KR20070057861A - 간염 ｃ 바이러스에 대한 백신 조성물 - Google Patents

간염 ｃ 바이러스에 대한 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 어떤 비율로 간염 C 바이러스 구조 항원을 성분으로 포함하고 간염 C 바이러스에 대한 면역 반응의 전개에 있어서 고양자 효과를 갖는 간염 C의 치료 및 예방적 치료를 위한 백신 조성물이다. 이 백신 조성물을 포함하는 병원체에 대한 조합된 백신 또한 기술되어 있다.
간염 C 바이러스, 백신, 구조 단백질 E1, N. 메닝기티디스

Description

간염 Ｃ 바이러스에 대한 백신 조성물{VACCINE COMPOSITION AGAINST HEPATITIS C VIRUS}
본 발명은 면역학 분야에 관한 것으로, 특히 간염 C 바이러스 (HCV)에 대해 강력하고 다양한 반응을 유도할 수 있는 백신 항원 조성물과 이 백신 조성물을 포함하는 병원체에 대한 조합된 백신에 관한 것이다.
RNA 바이러스로서 이 바이러스가 환경에 적응하는데 있어서 빠르게 변이될 수 있기 때문에 이런 몇몇 장애가 HCV에 대한 효과적인 백신의 생산을 방해해 왔다. 이것은 전세계에서 동정된 복합 바이러스 분리물로부터 아주 다양한 시퀀스에 기여한다. 주요한 이질성은 HCV E2 프로테인에 프레임된 고도로 다변화할 수 있는 영역, 자세하게는 중성화하는 에피토프에 집중된다 ( Bukh et al . US 6,110,465). HCV는 활성적인 면역 반응의 존재에도 불구하고 면역능력이 있는 개개인에게도 지속적인 감염을 야기한다 (Lechmann et al. (2000) Vaccine development for hepatitis C. Semin Liver Dis. 20:211-226). 중화 항체의 존재의 평가 및 HCV 복제를 지지하는 생체외 세포 배양 시스템 또는 효과적인 동물 모델은 없다. 질병의 진행 또는 보호와 관련된 면역학적 패턴은 완전하게 정의되지 않았다. HCV 감염을 명료하게 하기 위해 강력하고, 다특이적이고, 장기간의, 체액성 및 세포적 양자의 면역 반응을 필요로 할 것이다 (Lechmann et al. (2000) Vaccine development for hepatitis C. Semin Liver Dis . 20:211-226).
몇몇 접근법이 HCV에 대한 백신을 개발하기 위해 사용되어 왔는데; 이들 중에서, 재조합 프로테인, 합성 펩티드, 파티클, 나(裸) DNA 및 재조합 바이러스와 같은 바이러스가 광범위하게 평가되어 왔다 ( Depla et al . US 6,635,257; Liang et al. US 6,387,662; Pachuk et al . US 6,235,888; Berzofsky et al . US 6,685,944).
몇몇 플라비바이러스에 대해 엔벨롭 프로테인에 대한 항체가 보호를 부여하기 때문에 단백질 서브유닛에 기한 백신의 개발은 HCV에 대해 이미 평가된 전략의 하나이다 ( Min et al . US 5,985,609). HCV 구조적 항원에 기한 몇몇의 전략은 동물모델에서 바이러스에 대한 제한된 보호를 이끌어 냈다. 이것은 E1 및 E2의 올리고머로 면역된 침팬지의 경우이다. 일곱 마리의 침팬지가 백신 접종되었고, 일곱 마리 중 다섯 마리가 보호되고 두 마리는 병에 걸렸지만 만성 상태에 도달하기 전에 치료되었다 (Choo et al. (1994) Vaccination of chimpanzees against infection by hepatitis C virus. PNAS USA, 91:1294-98). 이러한 보호는 인간 세포에 E2의 결합을 저해할 수 있는 항체(Abs)의 존재와 관련된다(Rosa et al. (1996) A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: Cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. PNAS USA, 93:1759-63).
지노타입 1b 분리물로부터 재조합 E1 단백질이 대략 9 nm 크기의 파티클과 연계된 호모다이머로 정제되었다 (Maertens et al. (2000) Improvement of chronic active hepatitis C in chronically infected chimpanzees after therapeutic vaccination with the HCV E1 protein. Acta Gastroenterol Belg. 63:203). 두 마리의 침팬지는 HCV 수용 9 복용의 50 ㎍ 의 재조합 E1 단백질로 만성적으로 감염되었다. 이 예방 접종은 간 조직구조를 개선하였고, 간에서 바이러스 항원의 소멸과 알라닌 아미노트랜스퍼라제 준위(ALT)의 감소를 결정했다. 비록 혈청에서 ARN의 준위가 치료기간 동안 변하지는 않았지만, 간장의 염증과 바이러스 항원이 치료 종결 후에 다시 나타났다. E1에 대한 항체의 높은 준위와 질병의 개선과의 사이에서의 상관관계가 관찰되었다(Maertens et al. (2000) Improvement of chronic active hepatitis C in chronically infected chimpanzees after therapeutic vaccination with the HCV E1 protein. Acta Gastroenterol . Belg . 63:203).
재조합 단백질로부터의 입자와 같은 바이러스의 형성과 백신으로서의 그 사용은 이들의 구조가 바이러스의 특징과 매우 유사하기 때문에 매우 매력적이다( Liang et al . US6 ,387,662). HCV 구조적 항원의 시퀀스를 담지하는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 곤충세포로부터 얻어진 이 천연의 파티클은 이러한 항원에 대해 체액성 및 세포성 면역 반응을 일으킬 수 있다(Baumert et al. (1999) Hepatitis C virus-like particles synthesized in insect cells as a potential vaccine candidate. Gastroenterology 117:1397-407; Lechmann et al. (1999) Induction of humoral and cellular immune responses in mice by immunization with insect-cell derived HCV-like particles. Hepatology 30:423-29).
한편, 몇 가지의 바이러스의 재조합 벡터는 HCV에 대한 재조합 백신을 개발하기 위해 평가되었다. 특히, 재조합 장애 아데노바이러스는 체액 및 세포의 면역성을 유도하는 능력인 그의 헤파트로피즘 뿐 아니라 비경구 및 경구 경로에 의해 투여될 수 있는 가능성으로 볼때 매력적인 후보군이다. HCV 구조 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 이들 단백질에 대해 항체 반응을 유도한다 (Makimura et al. (1996). Induction of antibodies against structural proteins of hepatitis C virus in mice using recombinant adenovirus. Vaccine 14:28-36). 부가하여, 코어 및 E1 항원을 포함하는 재조합 아데노바이러스로 마우스 면역화 후에, 이들 항원에 대한 T 세포독성 특이적 반응이 검출되었다(Bruna-Romero et al. (1997) Induction of cytotoxic T-cell response against hepatitis C virus structural antigens using a defective recombinant adenovirus. Hepatology 25:470-77). 이들 반응이 고무적이기는 하지만, 유전자 치료에서 재조합 아데노바이러스의 사용에 관한 최근의 문제점은 인체에 이들의 사용에 대해 몇 가지의 의문을 제기했다. 다른 HCV 유전자를 담지하는 우두 바이러스와 같은 다른 재조합 바이러스의 채용은 마우스에서 강력한 T 세포독성 및 헬퍼 반응을 유도했다(Shirai et al. (1994) An epitope in hepatitis C virus core region recognized by cytotoxic T cells in mice and humans. J. Virol. 68:3334-42; Large et al. (1999) Suppression of host immune response by the core protein of hepatitis C virus: possible implications for hepatitis C virus persistence. J. Immunol. 162:931-38). 그럼에도 불구하고, 이들 재조합 바이러스 뿐 아니라 셈리키 포레스트 (semliki forest) 바이러스와 같은 알파 바이러스의 다른 변형체의 사용은 이들의 적용에 관련된 조절되고 안전한 이슈에 의해 영향을 받는다(Vidalin et al. (2000) Use of conventional or replicating nucleic acid-based vaccines and recombinant Semliki forest virus-derived particles for the induction of immune responses against hepatitis C virus core and E2 antigens. Vaccine 276:259-270).
바이러스의 분류에 중요할 수 있는 바이러스 HCV 다단백질에서 몇몇 T CD4+ 및 CD8+ 에피토프의 동정이 이 병원체에 대한 백신 후보군으로 합성 펩티드를 사용하는 전략을 지지한다 (Berzofsky et al. US 5,980,899). 코어, NS4 및 NS5 단백질로부터 HCV 에피토프를 포함하는 단독 또는 지질화된 다른 펩티드는 마우스에서 강력한 T 세포독성 반응을 유도했다 (Shirai et al. (1996) Use of intrinsic and extrinsic helper epitopes for in vivo induction of anti-hepatitis C virus cytotoxic T lymphocytes (CTL) with CTL epitope peptide vaccines. J. Infect . Dis. 173:24-31; Hiranuma et al. (1999) Helper T cell determinant peptide contributes to induction of cellular immune responses by peptide vaccines against hepatitis C virus. J. Gen . Virol. 80:187-193; Oseroff et al. (1998) Pools of lipidated HTL-CTL constructs prime for multiple HBV and HCV CTL epitope responses. Vaccine, 16:823-833).
