuesta humoral adyuvada con hidróxido de aluminio (Alúmina (AIOH3)), grupo 2: Variante óptima para respuesta humoral adyuvada con fosfato de aluminio, grupo 3: Variante óptima para respuesta humoral adyuvada con Adyuvante de Freund, grupo 4: Variante óptima para respuesta humoral adyuvada con adyuvante oleoso (Montanide ISA 51), grupo 5: Variante óptima para respuesta humoral sin adyuvante, grupo 6: Variante óptima para respuesta celular adyuvada con hidróxido de aluminio (Alúmina (AIOH3)), grupo 7: Variante óptima para respuesta celular adyuvada con fosfato de aluminio, grupo 8: Variante óptima para respuesta celular adyuvada con Adyuvante de Freund, grupo 9: Variante óptima para respuesta celular adyuvada con adyuvante oleoso (Montanide ISA 51), grupo 10: Variante óptima para respuesta celular sin adyuvante. La respuesta de anticuerpos se estudió 15 días después de terminado el esquema de inmunización (0, 1, 2 semanas) contra los 3 antígenos que forman Ia región estructural del VHC (antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC). Los resultados obtenidos muestran que a pesar de existir diferencias entre los niveles de anticuerpos generados se obtuvo una respuesta específica contra los antígenos empleados. Los niveles de anticuerpos fueron similares cuando las variantes fueron adyuvadas tanto con hidróxido de aluminio así como con fosfato de aluminio. Los mayores niveles de anticuerpos, se obtuvieron al emplear adyuvante de Freund en las preparaciones vacunales y posteriormente en menor grado aquellas adyuvadas con Montanide ISA-51. Los menores niveles de anticuerpos obtenidos fue cuando no se utilizó adyuvante en las preparaciones vacunales, aunque si se generó una respuesta antígeno específica. Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 14. La respuesta linfoproliferativa en las células del bazo de los ratones inmunizados fue evaluada contra los antígenos virales de Ia región estructural, 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Los mayores índices de linfoproliferación se obtuvieron para Ia variante celular adyuvada con Freund y Montanide ISA-51 , respectivamente. Los índices de linfoproliferación para las variantes donde se utilizó tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio fueron similares. Los menores niveles de respuesta celular se obtuvieron cuando Ia preparación vacunal fue suministrada a los ratones en ausencia de adyuvante. La Figura 15 muestra los resultados obtenidos, incluyendo también otro grupo control negativo (Grupo 11), correspondiente a ratones no inmunizados. La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó inoculando 106 ufp del vRE 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Cinco días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La Figura 16, muestra los resultados obtenidos, en Ia cual se incorporó otro grupo control negativo (Grupo 11), correspondiente a ratones no inmunizados. En esta Figura se observa una reducción de 1 ,7 (variante óptima para respuesta humoral) y 2,4 (variante óptima para respuesta celular) del Log de título viral en los ratones inmunizados con adyuvante de Freund, así como de 1,9 (variante óptima para respuesta humoral) y 2,5 (variante óptima para respuesta celular) del Log de título para aquellos inmunizados con Montanide ISA- 51, respectivamente. En el caso de los ratones inmunizados con sales de aluminio, tanto hidróxido como fosfato Ia reducción en el Log del título viral en los ovarios de los ratones inmunizados y retados fue de 1,4 (variante óptima para respuesta humoral) y 2,1 (variante óptima para respuesta celular) órdenes de magnitud. Se observó una pequeña reducción en el título viral en aquellos ratones inmunizados sin adyuvante y después retados con el vRE.
Ejemplo 6: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC mezcladas con otros antigenos virales. La potenciación o generación de Ia respuesta inmune por otros antígenos virales (antígeno de superficie del virus de Ia Hepatitis B- HBsAg, antígeno de Ia cápsida del virus de Ia Hepatitis B-HBcAg) mezclados con Ia preparación vacunal contra VHC (preparación vacunal que genera respuesta celular óptima) en estudio fue evaluada tras Ia inmunización de ratones. Ratones BALB/c fueron inmunizados i.p. con: grupo 1- HBsAg-preparación vacunal, grupo 2- HBcAg-preparación vacunal, grupo 3-preparación vacunal, grupo 4- HBsAg, grupo 5- HBcAg. El esquema de inmunización empleado fue de 0, 2, 4 semanas y Ia respuesta inmune estudiada 15 días después de terminado el esquema de inmunización. La respuesta de anticuerpos se evaluó contra los 3 antígenos que forman la región estructural del VHC (antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC), así como contra HBsAg y HBcAg. Se observó una generación de Ia respuesta inmune antígeno específica. Se generaron anticuerpos contra los antígenos virales HBsAg y HBcAg. Aunque los niveles de anticuerpos contra HBcAg en el grupo 2 (HBcAg-preparación vacunal VHC) fueron ligeramente inferiores comparados contra el control (grupo 5- HBcAg), las diferencias obtenidas no fueron estadísticamente significativas. Contra HBsAg, los niveles de anticuerpos generados fueron superiores para el grupo 1 (HBsAg- preparación vacunal VHC) con respecto al grupo control 4 (ratones inmunizados con HBsAg), observándose una tendencia a Ia potenciación de Ia respuesta inmune contra este antígeno, teniendo en cuenta que las diferencias no tuvieron significación estadística. Los resultados de estos experimentos se muestran en Ia Figura 17.
La respuesta linfoproliferativa en las células del bazo de los ratones inmunizados fue evaluada contra los antígenos virales de Ia región estructural del VHC, así como contra HBsAg y HBcAg, 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Como se muestra en Ia Figura 18, no hubo variación en los índices de estimulación cuando se comparó Ia preparación vacunal mezclada con los antígenos virales (HBsAg o HBcAg) y sus respectivos controles. Se generó una respuesta antígeno- específica en cada caso. Las diferencias en los índices de estimulación detectadas no fueron estadísticamente significativas, cuando se compararon los grupos en estudio. En el experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 6), correspondiente a ratones no inmunizados.
La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó inoculando 106 ufp del vRE 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Cinco días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La Figura 19, muestra los resultados obtenidos, donde se observó que solo en aquellos grupos inmunizados con Ia preparación vacunal contra VHC, mezclada o no con los antígenos virales del VHB (HBsAg o HBcAg), hubo una disminución de aproximadamente 2,5 del Log del título viral. No hubo diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon los títulos virales obtenidos entre estos grupos. En los grupos controles negativos para VHC, no se detectó disminución del título viral en los ovarios de los ratones retados. En el experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 6), correspondiente a ratones no inmunizados. Ejemplo 7: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC mezcladas con antigenos bacterianos.
La potenciación o generación de Ia respuesta inmune generada por Ia combinación de Ia preparación vacunal con antígenos bacterianos (proteínas de Ia membrana externa (PME) de Neisseria meningitidis) mezclados con Ia preparación vacunal (preparación vacunal que genera respuesta celular óptima) en estudio fue evaluada tras Ia inmunización de ratones. Ratones BALB/c fueron inmunizados i.p. con: grupo 1- PME-preparaclón vacunal VHC, grupo 2- preparación vacunal VHC, grupo 3- PME adyuvados con hidróxido de aluminio. El esquema de inmunización empleado fue de 0, 2, 4 semanas y Ia respuesta inmune fue estudiada 15 días después de terminado el esquema de inmunización. La respuesta de anticuerpos se evaluó contra los 3 antígenos que conforman Ia región estructural del VHC (antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC), así como contra un preparado de proteínas de Ia membrana externa de N. meningitidis correspondiente a Ia cepa cubana CU 385/83. La Figura 20 muestra que los niveles de anticuerpos generados por Ia combinación del preparado vacunal con las PME generó niveles mayores de anticuerpos cuando estos se compararon tanto contra los generados por el grupo de ratones inmunizados con PME así como con Ia preparación VHC relacionado a los antígenos independientes como a PME. Estas diferencias no tuvieron significación estadística.
La respuesta linfoproliferativa en las células del bazo de los ratones inmunizados fue evaluada contra los antígenos virales de Ia región estructural del VHC, así como contra las PME de Ia cepa cubana CU385 de N. meningitidis, 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Como se muestra en Ia Figura 21, hubo un aumento de los índices de estimulación cuando las células del bazo de los ratones inmunizados con Ia combinación PME-preparación vacunal VHC fueron estimuladas con los antígenos de Ia región estructural del VHC así como con las PME, en comparación a los grupos controles. Esta estimulación fue antígeno específico. En este experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 4), correspondiente a ratones no inmunizados.