HCV에 대한 백신을 개발하기 위해 사용된 또 다른 전략은 선형 에피토프에 대한 항체를 발생할 가능성에 기인된다. 이 대안은 몇 가지의 고무적인 결과로 래빗 및 침팬지에서 HCV 고변이성 영역 1(HVR-1)에 대해 항체를 발생하기 위해 주로 평가되어 왔다 (Esumi et al. (1999) Experimental vaccine activities of recombinant E1 and E2 glycoproteins and hypervariable region 1 peptides of hepatitis C virus in chimpanzees. Arch Virol. 144:973-980; Shang et al. (1999) Broadly cross-reactive, high-affinity antibody to hypervariable region 1 of the hepatitis C virus in rabbits. Virology 258:396-405). HCV 백신에 대한 타겟으로 HVR을 선택한 주요 문제는 이 지놈 영역에 콰시-종의 존재에 기인된다.
펩티드 백신 어프로치에 대한 주요한 장애는 헬퍼 작용이 없는 이들 펩티드가 빈약한 면역원일 수 있고, 주로 백신의 효능은 다른 항원에 대해 매우 광범위한 범위로 다중 반응의 유도에 기초한다는 것에 있다. 이들의 제한은 이 전략의 단점이다.
DNA 면역화반응이 HCV에 대한 백신 개발을 위해 광범위하게 연구되어 왔다 (Donnelly et al . US 6,653,125). 코어 단백질은 몇몇 발현 벡터에, 이 단백질의 전체 길이 또는 잘려진 변형체를 사용하여 포함되어 졌다(Lagging et al. (1995) Immune responses to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus core protein. J. Virol. 69:5859-5863; Chen et al. (1995) Genetic immunization of mice with plasmid containing hepatitis C virus core protein-encoding DNA. Vaccine Res . 4:135-144).
다른 유전적 컨스트럭션이 또한 5 비전사 영역을 포함한다(Tokushige et al. (1996) Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs. Hepatology 24:14-20). HB 표면 항원에 융합된 변형체 및 다른 바이러스로부터의 변형체가 또한 연구되었다 (Major et al. (1995) DNA-based immunization with chimeric vectors for the induction of the immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid. J. Virol. 69:5798-805). 이들 벡터로의 면역화 반응은 주로 검출할 수 있는 림프증식성 및 T 세포 림프구 세포독성 반응을 유도했다.
HCV 엔벨롭 단백질은 또한 이런 종류의 기술에 흥미있는 타겟을 구성한다. E2의 경우에, 체액성 면역 반응은 HVR-1에 대한 것으로 여겨진다 (Lee et al. (1998) Hepatitis C virus envelope DNA-based immunization elicits humoral and cellular immune responses. Mol . Cells 8:444-451). 면역화 반응이 E1 및 E2 단백질의 분비가능한 변형체에 대한 벡터로 수행되었을 때, 비-분비가능한 변형체에 비하여 면역 반응에서의 차이가 검출되지 않았다(Lee et al. (1998) Optimal induction of hepatitis C virus envelope-specific immunity by bicictronic plasmid DNA inoculation with the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene. J. Virol. 72:8430-8436). Inoculation with bicistronic plasmids expressing independently the genes codifying for the GM-CSF, E1 및 E2 단백질을 코드하는 유전자를 독립적으로 발현하는 비시스트론성 플라스미드로의 접종은 체액성 및 세포성 면역 반응을 발생하고 증강하였다. 최근에, 이들 단백질의 면역 학적 효과가 양자가 비시스트론성 벡터에 포함되어 질 때 생체 내 헤테로다이머 형성의 가능성이 지지되거나 삭제되어 지는 곳에서 조사되었다. 이런 복합체가 형성될 때 항체반응이 얻어지지 않는다는 것을 확인하였다. 정밀한 비교에서, 입체 배좌의 그리고 선형의 결정자에 대한 높은 항체 역가가 동물이 양자 구조 단백질의 턴케이트 된 형태를 발현하는 플라스미드로 면역될 때 발생되었다. 따라서, 양자의 항원으로 면역화반응이 수행되어질 때 우수한 항체 반응을 얻기 위해서는 헤테로다이머 형성을 피할 필요가 있는 것으로 여겨진다(Fournillier et al. (1999) Expression of noncovalent hepatitis C virus envelope E1-E2 complexes is not required for the induction of antibodies with neutralizing properties following DNA immunization. J. Virol. 73:497-504).
비구조적 단백질은 또한 이 기술을 통하여 평가되었다. NS3 단백질의 C-말단 영역에 대해 코드하는 영역은 우수한 결과를 갖는, 이 단백질 및 IL-2의 동시적 또는 독립적으로의 발현을 허용하는 벡터에 포함되어졌다(Papa et al. (1998) Development of multigenetic plasmid vector for HCV DNA immunization. Res . Virol. 149:315-319). NS4 및 NS5 단백질은 동일한 방법에 의해 림프구 T 세포독성 및 항체 반응이 발생되었다(Encke et al. (1998) Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis C virus in murine model. J. Immunol. 161:4917-4923).
최근에는, 바이러스의 비 구조적 단백질(NS3, NS4 및 NS5; GM-CSF에 대해 코드화하는 유전자를 포함함)을 코드화하는 유전자 컨스트럭션의 사용은 비 구조적 단백질의 각 하나에 대한 T 세포 증식적 반응의 증가뿐 아니라 강력한 항체 반응이 발생된다는 것을 확인하였다(Cho et al. (1999) Enhanced cellular immunity to hepatitis C virus nonstructural proteins by codelivery of granulocyte macrophage-colony stimulating factor gene in intramuscular DNA immunization. Vaccine 17:1136-1144).
일반적으로, DNA 면역화 반응 후 다른 HCV 항원에 대한 항체의 효과적인 발현뿐 아니라 발생이 보고되었다. 그 준위는 연구(Inchauspe et al. (1997) DNA vaccination for the induction of immune responses against hepatitis C virus proteins. Vaccine 15:853-856)에서의 조합에 따라 1:100 내지 1:100000 사이의 영역으로 된다. 또한, 특이적 세포독성 및 림프구 증식성의 개선이 확인되었다(Inchauspe et al. (1997) Plasmid DNA expressing a secreted or a nonsecreted form of hepatitis comparative studies of antibody and T-helper responses following genetic immunization. DNA and Cell Biology 16:185-195). 그러나, 다른 HCV 단백질에 대한 충분히 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응에 도달하기 위해 이 방법학을 개선하는 것이 필요하다. 이 관점에서, DNA 예방접종 후 유도된 면역 반응을 개선하기 위해 몇몇 변형체가 평가되었는데, 이는 이들을 어쥬번트로서 리포좀(Gramzinski et al. (1998) Immune response to a hepatitis B DNA vaccine in Aotus Monkey: A comparison of vaccine formulation, route and method of administration. Mol . Medicine 4:109-118), 모노포스포릴 리피드 A 및 사포닌 QS-21 (Sasaki et al. (1998) Induction of systemic and mucosal immune responses to human immunodeficieny virus type 1 by a DNA vaccine formulated with QS-21 saponin adjuvant via intramuscular and intranasal routes. J. Virol. 72:4931-4939)의 사용이다. 한편, DNA 면역화 반응에서 생물학적 어쥬번트로서 덴트리트 세포가 연구되었다. 바이러스 벡터를 사용한 종양 항원을 발현하기 위해 생체 외에서 유전적으로 변형된 마우스 골수로부터 유래된 덴트리트 세포로 구성된 백신이 사용되었고, 마우스에서 종양에 대한 세포에 의해 매개된 특이적 T 세포 반응 및 예방적 면역원성을 자극하는 그의 능력이 입증되었다(Specht et al. (1997) Dendritic cells retrovirally transduced with a model antigen gene are therapeutically effective against established pulmonary metastases. J. Exp . Med. 186:1213-1221; Brossart et al. (1997) Virus-mediated delivery of antigenic epitopes into dendritic cells as a means to induce CTL. J. Immunol. 158:3270-3276; Song et al. (1997) Dendritic cells genetically modified with an adenovirus vector encoding the cDNA for a model antigen induce protective and therapeutic antitumor immunity. J. Exp . Med. 186:1247-1256), o ARN (Boczkowski et al. (1996) Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo. J. Exp . Med. 184:465-472).
현재에는, CpG의 삽입을 포함하는 벡터의 개선은 발현된 항원에 대해 면역 반응을 고양하기 위해 수행되었으며, 플라스미드 방출을 위한 시스템은 이 기술의 한계를 극복하기 위한 연구에서 결정적인 대상이다(Hasan et al. (1999) Nucleic acid inmunization: concepts and techniques associated with third generation vaccines. J. Immunol . Meth. 229:1-22).
HCV에 의해 설정된 병원균 도입 및 이 병원체에 대한 보호와 관련된 면역학적 변수에 대한 명확한 정의의 부재에 기인하여, HCV에 대한 효과적인 백신은 면역 반응의 다양한 측면을 자극하는 다변이 가능한 접근을 필요로 할 수 있다. 이 문제에 대한 해결은 지금까지 시험된 몇 가지의 백신 접근의 조합에 있다고 볼 수 있다. 이런 관점에서, DNA 백신으로 초기 복용과 단백질 또는 재조합 바이러스 벡터로 추가 복용을 조합한 면역화 스케쥴이 보다 긍정적인 것은 주제의 조합이 HCV에 대해 보호적인 면역성을 유도할 수 있다는 것을 입증하기 위해 부가적인 조사를 필요로 한다는 결과로 평가되어왔다(Hu et al. (1999) Characterization of the humoral and cellular immune responses against hepatitis C virus core induced by DNA-based immunization. Vaccine 17:3160-3170; Pancholi et al. (2000) DNA prime-canarypox boost with polycistronic hepatitis C virus (HCV) genes generates potent immune responses to HCV structural and nonstructural proteins. J. Infect . Dis. 182:18-27).
부가적으로, 간염 B 모델에 대해, HbsAg에 대한 모노크로날 항체로 간염 B 표면 항체의 복합체와 이 항원에 대해 코드하는 플라스미드에 의해 구성된 백신 제제가 평가되었다(Wen et al. US 6,221,664 ). 이 제형은 다른 경로에 의해 항원의 발현과 분리된 주제에 의해 발생된 것보다 높은 면역 반응의 빠른 유도를 가능하게 한다. 이 방식에서, 효과적인 백신의 개발이 중대하고 더욱이 현저한 성공이며, 이것은 여전히 진행중인 과제이다.
본 발명에는, 간염 C 바이러스의 구조적 항원에 의해 구성된 백신 제제가 기술되어 있다. 단백질에 기초한 종래의 백신 제제에 비하여, 단지 E1 및 E2 단백질이 사용(단독 또는 조합하여)되는 경우, 본 백신 제제에서는 또한 HCV 코어 항원이 포함되어진다. 이 백신 조성물의 유연성은 이 백신 제제에 사용되는 항원 양의 범주로 되어, 뮤어라인 모델에서 재조합 우두 바이러스로 병원체 도입에 대해 양성적 반응뿐 아니라 동시적인 방식으로 다른 항원에 대해 강력한 면역 반응(체액성 및 세포성) 발생을 부가적으로 가능하게 한다.
HCV에 대해 신뢰할 수 있고 효과적인 치료 백신을 개발하는 것이 절박하다고 문헌에 확립되어 있다. 따라서, 본 발명은 간염 C 바이러스의 구조적 항원의 혼합물에 의해 구성된 백신 제제의 공급에 초점이 맞추어졌다. 이 경우에, 코어 단백질, 구조 단백질 E1 및 구조 단백질 E2는 HCV에 대해, HCV의 만성적 환자에 대해서도(이것만은 아님) 체액성 및 세포성 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 신규성은 이 연구에서 혼합물로 면역화 반응 후 얻어진 보호적 효과와 항원 상관관계의 범주를 얻음에 의해 주어졌다. 연구에서 항원은 면역 반응이 HCV에 대해 발생되어질 수 있다는 수단에 의해 매력적인 백신 타겟이다.
특정한 구현에서, 백신 제형은 최적의 체액성 면역 반응을 발생하기 위해 코어 단백질, E1 및 E2 각각에 대해 (1.5-2.5):(1-2.5):(1-2) 로 맞추어 지고 혼합물로 존재하는 항원에 대한 상관관계의 범위를 사용한다. 다른 구현에서는, 항원이 코어 단백질, E1 및 E2 각각에 대해 (1.5:1.1:1)의 상관관계로 사용되었다.
본 발명의 구체화에서, 백신 제형은 최적의 세포성 면역 반응을 발생하기 위해 코어 단백질, E1 및 E2 각각에 대해 (1:50):(120-180):(120-180)으로 맞추어진 혼합물로 존재하는 항원에 대한 상관관계의 범위를 사용한다. 다른 구체화에서는, 단백질 항원이 코어 단백질, E1 및 E2 각각에 대해 (1:160:160)의 상관관계로 사용되었다.
본 발명의 백신 제제는 경구 및 비경구 주사(즉, 정맥내로, 피하로 또는 근육내로)를 포함하는 백신 투여에 대한 편리한 방법에 의해 고체 산물, 액체 산물 또는 에어로졸로서 투여되어질 수 있고, 더욱이 이 조성물은 어쥬번트되기에 앞서 단백질 항원의 혼합뿐만 아니라 별도로 항원을 어쥬번트하고 후에 이들을 혼합함에 의해서도 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 항원은 천연에서 얻어지거나 또는 아래에 자료로 제공된 것과 같은 어떤 발현 시스템에서 재조합 DNA 기술에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 구체화에서, 본 발명에 포함되어진 백신 제제는 다른 면역화 스케쥴로 투여되어 질 수 있다.
동일한 방식으로, 다른 다당체의 항원(컨쥬게이트되거나 또는 아닌 것) 및/또는 바이러스 항원 및/또는 박테리아 항원과 혼합된 이들 항원성 조합으로 면역화는 따라서 광범위한 전염성 병원체에 대해 합성적 면역화 반응을 발생한다.
본 발명의 다른 구체화에서, 백신 제형은 바이러스 및/또는 박테리아의 질병에 대한 전염성 병원체로부터 항원에 대해 코드화하는 플라스미드와의 HCV 구조 항원의 조합을 포함한다.
본 발명에서 바람직한 백신 조성물은 바이러스 항원을 포함한 다른 것이: 간염 B 코어 및/또는 표면 항원, 박테라아 항원으로서 N. 메닝기티디스로부터의 프로테오리포좀 또는 N. 메닝기티디스(N. meningitides)로부터의 정제된 아웃터 멤브레인 단백질 및 캐리어 단백질에 컨쥬게이트되거나 되지 않은 다당성 항원과 같은 것인 제제이다. 이들은 바이러스 및 박테리아성 병원체에 대한 제형에서 활성적 주제로 사용되어 질 수 있다.
여기에 기술된 백신 조성물은 DNA 백신인 생 재조합 벡터, 펩티드 및 단백질에 기초한 다른 백신 후보군과 조합된 스케쥴로 투여되어질 수 있다. 이것은 또한 간경변 및 간암을 갖는 만성적인 간염 C 환자에서 HCV에 대한 면역성을 유도하기 위해 사용되어질 수 있다.
도 1은 ELISA에 의해 평가된 HCV 구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것이다.
도 2는 연구에서 조합으로 면역된 마우스로부터 비장세포질에서 HCV 구조 단백질에 대한 림프구증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV의 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 3은 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입 후 평가된 연구에서 제제의 기능성 반응이다.
도 4a, 4b 및 4c는 HCV 백신 제제의 존재 하에 조성분의, (A) 체액성 면역 반응, (B) 림프증식성 면역 반응, (C) 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 영향의 분석이다.
도 5는 HCV 백신 제제에 사용된 항원의 상관관계 범위에 의해 체액성 면역 반응에 대한 영향으로, (A) HCV의 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것이다.
도 6은 HCV 백신 제제에 사용된 항원의 상관관계 범위에 의해 면역된 마우스의 지라 세포에서 HCV 구조 단백질에 대한 림프증식성 면역 반응에 대한 영향이다. HCcAg, HCV의 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 7은 HCV 백신 제제에 사용된 항원의 상관관계 범위에 의해 재조합 우두로 병원균 도입에 대해 마우스에서 평가된 기능성 반응에 대한 영향이다.
도 8은 다른 다른 시간 간격(다른 면역화 스케쥴)으로 면역화 후 ELISA에 의해 평가된 HCV 구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것이다.
도 9는 다른 시간 간격(다른 면역화 스케쥴)으로 면역된 마우스의 지라 세포 에서 HCV 구조 단백질에 대한 림프증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 10은 다른 시간 간격으로 면역된 마우스의 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 기능성 반응이다.
도 11은 다른 경로에 의해 HCV 백신 제제로 면역된 마우스의 ELISA에 의해 평가된 HCV 구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것이다.
도 12는 다른 경로로 투여된, HCV 백신 제제로 면역된 마우스의 지라 세포에서 HCV 구조 단백질에 대한 림프증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 13은 다른 경로에 의해 투여된, HCV 백신 제제로 면역된 마우스에서 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대해 평가된 기능성 면역 반응이다.
도 14는 다른 어쥬번트를 사용하여 HCV 백신 제제로 면역된 마우스의 ELISA에 의해 평가된 HCV 구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것이다.
도 15는 면역화 된 마우스의 지라 세포에서 HCV 구조 단백질에 대한 림프증식성 면역 반응에 다른 어쥬번트의 영향이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되 고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 16은 면역된 마우스에서 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 기능성 면역 반응에 다른 어쥬번트의 영향이다.
도 17은 HCV 백신 제제 및 바이러스 항원의 혼합물로 면역화 후, ELISA에 의해 평가된 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것, (D) HbsAg에 대한 것 및 (E) HbcAg에 대한 것 이다.
도 18은 HCV 백신 제제 및 바이러스 항원의 조합으로 면역화 된 마우스의 지라 세포에서 HCV 구조 단백질(코어, E1, E2), HBsAg 및 HBcAg 에 대한 림프증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 19는 HCV 백신 제제 및 바이러스 항원의 조합으로 면역된 마우스에서 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 기능성 면역반응이다.
도 20은 HCV 백신 제제 및 박테리아 항원(엔. 메닝기티디스 로부터의 아웃터 멤브레인 단백질)의 혼합물로 면역화 후, ELISA에 의해 평가된 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것 및 (D) 엔. 메닝기티디스로부터의 아웃터 멤브레인 단백질에 대한 것이다.