La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó inoculando 106 ufp del vRE 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Cinco días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La Figura 22, muestra los resultados obtenidos, donde se observó que en ambos grupos (preparación vacunal contra VHC y Ia mezcla con PME) hubo una reducción de 2 Log dei título viral. En el grupo control (ratones inmunizados con PME) no se observó disminución del título viral en los ovarios de los ratones inmunizados, así como en otro grupo control negativo (Grupo 4), correspondiente a ratones no inmunizados, incluido en el experimento. La actividad funcional de los anticuerpos generados respecto a Ia entidad bacteriana de donde se purificaron las PME, se evaluó mediante el ensayo bactericida. En este ensayo se mide Ia propiedad de ios anticuerpos de matar Ia bacteria in vitro en presencia de complemento exógeno. En este sentido, los resultados que muestra Ia Tabla 3, indican que Ia mezcla de preparación vacunal contra VHC con las PME, no inhibió ni potenció Ia generación de anticuerpos específicos-funcionales contra N. meningitidis, ya que los títulos bactericidas de los grupos 1 y 3 fueron similares.
Tabla 3. Actividad bactericida de los sueros obtenidos en este estudio contra N. menigitidis CU 385. Anticuerpos Título bactericida3
Grupo 1 8
Grupo 2 < 2
Grupo 3 9
Preinmune < 2
C(+) ensayo 7
C(-) ensayo < 2
a Los títulos bactericidas se expresan como el Log2 de Ia última dilución del suero capaz de matar el 50% del inoculo inicial de bacteria empleado en el ensayo.
Ejemplo 8: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC mezcladas con polisacaridos.
La influencia sobre Ia respuesta inmune generada por polisacaridos capsulares (polisacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C-conjugados con una proteína portadora P64k) mezclados con Ia preparación vacunal contra VHC en estudio (preparación vacunal que genera respuesta celular óptima) fue evaluada tras Ia inmunización de ratones por vía i.p. Ratones BALB/c fueron inmunizados con: grupo 1- Conjugado (MenC-P64k)-preparación vacunal, grupo 2- preparación vacunal contra VHC, grupo 3- Conjugado (MenC-P64k). El esquema de inmunización empleado fue de 0, 2, 4 semanas y Ia respuesta inmune fue estudiada 15 días después de terminado el esquema de inmunización. La respuesta de anticuerpos se evaluó contra los 3 antígenos que conforman Ia región estructural del VHC (antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC), así como contra el polisacárido capsular de N. meningitidis serogrupo C.
La Figura 23 muestra que los niveles de anticuerpos generados por Ia combinación del preparado vacunal con el conjugado fueron similares cuando al ser estos evaluados tanto contra las proteínas estructurales del VHC, así como contra el polisacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis.
La respuesta linfoproliferativa en las células del bazo de los ratones inmunizados fue evaluada contra los antígenos virales de Ia región estructural del VHC. Como se muestra en Ia Figura 24, hubo una variación en los índices de estimulación cuando las células del bazo de los ratones inmunizados con Ia combinación conjugado (MenC-P64k)-preparación vacunal VHC fueron estimuladas con los antígenos de Ia región estructural del VHC en comparación con el grupo control de los ratones inmunizados solamente con el preparado vacunal contra VHC. En este experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 4), correspondiente a ratones no inmunizados.
La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó inoculando 106 ufp del vRE 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Cinco días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La Figura 25, muestra los resultados obtenidos, donde no se observó diferencia en el título viral determinado en los ovarios de los ratones inmunizados con el preparado vacunal contra VHC con o sin el conjugado (MenC-P64k) y posteriormente retados con el virus vaccinia recombinante. En ambos grupos hubo una disminución de aproximadamente 2,1 Log del título viral en los ovarios de los ratones inmunizados, en relación al grupo control (ratones inmunizados solamente con el conjugado MenC-P64k). La diferencia observada entre el grupo control y los otros dos grupos tuvo significación estadística. En este experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 4), correspondiente a ratones no inmunizados. La actividad funcional de los anticuerpos generados respecto a Ia entidad bacteriana (N.meningitidis serogrupo C), se evaluó mediante un ensayo bactericida, midiendo Ia propiedad de los anticuerpos de matar Ia bacteria in vitro en presencia de complemento exógeno. En este sentido, los resultados que muestra Ia Tabla 4, indican que Ia mezcla de Ia preparación vacunal contra VHC con y el conjugado MenC-P64K, no tuvo influencia en Ia generación de anticuerpos específicos- funcionales contra Ia bacteria N. meningitidis, generados a partir del propio conjugado MenC-P64K.