도 21은 HCV 백신 제제 및 박테리아 항원(OMP, 엔. 메닝기티디스 의 아웃터 멤브레인 단백질)의 조합으로 면역화 된 마우스의 지라 세포에서 엔. 메닝기티디스 로부터의 아웃터 멤브레인 단백질과 HCV 구조 단백질(코어, E1, E2)에 대한 림프증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 22는 HCV 백신 제제 및 박테리아 항원(엔. 메닝기티디스로부터의 아웃터 멤브레인 단백질)의 조합으로 면역된 마우스에서 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 기능성 면역반응이다.
도 23은 HCV 백신 제제 및 컨쥬게이트된 캡슐형 다당체의 혼합물로 면역화 된 마우스의 ELISA에 의해 평가된 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것 및 (D) 엔. 메닝기티디스로부터의 세로그룹 C의 캡슐형 다당체에 대한 것이다.
도 24는 HCV 백신 제제 및 컨쥬게이트된 캡슐형 다당체의 조합으로 면역화 된 마우스의 지라 세포에서 HCV 구조 단백질(코어, E1, E2)에 대한 림프증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 25는 HCV 백신 제제 및 컨쥬게이트된 캡슐형 다당체의 혼합물로 면역된 마우스에서 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 기능성 면역반응이다.
도 26은 HCV 백신 제제 및 HBsAg와 HBcAg를 코드화하는 플라스미드의 혼합물로 면역화 후, ELISA에 의해 평가된 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것, (D) HBsAg에 대한 것, 및 (E) HBcAg에 대한 것이다.
도 27은 HCV 백신 제제 및 HBsAg와 HBcAg를 코드화하는 플라스미드의 조합으로 면역화 된 마우스의 지라 세포에서 HCV 구조 단백질(코어, E1, E2), HBsAg 및 HBcAg에 대한 림프증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 28은 HCV 백신 제제 및 HBsAg와 HBcAg항원을 코드화하는 플라스미드의 조합으로 면역된 마우스의 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 기능성 면역반응이다.
도 29는 HCV 백신 제제로 부가 복용 및 DNA의 조합으로 면역화 된 마우스의 ELISA에 의해 평가된 체액성 면역 반응으로, (A) HCV 코어 항원에 대한 것, (B) E1 단백질에 대한 것, (C) E2 단백질에 대한 것이다.
도 30은 HCV 백신 제제로 부가 복용 및 DNA의 조합으로 면역화 된 마우스의 지라 세포에서 HCV 구조 단백질(코어, E1, E2)에 대한 림프증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 31은 HCV 백신 제제로 부가 복용 및 DNA의 조합으로 면역화 된 마우스에 서 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 기능성 면역반응이다.
도 32는 다른 방법에 의해 만들어진 HCV 백신 제제로 면역화 된 마우스에서 HCV 구조 단백질(코어, E1, E2)에 대한 체액성 면역 반응이다.
도 33은 다른 방법에 의해 만들어진 HCV 백신 제제로 면역화 된 마우스의 지라 세포에서 HCV 구조 단백질(코어, E1, E2)에 대한 림프증식성 면역 반응이다. HCcAg, HCV 코어 항원, E2-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E2, E2-lev, 효모 피키아 패스토리스로부터 생산되고 정제된 E2, E1-coli, 대장균으로부터 생산되고 정제된 E1.
도 34는 다른 방법에 의해 만들어진 HCV 백신 제제로 면역화 된 마우스에서 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 기능성 면역 반응이다.
실시예 1: HCV 단백질 백신 제제로 면역화 된 마우스에서 재조합 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 체액성 , 림프증식성 및 기능성 면역 반응.
백신 제제의 투여 후 HCV에 대한 특이적이고 기능성 면역 반응의 발생을 결정하기 위해, 수산화 알루미늄과 혼합되고 어쥬번트된 후 HCV 코어, E1 및 E2 항원이 암컷 BALB/c 마우스(10 마리의 군)에 복막내의 경로로 주입되어졌다. 면역화 스케쥴은 0, 7, 14일에 3 접종을 포함한다. 최종 접종 15일 후에 (HCV 구조 단백질을 포함하는) 재조합 우두 바이러스 vvRE로 병원균 도입에 대한 보호뿐 아니라 체액성 및 세포성 면역 반응(림프증식성 반응)이 연구되었다. 이 연구에서 군은 표 1에 도 시되었다.
이 연구에 사용하기 위한 면역원의 제조
군 면역원 접종부피 경로
1 8.37 ㎍ HCcAg +16.8 ㎍E1 +8.37 ㎍ E2 100 μL/마우스 어쥬번트:수산화알루미늄 (1:40):(prot : AlOH3) 복막내로
2 8.37 ㎍ HCcAg +8.37 ㎍ E1 +8.37 ㎍ E2
3 13.34 ㎍ HCcAg + 3.34 ㎍ E1 +13.34 ㎍ E2
4 8.37 ㎍ HCcAg +8.37 ㎍ E1 +16.8 ㎍ E2
5 3.34 ㎍ HCcAg + 3.34 ㎍ E1 + 3.34 ㎍ E2
6 8.37 ㎍ HCcAg + 50 ng E1 + 8.37 ㎍ E2
7 16.8 ㎍ HCcAg + 8.37 ㎍ E1 + 8.37 ㎍ E2
8 3.34 ㎍ HCcAg + 13.34 ㎍ E1 + 3.34 ㎍ E2
9 3.34 ㎍ HCcAg + 3.34 ㎍ E1 + 13.34 ㎍ E2
10 8.37 ㎍ HCcAg + 8.37 ㎍ E1 + 50 ng E2
11 13.34 ㎍ HCcAg + 13.34 ㎍ E1 + 3.34 ㎍ E2
12 50 ng HCcAg + 8.37 ㎍ E1 + 8.37 ㎍ E2
13 3.34 ㎍ HCcAg + 13.34 ㎍ E1 + 13.34 ㎍ E2
14 13.34 ㎍ HCcAg +3.34 ㎍ E1 + 3.34 ㎍ E2
15 13.34 ㎍ HCcAg +13.34 ㎍ E1 + 13.34 ㎍ E2
16 8.37 ㎍ HCcAg + 8.37 ㎍ E1 + 8.37 ㎍ E2
17 어쥬번트: 수산화 알루미늄
HCV 구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응은 면역-효소적 분석(ELISA)에 의해 결정되었다. 결과를 통계적으로 분석하기 위해 "Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance" 및 후-시험으로 "Dunn's Method"가 사용되었다. p<0.05를 갖는 결과는 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는 것으로 여겨진다. 도 1은 이것이 어떤 상관관계로 투여되어질 때 세 개의 HCV 구조 항원에 대한 특이적 체액성 면역 반응을 얻을 수 있음을 나타낸다. 어떤 조합은 HCV 단백질(코어, E1, E2)에 대해 높은 항체 역가를 부여하고, 이것은 마우스가 독립된 단백질 또는 어쥬번트 단독으로 면역화된 대조군에서 얻어진 것보다 통계적으로 높다.
HCV 구조 항원(코어, E1, E2)에 대한 림프증식성 반응(도2)은 각 조합에서 특징적인 행동을 나타냈다. 이들 데이터는 최상의 세포성 반응을 형성하기 위해 최적의 변형체(항원 상관관계)를 계산하기 위해 이후에 사용된다. 이 결과는 (3H-티미딘 합체에 의해 계산된) 면역된 동물로부터의 지라 세포의 자극 지수로 나타냈다. 도 2에 나타난 실험군은 또한 수산화 알루미늄 만으로 면역된 마우스에 상응하는 음성 대조군(17 군)을 갖는 표 1에 나타난 것과 상응한다.
본 연구의 제제에 의하여 발생된 기능성 면역 반응은 vvRE로 병원균 도입 후 평가되었다. i.p. 경로에 의해 106 pfu의 vvRE로 면역화 스케쥴의 종료 15일 후 동물에 병원균이 도입되었고, 마우스의 난소에 바이러스의 존재가 바이러스 접종 5일 후 평가되었다. 도 3은 얻어진 결과를 나타내는 것으로 13 군은 음성 대조군에 비하여 바이러스 역가에 있어서 2 Log-감소를 나타냈다. 도 3에 나타난 실험군은 표 1에 나타난 것과 상응한다.
사용된 변수(항체 반응, 림프증식 반응 및 우두 바이러스로 병원균 도입에 대한 보호(도 4a, 4b, 4c))의 상관성 후 발생된 표면 반응 분석을 수행하여, 변수의 각각에 대한 최적의 반응을 얻기 위한 최상의 항원 상관관계가 계산되었다. 항체 반응에 대해서는 사용된 최적의 항원 상관관계는 (1.5:1.1:1):(코어:E1:E2)에 상당하고, 반면 최적의 세포 반응을 얻기 위한 면역화에 사용된 항원 상관관계는 (1:160:160):(코어:E1:E2)이다.
실시예 2: 다른 범위의 항원 상관관계를 갖는 HCV 단백질 제제로 면역화 후 BALB/c 마우스에서의 면역 반응의 평가.