Tabla 4. Actividad bactericida de los sueros obtenidos en este estudio contra N. menigitidis serogrupo C. Anticuerpos Título bactericida3
Grupo 1 9
Grupo 2 < 2
Grupo 3 9
Pre-inmune < 2
C(+) ensayo 5
C(-) ensayo < 2
a Los títulos bactericidas se expresan como el Log2 de Ia última dilución del suero capaz de matar el 50% del inoculo inicial de bacteria utilizado en el ensayo.
Ejemplo 9: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC mezcladas con plasmidios codificantes para antígenos virales. La influencia en Ia generación de Ia respuesta inmune por plasmidios para inmunización con ADN, que codifican para el antígeno de superficie (pAEC-M7- HBsAg) y de Ia cápsida (pAEC-M7-H BcAg) del virus de Ia Hepatitis B1 mezclados con el preparado vacunal contra VHC (preparación vacunal que genera respuesta celular óptima), fue estudiada tras Ia inmunización i.m. de ratones BALB/c. Los ratones fueron inmunizados con: grupo 1- pAEC-M7, grupo 2- pAEC-M7-preparado vacunal contra VHC, grupo 3- pAEC-M7-HBsAg, grupo 4- pAEC-M7-H BsAg- preparado vacunal contra VHC, grupo 5- pAEC-M7-HBcAg, grupo 6- pAEC-M7- HBcAg-preparado vacunal contra VHC, grupo 7- preparado vacunal contra VHC. El esquema de inmunización utilizado fue 0, 2, 4, 6 semanas, por vía i.m. La respuesta de anticuerpos se evaluó contra los 3 antígenos que conforman Ia región estructural del VHC (antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC), así como contra los antígenos de superficie (HBsAg) y de Ia cápsida (HBcAg) del virus de Hepatitis B. Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 26, donde se observa Ia generación de respuesta específica para cada uno de los antígenos evaluados. Se aprecian mayores títulos de anticuerpos contra las proteínas estructurales del VHC, de forma general, cuando se mezclaron los plasmidios con el preparado vacunal contra VHC en comparación con el preparado vacunal solo. Aunque esta fue Ia tendencia, las diferencias observadas no fueron estadísticamente significativas. Tanto contra HBsAg como HBcAg, los niveles de anticuerpos detectados fueron similares, cuando se inmunizó con los plasmidios codificantes para estos antígenos, solos o mezclados con el preparado vacunal contra VHC.
La respuesta linfoproliferativa en las células del bazo de los ratones inmunizados fue evaluada contra los antígenos virales de Ia región estructural del VHC, así como contra HBsAg y HBcAg, 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Como se muestra en Ia Figura 27, no hubo variación estadísticamente significativa en los índices de estimulación cuando se comparó Ia preparación vacunal mezclada con los plasmidios que codifican para los antígenos virales (HBsAg o HBcAg) y sus respectivos controles. En este experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 8), correspondiente a ratones no inmunizados. Se generó una respuesta antígeno-específica en cada caso. Las diferencias en los índices de estimulación detectadas no fueron estadísticamente significativas, cuando se compararon los grupos en estudio. Tampoco se apreció una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos de los ratones inmunizados con Ia preparación vacunal, en presencia o no de los plasmidios, cuando las células del bazo fueron pulsadas en presencia de los antígenos de Ia región estructural del VHC.
La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó inoculando 106 ufp del vRE 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Cinco días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La Figura 28, muestra los resultados obtenidos, donde se observó que solo en aquellos grupos inmunizados con Ia preparación vacunal contra VHC, mezclada o no con los plasmidios, hubo una disminución de aproximadamente 2 Log del título viral. No hubo diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon los títulos virales obtenidos entre estos grupos. En los grupos controles negativos para VHC, no se detectó disminución del título viral en los ovarios de los ratones retados. En este experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 8), correspondiente a ratones no inmunizados. Ejemplo 10: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones de ADN que codifican para antígenos de Ia región estructural del VHC y dosis refuerzos con las preparaciones proteicas del VHC en estudio.
La combinación de Ia inmunización con ADN con dosis de refuerzo empleando ei preparado vacunal contra VHC (preparación vacunal que genera respuesta celular óptima) fue estudiada en ratones BALB/c. El esquema de inmunización es el que se muestra en Ia Tabla 5.
Tabla 5. Esquema de inmunización para el estudio de combinación de ADN con dosis de refuerzo con Ia preparación vacunal.
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Ratones BALB/c fueron inmunizados con Ia preparación de ADN plasmídlco (Dueñas-Carrera, et al. (2002) Enhancement of the immune response generated against the hepatitis C virus envelope proteins after DNA vaccination with polyprotein-encoding plasmids. Biotechnol Appl Biochem, 35, 205-212) por vía i.m. y posteriormente Ia dosis de refuerzo fue administrada por vía i.p. La respuesta de anticuerpos se evaluó contra los 3 antígenos que conforman Ia región estructural del VHC (antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC). Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 29. No se evidenció una potenciación de Ia respuesta de anticuerpos contra el antígeno de Ia cápsida del VHC. Los niveles de anticuerpos detectados fueron mayores para las variantes proteicas en comparación con los grupos inmunizados con ADN, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. La respuesta de anticuerpos contra E1 fue potenciada, al administrar Ia dosis de refuerzo con el preparado vacunal. En este caso los mayores niveles de anticuerpos fueron detectados en los grupos de animales inmunizados con proteína en comparación con aquellos inmunizados con ADN. Las diferencias observadas en los niveles de anticuerpos contra E1, después de Ia dosis de refuerzo no tuvieron significación estadística. Los niveles de anticuerpos detectados en este régimen de inmunización contra E2, mostraron mayores niveles de anticuerpos para los animales inmunizados con las variantes proteicas en comparación con Ia respuesta obtenida en los animales inmunizados con ADN. Después de Ia dosis de refuerzo, los niveles de anticuerpos no se modificaron.
La respuesta linfoproliferativa en las células del bazo de los ratones inmunizados fue evaluada contra los antígenos virales de Ia región estructural del VHC, 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Como se muestra en Ia Figura 30, aunque si existió un aumento en los índices de linfoproliferación para el caso de las variantes proteicas con refuerzo, las diferencias no fueron estadísticamente significativas. De igual forma para el caso de los ratones inmunizados con ADN y con dosis de refuerzo con proteína hubo un aumento de Ia respuesta linfoproliferativa para todos los casos contra todos los antígenos y marcada fundamentalmente contra Ia proteína El Las diferencias observadas no fueron estadísticamente significativas.
La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó inoculando 106 ufp del vRE 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Cinco días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La Figura 31 muestra los resultados obtenidos, donde hubo una reducción de aproximadamente 2 Log del título viral en los animales inmunizados con el preparado vacunal óptimo para respuesta celular. Los ratones inmunizados con ADN mostraron una reducción de 1,2 Log del título viral. Después de Ia dosis de refuerzo con el preparado vacunal óptimo para respuesta celular, se observó que hubo una reducción de 6,6 Log del título viral en los animales inicialmente inmunizados con el preparado proteico óptimo para respuesta celular. En el caso de los ratones inmunizados inicialmente con ADN y a los que se les administró Ia dosis de refuerzo con el preparado vacunal, se observó una reducción de 1,8 Log del título viral. En los demás grupos de animales no se detectó reducción significativa del título viral en los ovarios de los animales. Ejemplo 11: Evaluación de Ia respuesta inmune en ratones BALB/c tras Ia inmunización con preparaciones proteicas del VHC teniendo en cuenta diferentes formas de preparación.
La generación de Ia respuesta inmune contra las proteínas recombinantes de Ia región estructural del VHC1 fueron estudiadas tras Ia preparación del inmunógeno de diferentes formas. Se estudiaron las siguientes variantes: (1) Los tres antígenos fueron mezclados y posteriormente adyuvados con el gel de hidróxido de aluminio, (2) Cada antígeno por separado fue adyuvado con el gel de hidróxido de aluminio y posteriormente mezclados para conformar Ia preparación final. Ratones BALB/c fueron inmunizados con ambas preparaciones. Se utilizó Ia preparación vacunal óptima para Ia generación de una respuesta celular en ratones BALB/c. El esquema de inmunización empleado fue 0, 2, 4 semanas y Ia respuesta inmune fue estudiada 15 días después de terminado el esquema de inmunización. La respuesta de anticuerpos se evaluó contra los 3 antígenos que forman Ia preparación vacunal (antígeno de Ia cápsida, E1 y E2 del VHC). La Figura 32 muestra que los niveles de anticuerpos generados para cada antígeno en análisis fueron similares, no existiendo diferencias estadísticamente significativas entre los estudiados. La respuesta linfoproliferativa en las células del bazo de los ratones inmunizados fue evaluada contra los antígenos virales de Ia región estructural del VHC. Como se muestra en Ia Figura 33, Ia forma de preparación del inmunógeno no ejerció influencia alguna en Ia respuesta linfoproliferativa antígeno específica obtenida. No se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos en estudio. En este experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 3), correspondiente a ratones no inmunizados.