우수한 면역 반응을 얻기 위한 백신 제제에 사용되어지는 항원의 범위를 평가하기 위해, BALB/c 마우스가 실시예 1에 기술되어 진 것과 동일한 면역 스케쥴 하에서 i.p.로 면역되었다. HCV 항원(코어, E1 and E2)의 상관관계는 표 2에 나타나있다. 이 연구에서 사용된 항원의 양은 실시예 1로부터의 표면 반응 분석의 결과이다. 체액성 면역 반응에 대해서는, 상관관계의 연구된 범위는: (1.5-2.5):(1-2.5):(1-2):(코어:E1:E2)이고, 반면 세포성 면역 반응에 대해서는 상관관계의 연구된 범위는: (1:50):(120-180):(120-180): (코어:E1:E2)이다.
Figure 112007023416344-PCT00001
HCV 구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응은 도 5에 나타냈다. 연구된 상관관계는 HCV 항원 (코어, E1 및 E2)에 대한 특이적 항체 반응을 발생시켰다. 각 특정 항원에 대해 관찰된 변동에도 불구하고 다른 변형체(세포 반응에 대한 최적의 변형체 및 체액성 반응에 대한 최적 변형체)에 의해 발생된 체액성 반응에서 아무런 통계적 차이도 발견될 수 없었다. 도 5에 좌표된 실험군은 표 2에 도시된 것에 상응한다.
림프증식성 반응은 이들의 자극 후에 면역된 마우스의 지라 세포에서 3H-티미딘 합체에 의해 평가되었다. 연구된 항원에 대한 특이적 림프증식성 반응이 면역된 마우스에서 발생되었다(도 6). 도 6에 좌표된 군은 표 2에 나타난 것에 상당하였고, 다른 대조군(17 군)은 비면역화된 군에 상당한다. 통계적으로 유의성 있는 차이가 연구된 변형체(각각, 세포 반응에 대한 최적의 변형체 및 체액성 반응에 대한 최적 변형체) 각각에 대해 관찰된 자극 지수 중에서 관찰되지 않았다.
면역된 마우스는 i.p. 경로에 의해 106 pfu의 vvRE로 병원균 도입이 되었다. 바이러스의 역가가 바이러스 접종 5일 후 면역된 마우스의 난소에서 평가되었다. 도 7은 달성된 보호 준위를 나타낸다. 바이러스 적하의 감소는 주로 세포성 면역 반응을 달성하기 위해 최적의 변형체로 면역된 동물의 군에 있어서 음성 대조군에 비하여 혼합물로 면역된 마우스에서 통계적으로 유의성이 있었다(대략적으로 2.5 Log의 바이러스 역가의 감소). 도 7에 나타난 분석된 군은 표 2에 나타난 것에 상당하였고, 부가적인 음성 대조군(17 군)은 비면역화된 군에 상당한다.
실시예 3: 다른 면역화 스케쥴에 따른 HCV 단백질 제형으로 면역화반응에 의하여 BALB /c 마우스에서 발생된 면역 반응의 평가.
면역 반응의 발생에서 면역화 중에 시간의 영향을 분석하기 위해, 암컷 BALB/c 마우스가 실시예 1에서 언급된 바와 같이 최적의 세포성 면역 반응의 발생을 위한 변형체로 다른 시간 간격으로 i.p 경로에 의해 면역되었다. 1 군은 1, 1 및 2 주에 면역되었다. 2 군은 0, 2, 및 4 주에 면역되었다. 3 군은 0, 3, 및 6 주에 면역되었고, 반면 4 군은 0, 4, 및 8 주에 면역되었다. HCV 코어, E1 및 E2 단백질에 대한 항체 역가가 ELISA에 의해 평가되었다. 그 결과는 도 8에 나타냈다. E1 및 E2에 대한 항체 역가에 있어서 이들이 최종 면역화 후 15일에 평가되었을 때 아무런 통계적 유의성 있는 차이가 없었다. 유의성 있는 통계적 차이는 1 군 (0, 1, 2주에 면역화 스케쥴)과 다른 나머지 군과의 사이에서 이들이 비교될 때 코어 항원에 대한 항체 역가에 있어서 관찰되었다.
면역화된 마우스의 림프증식성 반응은 최종 면역화 후 15일에 평가되었다. 각 연구된 변형체 중에 자극 지수에서의 차이와 같이, 이들은 통계적으로 유의성 있는 차이가 없다. 얻어진 결과는 도 9에 나타냈으며, 여기서 부가적 음성 대조군이 또한 포함되며(5 군) 면역되지 않은 마우스에 상당한다. 바이러스 병원균 도입에 대해 면역화된 마우스의 보호는 다른 실시예에서 이미 기술된 바와 같이 평가되었다.
동물은 i.p. 경로에 의해 106 pfu의 vvRE로 면역화 스케쥴의 종단 15일 후에 병원균 도입이 되어 마우스의 난소에서 바이러스의 존재가 바이러스 접종 5일 후 평가되었다. 도 10은 얻어진 결과를 나타내며, 여기서 다른 스케쥴로 면역된 군 중에 바이러스 역가에서 관찰된 차이는 통계적으로 유의성이 없었다. 이 도에서, 다른 음성 대조군이 또한 포함되어(5 군) 비면역화된 마우스에 상당한다.
실시예 4: 다른 경로에 의해 투여된 HCV 단백질 제형으로 면역화반응 후 BALB/c 마우스에서 면역 반응의 평가.
다른 면역화 경로를 통한 백신 제형의 투여는 또한 하나의 연구 측면이다. 암컷 BALB/c 마우스는 다른 경로에 의해 최적의 세포성 및 체액성 면역 반응을 발생하기 위해 HCV 제제로 면역된다: 1 군: 피하(s.c.) 경로에 의해 체액성 반응에 대한 최적 제형, 2 군: 복막내(i.p.) 경로에 의해 체액성 반응에 대한 최적 제형, 3 군: 근육내(i.m.) 경로에 의해 체액성 반응에 대한 최적 제형, 4 군: 비강내(i.n.) 경로에 의해 체액성 반응에 대한 최적 제형, 5 군: s.c. 경로에 의해 세포성 반응에 대한 최적 제형, 6 군: i.p 경로에 의해 세포성 반응에 대한 최적 제형, 7 군: i.m. 경로에 의해 세포성 반응에 대한 최적 제형, 8 군: i.n 경로에 의해 세포성 반응에 대한 최적 제형.
HCV 구조 항원 (코어, E1 및 E2)에 대한 체액성 면역 반응이 면역화 스케쥴(0, 1 및 2주) 종료 15일 후에 연구되었다. 얻어진 결과는 항체 준위 중에서 통계적으로 유의성 있는 차이를 가짐에도 불구하고 채용된 항원에 대한 특이적 면역 반응이 발생되었다는 것을 보여준다. 이들 차이는 채용된 면역화 스케쥴에 기인하며, 여기서 항체 반응의 발생은 면역 반응의 동역학 때문에 몇몇 변형체에 대해 바람직하게 된다. s.c., i.p. 및 i.m 경로가 사용될 때, 아무런 통계학적으로 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 결과는 통계적으로 유의성 있는 차이를 가지는 경우에 i.p 경로가 사용되었을 때 높았고, i.n 경로가 사용되었을 때 낮았다. 결과는 도 11에 나타냈다.
마우스의 림프증식성 면역반응은 최종 면역화 15일 후에 바이러스 항원에 대해 평가되었다. 체액성 면역 반응에 유사하게, 연구된 군 중에서 자극 지수에서의 차이는 면역 반응을 생성한 면역의 동역학 때문에 i.n 경로의 경우와 일반적인 경로(나머지 면역화 경로)에서 사용된 항원의 양에 따른다. 특이적 림프증식성 반응이 각 HCV 항원에 대해 발생되었다. 그럼에도 불구하고, i.n. 경로에 의해 얻어진 자극 지수는 다른 면역화 경로에 비하여 통계적으로 유의성 있게 낮았다. 도 12는 얻어진 결과를 나타낸다. 이 분석에서, 다른 음성 대조군이 또한 포함되어(9 군) 비면역화된 마우스에 상당한다.
면역화된 마우스의 바이러스 병원균 도입에 대한 보호는 106 pfu의 vvRE로 면역화 스케쥴의 종료 15일 후에 접종되어 평가되었다. 병원균 도입 5일 후, 바이러스의 양은 면역되고 병원균이 도입된 마우스의 난소에서 결정되었다. 도 13은 얻어진 결과를 나타내며, 여기서 비록 i.n. 경로에서 1 Log의 바이러스 역가의 감소를 나타냈지만 다른 면역화 스케쥴 중에서의 차이는 관찰되지 않았다. 이 실험에서, 비면역화된 마우스에 상당하는 다른 음성 대조군이 포함된다(9 군).
실시예 5: 다른 어쥬번트를 사용한 HCV 단백질 제제로 면역화 후 BALB /c 마우스에서 면역 반응의 평가.