La protección frente al reto viral de los ratones inmunizados se evaluó inoculando 106 ufp del vRE 15 días después de terminado el esquema de inmunización. Cinco días después del reto, se determinó Ia cantidad de virus en los ovarios de los ratones inmunizados y retados. La cantidad de virus detectada en los ovarios de los ratones inmunizados, reflejados como Log del título viral indicó que no existieron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos. Estos resultados se muestran en Ia Figura 34. En este experimento se incluyó otro grupo control negativo (Grupo 3), correspondiente a ratones no inmunizados.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición vacunal para generar respuesta inmune celular y humoral protectora contra Ia infección por el virus de hepatitis C, caracterizada por Ia combinación óptima de Ia mezcla de los antígenos de Ia región estructural del Virus de Ia Hepatitis C (Proteína de Ia cápsida:E1:E2) y administrada utilizando cualquier tipo de adyuvante.
2. La composición vacunal según Ia reivindicación 1, donde las cantidades de antígenos a utilizar se enmarcan en los rangos de relaciones [(1,5-2,5):(1-2,5):(1- 2)]:[Proteína de Ia cápsida:E1:E2], para generar una respuesta humoral óptima.
3. La composición vacunal según Ia reivindicación 2, donde las cantidades de antígenos a utilizar se corresponden con Ia relación (1 , 5:1,1 :1):(Proteína de Ia cápsida:E1:E2).
4. La composición vacunal según Ia reivindicación 1, donde las cantidades de antígenos a utilizar se enmarcan en los rangos de relaciones [(1:50):(120-180):(120-
180)]: [Proteína de Ia cápsida:E1:E2], para generar una respuesta celular óptima.
5. La composición vacunal según Ia reivindicación 4, donde las cantidades^ de antígenos a utilizar se corresponden con Ia relación (1:160:160):(Proteína de Ia cápsida:E1 :E2).
6. La composición vacunal según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 5, donde dicha composición vacunal se administra en diferentes esquemas de inmunización.
7. Composición vacunal combinada contra enfermedades virales y/o bacterianas, donde se combinen como principios activos Ia mezcla de los antígenos de Ia región estructural del Virus de Ia Hepatitis C según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 5, junto a antígenos polisacarídicos (conjudagos o no) y/o virales y/o bacterianos.
8. Composición vacunal combinada contra enfermedades virales y/o bacterianas, donde se combinen como principios activos Ia mezcla de los antígenos de Ia región estructural del Virus de Ia Hepatitis C según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 5, junto a plasmidios que codifiquen para antígenos de entidades infecciosas.
9. La composición vacunal combinada de acuerdo a Ia reivindicación 7, donde los antígenos virales empleados sean el antígeno de Ia nucleocápsida y/o el antígeno de superficie del virus de Ia Hepatitis B.
10. La composición vacunal combinada de acuerdo a Ia reivindicación 7, donde los antígenos bacterianos empleados sean las proteínas de Ia membrana externa de N. meningitidis como preparado vacunal o cualquiera de las proteínas que conformen Ia misma.
11. La composición vacunal combinada de acuerdo a Ia reivindicación 7, donde se empleen antígenos polisacarídicos conjugados o no a proteínas portadoras como principios activos de formulaciones contra entidades bacterianas.
12. La composición vacunal según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 5, donde dicha composición vacunal se administre en esquemas combinados con otros candidatos vacunales basados en vacunas de ADN, vectores vivos recombinantes, péptidos y proteínas.
13. La composición vacunal según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 5 para inducir inmunidad contra el VHC en pacientes con hepatitis C crónica, cirrosis y cáncer de hígado.
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