백신 제제에 의해 발생된 면역 반응을 증진하기 위해 어쥬번트의 사용이 또한 연구되었다. 암컷 BALB/c 마우스가 다음과 같이 최적의 세포성 또는 최적의 체액성 면역 반응을 발생하기 위해 백신 제제로 i.p.로 면역된다: 1 군: 수산화 알루미늄(AlOH3)에서 체액성 반응에 대한 최적의 변형체, 2 군: 인산염 알루미늄에서 체액성 면역 반응에 대한 최적의 변형체, 3 군: 프로인드 어쥬번트에서 체액성 면역 반응에 대한 최적의 변형체, 4 군: 유상 어쥬번트(Montanide ISA 51) 에서 체액성 면역 반응에 대한 최적의 변형체, 5 군: 어쥬번트 없이 체액성 면역 반응에 대한 최적의 변형체, 6 군: 수산화 알루미늄 (AlOH3) 에서 세포성 면역 반응에 대한 최적의 변형체, 7 군: 인산염 알루미늄에서 세포성 면역 반응에 대한 최적의 변형체, 8 군: 프로인드 어쥬번트에서 세포성 면역 반응에 대한 최적의 변형체, 9 군: 유상 어쥬번트 (Montanide ISA 51) 에서 세포성 면역 반응에 대한 최적의 변형체, 10 군: 어쥬번트 없이 세포성 면역 반응에 대한 최적의 변형체. 면역화 스케쥴(0, 1 및 2주)의 종료 15일 후, HCV 구조 항원 (코어. E1 및 E2)에 대한 체액성 반응이 연구되었다. 결과는 모든 군에 있어서 항체 역가에서의 차이에도 불구하고 특이적 반응이 HCV 항원에 대하여 발생되었다는 것을 보여준다. 항체의 준위는 수산화 알루미늄 (AlOH3) 및 인산염 알루미늄에서의 백신 변형체로 면역된 이들 군에서 유사했다. 프로인드 어쥬번트 제제로 면역된 군은 최고의 항체 역가에 도달하였으며, Montanide ISA 51에서의 제제로 면역된 군이 그 뒤를 따랐다. 비록 어쥬번트를 갖지 않는 제제로 면역된 군에서 특이적 항체 반응이 있었지만, 얻어진 항체 역가는 가장 낮았다. 이들 결과는 도 14에 나타냈다.
HCV 바이러스 구조 항원에 대한 림프증식성 면역 반응이 면역 스케쥴의 종료 15일 후 면역화된 마우스로부터 지라 세포에서 평가되었다. 최고의 림프증식 지수가 각각 프로인드 어쥬번트 및 Montanide ISA 51에서 세포반응에 대한 최적의 변형체로 면역된 군에서 관찰되었다. 수산화 알루미늄 및 인산염 알루미늄에서의 제제로 면역된 군에서 림프증식 지수는 유사했다. 최저 수준의 세포 면역 반응은 제제가 어쥬번트 없이 투여될 때 관찰되었다. 이들 결과는 도 15에 나타냈으며, 여기서, 비면역화된 마우스에 상당하는 음성 대조군(11 군) 이 포함된다.
바이러스 병원균 도입에 대한 보호는 106 pfu의 vvRE로 면역화 스케쥴의 종료 15일 후에 접종에 의해 평가되었다. 병원균 도입 5일 후, 바이러스의 역가는 마우스의 난소에서 시금되었다. 결과는 도 16에 나타내며, 비면역화된 마우스에 상당하는 부가적 음성 대조군(11 군)이 포함된다. 체액성 면역 반응에 대한 최적의 변형체 및 세포성 면역 반응에 대한 최적의 변형체로 면역된 마우스에서, 프로인드 어쥬번트에서 양자는 각각 바이러스 역가에서 1.7 및 2.4-Log 감소가 관찰되었다. Montanide ISA 51로 어쥬번트된 체액성 면역 반응에 대한 최적의 변형체 및 세포성 면역 반응에 대한 최적의 변형체로 면역된 이들 마우스에서, 각각 바이러스 역가에서 1.9 및 2.5-Log 감소가 관찰되었다. 알루미늄염의 제제로 면역된 마우스에서, 마우스의 난소에서 바이러스 역가의 감소는 각각 최적의 체액성 면역 반응 및 최적의 세포성 면역 반응의 유도에 대한 변형체의 경우에서 1.4 Log 및 2.1 Log이었다. 어쥬번트 없이 면역된 동물에서는 바이러스 역가에서 단지 적은 감소만이 관찰되었다.
실시예 6: 다른 바이러스 항원이 혼합된 HCV 단백질 제제로 면역화 후 BALB/c 마우스에서 면역 반응의 평가.
HCV 제제 (최적의 세포성 면역 반응을 발생하기 위한 HVC 제제)가 혼합된 다른 바이러스 항원(간염 B 표면 항원- HBsAg, 간염 B 코어 항원- HBcAg)에 의한 면역 반응의 발생 또는 증진이 마우스에서 평가되었다. BALB/c 마우스가 i.p 경로로: 1 군은 HBsAg-HCV 백신 제제, 2 군은 HBcAg- HCV 백신 제제, 3 군은 HCV 백신 제제, 4 군은 HBsAg 및 5 군은 HbcAg로 면역되었다. 채용된 면역 스케쥴은 0, 2 및 4 주에 접종이고, 면역 반응은 최종 면역 15일 후에 연구되었다. 항체 반응은 HBcAg 및 HbsAg에 대해서 뿐 아니라 HCV 구조 항원 (코어, E1 및 E2)에 대해서 평가되었다. 항원 특이적 면역 반응의 발생이 관찰 되었다. HBcAg 및 HbsAg에 대한 특이적 항체가 발생되었다. 비록 2 군(HBcAg-HCV 백신 제제)에서 HbcAg에 대한 항체 역가가 대조군(5 군 - HBcAg 단독)에서 발생된 것에 비해 얼마간 낮지만, 이들의 차이는 통계적으로 유의적이지 않다. HbsAg에 대한 역가는 대조군 4 (HBsAg 단독)과 비교할 때 1 군(HBsAg- HCV 백신 제제)에서 높아, 비록 관찰된 차이가 통계적으로 유의적이지는 않지만 이 항원에 대한 면역 반응의 증진 경향을 나타냈다. 이들 결과는 도 17에 나타냈다.
면역된 마우스로부터 지라 세포에서의 림프증식성 면역 반응이 HBcAg 및 HbsAg에 대해서 뿐 아니라 HCV 구조 바이러스 항원에 대해서, 면역화 스케쥴 종료 15일 후 평가되었다. 도 18에 도시된 바와 같이, HCV 백신 제제와 바이러스 항원 HBcAg 또는 HbsAg의 혼합물을 상응하는 대조군과 비교할 때, 자극 지수에서의 차이가 발견되지 않았다. 각각의 경우에 있어서, 항원 특이적 면역 반응이 발생되었다. 연구된 군으로부터 자극 지수가 비교될 때, 통계적으로 유의성 있는 차이가 발견되지 않았다. 이 실험에서, 부가적 음성 대조군(6 군)이 포함되어 비면역화된 마우스에 상당한다.
면역된 마우스의 바이러스 병원균 도입에 대한 보호는 106 pfu의 vvRE로 면역화 스케쥴의 종료 15일 후에 접종에 의해 평가되었다. 병원균 도입 5일 후, 바이러스의 역가는 마우스의 난소에서 시금되었다. 도 19는 얻어진 결과를 보여주며, 여기서 HBV 바이러스 항체 (HBsAg 또는 HBcAg)와 혼합되거나 되지 않은 HCV 백신 제제로 면역된 마우스 군에서만 대략 2.5 Log의 바이러스 역가의 감소가 검지되었음을 관찰할 수 있었다. 바이러스 역가가 비교될 때, 아무런 통계적으로 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다. HCV에 대한 음성 대조군에서, 병원균 도입 마우스로부터의 난소의 바이러스 적하에서의 감소가 감지되지 않았다. 비면역화된 마우스에 상당하는 부가적인 음성 대조군(6 군)이 이 실험에 포함된다.
실시예 7: 박테리아 항원이 혼합된 HCV 단백질 제제로 면역화 후 BALB /c 마우스에서 면역 반응의 평가.
박테리아 항원(나이세리아 메닝기티디스로부터의 아웃터 멤브레인 단백질- OMP- )과 HCV 백신 제제(HCV 최적 면역 반응을 발생하기 위한 제제)조합에 의한 면역 반응의 발생 또는 증진이 마우스 면역화 후에 평가되었다. BALB/c 마우스가 i.p. 경로로: 1 군은 OMP-HCV 백신 제제로, 2 군은 HCV 백신 제제로 그리고 3 군은 수산화 알루미늄으로 어쥬번트된 OMP으로 면역되었다. 마우스는 0, 2 및 4 주에 면역되었고, 면역 반응은 면역화 스케쥴 종료 15일 후에 연구되었다. 체액성 면역 반응이 쿠바 균주 CU 385/83의 나이세리아 메닝기티디스로부터의 아웃터 멤브레인 단백질의 제제에 대해서 뿐 아니라 HCV 구조 항원 (코어, E1 및 E2)에 대해 평가되었다. 도 20은 OMP들을 갖는 HCV 백신 제제의 조합에 의해 발생된 항체 준위는 HCV 독립 항체 및 OMP에 대한 반응을 측정하여 OMP 단독 및 HCV 백신 제제에 의해 발생된 것 보다 높았다는 것을 보여준다. 이들 차이는 통계적으로 유의성이 있지 않다.
면역된 마우스로부터 지라 세포에서의 림프증식성 반응이 면역화 스케쥴의 종료 15일 후에 나이세리아 메닝기티디스 CU 385/83 쿠바 분리물로부터의 OMP에 대해서 뿐 아니라 HCV 구조 항원에 대해 평가되었다. 도 21에 도시된 바와 같이, 이들이 HCV 구조 항원 및 OMP으로 자극될 때, 대조군에서 관찰된 것에 비하여 OMP-HCV 백신 제제로 면역화된 마우스의 지라 세포에서 자극 지수가 증가되었다. 이 자극화는 항원 특이적이다. 이 실험에서, 비면역화된 마우스에 상당하는 부가적인 음성 대조군(4 군)이 포함된다.
면역된 마우스에 바이러스 병원균 도입 후 보호가 면역화 스케쥴의 종료 15일 후에 106 pfu의 vvRE의 접종에 의해 평가되었다. 병원균 도입 5일 후, 바이러스의 역가는 병원균 도입 마우스의 난소에서 시금되었다. 얻어진 결과는 도 22에 나타냈다. 양 군(HCV 백신 제제 및 OMP-HCV 백신 제제)에서 바이러스 역가에서의 2 Log 감소가 있었다. 대조군(OMP으로 면역화된 마우스)에서는 난소에서의 바이러스 역가의 감소가 관찰되지 않았다. 이와 동일한 것이 마우스가 면역화되지 않은, 이 실험에 포함된 다른 음성 대조군(4 군)에서 일어났다.
수막염 구군에 대해 발생된 항체의 기능성 활성은 혈청-살균제의 분석에 의해 평가되었다. 이 분석에서, 외인성 보충 원의 존재 하에, 생체 외에서 박테리아를 사멸하는 항체의 능력이 측정되었다. 표 3에 나타난 결과는 OMP을 갖는 HCV 백신 제제의 혼합물은, 박테리아 역가가 군 1 및 3에서 유사하였기 때문에, 나이세리아 메닝기티디스에 대한 특이적-기능성 항체의 발생을 저해하지도 고양하지도 않는다는 것을 나타낸다.
Figure 112007023416344-PCT00002
실시예 8: 폴리사카라이드류가 혼합된 HCV 단백질 제제로 면역화 후 BALB /c 마우스에서 면역 반응의 평가.
HCV 백신 제제 (최적의 세포성 면역 반응을 유도하는 백신 제제)가 혼합된 캡슐형의 폴리사카라이드류(P64k 담체 단백질로 컨쥬게이트된 나이세리아 메닝기티디스 세로그룹 C-로부터의 캡슐형의 폴리사카라이드)에 의해 발생된 면역 반응에 대한 영향이 BALB/c마우스에 i.p 경로로: 1군은 컨쥬게이트(MenC-P64k)-HCV 백신 제제로, 2 군은 HCV 백신 제제로, 3 군은 컨쥬게이트(MenC-P64k)로 면역화 후 평가되었다. 이 면역화 스케쥴은 0, 2, 4 주에 접종을 포함하고 면역 반응은 최종 면역화 15일 후에 연구되었다.
체액성 면역 반응이 나이세리아 메닝기티디스 세로그룹 C 캡슐형의 폴리사카라이드에 대해서 뿐 아니라 HCV 구조 항원 (코어, E1 및 E2 단백질)에 대해 평가되었다.
도 23은 컨쥬게이트와 혼합된 HCV 백신 제제의 조합에 의해 발생된 항체 준위가 반응이 세로그룹 C로부터 나이세리아 메닝기티디스 캡슐형 폴리사카라이드에 대해서 뿐 아니라 HCV 구조 단백질에 대해 평가될 때 양 성분에 의해 독립적으로 얻어진 것에 유사하였다는 것을 보여준다.
면역된 마우스의 지라 세포에서의 림프증식성 반응이 HCV 구조 단백질에 대해 평가되었다. 도 24에 도시된 바와 같이, 백신 조합 MenC-P64k-HCV 백신 제제와 HCV 백신 제제로 면역된 마우스의 지라 세포는 컨쥬게이트로 만 면역된 대조군에 비하여 HCV 구조 영역으로부터 항원으로 자극되었다. 이 실험에서, 다른 음성 대조군이 비면역화 마우스를 포함하는 4 군으로 포함되었다.
바이러스 병원균 도입 후 면역된 마우스에 보호가 면역화 스케쥴의 종료 15일 후에 106 pfu의 vvRE의 접종에 의해 평가되었다. 병원균 도입 5일 후, 면역되고 병원균 도입된 마우스의 난소에서 바이러스의 적하의 적정이 시금되었다. 도 25는 결과를 나타내며, 여기서 컨쥬게이트(MenC-P64k)를 갖거나 갖지않는 HCV 백신 제제로 면역된 마우스의 난소에서 결정된 바이러스 적하에서의 차이가 없다. 대조군에 비하여 양군에서는 바이러스 역가의 2.1-Log 감소가 관찰되었다. 이 차이는 이들 군의 바이러스 역가는 음성 대조군(컨쥬게이트 MenC-P64k 만으로 면역된 마우스)과 비교될 때, 통계적으로 유의성이 있었다. 면역화되지 않은 마우스에 상당하는 부가적인 음성 대조군(4 군)이 이 실험에 포함되었다.
나이세리아 메닝기티디스 세로그룹 C에 대해 발생된 항체의 기능성 활성이 외인성 보충 원의 존재할 때, 박테리아를 사멸하는 항체의 능력이 생체 외에서 측정되는 살균제의 분석에 의해 평가되었다. 이런 관점에서, 표 4에 나타난 결과는 HCV 백신 제제- MenC-P64K 컨쥬게이트의 혼합물이 컨쥬게이트 MenC-P64K에 의해 생산된 나이세리아 메닝기티디스에 대한 특이적이고 기능성 항체의 발생에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
Figure 112007023416344-PCT00003
실시예 9: 바이러스 항원을 코드하는 플라스미드가 혼합된 HCV 단백질 제제로 면역화 후 BALB /c 마우스 면역 반응의 평가.
HCV 백신 제제 (세포성 면역 반응에 대한 최적 변형체)로 혼합될 때 면역 반응의 발생에 있어서, 간염 B 바이러스의 표면 항원(pAEC-M7-HBsAg) 및 코어 항원(pAEC-M7-HBcAg)에 대해 코드하는 DNA 면역화 플라스미드의 영향이 BALB/c 마우스에: 1 군은 pAEC-M7로, 2 군은 pAEC -M7-HCV 백신 제제로, 3 군은 pAEC-M7-HbsAg로, 4 군은 pAEC-M7-HBsAg-HCV 백신 제제로, 5 군은 pAEC-M7-HbcAg로, 6 군은 pAEC-M7-HBcAg-HCV 백신 제제로, 7 군은 HCV 백신 제제로 근육 내로 면역화 후에 연구되었다. 동물은 0, 2, 4 및 6 주에 면역되었다. 간염 B 바이러스 표면(HBsAg) 및 코어 (HBcAg) 항원에 대해서 뿐 아니라 HCV 구조 항원(코어, E1 및 E2)에 대한 체액성 면역 반응이 평가되었다. 얻어진 결과는 도 26에 나타냈으며, 여기서 분석된 항원 각각에 대해 특이적인 반응의 발생이 관찰되어질 수 있다. 일반적으로, 플라스미드가 HCV 백신 제제로 혼합될 때, HCV 구조 항원에 대한 항체 역가가 HCV 백신 제제 단독에 의해 발생된 것 보다 높았다. 비록 이것은 어떤 경향이었지만, 관찰된 차이는 통계적으로 유의적이지 않았다. 동물이 HBsAg 및 HbcAg를 코드화 하는 플라스미드 단독 또는 HCV 백신 제제와 혼합되어 면역되어 질 때, 이들 항원에 대한 항체 역가는 유사하였다.
면역화된 마우스로부터의 지라 세포에서 림프증식성 반응이 HBsAg 및 HbcAg에 대해서 뿐 아니라 HCV 구조 항원에 대해서 면역화 스케쥴 종료 15일 후에 평가되었다. 도 27에 도시된 바와 같이, 간염 B 항원 (HBsAg 또는 HBcAg)을 코드하는 플라스미드가 혼합된 HCV 백신 제제가 상응하는 대조군과 비교될 때, 자극 지수에서의 통계적 차이가 관찰되지 않았다. 이 실험에서, 비면역화된 마우스를 포함하는 부가적 음성 대조군(8 군)이 포함되었다. 각 경우에 있어서, 항체-특이적 반응이 관찰되었다. 연구된 군이 비교될 때, 자극화 지수들에서 검출된 차이는 통계적인 유의성 차이가 없었다. 동시에, 지라 세포에 HCV구조 항원이 부가될 때, 플라스미드가 혼합되거나 되지 않은 HCV 백신 제제로 면역된 마우스의 군 사이에서는 통계적으로 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다.
면역된 마우스의 바이러스 병원균 도입 후 보호가 면역화 스케쥴의 종료 15일 후에 106 pfu의 vvRE의 접종에 의해 평가되었다. 병원균 도입 5일 후, 병원균 도입된 마우스의 난소에서 바이러스의 적하가 시금되었다. 도 28은 얻어진 결과를 나타내며, 여기서 단지 플라스미드가 혼합되거나 되지 않은 HCV 백신 제제로 면역된 군에서 만 바이러스 역가에서 대략 2 Log의 감소가 있었다. 이들 군 사이에서 바이러스의 역가가 비교될 때 통계적으로 유의성 있는 차이가 없었다. HCV 음성 대조군에서, 면역된 마우스의 난소에서의 바이러스 적하의 감소가 없었다. 이 실험에서, 비면역화된 마우스에 상당하는 부가적 음성 대조군(8 군)이 포함되었다.
실시예 10: HCV 구조 영역에 대해 코드화하는 DNA 제형으로 초기 면역화와 연구된 HCV 단백질 제제로 추가 면역화 후 BALB /c 마우스에서 면역 반응의 평가.
DNA로 초기 및 (최적의 세포성 면역 반응을 위한) HCV 백신 제제로 부가 면역의 조합이 BALB/c 마우스에서 연구되었다. 면역화 스케쥴은 표 5에 나타냈다.
Figure 112007023416344-PCT00004
BALB/c 마우스는 DNA 플라스미드 제형으로 i.m 경로에 의해 면역되었고(Duens-Carrera, et al. (2002). Enhancement of the immune response generated against the hepatitis C virus envelope proteins after DNA vaccination with polyprotein-encoding plasmids. Biotechnol Appl Biochem, 35, 205-212) 추가 복용이 i.m 경로에 의해 투여되었다.
체액성 면역 반응이 HCV 구조 항원 (코어, E1 및 E2)에 대해 평가되었다. 얻어진 결과는 도 29에 나타냈다. HCV 코어 항원에 대한 항체 반응의 증진의 아무런 증거도 발견되지 않았다. 단백질 변형체로 면역된 이들 군에서 검출된 항체 준위는 비록 통계적으로 유의적이지는 않지만 DNA로 면역된 군에 대한 것보다 높다.
E1 단백질에 대한 체액성 면역 반응은 HCV 백신 제제로 추가 투여될 때 고양되었다. 이 경우에, 보다 높은 항체 준위가 DNA로 면역된 군에 비하여 단백질 변형체로 면역된 마우스의 군의 것에서 검출되었다. 추가 복용 전 후에, E1에 대한 항체 준위에서 관찰된 차이는 통계적으로 유의적이지 않았다.
이 면역화 요법을 사용하여 E2 단백질에 대해 검출된 항체 준위는 DNA로 면역된 마우스에서 얻어진 항체 반응에 비해 단백질 제형으로 면역화된 동물들에서 보다 높았다. 추가 복용 후 E2 단백질에 대해 검출된 항체 준위는 변하지 않았다.
면역된 마우스의 지라 세포에서 림프증식성 반응이 최종 면역화 15일 후 구조 HCV 바이러스 항원에 대해 평가되었다. 도 30에 도시된 바와 같이, 비록 림프증식 지수가 단백질 제형으로 추가된 마우스로부터의 지라 세포에서 증가되었지만, 그 차이는 통계적으로 유의성이 있지는 않다. 유사하게, DNA로 면역되고 단백질로 추가된 마우스의 HCV 구조 항원에 대한 림프증식성 반응은 E1 단백질에 대해 현저하게 증가되었다. 군들 사이의 차이는 통계적으로 유의성이 있지는 않다.
면역된 마우스의 바이러스 병원균 도입에 대한 보호가 최종 면역화 15일 후에 106 pfu의 vvRE의 접종에 의해 평가되었다. 병원균 도입 5일 후, 면역되고 병원균 도입된 마우스의 난소에서 바이러스의 역가가 결정되었다. 도 31은 얻어진 결과를 나타내며, 여기서 최적 세포 백신 제제로 면역화된 동물에서 바이러스 적하의 대략 2 Log 감소가 검지되었다. DNA로 면역된 마우스는 바이러스 역가의 1.2 Log 감소를 보였다. 최적 세포 면역 반응을 위해 백신 제형으로 추가 복용 후, 바이러스 역가의 6.6 Log 감소가 최적 세포 반응에 대한 제형으로 초기에 면역된 동물에서 관찰되었다. DNA로 초기 면역되고 HCV 백신 제제로 추가 면역된 마우스에서는 바이러스 역가의 1.8 Log 감소가 관찰되었다. 다른 군에서는 마우스의 난소에서 바이러스 적하의 감소는 발견되지 않았다.
실시예 11: 제제의 다른 경로를 고려한 HCV 단백질 제제로 면역화 후 BALB /c 마우스에서 면역 반응의 평가.
재조합 HCV 구조 단백질에 대한 면역 반응의 유도가 다른 형태에 의한 면역원의 제조 후 연구되었다. 다음의 변형체가 연구되었다: (1) 세 항원이 혼합되고 그 후 수산화 알루미늄으로 어쥬번트되었고, (2) 각 항원은 먼저 별도로 수산화 알루미늄 젤로 어쥬번트되었고 나중에 최종 제제를 구성하기 위해 혼합되었음. BALB/c 마우스는 양 제형으로 면역화되었다. BALB/c 마우스에서 최적의 세포 반응의 유도를 위한 백신 제형이 사용되었다.
확립된 면역화 스케쥴은 0, 2 및 4 주 이다. 면역 반응은 면역화 스케쥴이 완료된 후 15일에 연구되었다.
항체 반응은 HCV 백신 제제 (코어, E1 및 E2)가 존재하는 항원에 대해 평가되었다. 도 32는 각 항원에 대해 발생된 항체 준위가 유사하였고; 연구된 군 사이에서의 차이는 통계적으로 유의성이 있지 않았다는 것을 나타낸다.
면역된 마우스의 지라 세포에서 림프증식성 반응이 HCV 구조 항원에 대해 평가되었다. 도 33에 도시된 바와 같이, HCV 면역원을 제조하는 방법은 항체-특이성 림프증식성 반응에 영향을 미치지 않았다. 연구된 군들 사이에 차이는 통계적으로 유의적이지 않았다. 다른 대조군은 이 실험에 포함되고(3 군), 비면역화된 마우스에 상당한다.
바이러스 병원균 도입에 대한 면역된 마우스의 보호가 최종 면역화 15일 후에 106 pfu의 vvRE 접종에 의해 평가되었다. 병원균 도입 5일 후, 면역되고 병원균 도입된 마우스의 난소에서 바이러스 역가가 결정되었다. 면역된 마우스의 난소에서 검출된 바이러스의 양은 바이러스 역가의 Log로 표현되어, 연구된 군 사이에서의 차이가 통계적으로 유의적이지 않았다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 도 34에 나타났다. 다른 대조군은 이 실험에 포함되고(3 군), 비면역화된 마우스에 상당한다.

Claims (13)

  1. 간염 C 바이러스 구조 항원(코어, E1 및 E2)의 최적 조합에 의해 특징되고 모든 타입의 어쥬번트를 사용하여 투여되는 간염 C 바이러스로의 감염에 대한 보호적 세포성 및 체액성 면역 반응을 발생하기 위한 백신 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 최적의 체액성 면역 반응을 발생하기 위해 사용된 항원의 양은 비율이 [(1.5-2.5):(1-2.5):(1-2)]:[코어:E1:E2]의 범위인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 사용된 항원의 양은 비율이 (1.5:1,1:1):(코어:E1:E2)에 상응하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 최적의 세포성 면역 반응을 발생하기 위해 사용된 항원의 양은 비율이 [(1:50):(120-180):(120-180)]:[코어:E1:E2]의 범위인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 사용된 항원의 양은 비율이 (1:160:160):(코어:E1:E2)에 상응하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 다른 면역화 스케쥴로 투여됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 활성 성분으로 간염 C 바이러스 구조 항원의 혼합물이, 청구항 1 내지 5중 어느 한 항에 따라 폴리사카라이드(컨쥬게이트되거나 되지 않은 것) 및/또는 바이러스 및/또는 박테리아 항원에 조합된 바이러스 및/또는 박테리아 질병에 대한 조합된 백신 조성물.
  8. 활성 주제로 간염 C 바이러스 구조 항원의 혼합물이, 청구항 1 내지 5항 중 어느 한 항에 따라 감염성 제제의 항원을 코드화 하는 플라스미드에 조합된 바이러스 및/또는 박테리아 질병에 대한 조합된 백신 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 사용된 바이러스 항원이 간염 B 바이러스의 코어 및/또는 표면 항원임을 특징으로 하는 조합된 백신 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 사용된 박테리아 항원이 개별적으로 또는 백신 제형에 포함된, 엔. 메닝기티디스(N. meningitidis)로부터의 아웃터 멤브레인 단백질인 것을 특징으로 하는 조합된 백신 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 담체 단백질에 컨쥬게이트되거나 또는 되지 않은 폴리사카라이드 항원은 박테리아 제제에 대한 제형에서 활성 주제로 사용됨을 특징으로 하는 조합된 백신 조성물.
  12. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 DNA 컨스트럭트, 생 바이러스 벡터, 펩티드 및 단백질에 기초된 다른 백신 후보와 조합된 스케쥴로 투여됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 간염 C, 간경병 및 간암을 지닌 환자에 있어 간염 C 바이러스에 대한 면역성을 유도하기 위한 백신 조성물.
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